Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ферменты метаболизма трикарбоновых кислот и регуляция их активности в растениях

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ферменты метаболизма трикарбоновых кислот и регуляция их активности в растениях"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РАСТЕНИЕВОДСТВА имени Н. И. ВАВИЛОВА

Ой .•г ¡:;

На правах рукописи

ЗЕМЛЯНУХИН Леонид Александрович

УДК 577.152.1.:582.5

ФЕРМЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ И РЕГУЛЯЦИЯ ИХ АКТИВНОСТИ В РАСТЕНИЯХ

Специальность: 03.00.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

Работа выполнялась в 1972—1992 гг. в Воронежском государственном университете и в Воронежском технологическом институте.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н. Д. Ещен-ко; доктор биологических наук, профессор Г. Н. Чупахина; доктор биологических наук 3. Г. Евстигнеева.

Ведущее учреждение — Институт почвоведения и фотосинтеза РАН.

Защита диссертации состоится 1994 г. в ¡0 ча-

сов на заседании специализированного совета Д 020.18.02 при Вссро^ сийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н. И. Вавилова по адресу: 190000, Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке. Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н. II. Вавилова.

Автореферат разослан 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Э. А. Гончарова

' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Нивые организмы характеризуются функционированием сложных метаболических систем, обеспечивающих нормальный ход физиологических процессов. Основу метаболических систем составляют ферменты, исследованию которых уделяется огромное внимание. Последнее, однако, характерно в большей степени для животных организмов. Между тем обмен веществ растительных организмов существенно отличается от животных. В частности, общеизвестно, что растительные клетки содержат вакуоли, являющиеся вместилищем разнообразных органических кислот и некоторых ферментов, отсутствующих в ЖИВОТНЫХ КЛеТКаХ ( Boiler, WLemken, 1986 ).

Несмотря на большие успехи, достигнутые в последние годы в изучении ферментов, ферменты ЦТК и глиоксилатного никла растений, участвующие в образовании трикарбоновых кислот - цптратсинтаза (ЦС) и аконитатгидратаза (АГ) были изучены в очень слабой степени. Что же касается обмена транс-аконитовой кислоты в растениях, то этот вопрос еще не был изучен и фермент аконитатизомераза (АИ), участвующий во взаимопревращении цис- и транс-аконитатов, бил обнаружен лишь в бактериях ( Rao, Aitekar, 196I ). Вопрос о метаболизме ок-силимонйой кислоты, найденной в растениях-, до наших работ был очень не ясен (Ц'ипарев, Солдатенков, 1972).

Известно, что органические кислоты в растениях являются связующим звеном как в биосиитетических, так и катаболичес-ких реакциях. Метаболизм органических кислот в растениях тесно связан с обменом аминокислот и процессом глюконеогене-за, выступая в качества их субстратов и регуляторов ( Nishi-mura, Beevers, 1974 ). Именно эта значимость процессов обмена трикарбоновых кислот в растениях и побудила нас исследовать ферменты, участвующие в этих реакциях.

Цель и задачи исследования. Основной целью нащей работы явилось изучение свойств ферментов, участвующих в метаболизме цитрата, цис- и транс-аконитатов, ацетил-КоА и окепцпт-рата, а такке механизмов их регуляции у высотах растений.

Исходя из цели работы нами бнли поставлены следующие задачи!

I. Бцделить и получить в'гомогенном пли впеокоочппенном состоянии ЦС, АГ, АИ.Ш'етил-КоА-гплролпзу (АпГ) из высших ра-

стегай. Изучить их физико-химические и кинетические свойства.

2. Исследовать внутриклеточную локализацию этих ферментов и наличие их множественных молекулярных форм.

3. Изучить распространение и динамику изменения активности ЦС, АцГ, АГ и АН в онтогенезе различных растений.

4. Исследовать возможность индуцированного синтеза ЦС, АГ и Alf в растениях под действием эндогенных органических кислот.

5. Изучить воздействие некоторых факторов внешней среди на активность ЦС, АГ, АН и АцГ.

6. Выяснить пути обмена оксилимонной кислоты в живых организмах.

Научная нолизна работы. 3 результате проведенных исследований разработан способ получения в гомогенном состоянии ЦС из кенафа и изучены ее физико-химические свойства. Впервые получены в галогенном состоянии АГ и АцГ из растений и также изучены их физико-химические и кинетические свойства. Показано присутствие All в растениях и исследованы физико-химические и кинетические свойства,частично очищенной АИ из кукурузы.

Изучена внутриклеточная локализация ЦС, АцГ, АГ и АИ в растениях. Показано, что ЦС локализована как в митохондриях, так'и глиоксисомах. АГ находится в основном в цитоплазме, небольшая активность обнаружена в митохондриях и глиоксисомах, Основная часть АцГ и АИ локализована в цитоплазме, небольшая активность найдена в митохондриях.

Дяя АГ впервые показано, что физико-химические и каталитические свойства митохондриальной аконитазы заметно отличаются от свойств этого фермента из цитоплазмы и глиокси-сом. В то же время обнаружено значительное сходство свойств АГ из цитоплазмы и глиоксисом.

С помощью модифицированных нами методов специфического проявления ЦС, АцГ и АГ в гелях после электрофореза впервые показано присутствие мнодастпенных молекулярных форм этих ферментов в высших растениях.. Получены в частично очищенном состоянии молекулярные формы АцГ и ЦС из катрана и кенафа, соответственно, и изучены их свойства.

В результате на:чей работы открыт нош;й фермент - окси-цитратдогицратаза(декарбоксилирудаая)(ОД), участвующая в

обмене оксицитрата в бактериях. Показано присутствие этого фермента в кенафе. Произведена частичная очистка ОД из бактерий и изучены ее некоторые свойства.

Распространение ЦС, АцГ, АГ и АИ изучено в более чем 50 видах растений. Обнаружено, что АцГ присутствует у всех изученных растений, что говорит о возможности регуляции ЦС, а следовательно, и ЦТК, на ферментативном уровне. -С помощью разработанных нами методов показано, что АИ присутствует у тех растений, которые способны накапливать аконитовую кислоту. Изучено изменение активностей вышеупомянутых ферментов как при прорастании целого ряда семян растении, так и в ходе их онтогенеза;

Впервые изучены активные центры ЦС, АцГ, АГ и АИ из высших растений. Для ЦС обнаружено, что в каталитическом синтезе UHTpáTa участвуют одна молекула лизина и одна молекула аргинина. На примере АцГ ячменя впервые показано наличие в активном центре фермента одного остатка триптофана. Дня АГ из растений, в отличие от АГ из других источников, показано отсутствие цистеина в активном центре молекулы, а тагске присутствие в нем одной молекулы аргинина. В активном центре АИ обнаружено присутствие одной молекулы гистпдшга.

Впервые для высших растений обнаружено, что при выращивании семян подсолнечника на растворах ацетата и цитрата в его семядолях происходит индуцированный синтез АГ. При выращивании проростков ячменя на растворе транс-аконитата в' них происходит индуцированный синтез фермента АИ. Для АГ показано, что эта индукция происходит в глиоксисомальной и цитоплазматической фракциях клеток. Индуцированный•синтез этих ферментов происходит на 80s рибосомах клетки.

Обнаружено, что при выращивании растений на свету в них происходило снижение активностей АцГ, АГ и АИ по сравнению с темновыми условиями. Для АК найдено, что свет ускорял метаболизм транс-аконитовой кислоты в зеленых проростках кукурузы и тормозил этот процесс з этиолированных проростках, причем действие синего света было более эффектш-нш, чем красного. Длительная гппегеня (до 2 дней) подавляла активность ЦС, АнГ и АГ з сг.стс!п;ях, причем COg-ar.rccnepa оказг-ппла гораздо более доГстзне пг оти "ешепты,

чем атмосфера азота г«хпя.

На основании полученных данных в настоящей работе предложена схема обмена трикарбоновых кислот и ферментов этого метаболизма в растительной клетке.

Рсактическая ценность работы. Полученные в диссертаЦионной работе данные дают нам возможность понять, как организован обмен трикарбоновых кислот.как в целой растительной клетке, так и в ее компартментах. Результаты намих исследований позволяют объяснить процессы метаболизма транс-аконитата и ' оксицитрата в растениях. Полученные результаты указывают на тесную взаимосвязь ЦС и АцГ в растениях, что имеет большое значение'для регуляции" ЦТК в растениях.

Открытие нового фермента - -ОД имеет очень большое значение для.объяснения некоторых сторон обмена оксицитрата в природе. Разработан способ определения активности этого фермента.

Модифицированы и сделаны пригодными для высших растений методы определения активности АГ и методы специфического проявления изоформ ЦС, АцГ, АГ в гелях, на которые получены 4 рационализаторских предложения. Разработаны два метода определения активности АИ: первый - радиометрический и второй-спектрофотометрический. Разработан способ получения НАДФ-изовдтратдегидрогеназы (НАДФ-ИДГ), на который получено авторское свидетельство (A.c. Н205929, 1986 г.).

.Выявленные в работе закономерности регуляции активности ЦС, .АГ, Aitf1 и АИ-являются теоретической основой для понимания механизмов адаптации растений к различным экологическим факторам* таким как газовый состав атмосферы и освещение. Подучены принципиально новые данные, показывающие возможность индукции з растениях АГ и АИ.

В ходе работы получил дальнейшую разработку метод аффин-но-элюционной хроматографии ферментов, который позволяет получить гомогенные ферменты из растений и с достаточно большим выходом...,'..

Основные положения диссертации, вннооимые на защиту.

1. В растениях, накапливающих транс-аконитовую кислоту, присутствует фермент АИ, участвующий в ее метаболизме, причем этот фермент находится как в цитоплазме, так и в митохондриях.

2. ЦС локализована как и глкокснсо7ах,так. и в митохонд-

риях, а аконитатгидратаза обнаружена кроме того и в цитоплазме. Множественные формы АГ и ЦС в глиоксисомах и митохондриях значительно отличаются по своим свойства!,1.

3. По своему строению активные центры растительных ЦС.АГ и АцГ имеют как определенные сходства с. активными центра',® ферментов из других источников, так и существенные различия.'

4. АцГ растений является мультифункциовальным ферментом, одной из ватаейиях функций которой является ее участие в ре- . гуляции ЦС, а следовательно, и ЦТК.

5. Освещение несколько уменьпает (на 10-207$) активность ферментов АГ, АцГ и АИ и не влияет на активность ЦС, что говорит о достаточно высокой степени функционирования ЦТК на свету.

Апробация работы. Материалы, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, докладывались и обсугдались на Ш Всесоюзном биохимическом съезде (Рига,1974), на 17 Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений (Алма-Ата,1978), на Всесоюзной конференции "Проблемы изучения и использования в народном хозяйстве растений природной флоры (Москва,1979), на П Всесоюзной межуниверситетской конференции молодых ученых (Тбилиси,1980), на У1 Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений (Львов,1960), на УТ Объединенном симпозиуме биохтслических обществ СССР и ГДР (Таллин,1961), на Всесоюзной конференции "Проблемы и пути повышения устойчивости растений к экстремальним условиям среды в свете задач селекции" (Ленинград,1981), на Всесоюзной конференции "Проблемы физиологии и биохимии древесных растений" (Красноярск,1982), на М1 и XIУ конференциях молодых ученых биологического факультета Московского государственного университета (Москва,1982, 1984), на Всесоюзно;'! конференции "Проблемы фотоэнергетики растений и повышение урояайности" (Львов,1984), на 1-ом Всесоюзном совещании "Актуальные-задачи физиологии и биохимии растений в ботанических садах СССР" (Пущино,1984), на У Всесоюзном биохимическом съезде' (!.1оскза,1986), на У1 Всесоюзной кон-фюренции по применению ионообменных материалов в промыщленног-сти и аналитической химии (Воронеж,1986), на .Всесоюзной конференции "Применение биотехнологии в народном хозяйстве" (Уфа, 1987), на УИ делегатском •съезде Всесоюзного' ботанического общества ( Алма-Ата,/ 1988), на-7-ом Ме.гду-

народном конгрессе Европейского общества физиологии растений (Швеция,1990), на УП Всесоюзной конференции по .применению ионообменных материалов в промышленности и аналитической химии (Воронеж,1991), на .111 съезде Всероссийского общества физиологов растений (С.-Петербург,1993).

Публикации. Материалы диссертации изложены в одной монографии и в более 60 экспериментальных работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения,' обзора литературы (68 е.), экспериментальной части.(208 е.), заключения (15 с.)выводов, списка литературы и приложения (54 е.). Диссертация изложена на 403 страницах машинописного текста, включая список литературы, содержащий 93 отечественных и 307 иностранных наименований работ. Работа содержит 38 таблиц, 5 схем и 53 рисунка в тексте и 21 таблицу и 24 рисунка в приложении. .

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы исследования

Объект исследования. Основными объектами натшх исследований СЛУЖИЛИ следующие растения: кукуруза.( Zea mays l. ) С.Воронежская 76, ячмень ( Hordeum sativum L, ) С.НОСОВСКИЙ 6, подсолнечник (Helianthus annuus L. ) С.ПврвДОВИК, ГСрОХ ( RLsurn sativum L. ) С.РаМОНСКИЙ 77, Кенаф ( Hibiscus canna-binué l. ). Кроме этих объектов в разных опытах мы использовали и другие виды растений (более 70 видов).

•Семена растений бшщ получены из Орловской опытной станции, ботанического сада ВГУ и Краснодарского Всесоюзного НИИ масличных культур.

Методы "определения органических киолот. кетокислот. Сахаров и аминокислот в растениях. Для этих целей растения после опытов фиксировали кипящим 961? этанолом и подвергали ра-диохроматографическому анализу. Экстракты фракционировали на ионообменвдках и определяли1 аминокислоты по методу Г.С.Пас-хиной (1964), органические кислоты - по С.В.Солдатенкову и Г.А.Мазуровой (1962), углеводы - по О.А.ПавлиновоЙ (1962) и кетокислоти - .по А.А.Землянухину и А.М.Макееву (1970).

- 6-*4С-транс-аконитовую кислоту синтезировали из 6-^С-лимонной кислоты го методу В.Брюса (1949), а 6-^С-цис-ако-нитовую ira слоту - по методу В.Умбрейта (1951). Радиоактивность образцов просчитывали с помощью установки УМФ—1500

или сцинтилляционного счетчика СБС-2.

Определение активности с&ерментов. Для определения активности АГ использовали спектрофотометрический метод Бэкона (Bacon ,1959). Активность АцГ и ЦС определяли различим® методами в зависимости от условий эксперимента и целей ис- > следования (srere ,1976; а-ass et аЗ,1980) • Активность АИ определяли методом Клинмана И Роуза ( Kllnman, Rose; 1971 ).

Нами были ррзргботаны несколько методов для определения активности ферментов. Для определения АГ в растениях был разработан способ определения ее активности, используя дополнительный фермент НАДФ+-ИДГ. Два новых метода были разрабо- • таны для определения активности АИ. Первый метод основан на учете выделяющейся 14С02 при.введении в интактнке ткани растений 6-^С-транс-аконитата. Второй метод, спектрофотометрический, основан на использовании двух дополнительных ферментов - АГ и НАДФ+-ИДГ (АГ выделяли из щитка кукурузы). Второй метод является более быстрым и специфичным по сравнению с первым методом.. Для определения активности ОД мы применили дополнительный фермент - НАД^-глутаматдегидрогеназу.

Определение белка. Содержанке белка определяли по методу Лоури И соавторов ( Loury et al, 1951 ).

Разделение клеточных органелл. Эту работу проводили методом дифференциального изоплотностного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы в течение 4-5 часов при 24000 об/мин на ультрацентрифуге УЦПЗ-47, ротор РКС-25.

Выращивание бактерий p. Micrococcus Бактерии, выделенные нами из почвы, обладали способностью расти на оксицитра-те. Среда выращивания имела следующий состав: оксицитрат 10 ммоль/л, Mgso^ б ммоль/л, К2НР04 1,5 ммоль/л, (нн^^о^ -10 ммоль/л, CaCIg 0,04 ммоль/л. Бактерии росли в колбах в термостате при +27° в течение двух суток, затем собирались и разрушались на установке УЗДН-2Т в течение 2 мин с интенсивностью 22 кГц.

Очистка Ферментов. Выделение и очистку АцГ проводили, используя фракционирование сульоатом аммония, ионообменную и аффинно-элюционную хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-фильтрацию на сефадексах Г-25 и Г-150. Гомогенный препарат АцГ из ячменя получили путем экстракции Фермента из гелей методом обратного -электрофореза ( Braatz, Ilclntire, 1977 ).

■Разделение изоформ АцГ из катрйна провидшли используя градиентную элюцию трио-буфером с ДЭАЭ-целлзолозы.

Выделение и очистку ЦС осуществляли с использованием субклеточного фракционирования, аффинно-элюционной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-фильтрации на сефадексах Г-25 и Г-150.

Для выделения АГ из растений использовали фракционирование сульфатом аммония, гель-хроматографию на сефадексе Г-25, вторичное высаливание сульфатом аммония и хроматографию на сефадексах Г-100 и Г-150. При очистке АГ из кенафа и щитка кукурузы применяли вместо вторичного^высаливания сульфатом аммония аффинно-элюционную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе.

Выделение и очистку АИ из колеоптилей кукурузы осуществляли путем высаливания сульфатом аммония, аффинно-элюционной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-хроматографии на сефадексах Г-25 и Г-100.

При очистке ОД из бесклеточного супернатанта высаливали этот ферлент сульфатом аммония и затем обессоливали его на сефадексе Г-25. Далее цроводили ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, используя ступенчатый градиент трис-<3у-фера и гель-хроматографию на сефадексе Г-100.

Определение молекулярной массы Ферментов. Для определения молекулярной массы ферментов использовали метод гель-фильтрации на сефадексах Г-100 и Г-150 (Детерлан,1970).Также применяли гель-электрофорез в присутствии додецил-сульфата ,

НатрИЯ ( Laemmly, 19?0 ).

Изучение множественных молекулярных Фода ферментов (ШФФ) и определение степени чистоты (Ьермонтннх препаратов. Электро-форетические исследования проводили по методу Дэвиса ( Davis, 196k )•' Специфическое' проявление форм АГ после гель-электрофореза. осуществляли модифицированным нами тетразолиевым методом при использовании субстрата цис-аконитата и вакууминфиль-трации. Специфическое окрашивание АцГ и ЦС осуществляли модифицированным нами методом Волка и соавт. ( Volk et ai, 1971t ) в системе геля с линейно меняющейся концентрацией ак-рнламидной смеси от 2 до 15% с помощью реакции образования медно-ферроцианидного осадка при сульфгидрильном окислении феррИ151Ш1ИДа ( Trelease et al, 1974 ).

Определение продукта реакции, катализируемой Аг'Л и синтез ацетил-КоА. Для определения продукта реакции, .катализируемой АцГ (из проростков ячменя), использовали радиоизотопный метод (ñ-ass et ai.,1980), основанный на известной низкой экстрактивности уксусной кислоты.серным эфиром из водных смесей по сравнению с другими кислотами. Синтез ацетил-КоА проводили по методу Симона и Шемина (simón, shemin, 1953 ) из кофермента А и уксусного ангидрида.

Идентификация' йункциональных групп активного центра Ферментов. Для изучения роли остатков гистлдинав молекулах ферментов ИСПОЛЬЗОВалИ ДИЗТИЛПЯрОКарбОнат (Fan et ál., 1977 ), . для аргинина - диацетил (Borders et al.,1978-) ,для серина- фе-нилметилсульфонилфторид (chatonnet, 1985 ), для триптофана -н-бромсукцшпшид ( i« et ai.,198I ), для тирозина - тетрани-трометан (Caruso et ai.,1987 ), для лизина - пиридоксаль-5'-фосфат ( Beec-kraana, 1981* ), для SH-.групп 0CT3TK0B ЦИСТеИНЭ -п-ЗШБ (Торчинский,1977). Количество остатков аминокислот в активном центре рассчитывали по методу Майлза ( mies,1978 ). Константы ионизации субстрат-сзязтающих, групп в молекулах определяли по методу Диксона (1962).

Статистическая обработка результатов. Все опыты проводили не менее 3-4 раз, причем аналитические определения для ка-кдой пробы выполняли в трех повторностях. В таблицах и на рисунках показаны данные типичных опытов, причем каждое значение есть среднее из трех определений. При математической обработке использовали критерий Стьюдента. Определение констант Михаэлиса, ингибирования и расчет термодинамических параметров осуществляли с использованием программ линейной аппроксимации по методу наименьших квадратов. Расчет коэффициента Хилла и рРС ионизационных групп осуществляли по Диксону и Уэббу (1982).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ I. Очистка цитратсннтазн (Kf¿ 4.1.3.7), ацетпл-КоА-гидро-лазн (К*> 3.1,2.1)., аконптатглдратазц (КФ 4.2.1.3)^.аконитат-изомеразн (КФ 5.3.3.7)__из_рас1тений_и оксицитратдегидратазы (декарбоксилирудией) из бактерий.

Долгое время считалось, что ЦС в растениях присутствует только в митохондриях. Однако после открытия глиоксилатного цикла било обнаружено, что в нем потптгтает'участие ЦС, кото-

Q

рая отличается по своим свойствам от митохондриалъного фермента.

До начала наших исследований ЦС была получена в гомогенном состоянии только из семядолей огурца ( каивг въ а!, 1979) и в частично очищенном - из ряда других растений.Наши предварительные результаты показали наличие высокой активности ЦС в семядолях кенафа, конопли и подсолнечника, что и явилось причиной использования этих растительных объектов для выделения ЦС-аз и изучения их свойств.

Данные по очистке ЦС из 3-дневных этиолированных семядолей кенафа представлены в табл.1. Разработанная схема очист-

Таблица I

■ Очистка дитратсинтазы из семядолей кенафа

Стадия : ¡Объем:количе ст-: :фрак-:во белка,: :ции, : мг : : мл : : Активность, ФЕ :Удельная активность : ФЕ/мг :Степень : очистки

Гомогенат* 135 6000,75+ 164,23" 44,45± I ¡23 0,007+ 0,001" (I)

Фракция ми1фочастиц 10,3 65,20+ 1,96" 6,33+ оит 0,097+ 0,003" 13,1

Обессоливание на сефадексе Г-25 30,0 74,13+' 2,11" 11,10+ о|зг 0,149+ 0,005" 20,2

Хроматография на ДЭАЭ.-целлюлоз е:

I пик 90,0 0,116+ . 0,003" 5,50+0,14" 47,41+ 1,ЗТ 6400,7

• П пик 25,5 0,205+ 0)007~ 1,00+ 0,03" 4,88^ 0,18 658,9

Гель-фильтрация на сефадсксе Г-150:

I пик 2Д 0,012+ 0,001" 1,52+ 126,67+ 0,04" 3,73" 17101,4

П пик , 2,3 0.003 0,24± 0,02 10,43+ О.ЗГ 1408,1

* Для выделения использовано около 40 г семядолей.

ки позволила получить два пика активности фермента - ЦС I и ЦС 2. Препарат ЦС I имел удельную активность 126,7 ФЕ/мг белка (гомогенный фермент), и ЦС 2 - 10,4 ФЕ/мг белка.

ЦС из этиолированных семядолей конопли была частично очищена путем выделения митохондрий и глиоксисом в градиенте плотности сахарозы. Также была получена в частично очищенном

состоянии ЦС из этиолированных семядолей подсолнечника.

В ходе наших исследований по изучению ЦС расте'.гай мы обнаружили, что атому ферменту всегда сопутствовала ацетшг-КоА-гидролазная активность. Наибольшая активность АцГ была найдена нами в ячмене, который и послужил основным объектом для очистки и изучения свойств этого фермента.

Наши исследования позволили разработать методику получения гомогенного препарата АцГ из этиолированных листьев ячменя (табл.2). В результате был очищен фермент в 1602 раза и по-

Таблица 2

Очистка ацетил-КоА-гидролазы' из проростков ячменя

Степень

Стадия :фрак-:ции, : мл во белка, мг :ность, : ФЕ актив-:ность, ФЕ/мг ОЧИСТКИ

Гомогенат 930 4390,0+ 122,Т 659,5+ ■18,6" 0,150+ 0,005" (I)

Осаэдение 60-85$ насыщения 7,1 • 320,9+ 9,6" 395,2+ 10.Т 1,232+ 0,034" 3,2

Обессоливание на сефадексе Г-25 34 270,е+ &;т- 353,5+ 9\Т 1,303+ 0,035" 8,7

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе ДЕ-32 33,5 3,39+ 0,10" 276,5+ 9,8" 81,323+ 2,381" 542,0

Гель-йильтрация на сефадексе Г-150 1,8 0,231+ 0.006" 55.5+ 240,304+ 1.56" 7.13 ~ 1602,0

лучен препарат АцГ с удельной активность 240,3 ФЕ/мг белка. Электрофорез в ПААГ показал наличие двух полос белка ( Rf 0,30 и 0,41), обладающих ацетил-КоА-гидролазной активностью, т.е. данный препарат АцГ состоит из двух различных 1.ТМФФ. Дальнейшая элюция быстрой электрофсретической фракции АцГ из гелей (с помощью обратного электрофореза) позволила изучить ее свойства.

Вторым объектом для выделения и изучения АцГ был катран абиссинский, из которого мы получили два пика активности АцГ, причем обе АцГ не были гомогенными. АцГ мы такяо очистили и из 2-дневных этиолированных семядолей тшшы.

При действии ЦС образуется цитрат, который панее исполь- ' зуется АГ-ой. Несмотря на большую изученность АГ из животных тканей И микроорганизмов ( Gluskcr, I97I; Suzuki et al, 1975 ), для растеши"! этот фермент оставался практически но изученным. Существовала только очна работа ( i^im^r, 1964 ), в которой

была осуществлена частичная очистка АГ но листьев горчшш.Все это и побудило нас заняться изучением АГ.

В результате исследований мы разработали различные способы получения гомогенных АГ-из высших растений. Первый из этих способов включал в себя применение двух сейадексов:Г-ЮО и Г-150. Этим методом наш была получена гомогенная АГ из этиолированных семядолей подсолнечника, из зеленых листьев гороха, щитка кукурузы и колеоптилей кукурузы. Специфическое проявление АГ в гелях после электрофореза показало, что в препаратах АГ из кукурузы и подсолнечника присутствуют по две множественные молекулярные формы этого фермента, а в горохе -одна форма. Для очистки АГ из семядолей кенафа и из щитка кукурузы нами бил использован метод аффинно-элюционной хроматографии. Гомогенный препарат АГ из кенафа состоял из двух электроморф, а из щитка - из одной.

Данные по очистке АГ из этиолированных семядолей подсолнечника представлены в табл.3. В результате очистки был получен гомогенный фермент с удельной активностью 4,69 ФЕ/мг белка и очисткой фермента в 70 раз.

Таблица 3.

Очистка аконитатгидратазы из этиолированных семядолей подсолнечника

Объ ем,?Котчаст-: Актив-: Удель- Г Степень мл :во белка,:ность,:ная ак- :очистки

: мг : ФЕ :тивность; __:_: ФЕ/мг :_

Стадия

Гомогенат

300

Насыщение сульфатом 15 аммония 50-70%.

Гель-фильтрация на 30 сефадексе Г-25

Насыщение 2,5

50-70% после обес-соливания

Гель-фильтрация На сефадексе: .

Г-100 2,4

Г-150 1,0

2798+ 173 284± 172 230+

га,

34,1+

•1:5-

195,4+ 7,1

117,3+ 4,4". 120+ ' 078 24,7+

о;ш

4,65+ ' 0.1СГ

0,388+ 0.010"

10,9+

о:ш

1,9+ 0.05

0,069+ 0,002"

0,41+ 0,01"

0,52+ 0|01~

0,72± 0,02

2,24+ 0,03"

4,89+ ,0,02';

I ' 5,95 7,5 • 10,3 '

33 70

Фермент АГ превращает некоторых бактериях рядом

цитрат в изоцитрат и цис-аконитат.В исследователей был обнаружен фер-

мент АИ, осуществляющий взаимопреврацение цис-аконитата (ЦАЕО и транс-акбнитата (ТАК)( Rao, Aitekar,i96l ). Также имелись данные, что во многих растениях аконитовая кислота накапливается в значительных количествах ( Bush, i960 ), Именно поэтому было предположено, что в этих растениях присутствует фертент • АИ, однако обнаружить его в растениях тогда не удалось ( мае

Lennan, Beevers, I964 ).

В ходе напих исследований по изучению обмена 6-^С-ЦАК и 6-14С-ТАК в растениях нагл удалось разработать методы определения, активности АИ в растениях, что позволило разработать способ очистки АИ из этиолированных колеоптилей кукурузы. АИ была очищена в 50 раз и получен фермент с ~ 90% чистотой.

.Большой интерес представляло изучение обмена оксплимонной кислоты в живых организмах. Эта кислота встречается в больших количествах у различных представителен рода Hibiscus (до на сухой вес) И в плодах рода Garcinia (до 30$ на сухой вес). Оксилимонная кислота из этих объектов представлена различными СТереОИЗОМера'ЛИ ( Lewis, Neelakantan, 1964 ).

Pao и Рамакрипна на основании своих опнтов с бактериями предположили, что при их выращивании на среде с (-)-оксицитра-том (из плодов гзрщшии), в них индуцируется фермент НАДЗ+-ок-сицитратдегидрогенапа ( Нао, Ramakrlshnan, I966 ).С.Н. [.''дпаровым л С.В.Солдатенковнм в 1970-72 гг. был изучен обмен (+)-алло-оксицитрата (из кенафа) в различных растешшх. Они предположили, что блияайшпл предшественником этой кислоты является ЦАК. Однако следует оплетать, что все эти работы не получили дальне ших. подтверхтений..

В начале наших исследованиЛ мы попытались обнаружить в кенафе фермент, осуществляющий метаболизм оксицитрата в этом растении. Однако эти попытки были безуспешными. Тогда мы выделили из почзн бактерии рода ra.crococcus , способные расти на (+)-алло-окс1;,1.-1?Р"те, с которыми били проведены дачънпйкйе исследования.. Опптн показ пли, что з этих бактериях- индуцируется ?ерг:ект, осуществляет:,ий цреэрздение оксицитрата в 2-оксоглута-; рат. Используя дополнительный -'г]иент глутаматдегпдрогеназу мы пазработали метод определения активности этого пгриента, наз-' ванного нами оксиП!1трэтдегидра?:-,:'оЩдскарбо:х!1л:ш}теей) осуществили частичную его очистку из бактерий и показали его присутствие в растениях. . - .

2. Четвертичные структуры и молекуллдные массы Ферментов.

Структура ферментов была изучена на очищенных препаратах.

Определение молекулярных масс цитратсинтаз из растений показало (табл.4), что все они.принадлежат к "малому"типу'фермен-та, присутствующего у :всех эукариотических организмов. Моле-

Таблица 4.

Молекулярные массы цитратсинтазы из разных объектов

Объект ■ Молекулярная масса Кенаго

" ЦС -I 55000 + 3000

ЦС 2 ' 74000 + 2000

Конопля

глиоксиссмы 88000 + 3000

митохондрии 88000 + 3000

Подсолнечник___100000 + 4000_:

кулярные массы отдельных форм цитратсинтаз кенафа различаются мевду собой, что, скорее всего, говорит об их разном (ми-тохондриальном и глиоксисомальном) происхождении. В то же время молекулярные массы цитратсинтаз из митохондрий и гли-оксисом конопли оказались одинаковыми.

Молекулярные массы АцГ ячменя оказались равны 45 и 65кДа, причем каждая из множественных молекулярных форм гаерлента состоит из одно]"; субъединицы. Молекулярные массы АцГ I, АцГ 2 из катрана и АцГ из тыквы равны 32, 74 и 150 кДа, в то же время субъединичное строение этих ферментов остается неясным.

В отличие от предыдущих ферментов молекулярные массы АГ из различных источников оказались очень; близкими мевду собой и лежат в пределах 104-108 кДа. Лишь АГ из кенафа имеет несколько меньшую молекулярную массу - 93' кДа. Определение молекулярной массы АГ при электрофорезе по методу Лэьади показало, что растительная ЛГ но имеет субъединичное строение. _

!,Молекулярная масса АИ из кукурузы равна 80 кДа. Молеку-. лярная масса ОД из бактерий равна 112 кДа.

3. Физико-химические и кинетические характеристики Фер-ментол.

Практически все изученные ферменты (кроме АцГ из катрана) обнаруживают гиперболическую зависимость скорости реакции от концентрации субстратов. ^ по оксалоацетату для ЦС I и ЦС 2 близки и равны 2,Г> и 2,3 мкМ, соответственно, а по ацстал-КоА для ЦС 2 (140 Ш'М) оказалась в 3,5 р\:*а выше

для ЦС I (40 мкШ. Сродство для ЦС из конопли оказалось в основном ниже, чем у фермента кенафа: Ку по оксалоацетату и ацетил-КоА для глиоксисом равны, соответственно, 45 и.59 мкМ, а для ЦС митохондрий - 33 и 48 мкМ. Для ЦС подсолнечника ^ по оксалоацетату и ацетил-КоЛ равны 40 и 114 мкН, соответст- . венно. Полученные данные подтверждают вывод о действии тройного фермент-субстратного комплекса, в котором оксалоацетат Присоединяется первым ( Л>}1апзоп, ^¿егвоп, 1974 ).

^ для АцГ из ячменя равна 37 мкМ. Что же касается катрана, то здесь зависимость активности АцГ I от концентрации субстрата Алеет более сложную кривую (рис.1); в этом случае проявляются смешанные кооперативные свойства, при этом АТФ • является ингибитором АцГ I, необратимо взаимодействуя с субстрат см.

фнкН/мь-т not

CM

qui

У

s

Г

Л"

У

м

и

J

'Г-'

/

у

г

и

ю

to to м

Рис.1. Зависимость активности AixT- I из семядолей катрана от концентрации ацетил-КоА без (I). и в присутствии (2) . I мМ АТФ.

Определение К,, и Уиах'для АГ по га зало (табл.5), что хотя эти величины п несколько отличаются друг от друга для разных • культур, они являются величинами одного порядка. Общим1 свойством всех АГ япляется то', "что наибольшим сродством этот фермент обладает к UAKj меньшим- к изоцитрату, епе меньшим - к- цитрату. ;

Для AH Kv равна по ЦАК I,3 i.ii, а для'ОД К^ по оксицитрату'• равна 0,35 t.i.i. <'. '. . .

1!сследова1шя .влийния- температуры на ЦС Г.кенафа: показало, что максимальная' актяппост^ этого 'фермента наблюдается при 51°С. Температурный оптимум активности АгСГ.'Ячгжпя 'составляет 49-51°,' причем линия зависимости актдгшости-фермента, от температуры в координатах Ap'peHiiyca inpcT- точку'йг.р'егиба. Это. Г

- -

Таблица 5.

Значения К^, и у[лах для АГ, очищенной из некоторых растений

той использовании -различных субстратов.__

Цитрат ; Изоцитрат • \ ЦАК

Субстрат

га 1 и V мМ ' 10,00 ± 0,20 .2,60 + 0,10 Не опр.

умах> мкМ/мин* мг белка 4,11 + 0,12 6,45 + 0,20 Не опр.

¿¿¿к о о о) р кокк 12,61 + 0,48 1,93 + 0,04 0,95 + 0,05

Умах • 4.94 * 0.20 , 10.42 ± 0.040 18,42 ± 2.41

К о Л о [-1 «м 5,55 + 0,12 1,65 £ 0,12 0,75 + 0,06

V мах 4.95 ± 0.19 7.68 ± 0.30 9.54 ± 0.30

Циток кукурузы «м " 10,00 0,14 1.85 ± 0,01 0.71 ± 0.03

умах 5,01 + 0,11 7,10 ± 0.20 16,21 + 0,29

1 >н< Ф и М В 6.41 ± 0.19 1.31 ± 0.40 Не опр.

Умах 4,32 ± 0,12 7,36 + 0,21 Не опр.

говорит о возможности существования фермента в двух формах, обладающих различной энергией активации (рис.2).

и 1Р

йб <1* V-

Рис

г ■

4> а

Г

/

/

/

1.0

06

О.к

Ю 20 30 40 £0 60 ¿X. '30 32 34 35 ({/тМогК

2. Влияние температуры на активность ацетил-КоА-гидролазы из ячменя, выделанной при помощи обратного электрофореза. А - прямая зависимость, Б - логарифмическая зависимость от обратной величины абсолютной температуры (20-450С).

Изучение влияния температуры на активность АГ показало, что температурный оптимум АГ из исследуемых 'растений находится при 45-47°,' а энергия активации лелшт в пределах 28-32 кДж•моль-*•град-*.

Для ЦС, АцГ и ОД нами была изучена специфичность действия. Так, ЦС I кенафа является высокоспецифичным ферментом' по отношению к ацетил-КоА, т.к. при увеличении длины углеродной цепи ацил-производных КоА скорость реакции, катализируемой ЦС, резко снижается до 0. Изучение специфичности АцГ ячменя и катрана показало, что эти ферменты такяе обладают высокой специфичностью по отношении к ацетил-КоА, что отличает их от. АцГ из митохондрий шпината И гороха { Liedvogel, 1968;

Stumpf, 1988 ).

Опыты по изучению специфичности ОД показал, что этот фермент не действует на ЦАК,.ТАК, изоцитрат и цитрат.

4. Регуляция активности исследованных ферментов.

а) Метаболитная регуляция.

ЦС является первым ферментом ЦТК и глиоксилатного цикла. Считается, что именно этот фермент является регулятором действия всего ЦТК. 3 регуляции активности ЦС обычно выделяют 3 ступени, связанные с Функционированием этих циклов:1) энергетическая (влияние аденилатов), 2) окислительная (влияние никотинамидных нуклеотидов) и 3) влияние интормедматов циклов.

Налги исследования показали, что АТФ является ингибитором ЦС I кенафа, причем это действие было конкурентны,! по отношению к ацетил-КоА и бесконкурентнш по отношению к оксалоаце-тату (рис.3). Ингибирования аденнлатами (3 t.fvl) уменьшалось ' для ЦС I кенафа в следующем порядке: АТФ>АДЗ> АИФ (48, 19 и $%, соответственно). ЦС 2 обладала примерно такой же чувствительностью к ATO. На ЦС из глиоксисом конопли АТФ оказала слабое действие, в то время как ЦС из митохондрий конопли сильно ингибировалась АТФ. Фермент из сег.этдолей подсолнечника при действии 1,5 i.i.l АТФ снижал свою активность на 28°í.

Действие НАДН является таксономическим признаком, отличающим ЦС грам-полохительных бактерий и эукариот от фермента грам-отрицательных бактерий, который шггибируется' этим нукле-отидом. Однако наши исследования обнаружили, что 3 Ш НАДН ингибирует ЦС из митохондрий конопли и ЦС I кенафа на 36 и

20. -^ /

hln -K»

Qi 4i <lt '. в ÜS 4,0 i,0 3.0

А/оклятчгтлйниН' [ifr<f>]nM

Еис.З. Влияние АТФ на активность ЦС I из семядолей кенафа. А - концентрация апетил-КоА 60 Midi; Т- активность 0еэ АТФ, 2 - 0,5 ш AT®, 3 - 1,0 tfj АТФ, 4 - 3,0 Ш АШ Б - концентрация оксалоацетата 1,3 ш; 1-60 мкМ ацетил-КоА, % - 48 шШ, 3 - 36 мкй.

соответственно. Нами впервые показано для растений, что НАДФН является довольно силыщм ингибитором фермента,снижая в концентрации 3 мМ активность на 21, 53, 53 и 59$ в препаратах ЦС I и ЦС 2 кенафа и глиоксисом и митохондрий конопли. Действие НАДФН на ЦС I является -конкурентным по отношению _к ацетил-КоА; вызывая, видимо, при' низких концентрациях последнего явление коопвративности.

. На АцГ ячменя аденилаты и нуклеотиды не действовали.АТФ ингйбирует активность АцГ I и. активирует АцГ 2 из катрана, а АДФ и АЧФ ингибирует активность АцГ 2. На АцГ 2 нихотнн-амидные нуклеотиды не действуют, однако АцГ1 ингибируется ими, причем степень ингибированяя увеличивалась в следующем порядке: НАДФН<НАД1 <НАД Ш, 4? и 50# ингибирования, соответственно). На другие исблсдованные ферменты аденилаты и нуклеотиды не оказали никакого влияния.

. Изучение влияния различных иктермедиатов показало, что некоторые органические кислоты (малонат, фумарат и изоцит-рат) оказались слабыми ингибиторами ЦС. АцГ из ячменя.слабо ингибировзлась цитратом. АцГ I -из катрана значительно подавлялась различии® органическими кислотами, тогда как АцГ 2 оказалась устойчивой к их действию. . ' •'.'

Для АГ большой интерес вызывало изучение влияния ТАК на

активность AT, т.к. эта кислота накапливается в различных растениях в больших количествах ( stout et ai, 196? ). Наши исследования показали (табл.6), что растительная АГ по сравнению с АГ из животных тканей значительно, более устойчива к действию ТАК, особенно при использовании субстрата ЦАК.

. Таблица 6.

Значения константы ингибирования транс-аконитовой кис__ лотой аконитазы из растений___■ _

Объект,из которого'Константа ингибирования в Их 'id-4 выделена акоттаза;Г^споль-зУе,ыд;сетонитат

Кукуруза- 3,00 + 0,05 60 + 0,9

Горох 2,10 + 0,03 68 + 1,0

Фасоль 1,92 ± 0,02 80 + 1,5

Гомогенный препа- 5,00 + 0,01 24 + О,В •

рат АГ иэ гороха____;___~_

Также как и АГ из животных тканей, растительная АГ ин-гибировадась по конкурентному типу. Устойчивость растительной АГ к ТАК в. значительной степени объясняет возможность' ■ ■ • накоплегая ТАК в растениях.

Другие органические кислоты - оксалоацетат, оксаломалат, 2-оксоглутарат и глиоксилат та^.е оказались ингибиторами АГ, Нами было обнаружено, что малат является конкурентным ингибитором АГ с ^ равной 1-1,5-Ш.

б) Регуляция активности исследованных ферментов на генетическом уровне.

• Для понимания механизмов действия ферментов является очень ватакм изучение вопроса о возможности их индуцированного синтеза в растениях. Этот вопрос нами был проработан для всех изученных ¡ферментов (кроме ОД),. При выращивании семян различных видов на растворах ТАК (0,05$) на свету бшго обнаружено,"что из всех изученных растений только у ячменя (в.корнях и надземной части) произошло увеличение активности АИ (активность АИ определялась радиометрическим методом).

Далее нами было изучено влияние света на активность АИ з проростках ячменя. В первом опыте наклюнувшиеся семена выращивали на растворе ТАК (0,1$) л темноте. Результаты показали, что в надземной части проростков ячменя не происходило возрастание активности АИ, в то время как в корнях активность АИ возросла в 5 раз. Следуюшил опыт, проведенный с освещен-

ними проростками, показал, что на свету в надземной части проростков ячменя происходило возрастание активности АИ,достигавшее своего максимума в 8 час освещения. После цре1фа-щения освещения, за ночь, активность АИ падала до уровня ■ контроля.

В последующем опыте мы изучили влияние циклогексимида на возрастание•активности АИ. Наклюнувшиеся семена ячменя помещали на' раствор ТАК с добавлением циклогексимида (5мкг/ мл) и 1-^С-глицина. Результаты показывают (рис.4), что ци-клогексимид подавляет возрастание активности АИ в надземной части проростков ячменя. Удельная радиоактивность белков 30-50$ сульфата,мониевой фракции (где в основном находится АИ) у растений, выраг.енных на среде с ТАК, была на 20% выше По сравнению с.контролем. Полученные данные свидетельствуют о том, что в проростках ячменя происходил индуцированный синтез АИ, причем этот синтез происходил на 80 2 рибосомах в'цитоплазме.

|

150 § 1

<00 £ I

50 ^

дни

/ Г 2 3 Ч

РесЖ Индукция аконитатизомеразы в надземной част проростков ячмоня: I- контроль, 2- опыт (добавлен индуктор), 3- опыт (индуктор плюс ингибитор). Столбики - удельная радиоактивность фракции белков, содержащих акони-татизоыеразу: а - опыт (добавлен индуктор), б - опыт (индуктор плюс ингибитор).

Индуцированный синтез бия такта обнаружен наш я для АГ. При взращивании' рада семян на средпх, содержащих ацетат или цитрат (0,05/!), в семядолях подсолнечника было обнаружено уэ<мшчсние активности АГ на 94^. Киеяно поэтому дальнейшие ' исследования бича гровояопк с подсолнечником.

При изучении влияния света выяснилось, что в отличие о,от АН, он ингибировал увеличение активности АГ в подсолнечнике, росшем.на ацетате, Далез мы поставили задачу выяснить, является ли возрастание активности АГ в семядолях подсолнечника простой активацией АГ или же синтезом фермента ¿г па*о. Длд выяснения зтого вопроса был проведен опыт, -в котором проклюнувшиеся семена подсолнечника выращивали на следующих средах: I) раствор ацетата (0,05 мг/мл). содержащий 50 мМ С-лэйцина (опыт), и 2) 50 мМ раствор С- лейцина (контроль). После 4-дневного выращивания на этих средах из семядолей подсолнечника - контрольных и опытных проводили одновременную очистку АГ, при этом на разных стадиях очистки определяли удельнухг активность АГ и удельную радиоактивность бедка. Получешке данные показали последовательное повнгакие удельной радиоактивности белка на всех стадиях очистки АГ, причем эта величина была выше в опыте, чем в контроле. Следовательно, возрастание активности АГ в семядолях подсолнечника, выращенного на среде, содержащей ацетат, связано с синтезом фермента ¿а поуо.

3 наших исследованиях было обнаружено, что АГ-в клетках растенил находится в различных компартментах (см,ниже)« В связи с этим определенный интерес вызывало изучение ком.чапг-ментации индукции этого фермента в клетке подсолнечника. Д-л этой цели был повторен вышеупомянутый опыт по индукции АГ и из опытных и контрольных растений было проведено разделение митохондрий и глиоксиоом4 В выделенных компартментах клетки определяли удельную радиоактивность белка- я удельную активность АГ. Результаты этого опыта показали (рис.5), что удельная активность АГ в супернатанте и. глиокслссмах, выделенных из растений, росших на растворе ацетата (с 1^С-лейодном ) , выше, "чем в этих компартментах контроля. В то жа вреда эти величины для фермента из митохондрий опытных и контрольных растений практически не различались. Удельная радиоактивность белка в супернатанте и гллоксисомах опытных растений по сравнении с контрольными растениями была выше в 3 и 5 раз, соответственно. Эти же характеристики для митохондрий в бинте и контроле отличались незначительно.

На основании этих исследований и исследования с применением никлогекспмида и актиномшшна Д иамя был сделан вывод о

Гг г лиски со ны

/ 2

11 Г г»исгсив>шг

/мнтохсндри и

4 а

с^шриопмг

■ Рис.5. Распределение аконитазной активности и радиоактивности белка в компартментах клеток семядолей подсолнечника. I - растения выращивались на 0,05 М растворе

"^С-лейцпна (контроль), 2 - растения выращивались на

растворе ацетата в 0,05 М растворе *4С-лейцина(опыт).

том, что индуцированный синтез АГ происходит в цитоплазме на Б0 о рибосомах.

. 5..Изучение активных центров ферментов. '

Изучение активного центра ЦС I кенафа показало, что в его состав входит один остаток аргинина и один остаток лизина (на одну'субъединицу молекулы). В активном центре'АцГ ячменя, вероятно, находится опна молекула триптофана. Наши данные также показали отсутствие 'В активном центре этого фермента цистеина, что,значительно отличает растительную АцГ от АцГ из печени крыс, а состав активного центра которой входит цистеин ( Накап1вЬ1 ег а1, 1989 . •■)..

Изучение активного центра АГ показало, что в. его состав, входит окна'молекула аргинина, что сходно со строением активного центра АГ из других источников. В то.же время, в отли- ' ;чие от АГ из" животных тканей, в растительной'АГ отсутствует в активном центре цистсип.

Особый интерес представляло изучение влияния ионов Ге2+ и цистеина на растительную АГ р связи. с тем, что з активном центра АГ из животных .тканей находится ь'е2+ и • (?<>р;лент акта-.

вируется этими ионами. Наши исследования показали, что для всех изученных АГ не происходила активация фермента ионами ге ^. Совокупность всех наггих данных говорит о существенном отличии механизма действия растительной АГ от фермента из других источников.

В активном центре АИ нами обнаружено присутствие одной молекулы гистидина.

6. Распространение, множественные молекулярные|формы и субклеточная локализация ЦС, АцГ, АИ и АГ в растениях.

В начале наших исследований было изучено распространение ЦС, АцГ, АГ и АИ в растениях. Для ЦС, АцГ и АГ нами обнаружено, что эти ферменты присутствуют как в сухих семенах,так и в различных органах растений. При прорастании семян динамика изменения активности ЦС и АГ имеет сходную картину. Так, в первые 3-5 дней прорастания наблюдается значительное увеличешю активности этих ферментов (в 5-12 раз), а в последующие дни она значительно снижается. .

В отличие от ЦС и АГ активность АцГ при прорастании семян изменяется по-разному. При этом пик активности этого фермента или не выражен, или бывает на 3-4 день прорастания.

Активность АИ мы определяли используя разработанный нами радиометрический метод определения активности этого фермента. Результаты этих опытов показали, что АИ присутствует в тех растениях, в которых накапливается аконитовая кислота.

■ Однако в 19Ы году вышла работа Брауэра и Тила, в которой они сообщили об'открытии нового фермента в кукурузе -цитратдегипразн (ГД), который осуществлял взаимопревращение цитрата и ТАК. Само присутствие фермента АИ в растениях было поставлено этими авторами под сомнение. Для разрещения вопроса нами был разработан новый, спектрофотометрический метод определения активности АИ с использованием двух дополнительных ферментов - АГ и НАДФ+-ИДГ. Используя данный метод была определена активность АИ в различных растениях.Эти измерения показали результаты, сходные с определением активности АИ радиометрическим метопом. При сравнении активностей АЛ и ЦД в кукурузе было обнаружено, что активность АИ в ней была более чем п 500 раз выче активности ЦД, что сеид-дотельстьует об основной роли АИ в метаболизме ТАК в кукурузе.

Вопрос о существований множественных молекулярных форм ЦС и АГ ранее практически не изучался, и поэтому цредстав-лял несомненный интерес. Изучение этого вопроса для ЦС показало, что в кенафе присутствуют 3 множественные молекулярные формы этого фермента; в семядолях конопли и щитке кукурузы - 2, а в остальных исследованных растениях - по одной форме.

Данные по изучению множественных форм АГ в растениях показали (рис.6), что в большинстве исследованных растений АГ представлена несколькими ШФФ с различной электрофорети-ческол подвижностью.

цо ог н

Не

о,» ' <0

/ей

клещеёина.

огу/>ча

9,0

0.1

ач • *

ее 6.

<й !

и

/ X } Ч 9 « ь*дсоАнеч ник

1 Л 3 1

1 Я 3 V Кенар

а(ёс пи

Л 3

4 1 г </ (6

< г- з с

г 3 ¥ 5

1X3

12 3

'Рис.6. Схема электро?оротических спектров аконитазы в разных органах растеши;: I - семена, 2 - корни, 3 - этиолированные листья, 4 - зеленые листья,5- цзетки.б- семядоли. .

Как уже отмечалось, в растительно!: метке ЦС обнаруживается в двух компартментах - в митохондриях и цитоплазме. Что же капается АцГ, то таких данных об этом ферменте практически не бь'-ло. Каш результаты изучения внутриклеточной локализации АцГ показали, что основная ее часть находится в цитоплазме, в суммарной фракции мптохонг.рпй и хжоксясом обнаруживаются 4-15$ активности. Одновременное определение актиэ-ности ЦС и АцГ в. суммарной фракции митохондрии и глиоксисом показало, что их о.тнопения гглгатся различите. для разных растений (присутствие АцГ в гл:ю;:спсомах растсшн: нам не удалось обнаружить). Ста данные покагц^ают, что активность

ЦС в митохондриях растений может регулироваться функционированием АцГ.

Изучение субклеточной локализации АГ в растительной клетке показало, что основная часть активности этого фермента (SO—955?) находится в цитоплазме, небольшая часть активности обнаруживается в митохондриях и глиоксисомах. Исследование свойств различно локализованных форм АГ выявило, что эти АГ имеют как определенное сходство, так и различия. Например, в цитоплазме и глиоксисомах у растений обнаруживается по одной форме АГ с одинаковой электрофоретической подвижностью, АГ из митохондрий растений представлены множественными' формами, отличающимися по электрофоретической подвижности от вышеупомянутых АГ. Кроме того, нами обнаружено, что в то время как АГ из цитоплазмы и глиоксисом обладают сходными физико-химическими- и каталитическими свойствами, АГ из митохогарии отличается по целому ряду свойств от АГ из вышеуказанных компартментов.

7. Влияние света и газового состава среды на активность . ЦС, АцГ и АГ в растениях. ,

В наших исследованиях изучалось и Елняние света активность ферментов. При действии света на активность ЦС выяснилось, что у кукурузы свет практически не влиял на активность фермента из листьев проростков, а активность ЦС в зеленых листьях была даже выше его активности в этиолированных листьях. Идя других растений была обнаружена сходная картина.

Для АцГ было показано, что в ячмене и катране в этиолированных проростках активность была выше, чем в зеленых, на 50 и 30%, соответственно.

Очень близким было действие света на активность АГ а АИ в растениях. Результаты исследований показали, что для зеленых растений характерна более низкая активность этих ферментов (на 20-30$) по сравнению с этиолированными растениями.

Результаты наших исследований з основном подтв'ер:кдают данные других авторов о том, что ЦТК интенсивно функционирует не только в темноте, но и на свету (Зерхотурова,19БЗ;Ма-мушина и др.,1991).

Другой частью работа было изучение влияния газового состава среды на активность изученных ферментов. Для АГ, ЦС а АцГ наши результаты показали, что двухсуточное пребывание

исследованных растений в атмосфере Не и и2 привело к небольшому уменычению рх активности, в то время как в атмосфере С02 активность ферментов заметно упала.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ташл образом, нашими исследованиями показана не только различная компартментагмя изученных ферментов в растительной клетке, но. и то, что они являются множествеиными молекулярными формами. А для таких ферментов, как ЦС, АГ и АцГ эти различия столь сущеггвенны, что можно предположить, что выявленные множественные формы являются изоферлентами, т.е. кодируются- различными генагли. Одновременно наш данные показывают, что ферменты трикарбоновых кислот, участвующие в анаболических реакциях, пространственно разобщены от ферментов ЦТК, И находятся в цитоплазме. Ферменты же ЦТК преимущественно выполняют энергетические функции. Именно участие изоферментов в различных процессах и обуславливает разницу их свойств.

Реакция, катализируемая ферментом АцГ, относится к фу-тильным реакциям, в ходе которых происходит диссипативное выделение энергии. Однако несмотря на это, как показывают наши данные, этот фермент широко распространен в растительном мире. Это, вероятно, связано с тем, что АцГ выполняет самые различные функции в растительной клетке. Так, очевидно, АцГ участвует в синтезе жирных кислот путем образования свободного ацетата, а также в поддержании определенного баланса между количествами КоА и ацетил-КоА в различных ком-партментах клетки. Б то же время очень важным оказалось обнаружение АцГ в митохондриях^ Ранее уже говорилось о том, что в регуляции ЦС (и ЦТК) можно выделить 3 ступени регуляции. Исходя из наших данных можно предположить, что существует и четвертая ступень регуляции ЦС - с помощью АцГ (путем Конкуренции за субстрат), т.е. осущесттляется ферментативная регуляция ЦС. Вероятно, в ячмене АцГ выполняет еще какую-то важную роль, однако она остается пока ene не ясной.

. Впервые нами изучены активные центры растительных АцГ, ЦС, АГ и АИ и показано, что по своему строешго они имеют определенные сходства и различия с ферментами из других источников. Особенно существенные отличия были найдены для АГ. В настоящее время показано ( Boínert, пяб ), что в состав

активного центра АГ из животных тканей и микроорганизмов входит 4ге-4э кластер. Наши и литературные даннш ( ^о-чи1аЕве1а1,1987) свидетельствуют о том, что либо в активном центре растительной АГ совсем нет железа, либо находящийся там кластер имеет другое строение.

В регуляции АГ, а следовательно, и в регуляции анаболн- • ческих и катаболических реакций могут играть роль ТАК, ма-лат и оксаломалат. Особенно сильным ингибитором. АГ оказался оксаломалат, поэтому можно предположить, что э.то соединение имеет важное значение в регуляции активности АГ у растений.

Изучение индукции АГ и АН расширяет наши представления о функционировании генетического аппарата клетки. Результаты наших исследований позволяют предположить, что у некоторых видов растений экспрессия генов,- кодирующих эти ферменты, может регулироваться как уровнем содержания субстрата, так, в случае АГ из подсолнечника, и уровнем ацетата. Кроме того, наши исследования по индукции АГ в подсолнпчнике показали, что синтез глиоксисомальной.АГ происходит в цитоплазме, а во время импорта этого фермента в гл^оксисогл! пго структура, вероятно, не подвергается каким-либо изменениям. Теистические исследования подтверждают наше прздположенио о существовании изоферментов АГ в растениях. Так, для кукурузы показано, что АГ кодируется в ней четырьмя локусами.щщ-чем 'штогоюзматическая и митохондриальная АГ кодируются на разлн' них генах ( копаех еь чх, 1988 ),

В тух растениях; которые накапливают ТАК, нами показано присутствие фермента АИ. Исходя из наших данных можно также представить себе, как происходит обмен ТАК в растениях: при действии ЦС в митохондриях образуется цитрат, он входит в цитоплазму в обмен па малат' ( В1гпьеге et а1, 198а ), а в цитоплазме при совместном действии АГ и АТГ образуется ТАК, который накапливается, вероятно, в вакуолях. Путь утилизации ТАК )ложно представить себе в обратном порядке.

Наши исследования показывают, что как образующиеся, так и накапливающиеся в вакуолях трикарбоновые кислоты могут быстро использоваться для синтеза аминокислот. При действии на эти кислоты аитоплазматических АИ, АГ и НАДФ+-ИДГ образуется 2-оксоглутарат, который является пр^пественником различных аминокислот.

Данные по изучению влияния света на активность ферментов > показали, что и на свету ЦТК функционирует, причем с достаточно высокой интенсивностью.

Опыты по исследованию действия различных газовых сред на изученные ферменты показали, что гипоксия оказывает ингибиру-вдее действие на активность всех этих ферментов.

Открытие нами нового фермента - ОД не только вносит существенный' вклад в изучение метаболизма органических кислот, но выдвигает и целый ряд новых проблем.

На основании проведенных исследований свойств и субклеточной локализации ЦС, АцГ, АГ, АК и НЛДФ+-ИДГ в разных растениях можно представить участие изоформ этих ферментов в разнообразных физиолого-биохимических процессах, протекающих в разных компартмектах растительной клетки (схема). На схеме показаны также взаимосвязь центральных метаболических путей (ЦТК) и анапяеротических реакций, поставляющих субстраты в ЦТК. ' '

ВЫВОДЫ

I. Впервые получены-из растений гомогенная ацетил-КоА-ги-дролаза (из ячменя) и аконитатгидратаза (из колеоптилей и щи-1'ка кукурузы, листьев гороха, семядолей подсолнечника и кенафа). Получена гомогенная цитратешгтаза из семядолей кенафа и частично очищенная из семядолей конопли и подсолнечника. ,-;' 2; Используя .разработанные нами методы, показано присутствие аконитаги з омерйз ы в растениях. Фермент получен в частично -очищенном состоянии из колеоптилей кукурузы.

3. Ферменты ацетил-КоА-гадролаза и питратсинтаза содержатся в растениях в виде множественных молекулярных форм. Множественные формы цигратсингазы (в кенафе и конопле) и ацетил-КоА-гвдролазы (в катране) отличаются между собой по физико-химическим и кинетическим свойствам.

4.-Аконитатизомераэа локализована как в цитоплазме (основная часть), так и в "митохондриях, а .аконитатгидратаза обнаружена также в в глиоксисомах..Множественные формы АГ в цитоплазме к глиоксисомах, г, одной стороны, и митохондрий, с другой, имеют существенные различия в свойствах, в отличие от АГ из цитоплазмы и глиоксисом, которые обладают сходными характеристиками.

5. В состав активного центра ЦС входит одна, молекула ли-

Схема метаболизма трккэрбоногшс кислот в растительной клетке.

АГ«- акоЕЕтатги-рзтаза (митохсшгриалчная); АГтгг- ,акокитатгпдратаза (ш?тошгзматическя-глиокса-сомальная) ;НАЛФ-ИдГтг- НАДФ-изоцитратдешдоогей&за Чцкгогназматическая) ;НАД5-КДГМ- ЬАДФ-изоцит-патдегиотогеказа (ыгтохошгоиальнг.ч) :ЦС.Г цит-затсантаза (мятохондрлальная);ЦСг- цитратсинтаза 7 гляо:'сисомал^ная5; АцГ- апетил-КоА-гил>олаза;АцС- ацетал-КоА-синтетаза;ОД- океанатратдегадра-таза(декарбО£щкда£'гЕцая);ЦД- гптатдегйдраза; Ш - аконитатизомераза.

I

со

зина и одна молекула аргинина в расчете на о,дну субъединицу цитратсинтазы кенафа, в состав АцГ входит одна молекула триптофана, ЛИ (кукуруза) - одна молекула гистиди-на, в АГ - одна молекула аргинина-,-Растительная АцГ (ячмень) не содержит цистеина в активном центре, а АГ не содержит ци-стеина и не активируется ионами двухвалентного железа в отличие от фермента из животных тканей.

6. Ацетил-КоА-гидролаза в растениях является мультифун-кциональным ферментом. Присутствие АцГ в митохондриях (¡дэоме цитоплазмы) говорит об ее участии в регуляции активности ЦС, а следовательно, и всего ЦТК.

7. Для некоторых растений аконитатгидратаза и аконитат-изомераза являются индуцибельными ферментами (индукторы -ацетат и транс-аконитат, соответственно). Их индуцированный синтез происходит в цитоплазме на 80s рибосомах.

8. Изучение влияния различных факторов внешней среды на активность ферментов показало, что свет практически не влияет на активность цитратсинтазы и несколько снижает активность ацетил-КоА-гидролазы, акони тати зомеразы, НАДФ-изоцит-ратдегидрогеназы и аконитатгидратазы, что свидетельствует о Функционировании ЦТК на свету. Синий свет более эффективен в превращении цис-транс-аконитатов в зеленых проростках кукурузы. '

•9. Кратковременное экспонирование проростков растений в атмосфере гелия и азота оказывает небольшой ингибирутащий эффект на активность исследованных ферментов, в то время как С02-среда является для них более сильным ингибитором.

10. В бактериях-рода Micrococcus ..растущих На среде с оксицитратом, обнаружено существование нового фермента - • оксицитратдегидратазы(декарбоксилирующей), который осуществляет превращение оксицитрата в 2-оксоглутарат. Получен частично -очищенный препарат этого фермента и изучены некоторые его свойства. Присутствие этого фермента показанр также для кенафа.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ

I. Землянухин Л.А., 1Лакеев A.M. К вопросу о метаболизме цио- и транс-аконитовой кислоты в растениях//В сб."Физиологические и физико-химические механизмы регуляции обменных процессов организма".-Вфснеж,ВГУ,1972.-С.7-10.

2. Землянухин Л.А., Макеев A.M. Получение и разделение *4С-цис- и транс-изомеров аконитовой кислоты//В сб"Физиоло-гические и физико-химические механизма регуляции обменных процессов организма". -Воронеж. ВГУ, 1973.-Вил.2.-С. II-I2.

3. Землянухин Л.А. Изучение динамита образования аконитовой кислоты в корнях кукурузы и ячменя//В сб."Физиологические и физико-химические механизмы регуляции обменнюс процессов организма".-Воронеж.ВГУ,1974.-Вып.З.-С.18-19.

4.Землянухин Л.А. Метаболизм 6-14С-цис- и транс-аконитовых кислот у растений С3- и С^-типов фотосинтеза//Тезисы докл. Ш Всесогаз. биохимического съезда.-Рига,1974.-С.76.

5. Землянухин Л.А. Аконитатизомераза в кукурузе//В сб. "Физиологические и физико-химические механизмы регуляции обменных процессов организма".-Ворокеж.ВГУ,1975.-Еып.4.-С.22-24.

6. Землянухин Л.А. Влияние освещения на превращение 6-*4С-цис- и транс-аконитовых кислот в растениях//Тезисы докл.

IV Всесоюз.конф.по фотоэнергетике растений.Киев,1975.-С.106-107.

7. Землянухин Л.А. Метаболизм аконитовой кислоты в рас-тениях//Еиологические науки.-1Э76.-.';7.-С.27-31.

б. Землянухин Л.А., Епринцев А.Т. Действие света на индуцированный синтез- аконитатизомеразы в растениях/Дезисы докл.

V Всесоюэ.конф. по фотоэнергетике растений.-Алма-Ата,1978.-С.93-94,

■ ,9. Землянухин Л.А., Епринцев А.Т. Пеиоторлэ стороны обмена транс-аконитовой кислоты в растениях//Тезисы докл.Всесогаз. конф."Проблемы изучения и использования в народном хозяйстве растений природной флоры."-Мос:аа,I979.-G.54.

10. Землянухин Л.А., Епринцоз А.Т. Индукция аконитатизомеразы у выспйх растсний//ДАН СССР.-1979.-Т. 246.-.''4.-С. 10201023.

11. Землянухин Л.А., Епринцев А.Т. Простой метод -обнаружения и определения активности аконитатизомеразы-в растениях// Физиология растений.-1979.-Т.26,-Внп.4.-С.873-876.

12. Землянухин Л.А., Епршшев'А.Т. Метаболизм цис-транс-аконитовых кислот в растекнпх//Тезиси докл. П Бсессяз.межун. кснф.молод.ученых.-Тбпли сп.ТГУ,1980.-С.95.

13. Землянухин Л.А., Еприпчев А.Т. Индуцированный синтез

аконигатизомеразы а различных видах растсний//3 сб."Фотосинтез, дыхание и органические кислоты".-Ворнш.ВГУ',1980.-С.106-112.

14. Землянухин Л.А., Епршщев /4ГТ. Влияние света на активность аконитатгпдратазн у растенпй//Тезисы докл.У! Всесоюз. конф. по фотоэнергетике.-Львов,1980.-С.61.

15. Zemlyanukhln L.A., Eprlnteev A., Suvorova I. Regulation of trims-nconitate exchange in plante//Abstracts Join ejmpoeiua of the biochemical societies of the ОШ and USSB. -ТаИ1пД98Х.-Р.17.

16. Епршщев A.T., Землянухин Л.А., Суворова И.!,i. Новый метод определения активности ахонитатгидратазн в растениях// В сб."Регуляция физиологических процессов растений".-Воронеж, ВГУ,1982.-С.51-56.

17. Землянухин Л.А. Метаболизм аконитовой кислоты в растениях/Дам же.-С.21-34.

18. Землянухин Л.А., Епринцев А.Т., Игамбердиев А.У. Активность аконитатгидратазы в растениях и ее зависимость от условий газовой среды//Тез.докл.Всесоюз.конф."Проблемы И пути повышения устойчивости растений к болезням й экстремальным условиям среды в связи с задачами селекции."-Ленинград,

Т982.-С.157.

!9. Землянухин Л.А., Епршщев А.Т. Некоторые свойства аконитатгидратазы из листьев древесных растений//Тез.докл. Всесоюз.конф. "Проблемы физиологии и биохимии древесных растений". -Красноярск, 1982.-С. 52.

20. Землянухин Л.А., Епринцев А.Т., Игамбердиев А.У.Ввде-ление, очистка и некоторые свойства аконитатгидратазы из кукурузы// Биологические науки . -1982.-МО.-С.77-82.

21. Землянухин Л.А., Епринцев 'А.Т., Землянухин А.А.Очистка аконитатгидратазы из семядолей. подсолнечника//В сб."Ферменты, ионы и биоэлектрогенез у растений".-Горький,1982.-

.С.32-36.

22. Землянухин Л.А., Епршщев А.Т., Суворова И.М.Активность вконътатгидротази в онтогенезе некоторых растений// Та;; ;-о,-С.55-61. '

23. Землянухин Л.А., Епринцев АЛ., Попова Т.Н. Роль-светового фактора и регуляция активности Ферментов обмена три-карбоновых кисЛот//Тез.докл.Всесоюз.конф.:Проблемы фотоэнергетики растений и позшение урожайности".-Львов,I9S4.-С.67-

24. Землянухин Л.А., Епринцев А.Т. Регуляция аконитазной активности в прорастающих семядолях подеолнечника//Тез.докл. I Всесоюз.совещания "Актуальные задачи физиологии и биохимии растений в ботанич. садах СССР."-Пущино,1&84.-С.125.

25. Землянухин A.A., Епринцев А.Т., Землянухин Л.А.,Игам-бердиев А.У. Субклеточная локализация изоформ аконитатгидра-тазы в высших растенийх//Физиология растений.-1984.-Т.31.-Вып.2.-С.337-343.

26. Землянухин Л.А., Епринцев А.Т., Суворова И.М. Очистка и некоторые свойства аконитатгидратазы из гороха//ДАН CCCP.-I984.-T.275.-JS.-C.I250-I253.

27. .Землянухин Л. А., Игасбердиев А .У., Землянухин A.A. Очистка и свойства изоцитратлиазы из подсолнечника//Био::и-мия. -Т. 49. -Выл .3.-I984.-C.3S7-393.

28. Землянухин Л.А., Землянухвна O.A., Самохвалоз И.М. Очистка и некоторые свойства цитратсинтазы из семядолей подсолнеч1шка//В сб."Ферменты, ионы я биоэлектрогенез у растений".-Горький.-1984.-С. 78-63.

29. Землянухин Л,А., Игачбердиев А.У., Землянухин а.А. Очистка изоцитратлиазы из подсолнечника с использованием различных сорбентов//^ сб."Теор. и практ. сорбц.процессов".-Вороне:-:;.ВГУ.-Вып. 17.-1984.-С. 94-96.

30. Землянухин A.A., Епринцев А.Т., Землянухин Л.А.,Ига-мбердпев А.У. Очистка и свойства аконитатгидратазы и изоцитратлиазы из растений//Тез.докг:. У Всесоюз.бнохим.съезда.-Москва,1986.-С.42.

31. Землянухина O.A., Иванов Б.Ф., Землянухин Л.А. Хро-матограгоические методы в применении к очистки цитратсинтазы растений//Тез.дэкл. 1У Всесоюз.конф."Применение -ионообменных материалов ь промышленности и аналитической химии".-Воронея,1986.-Т.I.-0.123.

32. Землянухина O.A., Самохвалов И.И., Землянухин Л.А.Выделение, очистка и некоторые Физико-химические свойства ацэ-тил-КоА-гидролазн из я^еняХ/Биологические науки.-1986.--.!?12. -С.73-78.

33. Землянухина O.A., Филатов Г.П., Землянухин Л.А., Ткачева Т.И. Счистка и некоторые свойства внемитохондриальной аиетил-КоА-гидролази иг ячмс.ш//ДАН СССР.-1986.-Т,291.-!Ч5,-

C.I250-I252.

34. Землянухин A.A., Землянухин JI.А., Епршщев А.Т. ,Игам-бердиез А.У. Глгоксилатпый цикл рзстений//Зоронеж,ВГУ.-1986.-147 с. °

35. Землянухин A.A., Попова Т.Н., Землянухин Л.А.,'Епринцев А.Т. Способ получения изоцитратдегидрогеназы из растительного сырья//Авторское свидетельство H305929.I986.

36. Епринцев А.Т., Землянухин Л.А. Получение гомогенных препаратов аконитатгидратазы и малатдегидрогеназы из высших растений//Тез.докл. Всесоюз.науч.-практ.конф. "Применение биотехнологии в народн.хоз-ве".-Уфа,I987.-C.18-21.

37. Землянухина O.A., Филатов Г.П., Землянухин Л.А. Использование ДЭАЭ-целлголозы для очистки ацетил-КоА-гидролазы из ячменя методом аффинно-злюционной хрокато rpaïmi//B сб. "Теор. и практ.сорбц.процессов."-Воронеж,В1У,1987.-Выл.19.-С.91-94.

38. Землянухина O.A., Землянухин Л.А., Бражникова Т.А. Вцяеление, очистка и характеристика цитратсинтазы из.семядолей кенафа Hibiscus cannablnus l. //Биохимия.-1987.-Т.52.-№7.-0.991-999,.

39. Епршщев А.Т., Землянухин Л.А. Влияние органических кислот на индукцию аконитатгидратазной активности у растений //В сб."физиология устойчивости растений и регуляторы роста". -Саранск .Мордов.ун-т,1987.-С.112-115.

40. Епринцев А.Т., .Игамбердиев А.У., Землянухин A.A.,Землянухин I.A. Распространение глиоксилатного цикла в высших растешшх/Дез.докл. УШ Всесоюз.съезда ботанич.об-ва.-Алма-Ата,1988.-C.9S.

41. Землянухин Л.А., Землянухина O.A. Распространение цитратсинтазы и ацетил-КоА-гидролазы в растениях//В сб."Интродукция растений в Центральном Черноземье".-Воронеж.ЗГУ,1988. -С.73-78.

42. Епринцев А.Т., Землянухин Л.А., Гороаалова С.Ю. Очис-ус, некоторые свойства аконптатглдргтазы кз семядолей ке-нафа//В сб."Регуляция йермент. актив, у растений".-Горький, 19&8.-С.5Ь-61,

43. Ткачева. Т.И., Ремлянухпн I.A. y.azw.zoi пчие Г.ЗА?-цел-л ""1СЗ!! для чрстячней очпсткя ы'онптэтгзо'Ч'р-с > ; -,я крзросткоз '•.'.•урузк// ■ сб,"Тссх). и практ.соггчг.крог'сс."- ороие™."»]У.,

1991.-Вил.21.-С.I44-149.

44. Землянухина O.A., Ткачева Т.Н., Землящхин Л.А. ,13ра-жншгава Т.Д. Агетнл-КоА-гадролаза из растений: очист:-:п и сволства//В сб."Регуляция фермент.акт-ти у растений".-Горь-ки'1,1990.-0.46-50.

45. ZenlyanuWiin L.A., Zenlj'raukhina O.A. Acstyl-CoA hydrola-• не frca higher plants//Ahstract3 7"11 Congreos of FSS PP.-Hiy.'iiolo-

gia Plantar um.-19 50.-7 »79>Faac .2 ,-fer t 2.-A 58.-P. 337.

46. Землянухлн Л.А., Ткачева Т.М. Применение ионообменной хроматограф:;;! для очистки аконитатгидратазы из растений //Тез.докл. УП Всесолз.коч-л."Применение ионообменных материалов в пргеаьгяешюсгл л аналитической химии".-Оорс

1991.-С.389-390.

47. Землянухин Л..А., Ткачзпа Т.П. Ковш метод определения активности аконитатизомеразы в растеш1ях//Физнология растений.-1993.-Т. 4(,.-Вшт.1.-С. 157-160.

48. Ткачева Т.П.,.Землянухин Л.А. Пекотор1:-; свойства пко+-нитатизомеразы кукурузы и ее внутриклеточчач локализация и измене гае активности при прораи:ании семян//5изиология-' растений.-1993.-Т. 40.-Вкл. I.-С. 84-Ь7.

49. Землянухин Л. А.//Регуляция обмена три карболовых кислот в растениях//Тез.докл. Ш съезда Всероссийского сб-ва физиологов растений.-Санкт-Петербург,1993.-Т.I.-СЛ06.

50. Землянухина O.A., Землянухин Л.А.//Ацет:!Л-КоЛ-гидро-лаза и регуляция ЦТК в растениях//Там же.-Т.I.-С.107.