Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ферменты белкового обмена коконопрядущих насекомых

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ферменты белкового обмена коконопрядущих насекомых"

На правах рукописи

КЛУНОВА Светлана Михайловна

ФЕРМЕНТЫ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА КОКОНОПРЯДУЩИХ НАСЕКОМЫХ

Специальность: 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной ст епени доктора биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре органической и биологической химии биолого-химического факультета Московского педагогического государственного университета

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор НЕМОВА Нина Ннколаевна доктор биологических наук, профессор ВАСИЛЬЕВ Андрей Валериевич доктор биологических наук, профессор ГЕНГИН Михаил Трофимович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита диссертации состоится 2005 г. в К часов на

заседании диссертационного совета Д 212.154.17 при Московском педагогическом государственном университете по адресу: 129278, г. Москва, ул. Кибальчича, дом 6, корпус 5, ауд. 506

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского педагогического государственного университета по адресу 119992, г. Москва, ул Малая Пироговская, д. 1.

Автореферат разослан"0 " — 2005 г Ученый секретарь

Диссертационного совета Холмогорова Н.В.

2,006-

Ib 711

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Ферменты белкового обмена занимают ключевые позиции в метаболизме как по числу и разнообразию тех процессов, в которых они участвуют, так и по их физиологическому значению. Ферменты белкового обмена участвуют в распаде и синтезе белков и аминокислот, образовании и детоксикации продукюв обмена (аминов, кетокислот, мочевины, аммиака), удалении аномально построенных белков и специальных превращениях аминокислот (аргинина, метионина, тирозина, триптофана, окси- и меркаптоаминокислот) (Майстер, 1961; Гауровитц, 1965; Бродский, 1966; Мосолов, 1971; Локшина, 1994; Степанов, 1996; Абрамова и др., 2002; Лузиков, 2002; Neurath, 1989; Han, Li, 2002). Контролируя концентрацию аминокислот, белков и биологически активных соединений, они обеспечивают интеграцию обмена веществ на уровне целою организма и воздействие на него нервных и гуморальных регуляторных механизмов (Старкова и др., 2000; Лузиков, 2000; Maurizi, 2002).

Уже более столетия в качестве удобного лабораторного объекта для изучения общебиологических закономерностей белкового обмена и механизма биосинтеза экскретируемых белков выступают коконопрядущие насекомые. Это объясняется исключительной интенсивностью, с которой осуществляются у них процессы азотистого обмена. Шелкоотделительная железа тутового шелкопряда вырабатывает около 140 мг фиброина в сутки (38 10" молекул в минуту), что не сопоставимо ни с одним изученным в этом аспекте биологическим объектом (Бродский, Нечаева, 1988). Особенности морфологии шёлкоотделительной железы шелкопряда обеспечивают широкие возможное!и для проведения сравнительно-биохимических исследований. Шелкоотделительная железа состоит из двух отделов, в клетках стенок которых синтезируются резко противоположные по аминокислотному составу белки - серицин и фиброин. Основная масса шёлкового волокна (70-80%) состоит из фиброина, построенного главным образом из глицина, алаиина серина и тирозина (Kirimura, 1962), которые принято называть главными аминокислотами шёлка.

Биологические системы, экскретирующие белки считаются удобными объектами биотехнологии (Баев, 1986; Егорова и др., 2003; Коничев, Севастьянова, 2003; Chen et al., 2003), что предполагает необходимость изучения механизмов их образования и функционирования. История изучения биосинтеза белков шёлка насчитывает несколько десятилетий (Филиппович, 1964; Куллыев, 1977; Караев, 1982; Михайлов, 1988; Филиппович и др., 1992; Akai, 1960, 1963; Jin, Kaplan, 2003), однако, путь, пройденный при формировании этих представлений, полон противоречий. Своеобразие схемы новообразования фибриллярного белка фиброина связывалось с уникальностью его первичной структуры - регулярностью расположения аминокислотных остатков по длине молекулы этого белка, вследствие чего механизму биосинтеза фиброина приписывали черты как матричной, так и

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ .

библиотека i

С.Петербург ' 09 Щ > «мГ^ Н

"И ■■ ш

пептидных схем (Антонов, 1964; Филиппович, 1964; Филиппович и др., 1992; Viswanathan et al., 1988).

Надёжные данные о закономерностях биосинтеза больших масс экскретируемых белков шёлка можно получить различными путями и, как нам представлялось, один из них сосюял в комплексном изучении важнейших ферменюв, участвующих в формировании исходных структурных единиц для построения белков шёлка. Тщательный анализ литературных данных, проведённый к моменту начала данного исследования, показал, что пути ферментативного синтеза главных аминокислот шёлка в тканях и органах коконопрядущих насекомых были изучены крайне неравномерно. Наименее скудные сведения о ферментах аминокислотного обмена были присущи шёлкоотделительной железе насекомых. Мало разработанной оказалась количественная сторона аминокислотного обмена в тканях и органах шелкопряда, что не давало представлений о локализации и реальных масштабах синтеза аминокислот в них. Между тем, некоторые наблюдения свидетельствовали о том, что процессы аминокислотного обмена в тканях и органах этих насекомых протекают достаточно специфично (Филиппович и др., 1992).

В качестве метаболитов, использующихся для создания исходных соединений для синтеза фиброина и серицина шёлка, могут служить также белки и пептиды-иных тканей шелкопряда (Koide et al., 1961; Shigematsu, Takeshita, 1968; Hirayama, Nakamura, 2002). Однако роль отдельных тканей и, особенно, значение конкретных белков в качестве поставщиков азотистого материала для синтеза белков шёлка оставались не охарактеризованы.

Крупномасштабные процессы перестройки белков сопровождают не только период шёлкообразования. но являются стержнем белкового обмена на всём протяжении онтогенетического развития коконопрядущих насекомых (Тыщенко, 1976; 1977; Филиппович и др., 1992; Клунова, Ярыгин, 2001). Процессы деструкции белков у насекомых протекают исключительно интенсивно и достаточно специфично. Среди пептидогидролаз насекомых найдены единственные в своём роде энзимы, субстратами которых являкмся такие устойчивые к биодеградации протеины как кератины и белки шёлка (Kofatos, Williams, 1964; Ward, 1975). Концентрация продуктов распада белков - свободных аминокислот и пептидов - чрезвычайно высока и является таксономическим признаком (Филиппович, 1963; Никитина, 1974; Филиппович и др , 1992).

Активность пептидогидролаз, обеспечивающих деструкцию запасных белков, ¡акономерно изменяется в зависимоеiи от фазы и стадии развития насекомого (Клунова, Ярыгин, 2001), что представляется важным для изучения природных механизмов регуляции не только активности протеолитических ферментов, но и кругооборота белков. Наиболее универсальным механизмом контроля внутриклеточного протеолиза является регуляция активности пептидогидролаз при посредстве эндогенных высокоспецифических белковых ингибиторов (Мосолов, 1983; 1994; Мосолов, Валуева, 1993; Валуева,

Мосолов, 1999). По сравнению с ингибиторами протеиназ позвоночных животных о белковых ингибиторах протеолитических ферментов у беспозвоночных, в том числе и насекомых, известно значительно меньше.

Наибольшее народохозяйственное значение среди коконопрядущих насекомых имеет тутовый шелкопряд, в области генетики и селекции которого ведётся напряжённая работа в поисках новых путей повышения его продуктивности и хозяйственной ценности. Начиная с 1989 года, производство шёлка-сырца в основных странах-производителях характеризует устойчивая 1енденция к его возрастанию (Головко, 1991; 1992). Уникальные свойства белков шёлка инициировали к жизни идеи об использовании генно-инженерных подходов к получению модульных волокон, близких по свойствам фиброину (ОоршаЙип, 1992; Нттап « а1., 2000; Вин е( а!., 2004), и стратегии применения белков шёлка в качестве новых носителей для иммобилизации ферментов и лекарственных препаратов (ТОш е1 а1., 1999; Zhu, Хи, 2001). В связи с этим комплексное исследование закономерностей и ферментов белкового обмена, непосредственно вовлечённых в формирование фонда исходных структурных единиц для синтеза белков шёлка, в тканях и органах различных по продуктивности пород и гибридов тутового шелкопряда с целью выявления энзимов, сцепленных с теми или иными хозяйственно-полезными показателями, в том числе и на ранних стадиях онтогенеза насекомого, предотавляет несомненный практический интерес. В этом направлении осуществлено весьма ограниченное число работ, сводящихся к анализу в породно-гибридном аспекте некоторых энзимов аминокислотного обмена (Егорова, 1983; Егорова, Насириллаев, 1987).

Различные виды коконопрядущих насекомых отличаются по объёму шелкопродукции, качеству шёлка, аминокислотному составу серицина и фиброина. Значительным пробелом в изучении закономерностей формирования экскретируемых белков у коконопрядущих насекомых является отсутствие данных об общих и межвидовых различиях параметров их белкового обмена, выявление которых безусловно представляем важным для установления универсальных и специфических закономерностей аминокислотного обмена в тканях группы коконопрядущих насекомых в целом.

Основной объём работ, посвященный ферментам белкового обмена насекомых, осуществлён главным образом на уровне гомогенатов отдельных их тканей или органов, в связи с чем сведения относительно свойств этих энзимов весьма немногочисленны. Поэтому получение гомогенных препаратов ферментов тутового шелкопряда и детальное исследование их физико-химических свойств представляет исключительный интерес как в сравнительно-видовом, так и в эволюционном аспекте. Кроме того, подробное физико-химическое исследование ферментов, наиболее тесно связанных с процессами шёлкообразования и продуктивностью коконопрядущего насекомого, может дать дополнительную информацию также относительно молекулярных механизмов продуктивности и гетерозиса тутового шелкопряда.

Цель исследования

Основной целью данной работы являлось изучение энзиматических систем, обеспечивающих формирование у представителей коконопрядущих насекомых фонда итвных аминокислот шёлка (глицина, аланина, серина и тирозина); оценка тканевой, фазовой и групповой специфичности ферментов; расшифровка некоторых общебиологических закономерностей белкового обмена в связи с процессами синтеза и экскреции специфических белков и разработка на этой основе методов прогнозирования продуктивности и эффекта гетерозиса у тутового шелкопряда.

Задачи исследования

1. Изучить пути синтеза глицина, аланина, серина и тирозина в фиброиновом и серициновом отделах шёлкоотделительной железы и функционально связанных с ней тканях - гемолимфе и жировом теле трёх видов коконопрядущих насекомых - тутового шелкопряда (Bombyx morí L ), дубового шелкопряда {Antheraea pernyi G-M) и павлиноглазки Артемиды (Actios artemnis В.).

2. Установить на основании опытов по включению 2-14С-глицина функциональную роль в процессах шёлкообразования отдельных белков тканей и органов тутового шелкопряда на заключительном этапе личиночного развития насекомого и в период завивки кокона.

3. Исследовать эндогенный протеолитический комплекс, проанализировать динамику активности пептидогидролаз в тканях и органах тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития и сопоставить её с динамикой 14С-меченых белков тканей и органов в аналогичных стадиях развития насекомого.

4. Сравнить активность ферментов аминокислотного обмена и пептидогидролаз в тканях и органах личинки с аналогичными параметрами развивающегося зародыша тутового шелкопряда.

5. Изучить активность белковых ингибиторов пептидогидролаз в эмбриогенезе тутового шелкопряда, субклеточную локализацию протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов в грене насекомого.

6. Исследовать взаимосвязь между активностью ферментов аминокислотного обмена, эндогенных протеиназ, белковых ингибиторов пептидогидролаз в тканях, органах и грене тутового шелкопряда и хозяйственно-полезными показателями ряда его пород и гибридов с целью прогнозирующей оценки по биохимическим тестам, в том числе, и на ранних стадиях онтогенеза, основных хозяйственно-ценных признаков насекомого.

7. Осуществить выделение и очистку, исследовать физико-химические свойства ряда ферментов, активность которых в наибольшей мере

коррелирует с процессами шёлкообразования и хозяйственно-полезными признаками тутового шелкопряда.

Научная новизна и теоретическая ценность диссертационной работы

Разработана система биохимических методов для детального изучения в фиброиновом и серициновом отделах шёлкоотделительной железы и функционально связанных с ними тканях (гемолимфе и жировом теле) путей синтеза глицина, аланина, серина и тирозина. Впервые в шёлкоотделительной железе и жировом теле тутового шелкопряда обнаружены НАД+ заяисимая гидроксималонатдегидрогеназа, серин-гидроксиметилтрансфераза, треонин-альдолаза, фенилаланингидроксилаза и окончательно подтверждено существование в них аспартат-4-декарбоксилазы. Охарактеризован путь новообразования глицина через производные малоновой кислоты, вероятный механизм образования глицина из серина и треонина, а также тирозина из фенилаланина. Осуществлена оценка реального вклада каждого из 10-ти энзиматических путей в биосинтез той или иной главной аминокислоты белков шёлка в исследуемых тканях шелкопряда

На основании комплексного сравнительно-биохимического анализа ферментов биосинтеза глицина, аланина, серила и тирозина у трёх видов насекомых (тутового шелкопряда, дубового шелкопряда и павлиноглазки Артемиды) впервые сформулировано обобщённое теоретическое представление об универсальности и специфичности организации ферментов биосинтеза главных аминокислот шёлка у коконопрядущих насекомых.

Впервые показана целесообразность исследования в видовом, тканевом и онтогенетическом аспектах ферментов синтеза главных аминокислот шёлка для выявления перечня энзимов-маркеров при оценке функциональной связи между интенсивностью белкового обмена (объёмом шёлкопродукции) и его направленностью (аминокислотным составом белков шёлка) в тканях и органах коконопрядущих насекомых и, в том числе, в шёлкоотделительной железе тутового шелкопряда как удобной модели для изучения закономерностей биосинтеза в ней экскретируемых белков.

Впервые выявлены закономерности белкового обмена в тканях тутового шелкопряда на уровне отдельных 14С-белковых фракций при биосинтезе экскретируемых белков, на основании чего получена однозначная информация о месте и времени образования, особенностях обмена и закономерностях мобилизации белков в каждой ткани, в частности об участии конкретных белков гемолимфы в качестве поставщиков азотистого материала для новообразования в шёлкоотделительной железе главных аминокислот шёлка.

Охарактеризован комплекс протеолитических ферментов, участвующих во внутриклеточной деградации белков и, в том числе, обеспечивающих создание фонда свободных аминокислот в тканях и органах гутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития и в яйцах насекомого в процессе эмбриогенеза. Сопоставлена динамика активности пептидогидролаз с

характером исчерпания запасных белков, благодаря чему установлена роль отдельных энзимов протеолитического комплекса в процессах деструкции резервных белков. Впервые выявлена тканевая специфичность в процессах мобилизации белков тканей при участии конкретных пептидогидролаз в ходе посгроения белков шёлка.

Впервые расшифрован комплекс белковых ингибиторов сериновых, цис1еиновых и аспартильных протеиназ, обеспечивающих направленность процессов гидролиза белковых субстратов в грене тутового шелкопряда Впервые исследована динамика активности протеолитического комплекса в единстве с изменениями активности комплекса белковых ингибиторов на протяжении эмбрионального развития тутового шелкопряда. Выявлена дополнительность и взаимообусловленность характера динамики белковых ингибиторов и конкретных протеаз.

Установлена субклеточная локализация прогеолитических ферментов и их белковых ингибиторов в грене тутового шелкопряда. Анализ динамики и субклех очной локализации пептидогидролаз и их белковых ингибиторов позволил конкретизировать функции белковых ингибиторов при осуществлении различных процессов в ходе рег-уляции активности эндогенных протеиназ.

Впервые из представителя класса насекомых выделены в виде высокоочищенных белков важнейшие ферменты белкового обмена -атанинаминотрансфераза шёлкоотделителыюй железы, катепсин Ь-подобная протеиназа из фены, цистеиновая прогеиназа с оптимумом рН 3,6 из хроматина фены тутового шелкопряда и охарактеризованы их физико-химические свойства.

Практическая значимость работы

Осуществлено комплексное изучение ферментов белкового обмена в тканях различных по продуктивности пород и гибридов тутового шелкопряда. Установлена положительная статистически достоверная корреляция высокого порядка между уровнем активности ряда энзимов белкового обмена и хозяйственно-полезными характеристиками исследованных пород и гибридов насекомого, что позволило разработать и предложить новые надёжные тесты для прогнозирования в процессе выведения пород их потенциальной продуктивности и оценки эффекта гетерозиса в потомстве у гибридов тутового шелкопряда.

Инструкции по применению разработанных биохимических тестов рекомендованы Среднеазиатскому НИИ шелководства (г.Ташкент) и Республиканской НИИ станции шелководства (пос.Иноземцево Ставропольского края) (сборник "Биохимические методы про!нозирования продуктивности, гетерозиса и оценки физиологического состояния полезных и вредных насекомых", МГПИ им. Ленина, 1975 с.24-38). Результаты проведённого исследования используются для ранней оценки родительских

пород тутового шелкопряда при планировании программ скрещивания с целью получения эффекта гетерозиса в потомстве.

Вычленение из сложного комплекса ферментов белкового обмена тканей и орунов личинки и грены тутового шелкопряда наиболее перспективных энзимов, сцепленных с продуктивностью, физико-химическая характеристика некоторых из них, установление их эндогенных субстратов представляет существенно новую информацию о молекулярных основах высокой продует ивнос ги и эффекта гетерозиса у коконопрядущего насекомог о

На основании проведённых исследований разработаны методические прописи, предназначенные для постановки спецпрактикума по биохимии белков (сборник "Методы анализа белков и нуклеиновых кислот в тканях и органах насекомых" - М. МГПИ им. Ленина, 1980 ч I с.24-38). Результаты исследований используются при чтении курса биологической химии, а также включены в семинарские и практические занятия со студентами П-Ш курсов биолого-химического и географо-биологического факультетов Московского педагогического государственного университета.

Положения, выносимые на защиту

1. Ферментные системы синтеза главных аминокислот шёлка в тканях и органах коконопряду щих насекомых на заключительном этапе личиночного развития организованы однотипно, что является результатом узкой направленности процессов аминокислотного обмена у них на биосинтез специфически построенных белков шёлка. 2 Высокая скорость экскреции белков у тутового шелкопряда поддерживается крупномасштабными процессами мобилизации белковых ресурсов тканей насекомого. Определённые белки гемолимфы, активно синтезирующиеся в жировом теле и накапливающиеся в период активного питания в каркасе и стенке кишечника, являются поставщиками азотистого материала для синтеза в шёлкоотделигельной железе главных аминокислот шёлка.

3. Процессы деградации запасных белков у тутового шелкопряда обеспечиваются преимущественно цистеиновыми протеиназами и характеризуются фазовой и тканевой специфичностью.

4. Совместная субклеточная локализация и альтернативный характер зависимости между величиной активности конкретных протеолитических ферментов и соответствующих белковых ингибиюров обеспечивает чёткую упорядоченность процессов протеолиза индивидуальных белков в ходе эмбриогенеза тутового шелкопряда.

5. Высокое сродство к эндогенным субстратам, являющееся характерным свойством ряда энзимов тутового шелкопряда (аланинаминотрансферазы шёлкоотделительной железы, катепсин Ь-подобной протеиназы грены и цистеиновой протеиназы с рН-оптимумом 3,6 хроматина грены) отражает

узкую специализацию обмена и высокую скорость кругооборота белков у коконоттрядущего насекомого. 6. Активность ряда ферментов белкового обмена может быть рекомендована для использования в качестве перспективного биохимического теста для прогнозирования в процессе выведения пород их потенциальной продуктивности и оценки эффекта гетерозиса в потомстве у гибридов тутового шелкопряда на стадии яйца и личинки.

Апробация диссертационной работы

Основные положения и результаты диссертации были представлены на VII «

International Congress of Biocbemistry, Tokio, 1967; XIII Internationa) Congress of Entomology, Moscow, 1968; III Всесоюзном биохимическом съезде, Рига, 1974; VI съезде, Воронеж, 1970 и VII съезде, Ленишрад, 1974 Всесоюзного энтомологического общества; X International Congress of Biochemistry, Hamburg, 1976; VIII Всесоюзном энтомологическом съезде, Вильнюс, 1979; 2-ом Всесоюзном семинаре-совещании по генетике и селекции тутового шелкопряда и шелковицы, Ташкент, 1979; координационных совещаниях по шелководству, Ташкент, 1976, 1978, 1979, 1983; IX Всесоюзном симпозиуме "Структуры и функции клеточного ядра", Черноголовка, 1987; Международном симпозиуме "Актуальные проблемы мирового шелководства", Мерефа, 1991; координационном совещании шелководов стран СНГ, Мерефа, 1993; 5-th European Congress of Entomology University of York UK, 1994; XX International Congress of Entomology, Firenze, Italy, 1996; Ленинских чтениях в МГПИ им. В.И.Ленина, 1974; научных сессиях по итогам научно-исследовательской работы М1 Б~У, 1992, 1995, 1997, 1999-2005 г.г.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 462 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной часш, включающей описание материалов и методов исследования, изложения полученных результатов с их обсуждением, '

заключения, основных выводов и практических рекомендаций. Список цитируемой литературы содержит 637 источников (192 отечественных и 445 зарубежных). Текст диссертации иллюстрирован 10-ю схемами, 51-ой таблицей, 60-ью рисунками и приложением (20 таблиц и 10 рисунков).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Материалы и методы изучения активности ферментов аминокислотного обмена. Материалом для исследования активности ферментов аминокислотного обмена служили гусеницы тутового шелкопряда Bombyx mori L (породы Азад, РС-1, Прозрачная, САНИИШ-9 и САНИИШ-21); ки i айского дубового шелкопряда Antheraea pernyi G M и павлиноглазки

Артемиды Actios artemnis В., полученные из коллекции САНИИШ (г.Ташкент) и НПО "Укрплемгрена" (г.Мерефа, Харьковской обл.), а также грена тутового шелкопряда, представленная Росшёлкстанцией (пос. Иноземцево Ставропольского края).

Исследовали гемолимфу, жировое тело, серициновый и фиброиновый отделы шелкоотделительной железы в середине и конце V возраста личиночной фазы развития, в 1-й и 3-й день завивки кокона у тутового и дубового шелкопрядов и в конце V возраста у павлиноглазки Артемиды. При исследовании активности ферментов аминокислотного обмена в процессе эмбрионального развития тутового шелкопряда анализировали неоплодотворённые яйца, развивающуюся грену предциапаузного периода, а также грену после выхода её из состояния диапаузы. Стадию развития зародыша определяли по методу Михайлова (Михайлов, 1953).

Определение активности аланин-глиоксилатаминотрансферазы, аланин-аминотрансферазы, аслартатаминотрансферазы, серин-гидроксиметил-трансферазы, треонинальдолазы и аспартат-4-декарбоксилазы растворимых белков тканей и грены шелкопряда осуществляли методом ионообменной хроматографии с использованием аминокислотного анализатора фирмы Hitachi (модель KLA-3B, Япония) по специально разработанным прописям. Активность ферментов выражали числом микромолей аминокислоты, образующейся в течение 1 минуты при 37°С, на 1 мг белка ферментного препарата.

Активность аспартат-кетомалонатаминотрансферазы, аспартатаминотранс-феразы, оксималонатдегидрогеназы, НАД* и НАДФ+-зависимой глутамат-дегидрогеназы, 3-фосфоглицератдегидрогеназы и фенилаланингидроксилазы определяли методом энзим-электрофореза в полиакриламидном геле. Для обнаружения на гелевой колонке белковых зон, обладающих дегидрогеназной активностью, использовали тетразолиевый метод (Markert, 1968), активностью аспартатаминотрансферазы и аспартат-кетомалонатамино!рансферазы метод Бабсона с сотр. (Babson et al., 1962); для тестирования фенилаланингидроксилазы осуществляли реакцию сочетания тирозина, возникающего в результате ферментативного окисления фенилаланина с хлоридом сафранилдиазония, который получали по Берстону (1965). Активность ферментов, выявленных методом энзимэлектрофореза в полиакриламидном геле, выражали в условных единицах, полученных при аппроксимировании пиков денситограмм по Покровскому с сотр. (Покровский и др., 1971).

Определение активности аспартат- и аланинаминотрансферазы растворимых белков тканей и грены шелкопряда осуществляли колориметрическим динитрофенилгидразиновым методом (Reitman, Frankel, 1957) в модификации Коровкина (Иванов и др., 1974). Активность глутамат-дегидрогеназы, 3-фосфоглицератдегидрогеназы и тирозинаминотрансферазы определяли спектрофотометрическим методом (Иванов и др., 1974; Diamondstone, 1966). Удельную активность исследованных энзимов выражали

в нмолях образовавшихся за ! мин инкубации пировиноградной кислоты (АЕ450), НАДН (АЕ340) или и-оксибензальдегида (AE33i) соответственно на мг белка ферментного экстракта.

2. Материалы и методы для изучения метаболизма 14С-меченых белков. Для работы использовали гемолимфу, жировое тело, фиброиновый и серициновый отделы шелкоотделительной железы, каркас тела и стенку кишечника тутового шелкопряда.

Меченые белки тканей тутового шелкопряда получали путём инъекции в гемолимфу гусениц середины V возраста 20 мккюри 2-14С-глицина.

Растворимые иС-белки получали экстракцией тканей шелкопряда трис-глициновым буфером (рН=8,6, ионная сила 0,075) с последующим осаждением 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты. Препараты растворимых белков и нерастворимых остатков тканей освобождали от свободных аминокислот, липидов и нуклеиновых кислот, доводили до воздушно-сухого состояния и использовали для просчёта радиоактивности.

Свободные аминокислоты получали экстракцией воздушно-сухих препаратов тканей шелкопряда 75%-ным этанолом.

Фракционирование растворимых белков в полиакриламидном геле осуществляли меюдом диск-электрофореза (Davis, 1964) в модификации для 1каней насекомых (Щеголева, Филиппович, 1969).

Радиоактивность отдельных белковых фракций тканей шелкопряда, выявляемых в полиакриламидном геле, определяли после разрезания колонок геля в поперечном направлении и обработки каждого среза геля по гидролитическому методу (Березина и др., 1974).

Просчёт радиоактивности исследуемых образцов осуществляли методом отношения каналов (Березина и др., 1974; Коломийцева, 1974) в гомогенной системе с использованием сцинтилляционной смеси на основе толуола и спирта на сцинтилляционном спектрометре LS-230 фирмы Бекман.

3. Материалы и методы для изучения активности нротеолитических ферментов и их белковых ингибиторов. Общую протеолитическую активность растворимых белков грены тутового шелкопряда определяли по методу Ансона (Anson, 1939), модифицированному для выявления активности нептидогидролаз в тканях и органах тутового шелкопряда (Клунова и др., 1987). Измерение активности трипсино- и химотрипсиноподобных прогеиназ проводили спектрофотометрическим методом в соответствии с руководством "Preparations for biochemistry" фирмы «Merck», используя в качес1ве субстратов растворы №бензоил-0,Ь-аргинин-«-нитроанилида (BAPNA) и сукцинил-0,Ь-фенилаланин-п-нитроанилида (SUPHERA). За единицу протеолитической активности принимали количество ферментного препарата, которое вызывало увеличение оптической плотности на 0,01.

Эндогенную ингибиторную активность но отношению к протеолитическим ферментам (папаину, пепсину, трипсину и химо трипсину) определяли спектрофоюметрическим методом по расщеплению субстратов гемоглобина, казеина, BAPNA и SUPHEPA соответственно Активность эндогенных

ингибиторов выражали либо в процентах от исходной активности коммерческого препарата, либо в условных единицах. За условную единицу принимали такое количество препарата ингибитора грены, которое вызывало уменьшение оптической плотности инкубационной среды на 0,01.

Субклеточное фракционирование грены тутового шелкопряда осуществляли методом дифференциального центрифугирования (Водолеев, 1977; Банников, 1983). Выделение ядер и хроматина из грены тутового шелкопряда проводили по методике, разработанной Курановой с сотр., (1985).

4. Методы выделения, очистки и характеристики ферментов белкового обмена тутового шелкопряда. Для фракционирования растворимых белков шелкоотделительной железы и грены тутового шелкопряда методом гель-фильтрации использовали сефадекс G-150 и TSK-гель марки HW-55. Ионообменную хроматографию и рехроматографию осуществляли на DEAE-целлюлозе марки Watman-32, а высокоэффективную жидкостную хроматографию на носителе TSK-DEAE марки 5pw с использованием приборов фирмы LKB и Hitachi-635. Изоэлектрофокусирование проводили в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 4-6 в колонке типа 8100-1 (LKJB, Швеция), в слое ультродекса и полиакриламидного геля на приборе "Multiphor" (LKB, Швеция). Аффинную хроматографию осуществляли на бацитрацин-сефарозе, синтезированной нами, а также на домбисорб-грамицидин-носителе, изготовленном фирмой ДИА-М.

Молекулярную массу очищенных препаратов ферментов измеряли методом гель-фильтрации и методом диск-электрофореза диссоциированных белков в 5,6% и 7,5% полиакриламидном геле, содержащем 0,1% SDS, калибруя колонки с помощью наборов маркеров молекулярных масс.

Аминокислотный состав белков определяли после гидролиза их воздушно-сухих препаратов 6н. соляной кислотой в течение 24 часов при 105°С на аминокислотных анализаторах KLA-3B фирмы Hitachi (Япония) и LC-6000 фирмы Biotronic (ФРГ).

Зависимость скорости прямой реакции, катализируемой аланинамино-трансферазой шелкоотделительной железы, от концентрации субстратов изучали с использованием сопряжённой энзиматической системы (лактатдегидрогеназа и НАДН), измеряя начальную скорость реакции по убыли экстинкции раствора при длине волны 340 нм, рН=8,5 и температуре 25°С. Константы Михаэлиса для субстратов энзима находили по графику Лайнуивера-Бэрка, построенному в двойных обратных координатах.

Концентрацию белка в пробах определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951) и методу Bradford (1976).

5. Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли, используя рекомендации Плохинского (1961) и Чарыкова (1984).

Результаты определения активности ферментов белкового обмена в тканях различных по продуктивности пород и гибридов тутового шелкопряда подвергали биометрической обработке, рассчитывая коэффициенты

(г) между хозяйственно-полезными признаками тутового шелкопряда и активностью соответствующих ферментов (Плохинский, 1961; Егорова, 1983; Меркурьева, Шангин-Березовский, 1983).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Фермент синтеза глицина, аланина, серина и тирозина в тканях и органах коконопрядущих насекомых

Результаты, характеризующие активность ферментов синтеза глицина, аланина, серина и тирозина в шелкоотделительной железе тутового шелкопряда представлены в таблице 1. Оказалось, чго пути синтеза глицина в шелкоотделительной железе весьма разнообразны. Первый из них состоит в переаминировании глиоксиловой кислоты с аланином. В этой реакции кроме аланина активными донорами аминогрупп могут быть глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, глутамин и аспарагин (перечислены в порядке убывающей активности). В противоположность реакциям переаминирования дру1их кетокислот, переаминирование, идущее с участием глиоксиловой кислоты в шелкоотделительной железе практически необратимо. Второй путь новообразования глицина в шелкоотделительной железе состоит в декарбоксилировании аминомалоиовой кислоты. С помощью метода энзим-злектрофореза в полиакриламидном геле нам впервые удалось обнаружить в тканях шелкопряда НАД+-зависимую гидроксималонатдегидрогеназу и, благодаря этому, полностью охарактеризовать весьма редкий путь синтеза i лицина. Он заключается в окислении гидроксималоновой кислоты, переаминировании образующегося кетомалоната и последующем декарбоксилировании аминомалоиовой кислоты. Третий путь биосинтеза глицина в шелкоотделительной железе заключается в преобразовании серина и треонина, однако природа реакций, ведущих к образованию из этих оксиаминокислот глицина, подробно не изучалась. В результате проведённых нами опытов обнаружено, что глицин в шелкоотделительной железе тутового шелкопряда образуется путём расщепления серина и треонина. Первый t

процесс катализирует серин-гидроксиметилтрансфераза, кофактором которой являются пиридоксальфосфат и тетрагидрофолиевая кислота. Превращение треонина в глицин осуществляется с помощью треонинальдолазы в присутствии пиридоксальфосфата. Таким образом, механизм реакций превращения серина и треонина в глицин у шелкопряда аналогичен тому, что известно в настоящее время для других организмов (Liu et al., 1998; Capelluto et al., 2000).

Алании может синтезироваться в шелкоотделительной железе путём переаминирования пирувата и [3-декарбоксилирования аспарагиновой кислоты. Переаминирование пировиноградной кислоты с глутаминовой протекает более энергично, чем с другими аминокислотами. Наши результаты подтвердили литературные данные о существовании в шёлкоотделительной железе

аспарта-1-4-декарбоксилазы. (5-декарбоксилаза - единственный пример присутствия этого фермента в животных тканях. В отличие от бактериальных клеток, оптимум рН энзима лежит в слабощелочной зоне, что приближает его к аминокислотным декарбоксилазам животных тканей.

Таблица 1.

Активность ферментов аминокислотного обмена в фиброиновом и серициновом отделах шелкоотделительной железы тутового шелкопряда, выявленная (в) с помощью аминокислотного анализатора (ДО^мкмоль аминокислоты на 1мг белка в 1мин) и (б) методом энзимэлектрофореза в полиакриламидном геле (условные единицы)_

Название фермента Серициновый отдел Фиброиновый отдел

(а) Аспартат-4-декарбоксилаза 1,4±0,1 2,3±0,2

Глутамат-пируватаминотрансфераза 37,5±3,3 26,1±2,3

Аланин-глиоксилатаминотрансфераза 15,0±1,1 47,5±4Д

Серин-гидроксиметилтрансфераза 0,7±0,1 1,9±0,2

Треонинальдолаза 4,3±0,3 7,4±0,5

Аспартат-а-кетоглугаратаминотрансфераза 18,2±1,5 18,511,1

(б) Гидроксималонатдегидрогеназа 11,0*0,9 17,011,0

Аспартат-кетомалонатаминотрансфераза 8,0±0,6 15,0±1,3

3-фосфоглицератдегидрогеназа 18,0±1,4 26,0±2,4

Фенилаланингидроксилаза 8,0±0,5 10,0±0,Э

Аспартат-а-кетоглутаратаминотрансфераза 28,0±2,2 31,0±2,6

Важнейшим промежуточным продуктом при биосинтезе серина в шелкоотделительной железе является 3-фосфооксипировиноградная кислота. Она образуется из 3-фосфоглицериновой кислоты под действием НАД1'-зависимой 3-фосфоглицератдегидрогеназы. Активность этого фермента, выявленная нами методом энзимэлектрофореза в полиакриламидном геле, в отделах железы характеризуется высокими значениями. Очевидно, переаминирование фосфооксипировишлрадной кислоты с аминокислотами является основным путём синтеза в шелкоотделительной железе серика. В этом убеждают также и опыты, продемонстрировавшие незначительный выход серина у шелкопряда из 14С-глицина и 14С-треонина (Впйеих-а^ош: с1 а1., 1960; Рикиёа, 1960; Азакига е1 а!., 1991).

Используя разработанный нами метод, мы обнаружили (табл. 1) в фиброиновом отделе шелкоотделительной железы процесс окисления фенилаланина в тирозин, осуществляемый при посредстве фенилаланин-гидроксилазы, донором электронов при этом служит производное восстановленного птерина (в наших опытах тетрш идрофолиевая кислота).

Из сравнительного анализа активности всех исследованных нами ферментов следует, что доминирующими среди них являются аланин-глио-ксилатаминотрансфераза, глутамат-пируватаминотрансфераза и аспартат-аминотрансфераза. Преобладание активности глутамат-пируватамино-трансферазы и аланин-глиоксилатаминотрансферазы отражает специфику аминокислотного обмена в шелкоотделительной железе тутового шелкопряда,

заключающуюся в необходимости наработки в V возрасте экстремальных количеств глицина и аланина для обеспечения сборки полипептидных цепей фиброина шёлка.

Синтез белков шёлка в шелкоотделительной железе не представляет какого-то изолированно протекающего самостоятельного процесса (Нгауата, Ыакатига, 2002). Из результатов, представленных в табл. 2 следует, что процессы синтеза главных аминокислот шёлка осуществляются не только непосредственно в клетках стенки шелкоотделительной железы, но активно идут и в жировом теле. Здесь присутствуют все исследуемые ферменты, в том числе и такие специфические для шелкоотделительной железы, как аспартат-кетомалонатаминотрансфераза и аспартат-4-декарбоксилаза.

Из полученных нами экспериментальных данных (табл. 1 и 2) следует, что каждая ткань тутового шелкопряда в связи с её спецификой характеризуется уникальным набором индивидуальных ферментов и определённым соотношением электрофоретических форм их. Так в заднем отделе шелкоотделительной железы максимальной активностью обладает аланин-глиоксилатаминотрансфераза (34,6мкмоля глицина/мг белка/мин • 10"3), а в переднем отделе шелкоотделительной железы - глутамат-пируватамино-трансфераза (36,0мкмолей аланина/мг белка/мин • 10'3); в вышеупомянутых тканях различен вклад в синтез глицина и аланина аспартат-4-декарбоксилазы, треонинальдолазы и серин-гидроксиметилтрансферазы. В жировом теле преобладают глутамат-пируватаминотрансфераза. аспартатаминотрансфераза, 3-фосфоглицератдегидрогеназа и фенилаланингидроксилаза. В противоположность шелкоотделительной железе и жировому телу, набор ферментов аминокислотного обмена в гемолимфе крайне беден.

По мере развития шелкопряда активность, число и соотношение форм изученных нами ферментов в тканях шелкопряда изменяется (табл. 2). При этом характер упомянутых изменений для каждого фермента строю индивидуален и связан с ролью каждого из них в процессах азотистого обмена в организме шелкопряда. Динамика большинства исследованных ферментов, таких как глутамат-пируватаминотрансфераза, треонинальдолаза, серин-гидроксиметилтрансфераза, аланин-глиоксилатаминотрансфераза, аспартат-кетомалонатаминотрансфераза и 3-фосфоглицератдегидрогеназа, характеризуется постепенным увеличением активности их параллельно скорости шелкообразования и резким спадом активности к концу завивки кокона. Максимуму синтеза глицина и аланина во второй половине V возраста соответствует возрастание содержания и активности в шелкоотделительной железе глицил- и аланил-тРНК-синтетаз (Караев, 1982; Укчуапаймп а а!., 1988). В период завивки кокона дефицит в шелкоотделительной железе аланина, глицина и серина восполняется за счёт фонда свободных и связанных аминокислот жирового тела, который создаётся в период активною питания гусениц.

Харак1ерно, что особенно существенные сдвиги в активности ферментов по мере развития шелкопряда присущи глутамат-пируватаминотрансферазе,

аланин-глиоксилатаминотрансферазе и аспартатаминотрансферазе, то есть ферментам, имеющим наибольшее физиологическое значение для исследуемых тканей.

Всё вышесказанное свидетельствует о юм, что процессом аминокислотного обмена в различных тканях тутового шелкопряда тесно взаимосвязаны и тонко координированы. Характер распределения и динамика активности всех исследуемых ферментов в тканях тутового шелкопряда коррелирует с процессами шелкообразования.

Таблица 2.

Активность ферментов аминокислотного обмена в различных тканях тутового и дубового шелкопрядов (мкмолях аминокислоты/мг белка/мин • 10~3)

Название

Фермента

Вид шелкопряда

Глутамэт- Тутовый пируеатами- шелкопряд нотрансфе- Дубовый раза__шелкопряд

Активность

Гемолимфа

-ГПГрЯТ~'*~

Жировое тело

I | II | III | IV I [~1Г

Передний отдел шелкоотделительной железы

III

IV

Задний отдел шелкоотделктельной

_железы_

I | II | III

1,3 18,3 35,8 25,7 9,4 24,в 36,0 34,в 16,7 23,8 26,3 22,0 17,2

±0,1 ±1,6 ±3,3 ±2,3 ±0,8 ±2,1 ±3,1 ±3,2 ±1,3 ±2.1 ±2,3 ±2,0 ±1,5

1П,в 5,1 5,8 11,6 16,0 17,5 15.5 12,0 17,2 14,4 11,3 14,3

±0,9 ±0,4 ±0,5 ±10 ±1,5 ±16 ±1,4 ±1,1 ±1,4 ±1,3 ±1,0 ±1,3

£4 ¡¡А 2Я 21 2,2 _ _ 1,1 1,0 3,3 1,6 2,6 2,2

±0,1 ±0,2 ±0,3 ±0 2 ±0,2 ±0,1 ±0,1 ±0,4 ±0,2 ±0,2 ±0 2

2,2 2,1 3,4 10,2 _ 3,1 4,6 4,7 3,2 4,9 5,8 1,6

±0,1 ±0,2 ±0,2 ±1,0_±0,3 ±0,4 ±0,4 ±0,3 ±0,3 ±0,8 ±0,1

Аспартат Тутовый [Некарбо шелкопряд ксмлаэа Дубовый шелкопряд

треониналь-долаза

Тутовый шелкопряд Дубовый шелкопряд

Серит+окси- Тутовый

метхлтранс- шелкопряд

фераза Дубовый

__шелкопряд

Аланим-глио- Тутовый

ксилатвмино- шелкопряд

трансфераза Дубовый шелкопряд

1,4 5,2 8,5 7,1 5,4 3,7

±0,1 ±0,4 ±0,7 ±0,6 ±0,6 ±0,4

4 6 5,9 4 1 5,3 0,8

±0,4 ±0.4 ±0,4 ±0,5 ±0,1

1,3 1,0 1,3 2 8 2,3

±0,1 ±0,1 ±01 ±0 3 ±0 2

1.8 2 8 _ 18

±0,2 ±0,2 ±0,2

03 ±01

3,8 2,5

±0,4 ±0,2

1,3 2,1

±01 ±0,2 1,1 ±01

0,6 0 9

±0,1 ±0,1

1Л ±0,1 2,0 ±0,2

0,4 ±0,1

4,5 5,4 ±0,4 ±0,5 1,1 1,3 ±0,1 jo.l 1,0 2,9 ±0 1 ±0,3 0,6 1,8 ±0.1 ±0.2

4,4 1,6 ±0,3 ±0,1 0,6 1,2 ±0,1 ±0,1 48 05 ±04 ±0,1 0,4 ±0,1

1,5 9,8 19,2 17,1 12,5 10,9 21,8 18,3 13,3 17,9 24,9 34,6 9,2

±0,1 ±1,1 ±2,1 ±1,6 ±1,1 ±1,0 ±2,0 ±1,7 ±1,2 ±1,6 ±2,3 ±3,5 ±1,1

8,8 7.6 8,5 23,0 3,0 4,2 7,4 5,2 6,4 13,8 12,1 15,9

_±0l7 ±0,6 ±0,7 ±2,0 ±0 2 ±0,3 ±0,7 ±0,4 ±0,5 ±1,1 ±1,1 ±1,4

Аспартат-»- Тутовый 2,5 2,0 4,3 5,5 15,4 27,3 SO,2 13,4 16,0 5,5 13,0 16,4 19,3 6,3 12,1 18,3

квтоглутарот шелкопряд ±0,2 ±0,2 ±0,4 ±0,4 ±1,6 ±2,8 ±19 ±14 ±15 ±0,в ±1,1 ±1,5 ±2,0 ±0 5 ±1,1 ±1,7

аминотранс- Дубовый 6,0 4,5 4,0 2,6 9,4 11,8 13 6 10,9 111 101 11,2 9,9 8,3 18,2 8,2 9 1

шелкопряд ±0,5 ±0,4 ±0,3 ±0.3 ±1,0 ±1,1 ±1,2 ±1,0 ±1,0 ±0,9 ±1,0 ±0,8 ±0,7 ±16 ±0.7 ±0В

Условные обозначения: I - гусеницы 3-го дня V возраста;

И - гусеницы перед яаяивкой кокона; Ш - гусеницы 1-го дня завивки кокона; IV - гусеницы З-го дня завивки кокона.

Продолжая исследования по установлению более чётких и глубоких корреляций между объёмом синтеза главных аминокислот шёлка и соотношением последних в составе шёлкового волокна, мы провели сравнительное исследование активности синтеза глицина, аланина, серина и тирозина в ряде тканей тутового и дубового шелкопрядов, а также павлиноглазки Артемиды, резко контрастирующих по соотношению упомянутых аминокислот в продуцируемых ими фиброине и серицине.

Из таблиц 2 и 3 следует, что ферментные системы синтеза глицина, аланина, серина и тирозина в тканях тутового и дубового шелкопрядов в основном однотипны. Основными путями синтеза глицина, аланина и серина в тканях и гутового, дубового шелкопрядов и павлиноглазки Артемиды являются реакции переаминирования пировиноградной, глиоксиловой и а-

кеюглутаровой кислот с первичными аминокислотами, а центрами новообразования их - шелкоотделительная железа и жировое тело.

Следовательно, отмеченный выше тип организации систем ферментов синтеза глицина, аланина и серина оптимален для выполнения специфической биологической функции, то есть интенсивной наработки в течение короткого срока больших количеств перечисленных аминокислот для обеспечения биосинтеза фиброина и серицина. Вследствие этого, по-видимому, в процессе эволюции она жёстко закрепилась в геноме шелкопрядов и существенно не модифицировалась.

В ферментных спектрах тутового и дубового шелкопрядов отражаются не только видовые, но и метаболические особенности, которыми обладают указанные виды насекомых. Экспериментальные данные, приведённые в таблицах 2 и 3, показывают, что активность большинства ферментов синтеза глицина, аланина, серина и тирозина в тканях тутового шелкопряда значительно выше, чем в соответствующих тканях дубового шелкопряда и павлиноглазки. Известно, что коэффициент использования азота распадающихся аминокислот для новообразования главных аминокислот шёлка у тутового шелкопряда в 2-3 раза выше, чем у дубового (Филиппович, 1963). Следовательно, способность к синтезу главных аминокислот шёлка у домашнего и диких видов шелкопряда тесным образом связана с объёмом их шелкопродукции. Чем выше метаболический потенциал организма (объём шелкопродукции), тем глубже специализация аминокислотного обмена и, в частное ги, активность ферментов синтеза главных аминокислот шёлка. Есть основания утверждать, что видовая вариабельность ферментов синтеза главных аминокислот шёлка в тканях коконопрядущих насекомых является результатом различий в экологии и биологии этих видов насекомых, равно как и итогом искусственного отбора, который в течение многих веков применялся в селекции тутового шелкопряда.

Сравнительный анализ активности исследованных ферментов в задних отделах шелкоотделительных желёз различных видов коконопрядущих насекомых, продуцирующих фиброины с резко противоположным соотношением в них глицина и аланина, показал, что распределение доминирующих ферментов синтеза глицина и аланина (аланин-глиоксилатаминотрансфераза и глутамат-пируватаминотрансфераза) в задних отделах шелкоотделительных желёз тутового шелкопряда, дубового шелкопряда и павлиноглазки Артемиды коррелирует с аминокислотным составом их фиброинов. Относительно высокому содержанию в составе фиброина тутового шелкопряда глицина соответствует в заднем отделе его шелкоотделительной железы более высокая активность аланин-глиоксилатаминотрансферазы (34,6мкмоля аминокислоты ■ 10'VMr белка/мин) по сравнению с активностью аланинаминотрансферазы (22,0мкмоля аминокислоты 10'3/мг белка/мин). В фиброиновом отделе

шелкоотделительной железы дубового шелкопряда и павлиноглазки, где синтезируются белки, богатые аланином, cooi ношение активности

упомянутых ферментов противоположно (13,8 и 14,4; 1,4 и 14,3 ■ 10"3мкмолей аминокислоты/мг белка/мин у дубового шелкопряда и павлиноглазки соответственно). Существенно, что соотношение активностей аланин-глиоксилатаминотрансферазы и глутамат-пируватаминотрансферазы в заднем отделе шелкоотделительной железы, выражаемое коэффициентом 1,6, близко к соотношению глицина и аланина в фиброине шёлка, составляющее 1,3. Соответствие уровня и соотношения активности аланин-глиоксилатамино-траясферазы в заднем отделе шелкоотделительной железы количественному содержанию в синтезируемом здесь фиброине шёлка глицина наводит на мысль о том, что аланин-глиоксилатаминотрансфераза является маркерным, органоспецифическим ферментом заднего отдела шелкоотделительной железы тутового шелкопряда.

Таблица 3

Активность ферментов аминокислотного обмена в различных тканях

тутового шелкопряда и павлиноглазки Артемиды

Название фермента Вид насекомого Активность фермента (в мкмолях аминокислоты/мг белка/мин ■ 10-3

жировое тело передний отдел шелкоотделительной железы заднии отд-дел шелкоотделительной железы

Глутамат-пируват-а м и нотрансфераза тутовый шелкопряд павлиноглазка 35,8±ЭД 2,7Ю,2 36,010,1 7,3±0,2 26,312,1 3,610,2

Аспартат-а-кетоглута-ратаминотрансфераза тутовый шелкопряд павлиноглазка 27,3±1,5 14,4±0,7 5,5±0,4 15,210,5 6,3±0,5 5,610,3

Аланин-глиоксилат-аминотрансфераза тутовый шелкопряд павлиноглазка 19,211,4 14,010,6 21,8±2,0 0,8±0Д 34,612,3 1,410,1

Треонинальдолаза тутовый шелкопряд павлиноглазка 8,510,7 3,210,2 3,8±0,3 5,4±0,4

Аспартат-4-декарбоксилаза тутовый шелкопряд павлиноглазка 2,1±0,2 1,8±0,1 0,910,1 2,5±0,2 1,610,2 3,110,2

У насекомых ферментативный аппарат, обуславливающий специфическую направленность обмена веществ в его тканях, претерпевает периодические и закономерные изменения при переходе от одной фазы развития к другой. Для выявления фазовой специфичности в организации ферментов аминокислотного обмена у коконопрядущего насекомого мы на следующем этапе нашей работы предприняли попытку изучить активность ферментов аминокислотного обмена в эмбриогенезе тутового шелкопряда.

В грене тутового шелкопряда нами не обнаружено активности около половины энзимов (аспартат-Р-декарбоксилазы, треонинальдолазы, аланин-глиоксилатаминотрансферазы, оксималонатдегидрогеназа и глутаматдегидро-геназы) аминокислотного обмена, выявленных на личиночной фазе развития насекомого Вышеперечисленные ферменты фазоспецифичны и функционируют в тканях и органах личинки тутового шелкопряда в результате изменения программы развития организма.

Белковые компоненты тканей и органов тутового шелкопряда как источники азотистого материала для синтеза главных аминокислот шёлка

Известно, что определённая часть белков шёлка синтезируется во время завивки кокона, когда не происходит поступления аминокислот из пищи (Амбарцумова и др., 1967; Нопе й а1., 1978; Шгауаша, Ыакашига, 2002). Ногучи с соавт. (Тм'о£исЫ й а1., 1974). изучая взаимосвязь белкового обмена шелкоотделительной железы и других тканей шелкопряда, пришли к выводу, что формирование шёлка в период завивки кокона в значительной мере контролируется уровнем белковых резервов тканей. Однако, количественной оценки степени использования в ходе шелкообразования белков каждой ткани шелкопряда в отдельности и конкретных сведений о функциональной роли в эгом процессе отдельных белков не было получено

Сопоставление данных по удельной и общей радиоактивности белков и фонда свободных предшественников в каждой ткани тутового шелкопряда после инъекции в ею гемолимфу 2-!4С-глицина показывает, что наибольшей синтетической активностью в середине V личиночного возрасга характеризуется шелкоотделительная железа тутового шелкопряда Наименьший уровень радиоактивности в этот период развития наблюдается в белках стенки кишечника и гемолимфы, средний - в каркасе и жировом теле. По мере развития шелкопряда происходит перераспределение радиоактивного азотсодержащего материала между его тканями. Сведение баланса радиоактивности в период завивки кокона показывает, что за счёт меченых компонентов тканей шелкопряда, накопленных в них к началу завивки кокона, формируется 11,2% радиоактивности шёлкового волокна, в том числе 48,69% радиоактивности формируется за счёт белков гемолимфы (18,29%), жирового тела (10,28%), каркаса (16,74%) и стенки кишечника (3,37%), а 11,97% - за счёт свободных аминокислот этих тканей и шелкоотделительной железы.

Характер динамики радиоактивности белков с величинами ОЭП = 0,02; 0,05; 0,09 и 0,24 (см. рис.1) во всех исследованных тканях позволяет констатировать, что эти наиболее высоко и быстро метящиеся белки активно синтезируются в жировом теле в течение V личиночного возраста, накапливаются в период питания в стенке кишечника и каркасе и используются через посредство гемолимфы шелкоотделительной железой в период завивки кокона. Аминокислотный состав ни одной из перечисленных выше белковых фракций гемолимфы не соответствует аминокислотном)' составу белков шёлка. Учитывая обогащённость выше перечисленных фракций белков валином, глутаминовой кислотой, изолейцином, фенилаланином и тирозином, характерную также для пула свободных аминокислот шелкоотделшельной железы (Клунова, 1970) и высокую активность ферментов аминокислотного обмена в ней, можно заключить, что белки гемолимфы с величинами ОЭП 0,02; 0,05; 0,09 и 0,24 являются

поставщиками азотистого материала для синтеза в шелкоотделительной железе главных аминокислот шёлка.

Характер динамики радиоактивности белков с величинами ОЭП 0,42; 0,50; 0,55 и 0,60 в течение V личиночного возраста свидетельствует о том, что они могут принимать участие в процессе шелкообразования, но не в качестве источника предшественников для биосинтеза белков шёлка, а возможно, для обслуживания этого процесса.

Взаимосвязь белкового обмена различных тканей шелкопряда осуществляется не только за счёт белков, являющихся общими для всех исследуемых тканей, но и тех, которые характерны только для некоторых тканей (фракции с величинами ОЭП 0,11; 0,13; 0,18 и 0,22). Динамика радиоактивности белков с величинами ОЭП 0,16; 0,28 и 0,35 на протяжении V личиночного возраста и периода завивки кокона показала, что это запасные протеины, которые накапливаются в гемолимфе предкуколки тутового шелкопряда и используются впоследствии для построения тканей куколки и имаго.

Таким образом, исследование метаболизма |4С-растворимых белков тканей тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития методом электрофореза в полиакриламидном геле позволило охарактеризовать функциональную роль отдельных белковых фракций в процессе шелкообразования- и личиночно-куколочной трансформации.

Инъекция препарата 14С-белков гемолимфы в организм тутового шелкопряда и дальнейшее изучение распределения радиоактивного предшественника между белковой и аминокислотной фракциями исследуемых тканей и органов (табл. 4) позволили установить судьбу белков гемолимфы на заключительной стадии личиночного развития насекомого. Из таблицы 4 следует, что через час после инъекции меченых белков в организм шелкопряда удельная радиоактивность растворимых белков тканей примерно в 10 раз выше таковой нерастворимых, а радиоактивность фонда свободных аминокислот составляет 15,4% от радиоактивности суммарных белков, учтённой во всех исследуемых тканях шелкопряда.

Наиболее высокий уровень удельной радиоактивности характерен для растворимых белков жирового тела. Последнее обстоятельство свидетельствует о том, что местом синтеза белков использующихся в период завивки кокона для шелкообразования, является жировое тело шелкопряда.

Использование |4С-белков гемолимфы различными тканями шелкопряда в период завивки кокона существенно отличается от такового во второй половине V личиночного возраста: жировое тело не аккумулирует меченые белки гемолимфы, их в значительной мере использует шелкоотделительная железа. Об этом свидетельствуют наиболее низкая по сравнению с другими тканями удельная радиоактивность белков жирового тела и наиболее высокая - белков шелкоотделительной железы.

А. 5 день V возраста

Гемолимфа

Жировое тело

| 1200

' 1000

I

I 800

| 600

I 400

1 200

I

I о

расп/мин

1

Шя 1 тТтгт

0,1 0.2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

Б.

В. Перед завивкой кокона

1 1 0.2 0 3 0,4 0 5 0.« 0,7 0,8 0,8

I ОЭП 0 1 0,г 0,3 0,4 0,5 0,5 0,7 0,8 0,9

Рисунок 1. С хема распределения радиоактивности и растворимых белков гемолимфы и

жирового тела на колонках цолиакриламидно! о геля после иньекции в гемолимфу личинки гутового шелкопряда 2-нС-глицина

Г.) день завивки кокона Гемолимфа Жировое тело

расд/мин

рзсп./ыин

Д. II! день завивки кокона

Рисунок 1. (продолжение)

Таблица 4.

Радиоактивность растворимых и нерастворимых белков тканей тутового шелкопряда после инъекции в его организм радиоактивного белкового препарата, _полученного из гемолимфы после введения в неё 2-*4С-глицина_

Сроки развития (время после Ткань Удельная радиоактивность (в распадах в мин на мг белка)

инъекции) Растворимые белки Нерастворимые белки

После инъекции препарата гемолимфы с удельной радиоактивностью 49688 расп/мин/мг белка

8-ой день Гемолимфа 1415145 —

V возраста (1 ч) Жировое тело 27871138 24915

Фиброиновый отдел 24201138 718147

Серициновый отдел 2642±197 241118

Каркас 623161 29617

Стенка кишечника 13991129 11118

После инъекции препарата гемолимфы с удельной радиоактивностью 123641 расп/мин/мг белка

1 день завивки Гемолимфа 40841154 —

кокона (1 ч) Жировое тело 539126 341115

Фиброиновый отдел 1986150 53281250

Серициновый отдел 83221324 24821111

Каркас 573112 1475153

Стенка кишечника 679129 377115

Оболочка кокона — 580441271

Исследование протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов у тутового шелкопряда

Для выяснения закономерностей мобилизации резервных белков в процессах построения белков шёлка мы исследовали протеолитический комплекс тканей и органов тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития. Использование современных методов тестирования иротеолитической активности с использованием природных и модельных субстратов показало, что эндогенные пептидогидролазы тканей и органов 1

гутового шелкопряда представлены многокомпонентным комплексом ферментов, активных при кислых, нейтральных и щёлочных значениях рН (наиболее эффективных при рН 3,4; 6,2 и 8,6, а в некоторых тканях при рН 7,0; 1

7,8; 9,9 и 10,9), что обеспечивает специфичность и согласованность деструкции белковых субстратов в процессе развития насекомого, а высокий уровень активности и разнообразие пептидогидролаз в жировом теле и шелкоогделигельной железе шелкопряда предопределяет центральную роль их н процессах перестройки соединений белковой природы тканей в белки шёлка. Низкий уровень пептидогидролазной активности в гемолимфе подтверждает транспортную функцию её в азотистом обмене шелкопряда.

Сопоставление динамики общей протеолитической активности в тканях и органах гутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития с результатами изменения в тканях удельной радиоактивности меченых белков после инъекции в гемолимфу гусениц 4-го дня V возраста 2-|4С-глицина показывает, что анализируемые параметры находятся в обратной зависимости (см. рис. 2).

Роль отдельных энзимов протеолитического комплекса тканей в мобилизации белков тканей для построения белков шёлка неодинакова. Так, пептидогидролазы жирового тела функционируют лишь в период активного питания насекомого, в то время как протеолитические ферменты " шелкоотделительной железы - в течение всего периода шелкообразования. При этом наиболее ярко в связи с процессами шелкообразования в жировом теле выступает динамика пептидогидролазы, осуществляющей гидролиз при 1 рН=3,4, а в шелкоотделительной железе - при рН=6,2, что позволяет их считать ферментами, обеспечивающими специфическую направленность процессов катаболизма белков в тканях и органах тутового шелкопряда. Специально поставленные эксперименты показали, что пептидогидролазы с оптимумом рН 3,4 и 6,2 представлены цистеиновыми протеиназами.

Интересно, что в первый день завивки кокона, когда гусеница не питается, и белки шёлка формируются исключительно за счёт азотистых компонентов иных тканей шелкопряда, протеолитическая активность сохраняется па высоком уровне лишь в шелкоотделительной железе, что может свидетельствовать о временной и пространственной компартментализации процессов деструкции запасных белков у тутового шелкопряда. Таким образом, протеолитические ферменты выступают в качестве важнейшею механизма переключения отдельных этапов программы азотистого обмена в тканях и органах тутового шелкопряда.

Деструкция запасных белков при участии пептидогидролаз сопровождает не только период шелкообразования, но и является характерной особенностью метаболизма белков на всём протяжении эмбриогенеза. Азотистый обмен в эмбриогенезе протекает в закрытой системе, благодаря чему фена тутового шелкопряда является наиболее удобной моделью для изучения не только закономерностей деструкции под воздействием пептидогидролаз конкретных белков, но и механизмов регуляции их активности.

Экспериментальные данные показали, что в составе грены тутового шелкопряда присутствуют аспартильные (оптимум рН 3,0), цистеиновые (оптимум рН 3,0; 3,6; 6,2 и 8,6) и сериновые (оптимум рН 6,2; 7,2; 8,6 и 9,0) протеиназы. При этом сериновые пептидогидролазы с оптимумом рН 7,2 являются химотрипсиноподобными, а с оптимумом рН 9,0 - трипсино-подобными протеиназами. В яйцах туювого шелкопряда совместно с комплексом пептидогидролаз приеу1С1вует не менее сложный комплекс белковых ингибиторов протеиназ, функционирующих при тех же значениях рН, что и эндогенные пептидогидролазы (рис. 3).

фиброиноеый отдел

Стадии развития

Стадия развития

Условные обозначения:

—♦— Протеиназа с оншмумом рН 3,4 —и— Протеиназа с оптимумом рН 6,2 —л— Про1еиназа с оптимумом рН 8,6 —ж— Протеиназа с оптимумом рН 9,9 —и— Удельная радиоактивность

Рисунок 2. Изменение активности ттептидогидролаз и удельной радиоактивности прспараюв тгальных 14С-белков тканей тутового шелкопряда на заключительном этапе личиночного развития

Исследование изменения активности эндогенных протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов в эмбриогенезе тутового шелкопряда показало, что наиболее яркой чертой динамики тех и других является взаимообусловленный характер зависимости между активностью исследуемых ферментов и их ингибиторов.

Так, неоплодотворённые яйца тутового шелкопряда характеризуются невысоким уровнем активности как протеолитических ферментов, так и их белковых ингибиторов. Согласно литературным данным, неоплодотворённая грена обладает невысокой концентрацией свободных аминокислот (Толчинская, 1976), всех видов нуклеиновых кислот и ограниченным набором множес-гненных форм ферментов (Коничсв, 1974; Толчинская, 1976; Филиппович и др., 1992).

Самые ранние стадии преддиапаузного развития зародыша тутового шелкопряда сопровождаются резким возрастанием уровня активности лишь аспартильных катепсино-В-подобных и кислых цистеиновых протеиназ (в 2 раза) и их белковых ингибиторов (оптимум рН 3,0 в 3,2 раза). Анализ литературных данных позволяет полагать, что возрастание после оплодотворения активности пептидогидролаз и их белковых ингибиторов обеспечивается в грене за счёт механизмов регуляции их активности, одним из коюрых может быть ограниченный протеолиз.

Последующие отапы преддиапаузного развития грены характеризуются постепенным возрастанием активности как пептидогидролаз, так и их белковых ингибиторов. При этом максимального уровня активности (для данного этапа развития) протеолитические ферменты достигают после прохождения зародышем стадии гаструлы, а ингибиторы - по завершении преддиапаузного развития и вхождения в диапаузу. Именно на стадии гаструлы отмечено увеличение количества РНК (Коничев, 1974) и активности ферментов аминокислотного обмена в грене гутового шелкопряда.

В период диапаузы в грене тутового шелкопряда значительная активность белковых ингибиторов пептидогидролаз, наблюдаемая в этот период, удерживает на низком уровне активность большинства протеолитических ферментов, что обеспечивает грене состояние физиологического и метаболического покоя.

Биохимическая направленность постдиапаузного периода развития грены своди гея к прогрессирующей деградации запасных белков желтка и новообразованию специфических белков зародыша. В этот период активность пептидогидролаз и их ингибиторов невелика Исключение составляют кислые цистеиновые (оптимум рН 3,0) и химотрипсиноподобные протеиназы, обладающие средним уровнем активности и обеспечивающие протеолиз запасных белков на начальных этапах постдиапаузного периода развития грены. На последующих этапах постдиапаузного периода развития наблюдается постепенное возрастание активности протеолитических ферментов и их ингибиторов, большинство из которых достигает максимального уровня её на 6-7 дни весенней инкубации грены, что

соответствует стадии формирования белой гусеницы и сопряжено с клеточной мультипликацией и процессами роста эмбриона

- ♦ - активность ингибитора пепсина —■— активность ингибитора трипсина —А— активность ингибитора папаина —X— активность ингибитора химотрипсина

Рисунок 3. Изменение активности эндогенных ингибиторов пептидогидролаз в грене тутового шелкопряда в зависимости от рН инкубационной среды

Таким образом, приведённые выше экспериментальные данные свидетельствуют о том, что судьба каждого из компонентов эндогенного комплекса пешидогидролаз и их белковых ингибиторов строго индивидуальна, что обеспечивает чёткую упорядоченность процессов протеолиза индивидуальных белков в эмбриогенезе насекомого. Взаимообусловленность характера динамики белковых ингибиторов и конкретных пептидогидролаз показывает, что основная функция белковых ингибиторов в грене состоит в регуляции активности эндогенных протеаз, предотвращая тем самым неуправляемый протеолиз.

Максимальный уровень протеолитической активности исследованных аспартильных, кислых и слабокислых цистеиновых протеиназ (оптимум рН 3,0; 3,6 и 6,2), основной функцией которых является деградация запасных белков, главным образом присущ лизосомальной фракции грены Существенно меньший уровень активности характерен для ядерной и митохондриалъной фракций грены В литературе имеются сведения о наличии лизосомальных цистеиновых и аспартильных протеиназ в яйцах насекомых (Иванов, 1985; Takahashi et al., 1993; Dittmer, Raikhel, 1997; Cho et al, 1999), а также об обнаружении цистеиновых протеиназ в ядерной и mhi охондриальной фракциях животных клеток (Куцый и др , 1999; Скулачев, 2000; Фильченков, 2003; Chen et al., 1998).

Существенно, что белковые ингибиторы кислых пептидогидролаз локализованы в тех же компартментах фены, что и протеолитические ферменты. При этом уровень активности белковых ингибиторов во всех случаях дополнителен по отношению к активности соответствующего энзима.

Резкое преобладание активности белковых ингибиторов аспартильных, дистеиновых и сериновых протеиназ над активностью соответствующих пептидогидролаз в ядерной фракции грены свидетельствует на наш взгляд о возможном участии ингибиторов пептидогидролаз в поддержании структуры и целостности ядер, ибо протеолигическое расщепление их жизненно важных структурных и функциональных белков (ингибиторов ДНКазы и белка р-53, поли-(АДФ-рибозо)-полимеразы и ферментов репарации) приводит к нарушению структурной организации органелл, к разбалансировке упорядоченных биохимических реакций в них и в итоге к фрагментации ДНК и гибели клеток.

Наличие активности белковых ингибиторов цистеиновых и аспартильных протеиназ в митохондриальной фракции, по-видимому, связано с присутствием в этом комиартменте соответствующих протеиназ и с защитой структурных и функциональных белков от протеолитического действия этих энзимов.

Не исключено, что белковые ингибиторы протеаз ядер и митохондрий фены тутового шелкопряда принимают участие в регуляции механизмов процесса клеточной гибели (апоптоза).

Локализация белковых ингибиторов протеиназ в лизосомальной фракции доказывает участие этих белков в процессах регуляции гидролиза запасных белков желтка в ходе эмбрионального развития тутового шелкопряда.

Среди пептидогидролаз субклеточных фракций значительный интерес представляют протеолитические ферменты структурных элементов ядра, в частности, хроматина. Подробный анализ протеолитических ферментов хроматина как целостного комплекса до настоящего времени не осуществлён. Практически полностью отсутствует информация о протеазах хроматина насекомых.

В составе хроматина фены тутового шелкопряда нами обнаружено присутствие достаточно сложного комплекса протеолитических ферментов, функционирующих при разнообразных значениях рН (оптимум рН 3,4; 6,2; 7,8 и 9,9). Это согласуется с имеющимися в литературе данными о присутствии в хроматине эукариот протеаз с оптимумом в широком диапазоне рН (от 4 до 11) (Motizuki et al., 1988). Преобладание "кислых" протеаз в составе хроматина фены соответствует данным о доминировании сходных ферментов в протеолитическом комплексе, осуществляющем гидролиз запасных белков грены, что может говорить о тесной связи данных протеолитических комплексов. В хроматине других организмов не обнаруживается преобладания протеолитической активности в кислой области рН (Lipinska, Klyszejno-Stefanovich, 1980).

^ 1200 ■ I 1000 -

* 800 -

§

Б боо -

ё 400-

о

200 -0 •

8 9

Дни развития

4 6

Дни развития

■ грена (белки, растворимые в 0.35М №С1)

- хроматин (экстракт лабильно связанных белков)

- грена (Оелкт, растворимые в 0,35М ЫаС1) -хроматин (экстракт прочно связанных белков)

Рисунок 4, Изменение удельной активности протеаз с оптимумами рН 3, 4(А) и 6,2(В) в холе постдиапаузного развития 1-рены тутового шелкопряда

Нами прослежено (рис. 4) изменение активности протеаз с оптимумом рН 3,4 и 6,2 в развивающейся грене в каждой из двух исследованных субфракций белков хроматина. Активность протеазы с оптимумом рН 3,4 в составе лабильно связанных белков хроматина возрастает к 8-му дню весеннего развития грены (стадия формирования белой гусеницы). Это коррелирует с ускорением умножения числа клеток и роста эмбриона, а также с накоплением ДНК и РНК и усилением новообразования аминокислот и белков. На основании приведённых данных напрашивается предположение о важной роли в развитии эмбриона тутового шелкопряда протеазы с оптимумом рН 3,4 хроматина.

На рисунке 4 также ясно видно, что переход протеазы с оптимумом рН 6,2 из прочно связанного в лабильно связанное состояние соответствует 4 дню эмбрионального развития (стадия укорочения зародыша). Этот период характеризуется усилением интенсивности биосинтеза ДНК, изменением структурного состояния и метаболической активности хроматина. Поэтому можно допустить, что протеаза с оптимумом рН 6,2 имеет отношение к процессам активации генома, предшествующим дифференцировке и органогенезу у тутового шелкопряда.

Всё сказанное подтверждает вышесказанную концепцию о полифункциональном характере протеолитического комплекса хроматина грены и об участии его в реализации фундаментальных процессов в организме насекомого.

Ферменты бепкового обмена как маркеры продуктивности и явление гетерозиса у тутового шелкопряда

Поскольку наследственная информация реализуется в значительной мере через посредство энзиматических систем организма, исследование ферментативной активности белков, как биохимических тестов для прогнозирования продуктивности и эффекта гетерозиса в потомстве, явилось одним из наиболее перспективных и принципиально новых направлений в селекции (Егорова, 1983; Коничев, 1991). Несмотря на широкий круг исследований по биохимии тутового шелкопряда, вопрос о взаимосвязи его продуктивности и эффекта гетерозиса с активностью ферментов белкового обмена был изучен недостаточно.

Полученные нами экспериментальные данные показали, что практически активность всех изученных нами ферментов в тканях и органах тутового шелкопряда взаимосвязана с продуктивностью. Наиболее ярко взаимосвязь между биологическими показателями и активностью исследуемых ферментов прослеживается в тканях, занимающих ключевые позиции в процессах аминокислотного обмена в организме тутового шелкопряда - жировом теле и заднем отделе шелкоотделительной железы, где активность ферментов у высокопродуктивных пород, по сравнению с низкопродуктивной, в 2-4 раза выше. Следовательно, высокопродуктивные породы тутового шелкопряда

характеризуются более выраженной способностью к синтезу главных аминокислот шёлка.

Положительную связь с биологическими показателями в каждой ткани обнаруживают в большей степени органоспецифические ферменты, то есть те ферменты, которые являются носителями функциональной направленности обмена веществ в данной ткани.

Продолжая изучение ферментов аминокислотного обмена у тутового шелкопряда в породно-гибридном аспекте, мы сочли необходимым выбрагь для этой цели те энзимы (аспартат- и аланинаминотрансферазу), активность которых в тканях и органах насекомого могла быть детектирована более доступными методами. Обнаружена положительная, статистически достоверная корреляция высокого порядка между активностью аспартат- и аланинаминотрансферазы в ряде тканей и органов личинок исследованных пород и гибридов, с одной стороны, и средним весом кокона, весом шёлковой оболочки и шелконосносгью, с другой.

Следовательно, в активации процессов переаминирования в тканях гибридов по сравнению с таковыми у исходных пород проявляется гегерозис гугового шелкопряда на биохимическом уровне. Логическим итогом этого является более высокий уровень биосинтеза аминокислот и белков в 1канях высокогетерозисных гибридов.

Наиболее чёткую положительную взаимосвязь с превосходством гибридных организмов по отношению к среднеродительским показателям по весу кокона, весу шёлковой оболочки и шелконосности проявляет аланинаминотрансфераза серицинового отдела шелкоотделительной железы, которая по существу является носителем функциональной направленности обмена веществ в данной ткани насекомого.

Важнейшей задачей современного шелководства является создание биохимических тестов для раннего прогнозирования продуктивности, что предполагает значительный экономический эффект Исследование активности аланин- и аспартатаминотрансферазы, а также 3-фосфоглицератдегидрогеназы в грене в породно-гибридном аспекте позволило установить положительную статистически достоверную корреляцию между активностью перечисленных выше ферментов в грене 9-и контрастных по продуктивности пород тутовою шелкопряда с одной стороны и шелконосностью коконов и весом шёлковой оболочки - с другой.

Эта закономерность подтверждена результататми анализа активности указанных аминотрансфераз в фене 22-х родительских пород и 193-х прямых и обратных гибридов, полученных при их скрещивании Контрольная выкормка на базе Росшёлкстанции 13-ти контрастных по активности исследуемых ферментов гибридов тутового шелкопряда выявила 100%-ную корреляцию между шелконосностью их коконов и уровнем аминотрансферазной активности в грене (табл 5).

Таблица 5.

Сопоставление активности аланин- и аспартатаминотрансферазы в грене с показателем шелконосности пород и гибридов тутового шелкопряда _

Гибриды Активность аланин-аминотрансферазы Активность аспартатаминотрансферазы Шелконосность сырых коконов

РС-5 х Джень-5 +24,1 +52,2 +2,8

РС-3 х РС-4 +21,8 +16,0 +4,5

Б-2 х Кит.-21 +8,5 +86,0 +7,0

РС-5 х Кит.-21 +22,6 +48,1 +1,0

ПС-5ул. х Б-2 +19,6 +25,5 +2,9

Джень-5 х Сусс.-16 0 +28,3 0 +5,0 +9,9

РС-4 х Б-2 +24,1 0

ПС-5ул. х СК-2 +11,5 +2,0

Кит-118 х Джень-5 -20,2 -10,4 0

СК-2 х САНИИШ-80 -20,5 -6,8 -4,0

РС-2ул. х РС-1 -9,1 -12,3 -1Д

Цян-Мао21*РС-2ул. -16,7 -5,3 -3,4

Кит.-118 х Кит.-109| -20,4 -36,4 -9,6

Примечание: активность ферментов и шелконосность коконов выражена в % к

среднеродительским показателям; (+) - увеличение соответствующего показателя, (-) - снижение соответствующего показателя по отношению к среднеродительскому.

Сопоставление значений коэффициентов корреляции белковых ингибиторов с опгимумами рН 3,0; 6,2 и 8,6 со значениями коэффициентов корреляции цистеиновых протеиназ с оптимумами рН 3,0; 6,2; 8,6 и с хозяйственно-полезными признаками, демонстрирует дополнительность и взаимообусловленность этих величин и позволяет заключить, что блаюдаря взаимодействию белковых ингибиторов с протеиназой мишенью, активность каждой конкретной пептидогидролазы в грене в определённой степени коррелирует с хозяйственно-полезными признаками (шелконосностью, средним весом кокона и массой шелковой оболочки) исследуемых пород тутового шелкопряда.

Установлена положительная корреляция между уровнем активности кислых цистеиновых протеиназ (оптимум рН 3,0 и 3,6) в развивающейся грене 6-ти родительских пород и 8-ми гибридов, полученных на их основе, с одной стороны и рядом хозяйственно-полезных показателей с другой. Используя полученные экспериментальные данные, среди исследованных гибридов выделена группа перспективных гибридов, превышение уровня акшвности цистеиновых протеиназ у которых действительно сопровождалось увеличением процента шёлковой оболочки и длины шелковины одного кокона

Совокупность приведённых экспериментальных данных показываем что продуктивность и гетерозис тутового шелкопряда определяются интенсивностью процессов создания фонда структурных единиц для синтеза экскретируемых белков, которая обеспечивается активностью как ключевых энзимов синтеза аминокислот, так и про геолитических ферментов,

участвующих в деструкции запасных белков тканей и органов коконопрядущего насекомого.

Выделение и физико-химическая характеристика ряда ферментов белкового обмена из тканей и органов тутового шелкопряда

Изучение ферментов белкового обмена у тутового шелкопряда было бы неполным без более детальной характеристики отдельных, наиболее функционально значимых энзимов его тканей и органов. Исходя из вышеизложенного, мы предприняли попытку очистки аланин-аминотрансферазы из шелкоотделительной железы личинок V возраста, пептидогидролазу с оптимумом рН 3,0 из грены 4-го дня постдиапаузного развития (стадия Е1, бластокинез) и пептидогидролазу с оптимумом рН 3,4 из я

хроматина грены 8-го дня того же периода развития (стадия Е2, белая гусеница) (табл. 6,7, и 8).

Отчётливо выраженная гомогенность полученных препаратов двух первых энзимов и близость к гомогенности последнего открыла возможность для изучения ряда их физико-химических свойств (см. рис. 5).

Аланинаминотрансфераза тутового шелкопряда обладает значительной термостабильностью. Начальная скорость ферментативной реакции, катализируемая аланинаминотрансферазой, растёт линейно от 22 до 55°Г. Отсутствие активации аланинаминотрансферазы насекомого энзогенным пиридоксаль-5'-фосфатом наблюдалось на всех этапах очистки энзима, что свидетельствует о наличии прочной связи апофермента с простетической группой. Изоэлектрическая точка энзима, измеренная методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 4-6 и в тонком слое полиакриламидного геля в интервале рН 3-10 составляет 5,0±0,2.

Молекулярная масса аланинаминотрансферазы, измеренная методом гель-фильтрации, составляет 74Да. Молекула фермента представляет собой тетрамер, состоящий из одинаковых субъединиц, с молекулярной массой '

18000Да (определено методом диск-электрофореза белка в 5,6% полиакриламидном геле с 1% БОБ). Аланинаминотрансфераза обнаруживает в пределах чувствительности применённого нами метода ионобменной *

хроматографии с использованием аминокистотного анализатора модели КЬА-ЗВ фирмы Хитачи (Япония) очень узкую субстратную специфичность, катализируя переаминирование а-кетоглутаровой кислоты только с Ь-аланином, а пировиноградной кислоты - с Ь-глутаминовой кислотой и в незначительной мере - с её амидом. Изучение зависимости скорости прямой реакции переаминирования, катализируемой аланинаминотрансферазой, от концентрации субстратов показало, что аланинаминотрансфераза шелкоотделительной железы катализирует реакцию переаминирования в соответствии с пинг-понговым механизмом. Константы Михаэлиса для

субстратов энзима составляют 18,12мМ и 1,81мМ для аланина и а-кетоглутаровой кислоты соответственно.

Таблица 6.

Схема очистки аланинаминотрансфераэы из шелкоотделительной железы __тутового шелкопряда_

Стадия очистки Объем фракции фермента (в мл) Общий белок (в мг) Общая активность (вед.) Удельная активность (в ед/мг белка) Кратность повышения удельной активности (степень очистки) Выход фермента (в % от исходной активности)

1. Грубый экстракт 3900 2100 6382 3,04 1,0 100

2, Термическая обработкА 3939 1470 6250 4,25 1,4 98,0

3. Кислотная обработка 170 800 5602 7,00 2,3 88,0

4.Фракциони-рование сульфатом аммония 6 128 2850 22,37 7,3 44,7

5. Хроматография на ОЕАН-целлю-лозе (рН 6,0) 9 17,1 1493 87,31 28,7 23,4

6. Рехромато-графия на ОЕАЕ- Ц0ЛЛЮЛО- зе (рН 8,Б) 14 5,9 702 119,39 39,3 11,0

7. Хроматография на ок-сиапатите 4,5 2,7 388 143,78 47,1 6,1

8. Изоэлект-рофокусиро-вание в градиенте плотности целлюлозы 3 1,9 303 156,07 513 4,7

Цитозольная аланннаминотрансфераза шелкоотделительной железы тутового шелкопряда по многим исследованным нами свойствам: термостабильности, прочности связи апофермента с простетической группой, оптимуму рН, изоэлектрической точке, константам Михаэлиса для аланина и а-кетоглутаровой кислоты, аминокислотному составу близка к аминокислотному составу млекопитающих (Ма1зига\уа е? а!., 1997). Однако есть и

существенные различия, связанные,

KWÄWVWfÄö н*,п уникальной БИБЛИОТЕКА С Петербург ;

08 WO мт

физиологической ролью исследованного нами ферментам и узкой специализацией его в обмене веществ у коконопрядущего насекомого. Это, во-первых, практически абсолютная субстратная специфичность энзима насекомого, во-вторых, низкая молекулярная масса его и, в-третьих, наличие четырёх субъединиц в составе молекулы фермента.

Таблица 7.

Выделение и очистка протеиназы с оптимумом рН 3,0 из фены _тутового шелкопряда__

Стадия очистки Общий белок, мг Общая активность, усл-ед. Удельная активность, усл. ед./мг белка Выход, % Степень очистки

Í. Экстракт (0Д5М NaCI) 630 157 0,25 100 1

2. Гель-фильтрация через TSK-HW-55 22,90 147 6,41 53,63 25,64

3. HPLS на TSK-DEAE-5-pW 2,92 75 25,68 47,77 102,72

4. Препаративное изоэлектрофокусирование на ультродексе

Изоформа А 0,81 27 33,95 17,52 135,80

Изоформа В 0,94 47 50,00 29,93 200,00

Молекулярная масса протеиназы яиц тутового шелкопряда, определённая методом гель-фильтрации (бЗкДа), несколько превышает значение данного параметра, выявленного методом электрофореза (50кДа). Близкие значения молекулярных масс имеют некоторые цистеиновые (Kageyama et al., 1981; Shumaker et al., 1993), сериновые (Novillo et al., 1997) и аспартильные протеиназы (Lemos, Terra, 1991) насекомых. Для определения подклассовой принадлежности протеазы с оптимумом рН=3,0, выделенной из яиц тутового шелкопряда, был проведён инпибиторный анализ, доказывший, что протеолитическая активность при рН 3,0, присутствующая в грубом экстракте грены, принадлежит кислым цистеиновым протеиназам. Полученные нами данные позволяют однозначно заключить, что очищенная цистеиновая протеиназа проявляет максимальную активность именно в отношении запасных белков и менее активна, как по отношению к экзогенным белковым субстратам, так и по отношению к синтетическим субстратам.

Результаты электрофоретического анализа показали, что очищенная нами протеиназа гидролизовала запасные белки Б-1 и Б-2 до пептидных фрагментов (рис. 6), что подтверждается литературными данными о закономерностях гидролиза запасных белков яйца у других насекомых (Indrasith et al., 1987; Liu etal., 1996).

Анализ совокупных свойств энзима тутового шелкопряда позволяет сделать вывод о том, что исследованная цистеиновая протеиназа по своим характеристикам может быть отнесена к катепсин L-подобным ферментам. Подобно катепсину L млекопитающих, изученная протеиназа насекомого локализована в лизосомах, имеет оптимум рН в кислой среде, принадлежит к

цистеиновым протеиназам, не активна по отношению к субстрату катепсина В В АРМА, имеет сродство к эндогенным запасным белкам и обладает множественными формами.

е»

Г- 1 - Е

[. т

■ 1

1 и и -

Рисунок 5. Схема электрофореграмм очищенных препаратов аланинаминотрансферазы шелкоотделительной железы (АЛТ, 5,6% ПААГ), А и В изоформ цистеиновой протеиназы с рН-онтимумом 3,0 грены (А, В, 7,5% ПААГ; С - 7,5% ПААГ) и цистеиновой протеиназы с рН-оитимумом 3,4 из хроматина грены тутово! о шелкопряда (Д, 7,5% ПААГ) Значшельиый интерес представляет характеристика ферментов белкового обмена отдельных субклеточных фракций, а из последних - пептидо-гидролазы хроматина Наиболее ярко в протеолитическом комплексе хроматина грены тутового шелкопряда представлена пептидогидролаза с оптимумом рН 3,4, очистка и характеристика которой и явилась следующей задачей нашей работы.

о 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Рисунок 6. Схемы электрофореграмм (7,5%-ный ПААГ)- а-смеси запасных белков с цистеиновой протеиназой до инкубации (контроль); б - запасные белки после инкубации с прогеиназой, ! ,2 - запасные белки; 3 - цисгеиновая протеинам с оптимумом рН 3,0.

Учитывая крайне невысокий выход белков из хроматина, мы сочли необходимым для очистки протеазы из его состава применить метод аффинной

хроматографии на бацитрацин-сефарозе. В результате нами был получен фермент, очищенный в 145 раз (табл. 8).

Таблица 8.

Очистка пептидогидролазы оптимумом рН 3,4 хроматина грены _тутового шелкопряда_

Стадии очистки Общая активность (усл,ед.) Общий белок (мг) Удельная активность (усл. 6Д./МГ белка) Степень очистки Выход

Исходный гомогенат 100г граны 33800 563,3 60,0 1 100

Экстракт белков ядер (0,35М N801) 2S320 65,9 384.0 6.4 75

Экстракт белков хроматина (0.35М N301) 20300 35,0 580,0 9,7 60

Аффинная хроматография на бацитрацин-сефарозе 8450 0,97 8700 145 25

Ингибиторный анализ доказал принадлежность пептидогидролазы хроматина с рН-оптимумом 3,4 цистеиновым протеиназам. Исследование субстратной специфичности пептидогидролазы хроматина грены продемонстрировало отсутствие активности у неё в отношении синтетических субстратов (Ъ-аланин-я-нитроанилида, Ы-бензоил~0,Ь-аргинин-н-

нитроанилида и Ы-бензоил-Ь-тирозин-и-нитроанилида), что присуще многим известным протеолитическим ферментам хроматина. В то же время энзим примерно в равной мере гидролизовал казеин и эндогенные негистоновые белки, но всё же в большей степени проявлял специфичность в отношении эндогенных гистонов (табл. 9). Эти данные согласуются с гипотезой об участии протеиназ хроматина в превращениях гистонов и процессинге факторов репликации и других негистоновых белков в процессе репликации и транскрипции (Горюхина и др., 1979; Вокуркова, 1985; СЬог^ е! а1„ 1974; Сгипйеш, 1990).

Таблица 9.

Субстратная специфичность пептидогидролазы хроматина __ грены тутового шелкопряда__

Название субстрата

гисгоны негистоновые белки казеин

Активность пептидогидролазы (усл.ед.) 52,7±4,3 43,3±3,8 33,6±3,1

Итак, хотя конкретные механизмы участия протеолитических ферментов хроматина в регуляторных процессах в клетке не расшифрованы, совокупность приведённых выше данных свидетельствует о том, что пептидогидролазы хроматина приурочены к фундаментальным процессам в эмбриогенезе насекомого.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По мере накопления данных в области сравнительной биохимии становится всё более очевидным, что различия между живыми организмами проявляются на многих уровнях их биохимической организации и, в том числе, на уровне отдельных метаболических путей, единичных ферментативных реакций и даже изолированных макромолекул. Однако исследования, посвящённые систематическому изучению биохимических особенностей отдельных групп животных, ещё крайне немногочисленны.

В представленной работе обобщены результаты многолетнего комплексного изучения ферментов белкового обмена у коконопрядущих насекомых в связи с процессами биосинтеза у них специфических белков шёлка.

Благодаря использованию прогрессивных и в большинстве случаев оригинальных способов определения активности ферментов впервые охарактеризованы не изученные пути биосинтеза в шелкоотделительной железе главных аминокислот шелка и, в том числе, весьма редкий путь новообразования глицина через производные малоновой кислоты, а также установлена возможность синтеза и верой шый механизм образования глицина из серина и греонина и, кроме того, тирозина из фенилаланина.

Исключительно широкий диапазон реакций переаминирования, высокая активность аланин-глиоксилат- и глутамат-пирувагаминотрансфераз, наличие среди ферментов аминокислотного обмена шких редких биокатализаторов, как гидроксималонатдегидрогеназа и аспаргат-4-декарбоксилаза, а также своеобразие свойств некоторых из энзимов - таков перечень обнаруженных нами специфических особенностей в процессах, ведущих в шелкоотделительной железе к синтезу главных аминокислот шелка

Оказалось, что ферментные системы синтеза глицина, аланина, серина и тирозина в различных тканях трех видов коконопрядущих насекомых однотипны В результате проведенного количественного анализа нам удалось установить, что основными путями синтеза глицина, аланина и серина в тканях шелкопрядов являются реакции переаминирования пировиноградной, глиоксиловой и фосфооксипировиноградной кислот с первичными аминокислотами, а центрами новообразования их - шелкоотделительная железа и жировое тело. Совершенно очевидно, что данный тип организации ферментов синтеза главных аминокислот шелка оптимален для обеспечения специфической биологической функции, состоящей в необходимости биосинтеза значительного количества обогащенных глицином, аланином, серином и тирозином белков шелка.

Вместе с 1ем нами обнаружены определённые видовые, тканевые и фазовые различия как в уровне и соотношении, так и характере распределения ферментов аминокислотного обмена по органам и тканям исследованных насекомых. Совокупность полученных нами данных показала, что способное! ь к синтезу главных аминокислот шелка у домашнего и диких видов

коконопрядущих насекомых тесным образом связана как с природой синтезируемых ими белков, так и с объемом шелкопродукции. Чем выше последний, тем глубже специализация аминокислотного обмена и активнее ферменшые системы биосинтеза главных структурных единиц шёлка. При лом соотношение активностей аланин-глиоксилатаминотрансферазы и глутамат-пируватаминотрансферазы в фиброиновых отделах шелкоотдели-1ельных желёз коконопрядущих насекомых является биохимическим показателем направленности специализации белковою обмена на заключи тельном этапе их личиночного развития.

Полученные результаты оказались интересными не только в сравнительно-биохимическом плане; в совокупности с имеющимися литературными данными они в своё время послужили весомым аргументом в пользу матричной схемы биосинтеза фиброина (Караев, 1992; Wiswanathan et al , 1988).

Изучение метаболизма |4С-меченых белков у тутового шелкопряда позволило нам считать, что высокая скорость биосинтеза и экскреции специфических белков в шелкоотделительной железе обеспечивается процессами накопления и мобилизации азотсодержащих ресурсов в его тканях и opiaHax. Дальнейший анализ динамики радиоактивности и аминокислотного состава белков позволил установить время и место образования резервных белков тканей, а также конкретизировать функции определённых белков в качестве поставщиков азотистого материала для новообразования в шелкоотделительной железе главных аминокисло! шёлка. В часiносги нами показано, что наиболее высоко и быстро метящиеся белки активно синтезирую 1ся в жировом теле в течение V личиночного возраста, накапливаю [ся в период питания в каркасе и стенке кишечника и используются через посредство 1емолимфы шелкоотделительной железой в период завивки кокона.

Сопоставление динамики общей протеолитической активности в тканях и органах тутового шелкопряда с результатами изменения в тех же тканях удельной радиоактивности тотальных меченых белков после инъекции в гемолимфу гусениц 4-го дня V возраста 2-иС-глицина продемонстрировало их взаимную обусловленность. Полученные данные говорят о важной роли пептидогидролаз в процессах использования белков тканей личинки шелкопряда для пос[роения белков шёлка. При этом наиболее ярко в связи с процессами шелкообразования в жировом теле выступает динамика цистеиновых протеиназ с рН-оптимумом 3,4, а в шелкоотделительной железе -с рН-оптимумом 6,2. Активность последней сохраняется на высоком уровне в 1-ый день завивки кокона, когда гусеница не питается, лишь в шелкоотделительной железе. Мы считаем, что вышеупомянутый иротеолитический энзим фиброинового отдела шелкоотделительной железы принимает участие в деструкции соединений белковой природы, поступающих через посредство гемолимфы в шелкоотделительную железу из других тканей

насекомого. Этот вывод согласуется с результатами изучения судьбы меченых белков гемолимфы после инъекции их в организм тутового шелкопряда.

Набор пептидогидролаз у тутового шелкопряда фазоспецифичен. Так, протеолитический комплекс грены тутового шелкопряда включает не только ферменты, присущие другим стадиям и даже фазам развития насекомого (пептидогидролазы с рН-оптимумами от 6,2 до 10,2), а с другой -специфические энзимы (аспартатные и кислые цистеиновые протеиназы).

Логическим продолжением изучения закономерностей деградации белков у тутового шелкопряда при участии пептидогидролаз явилось исследование белковых ингибиторов этих энзимов на одной из фаз развития (в эмбриогенезе) насекомого. Обнаружена четкая приуроченность оптимумов рН действия белковых ингибиторов пепсина, папаина и химотрипсина таковым соответствующих аспартильных, цистеиновых и сериновых пептидогидролаз. Наиболее яркой чертой динамики протеаз в эмбриогенезе тутового шелкопряда является альтернативный характер зависимости между активностью исследуемых протеолитических ферментов и их ингибиторов, что обеспечивает строгую направленность процессов гидролиза белковых субстратов в процессе эмбрионального развития коконопрядущего насекомого. Существенную дополнительную информацию о функциональной роли белковых ингибиторов предоставило нам изучение субклеточной локализации пептидогидролаз и их белковых ингибиторов. Установлено, что максимальный уровень активности аспартильньгх и кислых цистеиновых протеиназ (оптимум рН 3,0; 3,6 и 6,2) присущ лизосомальной фракции грены. Гораздо меньший уровень активности характерен для ядерной (оптимум рН 3,0 и 3,6) и митохондриальной (оптимум рН 3,0 и 3,6) фракций. Известно, что цистеиновые и аспартилыше протеиназы лизосом участвуют в распаде запасных белков (Иванов, 1986; Шйгег, Ка!кЬе1, 1997; Ото <л а!., 1999), а цистеиновые протеиназы митохондрий и ядер - в осуществлении апоптоза (Скулачев, 2000; Фильченков, 2003).

Среди пептидогидролаз субклеточных фракций значительный интерес представляют протеолитические ферменты структурных элементов ядра, и в том числе хроматина, функции которых окончательно не установлены. Изучение протеолитических ферментов в составе лабильно связанных и прочно связанных белков хроматина грены тутового шелкопряда показало, что в хроматине грены тутового шелкопряда пептидогидролазы локализованы, главным образом, во фракции негистоновых белков, где они представлены комплексом ферментов с оптимумами рН 3,4; 6,2; 7,8 и 9,9. Последнее сближает протеолитический комплекс хроматина тутового шелкопряда с таковым дрожжей .ЧассЬаготусев сеге\ч5;ае (Мо^и1а ег а!., 1988), но отличает его от протеолитических энзимов хроматина других эукариот.

Динамика активности протеиназы с рН-оптимумом 3,4, локализованной во фракции лабильно связанных белков хроматина, коррелирует с процессами роста зародыша, а переход пептидогидролазы с рН-оптимумом 6,2 из состава прочно связанных белков во фракции лабильно связанных белков хроматина

сопряжён с усилением интенсивности биосинтеза ДНК, изменением структурною сосюяния и метаболической активности хроматина (Севастьянова и др., 1986). Следовательно, будучи вовлечены в реализацию определенных функций, пептидогидролазы хроматина принимают участие в контроле фундаментальных процессов в организме насекомого

Выявленная дополнительность активное!и эндогенных ингибиторов по отношению к активности соответствующих протеолитических ферментов и их совместная локализация в определенных фракциях клетки прямо доказывает важнейшую роль белковых ингибиторов в регуляции активности конкретных внутриклеточных протеиназ, вовлеченных в фене в осуществление различных биологических процессов (катаболизм запасных белков, процессинг биологически активных молекул, распад структурных и функциональных белков субклеточных фракций и другие).

Благодаря экономическому значению тутового шелкопряда молекулярные основы ею высокой продукшвности издавна привлекали внимание исследователей. Особый интерес в практике селекционных работ с тутовым шелкопрядом на биохимическом уровне имеет изучение тех энзимов, деятельность которых обеспечивает создание фонда сгруктурных единиц для синтеза специфических белков шелка.

Изучение закономерностей биосинтеза главных аминокислот шелка у контрасшых по продуктивности пород и обладающих определённой степенью гетерозиса гибридов тутового шелкопряда, предпринятое нами, показало что высокопродуктивные породы и гибриды тутового шелкопряда характеризуются более выраженной способностью к синтезу главных аминокислот шелка. По мере увеличения продуктивности роль жирового тела и фиброиновою отдела шелкоотделительной железы как непосредственных центров синтеза главных аминокислот шелкового волокна возрастав! Существенным выводом этой части работы явилось обнаружение наибольшей степени корреляции с биологическими показателями исследованных пород и гибридов 1утового шелкопряда, активности тех ферментов его тканей, которые являются носителями (маркерами) функциональной направленности обмена веществ в каждой из них. Полученные нами экспериментальные данные показали превосходство активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и 3-фосфоглицера1дегидрогеназы кислых цис1еиновых про1еиназ (оптимум рН 3,0 и 3,6) в развивающейся грене высокопродуктивных пород над таковой в фене средне- и низкоиродуктивных пород тутового шелкопряда.

Контрольная выкормка, осуществленная в течение 1979 и 1980 гг. и 20002001 г л. на базе Росшелкстанции с последующим снятием биологических показателей 13 контрастных по актнвнос1И аланин- и аспаршг-аминотрансферазы и 6-и по ак!ивности цистеиновых прошиназ гибридов тутового шелкопряда, выявила 100% корреляцию между шелконосносгью и уровнем аминотрансферазной активности в фене.

Таким образом, полученные нами данные продемонстрировали принципиальную возможность раннего прогнозирования явления гетерозиса по основным биологическим показателям у гибридов тутового шелкопряда на основании сравнения активности аминотрансфераз и цистеиновых протеиназ с оптимумом рН 3,0 и 3,6 в их грене.

Изучение ферментов белкового обмена у тутового шелкопряда было бы неполным без более детальной характеристики отдельных, наиболее функционально значимых энзимов его тканей и органов. Нами впервые выделен в виде высокоочищенных белков и охарактеризован ряд важнейших энзимов белкового обмена (цитозольная аланинаминотрансфераза из шелкоотделительной железы, цистеиновая протеиназа с рН-оптимумом 3,0 из грены и цистеиновая протеиназа с рН-оптимумом 3,4 из хроматина фены) из представителя группы коконопрядугцих насекомых - тутового шелкопряда, что представляет несомненный теоретический и практический интерес.

Сравнительный анализ установленных нами физико-химических и иных свойств выделенных энзимов с таковыми одноименных ферментоз эукариот показали, что по многим исследуемым параметрам энзимы насекомых и эукариотических организмов обнаруживают значительное сходство. Однако имеются и определенные отличия, наиболее существенным из которых является ограниченные пределы их субстратной специфичности, связанные, на наш взгляд, с узкой специализацией белкового обмена и высокой скоростью кругооборота белков у коконопрядущего насекомого.

ВЫВОДЫ

1. В процессе изучения ферментов биосинтеза главных аминокислот шелка в тканях и органах тутового шелкопряда:

а) открыт путь синтеза кетомалоновой из гидроксималоновой кислоты при посредстве гидроксималонатдегидрогеназы, благодаря чему полностью охарактеризован процесс новообразования глицина через производные малоновой кислоты;

б) впервые доказано наличие ферментов, обеспечивающих биосинтез глицина из серина и треонина (серин-гидроксиметилтрансферазы и треонинальдолазы) и превращения фенилаланина в тирозин (фенилаланингидроксилазы);

в) окончательно подтверждено наличие иути биосинтеза аланина посредством ¡3-декарбоксилирования аспарагиновой кислоты

2 Пути биосинтеза главных аминокислот шелка в тканях грех видов коконопрядущих насекомых (тутового шелкопряда, дубового шелкопряда, павлино] лазки Артемиды) однотипны, а ферменты синтеза локализованы преимущественно в шелкоотделительной железе и жировом теле насекомых

3 Соотношение активностей доминирующих ферментов синтеза глицина и аланина (аланин-глиоксилатаминотрансферазы и глутамат-пируватаминотрансферазы) в задних отделах шелкоотделительных желез

тутового шелкопряда, дубового шелкопряда и павлиноглазки Артемиды коррелирует с содержанием указанных аминокислот в составе их фиброинов; активность большинства изученных ферментов в тканях шелкопрядов изменяется параллельно шелкообразованию, что отражает направленность процессов аминокислотного обмена у коконопрядущих насекомых на синтез специфически построенных белков шелка.

4. Высокая скорость биосинтеза белков шелка в период завивки кокона обеспечивается у тутового шелкопряда благодаря мобилизации азо содержащих ресурсов его тканей, за счст которых возникает 11,2% белков шелковою волокна. Белки (величины ОЭП 0,02; 0,05; 0,09 и 0,24), активно синтезирующиеся в жировом теле тутового шелкопряда в течение V личиночного возраста и накапливающиеся в период активного питания его гусениц в С1енке кишечника и каркасе тела, используются через посредство гемолимфы в период завивки кокона в качестве азотистого материала для синтеза в шелкоотделительиой железе главных аминокислот шелка.

5. Наиболее тесные корреляции с процессами деструкции запасных белков в ходе развития тутового шелкопряда проявляют цистеиновые протеиназы с оптимумами рН 3,0; 3,6 и 6,2 в грене; 3,4 - в жировом теле; 6,2 - в фиброиновом отделе шелкоотделительиой железы, функционирование которых обеспечивает организованный в пространстве и во времени протеолиз резервных белков насекомого.

6. В составе растворимых белков грены тутового шелкопряда обнаружены шдогенньге белковые ингибиторы аспартилькых, цистеиновых и сериновых ир01еиназ, характеризующихся одинаковыми оптимумами рН, взаимозависимой динамикой активности и совместной субклеточной локализацией с конкретными протеиназами, что доказывает участие белковых ингибиторов пептидогидролаз грены в регуляции активности эндогенных протеиназ.

7. Локализация исследованных протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов в субклеточных фракциях фены характеризуется:

а) присутствием аспартильных и цистеиновых протеиназ в ядерной, митохондриальной, лизосомальной и нос глизосомальной субклеточных фракциях, удельная активность которых убывает в ряду: лизосомы, митохондрии, ядра, постлизосомальная фракция;

б) присутствием цистеиновых протеиназ во фракции лабильно связанных и прочно связанных белков хроматина, активность которых коррелирует с процессами роста, дифференцировки и органогенеза у зародыша;

в) максимальной активностью белковых ингибиторов пептидогидролаз в ядерной и митохондриальной фракциях, обеспечивающей протекторную и регуляторную функции белковых ингибиторов при осущес1влении процессов протеолиза в ядрах и митохондриях.

8. Белковый обмен в тканях и органах высокопродуктивных пород тутового шелкопряда характеризуется:

а) более выраженной способностью к синтезу главных аминокислот шелка преимущественно в жировом теле и шелкоотделительной железе насекомого;

б) наибольшей степенью корреляции с продуктивностью ферментов-маркеров функциональной направленности обмена аминокислот в каждой ткани и органе (3-фосфоглицератдегидрогеназы серициновою отдела шелкоотделительной железы, аланинглиоксилатаминотрансферазы и треонинальдолазы фиброинового отдела её, аспартат-4-декарбоксилазы и треонинальдолазы жирового тела).

9. Установлена положительная, статистически достоверная корреляция » между уровнем активности аланинаминотрансферазы,

аспартатаминотрансферазы, 3-фосфоглицератдегидрогеназы, цистеиновых протеиназ с оптимумом рН 3,0; 3,6 и 8,6 в грене, с одной стороны, и рядом хозяйственно-полезных показателей - с другой, что позволяет рекомендовать уровень активности перечисленных ферментов в качестве биохимических тестов для раннего прогнозирования потенциальной продуктивности пород тутового шелкопряда.

10. Установлена положительная, статистически достоверная корреляция между уровнем активности аланинаминотрансферазы серицинового отдела шелкоотделительной железы гусениц V личиночного возраста, активности аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, цистеиновых протеиназ с оптимумом рН 3,0 и 3,6 в грене родительских пород и гибридов, с одной стороны, и рядом хозяйственно-полезных показателей - с другой, что позволяет рекомендовать уровень активности перечисленных энзимов в качестве биохимических тестов для прогнозирования ожидаемого эффекта гетерозиса в потомстве при оценке качества родительских пород.

11. Разработаны методы очистки, впервые выделены в высокоочищенном состоянии и охарактеризованы функционально значимые ферменты белкового обмена тутового шелкопряда: цитозольная аланинаминотрансфераза из шелкоотделительной железы ( Мг=74 кДа, субъединичная структура 18000x4, оптимум рН= 8,5, р1= 5.0, Км= 18.12 мМ и 1.81мМ для аланина и а» кетоглутарата); две изоформы катепсин Ь-подобной протеиназы из грены

(Мг=50кДа, оптимум рН=3.0. р1 = 5.95 и 6.43); цистеиновая протеиназа го хроматина грены (оптимум рН=3.4); высокое сродство к эндогенным ^ субстратам которых отражает узкую специализацию и высокую скорость

кругооборота белков у исследованного насекомого.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Использовать уровень активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, 3-фосфоглицератдегидрогеназы, цистеиновых протеиназ с рН-оптимумом 3,0; 3,6 и 8,6 постдиапаузирующей грены как новый тест для ранней прогнозирующей оценки продуктивности пород тутового шелкопряда.

2 При составлении оптимальных вариантов скрещивания использовать уровень активности аланинаминотрансферазы серицинового отдела шелкоотделительной железы гусениц V личиночного возраста, уровень активности аланинаминйтрансферазы, аспартатаминотрансферазы, цистеиновыз протеиназ с рН-оптимумом 3,0 и 3,6 в постдиапаузирующей грене как показатель большей телконосности при оценке качества родительских пород.

3. С целью дальнейшей интенсификации селекционной работы с тутовым шелкопрядом рекомендуем Министерству сельского хозяйства РФ включить в «Основные положения методики селекции тутового шелкопряда» определение активности ключевых ферментов белкового обмена насекомого на стадии яйца и личинки.

4. Ввести в соответствующие разделы учебных пособий по биохимии и селекции тутового шелкопряда новые материалы об особенностях белкового обмена у различных по продуктивности пород и гибридов тутового шелкопряда и, в том числе, о закономерностях биосинтеза в его тканях и органах главных аминокислот шелка, масштабах мобилизации запасных белков, роли в процессах деструкции резервных белков протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи в журналах

1. Ярыпш Д.В., Клунова С.М., Филиппович Ю Б Исследование белковых ингибиторов пептидогидролаз в эмбриогенезе тутового шелкопряда// Онтогенез. -2001. - Т.32 №4. С.269-276 (0,44 п.л., доля авторского участия 40%)

2. Клунова С.М., Назаров А.Ю., Филиппович Ю.Б. Исследования пептидогидролаз в хроматине грены тутового шелкопряда// Онтогенез. - 1993. - Т.24 Xsl. С 43-47 (0,28 п.л., доля авторского участия 70%)

3. Ярыпш ДВ., Клунова С.М., Филиппович Ю.Б. Выделение, очистка и свойства цисгеиновой протеиназы из грены тутового шелкопряда Bombyx morí L.// Биохимия.

- 2003. - Т.68. Вып.1. С.76-81 (0,3 п.л., доля авторского участия 30%)

4. Клунова С.М., Алцыбеева Т.И., Филиппович Ю.Б. Метаболизм |4С-растворимых белков тканей тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития// Биохимия. - 1980. - Т.45 Вып.11. €.2044-2052 (0,5 пл., доля авторского участия 50%)

5. Клунова С.М , Жукова H И., Филиппович Ю.Б. Исследования ферментов синтеза глицина и аланина в тканях тутового шелкопряда в процессе его развития// Биохимия. - 1976. - Т.41 Вып.7. С.1189-1192 (0,2 п.л., доля авторского участия 60%)

6. Филиппович Ю Б, Клунова С.М., Жукова Н.И Пути синтеза главных аминокислот в шелкоотделительной железе тутового шелкопряда// Доклады АН СССР. - 1974. Т.217. № 1. С. 241-244 (0,2 п.л., доля авторского участия 70%)

7. Жукова Н.И., Клунова С.М., Филиппович Ю.Б Активность ферментов синтеза глицина и аланина в тканях тутового и дубового шелкопрядов и их связь с шелкообразованием.// Ж. общей биологии - 1975. - Т.36. №2. С. 297-302 (0,33 п.л., доля авторского участия 60%)

8. Филиппович Ю.Б , Клунова С.М. О взаимосвязи динамики свободных аминокислот с биосинтезом белков шелка в шелкоотделительной железе Bombyx mari LII Журнал общей биологии - 1967. - Т.28. №6 С. 715-723 (0,4 пл, доля авторского участия 60%)

9. Филиппович Ю.Б., Клунова С.М. Свободные аминокислоты фиброинового и серипинового отдела шелкоотделительной железы тутового шелкопряда// Биохимия.

- 1967. - Т.32. Вып.2. С. 248-252 (0,28 п.л., доля авторского участия 60%)

10. Клунова С.М., Филиппович ЮБ. Исследования растворимых белков фиброинового и серицинового отдела шелкоотделительной железы гутового шелкопряда методом электрофореза в полиакриламидном геле// Биохимия - 1969. -Г.34. Вып.5. С. 937-943 (0,4 п.л., доля авторского участия 70%)

П.Жукова Н.И., Клунова СМ.. Филиппович ЮБ., Нуманов МИ Активность ферментов аминокислотного обмена в тканях и органах тутового шелкопряда различных по продуктивности пород// Биологические науки. - 1975. № 12 С. 113116 (0,2 пл.» доля авторского участия 50%)

12.Клунова С.М., Алцыбеева 'Г.И., Филиппович Ю.Б Обмен меченых белков гемолимфы тутового шелкопряда на заключитедьном этапе его личиночного развития// Доклады ВАСХНИЛ. - 1980 - № 3 С. 32-34 (0,17 п.л., доля авторского участия 45%)

13.Клунова С.М.. Евтушенко В.П., Филиппович Ю.Б., Нуманов МИ Исследование активности трансаминаз в тканях некоторых пород тутового шелкопряда и их

прямых и обратных гибридов// Шелк - 1977 - №.2. С. 11-12 (0,1 п.л. доля авторского участия 40%)

14.Клунова С.М., Алцыбеева Т.И., Филиппович Ю.Б., Нуманов М.И., Милохова И.П. Метаболизм 14С-растворимых белков в тканях конграсшых но продуктивности пород тутового шелкопряда// Шелк - 1979. - №.6 С.10-11 (0,1 п л., доля авторского участия 40%)

15.Банников В.М., Клунова С.М., Ушакова Г.И., Филиппович ЮБ Активность некоторых ферментов аминокислотного обмена в грене различных по продуктивности пород тутового шелкопряда// Шелк - 1980. - №.4. С 9-10 (0,1 п л., доля авторского участия 40%)

16.Клунова С.М., Тарасенко Н.В., Филиппович Ю.Б., Милохова И.П, Нуманов М.И Исследования пептидогидролазно1 о комплекса ферментов в тканях и органах тутового шелкопряда в связи с процессами шелкообразования// Шелк. - 1987. - №.1 С.12-14 (0,1 п.л., доля авторского участия 70%)

Монография

17.Клуиова С.М., Ярыгин ДВ Внутриклеточный протеолиз и его регуляция у насекомых - M ■ Прометей, 2001 - 104с (6,5 п л , доля авторского участия - 70%)

Учебные пособия

18.Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. - M • Академия, 2003. - 208 с. (13 п.л., доля авторского участия - 40%)

Методические разработки

19. Клунова Г.М. Определение активности некоторых ферментов аминокислотного обмена шелкоотдели гельной железы тутового шелкопряда с помощью автоматического анализатора аминокислот. В кн. Методы анализа белков и нуклеиновых кислот в тканях и органах насекомых. - М.' МГПИ им Ленина, 1980, -ч. I. с. 47-53 (0,4 п.л., доля авторского участия 100%)

20.Алцыбеева Т И , Клунова С.М., Филиппович Ю.Б Фракционирование методом вертикальною микроэлектрофореза в полиакриламидном геле меченых белков тканей тутового шелкопряда и определение радиоактивности отдельных белковых фракций В кн. Методы анализа белков и нуклеиновых кислот в тканях и органах насекомых - M : МГПИ им Ленина, 1980. - ч I с 29-37 (0,5 п.л., доля авторского участия 50%)

21 .Жукова Н.И., Клунова С.М., Филиппович Ю Б Исследование некоторых ферментов аминокислотного обмена в тканях тутового шелкопряда методом энзим-электрофореза в полиакриламидном геле// Биохимия насекомых - M • МГПИ им. Ленина, 1974. - Вьш. 17 с. 56-68 (0,7 п л., доля авторского участия 60%)

Статьи в сборниках

22.Филиппович Ю Б , FiopoBa Т.А, Клунова С.М. К вопросу о молекулярных основах породной специфичности, продуктивности и гетерошеа у тутового шелкопряда// Достижения генетики и селекции тутового шелкопряда и шелковицы. Сб. научн тр. CAO ВАСХНИЛ. - Ташкент: 1978 - Вьш. 6 с. 119-143 (1,4 п.л., доля авторского участия 40%)

23.Филиппович Ю.Б., Клунова С.М., Евтушенко В.П., Нуманов М.И Исследование ферментов аминокислотного обмена в тканях и органах тутового шелкопряда в породпо-гибридном и видовом аспектах// Научные основы развития шелководства

Сб. научи, тр. САНИИШ. - Ташкент: 1978 - Вып. 12. с. 48-59(0,66 п.л., доля авторского участия 60%)

24. Клунова С.М., Евтушенко В.П., Жукова Н.И. Прогнозирование продуктивности и гетерозиса тутового шелкопряда по активности алаяин-а-кетоглутаратаминотрансферазы и 3-фосфоглицератдегидрогеназы серицинового отдела шелкоотделительной железы и треонинальдолазы фиброинового ее отдела и аспартат-р-декарбоксилазы и треонинальдолазы жирового тела// Сб.: Биохимические методы прогнозирования продуктивности, гетерозиса и оценки физиологического состояния полезных и вредных видов насекомых. - М • М1 ПИ им. Ленина, 1979 - с 24-38 (0,83 п.л., доля авторского участия 70%)

25.Евтушенко В.П., Клунова С.М., Филиппович Ю.Б. Частичная очистка аланин-а-кетоглутаратаминотрансферазы шелкоотделительной железы тутового шелкопряда// Биохимия насекомых. Сб. научн. тр. каф. орг. и биол. химии МГПИ им. В.И Ленина. -М. 1977. - Вып. 19. с. 39-41 (0,2 п.л., доля авторского участия 50%)

26.Евтушенко В П., Клунова С.М., Филиппович Ю.Б. Очистка аланинаминотрансферазы (Ь-аланин:2-оксоглутаратаминотрансферазы: КФ 2 6.1.2.) шелкоотделительной железы тутового шелкопряда. В кн. Методы анализа белков и нуклеиновых кислот в тканях и органах насекомых - М.: МГПИ им. Ленина, 1980. -ч. I. с. 53-72 (0,55 и.л., доля авторского участия 50%)

27.Клунова С.М., Банников В.М., Ушакова С.М Исследование ферментов аминокислотного обмена в грене тутового шелконрада в период ее пред- и постдиапаузного развития// Биохимия насекомых Сб. научн. тр каф. орг и биол химии МГПИ им В.И Ленина -М- 1980. - Выл 22 с 83-95 (0.7п.л, доля авторского участия 70%)

28.Клунова С.М., Тарасенко Н В., Киреева З.В. Изучение протеолитического комплекса ферментов в гемолимфе и шелкоотделительной железы тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночною развития// Биохимия насекомых (Структура хроматина и характеристика продуктов генной активности). М : МГПИ им. Ленина, 1987. - с. 112-120 (0,5 п.л., доля авторского участия 80%)

29.Клунова С.М., Назаров А Ю. Очистка пептидогидролазы из хроматина грены тутового шелкопряда// Биохимия насекомых Сб. научн. тр каф орг и биол химии МШИ им В И. Ленина - М.' 1989 - с. 38-45 (0,44 п л , доля авторского участия 80%)

30.Тарасенко Н В , Клунова С.М, Филиппович Ю.Б., Макулин А.И Исследование белковых ингибиторов пептидошдролаз в тканях и органах тутового шелкопряда на заключительном этапе ею личиночного развития// Сб. научн. тр. МГПУ им. В.И. Ленина. Серия, естеств. науки М.: Прометей, 1996. - с. 248-251 (0,2 пл., доля авторского участия 60%)

31 .Ярыгин Д В., Тарасенко Н.В , Клунова С.М., Богословский В.В., Филиппович Ю.Б Субклеточная локализация ферментов и их белковых ингибиторов в яйцах тутового шелкопряда// Сб. научн. гр. МГПУ. Серия: естеств. науки М.: Прометей, 2000. - с 249-252 (0,2 п л., доля авторского участия 30%)

32.Ярыгин Д.В., Лапковский В.В., Богословский В.В., Клунова С.М., Филиппович Ю.Б Активность нистеиновых протеина) и белковых ингибиторов папаина в грене различных по продуктивности пород тутового шелкопряда// Сб научн. тр. МГПУ. Серия: естеств. науки. М.: Прометей, 2001. - с. 183-186 (0,2 пл., доля авторского участия 30%)

33.Ярыгин ДВ„ Клунова С.М. Практические аспекты изучения протеолитических ферментов и их регуляции у насекомых// Актуальные вопросы экологии и биологии:

наука и образование. Сб. научн. тр. биол-хим. фак. им. М А. Шолохова М ■ Альфа, 2002. -Т.2. с. 124-131 (0,44 п л., доля авторского участия 50%)

34.Крылова И.Д, Ярыгин Д.В, Минькова И.О., Богословский В.В., Клунова С.М. Активность сериновых протеиназ в грене родительских пород и гибридоь тутового шелкопряда// Актуальные вопросы экологии и биологии, наука и образование. Сб. научн тр. биол-хим. фак им М.А. Шолохова. М.' Альфа, 2003 -Т.З. с. 103-106 (0,2 п л., доля авторского участия 30%)

35.Клунова С.М., Минина Н.И. Ферчепты тканей и органов тутового шелкопряда, выявленные методом энзим-электрофореза в полиакриламидном геле// Анвот локл VI съезда ВЭО - Воронеж, 1970. - с 83 (0,1 п.л., доля авторского участия 50%)

36.Клунова С.М., Жукова НИ., Филиппович Ю.Б. Ферменты синтеза глицина и

аланина у тутового и дубового шелкопряда в процессе развития// Материалы VII <

сьезда ВЭО. Ленинград. 1974. ч.1. с, 174-175 (0,1 п.л., доля авторского участия

70%)

37.Филиппович Ю.Б, Егорова ТА, Зябрява АН., Клунова С.М., Жукова Н.И, Коничева А.П., Кутузова Н.М., Остапенко В.И , Санкина Т.М. Молекулярные основы • гетерозиса у тутового шелкопряда// Тезисы научн. сообщ. Ш Всссоюзн биохим

съезда. - Рига, 1974. Т. 1 с 72 (0,1 п.л , доля авторского участия 30%)

38.Клунова С.М. Тарасенко НВ. Изучение протеолитического комплекса ферментов хромагина грены тутового шелкопряда в процессе эмбриогенеза// Тезисы докл IX Всееоюзн симп OrpyKiypa и функции клег. ядра. Черноголовка, 1987. - с 162(0,1 п.л , доля авторского участия 70%)

39.Phillppovitch Yu.B, Klunova S.M Amino acid and protein metabolism in organs and tissues of silkworm (Bombyx mori L)// Abstr VII Internal. Cong. Biochem. Tokyo, 1967 V IV, A-130. P. 611 (0,1 пл., доля авторского участия 80%)

40.Philippovitch Yu В., Klunova S .M. Protem fractions on tissues of the silkworm during ontogenesis and under different physiological conditions// Abstr. VI meeting FEBS -Madrid: 1969. - part 10. P.223 (0,1 н jr., доля авторского участия 80%)

41. Klunova S.M., Altsybeyeva 11. Metabolism of labelled proteins in the tissues of the silkworm Bombyx mori during ontogenesis)// Abstr. 10th Internat Congr. Biochem. -Hamburg. 1976. P. 649 (0,1 пл., доля авторского участия 60%)

42.Klunova S.M., Nazarov A.Yu., Tarasenko N.V., Yaltsev A.G. Investigation of peptidohydrolases and their inhibitors in silk gland of silkworm Bombyx mori L.// Abstr. Furop. Congr. of Entomol. Univ Uork IJK 1994 (0,1 п.л., доля авторского участия 30%)

43.Klunova S.M., Tarasenko N.V., Kolobova F Yu., Philippovitch Yu.B Investigation of ' protem inhibitors of tripsin-like proteinases and calpain I and calpain IT activities in tissues

and organs of silkworm Bombyx mori L// Proc. XX Internat congr Entomol Hrenze, 1996. - 05. 111. P. 182 (0,1 п.л., доля авторског о участия 50%)

V

«

4

Подл, к печ. 26.09.2005 Объем 3.0 пл. Заказ №.333 Тир 100 экз.

Типография МПГУ

№18 4 18°

РНБ Русский фонд

2006^4

"шТТ

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Клунова, Светлана Михайловна

Оглавление.

Список сокращений.

Введение

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ферменты белкового обмена коконопрядущих насекомых"

Цель исследования.19

Задачи исследования.20

Научная новизна и теоретическая ценность диссертационной работы.21

Практическая значимость работы.23

Положения, выносимые на защиту.24

Апробация диссертационной работы.26

Структура и объём диссертации.26

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Клунова, Светлана Михайловна

ВЫВОДЫ

1. В процессе изучения ферментов биосинтеза главных аминокислот шелка в тканях и органах тутового шелкопряда: а) открыт путь синтеза кетомалоновой из гидроксималоновой кислоты при посредстве гидроксималонатдегидрогеназы, благодаря чему полностью охарактеризован процесс новообразования глицина через производные малоновой кислоты; б) впервые доказано наличие ферментов, обеспечивающих биосинтез глицина из серина и треонина (серии-гидроксиметилтрансферазы и треонинальдолазы) и превращения фенил аланина в тирозин (фенил ал анингидроксил азы); в) окончательно подтверждено наличие пути биосинтеза аланина посредством р-декарбоксшшрования аспарагиновой кислоты.

2. Пути биосинтеза главных аминокислот шелка в тканях трех видов коконопрядущих насекомых (тутового шелкопряда, дубового шелкопряда, павлиноглазки Артемиды) однотипны, а ферменты синтеза локализованы преимущественно в шёлкоотделительной железе и жировом теле насекомых.

3. Соотношение активностей доминирующих ферментов синтеза глицина и аланина (аланин-глиоксилатаминотрансферазы и глутамат-пируват-аминотрансферазы) в задних отделах шелкоотделительных желез тутового шелкопряда, дубового шелкопряда и павлиноглазки Артемиды коррелирует с содержанием указанных аминокислот в составе их фиброинов; активность большинства изученных ферментов в тканях шелкопрядов изменяется параллельно шелкообразованию, что отражает направленность процессов аминокислотного обмена у коконопрядущих насекомых на синтез специфически построенных белков шелка.

4. Высокая скорость биосинтеза белков шелка в период завивки кокона обеспечивается у тутового шелкопряда благодаря мобилизации азотсодержащих ресурсов его тканей, за счет которых возникает 11,2% белков шелкового волокна. Белки (величины ОЭП 0,02; 0,05; 0,09 и 0,24), активно синтезирующиеся в жировом теле тутового шелкопряда в течение V личиночного возраста и накапливающиеся в период активного питания его гусениц в стенке кишечника и каркасе тела, используются через посредство гемолимфы в период завивки кокона в качестве азотистого материала для синтеза в шёлкоотделительной железе главных аминокислот шелка.

5. Наиболее тесные корреляции с процессами деструкции запасных белков в ходе развития тутового шелкопряда проявляют цистеиновые протеиназы с оптимумами рН 3,0; 3,6 и 6,2 в грене; 3,4 - в жировом теле; 6,2 - в фиброиновом отделе шелкоотделителыюй железы, функционирование которых обеспечивает организованный в пространстве и во времени протеолиз резервных белков насекомого.

6. В составе растворимых белков грены тутового шелкопряда обнаружены эндогенные белковые ингибиторы аспартильных, цистеиновых и сериновых протеиназ, характеризующихся одинаковыми оптимумами рН, взаимозависимой динамикой активности и совместной субклеточной локализацией с конкретными протеиназами, что доказывает участие белковых ингибиторов пептидогидролаз грены в регуляции активности эндогенных протеиназ.

7. Локализация исследованных протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов в субклеточных фракциях грены характеризуется: а) присутствием аспартильных и цистеиновых протеиназ в ядерной, митохондриальной, лизосомальной и постлизосомальной субклеточных фракциях, удельная активность которых убывает в ряду: лизосомы, митохондрии, ядра, постлизосомальная фракция; б) присутствием цистеиновых протеиназ во фракции лабильно связанных и прочно связанных белков хроматина, активность которых коррелирует с процессами роста, дифференцировки и органогенеза у зародыша; в) максимальной активностью белковых ингибиторов пептидогидролаз в ядерной и митохондриальной фракциях, обеспечивающей протекторную и регуляторную функции белковых ингибиторов при осуществлении процессов протеолиза в ядрах и митохондриях.

8. Белковый обмен в тканях и органах высокопродуктивных пород тутового шелкопряда характеризуется: а) более выраженной способностью к синтезу главных аминокислот шелка преимущественно в жировом теле и шелкоотделителыюй железе насекомого; б) наибольшей степенью корреляции с продуктивностью ферментов-маркеров функциональной направленности обмена аминокислот в каждой ткани и органе (3-фосфоглицератдегидрогеназы серицинового отдела шёлкоотделительной железы, аланинглиоксилатаминотрансферазы и треонинальдолазы фиброинового отдела её, аспартат-4-декарбоксилазы и треонинальдолазы жирового тела).

9. Установлена положительная, статистически достоверная корреляция между уровнем активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, 3-фосфоглицератдегидрогеназы, цистеиновых протеиназ с оптимумом рН 3,0; 3,6 и 8,6 в грене, с одной стороны, и рядом хозяйственно-полезных показателей - с другой, что позволяет рекомендовать уровень активности перечисленных ферментов в качестве биохимических тестов для раннего прогнозирования потенциальной продуктивности пород тутового шелкопряда.

10. Установлена положительная, статистически достоверная корреляция между уровнем активности аланинаминотрансферазы серицинового отдела шёлкоотделительной железы гусениц V личиночного возраста, активности аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, цистеиновых протеиназ с оптимумом рН 3,0 и 3,6 в грене родительских пород и гибридов, с одной стороны, и рядом хозяйственно-полезных показателей - с другой, что позволяет рекомендовать уровень активности перечисленных энзимов в качестве биохимических тестов для прогнозирования ожидаемого эффекта гетерозиса в потомстве при оценке качества родительских пород.

11. Разработаны методы очистки, впервые выделены в высокоочшценном состоянии и охарактеризованы функционально значимые ферменты белкового обмена тутового шелкопряда: цитозольная аланинаминотрансфераза из шёлкоотделительной железы ( Мг=74 кДа, субъединичная структура 18000x4, оптимум рН= 8,5, pl= 5.0, Кт= 18.12 мМ и 1.81мМ для аланина и а-кетоглутарата); две изоформы катепсин L-подобной протеиназы из грены (Мг=50кДа, оптимум рН=3.0, pi = 5.95 и 6.43); цистеиновая протеиназа из хроматина грены (оптимум рН=3.4); высокое сродство к эндогенным субстратам которых отражает узкую специализацию и высокую скорость кругооборота белков у исследованного насекомого.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Использовать уровень активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, 3-фосфоглицератдегидрогеназы, цистеиновых протеиназ с рН-оптимумом 3,0; 3,6 и 8,6 постдиапаузирующей грены как новый тест для ранней прогнозирующей оценки продуктивности пород тутового шелкопряда.

При составлении оптимальных вариантов скрещивания использовать уровень активности аланинаминотрансферазы серицинового отдела шёлкоотделительной железы гусениц V личиночного возраста, уровень активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, цистеиновыз протеиназ с рН-оптимумом 3,0 и 3,6 в постдиапаузирующей грене как показатель большей шелконосности при оценке качества родительских пород.

С целью дальнейшей интенсификации селекционной работы с тутовым шелкопрядом рекомендуем Министерству сельского хозяйства РФ включить в «Основные положения методики селекции тутового шелкопряда» определение активности ключевых ферментов белкового обмена насекомого на стадии яйца и личинки.

Ввести в соответствующие разделы учебных пособий по биохимии и селекции тутового шелкопряда новые материалы об особенностях белкового обмена у различных по продуктивности пород и гибридов тутового шелкопряда и, в том числе, о закономерностях биосинтеза в его тканях и органах главных аминокислот шелка, масштабах мобилизации запасных белков, роли в процессах деструкции резервных белков протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов.

398

БЛАГОДАРНОСТИ

Я глубоко признательна всем, кто помогал мне в создании этой работы. Более всего я обязана своим родителям и семье. Я благодарю их за беспредельную самоотверженность, постоянное сочувствие и терпение. Я бесконечно благодарна моему учителю Ю.Б.Филипповичу, который, будучи инициатором данного направления науки, научил меня культуре проведения научного эксперимента и не уставал воспитывать во мне ответственность и самостоятельность. Я приношу благодарность д.б.н. А.С.Коничеву за просмотр рукописи диссертации и за ценные замечания относительно её. Я высоко оцениваю вклад в работу аспирантов кафедры: Н.И.Жуковой, В.П.Банзаковой, Т.И.Лаптевой, В.М.Банникова, А.Ю.Назарова, Н.В.Тарасенко и Д.В.Ярыгина. Я благодарна коллегам кафедры за доброжелательно-творческую атмосферу, Н.М.Тугушевой, Н.Н.Белявой и Т.Г.Матюшиной за постоянную готовность помочь во всём (особенно в командировках), сотрудникам САНИИШ и Росшелкстанции за предоставление биологического материала для исследований. В заключение я выражаю глубокую признательность всем друзьям и родственникам за поддержку и понимание тех длительных усилий, которые сопровождали создание этого труда.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Клунова, Светлана Михайловна, Москва

1. Абелян Г.П., Тозалакян П.В., Мкртян М.В., Мелконян А.Б., Бабаханян А.В. Кинетические аспекты влияния некоторых ПАВ на L-аспартат-р-декарбоксилазу Alcaligenes faecalis.// Биотехнология. 1996. - № 12. С. 37-43.

2. Амбарцумова С.И. Азотистый обмен у контрастных по продуктивности пород тутового шелкопряда: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Ашхабад. -1968-18 с.

3. Амбарцумова С.И., Филиппович Ю.Б. О балансе аминокислот в тканях и ^ органах контрастных по продуктивности пород тутового шелкопряда.// Всб. тр. МГПИ им В.И.Ленина: Биохимия насекомых 1974 - Вып. 17. С. ф 98-106.

4. Андреева Н.А. Участие фолиевой кислоты в превращениях одноуглеродистых соединений. // Усп. биол. химии. 1963 - Т.5. С. 251261.

5. Антонов А.С. Сравнительно-систематическое изучение состава нуклеиновых кислот животных и его связи с составом синтезирующих белков: Автореф. дисс. канд. биол. наук. М. 1964. - 21с.

6. Антонов В.К. Химия протеолиза. М.: Наука, 1991. - 504с.

7. Баев А.А. Биохимия, молекулярная биология, генетическая инженерия -• взгляд в будущее.// Изв. АН ССР, сер. биол. -1986. № 2. С. 169-180.

8. Банников В.М., Бочкова А.П., Ушакова Г.И., Филиппович Ю.Б. Исследование субклеточной локализации некоторых ферментов в яйцах тутового шелкопряда.// Биохимия. 1982. - Т.47. Вып. 8. С. 1386-1391.

9. Баррет А.Д. Хит Н.Ф. Лизосомы. Методы исследования. М.: Мир, 1980. - 157с.

10. Белозерский М.А. Дунаевский Я.Е. Протеолитические ферменты и их ф ингибиторы в семенах гречихи.// Физиология растений. 1999. - Т.46. №3. С. 388-399.

11. Берстон М. Гистохимия ферментов. М.: Мир, 1965. - с. 97

12. Бирюкова Н.В. Изучение биосинтеза и физико-химических свойств фиброиногена тутового и дубового шелкопрядов: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Ашхабад, 1969. -24с.

13. Браунштейн А.Е. Пути превращения L-триптофана в организме животных и функции витамина Вб в этих превращениях.//Докл. АН СССР. 1949. -Т.65. № 5. С. 715-718.

14. Браунштейн А.Е. На путях к познанию реакций и ферментов переноса аминогрупп. Доклад на пленарном заседании III Всесоюзного биохимического съезда (Рига, 14окт. 1974г.).-М.: 1974.-37с.

15. Браунштейн А.Е., Виленкина Г.Я. Энзиматическое образование глицина из серина, треонина и других оксиаминокислот в животных тканях.// Докл. АН СССР. 1949. - Т. 66. № 2. С. 243-246.

16. Браунштейн А.Е., Горяченкова Е.В. Энзиматическое образование аланина из L-кинуренина и L-триптофана и роль витамина Вб в этом процессе.// Биохимия. 1949. Т. 14. Вып. 2. С. 163-179.

17. Бродский В.Я. Трофика клетки. М.: Наука, 1966. 355с.

18. Бродский В.Я., Нечаева Н.В. Ритм синтеза белка. М.: Наука, 1988. 239с.

19. Бунгова В.Г. Обмен аминокислот у тутового шелкопряда в процессе онтогенеза: Автореф. дисс. канд. биол. наук. -М., 1966. -20с.

20. Бунгова В.Г., Филиппович Ю.Б. Обмен аминокислот в развивающейся грене тутового шелкопряда.// Прикл. биохимия и микробиол. 1966. -Т.2. № 3. С. 227-231.

21. Бунгова В.Г., Филиппович Ю.Б. Баланс аминокислот в период завивки кокона и метаморфоза у тутового шелкопряда (Bombyx rnori L.)// Биол. науки. 1967. № 5. С. 47-51.

22. Бурова А.А. Пировиноградная кислота и ее участие в образовании аланина в организме дубового шелкопряда.// Уч. Зап. МГПИ им. В.И. Ленина. 1953. - Т. 77. № 7. С. 33-66.

23. Валуева Т.А. Структура и свойства белковых ингибиторов сериновых протеиназ и биоспецифические сорбенты на их основе: Автореф. дисс. докт. биол. наук. М., 1990. - 54с.

24. Валуева Т.А. Мосолов В.В. Белки-ингибиторы в семенах.//Физиология растений. 1999. -Т.46. № 3. С. 362-387.

25. Васильева Н.В. Исследования обмена белков у дубового шелкопряда с помощью меченого метеонина.// Уч. Зап. МГПИ им. В.И. Ленина. -1958.—Т.140. Вып. 9. С. 63-146.

26. Вейганд К., Хильгетаг Г. Методы эксперимента в органической химии. — М.: Химия, 1969.-944с.

27. Видута О.Д. Структурное состояние ДНК и активность генома в онтогенезе тутового шелкопряда: Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1975.-25с.

28. Вильсон Майлс Э., Новогродский А., Майстер А. Некоторые вопросы строения и функции аспартат-р-декарбоксилазы. В кн. «Химия и биология пиридоксалевого катализа». - М.: Наука, 1968. - С. 257.

29. Винокуров К.С. Организация протеолиза в средней кишке насекомых: Автореф. дисс. канд. биол. наук. -М. 2003. 24с.

30. Вовчук С.В., Левицкий А.П., Чарский В.В., Сиволап Ю.М. Обнаружение протеолитических ферментов и их ингибиторов в ядрах, выделенных из проростков ячменя.// Научно-техн. бюл. Всесоюзн. селекц. генетич. института. Одесса: 1981. -№ 1. С. 42-49.

31. Водолеев А.С., Коничев А.С., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Рибонуклеазная активность в субклеточных фракциях развивающейсягрены тутового шелкопряда.//Научн. докл. высш. шк., сер. биол. науки. -1977.-№ 11. С. 139.

32. Вокуркова Н.А. Особенности ядерного матрикса печени и гепатом крысы в зависимости от условий его излучения: Автореф. дисс. канд. биол. наук. -М., 1983.-16с.

33. Газиев А.И., Куцый М.П. Протеиназа,специфичная к гистону HI, ассоциирована с ядерным матриксом и активируется ДНК, содержащей разрывы или денатурированные участки.// Докл. АН СССР. 1988. — Т.299. № 1. С. 240-243.

34. Галимова JI.M., Иванова П.В., Корженко В.П., Антонов А.С. Влияние 5'-бромурацила на аминокислотный состав фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori L.// Биохимия. 1973. Т. 38. Вып. 4. С. 707711.

35. Гауровитц Ф. Химия и функции белков. М.: Мир, 1965. - 530с.

36. Гилмур Д. Метаболизм насекомых. М.: Мир, 1968. - 229с.

37. Головко В. А. Опыт ведения шелководства в Китае.// Шелк. 1991. - № 2. С. 27.

38. Головко В.А. Итоги работы Украинского научно-исследовательского института шелководства и перспективы исследования по программе «Кокон».//Шелк. 1992. -№1. С. 22-24.

39. Горюхина О.А., Степанова И.С., Гончарова В.Г., Резцова В.В. Протеиназная активность ядер различных тканей в отношении эндогенных гистонов.//Биохимия. 1979. -Т.44. № 3. С. 504-513.

40. Гулый М.Ф. Обмен глиоксиловой кислоты в клетке.// Укр. биохим. журнал. 1972. -Т.44. № 6. С. 804-820.

41. Гумилевская Н.А., Куваева Е.Б., Чумикина JI.B. Включение С14-глицина и С14 -лейцина бесклеточной системы из шёлкоотделительной железы Bombyx mori.//Докл. АН СССР. 1967. -Т.174. № 2. С. 472-475.

42. Гусев М.В., Никитина К.А., Ушакова Н.А. О фенилаланингидроксилазной активности в экстрактах клеток синезеленой водоросли Anabaena variabilis.// Микробиология. 1972. - Т.41. Вып. 6. С. 959-963.

43. Дегли С., Никольсон Д. Метаболические пути. М.: Мир, 1973. - 3 Юс.

44. Демяновский С.Я., Бурова А.А. Пировиноградная кислота и ее аминирование в организме дубового шелкопряда.// Биохимия. 1951. -Т. 16. Вып. 1.С. 29-35.

45. Демяновский С.Я., Сокольская А.В. Образование и распад аминокислот в тканях дубового шелкопряда Antheraea pernyi G.-M.// Биохимия. 1948. -Т. 13. Вып. 3. С. 273-278.

46. Демяновский С.Я., Филиппович Ю.Б. Связь белков и аминокислот с синтезом белков шелка в организме дубового шелкопряда Antheraea pernyi G.-M.//Биохимия. 1950. - Т. 15. Вып. 5. С. 437-443.

47. Егорова Т.А. Ферментные системы тканей тутового шелкопряда Bombyx mori L. (в теоретическом и прикладном аспектах): Автореф. дисс. докт. биол. наук. — Боровск, 1983. 34с.

48. Егорова Т.А., Васильева JI.E., Насириллаев У.Н. О возможности использования эстеразного теста для целей генетической экспертизы.// В сб. тр. МГПИ им. В.И. Ленина: Биохимия насекомых. 1978. - Вып. 20. С. 69-76.

49. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. -М.: Академия, 2003. -208с.

50. Егорова Т.А., Налетова Е.А., Шуршикова Н.В, Насириллаев У.Н. О перспективах использования эстсраз в селекции тутового шелкопряда.// В сб. тр. МГПИ им. В.И. Ленина: Биохимия насекомых. 1980. - Вып. 22. С.76-82.

51. Егорова Т.А., Насириллаев У.Н. Ферментные системы тканей тутового шелкопряда и их использование в селекции. Ташкент: Мин с-х. Уз ССР, 1987.-54с.

52. Егорова Т.А., Остапенко В.И., Филиппович Ю.Б. Изучение активности некоторых ферментов гемолимфы и грены у родительских пород игибридов тутового шелкопряда. В сб. тр. МГПИ им. В.И. Ленина: Биохимия насекомых. -1977. Вып. 19. С. 29-35.

53. Егорова Т.А., Санкина Т.М., Филиппович Ю.Б., Насириллаев У.Н. О путях и методах повышения продуктивности тутового шелкопряда. В сб. тр. МГПИ им. В.И. Ленина: Биохимия насекомых. 1977. - Вып. 19. С. 38.

54. Животенко Е.Ю., Кутузова Н.М., Филиппович Ю.Б. Сопоставление активности тирозиндекарбоксиназы в онтогенезе комнатных мух и тутового шелкопряда.// Онтогенез. -1990. Т.21. № 5. С. 548-551.

55. Жужиков Д.П. Ингибитор сериновых протеиназ в кишечнике пепельно-серого таракана Nauphoeta cinerea. И Ж. эволюц. биохимии и физиол. -1997. -Т.ЗЗ. №6. С. 592-598.

56. Иванов В.Г. Белковый комплекс и протеолитические ферменты желточного содержимого грены тутового шелкопряда Bombyx mori L: Автореф. дисс. канд. биол. наук. -М., 1986. 17с.

57. Иванов В.Г., Коничев А.С., Филиппович Ю.Б. Изменения содержания белковых фракций в желтке развивающейся грены тутового шелкопряда. Онтогенез. - 1985. -Т.16. № 2. С. 156-161.

58. Иванов И.И. , Коровкин Б.Ф., Маркелов И.М. Введение в клиническую энзимологию. Л.: Медицина, - 1974. - 277с.

59. Ишмаев A.M. Морфология и постэмбриональный рост шёлкоотделительной железы дубового шелкопряда.// Зоол. журнал. -1937.-Т. 16. №2. С. 239-246.

60. Караев К. Исследование биосинтеза фиброина в шёлкоотделительной железе тутового шелкопряда: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Ташкент, 1982.-18с.

61. Катунума Н., Окада М., Фудзино А., Катунума Т., Матсузава Т. Роль изоэнзимов трансаминазы в обмене веществ. В кн. Химия и биология пиридоксалевого катализа. М.: Наука, 1968. - С. 155-163.

62. Кафиани К.А. Пути саморегуляции ферментных систем анаболизма.// Успехи биол. химии. -1963. Т 5. С. 100-150.

63. Кирпичников B.C. Общая теория гетерозиса. I. Генетические механизмы наследственности.//Генетика. 1967. -№ 10. С. 167-180.

64. Клунова С.М. Азотистый обмен в шёлкоотделительной железе тутового шелкопряда: Дисс. канд. биол. наук. -М: 1970. 199с.

65. Клунова С.М., Филиппович Ю.Б. Исследование растворимых белков серицинового и фиброинового отделов шелкоотделителыюй железы тутового шелкопряда методом электрофореза в полиакриламидном геле.// Биохимия. 1969. -Т.34. Вып.5. С. 937-943.

66. Клунова С.М., Филиппович Ю.Б. Свободные аминокислоты в стенке и содержимом серицинового и фиброинового отделов шёлкоотделительной железы Bombyx mori L.// Уч. Зап. МГПИ им. В.И. Ленина. 1970. - Вып. 12. С. 100-104.

67. Клунова С.М., Ярыгин Д.В. Внутриклеточный протеолиз и его регуляция у наскомых. -М.: МПГУ, 2001. 104с.

68. Ковалевская Н.И. Азотистый обмен в организме тутового шелкопряда в аспекте полового диморфизма: Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1972.-35с.

69. Ковалевская Н.И., Филиппович Ю.Б. Половой диморфизм в содержании растворимых белков в тканях и органах тутового шелкопряда (Bombyx mori Ь).//Ж. общ. биологии. 1970. -Т.31. № 5. С. 650-659.

70. Коломийцева Г.Я. Измерение радиоактивности методом сцинтилляций в жидкой среде. В сб. «Методы биохимического эксперимента». М.: МГУ, 1974.-С. 112-137.

71. Коничев А.С. Обмен нуклеиновых кислот в эмбриогенезе тутового шелкопряда. Автореф. дисс. канд. биол. наук. -М., 1974. 27с.

72. Коничев А.С. Физико-химическая и функциональная характеристика множественных форм ферментов насекомых: Автореф. дисс. докт. биол. наук. М., 1991. 48с.

73. Коничев А.С., Севастьянова Г.А. Молекулярная биология. М., Академия, 2003. 400с.

74. Коничев А.С., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Биосинтез РНК в эмбриогенезе тутового шелкопряда.// В сб. тр. МГПИ им. В.И. Ленина: Биохимия насекомых. 1974. - Вып. 17. С. 75-84.

75. Коничева А.П. Сравнительное изучение белкового полиморфизма у различных по происхождению и продуктивности пород тутового шелкопряда: Автореф. дисс. канд. биол. наук. -М., 1975. 21с.

76. Коновалов Ю.Д. Свойства, локализация, роль и возможные пути регуляции активности протеиназ и аминотрансфераз в раннемонтогенезе рыб.// Успехи современной биологии. 1986. - Т. 101. № 3. С. 359-373.

77. Коровкин Б.Ф. Определение изоферментов в тканях и сыворотке крови методом энзим-электрофореза. В кн. Современные методы в биохимии. -М.: Медицина, 1968. С. 140-154.

78. Корочкин Л.И. Генетика изоферментов и развитие.// Онтогенез. 1976. -Т.7. № 1.С. 3-17.

79. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа, 1980.-272с.

80. Кретович В.Л. Обмен азота в растениях. М.: Наука, 1972. - 527с.

81. Кривченкова Р.С. Определение активности цитохромоксидазы в суспензии митохондрий: В кн. Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977. - С. 49-47.

82. Кузнецов Н.Я. Основы физиологии насекомых. М. - Л.: АН СССР, -1948.-Т.1. 480с.; 1953.-Т.2. 402с.

83. Куллыев П. Исследование биосинтеза рибонуклеиновых кислот и фиброина в шёлкоотделительной железе шелкопряда: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Ашхабад, 1965. -23с.

84. Куллыев П. Исследование биосинтеза белков и нуклеиновых кислот у тутового шелкопряда: Автореф. дисс. докт. биол. наук. Ашхабад, 1977. -44с.

85. Куллыев П., Гаузе Г.Г. РНК полимеразная активность в изолированных ядрах развивающегося зародыша тутового шелкопряда.// Онтогенез. -1974.-Т.5. №4. С. 398-400.

86. Куллыев П., Збарский И.Б., Раменская Г.П., Самарина О.П. О биосинтезе рибонуклеиновых кислот в шёлкоотделительной железе шелкопряда.// Биохимия. 1964. -Т.29. Вып. 3. С. 470-576.

87. Куллыев П., Караев К., Гаузе Г.Г. Ацшшрование тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами фиброинового отдела шёлкоотделительной железы вначале и конце V возраста.// Докл. АН СССР. 1975. - Т.223. № 2. С. 497-500.

88. Куранова О.П. Негистоновые белки группы высокой подвижности хроматина тутового шелкопряда: Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1987.-16с.

89. Куранова О.П., Краснов П.А., Караванов А.А., Филиппович Ю.Б. Выделение и очистка ядер и хроматина из грены тутового шелкопряда (Bombyx mori L).// Онтогенез. 1985. - Т. 16. № i. с. 88-91.

90. Куцый Н.П., Кузнецова Е.А., Газиев А.И. Участие протеаз в апоптозе.// Биохимия. 1999. -Т.64. Вып. 2. С. 149-163.

91. Кушнер Х.В., Зубарева JI.A., Гинтовт В.Е., Новик И.Е., Карликов Д.В. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции животных. -М.: ВИНТИСХ, МСХ СССР, 1968. 128с.

92. Левченко И.В. Органная специфичность трансаминазной активности пчел.// Пчеловодство. 1972. -№ 6. С. 11.

93. Левченко И.В. Особенности азотистого обмена у медоносной пчелы Apis mellifera L: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Киев, 1973. - 22с.

94. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир, 1969.-209 с.

95. Локшина Л.А. Протеолитические ферменты в регуляции биологических процессов.// Биоорганическая химия. -1994. -Т.20. № 2. С. 134-142.

96. Лузиков В.Н. Контроль качества: белки и органеллы.// Биохимия. 2002. -Т.67. Вып.2. С. 205-219.

97. Майстер А. Биохимия аминокислот. М.: Мир, 1961. - 530с.

98. Макулин А.И. Белки гемолимфы тутового шелкопряда; их физико-химическая и биологическая характеристика: Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1975.-28с.

99. Маурер Г. Диск-электрофорез. -М.: Мир, 1971. -247с.

100. Меркурьева Е.К., Шангин-Березовский Г.Н. Генетика с основами биометрии. -М.: Колос, 1983. С. 11-28.

101. Мешкова Н.Г., Северин С.Е. Практикум по биохимии животных. М.: Советская наука, 1950. - С. 36.

102. Минина Н.И. Ферменты в тканях тутового шелкопряда в процессе его онтогенеза: Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1973. - 28с.

103. Минина Н.И., Клунова С.М., Филиппович Ю.Б. Молекулярные формы лейцинаминопептидазы, аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы в тканях и органах тутового шелкопряда.// Уч. Зап. МГПИ им. В.И. Ленина. -1972. Вып. 15. С. 5-22.

104. Михайлов Е.Н. Грена. Ташкент: Госиздат, 1953. - 156с.

105. Михайлов Е.Н. Новое в преобразовании секрета шёлкоотделительной железы в шелковину (обзор проведенных исследований и точек зрения на процесс).// Шелк. 1988. № 1. С. 9-13.

106. Морозова В.П., Безбородова С.И. Кислая внеклеточная фосфомоноэстераза Aspergillus clavatus.//Микробиология. 1972. - Т. 12. № 3. С. 404-412.

107. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Наука, 1971. -414с.

108. Мосолов В.В. Белковые ингибиторы как регуляторы процессов протеолиза.// 36-е Баховские чтения. М.: Наука, 1983. - 40с.

109. Мосолов В.В. Ингибиторы белковой природы протеолитических ферментов.//Биоорганическая химия. 1994. -Т.20. № 2. С. 153-161.

110. Мосолов В.В. Новое о природных ингибиторах протеолитических ферментов.// Биоограническая химия. 1998. -Т.24. № 5. С. 332-340.

111. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Растительные белковые ингибиторы протеолитических ферментов. М.: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 1993.-208с.

112. Мэтун Дж. Р. Биосинтез аминокислот. В кн. Биогенез природных соединений. -М.: Мир, 1965. С. 9-32.

113. Нагиев Э.Р., Цыбульский В.В. Влияние пиридоксальфосфата на активность аминотрансфераз в различных структурно-функциональныхотделах головного мозга.// Укр. биохим. журнал. 1993. - т.65. №5. С. 63-69.

114. Нейфах А.А., Тимофеева М.Я. Молекулярная биология процессов развития. -М.: Наука, 1977.-312 с.

115. Немова Н.Н. Внутриклеточные протеолитические ферменты у рыб. -Петрозаводск: КНЦ РАН, 1996. -104 с.

116. Никитина И.Л. Пептиды в организме тутового шелкопряда (методы выделения и фракционирования, структура и возможное биологическое значение): Автореф. дисс. канд. биол. наук, 1974. -22с.

117. Остапенко В.И., Егорова Т.А., Филиппович Ю.Б. Полиморфизм амилазы и гликогенфосфорилазы у родительских пород и гибридов тутового шелкопряда.// Шелк. 1974. - № 4. С. 9-11.

118. Паршин А.Н., Горюхина Г.А., Лебедева С.Б. Серинтрансоксиметилаза клеток и субклеточных структур печени и гепатом.// Биохимия. 1971. -Т.36. Вып. № 5. с. 921-925.

119. Плохинский Н.А. Биометрия. Новосибирск. - СО АН СССР, 1961. -364с.412 :

120. Покровский А.А., Абрамук И.Р., Бондаренко М.В., Венде Э.Ю, Константинов И.Д., Коровников К.А. К вопросу о денситометрическом анализе изоферментных спектров.// Лаб. дело. 1971. -№ 1. С. 8-12.

121. Поляновский О.А. Макромолекулярная структура аспартаттрансаминазы. В кн. Химия и биология пиридоксалевого патализа. Тр. II Международного симпозиума. М.: Наука, 1968. - С. 100-107.

122. Правдина Н.Ф. Азотистый обмен в организме дубового шелкопряда и связь его с углеводным обменом: Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1963.-22с.

123. Рождественская В.А. Молочная кислота в организме Bombyx mori.// Уч. зап. фак. естествознания Моск. гос. пед. ин-та. М.: МГПИ. 1936. - Вып. 2. С. 125-138.

124. Самсонова М.В. Алании- и аспартатаминотрансферазы как индикаторы физиологического состояния рыб: Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 2002.-18с.

125. Самуилов В.Д. Программированная клеточная смерть.// Биохимия. -2000. Т.65. Вып. 8. С. 1029-1046.

126. Санкина Т.М., Егорова Т.А., Филиппович Ю.Б. Изучение растворимых белков и их ферментативная активность в зимующей грене различных пород тутового шелкопряда.// В. сб. тр. МГПИ им. В.И. Ленина: Биохимия насекомых. 1974. - Вып. 17. С. 42-55.

127. Сафронова М.Б., Шапошников Г.А., Гельман Н.С., Островский Д.Н. Аминокислотный состав некоторых белков мембран.// Биохимия. 1973. -Т.38. Вып. 3. С. 589-596.

128. Севастьянова Г.А. Биосинтез РНК у зародышей тутового шелкопряда в период их постдиапаузного развития: Тез. докл. VI Всесоюзного биохимического съезда (Москва, 1979). М.: Наука, 1979. - Т.2. С. 305.

129. Севастьянова Г.А. Структура генома тутового шелкопряда (теоретический и прикладной аспект): монография М.: МПГУ, 2001. -91с.

130. Севастьянова Г.А., Родина Е.Ю. Биосинтез ДНК в период пост-диапаузного развития грены тутового шелкопряда.// Биохимия насекомых. -М.: МГПИ им. В.И. Ленина. 1987. Вып. 26. С. 34-45.

131. Северин С.Е. Место современной биохимии в системе смежных научных дисциплин.// Биохимия. -2001. -Т.66. №10. С. 1465-1469.

132. Скулачев В.П. В своем межмембранном пространстве митохондрия таит «белок самоубийства», который, выйдя в цитозоль, вызывает апоптоз.// Биохимия. 1996. -Т.61. Вып.11. - С. 2060-2063.

133. Скулачев В.П. Старение организма особая биологическая функция, а не результат поломки сложной живой системы: биохимическое основание гипотезы Вейсмана.// Биохимия. - 1997. -Т.62. Вып. 11. С. 1394-1399.

134. Скулачев В.П. Кислород и явление запрограммированной смерти.// Первое северинское чтение. М.: Наука, 2000. - 38с.

135. Смирнов В.Н., Спирин А.С., Куллыев П., Збарский И.Б. Биосинтез РНК и фиброина в шёлкоотделительной железе тутового шелкопряда (Bombyx mori).//Тезисы I Всесоюзного биохимического съезда: Ленинград. 1964. -Т.2. С. 82.

136. Смирнов O.K. Активность некоторых ферментов крови, их наследуемость и связь с продуктивностью свиней. В сб. Породы свиней СССР. М.: Колос, 1970.-С. 192-200

137. Старкова Н.Н., Королева Е.П., Ротанова Т.В. Внутриклеточный протеолиз. Сигналы селективной деградации белков.// Биоорганическая химия. 2000. - Т.26. № 2. С. 83-96.

138. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функция белков (Под ред. А.С. Спирина). -М.: Высшая школа, 1996. -335с.

139. Струнников В.А. Разработка методов повышения продуктивности тутового шелкопряда: Дисс. докт. биол. наук. Ташкент, 1962. - 351с.

140. Сулейманов А.Ш., Рзаева А.А. Обмен азота (белка) у пород тутового шелкопряда.//Вестник с-х. науки. -1976. -№ 1. С. 33-37.

141. Толчинская B.E. Свободные и связанные аминокислоты, растворимые белки и их функциональная активность в эмбриогенезе тутового шелкопряда: Автореф. дисс. канд. биол. наук. -М., 1976. 24с.

142. Толчинская В.Е., Филиппович Ю.Б. Биохимические превращения в процессе развития грены тутового шелкопряда.// В сб. Тр. МГПИ им. В.И. Ленина: Биологическая и органическая химия. 1970. - Вып. 13. С. 51-70.

143. Торчинский Ю.М. Частичная очистка аланин-глютамат-трансаминазы сердца и некоторые ее свойства.// Биохимия. 1972. - Т.27. Вып. 5. С. 916-926.

144. Тыщенко В.П. Основы физиологии насекомых. ЛГУ: 1976. - Т.1. 362с.; 1977.-Т. 2. 302с.

145. Уилкинсон Д. Изоферменты. -М.: Мир, 1968. -224с.

146. Урванцева Г.А., Жохова Н.Б. Изучение белков гемолимфы личинок некоторых видов стрекоз методом электрофореза в полиакриламидном геле. 1980. - Рукопись деп. в ВИНИТИ 17 марта 1980 г.

147. Физер Л., Физер М. Реагенты для органического синтеза. М.: Мир, 1970. - Т. 1. С. 35.

148. Филиппович Ю.Б. Связь аминокислот и белков гемолимфы с синтезом белков шелка в организме дубового шелкопряда. // Уч. зап. МГПИ им. В.И. Ленина. -1953. -1.21. Вып. 7. С. 125-181.

149. Филиппович Ю.Б. Аминокислотный и белковый обмен в организме шелкопряда: Автореф. дисс. докт. биол. наук. -М., 1963. 35с.

150. Филиппович Ю.Б. Механизмы биосинтеза фиброина шелка.// Успехи современной биологии. -1964. -Т.57. Вып. 2. С. 192-210.

151. Филиппович Ю.Б. (ред). Биохимические методы прогнозирования продуктивности, гетерозиса, и оценки физиологического состояния полезных и вредных насекомых. Методические издания. М.: МГПИ им. Ленина, 1979.-70с.

152. Филиппович Ю.Б., Алиева М.И. Белки гемолимфы у разных пород тутового шелкопряда. // Прикл. биохимия и микробиол. 1967. -Т.З. № 2. С. 192-197.

153. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Грябина И.П. О перспективах использования биохимических маркеров в генетике и селекции тутового шелкопряда.// Сб. Тр. САНИИШ: Научные основы развития шелководства. Ташкент: Мин. с.-х. Уз. ССР, 1977. - Вып. 11. С. 130146.

154. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Носова А.П. Санкина Т.М. Изучение растворимых белков гемолимфы различных пород и рас шелкопряда (Bombyx mori L). // В. сб. Тр. МГПИ им. В.И. Ленина: Биохимия насекомых, 1974- Вып. 16. С. 112-124.

155. Филиппович Ю.Б., Клунова С.М. О взаимосвязи свободных аминокислот с биосинтезом белков шелка в шёлкоотделительной железе Bombyx mori L. //Ж. общ. биол. -1967. -Т.28. № 6. С. 715-723.

156. Филиппович Ю.Б., Коничев А.С., Водолеев А.С. Изучение ДНКазной и РНКазной активности у личинок исходных пород и гетерозисных гибридов тутового шелкопряда.// В. сб. Тр. МГПИ им. В.И. Ленина: Биохимия насекомых, 1977. Вып. 19. С. 19-22.

157. Филиппович Ю.Б., Коничев А.С. Множественные формы ферментов насекомых и проблемы сельскохозяйственной энтомологии. М.: Наука, 1987.-167с.

158. Филиппович Ю.Б., Лаптева В.И., Никитина И.Л. Основы биохимии тутового шелкопряда. -М.: Прометей, 1992. 308с.

159. Филиппович Ю.Б., Минина Н.И. Ферменты насекомых.// В сб.: Итоги науки и техники, сер. биолог, химия. 1976. - Т. 9. С. 126-139.

160. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А. Видута О.Д. Характеристика структурного состояния ДНК в онтогенезе тутового шелкопряда.// Докл. АН СССР. 1974. - Т.216. № 5. С. 1192-1194.

161. Филиппович Ю.Б., Щеголева Л.И. Исследование растворимых белков тканей тутового шелкопряда методом электрофореза в полиакриламидном геле.// Докл. АН СССР. 1967. - Т. 174. № 1. С. 240242.

162. Философова Е.М. Аминотрансферазы скелетных мышц низших позвоночных.// Ж. эволюц. биохимии и физиологии. 1970. Т. 6. № 2. С. 179-186.

163. Философова Е.М. Изоэнзимы аспарат- и аланинаминотрансфераз соматических мышц некоторых низших позвоночных.// Биохимия. -1972. -Т.36. № 3. С. 498-506.

164. Фильченков А.А. Каспазы: регуляторы апоптоза и других клеточных функций.// Биохимия. 2003. - Т.68. Вып. 4. С. 453-466.

165. Цирюльникова К.Б., Мельников Э.Э., Ротанова Т.В. Протеолиз, сопряженный с гидролизом АТФ. Регуляция активности протеолитических центров Ьоп-протеиназы Е. coli.// Биоорганическая химия. 2003. - Т.29. № 5. С. 486-498.

166. Чарыков А.К. Математическая обработка результатов химического анализа. — Л.: Химия, 1984. С. 22-26.

167. Шулика М.Н., Кутузова Н.М. Изучение белков гемолимфы, обладающих амиазной активностью у пород и гибридов тутового шелкопряда. // В. сб. Тр. МГПИ им. В.И. Ленина: Биохимия насекомых, 1980. Вып. 22. С. 95-105.

168. Шульц Г., Ширмер Р. Принципы структурной организации белков. М.: Мир, 1982. 354с.

169. Щеголева Л.И. Аминокислотный и белковый обмен в тканях и органах тутового шелкопряда: Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1968. - 20с.

170. Щеголева Л.И., Филиппович Ю.Б. Динамика свободных аминокислот тканей тутового шелкопряда в процессе его развития.// Биохимия. 1967. -Т.32. Вып. 4. С. 766-773.

171. Щеголева Л.И., Филиппович Ю.Б. Изменение содержания связанных аминокислот в тканях тутового шелкопряда в процессе его развития.// Биохимия. 1968. -Т.ЗЗ. Вып. 3. С. 488-492.

172. Щеголева Л.И., Киреева З.В., Хейфец А.Е. Сложные белки грены тутового шелкопряда в период инкубации.// В. сб. Тр. МГПИ им. В.И. Ленина: Биохимия насекомых, 1974. Вып. 16. С. 125-131.

173. Яковлева В.И. Изоферменты.// Успехи биол. химии. 1968. - Т.9. С. 5594.

174. Akai Н. Histological and Histochemical Observation of the Secretion from the Posterior Division of the Silk Gland in the Silkworm, Bombyx mori L.// J. Sericult. Sci. Japan. 1960. - V.29. №3. P. 206.

175. Akai H. Electron Microscopical Observation on the Fibroin Formation in the Silk Gland in the Silkworm, Bombyx mori L.// Bull. Sericult. Experiment. Stat. 1963. - V. 18. №3. P. 271.

176. Akhtar M., El-Obeid H.A. Inactivation of Serine transhydroxymethylase and threonine aldolase activities.// Biochim. et Biophys. Acta. 1972. - V.258. №3. P. 791-799.

177. Al-Adil K.M., Kilgore W.W.,Gadallah A.I., Painter R.R. Biochemical effect of metepa on house fly eggs.// J. econ. entomol. 1972. - V.65. №2. P. 321324.

178. Alnemri E.E., Livington D.J., Nicholson D.W., Salvesen G., Thomberry N.A., Wong W.W., Yuan J. Human ICE/CED-3 Protease Nomenclature.// Cell. -1996.-V. 87. №2. P. 171.

179. Anson M.L. The estimation of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with hemoglobin.//J. Gen. phisiol. 1939. - V.22. №1. P. 79-82.

180. Ashida M., Kinoshi Т.К., Brey P.T. Prophenoloxydase activation in the mosquito Aedes aegypti L.// Eur. J. Biochem. 1990. - V.188. №3. P. 507515.

181. Asakura Т., Kawaguchi Y., Demura M., Osanai M. 13C and 31PNMR studies on sugar metabolism in Bombyx mori and Philosamia cynthia ricini larvae.// Insect Biochem. 1988. - V.18. № 6. P. 531-538.

182. Asakura Т., Demura M., Nagashima M., Sakaguchi R., Osanai M., Ogawa K. Metabolic flux and incorporation of 2-13C-glicine into silk fibroin studied by 13C NMR in vivo and in vitro.// Insect Biochem. 1991. - V.21. № 7. P. 743748.

183. Aso Y., Yamashita Т., Meno K., Murakami M. Inhibition of prophenoloxidase-activating enzyme from Bombyx mori by endogenouschymotrypsin inhibitors.// Biochem. Mol. Biol. International. 1994. - V.33. №4. P. 751-758.

184. Asuma M., Ohta J. Changes in ^-translocating vacuolar-type ATPase in the anterior silk gland of Bombyx mori during metamorphosis.// J. Exp. Biol. -1998. V.201. №4. P. 479-486.

185. Babson A.L., Shapiro P.O., Williams P.A.R., Phillips G.E. The use of a diasonium Salt for the determination of glutamic-oxaloacetic transaminase in serum.// Clin. Chim. Acta. 1962. - V.7. №2. P. 199-205.

186. Bania J., Stachowian D., Palanowski A. Primary structure and properties of cathepsin G/chymotrypsin inhibitor from the larval hemolymph of Apis mellifera.// Eur. J. Biochem. 1999. - V.262. №3. P. 680-687.

187. Baors J.J.P., Op den Camp H.J.M., van der Drift C., Yoordens J.J.M., Wijmenga S.S., Van Griensven L.J.L.D., Hermans J.M.H., Vogels G.D. NMR study of ammonia assimilation in Agaricus bisporus.// Biochim. et Biophys.Acta. 1996. - V. 1310. №1. P. 74-80.

188. Ban-anger J.A., Geliger P.J., Huzino A., Bessman. S.P. Isozymes of phenylalanine hydroxylase.// Science. 1972. -V. 175. №4024. P. 903-905.

189. Barrett A.J. Cathepsin D and other carboxyl proteinases. In: Proteinases of mammalian cells and tissues. Ed. Barret A.J. Amsterdam.: Elsevier/North-Holland Biomedical Press, 1977. -P.209-248.

190. Bel Y., Jacobson K.B., Silva F.J., Ferre J. Developmental and Biochemical studies on the phenylalanine hydroxylation system in Drosophila melanogaster.//Insect Biochem. Mol. Biol. 1992. - V.22. №7. P. 633-638.

191. Belzecka K., Bojanowska K.R., Heller J. Studies on transamination in insects. I. Aspartic-a-ketoglutaric transaminase in Celerio euphorbiae L.// Acta, biochim.polon. -1959. V.6. №2. P. 195-203.

192. Belzecka K., Laskowska Т., Mochnacka I. Hydroxylation of phenylalanine in insects in some vertebrates.// Acta, biochim.polon. 1964. - V.ll. №2/3. P. 191-196.

193. Bergman A., Agapite J., Steller H. Mechanisms and control of programmed cell death in invertebrates.// Cell. 1998. - V.95. №3. P. 331-341.

194. Bernhard S. Changes of enzyme patterns in the integument of Locusta migratoria during formation of adult cuticle.// Insect Biochim.- 1976. V.6. №1. P. 79-83.

195. Berova N., Breinholt J., Jensen G.W., Kjaer A., Lo L., Nakanishi K., Nielsen R.I., Olsen C.E., Petersen Ch., Stidsen C.E. Malonofungin: an antifungal aminomalonic acid from Phaloramularia fusimaculans.// Acta chem. scand. -1994. V.48. № 3. P. 240-259.

196. Bheemeswar B. Studies on transaminase and decarboxylase catalysed by exstracts of silkworm Bombyx mori L.// Nature. 1955. - V.176. №4481. P. 555-556.

197. Bheemeswar B. Some aspects of amino acid metabolism in insects// Proc. 4-th International Congr. Biochemistry. 1958. -V. 12. P. 78-79.

198. Bheemeswar В., Sreenivasaya M. Occurrence of transaminase in the silkworm Bombyx mori L.// Curr. Sci. 1952. - V.21. P. 253.

199. Bini E., Knight D.P., Kaplan D.L. Mapping domain structures in silks from insects and spiders related to protein assembly.// J. Mol. Biol. - 2004. -V.335. №1. P. 27-40.

200. Bocca S.N., Muzzopappa M., Silberstein S., Wappner P. Occurence of a putative SCF ubuquitin ligase complex in Drosophila// Biochem. and Biophys. Res. Commun. 2001. - V.286. №2. P. 357-364.

201. Boigegrain R.A., Mattras H., Brechelin M., Paroutaud P., Coletti-Previero M. Insects immunity: two proteinase inhibitors from hemolymph of Locusta migratoria.// Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1992. - V.189. №2. P. 790-793.

202. Boigegrain R.A., Pugniere M., Paroutaud P., Castro В., Brehelin M. Lowо molecular weight serine protease inhibitors from insects are proteins with1. Туhighly conserved sequences.// Insect Biochem. Mol. Biol. 2000. - V.30. №1.ф P. 145-152.

203. Boisen S., Djurtoft R. Trypsin inhibitor from rye endosperm-purification and properties// Cereal. Chem. 1981. - V.58. №3. P. 194-198.

204. Boyd J. W. The extraction and purification of two isoenzymas of L-aspartate: 2-oxoglutarate aminotransferase.// Biochim. et Biophys. Acta. 1966. -V.113. №2. P. 302-311.

205. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.// Analyt.

206. Ф Biochem. 1976. - V.72. №1-2. P. 248-254.

207. Bradford H.F., Chain E.B., Cory H.T., Rose S.P. Glucose and amino acid metabolism in some invertebrate nervous systems.// J. Neurochem. 1969. -V.16. №6. P. 969-978.

208. Braunstein A.E. The enzyme system of tras-amination, its mode action and

209. Ф biological significance.// Nature. 1939. - V.143. P. 609-610.

210. Bricteux-Gregoire S., Dewandre A., Florkin M. Contribution a la biochimie du ver a soie. XVI. Conversion de la threonine en glycine, serine et alanine de la fibroine de la soie.//Arch. Int. Phisiol. Biochim. 1960. - V.68. №2. P. 281284.

211. Bricteux-Gregoire S., Dewandre A., Florkin M., Verly W.G. Contribution a la biochimie du ver a soie. XI. Utilization du carbone du formiate pour laф biosynthese des acides amines de la fibroine de la soie.//Arch. Int. Phisiol.

212. Biochim. 1959a. -V.67. №5. P. 687-692.

213. Bricteux-Gregoire S., Fukuda Т., Dewandre A., Florkin M. Contributions to silkworm biochemistry. VIII. Conversion of pyruvate into alanine, glycine and serine of silkfibroine.//Arch. Internat. Physiol, et Biochim. 1959c. - V.59. №4. P. 545-552.

214. Bricteux-Gregoire S., Verly W.G., Florkin M. Utilization of carboxyl carbon of L-phenilalanine for the synthesis of amino acids of silk by Bombyx mori.// Nature. 1956. -V. 177. №4522. P. 1237-1238.

215. Brock B.L.W., Wilkinson D.A., King J. Glyoxylate aminotransferases from oat leaves// Can J. Biochem. 1970. - V.48. №4. P. 486-492.

216. Broderick D.S., Candland K.L, North J.A., Mangum J.H. The isolation of serine transhydroxymethylase from bovine brain// Arch. Biochem. Biophys. -1972. V.148. №1. P. 196-198.

217. Brown C.M., MacDonald-Brown D.S, Meers J.L. Physiological aspects of microbial inorganic nitrogen metabolism// Adv. Microb. Physiol. 1974. -V.ll. №1. P. 1-52.

218. Capelluto D.G.S, Hellman U., Carzulo J.J., Cannata. J.J.B. Purification and some properties of serine hidroximethyltransferase from Trypanosoma cruzi. // Eur. J. Biochem. 2000. - V. 267. № 3. P. 712-719.

219. Carrell R.W., Boswell D.R. Serpins: the superfamily of plasma serin proteinase inhibitors. In Proteinase Inhibitors (Ed. by Barrett and Salvesen G.) Amsterdam-New York: Oxford Elsevier, 1986. P. 403-419.

220. Carrell R.W., Pemberton P.A., Boswell D.R. The serpins: evolution and adaptation in a family of protease inhibitors. In Cold Spring Harbar Symp. Quant. Biol. -1987. -L. 11. P. 527-535.

221. Carter D.B., Chae C.B. Chromatin-bound protease. Degradation of chromosomal proteins under chromatin dissociation conditions // Biochemistry. -1976. V.15. №2. P. 180-185.

222. Cartwright E.C., Danks D.M. Phenylalanine hydroxylase activity in human fibroblastic cells in culture// Biochim. et Biophys. Acta. 1972. - V.264. №1. P. 205-209.

223. Cartwright E.C., Connellan J.M., Danks D.M. Some properties of phenylalanine hydroxylase in human fetal liver// Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci.-1973. V.51. №4. P. 559-563.

224. Chang Van-Vun H., Frazier J.L., Heitz J.R. Time course of enzyme development in the boll weevil, Authonomus grandis//Comp. Biochem. Physiol. 1979. - V.B62. №1. P. 45-50.

225. Chapman H.A., Riese R.I., Shi G.P. Emerging roles for cysteine proteases in human biology//Ann. Rev. Physiol. 1997. - V.59. P. 63-88.

226. Chefurka W. Intermediary metabolism of nitrogenous and lipid compounds in insects. In "Physiology of insecta". New York-London : Acad Press, 1965. -V.2. P.670-768.

227. Chen P.S. Amino acid and protein metabolism in insect development. In: Advances in insect physiology. 1966. - London, New York: Acad Press, V.3. P.53-132.

228. Chen P.S., Bachmann-Diem C. Studies on the transamination reactions in the larval fat body of Drosophila melanogaster// J. Insect Physiol 1964. - V.10. №5. P.819-829.

229. Chen P.S., Baker G.T. L-Alanine aminotransferase in the paragonial gland of Drosophila // Insect Biochem. 1976. - V.6. №4. P.441-447.

230. Chen P., Nordstrom H., Gish В., Abrams J.M. Grim, a novel cell death gene in Drosophila// Genes Dev. 1996. - V.10. №14. P.1773-1782.

231. Chen J.S., Raikhel A.S. Subunit cleavage of mosquito pro-vitellogenin by a subtilisin-like convertase//Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1996. - V.93. №12. P.6186-6190.

232. Chen P., Rodriguez A., Erskine R., Trach Т., Abrams J.M. Dredd. a novel effector of the Apoptosis activators reaper , Grim and Hid Drosophila// Dev. Biol. 1998. - V.201. №2. P.202-216.

233. Chen K., Xu J., Jan Q., Прогресс в молекулярной биологии тутового шелкопряда. //Life Sci. Res. -2003. -V. 7. №3. P. 208-213.

234. Chimpendale G.M. Metamorphic changes in the fat body proteins of the southweatern corn borner, Diatraea grandiosella// J. Insect Physiol. 1970. -V.16. №6. P. 1057-1068.

235. Chimpendale G.M., Kilby B.A. Relationship between the proteins of the hemolymph and fat body during development of Pieris brassicae // J. Insect Physiol. 1969. - V.15. №5. P.905-926.

236. Chong M.T., Garrard W.T., Bonner J. Purification and properties of a neutral protease from rat liver chromatin // Biochemistry. 1974. - V.13. №3. P.5128-5131.

237. Chosa N., Ochiai M., Ashida M. cDNA cloning of a serin protease zymogen in plazma of the silkworm Bombyx mori. // Zool. Sci. 1998. - V. 15. Suppl. P 43a.

238. Cigic В., Dahl S.W., Pain R.H. The residual Pro-Part of Cathepsin С Fulfills the Criteria Required for an Intramolecular Chaperone in Folding and Stabilizing the Human Proenzyme// Biochem. 2000. - V.39. №40. P. 1238212390.

239. Coles G.C. The haemolymph and moulting in Rhodnius prolixus Stal// J. Insect Physiol. -1965. V.l 1. №10. P. 1317-1323.

240. Connellan J.M., Danks D. Demonstration of two forms of phenylalanine hydroxylase in humsn liver obtained at autopsy// Biochim. et Biophys. Acta. -1973. V.293. №1. P. 48-55.

241. Crabtree В., Newsholme E.A. The activities of proline dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, aspartate-oxoglutarate aminotransferase and

242. Ф alanine- oxoglutarate aminotransferase in some insect flight muscle// Biochem.

243. J. 1970. - V.l 17. №5. P. 1019-1021.

244. Creighton Т.Е., Darby N.J. Functional evolutionary divergence of proteolytic enzymes and their inhibitors// Trends Biochem. Sci. 1989. - V.14. №8. P. 319-324.

245. Dainty R.H. Purification and properties of threonine aldolase from Clostridium pasteurianum // Biochem. J. 1970. - V. 117. №3. P. 585-592.

246. Danielli A., Loukeris T.G., Lagueux M., Mtiller H.M, Richman A., Kafatos F. A modular chitin-binding protease associated with hemocytes and hemolymphin the mosquito A.GM Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2000. - V.97. №13. P. 7136-7141.

247. Daskalova S.M. Identification, purification and partial characterization of vitellin from the eggs of Eurygaster integriceps Putton (Heteroptera, Pentatomidae)// Arch. Insect Biochem. Physiol. 1995. - V.29. №3. P. 227242.

248. Daskalova S.M. Partial characterization of Trissolcus grandis trypsin -likeф enzyme. // Научн. Тр. Биол. Пловд. Унив. -1999. -V.35. №6. -Р.105-109.

249. Davies L.P., Johnston G.A.R. Serine hydroxymethyltransferase in the central nervous system: regional and subcellular distribution studies// Brain Res. -1973.-V.54. P. 149-156.

250. Davis J.R. Disc electrophoresis. Method and application to human serum proteins //Ann. N-Y. Acad. Sci. 1964. -V. 121. №2. P. 404-427.

251. Decker L.E., Rau E.M. Multiple forms of glutamic-oxaloacetic transaminases in tissues //Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 1963. - V.l 12. №1. P. 144-149.

252. Deng L.R., Fujii H., Aratake H., Kawaguchi Y.} Koga K. Isolation and properties of two allelic chymotrypsin inhibitors from the hemolymph of the silkworm Bombyx mori. // Insect Biochem. 1990. - V.20. №5. P. 531-536.

253. De Rosa G., Burk T.L., Swick R.W. Isolation and characterization of mitochondrial alanine aminotransferase from porcine tissue// Biochim. et Biophys. Acta. 1979. - V.567. №1. P. 116-124.

254. De Rosa G., Swick R.W. Metabolic implication of the distribution of the alanine aminotransferase isoenzyme// J. Biol. Chem. 1975. - V.250. №20. P. 7961-7967.

255. Desai R.M., Kilby B.A. Some aspects of nitrogen metabolism in the fat body of larva of Calliphora erythrocephala// Arch. Internat Physiol, et Biochem. -1958. V.66. №2. P. 248-259.

256. Deveraux G.L., Takahashi R., Salvesen G.S., Reed J.C. X-linned IAP is a direct inhibitor of cell-death proteases. // Nature. 1997. - V.388. №6639. P. 300-304.

257. Devie J.R., Murphy L.C., Level of ubiquitinated histone H2B in chromatin is coupled to ongoing transcription. // Biochemistry. 1990 .- V 29. №20. P. 4752-4757.

258. Dianondstone T.I. Assay of tyrosine transaminase activity by conversion p-hydroxyphenylpyruvate to p- hydroxybenzaldehyde. // Analyt. Biochem. -1966. V.l6. -№3. P. 395-401.

259. Dittmer N.T., Raikhel A.S. Analysis of mosquito lysosomal aspartic protease gene an insect reousekeeping gene with fat body-enhanced expression// Insect Biochem. Mol. Biol. -1997. - V.27. №4. P. 323-335.

260. Donnellan J.F., Jenner D.W., Ramsey A. Subcellular fractionation of fleshfly flight muscle in attempts to isolate synaptosomes and to establish the location of glutamate enzymes// Insect Biochem. 1974. - V.4. №3. P. 243-265.

261. Dumitru J.P., Iordachescu D., Niculesku S. Chromatographic purification, crystallization and study of vegetable L-alanine: 2-oxoglutarate-aminotransferase properties// Experientia- 1970. V.26. №8. P. 837-838.

262. Eguchi M. Inhibition of the fungal protease by haemolymph protease-inhibitors of the silkworm Bombyx mori L.// Appl. Ent. Zool. 1982. - V.17. №4. P. 589-590.

263. Eguchi M. Protein protease inhibitors in insect and comparison with mammalian inhibitors// Сотр. Biochem. Physiol. 1993. - V.105B. №3. P. 449-456.

264. Eguchi M., Haneda I., Iwamoto A. Properties of protease inhibitors from the haemolymph of silkworm, Bombyx mori, Antheraea pernyi and Philosamia cynthia ricini//Сотр. Biochem. Physiol. 1982. - V.71B. №4. P. 569-576.

265. Eguchi M., Itoh M., Chou L.Y. Nishino K. Purification and characterization of a fungal protease specific protein inhibitor (FPI-F) in the silkworm haemolymph//Сотр. Biochem. Physiol. 1993. - V.104B. №4. P. 537-543.

266. Eguchi M., Itoh M., Nichino K., Shibata H., Tanaka Т., Kameihayashi K., Hara S. Amino acid sequence of an inhibitor from the silkworm (Bombyx mori) haemolymph against fungal protease// J. Biochem. 1994. - V.115. №5. P. 881-884.

267. Eguchi M., Matsui Y., Matsumoto T. Developmental charge and hormonal control of chymotrypsin inhibitors in the haemolymph of the silkworm, Bombyx mori L. // Сотр. Biochem. Physiol. 1986. - V.84B. №3. P. 327

268. Eguchi M., Ueda K., Yamashita M. Genetic variants of protease inhibitors against fungal protease and a-chymotrepsin from haemolymph of the silkworm, Bombyx mori. // Biochem. Genet. 1984. - V.22. №11. P. 10931102.

269. Eguchi M., Yamamoto Y. Comparison of serum protein inhibitors from Ф various mammals, chicken and silkworm against four protease// Сотр.

270. Biochem. Physiol. 1988. - V.91B. №4. P. 625-630.

271. Engelman F., Geraerts W.P.M. The proteases and protease inhibitors in the ® midgut of Leucophae maderae // J. Insect Physiol. 1980. - V.26. №10. P.703.710.

272. Epel D. Protein synthesis in sea urchin egg: A "late" response to fertilization// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1967. V.57. №4. P.899-906.

273. Epel D., Pressman B.C., Elsaessar S., Weaver A.M. The program of structural and metabolic changes following fertilization of sea urchin eggs. In: The cell cycle gene-enzyme interactions (ed. by Padilla G.M.) New York: Acad. Press,1969.-P. 279-298.

274. Evan E.K., Lu W., Strum S.L., Mayer B.J., Kornbluth S. CRK is required for ^ apoptosis in Xenopus egg // EMBO J. 1997.-V. 16. №24. - P. 7372-7381.

275. Fallon H.G., Byrne W.L. 2-Phosphoglyceric acid phosphatase: identification and properties of the beef-liver enzyme// Biochim. et Biophys. Acta. 1965. -V.105. №1. P.43-53.

276. Fattah Abd el M.M., Algauhari A.E.I. Some enzymes in the haemolymph of Pectinophora gossaypiella during induction and termination of diapause// J. Compar. Physiol. 1972. - V.78. №1. P.20-24.

277. Fisher D.B., Kirkwood R., Kaufman S. Rat liver phenylalanine hydroxylase, an iron enzyme//J. Biol. Chem. 1972. - V.247. №16. P.5161-5167.

278. Fitzpatrick P.F. Tetrahydropterin-dependent amino acid hydroxylases. Annu. Rev. Biochem. Palo Alto (Calif). -1999. -V. 68. P. 355-381.

279. Florkin M. The free amino acids of insect hemolymph// Proc 4th Internat. Congr. Biochem. 1959. -V. 12. P.63-77.

280. Florkin M., Jeuniaux Ch. Hemolymph composition. In: Physiology of Insecta (Ed. M. Rockstein). New-York-London; Acad. Press, 1964. - V.3. P. 109152.

281. Fraser A.G., Evan I. Identification of a Drosophila melanogaster ICE/CED-3-related protease, DrICE. //EMBO J. 1997. - V.16. №10. P.2805-2813.

282. Friedrich Т., Kroger В., Bialojan S., Lemaire H.G., Hoffken H.W., Reuschenbach P., Otte M., Dodt J. A Kazal-type inhibitor with thrombin specificity from Rhodnius prolixus// J. Biol. Chem. 1993. - V.268. №22. P. 16216-16222.

283. FrObius A.C., Kanost M.R., Gotz P., Vilcinskas A. Isolation and characterization of novel inducible serine protease inhibitors from larval hemolymph of the greater wax moth Galleria mellonella// Eur. J. Biochem. -2000. V.267. №7. P.2046-2053.

284. Fukuda Т. Biochemical studies on the formation of the silk protein III. The conversion of C14-labelled phenylalanine to tyrosine in the silkworm larva (Bombyx mori).// J. Biochem. (Japan) 1956. - V.43. №2. P. 137-142.

285. Fukuda T. Conversion of phenylalanine into tyrosine in the silkworm larva (Bombyx mori).// Nature. -1956. V.177. №4505. P.429-430.

286. Fukuda T. Biochemical studies on the formation of the silkprotein III. The conversion of C14-labelled of pyruvic acid to alanine in the silkworm larva// J. Biochem. (Japan)- 1957. -V.44. №8. P.505-510.

287. Fukuda T. Conversion of pyruvic acid to alanine in silkworm larva// Nature. -1957.-V. 180. №4579. P.245.

288. Fukuda T. Biochemical studies on the formation of the silkprotein. VI. Conversion of serine to glycine in the silkworm larva // J. Biochem. 1960 a.- V.47. №5. P.581-583.

289. Fukuda T. Biochemical studies on the formation of the silkprotein. VII. The conversion of glycine to serine in the silkworm larva// J. Biochem. 1960 b. -V.47. №6. P.720-725.

290. Fukuda Т., Florkin M. Contribution to silkworm biochemistry. V. Time of biosynthesis of fibroin and its location in the silk of Bombyx mori L. (European race).// Arch. Internat. Physiol, et Biochem. 1959 a. - V.67. №2. P.185-189.

291. Fukuda Т., Florkin M. 1959. Contribution to silkworm biochemistry. VII. Ordered progression of fibroinogen in the reservoir of the silkgland during the 5th instar. // Arch. Internat. Physiol, et Biochem. 1959 b. - V.67. №2. P.214-221.

292. Fukuda Т., Hayashi T. Biochemical studies on the formation of the silkprotein. V. Conversion of glyoxylic acid to glycine in the silkworm larva// J. Biochem.- 1958. V.45. №7. P.469-474.

293. Fukuda Т., Hayashi T. Biochemical studies on the formation of the silkprotein. VIII. The synthesis of a-ketoglutaric acid, oxalacetic acid and glyoxylic acid from glucose in the silkworm// J. Biochem. 1960. - V.48. №1. P.9-12.

294. Fukuda Т., Kameyama Т. Biochemical studies on the formation of the silkprotein. VIII. The synthesis of glycine from glyoxylic acid in the silkworm larva// J. Sericul. Sci. Japan. -1961. V.30. P.437-441.

295. Fukuda Т., Matsuda K., Hayashi T. Separation of a-ketoglutaric acid and glyoxylic acid in the hemolymph and silk gland by chromatography and absorption spectroscopy. //Res. Sericult. Sci. 1954. -№7. P.35-38.

296. Fukuda Т., Sudo M., Matuda M., Hayashi Т., Kurose T. Horiuchi G., Florkin M. Formation of silkproteins during the growth of the silkworm larva Bombyx mori// Proc. 4th Internat. Congress Biochemistry. 1959. -V. 12. P.90-99.

297. Futterman S. Enzymatic reduction of folic acid and dihydrofolic acid to tetrahydrofolic acid//J. Biochem. -1957. V.228. №2. P.1031-1038.

298. Gadallah A.I., Marei N. Changes in soluble protein dehydrogenases and esterases of unfertilized eggs of Musca domestica// Insect Biochem. 1973. -V.3. №10. P.163-169.

299. Gamborg O.L., Neish A.C. Biosynthesis of phenylalanine and tyrosine in young wheat and buckwheat plants. // Canad. J. Biochem. Physiol. 1959. -V.37. №11. P.1277-1285.

300. Gamo Т., Kuroda S., Horie G., Watanabe K. Quantitative changes of asparagine and glutamine in hemolymph of silkworm, Bombyx mori, during larval and pupal development.// Appl. Entomol. Zool. 1978. - V.13. №3. P.223-226.

301. Gburek J., Osada J., Siekierka M., Warwas M. Clearance of chicken cystatin from the rat circulation// Compar. Biochem. Physiol. 1995. - V.B112. №4. P.697-701.

302. Gerber G., Altman K. Mechanism of Collagen Synthesis// Nature. 1961. -V.l89. №4767. P. 813-814.

303. Giorgi F., Bradley J.T., Nordin J.H. Differential vitellin polypeptide processing in insect embryos// Micron. 1999. - V.30. №6. P. 579-596.

304. Giorgi F., Yin L., Cacchettini A., Nordin J.H. The vitellin- processing protease of Blattella germanica is derived from a pro-protease of maternal origin// Tissue and Cell. 1997. - V.29. №3. P. 293-303.

305. Goldstein P., Marquet D., Depraete V. Homology between reaper and the cell death domains of FAS and TNFR1// Cell. 1995. - V.81. №2. P. 181-185.

306. Gomi Т., OkudaT., Tanaka S. Protein syntesis and degradation in the flight muscle of adult crickets (Gryllus bimaculatus) //J. Exptl. Biol. -1995. -V18. №5. P. 1071-1077.

307. Good A.G., Muench D.G. Purification and characterization of an anaerobically induced alanine aminotransferase from barley roots. //Plant. Physiol. 1992. -V.99. №4. -P. 1520-1525.

308. Gopinathan K.R. Biotechnology in sericulture// Curr. Sci (India). 1992. -V.62. №3. P. 283-287.

309. Goto S.G., Denlinger D.L. Genes encoding two cystatins in the flesh fly Sarcophaga crassipalpis and their distinct expression patterns in relation to pupal diapauses// Gene. 2002. - V.292. №1. P. 121-127.

310. Gowda T.V., Ramaiah T.R. Studies on aminotransferases in the developing ovary of the silkworm Bombyx mori L.// Indian J. Biochem. Biophys. 1975. -V.l2. №2. P. 100-102.

311. Grunstein M. Histone function in transcription// Ann. Rev. Cell. Biol. 1990. -V.6. P. 643-678.

312. Grzelakowska Sztabert В., Chmurzynska W., Lanaman M. Serine hydroxymethyltransferase and methylenetetrahydrofolate oxidoreductase from tissues of Galleria mellonella. // Insect Biochem. -1976. -V.6. №3. -P.227-232.

313. Guitton Y. Sur le metabolisme azote des gymnosperms. Mise en evidence de reactions de transamination dons les plantules de Pinus pinea L.// Сотр. Rend. Acad. Sci. 1961. - V.253. №22. P. 2583-2585.

314. Gupta U.S., Agraval D.P. Blood protein synthesis in the fat body of Poecilocera picta (Insecta, Orthoptera)//Lool. Jahrb- 1976. Abt.2. V.96. №3. P. 295-302.

315. Guroff G., Rhoads C.A. Phenylalanine hydroxylation by Pseudomonas speices (ATCC 1129a)//J. Biol. Chem. 1969. - V.244. №1. P. 142-146.

316. Hackman R.H. Gel electrophoresis and sephadex thin-layer studies of proteins from in insect cuticle, Agrianoma spinicollis (Colegtera)// Insect Biochem. -1972. -V.2. №6. P. 235-242.

317. Hackman R.H, Goldberg M. Some conformational studies of larval cuticular protein from Calliphora vicina// Insect Biochem. 1979. - V.9. №6. P. 557561.

318. Hahn D.A., Wheeler D.E., Presence of a single abundunt storage hexamerin in both larvae and adults of grosshoper Shistocerca americana. // J. Insect Physiol. 2003. V.49. №12. - P. 1187-1197.

319. Hakkansson H.O., Borgstrom A., Ohlsson K. Porcine pancreatic cationic pro-elastase. Studies on the activation, turnover and interaction with plasma protein inhibitor. // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1991. -V.372. №7. -P.465-472.

320. Hamilton P.B. Ion exchange chromatography of amino acids. A single column, high resolving, fully automatic procedure// Anal. Chem. 1963. - V.35. №13. P. 2055-2064.

321. Han Q., Li J. Comparative characterization of Aedes 3-hydroxykynurenine transaminase / alanine glyoxylate transaminase and Drosophila serine pyruvate aminotransferase. //FEBS Lett. -2002. -V. 527. P. 199-204.

322. Handley H.L., Estridge B.H., Bradley J.T. Vitellin processing and protein synthesis during cricket embryogenesis// Insect Biochem. Molec. Biol. 1998. - V.28. №11. P. 875-885.

323. Hansen-Delkeskamp E. Synthese von PNS und protein wahrend der oogenese und frtihen embryogenese von Acheta domestica// W. Roux Arch. Entwicklugengemech. Org. -1969. -Bd.162. H2. S. 114-120.

324. Harder W., Quayle J.R. The biosynthesis of serine and glycine in Pseudomonas AMI with special reference to growth on carbon sources other than Q compounds//Biochem J. -1971. - V.121. №5. P. 753-762.

325. Harvima R.J., Jabe K., Fraki J., Fucugama K., Epstein W.L. Hydrolisis of histones of proteinases. //Biochem J. -1988 -V.250. №3. -P. 859-864.

326. Hatch H.D. Separation and properties of leaf aspartate aminotransferase isoenzymes operative in the C4 pathway of photosynthesis// Arch. Biochem. Biophys. 1973. - V.156. №1. P. 207-214.

327. Hay B.A., Wassarman D.A., Rubin G.M. Drosophila Homologs of Baculovirus Inhibitor of Apoptosis Proteins Function to Block Cell Death// Cell. 1995. -V.83. №7. P. 1253-1262.

328. Heimburger N. Proteinase inhibitors of human plasma. Their properties and control functions. In: Proteases and Biological Control (Ed. by Reich et al)/ 1975.-P. 367-386.

329. Hengartner M. Death by Crowd Control// Science. 1998. - V.281. №5381. P. 1298-1299.

330. Henrikson P.A., Clever U. Protease activity and cell death during metamorphosis in the salivary gland of Chironomus tentans// J. Insect Physiol. 1972. - V.18. №10. P. 1981-2001.

331. Heptinstall J., Quayle J.R. Pathways leading to and from serine during growth of Pseudomonas AM 1 on Ci-compaunds or succinate// Biochem. J. 1970. -V.117. №3. P. 563-572.

332. Hinman M.B., Jones J.A., Lewis R.V. Synthetic spider silk: a modular fiber// Trends Biotechnol. 2000. - V. 18. №9. P. 374-379.

333. Hirayama C., Konno K., Shinbo H. The pathway of ammonia assimilation in the silkworm Bombyx mori.// J. Insect Physiol. -1997. V.43. P. 959-964.

334. Hirayama С., Nakamura M. Regulation of glytamine metabolism during the development of Bombyx mori larvae// Biochim. et Biophys. acta. 2002. -V.1571. №1. P.131-137.

335. Hirayama C., Saito H., Konno K., Shinbo H. Purification and characterization of HADH-dependent glutamate synthase from silkworm fat body (Bombyx mori)// Insect Biochem. Mol. Biol. — 1998. V.28. №7. P.437-482.

336. Homma K., Natori S. Identification of substrate proteins for cathepsin L that are selectively hydrolyzed during differentiation of imaginal disks of Sarcophaga peregrine. // Eur. J. Biochem. 1996. - V.240. №2. P.443-447.

337. Hopper S., Segal H.L. Kinetic studies of rat liver glutamic alanine transaminase//J. Biol. Chem. 1962. - V.237. №10. P.3189-3195.

338. Horie Y., Inokuchi Т., Watanabe K. Quantitative studies of food utilization by the silkworm Bombyx mori through its life cycle. II. Economy of hydrogen and amino acids//Bull. Sericult. Exper. Stat. 1978. - V.27. №5. P.531-578.

339. Horie Y., Shinbo H. Partial purification and properties of 3-phosphoglycerate dehydrogenase in the fat body tissues of larvae of the silkworm, Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae ).// Appl. Ent. Zool. 1985. - V.20. №3. P.282-291.

340. Hsu Ting-seng, Wang Er-lee. Studies on the metabolism of amino acids in the silkworm. III. The mode of formation of alanine from L-aspartic and a-ketoglutaric acid in the silkworm// Acta. Biochem. Boiphys. Sinica. 1964. -V.4. №3. P.329-341.

341. Ihara F., Mishiro K., Sato T. Radiolabelling of cuticular proteins of the brown-winged green bug, Plautia stali Scott (Hemiptera: Pentatomidae)// Appl. Entomol. and Zool. -2002. -V.37. №2. -P. 279-283.

342. Indrasith L.S., Furusawa Т., Shikata M., Yamashita O. Limited degradation of vitellin and egg-specific protein in Bombyx eggs during embryogenesis// Insect Biochem. 1987. - V.17. №4. P.539-545.

343. Indrasith L.S., Sasaki Т., Yamashita О. A unique protease responsible for selective degradation of a yolk protein in Bombyx mori// J. Biol. Chem. -1988. V.263. №2. P.1045-1051.

344. Inohara N., Koseki Т., Hu Y., Chen S., Nunez G. CLARP, a death effector domain-containing protein, interact with caspase-8 and regulates apoptosis// Proc. Nat. Acad. Sci. USA- 1997. -V.94. №20. P. 10717-10722.

345. Irie K., Yamashita O. Egg-specific protein in the silkworm Bombyx mori: purification, localization and titre changes during oogenesis and embryogenesis. // Insect Biochem. -1983. -V.13. №1. P.71-80.

346. Ishaaya I., Navon A. Phenoloxydase activity at various stages of development in the egyptian cotton worm Spodoptera littoralis// Insect Biochem. — 1978. -V.8. №1. P.81-85.

347. Izquierdopulido M.L., Haard T.A., Hung J., Haard N.F. Oryzacystatin and other proteinase-inhibitors in rice grain-potential use as a fish processing aid// J. Agr. Food. Chem. -1994. V.42. №3. P.616-622.

348. Izumi S., Yano K., Yamomoto Y., Takahashi S.Y. Yolk proteins from insect eggs-structure, biosynthesis and programmed degradation during embryogenesis//J. Insect. Physiol. 1994. - V.40. №9. P.735-749.

349. Jaffe J.J., Chrin L.R. Serine transhydroxymethylase activity in normal and Brugia pahandi-infected Aedes aegyptill J. Parasitol. 1978. - V.64. №5. P.769-774.

350. Jenkins W.T., Saier M. Jr. L-alanine aminotransferase (Pig heart). In: Methods in Enzymology (ed. by Tabor H., Tabor C.W.). New-York-London: Acad. Press. 1970.-V. 17a. P.159-163.

351. Jin H.J., Kaplan D.L. Mechanism of silk processing in insect and spiders. // Nature -2003. -V.424. №6952. P.1057-1061.

352. Julien P., Corrivault G.V., Perron J.M. Localization isoelectrique des glycoproteins de l'hemolymphe et des corps de Calliphora erythrocephala// Insect Biochem. -1977. V.7.№3. P.303-307.

353. Kageyama Т., Ohnishi E. Carbohydrate metabolism in the eggs the silkworm, Bombyx mod. II. Anaerobiosis and polyol formation// Devel. Grow, and Differ. 1973. - V.15. №1. P. 47-55.

354. Kageyama Т., Takahahi S.V., Takahahi K. Occurance of tiol proteinases in the eggs of the silkworm, Bombyx mori// J. Biochem. 1981. - V.90. №3. P. 665671.

355. Kamioka S., Kasegawa H. Physical properties in the blood of the silkworm, Bombyx mori L.// J. Sericult. Sci. Japan. -1961. V.30. №5. P. 395.

356. Kang S.H., Fuchs M.S. Isolation of chymotrypsin inhibitor from Drosophila melanogaster// Insect Biochem. 1974. - V.4. №1. P. 1-8.

357. Kang S.H., Fuchs M.S. Purification and partial characterization of a protease inhibitor from Drosophila melanogaster// Biochim. et Biophys. Acta. 1980. -V.611. №1-2. P.379-383.

358. Kanost M.R. Serine proteinase inhibitors from the serpin gene family in Manduca sexta and Drosophila melanogaster. In: Mol. Insect. Science (ed H.H. Hagedorn et al.). New York: Plenum press, 1990. - P. 139-146.

359. Kanost M.R., Prasad S.V., Huang Y.L., Willott E. Regulation of serpin gene-1 in Manduca sexta// Insect. Biochem. Molec. Biol. 1995. - V.25. №2. P.285-291.

360. Kanost M.R., Sarvamangala V.P., Wells M.A. Primary structure of a member of serpin superfamily of proteinase inhibitors from an insect, Manduca sexta// J. Biol. Chem. 1989. - V.264. №2. P. 965-972.

361. Karlson P., Sekeris C.E., Richards A.G., Richard P.A. The amino acid composition of the various types of cuticle of Limulus polyphemus// J. Insect. Physiol. 1969. - V.15. №3. P.495-507.

362. Karsten W.E., Ohshiro Т., Izumi Y., Cook P.F. Initial velocity spectral and pH studies of the serine-glyoxylate aminotransferase from Hyphomicrobium methylovorum/ // Arch. Biochem. and Biophys. -2001. -V.388. №2. P. 267

363. Kasting R., McGinnis J.A. Use of glucose labelled with carbon-14 to determine the amino-acids essential for an insect// Nature. 1958. - V.l82. P.1830-1831.

364. Kaufman S. The phenylalanine hydroxylating system from mammalian liver// Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. -1971. V.35. P.245-319.

365. Kawamura M., Wadano A., Miura K. Purification and characterization of insect cathepsin D// Insect Biochem. 1987. - V. 17. №1. P.77-83.

366. Kawasaki H., Ojima N., Tada H., Sato H. Conversion of serine to glycine in the spinning larva of silkworm, Bombyx mori// J. Biochem. 1968. - V.64. №2. P. 247-250.

367. Khan M.A., De Kopt C.A.D. Farher evidence for the significance of proline as a substrate for flight in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata// Сотр. Biochem. Physiol. 1978. - V.60B. №4. P.407-411

368. Kikkawa H. Biochemical genetics of proteolytic enzymes Drosophila melanogaster, general considerations. // Jap. J. Genet. -1968 -V.43 №2. P. 137-148.

369. Kikkawa L.F. Inactivation of human plasma serine proteinase inhibitors (serpins) by limited proteolysis of the reactive site loop with snake venom and bacterial proteinases// J. Cell. Biochem. 1986. - V.32. №1. P.51-58.

370. Kilby B.A. The biochemistry of the insect fat body// Advances in Insect Physiology. New York-London.: Acad. Press, 1963. - V. 1. P. 111-174.

371. Kilby B.A., Neville E. Amino acid metabolism in locust tissues// J. Expt. Biol. 1957. - V.34. №2. P.276-289.

372. Kilgore W.W., Painter R.R. Effect of the chemosterilant apholate on the synthesis of cellular components in developing house fly eggs// Biochem. J. -1964. V.92. №2. P.353-357.

373. Kindl H. Aromatische Aminosauren im Stoffwechsel hoherer Planzen// Naturwissenschaften. 1971. -Bd.58. Nr. 11. S.554-563.

374. Kirimura J. Studies of amino acid composition and chemical structure of silk protein by microbiological determination// Bull. Sericult. Exper. Stat. 1962.- V.17. №.4. P.515-522.

375. Kofatos F.S, Williams C.M. Enzymatic mechanism for the escape of certain moths from their cocoons// Science. 1964. - V. 146. №.3643. P.538-540.

376. Koga K. The silkworm an important laboratory tool Tokyo: - 1978, P. 103.

377. Koide F., Nagayama H., Shimura K. Transaminases in silkworm tissues// J. Agricult. Chem. Soc. Japan. -1955. V.29. №. 12. P.987-990.

378. Koide F., Shimura K. 3-Phosphoglyceric acid dehydrogenase from the silk gland//J. Biochem (Japan). 1962. - V.52. №4. P. 302-303.

379. Koide F., Shishido Т., Nagayama H., Shimura K. On the biosynthesis of glycine by transamination of the silkworm// J. Agricul. Chem. Soc. Japan. -1956. V.30. №.5. P.283-287.

380. Krebs H.A., Bellamy D. The interconversion of glutamic acid and aspartic acid in respiring tissues// Biochem. J. 1960. - V.75. №3. P.523-529.

381. Kucera M., Terner R.B. Purification and properties of protease inhibitors from developing embryos of Hemileuca olivial// Biochim. et Biophys. Acta. 1981.- V.662. №1. P.72-76.

382. Kuk-Meiri S., Lichtenstein N., Shulov A., Pener M.P. Cathepsine-type proteolytic activity in the developing eggs of the African migratory locust (Locucta migratoria)// Сотр. Biochem. Physiol. 1996. - V.l8. №4. P.783-795.

383. Kumar N.K., Ismail S.M., Dutta-Gupta A. Differential uptake of storage proteins by the fat body of rice moth Corcyra cephalonica// Entomol. 1998. -V.23. №2. P.83-90.

384. Kunitz M. Crystalline soybean trypsin inhibitor. General properties// J. Gen. Physiol. 1947. - V.30. №4. P. 291-320.

385. Kuriona A., Jamazaki M., Hirano H. Primary structure and possible functions of trypsine inhibitor of Bombyx mori// Eur. J. Biochem. 1999. - V.259. №12. P. 120-126.

386. Kusnan M.B., Berger M.G., Fock H.P. The involvement of glutamine synthetase / glutamate synthase in ammonia assimilation by Aspergillus nidulans// J.Gen. Microbiol. 1987. - V. 133. №5. P. 1235-1242.

387. Kwon Т.Н., Kim M.S., Choi H.W., Joo C.H, Cho M.Y., Lee B.L. A masquerade-like serine proteinase homologue is necessary for phenoloxidase activity in the coleopteran insect Holotrichia diomphalia// Eur. J. Biochem. -2000. V.267. №20. P. 6188-6196.

388. Laemmly U.K., Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature -1970. -V.227. № 5295. P. 620-685.

389. Lalitha K., Radhakrishnamurty R. Aminotransferases in the larva of the insect Corcyra cephalonica St.// Indian J. Biochem. Biophys. 1975. - V.12. №2. P. 103-106.

390. Lane E.A., Mavrides C. New assay for tyrosine aminotransferase with the amino acid analyzer// Anal. Biochem. 1971. - V.44. №1. P. 106-110.

391. Laskowski M. Jr., Kato I. Protein inhibitors of proteinases// Ann. Rev. Biochem. 1980. - V.49. P. 593-626.

392. Laskowski M., Kato I., Ardelt W., Cook J., Denton A. et. al. Ovomucoid third domains from 100 avian species: isolation, sequences and hypervariability of enzyme-inhibitor contact residues// Biochemistry 1987. - V.26. №1. P. 202221.

393. Laurell C.B., Jeppsson J.O. Protease inhibitors in plasma. In: Plasma proteins (Ed. by Putman F.W.) -1975. V.l. P. 229-264.

394. Lea P.J., Robinson S.A., Stewart G.R. In: The Biochemistry of Plants (eds. Miflin B.J., LeaP.J.). New York: Academic Press, 1990. - P. 121-159.

395. Lemos F.J.A., Terra W.R. Properties and intracellular distribution of a cathepsin D-like proteinase active at the acid region of Musca domestica midgut// Insect Biochem. 1991. - V.21. №5. P.457-465.

396. Liepman A., Olsen U.J. Alanine aminotransferase homologs catalyze the glutamate: glyoxylate aminotransferase reaction in peroxisomes of Arabidopsis. //Plant Physiol. -2003. -V.131. №1. -P. 215-227.

397. Lipinska A., Klyszejno-Stefanowich L. The activity of chromatin-bound protease extracted selectively with histone H2B from calf thymus and rat liver//J. Biochem. 1980. - V.l 1. №3-4. P. 299-303.

398. Lipinska A., Krawozyk Z., Krajewska W., Klyszejno-Stefanowich L., Chorazy M. Activity of chromatin-bound protease in histone fractions from rat liver and Morris hepatoma// Neoplasma. 1980. - V.27. №4. P. 409-413.

399. Liu X.D., McCarton R.C., Nordin J.H. A cysteine protease that processes insect vitellin-purification and partial characterization of the enzyme and the proenzyme//J. Biol. Chem. 1996. - V.271. №52. P. 33344-33351.

400. Liu X., Nordin J.H. Localization of the proenzyme form of vitellin-processing protease in Blattella germanica by affinity-purified antibodies// Arch. Biochem. Physiol. 1998. - V.38. №3. P. 109-118.

401. Llano E., Pendas A.M., Aza-Blank P. Dm 1-MMI?, a matrix metalloproteinase from Drosophila with a potential role in extracellular matrix remodeling during neural development// J. Biol. Chem. 2000. - V.275. №46. P. 3597835985.

402. Locke M., Collins J.V. Protein uptake in multivesicular bodies in the molt-intermolt cycle of an insect// Science. 1967. -V. 158. №3761. P. 467-469.

403. Locke M., Kiss A., Sacc M. The cuticular localization of integument peptides from particular routing categories. // Tissue and Cell. -1994. -V. 26. №5. P. 707-734.

404. Lockshin R.A. Insect embryogenesis macromolecular synthesis during early development// Science. -1966. V.154. №3750. P. 775-776.

405. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent// J. Biol. Chem. 1951. - V. 193. №1. P. 265275.

406. Maitreyi В., Guha S.R. Phenylalanine hydroxylase activity in rat liver// Indian J. Biochem. Biophys. 1972. - V.9. №2. P. 168.

407. Malkin L.I., Greenberg D.M. Purification and properties of threonine or allothreonine aldolase from rat liver// Biochem. et Biophys. Acta. 1964. -V.85. №1. P. 117-131.

408. Mallya S.K., Partin J.S., Valdizan M.C., Lennars W.J. Proteolysis on the major yolk glycoproteins is regulated by acidification of the platelets in sea urchin embryos//J. Cell Biol. 1992. - V.117. №6. P. 1211-1221.

409. Mane S.D., Mehrotra K.N. Alanine aminotransferase: properties and distribution in the desert locust, Schistocerca gregariaII Insect Biochem. -1977. V.7. №5-6. P.419-426.

410. Mane S.D., Mehrotra K.N. Locust alanine aminotransferase has subunit structure. // Experientia -1976. -V.32. № 2. P. 154-155.

411. Markert C.L., Moller F. Multiple forms enzymes: tissues, ontogenetic and species specific patterns// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1959. - V.45. №5. P. 753-763.

412. Martin M., Garcia de la Banda I., Sabater B. L'alanina: 2-cetoglutarato aminotransferasa de embrion de mais con propieda des cineticas complejas para L-alanina// Rev.esp. fisiol. 1976. - V.32. №2. P. 131-136.

413. Martinez-Carrion M., Critz W., Quashnock J. Molecular weight and subunits of serine transhydroxymethylase// Biochemistry. 1972. - V.ll. №9. P. 1613-1615.

414. Masetti M., Cecchettini A., Giorgi F., Estridge В., Bradley J.T. Resolution of polypeptide processing during yolk utilization in embryos of the stick insect Carausius morosus Br.// Amer. Zool. 1992. - V.32. №5. P. 79.

415. Masetti M., Cecchettini A., Giorgi F. Monoclonal and polyclonal antibodies as probes to study vittellin processing in embryos of the stick insect Carausius morosus Br. // Сотр. Biochem. Physiol. PTB. -1998. -V.120. №4. -P. 625631.

416. Massol G. Sur l'acide tartronique et les tartronates de potasse et de soude// Сотр. Rend. Acad. Sci. 1892. - V.l 14. №1. P. 422.

417. Matsuzawa Т., Kobayashi Т., Ogawa H., Kasahara M. Mycroheterogeneity and intrahepatic localization of human and rat liver cytozolic alanine aminotransferase. // Biochim. et Biophys. Acta -1997. -V. 1340 №1. P. 115122.

418. Matsuzawa Т., Segal H.L. Rat liver alanine aminotransferase. Cristallyzation composition and role of sulfhydryl groups. // J. Biol. Chem. 1968. -V.243 №22. P. 5929-5934.

419. Maurizi M.R. Love it or cleave it: Tough choices in protein quality control// Nature struct. Biol. -2002. -V.9. №6. P. 410-412.

420. May R., Model G. Freis amino sauren und proteine in specheldrusensekret und in der hemolymphe der Larren von Callitorga macellaria// Entomol. German. -1975. -Bd.2. Nr.2. S. 126-136.

421. McAllan J.W., Cheftirka W. Properties of transaminases and glutamic dehydrogenase in cockroach Periplaneta americana// Сотр. Biochem. and Physiol.-1961a.-V.3.№1. P. 1-19.

422. McAllan J.W., Chefurka W. Some physiological aspects of glutamate-aspartate transamination in insects// Сотр. Biochem. and Physiol. 1961b. -V.2. №4. P. 290-299.

423. McCarthy J. V., Dixit V.M. Apoptosis induced by Drosophila Reaper and Grim in a human system. Attenuation by inhibitor of apoptosis proteins (cIAPs).// J. Biol. Chem. -1998. -V. 273.№37. -P. 24009-24.015.

424. McEnroe W.D., Forgash A.I. Formate metabolism in the american cockroach Periplaneta americana (L)// Ann. Entomol. Soc. America. 1958. - V.51. №2. P. 126-129.

425. McGee M.M., Greengard O., Knox W.E. The quantitative determination of phenylalanine hydroxylase in rat tissues. Its developmental formation in liver// Biochem. J. 1972. - V.127. №4. P. 669-674.

426. Mehta P.K., Hale T.I., Christen P. Aminotransferases: demonstration of gomology and division into evolutionary subgroups. // Eur. J. Biochem. -1993. -V. 214.№2. P. 549-561.

427. Meister A. Biochemistry of the amino acids. New York. London; Acad. Press, 1965. - V.l. 119c.-1969.-V.2. 113c.

428. Metzler D.E., Ikawa M., Snell E.E. A general mechanism for vitamin B6 -catalyzed reactions//J. Amer. Chem. Soc. 1954. - V.76. №3. P. 648-652.

429. Mishio K., Akira W., Kazuo M. Purification and some properties of cathepsin-like thiol protease from pupal of the blowfly Aldrichia grahami// Сотр. Biochem. Physiol. 1984. - V.B78. №1. P. 279-286.

430. Mordue W., Goldsworthy G.J. Transaminase levels and uric acid production in adult locusts// Insect Biochem. 1973. - V.3. №12. P. 419-427.

431. Mori N., Yamashita O. Purification and characterization of a protease degrading 30 kDa yolk proteins of the silkworm Bombyx moriII Insect Biochem. Molec. Biol. 1997. - V.27. №8-9. P.721-728.

432. Morino Y., Wada H. The differences between the glutamic oxaloacetic apotransaminases of mitochondria and the supernatant fraction of beef liver. In: Chemical and Biological Aspects of Pyridoxal Catalyses (Ed. by Snell E.E.,

433. Fasella P.M., Braunstein A.E., Fanella A.R.) Oxford-London-New York-Paris: Pergamon Press: 1963.-P. 175-184.

434. Motizuki M., Kohno H., Tsurugi K. A study of the identities of the three species of chromatin-assosiated proteinases in a mutant of Saccharomyces cerevisiae which lacks four major vacuolar proteinases// J. Biochem. 1988. -V.l04. №2. P. 192-195.

435. Miiller W. Zur Nahrungsqualitat von Fichtennadeln ffir sorstliche Schadinsecten. 10. Untersuchungen an drei Enzymen des Aminosflurenstoffwechsels der larven von Gilpinia herajnial Htg. //Z. angew. Entomol. 1979. - Bd.87. Nr.2. S.160-170.

436. Muramatsu M., Otomo K., Shimura K. Studies on the biosynthesis of glycine in the silkworm. III. Formation of glycine from C14- glycolic and occurrence of glycolate oxidase//J. Biochem. (Japan). 1966. - V.59. №3. P.304-309.

437. Muramatsu M., Nagayama H., Shimura K. Studies on the biosynthesis of glycine in the silkworm. I. Formation of glycine from serine// J. Biochem. -1961. V.49. №1. P.55-58.

438. Muramatsu M., Shimura K. Studies on the biosynthesis of glycine in the silkworm. II. Conversion of glyoxylic acid to glycine in the intact silkworm// J. Biochem. 1962. - V.52. №2. P.297-301.

439. Nagata M. Protein synthesis in body wall and midgut during the larval moulting cycle of the silkworm, Bombyx mori// J. Sericult. Sci. Japan. 1976. - V.45. №4. P.328-336.

440. Nagayama H., Muramatsu M., Shimura K. Enzymic formation of aminomalonic acid from ketomalonic acid.//Nature. 1958. - V.181. №4606. P.417-418.

441. Naidoo N., Song W., Hunter-Ensor M., Sehgal A. A role for the proteasome in Light Responce of Timeless Clock Protein// Science. 1999. - V.285. №5434. P. 1737-1741.

442. Nakada H.I., Weinhouse S. Non-enzymatic transamination with glyoxylic acid and various amino acids// J. Biol. Chem. 1953. - V.204. №2. P.831-836.

443. Narumi H., Hishida Т., Sasaki Т., Feng D-Fei, Doolitle R.F. Molecular cloningjb», of silkworm (Bombyx mori) antichymotrypsin. A new member of the serpinesuperfamily of proteins from insect// Eur. J. Biochem. 1993. - V.214. №1.• P.181-187.

444. Neurath H. Proteolytic processing and physiological regulation// Trends Biochem. Sci. -1989. V.14. №7. P.268-271.

445. Nirmala X., Kodric D., Zurovec M., Sehnal F. Insect silk contains both a Kynitz-type and a unique Kasal-type proteinase inhibitor// Eur. J. Biochem. — 2001. V.268. №7. P.2064-2073.

446. Nishida H. Evolution of amino acid biosynthesis and enzymes with broad substrate specificity. //Bioinformatics. -2001. -V.17 № 12. P. 1224-1225.

447. Ф 477. Nishimura J.S., Manning J.M., Meister A. Studies on the mechanism of activation of aspartic acid p-decarboxylase by a-keto acids and pyridoxal-5'-phosphate// Biochemistry. 1962. - V.l. №3. P.442-447.

448. NisonofF A., Barnes W. F. Jr. Mechanisms in enzymatic transamination. Kinetic studies of the glutamate-asparate reaction// J. Biol. Chem. 1952.1. Л V.l99. №2. P.713-728.

449. Nittono Y., Takeshita H. Tyrosinase in the eggs of the silkworm, Bombyx mori L//J. Sericult. Sci. Japan. 1954. - V.23. №1. P.44-48.

450. Noguchi A., Taheshita H., Shigematsu H. Interrelationship between the silk gland and other tissues in protein metabolism in the latest larval stage of silkworm, Bombyx mori// J. Insect Physiol. 1974. - V.20. №5. P.783-794.

451. Noguchi A., Takado Y., Kido R. Glutamate-glyoxylate aminotransferase in rat liver cytosol. Purification, properties and identity with alanine-2-oxoglutarate aminotransferase// Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1977. -V.358. №12. P. 1533-1542.

452. Noguchi Т., Okuno E., Takada Y., Minatogawa Y., Okai. K., Kido R.• Characteristic of hepatic alanine-glyoxylate aminotransferase in different mammalian species. // Biochem. J. -1978. -V. 169 №1. P. 113-122.

453. Nordin J.H., Beaudoin E.L., Liu X. Acidification of yolk granules in Blattella germanica eggs coincident with proteolytic processing of vitellin// Arch. Insect Biochem. Physiol. 1991. - V.18. №3. P.177-192.

454. Novillo C., Castanera P., Ortego F. Characterization and distribution of chymotrypsin-like and other digestive proteases in Colorado potato beetle// Arch. Insect Biochem. Physiol. 1997. -Y.36. №3. P.181-201.

455. Ohshita Т., Kido H. Simple preparation of rat brain lysosomes and their proteolytic properties//Anal. Biochem. 1995. - V.230. №1. P.41-47.

456. Orlicky J., Ruscak M., Ruscakova D. Subcellular distribution and some properties of alanine aminotransferase in rat kidney cortex. // Biologia (CSSR) -1977. -V. 32 №9. P. 647-656.

457. Ornstein C. Dick electrophoresis. I. Background and theory// Ann. N-Y. Acad. Sci. 1964.-V.121. №2. P.321-349.

458. Osanai M., Okudaira M. Synthesis of glycine and L-serine by their interconversion in posterior silk gland of the silkworm, Bombyx mori// Amino Acids. 2001. - V.20. №1. P. 113-121.

459. Osanai M., Okudaira M., Naito J., Demura M., Asakura T. Biosynthesis of L-alanine, a major amino acid of fibroin in Samia cynthia ricini// Insect Biochem. Molec. Biol. 2000. - V.30. P.225-232.

460. Osanai M., Rembold H. Cofactor specifity of L-erytrotetrahydrobiopterin for rat liver phenylalanine-4-hydroxylase// Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. -1971. -Bd.352. Nr. 10. S.1359-1362.

461. Owen T.G., Hochachka P.W. Purification and properties of dolphin muscle aspartate and alanine transaminases and their possible role in the energy metabolism of diving mammals// Biochem. J. 1974. - V.143. №3. P.541-553.

462. Palekar A.G., Tate S.S., Meister A. Rat liver aminomalonate decarboxylase. Identity with hydroxymethylase and allothreonine aldolase// J. Biol. Chem. -1973. V.248. №4. P. 1158-1167.

463. Pant R., Kumar S. Significance of some enzymes and metabolites during ageing of the dipteran flesh fly Sarcophaga ruficornis// Curr. Sci. 1980. -V.49. №1. P. 10-13.

464. Papayannpoulos I.A., Biemann K. Amino acid sequence of a protease inhibitor isolated from Sarcophaga bullata determined by mass spectrometry// Protein Sci. 1992. - V.l. №2. P.278-288.

465. Parker R. A comparison of hemolymph proteins in two species of Leptinotarsa beetles//J. Insect Physiol. -1971. V.17. №9. P.1689-1698.

466. Patel N.C. Protein synthesis during insect development// Insect Biochem. -1971.-V.l. № 4 . P.391-427.

467. Patel N.C., Schneiderman H.A. The effects of perfusion on the synthesis and release of blood proteins by diapausing pupae of cecropia silkworm// J. Insect Physiol. 1969. - V.l5. №4. P.643-661.

468. Pearson D.J., Imbuga M.O., Hoak J.B. Enzyme activities in flight and leg, muscle of the dung beetle in relation to proline metabolism// Insect Biochem. 1979. - V.9. № 5. P.461-466.

469. Pietruschka F., Bier K. Autoradiographische untersuchunden zur RNS- and protein-synthese in der fruhen embryogenese von Musca domestical/ W. Roux's Arch. Entwicklungsmech. Org. 1972. -Bd. 169. Nr.l. S.56-59.

470. Plotnick M.I., Mayne L., Schechter N.M., Rubin H. Distortion of the active-site of the chymotrypsin complexed with a serpin// Biochemisrtry. 1996. -V.35. №23. P.7586-7590.

471. Polanowski A., Blum M.S., Whitman D.W., Travis Y. Proteinase Inhibitors in the Nonvenomous Defensive Secretion of Grasshoppers-Antiproteolytic Range and Possible Significance// Сотр. Biochim. Physiol. 1997. - V.l 17. №4. P. 525-529.

472. Polanowski A., Wilusz T. Serine proteinase inhibitors from insect hemolymph//Acta. Biochem. Polon. 1996. - V.43. №3. P.445-454.

473. Polanowski A., Wilusz Т., Blum M.S., Escoubas P., Schmidt J.O., Travis J. Serine proteinase inhibitors in the hemolymph of a wide range of insect species// Сотр. Biochem. Physiol. 1992. - V.102B. №4. P.757-760.

474. Potempa J., Korzus E., Travis J. The serpin superfamily proteinase inhibitors: structure, function and regulation// J. Biol. Chem. 1994. - V.269. №23. P. 15957-15690.

475. Prasad S.V., Kanost M.R., Wells M.A. Primary sequence of a serine proteinase inhibitors from hemolymph of Manduca sexta// Proc. 18th Intern. Congr. Entomol. Vancouver, 1988.-P. 142.

476. Price G.M. Some aspects of amino acid metabolism in the adult housefly, Musca domestical Biochem. J. -1961. V.80. №2. P.420-428.

477. Price G.M., Bosnian T. The electrophoretic separation of proteins isolated from the larval of blowfly Calliphora erythrocephala// J. Insect Physiol. -1966. V.l2. №7. P.741-745.

478. Ramachandran M., Ram K., Subrahmanyam D. Transamination in Culex pipiens fatigans// Indian J. Biochem. 1968. - V.5. №4. P.189-190.

479. Ramesh N., Sugumaran M., Mole J.E. Purification and characterization of two trypsin inhibitors from the hemolymph of Manduca sexta larval// J. Biol. Chem. 1988. - V.263. №23. P. 11523-11527.

480. Ramponi G., Nassi P., Liguri G., Cappugi G., Grisolia S. Purification and properties of a histone-specific protease from rat liver chromatin// FEBS Letts.- 1978. V.90. №1. P.228-232.

481. Rech J., Crouzet J. Partial purification and initial studies of the tomato L-alanine: 2-oxoglutarate aminotransferase// Biochim. et Biophys. Acta. 1974.- V.350. №2. P.392-399.

482. Reichsteiner M.C. Drosophila lactate dehydrogenase and L-glycerophosphate dehydrogenase; distribution and change in activity during development// J. Insect Physiol. 1970. - V.l 6. №6. P. 1179-1192.

483. Reitman S., Frankel S. A colorimetric method for the determination of serum glutamic oxalacetic and glutamic pyruvic transaminases// Ann. J. Clin. Path. -1957. V.28. №1. P.56-63.

484. Rembrich S.M., Britz A. Protein synthesis of the fat body of adult Tenebrio molitor// J. Insect Physiol. 1970. - V.l6. №4. P.643-651.

485. Retnakaran A., Beck S.D. Aspartate aminotransferase in the pea aphid, Acypthosiphon pisum (Harris)// Сотр. Biochem. Physiol. 1968. - V.26. №3. P. 1061-1069.

486. Ribolla P.E.M., Debianchi A.G. Processing of procathepsin from Musca domestica eggs// Insect Biochem. Molec. Biol. 1995. - V.25. № 9. P.1011-1017.

487. Richards E.H., Edwards J.P. Proteins syntesized and secreted by larval of the ectoparasitic wasp Eulophus pennicornis. // Arch. Insect Biochem. and Physiol. -2001. -V.46. №3. P. 140-151.

488. Rinaldi A.M., Parente A. Rate of protein synthesis in oocytes of Paracentrotus lividus// Devel. Biol. 1976. - V.49. № 1. P.260-267.

489. Roberts P.E., Willis J.H. The cuticular proteins of Tenebrio molitor. I. Electrophoretic banding patterns during postembryonic development// Devel. Biol. 1980. - V.75. № 1. P.59-69.

490. Rowash A., Gaabound J.A., Mostofa S.M. Effects of sublethal treatments with the insect growth regulator, altozar, ZR-512, on blood constituents of

491. Bombyx mori L. in relation to silk yield// J. Agr. Sci. 1977. - V.89. № 1. P. 157-160.

492. Rowsell E.V., Camie J.A., Snell K., Taktak B. Assays for glyoxylate aminotransferase activities//Int. J. Biochem. 1972. - V.3. № 15. P.247-257.

493. Rowsell E.V., Carnie J.A., Snell K. An assay for L-alanine-glyoxylate aminotransferase// Biochem. J. 1969. - V.l 12. № 1. P. 139.

494. Roy L.K. Studies on the mechanism of formaldehyde incorporation into serine// J. Biol. Chem. 1957. - V.227. № 2. P.805-814.

495. Rubenstein E.C., Han J.Y. Yolk protein degradation during embryonic development in Hyalophora cecropia// Amer. Zool. 1992. - V.32. № 5. P.405.

496. Rutledge B.J., Zhang 1С, Bier E., Jan Y.N., Perrimon N. The Drosophila spitz gene encodes a putative EGF-like growth factor involved in dorsal-ventral axis formation and neurogenesis// Genes Dev. 1992. - V.6. №8. P. 1503-1517.

497. Saier M.H. Jr., Jenkins W.T. Alanine aminotransferase. I. Purification and properties// J. Biol. Chem. 1967. - V.242. № i. p.91-100.

498. Samuel R.J., Reynolds S.E. Proteinase inhibitors from the molting fluid of the pharate adult tobacco hornworm M.S.// Arch. Insect Biochem. Physiol. -2000. V.43. №1. P.33-43.

499. Sasaki T. Chymotrypsin inhibitors from hemolymph of the silkworm, Bombyx mori// J. Biochem. 1978. - V.84. № 2. P.267-276.

500. Sasaki T. Amino acid sequence of a novel Kunitz-type chymotrypsin inhibitor from hemolymph of the silkworm larval// FEBS Lett. -1984. V.l68. №2. P.227-230.

501. Sasaki T. Patchwork-structure serpins from silkworm (Bombyx mori) larval hemolymph// Eur. J. Biochem. 1991. - V.202. № 2. P.255-261.

502. Sasaki Т., Kobayashi K. Isolation of two novel proteinase inhibitors from hemolymph of silkworm, Bombyx mori. Comparison with human serum proteinase inhibitors// J. Biochem. -1984. V.95. № 4. P.1009-1017.

503. Sasaki Т., Kobayashi К., Ozeki Т. Interaction of silkworm larval hemolymph antitrypsin and bovine trypsin// J. Biochem. 1987. - V.l02. № 2. P.433-441.

504. Sasaki S.H., Watanabe Т., Kondo Y. Studies on the free amino acids and related compounds in the silkworm Bombyx mori. I. On the amino acids and related compounds in silkworm eggs// J. Sericult. Sci. Japan. 1957. - V.26. №4. P.291-297.

505. Schirch L., Gross T. Serine transhydroxymethylase. Identification as the threonine and allothreonine aldolase// J. Biol. Chem. 1968. - V.243. №21. P.5651-5655.

506. Schreiber G., Eckstein N., Maas G., Holser H. Die physikalisch-chemischen Eingenschaften von Apoaspartataminotransferase aus Bierhefe// Biochem. Z. -1964. -Bd.340. Nr. 1. S.21-34.

507. Sedee D.I.W., Albers J.G., van Stratum P.G.C. A comparison between the intermediary amino acid metabolism of the rat, the cat and the blowfly larval (Calliphora erythrocephala, Meig)// Arch. Internat. Physiol. Biochim-1959. -V.67. №3. P.384-395.

508. Shiba H., Uchida D., Kobayashi H., Natori M. Involvment of cathepsin B- and L-like proteinases in silk gland hystolysis during metamorphosis of Bombyx mori//Arch. Biochem. Physiol. -2001. -V.390. №1. P.28-34.

509. Shigematsu H. Synthesis of blood protein by the fat body in the silkworm, Bombyx mori//Nature. -1958. V.182. P.880-882.

510. Shigematsu H., Miura Y., Ito H. Autoradiographic studies on the relation between the biosynthesis of ribonucleic acid (RNA) and of protein in the silk-forming glands of Bombyx mori// Compt. rend. biol. 1960. - V.154. P.892-895.

511. Shigematsu H., Takeshita H. Formation of silk proteins by the silkworm, Bombyx mori, after gamma-ray irradiation in the embryonic stage// J. Insect Physiol. 1968. -V. 14. №7. P.1013-1024.

512. Shimura К., Fukai M., Suto S., Hoshi R. Studies on the biosynthesis of silkfibroin. I. Incorparation of glycine 1-C14 into fibroin in vivo// J. Biochem. (Japan). 1958. - V.45. № 7. P.481-488.

513. Shimura K., Nagayama H., Kukuchi A. Aminomalonic acid decarboxylase: a new enzyme//Nature. -1956. V.l77. №4516. P.935-936.

514. Shrago E., Lardy H.A. Paths of carbon in gluconeogenesis and lipogenesis// J. Biol. Chem. -1966. V.241. № 3. P.663-668.

515. Shumaker T.T.S., Cristofoletti P.T., Terra W.R. Properties and compartmentalization of digestive carbohydrases and proteases in Scaptotrigona bipunetata (Apidae: Meliponinal) larval//Apidologie. 1993. -V.24. № 1. P.3-17.

516. Silverstein E., Geller H. Studies on the nature of non-specific staining in nitroblue tetrasolium detection of dehydrogenases in polyacrilamide gel electrophoresis ("nothing dehydrogenese")// J. chromatography. 1974. -V.101. № 2. P.327-337.

517. Sinohara H. Glicopeptides isolated from sericin of the silkworm, Bombyx mori// Compar. Biochem. Physiol. 1979. - V.B63. №1. P.87-91.

518. Somer H. "Nothing dehydrogenese" reactiones an artefact in serum isoenzyme analyses// Clinica chimica acta. 1975. - V.60. №2. P.223-229.

519. Song Z., McCall K., Steller H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development//Science. 1997. - V.275. №24. P.536-540.

520. Sridhara S., Ananthasamy T.S. Blood proteins of the silkworm Bombyx mori L.// Proc. Indian. Acad. Sci. 1963. - V.8. №58. P. 19-27.

521. Srivastava R.P. The amino acid composition of cuticular proteins of different developmental stages of Galleria melonella// J. Insect Physiol. 1971. - V.l7. №1. P.189-196.

522. Stafford H.A. Dehydrogenase activity of hydromalonate and related acids in higher plants// Plant Physiol. -1956. V.31. №2. P.135-141.

523. Stamm Menender M.D., Comenge M., Ruiz A.S. Metabolism of Bombyx mori. VI. Metabolism of phenylalanine in Bombyx moriII Rev. Espan. Fisiol. -1950.-V.6. P.181-187.

524. Stepanov V.M., Rudenskaya G.N. Proteinase affinity chromatography on bacitracin-sepharose//J. Appl. Biochem. 1983. - V.5. №2. P.420-428.

525. Stevenson E., Wyatt C.K. The metabolism of silkworm tissues. I. Incorporation of leucine into protein// Arch. Biochem. Physiol. -1962. V.99. №1. P.65-71.

526. Storey K.B., Bailey E. Intracellular distribution of enzymes associated with lipogenesis and gluconeogenesis in fat body of the adult cockroach , Periplaneta// Insect Biochem. 1978. - V.8. № 2. P. 125-131.

527. Sugimoto E., Kitagawa Y., Nakanishi K., Chiba H. Purification and properties of beef liver D-glycerate dehydrogenase// J. Biochem (Japan). 1972. - V.72. №6. P.1307-1315.

528. Sugumaran M. Molecular mechanism for mammalian melanogenesis. Comparison with insect cuticular sclerotization// FEBS Lett. 1991. - V.293. № 1-2. P.4-10.

529. Sugumaran M., Saul S.J., Ramesh N. Engogenous protease inhibitors prevent undesired activation of prophenolase in insect hemolymph// Biochem. and Biophys. Res. Commun. -1985. V.132. №3. P.l 124-1129.

530. Suzuki Т., Natori S. Purification and characterization of an inhibitor of the cystein protease from the hemolymph of Sarcophaga peregrina larvae// J. Biol. Chem. 1985. - V.260. № 8. P.5115-5120.

531. Suzuki Т., Natori S. Changes in the amount of sarcostatin A, a new cystein protease inhibitor, during the development of adult Sarcophaga peregrina// Insect Biochem. 1986. - V.16. №4. P.589-595.

532. Swick R.W., Barnstein P.L., Stange J.L. The metabolism of mitochondrial proteins. I. Distribution and characterization of the izoenzymes of alanineaminotransferase in rat liver// J. Biol. Chem. 1965. - V.240. № 8. P.3334-3340.

533. Szebenyi D.M., Liu X., Kriksunov I.A., Stover P.J., Thiel D.J. Structure of murine cytoplasmic serine hydroxymethyltranferase guinoid ternary complex: Evidence for asymmetric obligate dimers.// Biochemistry. -2000. -V. 39 №44. P. 313-323.

534. Takagi H., Narumi H., Nakamura K., Sasaki T. Amino-acid sequence of silkworm (Bombyx mori) hemolymph antitrypsin deduced from its cDNA nucleotide sequence-conformation of it homology with serpins// J. Biochem. -1990. -V.l 08. № 3. P.372-378.

535. Takahashi R., Deveraux S.Y., Tamm I., Welsh K., Assa-Munt N., Salvesen G.S., Reed J.C.J. A single BIR Domain of XIAP sufficient for inhibiting caspases// J. Biol. Chem. 1998. - V.273. № 14. P.7787-7795.

536. Takahashi S.Y., Yamamoto Y. Activation of cysteine proteinase of the silkworm Bombyx mori//Zool. Sci. 1993. -V. 10. № 6. P. 14.

537. Takahashi S.Y., Yamamoto Y., Kageyama Т., Zhao X. Acid cysteine proteinase from the eggs of silkworm Bombyx mori// Zool. Sci. 1991. - V.8. №6. P.1139.

538. Takahashi S.Y., Yamamoto Y., Watabe S., Kageyama T. Autolutic activation mechanism of Bombyx acid cysteine proteinase (BCP)// Biochem. Mol. Biol. Int. 1997. - V.42. № 3. P.591-600.

539. Takahashi S.Y., Yamamoto Y., Zhao X. F., Watabe S. Bombyx acid cysteine proteinase// Invertebr. Reprod. Dev. 1996. - V.30. № 1-3. P.265-281.

540. Takeyama S., Ito H., Miura Y. Fibroin synthesis and ribonucleic acid metabolism in the silk gland// Biochim. et Biophys. Acta. 1958. - V.30. №2. P.233-243.

541. Tanase S., Kojama H., Morino V. Pyridoxal 5-phosphate binding site of pig heart alanine aminotransferase// Biochemistry. 1979. - V.l8. №14. P.3002-3007.

542. Terra W.R., Bianchi A.G. Chemical composition of the cocoon of the fly, Rhynchosciara americana// Insect Biochem. 1974. - V.4. №2. P.173-183.

543. Tewarson N.C., Jany K.D. Determination of proteolytic activity in Varroa jacobsoni an ectoparasitic hemophagous mite of honeybeers. // Apidologie. -1982.-V. 13 №4. P. 383-389.

544. Thanassi J.W., Fruton J.S. Aminomalonic decarboxylase // Biochemistry. -1962. V.6. №1. P.975-982.

545. Tobe S.S., Loughton B.G. An autoradiographic study of haemolymph protein uptake by the tissues of the fifth instar Locusta// J. Insect Physiol. 1969. -V.15. №8. P. 1331-1346.

546. Tobe S.S., Loughton B.G. Haemolymph protein metabolism during the fifth instar of Locusta// Can. J. Zool. 1970. - V.48. №2. P.297-304.

547. Tonhazy E.W., White R.Y., Umbreit LP. A rapid method for the estimation pf the glutamic-asparate transaminase in tissues// Arch. Biochem. 1950. - V.28. №1. P.36-41.

548. Tourian A. Activation of phenylalanine hydroxylase by phenylalanine// Biochim. et Biophys. Acta. 1971. - V.242. №2. P.345-354.

549. Travis J., Salvesen G.S. Human plasma proteinase inhibitors// Annu. rev. Biochem. 1983. - V.52. №3. P.655-709.

550. Tsurugi K., Ogata K. Presence of thyol protease in regenerativy rat liver nuclei// Eur. J. Biochem. 1980. - V.109. №1. P.9-15.

551. Tsurugi K., Ogata K. Studies on the serine proteases associated with rat liver chromatin// J. Biochem. 1982. - V.92. №5. P.1369-1381.

552. Turunen S. Electrofocusing and electrophoresis of proteins present in fat body of Diatraca grandiosella (Lepidoptera: Pyralidae)// Ann. Zool. fenn. 1979. -V.l6. №4. P.295-301.

553. Uhlenbruck G., Narduck D., Sinohara H. Occurrence of the peanut lectin receptor in sericin of the silkworm, Bombyx mori, and A-like receptors in insect//Naturwissenschaften. 1980. -Bd.67. Nr.3. S. 146-147.

554. Umemusa J., Yanagiya K., Kamatsubara S., Sato Т., Tosa T. Purification and some properties of alanine aminotransferase from Candida maltosa. // Biosci., Biotechnol. and Biochem. -1994. -V.58. №2. -P. 283-287.

555. Urban S., Lee J.R., Freeman M. Drosophila Rhomboid-1 defines a Family of Putative Intramembrane Serine Protease// Cell. 2001. - V.l07. №2. P. 173182.

556. Vasilev A.V., Gutkin D.V., Dankova T.G., Vorobeichik T.A., Tutelyan V.A. Content of endogeneous inhibitors of thiol-dependent proteinases in subcellular fractions of rat hepatocytes// Voprosy meditsinskoi khimii. -1991. V.37. №6. P.89-91.

557. Veerabasappa G.T., Ramaian T.R. Studies on aminotransferases in the developing ovary of the silkworm Bombyx mori L.// Indian J. Biochem. Biophys. 1975. - V.12. №2. P. 100-102.

558. Vijayalakashmi S., Kumar T.P., Babu S.K. Rhythmicity of aminotransferase in the cockroach, Periplaneta americana// Experientia. 1978. - V.34. №2. P.192-193.

559. Vismanathan S., Dignam S.S., Dignam J.D. Control of the levels of alanyl-, glycyl-, and seryl-tRN synthetases in the silkgland of Bombyx mori// Dev. Biol. 1988. - V.l 29. №2. P.350-357.

560. Vucic D., Kaiser W.J., Harvey A.J., Miller L.K. Inhibition of reaper induced and FADD unducer apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (APS)// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997. - V.94. №19. P. 183-188.

561. Vucic D., Kaiser W.J., Miller L.K. Inhibitor of Apoptosis Proteins Physically Interact with and Block Apoptosis Induced by Drosophila Proteins HID and GRIM//Mol. Cell Biol. 1998. - V.l8. №6. P.3300-3309.

562. Wakayama Т., Iseki Sh. Expression and Localisation of urinary trypsin inhibitor in the rat embryo// Acta Histochem. Cytochem. 1997. - V.30. №56. P.557-565.

563. Wang Z., Haunerland N.H. Storage proteine uptake in Helicoverpa zea: arylphorin and VHDL share a single receptor. // Arch Insect. Biochem. Physiol. -1994. -V.26 №1. -P. 15-26.

564. Ward C.W. Resolution of Protease in the Keratinolytic Larval of the Webbing Clothes Moth//Aust. J. Biol. Sci. 1975. - V.28. №1. P.l-23.

565. Watanabe M., Asada N., Tomino S. Protease activities during post-embryonic development of Drosophila melanogaster. // Zool. Sci. -1998. -V.15. Suppl. P.48.

566. Watson D.K., Moudrianakis E.N. Histone-dependent reconstitution and nucleosomal localization of nonhistone chromosomal protein: the H2A-specific protease// Biochemistry. 1982. - V.21. №2. P.248-256.

567. Wedde M., Velcin-Scas A., Kopacek P., GOtz P. Detection and characterization of an inducible metallo-protease inhibitor in Galleria melonella// Proc. 20th Int. Cong. Entomol., Firenze , Aug. 25-31, 1996: Firenze. 1996. - P.281.

568. Wedde M., Weise Ch., Kopacek P., Franke P., Vilcinskar A. Purification and characterization of an inducible metallo-protease inhibitor from the hemolymph of greater wax moth larvae, Galleria mellonella// Eur. J. Biochem. 1998. - V.255. №3. P.535-543.

569. Wei A.Z., Rubin H., Cooperman B.S., Christianson D.W. Crystall structure of an uncleaved serpin revealed the conformation of an inhibitory reactive loop// Natur. Structur. Biol. -1994. V.l. №4. P.251-258.

570. Willis J.E., Sallach H.J. The occurence of D-3-phosphoglycerate dehydrogenase an animal tissues// Biochim. et Biophys. Acta. 1964. - V.81. №1. P.39-54.

571. Wilson E.M. Crystalline L-aspartate-4-carboxy-lyase// Biochim. et Biophys. Acta. 1963. - V.67. №2. P.345-348.

572. Wittwer D., Wiesner A. Insect Cell Ctimulation by LPS Requires the Activity of Cell-Released proteases// Arch. Insect Biochem. Physiol. 1998. - V.39. №1. P.91-97.

573. Wittwer D., Wiese C., G6tz P., Wiesner A. LPC (lipopolysaccharide) -activated immune responses in a hemocyte cell line from Estigmene acraea (Lepidoptera). / Dev. Сотр. Immunoe. -1997. -V.21 P. 323-335.

574. Wojon C.C. TIMe to be degraded// Trends Cell Biol. 2000. - V.10. №2. P.53.

575. Wyatt G.R. The biochemistry of insect hemolymph// Ann. Rev. Entomol. -1961.-V.6. P.75-102.

576. Wyatt G.R., Lougheed T.C., Wyatt S.S, The chemistry insect hemolymph. Organic components of the haemolymph of silkworm Bombyx mori and two other species//J. Gen. Physiol. 1956. - V.39. №6. P.853-868.

577. Yaginuma Т., Ushizima M. Proteolytic activity in the fat body during the pupal-adult metamorphosis of the silkworm, Bombyx mori// J. Exp. Zool. -1991. V.259. №2. P.145-153.

578. Yamafuji K., Akita T. Transoximation. // Nature. 1951. - V.l67. №4254. P.770.

579. Yamafuji K., Omura H. The oximase. // Enzymologia. 1952. - V.15. P.296-302.

580. Yamahora Y., Uto N., Tamotsu S., Yamamoto Y., Takahashi S.Y. Localization of Bombyx cysteine proteinase (BCP) and yolk proteins in developing egg:

581. Abstr. 69th Anna Meet Zool. Soc. Jap. Hiroshima, Sept. 26-28, 1998// Zool. Sci. 1998. -№15., Suppl. P.45.

582. Yamamoto Y., Eguchi M. Purification and characterization of chicken serum protein inhibitors against fungal protease// Сотр. Biochem. Physiol. 1990. -V.95B. №2. P.347-353.

583. Yamamoto Y., Suzuki A.C., Takahashi S.Y. An acid cysteine proteinase of the silkworm, Bombyx mori: site of synthesis and primary structure// Zool. Sci.1993.-V. 10. №6. P. 14.

584. Yamamoto Y., Takahashi S.Y., Kageyama Т., Zhao X. Acid cysteine proteinase from the eggs silkworm Bombyx mori: effect of vitellin phosphorylation on the susceptivity to the enzyme: Abstr. 19th Internat. Congr. Entomol. Beijing. 1992. - P. 114.

585. Yamamoto Y., Takimoto K., Izumi S., Tariyama-Sakurai M., Kageyama Т., Takahashi S. Molecular cloning and sequencing of cDNA that encodes cysteine proteinase in the eggs of the silkmoth Bombyx mori// J. Biochem.1994. V.l 16. №6. P.1330-1335.

586. Yamamoto Y., Watabe S., Kageyama Т., Takahashi S.Y. A novel inhibitor protein for Bombyx cysteine proteinase is homologue to propeptide regions of cysteine proteinases// FEBS Lett. 1999. - V.448. №2-3. P.257-260.

587. Yamamoto Y., Watabe S., Kageyama Т., Takahashi S.Y. Purification and characterization of Bombyx cysteine proteinase inhibitors from the hemolymph of Bombyx mori// Arch. Biochem. Physiol. 1999. - V.42. №2. P. 119-129.

588. Yamamoto Y., Watabe S., Kageyama Т., Takahashi S.Y. Proregion of Bombyx mori cysteine proteinase functions as a intramolecular chaperone to promoter proper folding of the mature enzyme// Arch. Insect Biochem. Physiol. 1999. - V.42. №3. P.167-178.

589. Yamamoto Y., Yamahara Y., Katou K., Watabe S., Takahashi S.Y. Bombyx cysteine proteinase (BCP): hormonal regulation of biosynthesis and accumulation in the ovary// J. Insect Physiol. 2000. - V.46. №5. P.783-791.

590. Yamomoto Y., Zhao X., Suzuki A.C., Takahashi S.Y. Cysteine proteinase from the eggs of silkmoth, Bombyx mori: site synthesis and a suggested role in the yolk protein// J. Insect Physiol. 1994. - V.40. №5. P.447-484.

591. Yamashita M., Eguchi M. Comparison of six genetically defined inhibitors from the silkworm hemolymph against fungal protease// Сотр. Biochem. Physiol. 1987. - V.86B. №1. P.201-208.

592. Yamazaki H.I. Activation of laccase-type prophenoloxidase in the cuticle of insect. VI. Properties of the pro-laccase constituting peptides// Zool. Sci. -1989. -V.6. №6. P. 1125.

593. Yamazaki X., Ogawa k., Kanekatsu R. N-terminal amino acid sequence of . cocoonase in the silkworm Bombyx mori// J. Sericult. Sci. Japan 1995. -V.64. №5. P.467-468.

594. Yang Y., Davis D.M. A mosquito-chymotrypsin inhibitor in tissues of adult Aedes aegypty// Сотр. Biochem. Physiol. 1972. - V.43B. №1. P.137-141.

595. Zhao X., Kageyama Т., Yamamoto Y., Takahashi S.Y. Acid cysteine proteinase from the eggs of silkworm, Bombyx mori. Purification, tissues distribution and synthesis//Zool. Sci. -1991. V.8. №6. P.l 139.

596. Zhao X., Wang J.X., Wang J.C. Purification and characterization of a cysteine proteinase from the eggs of the cotton Boll Worm, Helicoverpa armigera// Insect Biochem. Molec. Biol. 1998. - V.28. №4. P.259-264.

597. Zhao X., Wang J.X., Yagi N., Yamamoto Y., Watabe S., Takahashi S.Y. Occurence of a cathepsin B-like acid cysteine proteinase in the eggs of silkworm moth, Antheraea pernyi// Сотр. Biochem. Physiol. 1996. -V.113B. №1. P.95-103.

598. Zhivotovsky В., Nicotera P., Orrenius S. Mechanisms of the multistage cleavage of chromatin of apoptosis// Cell Proliferat. 1995. - V.28. №4. P. 172.

599. Zhu X., Lin R., Wang J. Исследование иммобилизации пектатлиазы с фиброином шелка// J. Zhejiang Agr. Univ. 1998. - V.24. №1. Р.74-78.(цит. по РЖ. энтомология - 1999. -№1. 04U3-513)

600. Zhu X., Xu. J. Изучение иммобилизации сахарогенной амилазы на фиброине шелка// Acta Sericol. Sin. 1999. - V.25. №2. Р.113-119.(цит. по РЖ. энтомология-2001. - №7. 04U3-492)

601. Zhu J., Indrasith L.S., Yamashita О. Characterization of vitellin, egg-specific protein and 30 kDa protein from Bombyx mori eggs, and their fates during oogenesis and embryogenesis// Biochim. et Biophys. Acta. 1986. - V.882. №3. P.427-436.

602. Zurovec M., Yang C., Kodrik D., Sehnal F. Identification of a novel type of silk protein and regulation of its expression// J. Biol. Chem. 1998. - V.273. №25. P. 15423-15428.