Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Фармако-токсикологическая оценка препарата гепавитол

ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Фармако-токсикологическая оценка препарата гепавитол"

На правах рукописи

СТАРИКОВА ЕЛЕНА АЛЕКСЕЕВНА

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПРЕПАРАТА ГЕПАВИТОЛ

06.02.03 — ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1 г дек гт

Краснодар-2013

005543561

005543561

Работа выполнена в лаборатории фармакологии Государственного научного учреждения Краснодарский научно-исследовательский ветеринарный институт Россельхозакадемии -

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук Кузьмииова Елена Васильевна

доктор ветеринарных наук, главный ветеринарный врач ППЗ «Братковский бройлер» Богосьян Адам Аведисович

кандидат ветеринарных наук, консультант отдела оперативного реагирования при возникновении заразных и иных болезней животных Государственного управления ветеринарии Краснодарского края

Соловьев Валерий Сергеевич

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Донской государственный

аграрный университет»

Защита состоится «20» декабря 2013 г. в 12°° часов на заседании диссертационного совета Д 220.038.07 при ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13.

Автореферат размещен на официальном сайте ФГБОУ ВПО «Кубанский ГАУ» http://wvvw.kubsau.ru «18» ноября 2013 г. и официальном сайте ВАК РФ - http://vak.ed.gov.ru.

Автореферат разослан «18» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор ветеринарных наук

И.А. Родин

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Заболевания печени у мелких домашних животных являются одними из наиболее распространенных патологий (Уша Б.В., 1979; Кузнецов Н.И., Кудинова H.A., 2007; Карпенко Л.Ю., 1998).

Печень - полифункциональный орган, играющий основную роль в метаболизме, секреции, детоксикации и экскреции различных веществ. Поражение ее ткани ведет к снижению барьерной функции, нарушению в белковом, углеводном, жировом, пигментном, гормональном и витаминном обменах.

Ассортимент лекарств, применяемых в комплексной терапии заболеваний гепатобилиарной системы, достаточно обширен. При этом выделяют сравнительно небольшую группу препаратов - гепатопротекторов, которые оказывают избирательное действие на печень. Их влияние направлено на повышение устойчивости органа к действию патогенных факторов, нормализацию функциональной активности и стимуляцию репаративно-регенерационных процессов в печени (Никитин И.Г., 2007; Оковитый C.B., 2006; Антонов В.А., Трошин А.Н., 2010).

Поскольку, при всех заболеваниях печени повреждаются мембранные структуры, обоснованным является применение веществ, оказывающих восстанавливающее действие на клеточные элементы гепатоцитов и тормозящих деструкцию клеток. Такой направленностью действия обладают фосфоли-пидные препараты (Сергеева С.А., 2001; Малявина В.В., 2007; Кунц Э., 1994; Ипатова О.М., 2005).

Защитное действие многих гепатопротекторов основывается на ин-гибировании процессов перекисного окисления липидов, которые рассматриваются как один из ведущих патогенетических механизмов развития поражений печени. Поэтому, использование антиоксидантов, таких, как бета-каротин и селен, является целесообразным (Кузьминова Е.В., Семененко М.П., 2007; Родионова Т.Н., 2010; Кудинова С.П., Казарян Р.В., 1988; Беляев В .А., 2010; Дорожкин В.И., 2001; Кощаев А.Г., 2008; Турченко А.Н., 2006).

Исходя из этого, был разработан новый гепатопротектрный препарат, в состав которого вошли каротин, селен и фосфолипиды, получивший название гепавитол.

Цель и задачи исследований. Основная цель настоящей работы состояла в разработке нового препарата гепавитол, изучении его фармако-токсикологических свойств и лечебной эффективности при заболеваниях печени у собак.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: - научно обосновать рецептуру гепавитола и изучить его физико-химические свойства, определить показатели качества препарата и методы их контроля;

- изучить токсикологические свойства гепавитола (острая, хроническая токсичность, влияние на функциональное состояние желудочно-кишечного тракта и почек, раздражающее свойства препарата при местном воздействии на кожу и слизистые оболочки);

- изучить фармакологические свойства (фармакодинамика) препарата;

- определить терапевтическую эффективность гепавитола при заболеваниях печени у собак.

Научная новизна. Разработан новый препарат - гепавитол, представляющий собой оригинальную композицию, состоящую из бета-каротина, органической формы селена и фосфолипидов. Впервые проведено изучение комплекса токсикологических показателей гепавитола, позволившее выявить степень безопасности его применения. Определено, что препарат относится к группе малотоксичных соединений, полученные при этом экспериментальные данные свидетельствует о безопасности его применения в широком диапазоне доз и длительности назначения. Установлены фармакодинамические свойства препарата, а также впервые доказана возможность использования гепавитола в качестве лечебного средства при заболеваниях печени у собак.

Теоретическая и практическая значимость работы. Для ветеринарной медицинской практики предложен новый препарат гепавитол, обладающий гепатопротекторными свойствами. Результаты изучения эффективности применения лекарственного средства могут быть использованы в практике ветеринарии при фармакотерапии гепатопатий.

Данные проведенных исследований учтены при разработке НТД (временная инструкция по применению препарата гепавитол в ветеринарии).

Изложенные в диссертационной работе материалы могут быть использованы при составлении научно-информационной литературы, в учебном процессе сельскохозяйственных ВУЗов, а также в ветеринарной практике.

Апробация работы. Результаты экспериментальных и клинических исследований, являющихся основой диссертации, доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета Краснодарского НИВИ (2010 - 2013 гг.); на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной ветеринарии» (Краснодар, 2011); на Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологии» (Екатеринбург, 2011); на Международной научно-практической конференции «Инновационные пути развития АПК: проблемы и перспективы» (п. Персиановский, 2013).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 7 научных статьях, 2 из которых в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- состав и физико-химические свойства гепавитола;

- токсикологическая оценка препарата;

- фармакологические свойства (фармакодинамика) гепавитола;

- терапевтическая эффективность препарата при заболеваниях печени у собак.

Объем н структура диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из разделов: введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка литературы. Список использованной литературы включает 236 источников, в том числе иностранных 68. Работа иллюстрирована 22 таблицами, 6 фотографиями и 4 рисунками.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2010 по 2013 годы в лаборатории фармакологии Государственного научного учреждения Краснодарский научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук в соответствии с Государственными планами научных исследований и является частью задания с № госрегистрации 150070.2308023075.11.5.002/001. Часть исследований проведена на базе ветеринарной клиники ГБУ РО Шахтинской горСББЖ.

Объект исследований — препарат гепавитол, опытные образцы которого наработаны в лаборатории фармакологии Краснодарского НИВИ.

Экспериментальные и научно-производственные опыты проведены в соответствии с требованиями к врачебно-биологическому эксперименту по подбору аналогов, постановке контроля, соблюдению одинаковых условий кормления и содержания животных в период проведения работы и учета результатов. При постановке опытов были использованы физиологические, клинические, токсикологические, морфологические, биохимические и другие методы исследований.

Общетоксические свойства гепавитола были изучены в соответствии с «Методическими рекомендациями по токсико-экологической оценке лекарственных средств, применяемых в ветеринарии», одобренных секцией отделения ветеринарной медицины РАСХН (1998).

Токсикологическую оценку препарата проводили в остром опыте на белых крысах и собаках по методике Deishmann & Le Blanc (Саноцкий И. В., 1970). Гепавитол опытным крысам вводился внутрижелудочно с помощью полиэтиленового зонда и шприца в дозах от 0,42 г/кг до 7,1 г/кг массы тела, в контрольной группе животных в тех же объемах вводили растительное масло.

Вторую серию экспериментов по определению острой токсичности гепавитола проводили на собаках. Для этого по принципу парных аналогов было подобрано 10 животных, из которых сформировали две группы. В опыт-

ной группе препарат вводили внутрижелудочно, однократно, после 12-ти часовой голодной диеты, в дозе 7,1 г или 6,5 мл на килограмм массы тела (расчет производился индивидуально по весу собаки). Выбор дозы был обусловлен стандартом классификации по степени воздействия веществ на организм животных при проведении токсикологических исследований (свыше 5000 г/кг массы тела - 4 класс опасности малоопасные вещества) и результатами исследований препарата на лабораторных крысах. Контрольная группа получала аналогичный объем растительного масла.

Параметры хронической токсичности изучали по общепринятым методикам на белых крысах и собаках. Образец гепавитола задавали индивидуально, перорально, ежедневно, натощак в течение 60 дней по непрерывной схеме в дозах, руководствуясь результатами, полученными при исследовании острой токсичности.

В первой серии опыты проводили на белых крысах, из которых сформировали 3 группы аналогов, по 10 голов в группе. Поскольку в остром опыте среднесмертельная доза (ЬО50) установлена не была, первая группа крыс получала исследуемый образец препарата гепавитол в дозе 1/10 от максимально введенной (7,1 г/кг-6,5 мл/кг), вторая группа получала препарат в дозе 1/20 от максимально введенной, третья группа служила контролем и получала растительное масло в объеме 0,11 мл на животное. Вещества задавали ежедневно индивидуально в виде желточно-маслянных шариков, в течение 2-х месяцев.

По окончании хронического эксперимента изучалось воздействие гепавитола на макро- и микроструктуру внутренних органов крыс. Патолого-анатомический анализ органов и тканей проводился согласно «Курса патоги-стологической техники» (Меркулов Г. А., 1969). В работе использовался анатомический и гистологический комплекс методов исследования. Анатомический метод был использован для изучения формы, размеров и топографии органов. Органы и ткани подвергали препарированию и описывали. Гистологический метод использовали для изучения микроструктуры органов и тканей, при котором срезы окрашивали гематоксилином Бемера и водным 0,1%-ным раствором эозина и эозином по Романовскому-Гимзе.

Для гистологического исследования фрагменты органов (желудок, две-надцатиперсная кишка, кусочки печени, почек, селезенки, сердца, лимфоузлы) фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина. Парафиновые срезы окрашивали рутинными красителями (гематоксином и эозином) и просматривали с помощью светового микроскопа.

Во второй серии опытов по оценке хронической токсичности гепавитола для опытов было сформировано 3 группы беспородных собак - аналогов (самцы с первоначальной массой тела 10,9-12,3 кг) по 5-ть особей в группе. Дозы препарата в опытных группах составили 15 мл (1-я опытная) и 25 мл (2-я опытная) на животное, что превышало условно-терапевтическую дозу в

3 и 5 раз. Контрольная группа получала подсолнечное масло в объеме наибольшей дозировки. Режим введения: ежедневно, индивидуально, в течение 60 дней.

В течение эксперимента ежедневно, проводилось наблюдение за общим состоянием животных, их выживаемостью. Взвешивание осуществлялось в начале и в конце опыта. Были проведены лабораторные исследования крови - фоновые и в конце опыта.

Для выявления возможного повреждающего действия гепавитола на функцию пищеварительного тракта и почек у собак каждые 10 дней собирали мочу и фекалии, в которых исследовали физико-химические показатели. В фекалиях определяли цвет, запах и консистенцию (органолептически), наличие кровяных пигментов (бензидиновой пробой), желчных пигментов, жира (окраской суданом-3), крахмала (обработка раствором Люголя), рН - лакмусовой бумагой. В моче определяли цвет, консистенцию, запах, концентрацию водородных ионов, удельный вес, содержание белка, углеводов, гемоглобина, желчных пигментов.

Оценку местно-раздражающего действия препарата гепавитол проводили методом накожных аппликаций и конъюнктивальной пробой на кроликах и морских свинках.

У морских свинок предварительно выстригали волосы на участке спины размером 2-3 см, в направлении от задней трети спины к голове. Препарат наносили 5 дней подряд, кроликам с внутренней стороны уха, свинкам на выстриженные участки путем втирания, после чего в течение 24-х часов учитывали состояние кожного покрова (окраску, местную температуру, припухлость, зуд).

Для конъюнктивальной пробы препарат вводили под нижнее веко в количестве 3-х капель, в подогретом до 37° С виде. Одновременно для контроля в другой глаз закапывали такое же количество растительного масла.

После введения препарата учитывали клиническое состояние животных (температуру тела, частоту пульса, количество дыхательных движений), в том числе, изменение кровенаполнения конъюнктивы, состояние век и роговицы, наличие выделений.

При гематологических исследованиях определяли количество эритроцитов и лейкоцитов в камере Горяева, выводили лейкоформулу по В.Г. Мухину, содержание гемоглобина (гемоглобинцианидным методом), высчитывали цветовой показатель, СОЭ в аппарате Панченкова. Биохимические исследования проводились на автоматическом биохимическом анализаторе Vitalab Flexor Junior с помощью наборов фирмы «ELITech Clinical Systems». Определяли уровень белковых фракций (нефелометрически), витамина А (по Бессею, в модификации Анисовой), витамина Е (по цветной реакции с хлорным железом и а-дипиридилом).

Исследование показателей системы ПОЛ-АОЗ проводили в соответствии с методическими рекомендациями ВНИВИПФиТ (1997) по изучению процессов перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты организма у животных.

Оценку фармакологических свойств (фармакодинамика) гепавитола проводили на собаках. Предварительно для формирования групп проводили полный клинический осмотр животных, а также оценивали ряд морфо-биохимических параметров крови и показателей антиоксидантной защиты организма. Препарат гепавитол давали за 30 минут до кормления индивидуально, перорально с небольшим количеством корма или принудительно с помощью шприца из расчета на 0,5 мл на 1 кг массы тела в течение 2-х недель.

Изучение фармакологического действия гепавитола проводили на экспериментальной модели острого гепатита у крыс, вызванного ССЬ4, в соответствии с Методическими указаниями по изучению гепатозащитной активности фармакологических веществ (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, под общей редакцией Р.У. Хабриева, 2005).

О фармакодинамике препарата судили по клиническим показателям, изменениям в морфологическом составе крови, белковом, липидном, углеводном, минеральном, витаминном обменах, в состоянии перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты организма, а также по ряду биохимических показателей, характеризующих функциональное состояние печени.

При разработке показаний к применению эффективность препарата гепавитол изучали при остром гепатите у собак. Для экспериментов были отобраны 14 собак в возрасте 2-6 лет с основным диагнозом пироплазмоз (с преобладанием гепатопривного синдрома), которых разделили на две группы по методу парных аналогов. В комплекс лечебных мероприятий животным первой (опытной) группы в схему лечения включали гепавитол, собакам второй (контрольной) группы применяли эссенциале.

В следующей серии экспериментов разрабатывались показания к применению гепавитола при гепатозе. Для этого было отобрано 14 собак в возрасте от 2 до 5 лет имевших симптоматические проявления хронической патологии печени (по типу жировой гепатоз). Терапию проводили комплексно: у животных с признаками дегидратации (перемежающаяся рвота и понос) для борьбы с обезвоживанием организма внутривенно вводили раствор Рин-гера; всем собакам применяли витамины группы В, животным с холестазом в качестве желчегонного средства — аллохол (согласно инструкции по применению). Животным первой группы применяли гепавитол, в контроле в качестве препарата сравнения использовали эссенциале.

Эффективность лечения животных опытной группы оценивалась в динамике по сравнению с контрольной группой. Заключение о положительном действии препарата делали на основании результатов комплексных клиниче-

ских, биохимических, гематологических исследований и по УЗИ гепатобили-арной системы.

Полученные в опытах данные подвергнуты биометрической обработке с помощью программного обеспечения фирмы Microsoft ®, фирмы Carl Zeiss ®. Критерий достоверности определяли по таблице Стьюдента.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Токсикологические свойства гепавитола

Гепавитол представляет собой масляный раствор: бета-каротина, селена и фосфолипидов.

При определении параметров острой токсичности исследуемый образец препарата опытным крысам вводился внутрижелудочно с помощью полиэтиленового зонда и шприца в дозах от 0,42 г/кг до 7,1 г/кг массы тела. Пересчет введенной дозы препарата и растительного масла в граммы проводили, исходя из их плотности 0,921 г/мл. Результаты опытов представлены в таблице 1.

Таблица 1

Определение острой токсичности препарата гепавитол для белых крыс

№ Масса тела, г Доза, г/кг массы тела Доза на животное, г Доза на животное, мл Эффект

1 205 0,42 0,090 0,08

2 197 0,62 0,122 0.11

3 208 0,94 0,195 0,18 Гибели не

4 200 1.4 0.28 0,25 зареги-

5 195 2,1 0,41 0.37 стрирова-

6 211 3,2 0,67 0.60 но

7 207 4,7 0,97 0,87

8 197 7,1 1,39 1,25

В результате проведенных исследований установлено, что однократное введение гепавитола в дозах от 420 до 7100 мг/кг массы тела не вызывало клинической картины токсикоза у белых крыс, гибели животных не отмечалось.

Во второй серии экспериментов по определению острой токсичности гепавитола на собаках его введение в дозе 7,1 г или 6,5 мл на килограмм массы тела не вызывало гибели и острой интоксикации животных, не влияло отрицательно на их общее состояние и поведение. Последующее наблюдение за собаками показало, что по показателям внешнего вида, шерстного покрова, видимых слизистых оболочек, отношению к воде и пище, подвижности, ритму и частоте дыхания подопытные животные не имели отличий от контрольных за весь период наблюдений. Однако у всех собак зарегистрировано

некоторое увеличение количества актов дефекации в первые сутки после введения, как образца препарата, так и растительного масла. Это можно рассматривать как ответную реакцию организма большие объемы масла, который в этих дозах оказывал некоторый слабительный эффект.

Таким образом, однократное введение исследуемого образца препарата гепавитол в дозах до 7100 мг/кг переносится животными без видимых последствий, он классифицируется как препарат малотоксичный и по ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества» относится к 4-му классу опасности (малоопасные вещества).

При определении параметров хронической токсичности гепавитола на крысах испытывали дозы 1/10 и 1/20 от максимально введенной (7,1 г/кг массы тела). В результате проведенных опытов было установлено, что гепавитол в испытанных дозах не оказывал токсического действия на организм животных. На всем протяжении эксперимента существенных отклонений от нормы в поведении, общем состоянии и аппетите крыс не регистрировали. Животные были подвижны, реакции и рефлексы сохранены. Тактильная и болевая чувствительность не нарушались. Изменений функций пищеварения и мочеотделения отмечено не было. Имевшие место колебания клинических показателей были незначительными и не выходили из границ физиологических пределов.

Гравиметрическими исследованиями выявлено увеличение массы у крыс, которое составило в первой опытной группе — 17,4%, во второй -16,1%, в контроле этот показатель равнялся 12,2%.

Биохимическими исследованиями крови установлено, что среднее значение показателей у крыс опытных групп не выходило за верхние границы нормы для данного вида животных и статистически не отличалось от их уровня в контроле. Выявлено увеличение на уровне тенденции концентрации общего белка на 13,5% и 15%, в сравнении с контрольными животными.

При патоморфологических и гистологических исследованиях у животных как в опытных, так и в контрольной группах не было выявлено отклонений от нормы в макро- и микроструктуре внутренних органов крыс.

Определение хронической токсичности на собаках показало, что применение гепавитола в дозах, превышающих условно-терапевтическую в 3 и 5 раз, не привело к развитию токсикоза и не позволило установить его вредного влияния на организм животных.

Оценка местно-раздражающего действия гепавитола методом накожных аппликаций и конъюнктивальной пробой на кроликах и морских свинках показала, что препарат характеризуется как не проявляющий раздражающего действия при местном воздействии на кожу и слизистые оболочки.

Таким образом, обобщая результаты опытов по изучению токсических свойств препарата гепавитол установлено, что он относится к классу малотоксичных веществ.

3.2 Фармакодинамика гепавнтола

Изучение фармакологических свойств (фармакодинамику) гепавитола проводили по результатам оценки его влияния на уровень обменных процессов у собак, после 2-х недельного применения препарата. Установлено, что у животных достоверно возрос уровень общего белка на 16,5%, уровень альбуминов увеличился на 10,5%. Также у животных к концу экспериментального периода достоверно увеличилась концентрация фосфолипидов на 44,1%. Анализируя данные по витаминному составу крови, установили: увеличение концентрации витамина А в 1,4 раза у собак, получавших гепавитол (со степенью достоверности Р<0,05). В содержании витамина Е выявили наличие тенденции к увеличению этого показателя на 18,3% по отношению к фоновым данным.

Позитивное влияние гепавитола на показатели, характеризующие интенсивность ПОЛ-АОЗ у собак, проявилось в снижении концентрации продуктов липопероксидации. Так, по окончании эксперимента регистрировались ниже уровни диеновых конъюгатов - на 14,3% и малонового диальдеги-да - на 25,3%, а активность глутатионпероксидазы была выше аналогичного показателя при фоновых исследованиях на 10,7%.

Улучшение обменных процессов в организме собак под влиянием препарата оказало влияние на клинический статус животных: собаки стали более подвижными, отмечено улучшение состояния кожи и шерстного покрова.

Гепавитол проявляет гепатозащитное действие при экспериментальном поражении печени четыреххлористым углеродом у лабораторных крыс, снижая уровень гепатоиндикаторных ферментов в крови опытных животных (АсАт и АлАт в среднем в 1,7 раза, ЩФ - на 50,4%), а также препятствуя развитию гипербилирубинемии и гиперпротеинемии, что свидетельствует о целесообразности его применения в качестве гепатопротектора.

3.3 Разработка показаний к применению препарата гепавитол 3.3.1 Эффективность гепавитола при гепатите у собак

При разработке показаний к применению препарата гепавитол были отобраны 14 собак с основным диагнозом пироплазмоз (с преобладанием ге-патопривного синдрома). При первичном клиническом обследовании собак общее состояние оценивали как удовлетворительное. Собаки с терминальной формой заболевания в эксперименте не участвовали.

Клинически начало заболевания у собак характеризовалось отсутствием аппетита, повышением температуры тела (у 10-ти животных), тахикардией, одышкой. У 6-ти собак (по три в группе) на 3-4 сутки суток появлялось иктеричное окрашивание слизистых оболочек ротовой полости, конъюнктивы. Снижение детоксикационной функции печени приводило

к нарастанию интоксикации, дегидратации, что клинически проявлялось саливацией, рвотой, реже диареей. По результатам УЗИ в печени наблюдались диффузные изменения паренхимы по типу острого гепатита.

Клинический анализ крови показал снижение содержания эритроцитов до 3,9±0,22* 1012/л и гемоглобина до 82,5+1,8 г/л. Отмечалось уменьшение сегментоядерных клеток, а также лимфо- и моноцитоз.

При оценке биохимического статуса больных собак установлено: ги-перпротеинемия (содержание общего белка до 75,4±1,6 г/л); в уровне мочевины, креатинина и хлоридов значимых изменений не выявлено (следовательно, сильного поражения почек у отобранных в опыт животных не развивалось); гипогликемия, обусловленная отказом животных от пищи и поражением паренхимы печени; повышенный уровень АлАТ до 98,4±2,1 ЕД/л и АсАТ до 76,3±2,5 ЕД/л; у шести животных (по три в группе) установлены холестатиче-ские отклонения, что проявилось увеличением уровня холестерина и щелочной фосфатазы, при этом статистическая обработка, в целом по группе, хотя и выявила повышение этих показателей, но без ярко выраженной манифестации; концентрация общего билирубина в сыворотке крови была значительно выше нормы (до 18,1±1,7 мкМ/л), что связано с массовым распадом эритроцитов и высвобождением гемоглобина, распадающегося в печени до билирубина. Значительно возросло количество прямого билирубина до - 7,1+0,6 мкМ/л. При анализе протеинограммы установлено выраженное снижение содержания альбуминов при повышении концентрации а- иу-глобулинов, что указывает на интенсификацию иммунобиологической реактивности организма (в острой фазе воспалительного процесса).

Схема лечения для всех больных собак включала в себя: из этиотропных средств протозойный препарат неозидин; из симптоматических средств: раствор Рингера, фурасемид, цианкобаламин, у собак с проявлением холестаза в качестве желчегонного средства - аллохол. При повышении температуры тела давали анальгин. В комплекс лечебных мероприятий животным первой (опытной) группы в схему лечения включали гепавитол, который применяли индивидуально, 2-3 раза в день (с общей суточной дозой 0,5 мл на кг массы тела), в течение 30 дней. Собакам второй (контрольной) группы применяли эссенциале по 1 капсуле 3 раза в сутки. Во всех группах собак, больных гепатитом, назначалась строгая диета, с увеличением числа приема пищи.

Лечение собак с использованием гепавитола обеспечивала более выраженный терапевтический эффект, что подтверждалось позитивным сдвигом в лабораторных показателях.

Из данных, представленных в таблице 2, установлено, что к 10-м суткам терапии в обеих группах наблюдалась нормализация ряда исходных показателей. Однако наиболее интенсивно этот процесс проходил у опытных животных. Так, содержание общего белка во всех группах уже к 10-му дню

лечения вошло в параметры нормы, в этот же период оптимизировался уровень глюкозы и холестерина. Повышенный уровень ферментов АсАТ, АлАТ и ЩФ в контрольной группе на 10-й день лечения свидетельствует о незавершенности детоксикационных и репаративных процессов у больных животных. У собак опытной группы вышеназванные показатели были близки к референтным, что подтверждает эффективное восстановление функции печени при использовании гепавитола. Так, разница с контролем составила по АлАТ - 27,3%, по АсАТ - 19,4%, по ЩФ - 30,2%. Аналогичная ситуация прослеживалась и в содержании билирубина - на 10-й день опыта концентрация прямого билирубина снизилась до уровня нормы в обеих группах, а оптимизация содержания общего билирубина зарегистрирована только у собак первой группы (разница составила 44,2% и она была достоверной).

Таблица 2

Биохимические показатели крови собак, больных гепатитом, при

п рименении гепавитола (М±т; п=7)

Показатели Опыт | Конт роль

10-й день 30-й день 10-й день 30-й день

Белок общий, г/л 67,5+2,3 61,4±1,8 69,8+2,7 62,9+3,1

Мочевина, мМ/л 4,8±0,5 5,1 ±0,9 6,3+1,1 5,9+0,7

Глюкоза, мМ/л 3,8±0,3 4,7±0,8 3,3+0,6 3,9+0,4

Холестерин, мМ/л 5,8±1,2 5,4±0,9 6,3±0,7 5,9+0,5

АлАТ, Ед/л 60,1+1,2* 51,8+2,5 76,5±1,8 59,3±1,5

АсАТ, Ед/л 45,9+1,4* 27,4+2,1 54,8±2,8 42,7±1,9

ЩФ, Ед/л 95,3±2,3* 81,7+1,6* 124,1+2,2 98,9+1,7

Амилаза, Ед/л 674,5+6,9 598,9+7,2 821,7+8,1 756,3±5,4

Об. Билир., мкМ/л 9,5±1,2* 5,4±0,7 13,7±0,8 7.9+1,1

Пр. билир, мкМ/л 2,4+0,2 1,8+0,3 2,6±0,5 2,3+0,2

Креатинин, мМ/л 74,9±3,1 68,1±2,6 85,3±3,7 80,4+3,5

Хлориды, мМ/л 110,1±2,8 109,8±1,9 115,6+3,1 111,2±2,6

* - различия достоверны (Р<0,05) по сравнению с контрольными животными

К концу экспериментального периода в первой группе показатели клинического и биохимического анализа крови соответствовали норме. Во второй группе у двух животных из 7-ми уровень АсАТ и ЩФ незначительно превышал норму, что свидетельствует о неполном восстановлении функции печени и требует продолжения курса терапевтических мероприятий.

В процессе применения гепатопротекторов изменения клинических показателей в сторону улучшения были зарегистрированы у животных обеих групп, но при применении гепавитола лечебный эффект проявлялся раньше. Так, у животных опытной группы улучшение клинического состояния наступало на 4-й день терапии, в контрольной группе этот процесс проявлялся на

6-й день. Летальный исход в обеих группах отсутствовал, продолжительность температурной реакции в опытной группе составила 2-3 дня, в контроле 3-4.

К 10-м суткам терапии у всех животных нормализовался аппетит, рвота и диарея отсутствовали, они стали активны, слизистые оболочки у животных первой группы стали бледно-розового цвета, а у контрольных желтый оттенок присутствовал у двух собак, что свидетельствует о сохраняющемся холестазе печени, который отмечался и на 30-е сутки эксперимента.

При ультразвуковом исследовании печени и желчевыделительной системы в конце эксперимента установлено, что у всех животных первой опытной группы и у 5-ти контрольных собак ультразвуковая картина печени соответствует практически здоровым животным. У двух контрольных животных наблюдалось снижение эхогенности паренхимы с ее неоднородной структурой и незначительно выраженной отечностью, нарушение контуров печени, также установлено расширение внутрипеченочных протоков, что свидетельствует о неполном восстановлении тканей печени после лечения.

Таким образом, при 30-ти дневном курсе терапии гепавитолом у 100% животных нормализовались клинические показатели и морфо-биохимический статус крови, в группе сравнения этот эффект был зарегистрирован у 5-ти собак (71,4%).

3.3.2 Эффективность гепавитола при гепатозе у собак

В эксперименте участвовали 14 собак имевших симптоматические проявления хронической патологии печени (по типу жировой гепатоз). При первоначальном клиническом осмотре животных установлено:

- показатели температуры, пульса и дыхания регистрировались в пределах нормы;

- общее состояние угнетенное, со сниженной динамической активностью, слабостью конечностей и шаткой походкой, быстрой утомляемостью животных, кахексичный вид, а также отсутствие аппетита со слов владельцев. В 57% случаях были отмечены: диарея, периодическая рвота и метеоризм кишечника;

- при оценке состояния видимых слизистых оболочек отмечалась их сухость, в 4-х случаях анемичность, а 6-ти незначительную иктеричность слизистых оболочек ротовой полости и склер глаз;

- кожный покров у всех больных животных был сухой, шерстный покров -тусклый, взъерошенный, регистрировались алопеции в области бедер, поясницы и основания хвоста. У большинства собак регистрировался зуд, что приводило к расчесыванию и нарушению целостности кожи этих участков;

- лимфатические узлы не увеличены, бобовидной формы, тестоватой консистенции, безболезненные и подвижные при пальпации;

- оценка границ печени выявила умеренную гепатомегалию без резкой боли у 8-ми собак.

По результатам клинического анализа крови собак при фоновых исследованиях зарегистрирована эритропения (снижение содержания эритроцитов до 4,25+0,26* 10'7л) и низкий уровень гемоглобина - 95,3 г/л. Содержание лейкоцитов у собак до начала эксперимента регистрировалось уровне 13,1±0,34*109/л.

При изучении биохимических показателей крови было установлено, что в крови, больных гепатозом собак, концентрация общего белка составила 53,9±2,4 г/л. Уровень мочевины регистрировался на нижней границе нормы и составил 3,5±0,8 мМ/л. В результате оценки содержания в крови собак индикаторных энзимов (АсАТ, АлАТ и ЩФ) получены данные, свидетельствующие об изменении концентраций этих показателей в сторону увеличения от физиологической нормы. Повреждение структурных компонентов печени и напряженность обменных процессов усугубляется повышением проницаемости плазматических мембран гепатоцитов, что и объясняет повышение активности сывороточных трансаминаз. Количественное содержание АлАТ в крови больных собак составило 72,8±2,9 Ед/л, а АсАТ 47,9±3,4 Ед/л. Зарегистрированная гиперфосфатаземия свидетельствует об умеренном холестазе у ряда животных (ее содержание выявлялось на уровне 108,1+5,1 Ед/л, что незначительно превышает норму). Результаты пигментного обмена показали отклонения от нормы в сторону увеличения содержания общего билирубина у больных гепатозом собак до 12,1±1,6 мкМ/л. У отобранных в опыт животных, уровень витамина А был ниже, чем у здоровых собак и составлял 78,6+3,9мкг%.

Таким образом, фоновое исследование собак показало, что нарушение функционального состояния печени при гепатозе сопровождается широким спектром морфо-биохимических отклонений в системе крови.

Для исследования гепатопротекторных свойств препарата гепавитол 14 собак с диагнозом гепатоз по принципу парных аналогов разделили на две группы (опытную и контрольную) по 7-мь особей в каждой.

Терапию при гепатозе проводили комплексно: у животных с признаками дегидратации (перемежающееся рвота и понос) для борьбы с обезвоживанием организма внутривенно вводили раствор Рингера; всем собакам применяли витамины группы В, животным с холестазом в качестве желчегонного средства - аллохол.

Животным первой группе применяли гепавитол, который задавали индивидуально 2-3 раза в день (с общей суточной дозой 0,5 мл на кг массы тела) в течение 30 дней. Собакам второй (контрольной) группы в качестве препарата сравнения применяли эссенциале по 1 капсуле 3 раза в сутки.

Использование гепавитола при лечении гепатоза у собак обеспечивало хороший терапевтический эффект, что подтверждалось улучшением клинического статуса животных и положительной динамикой лабораторных показателей.

При оценке клинического состояния собак установлено, что в процессе лечения положительные изменения были зарегистрированы у животных в обеих группах. Но в контрольной группе стабилизация клинического статуса произошла к концу эксперимента только у 4-х собак (57 %), а еще трем животным применение лечебных препаратов продолжили. В группе с использованием гепавитола у 5-ти животных уже через две недели восстановился аппетит, прекратилась рвота и диарея, снизилась интенсивность зуда до полного прекращения. На пораженных участках кожа подсыхала и покрывалась корочкой, с последующим очищением. Непигментированные видимые участки кожи и слизистых оболочек были бледно-розового цвета. К 30-му дню терапии у всех животных нормализовались клинические показатели. Прием воды и пищи у собак происходил с нормальной частотой, акт мочеиспускания и дефекации осуществлялся без отклонений от нормы. В местах алопеций наблюдали активный рост волос, у собак опытной группы шерсть отросла практически полностью, а у собак контрольной группы - частично. При пальпации болезненность в области печени и увеличение ее размеров отсутствовали.

В опытной группе при ультразвуковом исследовании печени в конце эксперимента эхограмма практически соответствовала здоровым животным. У 3-х контрольных животных еще обнаруживались в паренхиме участки печени повышенной эхогенности, при некотором расширении сосудов.

В результате лабораторных исследований крови установлено, что к концу эксперимента у всех собак наблюдалась нормализация факторов периферической крови. Уровень лейкоцитов в обеих группах находился в пределах нормы (10,3±0,86 и 11,5±0,73*109/л) без значимой разницы между группами. Лейкоцитарная формула как опытной группе животных, так и у контрольных собак не имела отклонений от нормы. Концентрация эритроцитов и гемоглобина в группе собак с применением гепавитола увеличилось на 46,5% и 31,8% относительно фоновых показателей. Достоверная разница между группами по данным показателям составили 17,3% и 11,7%.

При изучении биохимических компонентов крови (таблица 3) установлено, что содержание общего белка в крови собак в обеих группах после лечения повысилось и регистрировалось на уровне (68,3+1,5 и 56,1+1,7г/л). При использовании гепавитола его концентрация с достоверной разницей превосходила показатели контроля на 21,8%.

В опытной группе содержание мочевины в крови собак на 30-е сутки эксперимента повысилось с 3,3±0,5 мМ/л (фоновый показатель) до 4,5±0,3 мМ/л. У контрольных животных этот показатель изменялся в узких границах, если до начала эксперимента ее содержание составляло 3,5±0,8 мМ/л, то на 30-е сутки оно достигло уровня 3,7±0,2 мМ/л. У собак обеих групп содержание холестерина в крови находилось в пределах 3,6±0,7 и 3,9±0,6 мМ/л, что соответствовало физиологической норме.

Таблица 3

Биохимические показатели крови собак после лечения гепатоза (М±т; п=7)

Показатели Опыт Контроль Норма

Белок общий, г/л 68,3+1,5* 56,1+1,7 55-71

Мочевина, мМ/л 4,5+0,3 3,7±0,2 3,5-9,2

Глюкоза, мМ/л 4,7±0,5 4,3±0,8 3,3-5,6

Холестерин, мМ/л 3,6±0,7 3,9±0,6 2,8-6,9

АлАТ, Ед/л 37,3±1,2* 45,1±1,4 15-58

АсАТ, Ед/л 35,4±1,6* 44,7±1,9 16-43

ЩФ, Ед/л 58,9+3,7 65,4+2,8 10-100,7

Амилаза, Ед/л 776,9±5,4 811,9±6,7 510-1864

Об. билирубин, мкМ/л 5,4±0,2 6,1 ±0,5 1,7-10,6

Пр. билирубин, мкМ/л 1,1+0,09 1,5+0,18 0-2,5

Креатинин, мМ/л 88,1+3,4 92,3±2,8 55-114

Хлориды, мМ/л 112,8±4,2 115,6+3,7 107-126

Витамин А, мкг% 110,8+2,6* 82,1 ±2,9 -

* - различия достоверны (Р<0,05) по сравнению с контрольными животными

Определение ферментативной активности АсАТ и АлАТ показало, что у всех собак за период эксперимента произошло достоверное снижение этих показателей. На 30-е сутки эксперимента их уровень составил по АлАТ 37,3±1,2 и 45,1+1,4 Ед/л, а по АсАт 35,4+1,6 и 44,7±1,9 Ед/л. Таким образом, у животных контрольной группы ферментативная активность аминотрансфе-раз находилась на более высоком уровне, чем у собак опытной группы, достоверная разница составила 20,9% (АлАТ) и 26,2% (АсАТ). Средний показатель щелочной фосфатазы до начала эксперимента в обеих группах регистрировался на верхней границе нормы. В заключительный период эксперимента уровень этого фермента в крови собак всех групп снижался и достиг пределов 58,9±3,7 и 65,4+2,8 Ед/л, что соответствует норме.

Следовательно, наиболее эффективное нормализирующее влияние на активность АлАТ, АсАТ и ЩФ, оказало использование схемы лечения с ге-павитолом, что указывает на более выраженное восстановление мембранных структур клеток печени и свидетельствует о снижении цитолитического синдрома.

Терапия с гепавитолом способствовала уменьшению проявления хо-лестатического синдрома, что проявлялось уменьшением как активности щелочной фосфатазы, так и уровня билирубина. Концентрация общего билирубина в крови собак до начала эксперимента был повышена, после лечения содержание этого метаболита в крови снизилось до 5,4+0,2 мкМ/л в опытной группе, в контроле до 6,1 ±0,5 мкМ/л.

Содержание витамина А в крови собак в начале эксперимента находилось на низком уровне (78,6±3,9 и 85,3±4,1 мкг% против 115,6±4,3 мкг% у здоровых животных). На 30-е сутки эксперимента содержание ретинола у животных опытной группы было наиболее выраженным и достигало 110,8±2,6 мкг%. У собак контрольной группы содержание витамина А в течение эксперимента имело тенденцию к уменьшению, его уровень в крови составил 82,1±2,9 мкг%, со статистически достоверной разницей с животными, получавшими гепавитол 34,9%.

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют, что препарат гепавитол обладает выраженным гепатопротекторным действием при гепатозе собак, что проявляется улучшением клинического статуса, оптимизацией гематологических и биохимических показателей крови, при улучшении протеинсинтетической, пигментообразовательной и де-токсикацоинной функций печени, а также снижении цитолитического синдрома.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработан новый препарат гепавитол, который представляет собой масляный раствор бета-каротина, селена и фосфолипидов. Это прозрачная, без осадка маслянистую жидкость, коричневого цвета, без запаха, со вкусом обезличенного масла.

2. Гепавитол не токсичен для животных как в острых, так и в хронических экспериментах. Введение исследуемого образца препарата при определении параметров острой токсичности в дозах в дозах от 0,42 г/кг до 7100 мг/кг не вызывает гибели и выраженного токсикоза у животных, что классифицирует его как малотоксичный препарат и по ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества» он относится к 4-му классу опасности (малоопасные вещества).

3. Применение гепавитола в течении двух месяцев в токсичных дозах не вызывает гибели лабораторных крыс и собак, не проявляет негативного воздействия на общее состояние животных и показатели их клинического статуса, на функциональную активность печени, процессы пищеварения и мочеотделения, а также морфо-биохимические показатели крови (выявленное повышение уровня общего белка и лейкоцитов свидетельствует о защитной реакции организма на исследуемый препарат, при этом их содержание не выходило за верхнюю границу нормы).

Патоморфологическое и гистологическое исследование внутренних органов и тканей животных свидетельствует об отсутствии дополнительной нагрузки на органы, при длительном применении препарата.

Гепавитол при нанесении на кожу и слизистые оболочки не проявляет местного раздражающего действия. В экспериментах по изучению влияния

препарата на качество мясопродуктов установлено, что длительное его применение не оказывает отрицательного влияния на физико-химические и вкусовые качества мяса.

4. Фармакодинамика гепавитола характеризуется увеличением уровня общего белка на 16,5% и стабилизацией его фракционного состава, увеличением концентрации фосфолипидов на 44%, витамина А в 1,4 раза, витамина Е на 18,3%, оптимизацией уровня гепатоиндикаторных ферментов. Применение гепавитола повышает антиоксидантные защитные силы организма (активность глутатионпероксидазы возросла на 10,7%), а также снижает уровень токсичных продуктов липопероксидации (зарегистрировано снижение концентрации диеновых коныогатов на 14,3% и малонового диальдегида на 25,3%). Оптимизация обменных процессов в организме собак под влиянием препарата оказывает позитивное влияние на клинический статус животных (улучшение состояния кожи и шерстного покрова).

Гепавитол проявляет гепатозащитное действие при экспериментальном поражении печени четыреххлористым углеродом, снижая уровень ферментов в крови опытных крыс (АсАт и АлАт в среднем в 1,7 раза, ЩФ - на 50,4%), а также препятствуя развитию гипербилирубинемии, что свидетельствует о целесообразности его применения в качестве гепатопротектора.

5. Применение гепавитола в комплексной терапии гепатита у собак обуславливает более выраженный гепатопротекторный эффект в сравнении с традиционной схемой лечения. Его использование ведет к увеличению содержания в крови эритроцитов на 17,3% и гемоглобина на 12,9%. Эффективное восстановление функции печени подтверждалось снижением активности ферментов до значений нормы (относительно контрольной группы были ниже уровни АлАТ на 27,3%, АсАТ на 19,4%, по ЩФ на 30,2%). Оптимизация содержания общего билирубина зарегистрирована только у собак опытной группы (разница составила 44,2%). К концу эксперимента ультразвуковая картина печени опытных собак соответствовала практически здоровым животным. Месячный курс терапии с гепавитолом при гепатите у собак ведет к нормализации клинических показателей и морфо-биохимических факторов крови у 100% животных, в группе сравнения этот эффект был зарегистрирован у 5-ти собак (71,4%).

6. Гепавитол является эффективным терапевтическим средством при хронической патологии печени у собак (гепатоз), что проявляется улучшением клинического статуса, оптимизацией гематологических и биохимических показателей крови, при улучшении протеинсинтетической, пигментообразо-вательной и детоксикацоинной функций печени, а также снижении цитолити-ческого синдрома. Репаративный эффект препарата проявляется повышением уровня общего белка на 21,8%, стабилизацией его фракционного состава, повышением содержания мочевины до 4,5±0,3 мМ/л, снижением уровня билирубина и ферментов печени (у животных контрольной группы активность

аминотрансфераз находилась на более высоком уровне, чем у собак опытной группы, достоверная разница составила 20,9% (АлАТ) и 26,2% (АсАТ). Применение гепавитола обеспечивало снижение продолжительности болезни в 1,5-1,7 раза.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического животноводства и ветеринарии предлагается новый препарат гепавитол, обладающий гепатопротекторным действием. Входящий в его состав комплекс биологически активных веществ улучшает функциональное состояние печени и её детоксикационную функцию, способствует сохранению и восстановлению структуры гепатоцитов.

Гепавитол рекомендуется использовать как самостоятельно, так и в комплексе терапевтических мероприятий при заболеваниях печени у собак 2 раза в день в течение 3-5 недель с общей суточной дозой 0,5 мл на кг массы тела. Использование препарата регламентируется временной инструкцией по применению.

Результаты исследований могут быть использованы при составлении научной и информационной литературы, в учебном процессе профильных учебных заведений.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кузьминова, Е.В. Опыт применения каротиноидных препаратов при токсическом поражении печени /Е.В.Кузьминова, М.П. Семененко, Е.А. Старикова //Материалы второй межд. научн.-практ. конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологии».- Екатеринбург, 2011. - С. 159-160.

2. Кузьминова, Е.В. Практические аспекты применения антиоксидантов при токсическом поражении печени /Е.В. Кузьминова, Т.А. Шах-Меликьян, Е.А. Старикова //Материалы межд. научн.-практ. конференции, поев. 65-летию Краснодарского НИВИ «Актуальные проблемы современной ветеринарии».- Краснодар, 2011 - 4.1. - С. 182-184.

3. Кузьминова, Е.В. Влияние препарата бета-каротина на регенеративные процессы при заживлении ран. /Е.В.Кузьминова, М.П. Семененко, Е.А. Старикова //Материалы межд. научн.-практ. конференции, поев. 65-летию Краснодарского НИВИ «Актуальные проблемы современной ветеринарии».- Краснодар, 2011 - 4.1. - С. 180-182.

4. Старикова, Е.А. Оценка острой токсичности препарата гепавитол /Е.А. Старикова, Е.В.Кузьминова //Материалы межд. научн.-практ. конференции «Инновационные пути развития АПК: проблемы и перспективы».- п. Персиановский, 2013 - Том 3 — С. 234-236.

Старикова, Е.А. Фармакологические свойства препарата гепавитол /Е.А. Старикова, Е.В. Кузьминова //Материалы межд. научн.-практ. конференции «Инновационные пути развития АПК: проблемы и перспективы»,- п. Персиановский, 2013 —Том 3 - С. 236-248. Кузьминова, Б.В. Диагностическое значение биохимических показателей при гепатопатологиях /Е.В.Кузьминова, М.П. Семененко, Е.А. Старикова, Т.В. Михалева //Ветеринария Кубани. - 2013. - №5 -С. 11-13.

Кузьминова, Е.В. Применение биологически активных веществ для нормализации обменных процессов у животных /Е.В.Кузьминова, М.П. Семененко, Е.А. Старикова, Е.В. Тяпкина //Вестник Алтайского государственного аграрного университета. -2013. -№ И-С. 98-103.

Подписано в печать 15.11.2013 г. Формат 60х84'/1б

Бумага офсетная Офсетная печать

Печ. л. 1 Заказ № 685 Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии «Магия цвета», 350000, г. Краснодар, ул. Рашпилевская, 125

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Старикова, Елена Алексеевна, Краснодар

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ГНУ КРАСНОДАРСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ

СТАРИКОВА ЕЛЕНА АЛЕКСЕЕВНА

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПРЕПАРАТА ГЕПАВИТОЛ

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, Кузьминова Елена Васильевна

Краснодар - 2013

04201453319

СОДРЖАЫИЕ:

1. ВВЕДЕНИЕ..................................................................3

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................6

^ Печень, ее функции и заболевания, классификация гепатопро-текторов.......................................................................

2.2 Каротин: биологические свойства и применение........................................15

2.3 Селен: биологические свойства и применение................................................27

2.4 Фосфолипиды: биологические свойства и применение........................38

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................49

4. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ....................................55

4.1. Физико-химические свойства и контроль качества гепавитола. . 55

4.2. Токсикологическая оценка гепавитола........................63

4.2.1. Острая токсичность............................................65

4.2.2. Хроническая токсичность..................................68

4.2.3. Патоморфологические и гистологические исследования 72 Изучение раздражающее свойства гепавитола при мест- 77

4.2.4.

ном воздействии на кожу и слизистые оболочки.............

4.2.5. Влияние гепавитола на качество мясопродуктов..........................79

< 4.3. Фармакологические свойства гепавитола............82

^ Изучение фармакологических свойств гепавитола на со-

4.3.1 82

баках..................................................................

4.3.2. Эффективность гепавитола при экспериментальном

88

гепатите у крыс......................................................

4.4. Разработка показаний к применению препарата............................................90

4.4.1 Эффективность гепавитола при гепатите у собак........................90

4.4.2 Эффективность гепавитола при гепатозе у собак........................102

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................116

6. ВЫВОДЫ..................................................................124

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ....................................126

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................127

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Заболевания печени у мелких домашних животных являются одними из наиболее распространенных патологий (Уша Б.В., 1979; Кузнецов H.H., Кудимова H.A., 2007; Карпенко Л.Ю., 1998).

Печень - полифункциональный орган, играющий основную роль в метаболизме, секреции, детоксикации и экскреции различных веществ. Поражение ее ткани ведет к снижению барьерной функции, нарушению в белковом, углеводном, жировом, пигментном, гормональном и витаминном обменах.

Ассортимент лекарств, применяемых в комплексной терапии заболеваний гепатобилиарной системы, достаточно обширен. При этом выделяют сравнительно небольшую группу препаратов - гепатопротекторов, которые оказывают избирательное действие на печень. Их влияние направлено на повышение устойчивости органа к действию патогенных факторов, нормализацию функциональной активности и стимуляцию репаративно-регенерационных процессов в печени (Никитин И.Г., 2007; Оковитый C.B., 2006; Антипов В.А., Трошин А.Н., 2010).

Поскольку, при всех заболеваниях печени повреждаются мембранные структуры, обоснованным является применение веществ, оказывающих восстанавливающее действие на клеточные элементы гепатоцитов и тормозящих деструкцию клеток. Такой направленностью действия обладают фосфоли-пидные препараты (Сергеева С.А., 2001; Малявина В.В., 2007; Кунц Э., 1994; Ипатова О.М., 2005).

Защитное действие многих гепатопротекторов основывается на инги-бировании процессов перекисиого окисления липидов, которые рассматриваются как один из ведущих патогенетических механизмов развития поражений печени. Поэтому, использование аптиоксидантов, таких, как бета-каротин и селен, является целесообразным (Кузьминова Е.В., Семененко М.П., 2007; Родионова Т.Н., 2010; Кудинова С.П., Казарян Р.В., 1988; Беляев В.А., 2010; Дорожкин В.И., 2001; Кощаев А.Г., 2008; Турченко А.Н., 2006).

Исходя из этого, был разработан новый гепатопротегарный препарат, в состав которого вошли каротин, селенифосфолишщы, получивший название гепавитол.

Цель и задачи исследований. Основная цель настоящей работы состояла в разработке нового препарата гепавитол, изучении его фармако-токсикологических свойств и лечебной эффективности при заболеваниях печени у собак.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- научно обосновать рецептуру гепавитола и изучить его физико-химические свойства, определить показатели качества препарата и методы их контроля;

- изучить токсикологические свойства гепавитола (острая, хроническая токсичность, влияние на функциональное состояние желудочно-кишечного тракта и почек, раздражающее свойства препарата при местном воздействии на кожу и слизистые оболочки);

- изучить фармакологические свойс1ва (фармакодинамика) препарата; -определить терапевтическую эффективность гепавитола при заболеваниях печени у собак.

Научная новизна. Разработан новый препарат - гепавитол, представляющий собой оригинальную композицию, состоящую из бета-каротина, органической формы селена и фосфолипидов. Впервые проведено изучение комплекса токсикологических показателей гепавитола, позволившее выявить степень безопасности его применения. Определено, что препарат относится к группе малотоксичных соединений, полученные при этом экспериментальные данные свидетельствует о безопасности его применения в широком диапазоне доз и длительности назначения. Установлены фармакодинамические свойства препарата, а также впервые доказана возможность использования гепавитола в качестве лечебного средства при заболеваниях печени у собак.

Теоретическая и практическая значимость работы. Для ветеринарной медицинской практики предложен новый препарат гепавитол, обладающий гепатопротекторными свойствами. Результаты изучения эффективности применения лекарственного средства могут быть использованы в практике ветеринарии при фармакотерапии гепатопатий.

Данные проведенных исследований учтены при разработке НТД (временная инструкция по применению препарата гепавитол в ветеринарии).

Изложенные в диссертационной работе материалы могут быть использованы при составлении научно-информационной литературы, в учебном процессе сельскохозяйственных ВУЗов, а также в ветеринарной практике.

Апробация работы. Результаты экспериментальных и клинических исследований, являющихся основой диссертации, доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета Краснодарского НИВИ (2010 - 2013 гг.); на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной ветеринарии» (Краснодар, 2011); на Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологии» (Екатеринбург, 2011); на Международной научно-практической конференции «Инновационные пути развития АПК: проблемы и перспективы» (п. Персиановский, 2013).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 7 научных статьях, 2 из которых в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- состав и физико-химические свойства гепавитола; -токсикологическая оценка препарата;

- фармакологические свойства (фармакодинамика) гепавиюла;

- терапевтическая эффективность препарата при заболеваниях печени у собак.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из разделов: введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка литературы. Список использованной литературы включает 236 источников, в том числе иностранных 68. Работа иллюстрирована 22 таблицами, 6 фотографиями и 4 рисунками.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Печень, ее функции и заболевания, классификация генатопротскторов

Печень (hepar) самая массивная железа организма, однако ее относительная величина не одинакова: среди позвоночных она больше у низших классов (рыбы, амфибии), среди млекопитающих она массивнее у плотоядных по сравнению с травоядными. Это центральный орган в поддержании гомеостаза, который сохраняя динамическое постоянство внутренней среды организма животного, принимает активное участие в ликвидации последствий болезни.

Уша Б.В. (1979), выделяет следующие основные функции этого органа: желчеобразование и жёлчевыделение; обезвреживание ядов; участие в обмене белков, углеводов, липидов, витаминов, ферментов, пигментов; водном обмене. К основным из них можно отнести следующие:

- участие в процессах пищеварения, а именно обеспечение энергетических потребностей организма глюкозой, и конвертация различных источников энергии (свободных жирных кислот, аминокислот, глицерина, молочной кислоты и др.) в глюкозу (так называемый глюконеогенез);

- участие в процессах кроветворения, в частности синтез многих белков плазмы крови: альбуминов, альфа- и бет-глобулинов, транспортных белков для различных гормонов и витаминов, белков свёртывающей и противосвёр-тывающей систем крови и многих других; печень является одним из важных органов гемопоэза в пренатальном развитии;

- пополнение и хранение быстро мобилизуемых энергетических резервов в виде депо гликогена и регуляция углеводного обмена;

- синтез холестерина и его эфиров, липидов и фосфолипидов, липопротеидов и регуляция липидного обмена;

- синтез жёлчных кислот и билирубина, формирование жёлчи;

- синтез гормонов и ферментов, которые активно участвуют в преобразовании пищи в 12-перстной кишке и прочих отделах тонкого кишечника;

- пополнение и хранение депо некоторых витаминов (особенно велики в печени запасы жирорастворимых витаминов A, D, водорастворимого витамина В12), а также депо катионов ряда микроэлементов— металлов, в частности катионов железа, меди и кобальта;

- обезвреживание различных чужеродных веществ (ксенобиотиков), в частности аллергенов, ядов и токсинов, путём превращения их в безвредные, менее токсичные или легче удаляемые из организма соединения;

- обезвреживание и удаление из организма избытков гормонов, медиаторов, витаминов, а также токсичных промежуточных и конечных продуктов обмена веществ, например аммиака, фенола, этанола, ацетона и кетоновых кислот;

Печень также служит депо для довольно значительного объёма крови, который может быть выброшен в общее сосудистое русло при кровопотере или шоке за счёт сужения сосудов, кровоснабжающих печень (Watson J.P. et al., 1999; Braun U., 1994; Newberne P.M., 1986).

В связи с многочисленными функциями печени и ее расположением относительно других органов она чаще подвергается негативному влиянию различных фактов, что приводит к развитию патологических процессов и метаболическим нарушениям в организме животных. В литературе последнего десятилетия проблемам нарушения функции печени у животных уделено большое внимание. Распространенность заболеваний печени и желчных путей давно достигло масштабов экономической проблемы (Кузнецов Н.И., 1990; Кузьминова Е.В. и др. 2011; Байматов В.Н., 2000).

Различают такие патологии печени как гепатит, фиброз, цирроз, холе-стаз, очаговые и сосудистые поражения, метаболические нарушения и жировая печень, врожденные нарушения развития печени, опухоли печени и внут-рипеченочных желчных протоков, болезни желчного пузыря и внепеченоч-ных желчных протоков (Шарабрин И.Г. и др., 1985; Reiter R., Wendel А., 1983; Locker J., 1986; Devaux P. F. 1992).

Среди всех патологий печсии в настоящее время гепатозы считают -одной из часто встречаемых. Гепятоз - общее название ряда болезней печени, характеризующихся первичным нарушением обмена веществ в гепатоци-тах и морфологически проявляющихся их дистрофией без существенной клеточной реакции (Байматов В.Н., 1990; Hollander D., 1990). Наиболее полную классификацию гепатозов дал Б.В. Уша (1979), который выделил следующие разновидности их в зависимости от этиологии.

1. Первичная дистрофия печени - вызывается испорченными кормами, ядами растительного происхождения (алкалоиды, сапонины) и животного происхождения, односторонним белковым кормлением, перекормом концентратами, жомом, бардой, недостатком аминокислот (метионина, холина, цис-теина).

2. Экзотоксическая дистрофия - отравление животных ядами минерального, растительного и микотического происхождения.

3. Послеродовая дистрофия, обусловленная несбалансированным рационом при высокой молочной продуктивности животного, перекормом концентратами и отсутствием активного моциона на пастбищах.

4. Вторичная дистрофия - развивается вследствие интоксикации при инфекционных и незаразных заболеваниях (гастритах, энтеритах, эндометритах и др.).

В зависимости oi устойчивости организма, силы и времени действия причин, гепатозы могут протекать в следующих формах: скрытая (латентная); манифестирующая (период клинически выраженных признаков) и хроническая. А в зависимости от преобладания нарушенного обмена различают белковую, амилоидную, углеводную, жировую и смешанные дистрофии, а также токсическую гепатодистрофию, пигментный и холестатический гепа-тоз.

Гепятит - общее название воспалительных заболеваний печени; бывает вирусным или реактивным проявлением различных интоксикаций ядами растительного, грибкового и минерального происхождений, инфекционных и

инвазионных болезней; зачастую диффузного характера, сопровождающееся гиперемией, клеточной инфильтрацией, дистрофией, некрозом и лизисом ге-патоцитов и других структурных элементов, резко выраженной печёночной недостаточностью. По течению различают острый гепатит, протекающий с воспалением паренхимы органа и хронический гепатит, характеризующийся воспалительно-дистрофическими изменениями с умеренно выраженным фиброзом. Встречается серозный, паренхиматозный, гнойный и пролифера-тивный. По месту локализации гепатит бывает активный и персистирующий, перипортальный, портальный и лобулярный гепатиты.

Гнойный гепатит - остро, подостро и хронически протекающие заболевание печени с образованием гнойных очагов в печени. Этиология: зачастую возникает вторично, метастатически или путем занесения гноеродных бактерий из других органов с током крови. Также может развиваться вокруг погибших эхинококков, туберкулезных и актиномикозных очагов, в результате ран нанесённых инородным телом.

Паренхиматозный гепатит - воспаление печени, выражающееся комплексом альтернативных, экссудативных и пролиферативных изменений возникающих в органе.

Серозный гепатит - воспаление печени, характеризуется выпотом из сосудов прозрачной жидкости, содержащей сывороточный белок и незначительное число лейкоцитов, клеток мезотелия.

Пролиферативный гепатит - воспаление органа с преобладанием процессов пролиферации клеточных элементов и образованием гранулем.

Цирроз печени - группа хронически протекающих болезней печени различной этиологии, характеризуется дистрофией и некрозом паренхимы печени, диффузным разрастанием соединительной ткани и глубокими структурными изменениями в органе. Цирроз печени можно рассматривать как хроническое неспецифическое пролиферативное (интерстициальное) воспаление печени. Различают атрофические, гипертрофические, постнекротические, биллиарные, инфекционные и паразитарные циррозы. Цирроз часто яв-

)

ляется следствием гепатитов и гепатозов. Этиология заболевания циррозом печени в первичной форме связаны с определенными местностями где они встречаются в виде энзоотий. Наличие в кормах ядовитых растительных веществ, вредное действие испорченных заплесневелых кормов, воздействие эндогенных ядовитых веществ. Инфекционный материал (паратифозная инфекция, туберкулёз). Вторичные формы цирроза развиваются из дистрофии печени, токсического отека печени, паразитарный цирроз печени (миграция личинок).

Билиарный цирроз встречается при застое желчи, связанном с закупоркой выводных протоков, воспалении желчевыводящих протоков и желчного пузыря.

Инфекционные циррозы - встречаются при инфекционных заболеваниях связанных с поражением печени.

Паразитические циррозы - возникают при наличии паразитарных агентов в печени протекают по типу атрофических и билиарных циррозов.

Постнекротический цирроз - развивается в результате обширных некрозов печеночной паренхимы, ведущих к печеночной недостаточности.

Атрофический цирроз - возникает в результате нарушения общего или местного питания, происходит деструкция структурных единиц печени, что ведет к уменьшению объема органа и неправильному его функционированию.

Гипертрофический цирроз - развивается в результате диффузного междолькового и внутридолькового разрастания соединительной ткани, в следствие чего происходит нару