Фармако-токсикологические свойства гепатопротектора Диронакс

Дударев, Артур Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Фармако-токсикологические свойства гепатопротектора Диронакс
ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Фармако-токсикологические свойства гепатопротектора Диронакс"

ДУДАРЕВ АРТУР АЛЕКСАНДРОВИЧ

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГЕПАТОПРОТЕКТОРА ДИРОНАКС

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 4 АВГ 2014

Краснодар - 2014

005551715

Работа выполнена на кафедре морфологии, патологии, фармации и незаразных болезней ФГБОУ ВПО Башкирский государственный аграрный университет.

Научный Доктор ветеринарных наук, доцент, заместитель директора по вете-

руководитель: ринарии ООО «Подивит» Кильметова Инна Робертовна

Научный Доктор технических наук, директор ООО «Базис»

консультант Струнпн Борис Павлович

Официальные Доктор ветеринарных наук, научный консультант отдела фармако-оппоненты: логии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии Самотпн Анатолий Митрофанович

Доктор ветеринарных наук, профессор кафедры общей патологии МГАВМиБ имени К.И. Скрябина Байматов Валерий Нурмухаме-тович

Ведущая ФГБОУ ВПО Воронежский государственный аграрный университет

организация: имени Императора Петра I

Защита состоится 05 сентября 2014 г. в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 220.038.07 в Кубанском государственном аграрном университете по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13.

Автореферат размещен на официальном сайте ФГБОУ ВПО «Кубанский ГАУ» http://www.kubsau.ru 03 июля 2014 г. и официальном сайте ВАК РФ -http://vak.ed.gov.ru.

Автореферат разослан <^»^^/2014 г.

Учёный секретарь диссертационного совета д.в.н.

Родин Игорь Алексеевич

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время заболевания печени являются общемировой проблемой. Способность печени, как центрального органа процессов метаболизма, обмена ферментов, гормонов, микроэлементов и витаминов, нейтрализации токсинов к выполнению своих функций нередко снижается из-за многочисленных веществ, к которым относятся, в том числе, и некоторые лекарственные средства, при приеме в высоких, а иногда и в терапевтических дозах, повреждающие орган (В.Н. Денисенко, 2006; Е.Б. Бажибина, 2007; T.D. Gould, 2009).

Острые и хронические заболевания печени и желчевыводящих путей были и остаются важной проблемой ветеринарной медицины. Поскольку болезни печени широко распространены, их профилактика, лечение, изыскание способов ранней диагностики, коррекции нарушений метаболизма у животных являются одной из острых проблем в теоретической и практической работе (В.Н. Байматов, 1998; Г. Мюллер, 2006; C.B. Оковитый, 2010).

Несмотря на успехи в медицине и ветеринарии, обычные средства для лечения гепатопатий имеют нежелательные побочные эффекты, малоэффективны и являются дорогостоящими. Следовательно, существует большая потребность в безопасных альтернативных терапевтических средствах для лечения болезней печени (A.C. Логинов, 1997; В.А. Антипов, 2010; В. Бьюрж, 2010).

На отечественном рынке в настоящее время имеется широкий спектр препаратов и кормовых добавок, способствующих восстановлению печени при гепатопатиях различной этиологии, таких как гепатовет, лиарсин, глютаМакс, гепалон, полифепан, гепавет, гепатоджект, дюфалайт, гептрал, эссенциале, гепатосан, хофитол, аллохол, метионин, силимарин, лив 52, билигнин, фосфоглив, липоевая кислота, зиксорин и другие (Б.В. Уша, 2002; B.C. Бузлама, 2003; С. Кайзер, 2010).

Применение препаратов для лечения гепатопатий требует во многих случаях терапии в течение нескольких недель, часто с повторным курсом приёма, в результате чего затраты на лечение животных значительно повышаются. В связи с этим возникает необходимость в разработке гепатопротекторов, имеющих невысокую стоимость и не требующих длительного курса лечения.

В настоящее время разработан отечественный гепатопротектор Диронакс (дии-зопропиламмония дихлорацетат). Препарат синтезирован в ООО «Базис» (г.Уфа) под руководством доктора технических наук Б.П. Струнина.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение токсико-фармакологических свойств гепатопротектора Диронакс и его применение в ветеринарной практике для профилактики и лечения болезней печени.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- определить массовую долю основного вещества, изучить стабильность и подтвердить кристаллическую структуру Диронакса;

- дать токсикометрическую оценку Диронакса (острая и субхроническая токсичность, влияние на центральную нервную систему, функцию почек, массу внутренних органов):

- изучить влияние Диронакса на функциональное состояние печени на моделях эксперимент&чьных гепатитов;

- определить терапевтическую эффективность Диронакса при гепатите собак и кошек;

- определить экономическую эффективность применения Диронакса в ветеринарии.

Научная новизна. Впервые по новой технологии синтезирован отечественный гепатопротекторный препарат Диронакс и доказана его химическая структура. Впервые проведены исследования широкого комплекса токсикологических показателей гепато-протектора Диронакс, позволившее выявить степень безопасности его применения. Установлено, что препарат Диронакс относится к четвёртому классу опасности.

Впервые изучены его токсико-фармакологические свойства, влияние на массу внутренних органов, функциональное состояние печени при экспериментальных гепатитах, морфологические и биохимические показатели крови у лабораторных и домашних животных, в частности, у кошек и собак. Препарат имеет положительные показатели на основании доклинических и производственных исследований.

Практическая значимость. Выполненные исследования и полученные результаты позволяют предложить препарат Диронакс как гепатопротектор при заболеваниях печени различной этиологии у собак и кошек. Предложенная доза не вызывает отрицательного действия и обладает лечебным действием.

Результаты исследований использованы в учебном процессе при преподавании дисциплины «Болезни собак» и «Болезни кошек» для студентов факультета биотехнологий и ветеринарной медицины.

Управлением ветеринарии Республики Башкортостан утверждены «Научно-практические рекомендации по применению гепатопротектора Диронакс для лечения домашних животных».

Апробация работы. Результаты экспериментальных и клинических исследований, являющиеся основой диссертации, доложены, обсуждены и одобрены на V Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных « Молодежная наука и АПК: программы и перспективы» (Уфа, 2012), на II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Состояние и перспективы увеличения производства высококачественной продукции сельского хозяйства» (Уфа, 2013), на VI Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных «Наука молодых - инновационному развитию АПК» (Уфа, 2013), на Международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию ФГБОУ ВПО Ижевская ГСХА «Научное обеспечение АПК. Итоги и перспективы» (Ижевск, 2013).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 8 научных статьях, 4 из которых - в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Осповные положения диссертации, выносимые на защиту:

- определение массовой доли основного вещества, подтверждение его структуры и стабильности;

- токсикологическая характеристика препарата Диронакс;

- фармакологическая эффективность препарата Диронакс при экспериментальном поражении печени на модели острого гепатита у крыс;

- фармакологическая эффективность препарата Диронакс при гепатите у кошек и собак.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, библиографического списка и приложений. Изложена на 154 страницах компьютерного набора. Иллюстрирована 15 рисунками и 26 таблицами. Библиографический список включает 189 источников, в том числе 39 - иностранных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнялась с 2011 по 2014 гг. на кафедре морфологии, патологии, фармации и незаразных болезней ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет», в институте органической химии Уфимского научного центра РАН, государственном бюджетном учреждении «Уфимская городская ветеринарная станция», в обществе с ограниченной ответственностью «Базис»(г.Уфа).

Основной объект исследований — субстанция / препарат Диронакс — диизопро-пиламмония дихлорацетат, синтезируемый ООО «Базис» (г.Уфа). "

Массовую долю основного вещества определяли с помощью метода, основанного на реакции образования цветного комплекса диизопропиламмония дихлорацета-та с бромтимоловым синим. По результатам исследований было установлено, что массовая доля основного вещества составила 99,8%.

Качественное определение Диронакса проводили методом инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье. Измерения в среднем диапазоне порошкообразных образцов выполняли методом прессования образцов в таблетки и измерения спектров в режиме пропускания. Исследуемые образцы были сначала измельчены в тонкий порошок, а потом перемешаны с непоглощающим веществом - КВг. Измельченный и смешанный с КВг образец помещали непосредственно в стаканчик для образца, поверхность образца выравнивали и потом вводили в приставку диффузного отражения для измерений.

Изучение стабильности лекарственного препарата Диронакс проведено на трёх последующих сериях: 040, 041, 042 методом ускоренного старения при температуре 45°С в полимерных флаконах, укупоренных крышками с контролем первого вскрытия по 100 г., 200 г., 300 г.

Определение кристаллической структуры Диронакса было выполнено методом монокрисгального рентгеноструктурного анализа (РСтА). Рентгеноструктурный анализ монокристаллов Диронакса проведён в Отделении рентгеиоструктурных исследований Центра коллективного пользования ЦКП САЦ на базе Лаборатории дифракционных методов исследований ИОФХ им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН.

Кристаллографические характеристики соединения, параметры экспериментов и уточнения структур выполнены на автоматическом рентгеновском дифрактометре Bruker Smart Apex II CCD (MoK„ графитовый монохроматор X 0.71073 А 293 К). Структура была расшифрована с использованием программы SHELXS и уточнена методом наименьших квадратов с использованием программы SHELXL. Все неводородные атомы уточнены в анизотропном приближении. Координаты атомов водорода (за исключением атомов водорода аминогруппы) рассчитаны на основе стереохимиче-ских критериев и уточнены по соответствующим моделям «наездника». Координаты атомов водорода аминогруппы выявлены из разностных карт электронной плотности и уточнены на заключительных стадиях в изотропном приближении. Сбор, редактирование данных и уточнение параметров элементарной ячейки выполнены с использованием пакета программ APEX 2. Все расчёты произведены с использованием пакета программ WinGX. Анализ межмолекулярных взаимодействий проведён с использованием программы PLATON. Программа Mercury использовалась для выполнения рисунков.

В лабораторных и экспериментальных опытах было использовано 36 белых мышей, 352 белые крысы, 8 собак, 8 кошек.

Лабораторные животные содержались в одинаковых зоогигиенических условиях вивария. Кормление животных проводили согласно суточной потребности лабора-

торных животных (СанПиН. Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) М.:Закон, 1999).

Общетоксические свойства Диронакса были изучены и определены в соответствии с «Методическими указаниями по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве», утверждёнными ГУВ СССР и «Методическими рекомендациями по токсикоэкологической оценке лекарственных средств, применяемых в ветеринарии», одобренных секцией отделения ветеринарной медицины РАСХН (1998).

Опыты проводили с соблюдением принципов, изложенных в Европейской Конвенции по защите животных, используемых для экспериментальных целей (г. Страсбург, Франция 1986; Хабриев Р.У., 2005).

Перед началом опыта животных взвешивали и рассчитывали количество препарата для каждого животного индивидуально в миллиграммах на 1 кг массы животного. На каждую группу брали не менее б животных, подобранных по принципу аналогов. Исследуемый препарат вводили церорально при помощи ротожелудочного зонда.

Параметры острой токсичности препарата вычислялись с помощью пробит-анализа по методу Литчфильда и Уилкоксона (Беленький M.JI., 1963).

Значения LDgj и LDi6, найденные по характеристической кривой, использовались для вычисления коэффициента вариабельности смертельных доз, который характеризовали зону токсического действия и вычислялись как отношение LDS4 к LDi6.

Изучение субхронической токсичности проводили на белых крысах массой 170-190 г в течение 30 дней. Морфологические исследования крови проводили на гематологическом анализаторе Abacus junior vet, а также общепринятыми методами (Воронин, Е.С., 2003). Выведение лейкограммы проводили с помощью окрашивания мазков по Романовскому-Гимзе.

Биохимические показатели крови (общий белок, глюкоза, холестерии, билирубин, щелочная фосфатаза, аланин-аминотрансфераза (АлАТ), аспартат-аминотранс-фераза (АсАТ), определяли на биохимическом и иммуноферментном автоматическом анализаторе ChemWell Combo и по общепринятым методам (Антонов, Б.И., 1989; 1991; Воронин, Е.С., 2003).

Исследование влияния препарата Диронакс на изменение массы внутренних органов изучали на беспородных белых крысах со средней живой массой 170-190 г. Были созданы 4 группы: 3 опытные н контрольная (интактная) по 15 животных в каждой группе. Исследуемый препарат ежедневно вводили перорально из расчета 1/10, 1/20 и 1/50 от среднелеталыюй дозы в течение 30 дней. Животных на 30-е сутки дека-питировали под наркозом и производили взвешивание внутренних органов.

Влияние препарата Диронакс на центральную нервную систему проводили, исследуя ориентировочные реакции и исследовательский рефлекс крыс. Влияние препарата на функцию почек изучали в течение 30 дней. Для этого были подобраны на крысы средней массой 170-190 г. Исследуемый препарат вводили перорально в эффективной дозе 25 мг/кг. На 30-е сутки эксперимента исследовали влияние препарата на диурез. Мочу собирали с помощью индивидуальных мочесборников у животных, получивших водную нагрузку 5 мл на 100 г массы животного. За 12 часов до начала опыта животных лишали пищи и воды. Количество мочи измеряли каждый час в течение 3-х часов.

Гепатозашттюе действие препарата Диронакс изучали на экспериментальных моделях поражения печени четырёххлористым углеродом, парацетамолом и этанолом.

Определение эффективной дозы исследуемой дозы было проведено на модели острого СС14 - гепатита на 96 белых беспородных крысах линии Wistar обоего пола массой 170-200 г. Экспериментальный гепатит воспроизводился путём одно-, двух-, трёхдневного внутрибрюшишюго введения 50%-го раствора СС14 в дозе 0,4 мл на 100 г веса крысы.

Диронакс (20, 25, 30 мг/кг) исследовали при пероральном способе введения. Вводили по следующей схеме: каждый день, начиная с первого дня введения СС14 (в течение 3-х дней) за 1 час до введения гепатотоксина и в течение последующих 25 дней в одно и то же время до кормления животных.

Эффективность Диронакса при экспериментальном поражении печени парацетамолом изучали на 80 крысах линии Wistar обоего пола, массой 170-210 г. Лекарственное поражение печени воспроизводили введением парацетамола в желудок в дозе 500 мг/кг в течение двух дней. Изучаемые соединения и препарат сравнения вводили перорально на протяжении 30 дней, начиная с первого дня эксперимента (одновременно с введением гепатотоксина). Биохимические показатели и желчегонную активность исследовали на 10-й, 20-й, 30-й день эксперимента. Исследуемые соединения вводили в эффективной дозе (25 мг/кг), рассчитанной на модели поражения печени четырёххлористым углеродом. В качестве препарата сравнения использовали Карею «Софарма» в дозе 25 мг/кг.

Эффективность Диронакса при экспериментальном поражении печени этанолом изучали на 80 крысах обоего пола линии Wistar, массой 170-190 г. Экспериментальное повреждение печени у крыс вызывали пероральным введением 40% раствора этанола в дозе 1,2 мл на 100 г массы животного в течение 4-х дней. Диронакс и препарат сравнения Карсил «Софарма» по 25 мг/кг каждый вводили перорально при помощи зонда на протяжении 30 дней с первого дня эксперимента.

Для гистологических исследований кусочки печени крыс фиксировали в 10%-ном водном растворе нейтрального формалина, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации, заливали в парафин по общепринятой методике. Срезы получали на замораживающем микротоме после депарафинании и окрашивали гематоксилином Манера и эозином, по Романовскому-Гимза, Ван Гизону по общепринятым методам (Г.А.Меркулов, 1969).

Микроскопические исследования проводили с использованием светового микроскопа JENAVAL фирмы «CARL ZEISS» (Германия).

Для оценки влияния препарата Диронакс при остром гепатите были сформированы опытные группы из домашних животных (собаки и кошки), поступивших в ветеринарную лечебницу. В каждой группе наблюдалось не менее 8 животных. Анализ крови проводили в день поступления заболевших животных, а также на 10-й и 20-п дни наблюдения.

Экономическую эффективность устанавливали по «Методнке определепия экономической эффективности ветеринарных мероприятий» (Ветеринарное законодательство, 2000).

Результаты проведённых исследований обрабатывали статистически с применением метода вариационной статистики и проверкой достоверности результатов с использованием уровня значимости и критерия Стьюдента (Р). Достоверность различий оценивали при Р< 0,05 (ГОСТ 11.004-72, Г.Ф.Лакин, 1990).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Качественное п количественное определение Дпронакса

Определение массовой доли Дпронакса осуществляли с помощью метода, основанного на реакции образования цветного комплекса диизопропиламмония дихлор-ацетата с бромтимоловым синим. Интенсивность окрашивания при этом пропорциональна концентрации диизопропиламмония дихлорацетата. Реакция осуществлялась при рН=6,8.

Массовую долю основного вещества в процентах вычисляли по формуле: % = С* 10-6* 100*50* 100/т = 0,5 *С/т, где

С - количество диизопропиламмония дихлорацетата, определенное по

калибровочному графику пробы, г.

m - навеска пробы, г.

За результат анализа принимали среднее арифметическое трёх параллельных определений, абсолютное расхождение между которыми не превышает допустимое расхождение, равное 1,0%. Допустимая относительная погрешность результатов анализа ± 6,5%, при доверительной вероятности 0,05.

По результатам исследований было установлено, что массовая доля основного вещества составила 99,8%.

Качественное определение. Структура Диронакса была подтверждена с помощью Фурье-спектроскопии (англ. Fourier-transformed spectroscopy) - метода оптической спектроскопии, позволяющего получать спектр в результате обратного Фурье-преобразования интерферограммы исследуемого излучения, зависящей от оптической разности хода двух лучей и представляющей собой Фурье-образ спектра (функцию распределения энергии излучения по частоте). Измерение проводили на приборе Vec-tor-22 фирмы BRUKER.

Измерения в среднем диапазоне порошкообразных образцов выполняли методом прессования образцов в таблетки и измерения спектров в режиме пропускания. Исследуемые образцы были сначала измельчены в тонкий порошок, а потом перемешаны с непоглощающим веществом - КВг. Измельченный и смешанный с КВг образец помещали непосредственно в стаканчик для образца, поверхность образца выравнивали и потом вводили в приставку диффузного отражения для измерений.

Характеристические шкалы спектра Диронакса полностью совпадают со шкалами стандартного образца диизопропиламмония дихлорацетата, находящегося в библиотеке прибора, что подтверждает его структуру.

3.2 Изучение стабильности Дпронакса

Изучение стабильности лекарственного препарата Диронакс проведено на 3-х последующих сериях: 040, 041, 042 методом ускоренного старения при температуре 45°С в полимерных флаконах, укупоренных крышками с контролем первого вскрытия по 100 г, 200 г, 300 г. В течение всего эксперимента поддерживалось строгое соблюдение температурного режима. Для этого использовали ультратермостаты, позволяющие поддерживать температуру на заданном уровне с точностью ±(0,2-1)°С. Свойства препарата изучались непосредственно перед опытом, затем на 46-е, 91-е, 137-е и 182-е сутки опыта. Стабильность препарата оценивалась визуально (порошок белого цвета), ИК-спектрометрией и определением массовой доли основного вещества. Результаты испытания приведены в таблице 1.

Таблица 1 Физико-химические показатели Диронакса

Номер серии Длительность анализа при 45°С, с\гг. Срок годности при 20°С, год Описание Подлинность Количественное определение диизопропиламмония дихлорацетата %* масс, препарата

1 2 3 4 5 6

Порошок белого цвета Качественные реакции 1. диизопропиламмония дихлорацетат. ИК-спекгроскопия ИК-спектр поглощения субстанции с КВг в области от 434 до 4000 см-1, должен иметь полное совпадение полос поглощения с полосами поглощения спектра стандартного образца диизопропиламмония дихлорацетата.

040 0 0 соответствует подтвержд. 99,7

040 46 0.5 соответствует подтвержд. 99,6

040 91 1.0 соответствует подтвержд. 99,6

040 137 1.5 соответствует подтвержд. 99,5

040 182 2.0 соответствует подтвержд. 99,3

041 0 0 соответствует подтвержд. 99,3

041 46 0,5 соответствует подтвержд. 99,2

041 91 1.0 соответствует подтвержд. 99,2

041 137 1.5 соответствует подтвержд. 99,1

041 182 2.0 соответствует подтвержд. 99,0

042 0 0 соответствует подтвержд. 99,2

042 46 0.5 соответствует подтвержд. 99,2

042 91 1.0 соответствует подтвержд. 99,0

042 137 1.5 соответствует подтвержд. 99,0

042 182 2.0 соответствует подтвержд. 98,9

По результатам проведенного исследования можно сделать вывод, что экспериментальный срок годности Диронакса при 45°С в полимерных флаконах, укупоренных крышками с контролем первого вскрытия составляет 182 суток, что соответствует сроку годности в 2 года при 20° С.

3.3 Определение кристаллической структуры Диронакса

Нами была изучена кристаллическая структура Диронакса методом монокри-сталыюго рентгеноструктурного анализа (РСтА).

Бесцветные пластинчатые монокристаллы диизопропиламмония дихлорацетата были получены из раствора в термостатированных условиях при 20°С, с точностью до 0,1°С при медленном испарении

Рентгеноструктурный анализ монокристаллов диронакса проведён в Отделении рентгеноструктурных исследований Центра коллективного пользования ЦКП САЦ на базе Лаборатории дифракционных методов исследований ИОФХ им. А.Е.Арбузова КазНЦ РАН.

Эксперимент выполнен на автоматическом рентгеновском дифрактометре Bruker Smart Apex II CCD (MoÄ"„ графитовый монохроматор >. 0.71073 А 293 К). Структура была расшифрована с использованием программы SHELXS и уточнена методом наименьших квадратов с использованием программы SHELXL. Все неводородные атомы уточнены в анизотропном приближении. Координаты атомов водорода (за исключением атомов водорода аминогруппы) рассчитаны на основе стереохимических критериев и уточнены по соответствующим моделям «наездника». Координаты атомов водорода аминогруппы выявлены из разностных карт электронной плотности и уточнены на заключительных стадиях в изотропном приближении. Сбор, редактирование данных и уточнение параметров элементарной ячейки выполнены с использованием пакета программ APEX 2. Все расчёты произведены с использованием пакета программ WinGX. Анализ межмолекулярных взаимодействий проведен с использованием программы PLATON. Программа Mercury использовалась для выполнения рисунков.

В целом, упаковка молекул соединения в кристалле характеризуется образованием бислоевых супрамолекулярных структур с внутренними гидрофильными фрагментами молекул н внешними гидрофобными сторонами, состоящими из хлорсодер-жащих фрагментов. Причем, внутри подобного бислоя Н-связанные цепочки анионов и катионов плотно упаковываются вдоль кристаллографического направления Ос, но существенных межмолекулярных взаимодействий (за исключением обычных Ван-дер-ваальсовых) между цепочками не наблюдается.

3.4 Токсикологическая оценка Диронакса

Одним из параметров установления активности Диронакса было определение его токсичности, так как её выявление может стать основной причиной токсикозов у животных.

3.4.1 Острая токсичность Диронакса

Исследование острой токсичности Диронакса направлено на установление количественных параметров токсичности данного химического соединения, изучение характера его действия и специфического токсического эффекта. Гибель животных после однократного воздействия вещества может наступить не сразу: сроки смерти зависят от механизма действия вещества, поэтому в токсикологии принято наблюдать за животными в течение 14-ти суток.

Острую токсичность Диронакса определяли на мышах массой 18,0-20,0 г, подобранных по принципу аналогов (с учётом возраста, пола, массы тела и клинического состояния).

Животные содержались при постоянном доступе к воде и пище. Кормление проводили согласно нормам, принятым для лабораторных животных.

Регистрацию гибели животных осуществляли в течение первых суток после введения препарата, затем наблюдение за животными проводили в течение 14-ти суток (регистрировали клиническое состояние, характер токсического действия введённого препарата, поведение, двигательную активность, поедаемость корма и отправление физиологических функций), так как сроки смерти зависят от механизма действия препарата Диронакс.

Исследуемое вещество вводили внутрь вместе с водой однократно индивидуально по 0,5 мл на мышь в дозах от 1000 мг/кг до 7000 мг/кг. Токсическое воздействие Диронакса оценивали по срокам гибели, числу павших животных, по состоянию и поведению животных.

В результате проведённых исследований нами установлено, что однократное введение Диронакса в дозе 3000 мг/'кг не вызывает изменений клинической картины токсикоза у белых мышей. При увеличении дозы с 5000 мг/кг до 7000 мг/кг массы тела признаки отравления проявлялись через 6-10 часов после введения Диронакса. Смерть наступала через 20-24 часа после введения препарата в токсических дозах.

Среднесме'ртельная доза (Ы)5о) препарата составляет для белых мышей 5450 мг/кг (5068+5784), 1Л),6=5000 мг/кг. 1Х>84=6000 мг/кг.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что согласно ГОСТ 12.1.007. - 76 Диронакс относится к четвёртому классу опасности (малоопасные вещества).

3.4.2 Субхроннческая токсичность Диронакса

Субхроническую токсичность Диронакса изучали на 60 белых беспородных крысах массой 160-190 г в течение 30 дней, которые были разделены на 4 группы по 15 животных в каждой.

Первые три опытные группы животных получали водный раствор Диронакса из расчета 1/10, 1/20 и 1/50 от среднелетальной дозы, соответственно. Четвёртая группа животных служила контролем. В начале опыта, через 15 и 30 дней у животных оценивали токсическое действие по следующим параметрам: интегральные показатели (внешний вид, симптомы интоксикации, прирост массы тела, потребление пищи и воды); биохимические показателгг крови (уровень белка, холестерина, билирубина, ами-нотрансфераз: АлАТ, АсАТ); на периферическую кровь (лейкоциты, эритроциты, гемоглобин). Кроме того, внутренние органы подвергались визуальному осмотру.

В течение всего эксперимента не отмечали падежа жггвотньгх. Поведение животных и внешний вид волосяного покрова и кожи на протяжении эксперимента оставались без изменений.

Показатели морфологического состава крови, её биохимические параметры не выходили за пределы колебаний физиологической нормы в течение всего эксперимента. Биохимические показатели крови изменились лишь к 30-му дггго.

Весовые коэффициенты внутренних органов животных, получавших Диронакс, незначительно повысились относительно контрольных животных лишь к 30-му дню эксперимента. При визуальном осмотре они не отличались от органов животных контрольной группы. Незначительные сгустки крови обнаружены лишь на внутренних органах крыс 1-й группы.

В результате проведенных исследований установлено, что Диронакс при перо-ральном введении не вызывает значительных изменений морфологических и биохимических показателей периферической крови, незначительно влияет на массу органов крыс и не вызывает гибели животных.

3.4.3 Влпяпне Диронакса на функцию почек

Влияние препарата на мочевыделительную систему изучали на 60 белых беспородных крысах массой 160-190 г в течение 30 дней. Животным ежедневно вводили в желудок с помощью зонда водный раствор Диронакса в эффективной дозе 25 мг/кг. На 30-е сутки эксперимента исследовали влияние препарата на диурез.

Как видно из таблицы 2, в начале эксперимента уровень выделяемой мочи практически не отличался у опытных и контрольной группы и составлял 2,7±0,19 мл и 3,03±0,14 мл, соответственно. На 30-е сутки опыта в группе опытных крыс, получавших Диронакс в дозе 25 мг/кг, суммарное количество мочи за 3 часа составило 3,18±0,14 мл, тогда как в контроле - 2,91±0,19 мл.

Таблица 2 Влияние препарата Диронакс на диурез крыс (п=б)

Соединение Доза, мг/кг Время наблюдения, сут. Количество мочи, мл

через 1 час через 2 часа через 3 часа всего

Диронакс 25 исходное 0.77±0,10 1,03±0,15 0,9±0,Ю 2,7±0,19

через 30 суг. 1,3±0,20 0,82±0,07 1,07±0,17 3,18±0.14

Контроль - исходное 1,27±0,21 0,68±0,12 1,1 ±0,26 3,03±0,14

через 30 сут. 1,12±0,15 1,12±0,14* 0,67±0,14 2,91±0,19

* - достоверно по отношению к исходным данным (Р < 0,05).

В течение всего эксперимента во всех группах моча была светло-жёлтого цвета, прозрачная, без примесей и резкого специфического запаха. Акты мочеиспускания были произвольными и производились в естественной позе.

Таким образом, согласно данным, приведённым в таблице, диурез у опытных животных через 30 дней введения соединения аналогичен таковому у контрольных, что позволяет сделать вывод, что Диронакс не влияет на функцию почек.

3.4.4 Влияние Диропакса на центральную нервную систему

Для изучения влияния препарата Диронакс на функции центральной нервной системы крыс был использован тест «Открытое поле», для чего было сформировано 2 группы животных: опытная, животные которой получали Диронакс ежедневно в течение 30 дней в дозе 25 мг/'кг, и контрольная.

Через сутки после последнего введения препарата Диронакс в течение 3 минут регистрировали:

- число вертикальных стоек, как показатель неспецифического уровня возбуждения;

- число исследованных отверстий, отражающих исследовательскую активность;

- число актов чистки (грумминг), выявляющих эмоциональную активность.

После 30-дневного введения Диронакса число вертикальных стоек, исследуемых отверстий и актов чистки в течение 3 минут были аналогичны как в опытной, так и в контрольной группах.

Таким образом, длительное применение Диронакса не оказывает влияния на функцию центральной нервной системы.

3.4.5 Влияние Диронакса на детокспцирующую активность печени

Нами было изучено влияние препарата на функциональную активность печени. Изучали влияние Диронакса на продолжительность сна, вызванного гексеналом, хлоралгидратом и тиопенталом. На 21-е сутки эксперимента за 1 час до введения снотворных веществ животным перорально вводили Диронакс в дозе 25 мг/кг. Затем внутрибрюшинно вводили раствор гексенала в дозе 80 мг/кг в виде 0,2%-ного раство: ра, хлоралгидрат в дозе 325 мг/кг и тиопентал в дозе 35 мг/кг.

Эффект снотворных препаратов оценивали по длительности утраты гравитационного рефлекса. Продолжительность гексеналового и хлоралгидратового сна в опытных группах была больше, чем у контрольных животных, но разница статистически недостоверна. Продолжительность тиопенталового сна в группе опытных животных была достоверно меньше, чем в контрольной группе.

Таким образом, Диронакс не влияет на продолжительность снотворного действия гексенала и хлоралгидрата и не вызывает угнетения активности печени, но уменьшает продолжительность сна, вызванного тиопенталом. Уменьшение продолжительности сна, вызванного тиопенталом, может быть связано с усилением катаболизма препарата печенью под влиянием Диронакса.

3.5 Гепатопротекторное действие Диронакса

3.5.1 Эффективность Диронакса при экспериментальном пораженпп печени четырёххлорнстым углеродом

Определение эффективной дозы было проведено на модели острого гепатита, который воспроизводился путем одно-, двух-, трёхдневного внутрибрюшинного введения 50%-го раствора четырёххдористого углерода (СС14) в дозе 0,4 мл на ] 00 г веса крысы.

Диронакс (20, 25, 30 мг/кг) и Карсил (25 мг/кг) исследовали при пероральном способе введения. Вводили по следующей схеме: каждый день, начиная с первого дня введения СС14 (в течение 3 дней) за 1 час до введения гепатотокенна и в течение последующих 25 дней в одно и то же время до кормления животных.

Лечебное действие Диронакса определяли:

- по биохтпшеским показателям сыворотки крови крыс - уровню активности аланпн-и аспартат-аминотрансфераз сыворотки крови (АЛТ, АСТ) и по коэффициенту де Ритиса);

- по желчеобразователыюй функции печени (определяли общий объём выделенной желчи в мг на 100 г массы животного за 3 часа).

Во всех группах наблюдается повышение уровня АЛТ и билирубина, а так же понижение коэффициента де Ритиса относительно интактного контроля, что говорит о развитии гепатита после введения четырёххлористого углерода. Коэффициент де Ритиса (АСТ/АЛТ) в группе, получавшей Диронакс в дозе 25 мг/кг в течение 15-ти дней, соответствовал величине 0,88 ± 0,071 в группе Карсила - 1,02±0,087, в контроле - 0,69 ± 0,078.

На 20-й день эксперимента во всех группах было выявлено улучшение биохимических показателей крови, относительно контрольной группы (гепатит). Наиболее положительная динамика выявлена в группах, получавших Диронакс в дозе 25 мг/кг и Карсил, хотя величина АЛТ во всех группах была выше нормы в 1,3 раза, что говорит о неполном восстановлении функции печени.

На 25-й день эксперимента также отмечали положительную динамику во всех группах. В группах, получавших Диронакс в дозе 25 мг/кг и Карсил, биохимические параметры крови достигли пределов физиологической нормы (таблица 3). Так, количество общего билирубина составляло 6,1 ± 0,51 и 6,2 ± 0,42 мкмоль/л соответственно, тогда как в контрольной группе уровень этого параметра составлял 13,6 ±1,51 мкмол/л.

Таблица 3 Биохимические показатели крови крыс с СС14-индуцированным гепатитом на 25-й день эксперимента

Группа Коэффициент де Ритиса (АСТ/АЛТ) АЛТ, мккат/л АСТ, мккат/л Билирубин общий, мкмоль/л

Контроль (гепатит) 0,96 ± 0,043"' 0,0528 ± 0.003 0,051 ±0.003"" 13.6 ± 1.51

Карсил 25 мг/кг 1,06 ±0.068 0,0495 ± 0,005 0.051 ±0.002 6,2 ± 0.42

Диронакс 20 мг/кг 0.96 ± 0,089 0,047 ± 0.0026 0.044 ± 0,003 7,9 ± 0,81

Диронакс 25 мг/кг 1.01 ±0.12 0.0432 ± 0,0034 0.0425 ± 0.003" 6.1 ± 0.51"

Диронакс 30 мг/кг 0, 95 ±0,08 0.044 ± 0,003 0.041 ±0,0026 6.4 ± 0,62

* — достоверно по отношению к контрольной группе (Р<0,05); ** — достоверно по отношению к группе Карсил (Р<0,05); *** - достоверно по отношению к интактным животным (Р<0,02); **** — достоверно по отношению к интактным животным (Р<0,05).

После 15-дневного введения Диронакса в ежедневной дозе 25 мг/кг на фоне токсического гепатита, вызванного СС14, наблюдали выраженный желчегонный эффект по сравнению с другими группами в среднем в 1,5 раза (таблица 4).

Таблица 4 Желчеобразовательная функция печени на 15-й день эксперимента

—■—Группа Показатель -— Иитакгный контроль Карсил 25 мг/кг Диронакс 20 мг/кг Диронакс 25 мг/кг Диронакс 30 мг/кг

Относи I е::ьн:;я масса печени 0,040 ±0,0031 0,0335 ± 0,0024 0,034 ± 0.0014 0,030 ± 0,0012* 0,036 ± 0,002

Общее количество желчи, мг на 100 г за 3 часа 779,0 ± 35,87 826,1 ± 76,3" 992,5 ± 84.0' 1204,4 ± 72,7 848,7 ± 84,9

* — достоверно по отношению к контрольной группе (Р<0,01); ** — достоверно по отношению к контрольной группе (Р<0,05); *** — достоверно по отношению к интактным животным (Р<0,01).

На 20-й день эксперимента желчегонная активность печени в группах, получавших Диронакс и Карсил была значительно выше относительно группы контроля (гепатит).

В результате изучения гепатозащитного действия Диронакса в различных дозах, мы выявили наиболее эффективную дозу, которая составляет 25 мг/кг. В этой дозе Диронакс обладает выраженным желчегонным эффектом и способствует восстановлению функции печени уже "к 25-му дню.

Для гистологической оценки эффективности Диронакса было сформировано пять групп: в 1-Щ группах животным ежесуточно перорально вводили водный раствор Диронакса в дозе 20, 25 и 30 мг/кг, соответственно; животные IV группы находились на обычном рационе; контролем служили интактные особи (V группа).

Печень интактных животных (V группа) была неизменённой величины. Под микроскопом было установлено, что дольки имели светло-красную окраску. Меж-дольковые артерии и вены сопровождались желчными протоками и образовывали триады, хорошо видна междольковая соединительная ткань. Отчётливо видны внут-ридольковые (синусоидные) капилляры, которые располагались раздельно и сливались в центре. Гепатоциты располагались радиально.

Через 15, 20 и 25 суток после введения СС^ под микроскопом были выявлены изменения в печени и гепатоцитах (IV группа). Центральные вены и впадающие в них синусоиды были расширены и заполнены кровью, в печёночных пластинках наблюдалась их дискомплексация, гепатоциты имели нечёткую окраску, нечёткие границы, по периферии долек располагались набухшие гепатоциты с темными ядрами и зернистой цитоплазмой.

В клеточном детрите в зоне некроза отмечено скопление эритроцитов и лейкоцитов, глыбок пигмента в макрофагах. При гистологическом исследовании выявлены нарушения структуры печёночных тяжей, дистрофические изменения гепатоцитов, увеличение размера последних и появление клеток неправильной формы с ячеистой или сетчатой цитоплазмой. Наблюдались уменьшенные в объёме, сморщенные формы ядра гепатоцитов. Центральные вены били расширены и заполненные кровью. В междольковой соединительной ткани, портальных зонах, участках микронекрозов наблюдалась инфильтрация лимфоидными, плазматическими клетками, гистиоцитами и фибробластами. В некоторых дольках обнаружены очаги некроза, характеризующиеся кариолизисом гепатоцитов. Следовательно, после отравления к 20-му дню в печени белых крыс развивается паренхиматозный гепатит, характеризующийся альтеративными изменениями паренхимы, инфильтрацией стромы органа клетками гематогенного и тканевого происхождения.

В течение первых 15 суток в группах, где животным ежедневно вводился Диронакс, наблюдалась аналогичная картина, как и в IV группе. Далее отмечалось, что в участках печени с относительно хорошо сохранившейся паренхимой отмечено повышение вдела гепатоцитов с признакам! гипертрофии, что проявлялось увеличением появления большого количества ядрышек, появлением двухъядерных и делящихся печёночных клеток.

На 20-е сутки у животных, получавших Диронакс, после отравления четырёх-хлористым углеродом в печени выявлена белковая и жировая дистрофия гепатоцитов

центральных частей долек. В печени выявлены слабо выраженные признаю! венозной гиперемии и зернистой дистрофии гепатоцитов периферических участков долек, что свидетельствует о снижении гииоксического состояния.

Компенсаторно-приспособительные процессы в печени белых крыс характеризуются гипертрофией гепатоцитов, активацией белкового обмена, регенерацией паренхимы печени. К 25-му дню морфологические признаки функциональной активности печени белых крыс возвращаются к норме с сохранением зернистой дистрофии гепатоцитов в центральных зонах долек.

3.5.2 Эффективность Днронакса при экспериментальной поражении печени

парацетамолом

Опыты проведены на 80 крысах линии Wistar обоего пола, массой 170-210 г. Лекарственное поражение печени воспроизводили введением парацетамола в желудок в дозе 500 мг/кг в течение двух дней. Изучаемые соединения и препарат сравнения вводили перорально на протяжении 30-ти дней, начиная с первого дня эксперимента (одновременно с введением гепатотоксина). Биохимические показатели и желчегонную активность исследовали на 10-й, 20-й, 30-й день эксперимента.

Исследуемые соединения вводили в дозе 25 мг/кг, рассчитанной на модели поражения печени четырёххлористым углеродом. В качестве препарата сравнения использовали Карсил в дозе 25 мг/кг.

Было сформировано 3 группы (контроль гепатит, Карсил и Диронакс).

Желчегонную активность соединения оценивали по желчесекреторной (мг/мин на 100 г массы) и желчевыделигельной (общее количество желчи за 3 часа в мг на 100 г) функциям гепатоцитов. О гепатозащитном действии судили по активности ферментов аланинами-нотрансферазы (АЛТ) и аспаргатаминотрансферазы (ACT), билирубина в сыворотке крови.

Так, данные проведенных исследований свидетельствуют о том, что введение парацетамола в желудок в дозе 500 мг/кг в течение двух дней увеличивает содержание АЛТ на 80% и ACT на 9%. На фоне введения исследуемого соединения отмечается уменьшение активности биохимических показателей крови, характеризующих цитолиз и холестаз.

Коэффициент де Ритиса (ACT/АЛТ) в группах, получавших Карсил и Диронакс, в среднем был равен 1, что на 45-50% выше, чем в контрольной группе (гепатит) (таблица 5).

Таблица 5 Биохимические показатели сыворотки крови при экспериментальном поражении печени парацетамолом

Группа животных ACT, мккат/л АЛТ, мккат/л Коэффициент де Ритиса (АСТ/АЛТ) Билирубин общий, мкмоль/л

10-й день

Интактный контроль 0.045+0.0020 0,035+0,0020 1,28+0,044 4,9+0,22

Контроль (гепатит) 0.044±0.0036 0,063+0,0040 0,70+0,039 13,2+1,56

Карсил 0,043+0,0020 0.041 ±0,0031 1,08+0,080 9,6+0,50

Диронакс 0,046+0,0014 0,049+0,0019 0,94+0,017 11,4+0,58

20-й день

Контроль (гепатит) 0,049+0,0017 0.056±0,0048 0,89+0,056 10,1+0,71

Карсил 0,046±0,0015 0.039+0,0039 1,20+0,075 7,3+0,83

Диронакс 0,047±0.0012 0,047+0,0015 0,94+0,017 9,4+1,02

30-й день

Контроль (гепатит) 0,047±0.0026 0.50+0,0032 0,94+0,029 7,4+1.00

Карсил 0,047+0,0014 0,038±0,0015 1,24+0,071 5,2+0,24

Диронакс 0,046±0.0015 0,046±0,0012 0,98+0,036 6,7+0,94

При интоксикации парацетамолом наблюдаются значительные нарушения уровня билирубина. Содержание билирубина у больных животных было повышено в 2,7 раза по отношению к интактной группе. Днронакс и Карсил оказывали эффективное фармакотерапевтическое действие на функциональное состояние печени, снижая уровень билирубина в среднем на 20% по отношению к контрольной (гепатит) группе.

Также введение исследуемого соединения на фоне поражения печени парацетамолом увеличивает скорость секреции желчи и общее количество желчи по сравнению с контролем (гепатит).

Таким образом, введение Диронакса в эффективной дозе 25 мг/кг при поражении печени парацетамолом уменьшает выраженность синдромов цитолиза и холеста-за, приводит в норму уровень трансаминаз (ACT, АЛТ) и содержание билирубина, увеличивает интенсивность секреции и выделение желчи гепатоцитами.

3.S.3 Эффективность Диронакса при экспериментальном поражении печени

этанолом

Опыты проводили на 80 крысах обоего пола линии Wistar, массой 170-190 г. Было сформировано 3 группы: 1-я группа служила контролем, 2-я группа - Карсил (25 мг/кг) и 3-я группа - Диронакс (25 мг/кг).

На 10-й, 20-й и 30-й день эксперимента проводили оценку желчеобразователь-ной и гепатопротекгорной активности Диронакса. О степени выраженности воспалительных процессов в печени судили по отношению массы печени к массе тела.

Результаты проведенного исследования показали, что пероральное введение 40% раствора этанола в дозе 1,2 мл на 100 г живой массы в течение 4-х дней приводит к значительным изменениям биохимических показателей сыворотки крови. Повышаются уровни АЛТ (в 2,4 раза) и ACT (в 1,2 раза), наблюдается гипербилирубинемия (в 3,2 раза) по отношению к интактным животным. Биологическое действие соединения Диронакс на функциональное состояние печени при введении этилового спирта подобно влиянию известного препарата Карсил. Так, уже на 20-й день лечения у животных, получавших Диронакс и Карсил, коэффициент де Ритиса (АСТ/АЛТ) приблизился к 1, снизились уровни АЛТ, ACT и билирубина.

На 30-й день лечения Карсилом и Диронаксом наблюдаюсь повышение активности АЛТ. Так, её уровень составлял в контроле 0,060±0,0034 мккат/л, во второй группе - 0,040±0,0024 мккат/л и третьей группе - 0,051 ±0,0012 мккат/л.

Выраженность изменений в функциональном состоянии печени при поражении этанолом сопровождается также степенью угнетения желчеобразовательного и жел-чеотделительного процессов. У крыс, подвергнутых воздействию этанола, отмечается значительное снижение скорости секреции и падение общего количества желчи, что свидетельствует о развитии активности холестатического синдрома.

Диронакс и Карсил по сравнению с контролем (гепатит) увеличивают дебит желчи. На 30-й день лечения общее количество желчи за 3 часа (мг/100 г) в этих группах было выше, чем у интактных животных. Так, общее количество желчи на 10-й день у интакгных животных составляло 855,8±32,2 мг/100 г, у контрольных -591,2±37,3 мг/100 г, в группах, где вводили Карсил и Диронакс - 869,4±66,1 мг/100 г и 678,6±54,4 мг/100 г, соответственно.

На 30-й день опыта общее количество желчи за 3 часа составило в контрольной группе 789,9±61,3 мг/100 г, а в группах, где задавали Карсил и Диронакс, - 942,7±35,5 мг/100 г и 890,1±39,27 мг/100 г соответственно.

По результатам проведенных исследований можно сделать вывод, что введение Диронакса в дозе 25 мг/кг приводит к уменьшению проявлений интоксикации и восстановлению функционального состояния печени.

Лечение Диронаксом приводит к достоверному снижению АЛТ, ACT и билирубина по отношению к контролю (гепатит), а также нормализует желчегонную функцию печени.

3.6 Эффективность применение Днронакса при гепатите домашних животных

Целью данной работы является изучение гепатопротекторных свойств Днронакса при гепатите собак и кошек. Для опыта было отобрано по 8 животных в каждой группе. Собаки и кошки поступали в ветеринарную клинку в возрасте от 1 года до 6 лет. В опыте были использованы беспородные кошки и собаки мелких и средних пород (чау-чау, чихуахуа, той -терьеры и йоркширские терьеры и другие).

Диагностику гепатита у поступивших в ветеринарную лечебницу животных проводили с учётом анамнеза, клинических признаков, результатов ультразвукового • исследования органа, общего и биохимического анализа крови, исключалось инфекционное и паразитарное происхождение заболевания. При сборе анамнеза было установлено, что практически во всех случаях имело место кормление пищей «со стола» (молочные и кисломолочные продукты с высоким содержанием жира, свинина, птица с кожей и жирная птица, копчёности, сыр, кондитерские изделия).

У животных наблюдалась внезапная потеря аппетита, рвота, температура тела поднималась до 40-41°С. Отмечалось угнетение животных, одышка и учащённое дыхание, расстройство сердечно-сосудистой системы, болезненность печени при пальпации, диспепсические расстройства, зуд, шёрстный покров был тусклым и взъерошенным. При ультразвуковой диагностике печени устанавливали выраженную в разной степени неоднородность структуры, которая проявлялась чередованием участков сниженной, средней и относительно повышенной эхогенности. Общая эхогенность паренхимы была заметно снижена, капсула утолщена и четко визуализировалась. Границы печени были ровными. Сосудистый рисунок обогащен за счет более четкой визуализации стенок печёночных вен. Размеры печени были увеличены. Острый гепатит протекает одновременно с холециститом, что характеризовалось обнаружением соответствующих ультразвуковых признаков, таких как отёк стенки желчного пузыря.

Для выявления влияния Диронакса на обменные процессы в организме собак и кошек было проведено морфологическое и биохимическое исследование крови. Взятие крови проводили во время первичного обращения в клинику, а также на 10-и и 20-й день комплексного лечения с применением препарата Диронакс.

3.6.1 Влияние Днронакса на морфологические п биохимические показатели крови собак

Одним из наиболее важных диагностических методов воздействия различных физиологических и патологических факторов является, в первую очередь, общеклиническое исследования крови и определение биохимических показателей в сыворотке крови подопытных животных.

Итак, уровень эритроцитов у заболевших животных был равен 7,92±0,31х101;/л; на 10-й и 20-й день лечения препаратом Диронакс количество эритроцитов составляло 7,66 ± 0,4х10'-/л и 7,31±0,42х101:/л.

Установлено, что количество лейкоцитов во все сроки исследования оставалось в пределах нормы и составляло 10,96±1,37х109/л; 12,29±1,86х109/л и 11,36±1,17х109/л (до лечения, на 10-й и 20-й день соответственно). Однако полученные результаты статистически не подтверждены.

Количество лимфоцитов до лечения составило 38,23±9,05 %, а эозинофилов 4,39±1,0 %, при норме 12,0-30,0 % и 2,0-4,0 %, соответственно. На 20-й день приме-

нения Диронакса их количество доходило до физиологической нормы (29,16 ± 1,42 % и 4,9 ± 0,81 %, лимфоциты и эозинофилов, соответственно), но различия не подтверждаются статистикой.

Уровень нейтрофилов в начале эксперимента был понижен и составлял 57,38±8,11%, а на 20-й день лечения Диронаксом повышался до 65,94±2,12 %.

Незначительное снижение количества эритроцитов в пределах нормы определяло и уровень гемоглобина. Так, до лечения его количество составляло 184,0±7,67 г/л, а после терапии Диронаксом - 170,63±5,98 г/л и 169,0±4,8 г/л (10-й и 20-й день, соответственно), однако полученные данные были не достоверными.

Анализ результатов исследований показал, что у подопытных животных во все сроки наблюдения не происходило изменения гематокрита. В начале опыта уровень гематокрита составил 52,18±1,71 % в конце - 50,60±2,03 %.

Усреднённый объём эритроцита (УОЭ) у заболевших животных составлял 66,37±1,3фл, лечение Диронаксом не изменяло данный показатель, и на 20-е сутки эксперимента он находился в пределах физиологической нормы (66,25±1,04 фл).

Среднее содержание гемоглобина в эритроците (ССГЭ) в начале опыта составлял 23,24±0,44 пг, а в конце - 23,6 ±0,79 пг.

Во все сроки исследования наблюдалось незначительное повышение уровня СКГЭ (средней концентрации гемоглобина в эритроците), которое составляло на начало опыта 349,63± 1,56 г/л и в конце 345,43±8,55 г/л. Полученные результаты статистически не подтверждены.

Количество тромбоцитов составило 291,5±43,81x10%, а на 20-й день дачи Диронакса - 295,29±21,75х10'/л.

УОТ (усреднённый объём тромбоцитов) у подопытных животных находился в пределах физиологической нормы для данного вида животного и составлял 8,7±0,47 ф/л на начало опыта и 9,14±1,01 ф/л на 20-й день дачи препарата Диронакс.

Наиболее важными показателями в диагностике заболеваний печени являются определение ферментов из группы трансфераз - ACT и AJIT, а также ГГТ, ЛДГ, щелочная фосфатаза, холестерин и триглицериды (таблица 6).

Содержание гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТ) в сыворотке крови до лечения составляло 11,68±1,33 ед./л, что на 66,8% выше нормы. При введении препарата наблюдается постепенное снижение активности фермента до 8,51±0,78 ед./л (20-й день), хотя уровень данного показателя остаётся выше физиологической нормы.

Как видно из таблицы 6 в начале опыта уровень лактатдегидрогеназы (ЛДГ) составлял 442,85 ± 91,09 ед./л, что в среднем, на 55,3% выше физиологической нормы. В дальнейшем, при назначении препарата Диронакс наблюдалось значительное понижение уровня ЛДГ до 89,66±2,19 ед./л на 10-й и 88,68± 3,85 ед./л на 20-й день лечения Диронаксом (Р<0,01).

Аспартатаминотрансфераза (ACT) и аланинаминотрансфераза (АЛТ) - ферменты из группы трансфераз, которые участвуют в реакции трансаминирования. Так, применение Диронакса понизило содержание ферментов ACT и АЛТ в сыворотке крови собак до пределов физиологической нормы. Достоверное (Р<0,01) снижение уровня активности ACT было зафиксировано на 10-е и 20-е сутки при использовании препарата на 38% и 37,2% по отношению к исходным показателям. Уровень активности АЛТ был значительно повышен относительно нормы. В ходе опыта данный показатель снижался до нормы.

Важное диагностическое значение имеет коэффициент де Ритиса, определяемый отношением ACT к АЛТ. Нами установлено, что у заболевших животных коэффициент де Ритиса составил 0,38, то есть был значительно ниже параметров физиоло-

гйческих показателей. На 10-й день лечения Диронаксом этот показатель повысился до 0,4, на 20-й день - до 0,65, что указывает на положительное действие препарата.

Содержание холестерина в крови больных животных составляло 189,47 ± 17,01 мг/дл. При введении Диронакса на 20-й день его уровень понижался до 182,04±8,84 мг/дл. Применение Диронакса повышало содержание триглицеридов с 57,0±11,05 мг/дл (заболевшие животные) до 63,29±6,45 мг/дл (20-й день лечения). Однако полученные данные статистически не подтверждены.

Таким образом, введение препарата Диронакс в состав комплексной терапии у собак способствует снижению уровня холестерина в крови и повышению запаса энергии в организме.

Установлено, что у заболевших животных активность щелочной фосфатазы (ЩФ) была довольно высокой и составила 240,88±55,42 ед./л, что выше физиологической нормы в среднем на 68,4%. Включение Диронакса в лечение приводило к снижению активности фермента и по окончанию лечения данный показатель составлял 141,0±9,90 ед/л, то есть сохранялся в пределах физиологической нормы.

Таблица 6 Биохимические показатели крови больных гепатитом собак до и после лечения Диронаксом (п=8)

№ п/п Показатель Исходные данные 10-й день лечения 20-й день лечения Норма

1 ГГТ, ед./л 11.68 ± 1,33 11,5 ± 1,27 8,51 ±0,78 0,0-7,0

7. ЛДГ, ед./л 442,85 ±91,09 89,66 ±2,19* 88,68 ±3,85* 80,0-285,0

3 АЛТ, ед./л 253.6 ± 25.97 115,2 ±20,1 44,74 ± 3,32 19.0-107,0

4 ACT, ед./л 95,91 ± 17,32 46,46 ± 1,66* 35,74 ±3,51* 16,0-43,0

5 Коэффициент де Ритиса 0,38±0,04 0.4±0,05 0.65±0,06 0,42-0,97

6 Альбумин, г/л 33,5 ± 2.24 37,55 ±1,44 37,19 ± 1,38 29,0-43,0

7 а-амилаза, ел./л 982,71 ± 101,4 1014,89 ± 124.02 1073.13 ±97,04 510,0-1865,0

8 Креатинин, мкмоль/л 93,14 ± 6,27 91,8 ± 13,73 91,46 ± 11,22 20,0-150,0

9 Глюкоза, ммоль/л 6,3 ± 0,42 6.66 ± 0,33 6.83 ± 0,55 3,3-7,3

10 Общий белок, г/л 67,07 ± 2.84 66,68 + 2,77 68,94 ±2.21 54,0-71,0

11 Холестерин, мг/дл 189,47 ± 17.01 193,85 ± 14.6 182.04 ±8,84 108,0-266,0

1? ЩФ, ед./л 240.88 ± 55,42 142,71 ± 10.2 141,0 ±9,90 22,0-143,0

13 Триглицериды. мг/дл 57,0 ± 11,05 49,83 ± 2.72 63,29 ± 6,45 20,0-120.0

* - достоверно по отношению к исходным данным (Р<0,01).

Остальные показатели (альбумин, а-амилаза, креатинин, глюкоза, общий белок) во все сроки наблюдения и лечения животных также находились в пределах физиологической нормы.

Таким образом, по результатам морфологических н биохимических исследований можно сделать вывод, что введение препарата Диронакс в состав комплексной терапии при гепатите собак нормализует метаболические процессы внутри организма.

3.6.2 Влнянне Диронакса на морфологические н биохимические показатели

кровн кошек

Для изучения эффективности воздействия гепатопротектора Диронакс на организм кошек было проведено морфологическое и биохимическое исследование крови. Анализ полученных результатов показал, что при гепатите у заболевших животных уровень эритроцитов оставался в пределах физиологической нормы и был равен 8,68±0,82х1012/л в начале опыта и 8,57±0,76х1012/л на 20-й день применения Диронак-

са. Соответственно, содержание гемоглобина составляло 138,13±10,92 г/л и 124,88±8,97 г/л, однако данные были не достоверными.

Количество лейкоцитов в начале опыта было в среднем на 111,4% выше, чем в норме. В дальнейшем, при лечении препаратом Диронакс, их уровень понижался, хотя на 20-й день оставался выше пределов нормы на 18,1 %.

При анализе лейкоцитарной формулы нами установлено, что при гепатите на начало эксперимента было снижено содержание лимфоцитов в среднем на 35,7% и повышено количество нейтрофилов на 47% от физиологической нормы. При терапии Ди-ронаксом содержание лимфоцитов и нейтрофилов на 20-й день приходило к показателям физиологической нормы: 37,78±4,0% и 58,84±3,81%, соответственно (Р<0,001).

Количество эозинофилов при первичном анализе составляет 2,87±0,47%, а к концу опыта незначительно повышается до 3,38±0,75% (20-й день). Полученные'дан-ные не показали достоверной разницы по отношению к исходным показателям.

Содержание нейтрофилов составляет 84,5±2,85 % на начало опыта, а при даче Диронакса в течение 20-и дней снижается до 58,85 ± 3,81 %, что соответствует физиологической норме (Р<0,001).

Уровень гемоглобина и гематокрита оставался в пределах физиологической нормы. Так, на начало опыта, концентрация гемоглобина составляла 138,13±10,92 г/л, а в конце - 124,88±8,97 г/л. Уровень гематокрита составлял 37,95±2,99 % и 40,71±2,34 % на начало и конец эксперимента, соответственно.

Показатели УОЭ и ССГЭ у кошек, в целом, были в пределах физиологической нормы в начале и конце эксперимента.

Анализ полученных данных позволяет выявить незначительно повышение уровня СКГЭ у больных кошек, который затем снижается до физиологической нормы (363,0± 14,56 г/л - исходные данные и 332,88±6,5 г/л -20-й день эксперимента).

Установлено, что содержание тромбоцитов и УОТ в сыворотке крови в начале опыта было понижено и составляло 226,83±35,02х109/л и 11,08±0,46 ф/л, соответственно. На 20-й день терапии Диронаксом их уровень составил 330,63 ± 40,95 х 109/л (тромбоциты) и 12,34±0,68 ф/л (УОТ), что соответствует физиологической норме.

Отслеживая влияние препарата Диронакс при гепатите кошек в течение всего периода лечения, изучали также динамику изменения биохимических показателей (таблица 7).

Определение в сыворотке крови активности ферментов даёт информацию о локализации процессов происходящих внутри организма.

Так, содержание ГГТ в сыворотки крови понижалось к 20-му дню применения Диронакса. В начале опыта уровень ГГТ составлял 9,37±1,64 ед./л, что выше нормативных показателей на 56,1%, к 10-му и 20-му дню лечения Диронаксом этот показатель постепенно нормализовывался и составлял 7,89±0,95 ед./л и 5,61±0,57 ед./л, соответственно.

Уровень ЛДГ в начале исследования составлял 431,16±43,64 ед./л или 51,2% выше нормы. В дальнейшем, при даче препарата Диронакс, наблюдалось также постепенное снижение данного показателя до уровня физиологической нормы -165,94±27,05 ед./л (10-й день лечения) и 142,25±20,46 ед./л (20-й день лечения). Данные достоверны по отношению к исходному показателю (Р<0,001).

Применение препарата Диронакс способствовало снижению уровня ферментов АЛТ и ACT у больных животных на 10-й и 20-й дни лечения. Так, уровень АЛТ и ACT при первичном исследовании сыворотки крови составлял, соответственно, 287,63±22,59 ед./л и 162,29±31,37 ед./л, что было, в среднем, выше на 173% и 189% от верхних пределов физиологической нормы. На 10-й и 20-й день применения Диро-

накса было зафиксировано понижение данных показателей по отношению к исходным данным и составило: 68,26±11,39 ед./л; 53,86±8,62 ед./л (АЛТ) и 39,09x3,16 ед./л: 36,26±4,39 ед./л (ACT), соответственно.

В ходе проведения опыта установлено, что коэффициент де Ритиса у больных животных был ниже уровня физиологической нормы для данного вида животных. Так при первичном анализе крови у заболевших животных отношение ACT к АЛТ составило 0,56, на 10-й день лечения Диронаксом - 0,57 и на 20-й - 0.67, что говорит о нормализации данного параметра.

Таблица 7 Биохимические показатели крови больных гепатитом кошек до и после лечения Диронаксом (п=8)

№ п/п Показатель Исходные данные 10-й день лечения 20-й день лечения Норма

1 ГГТ, ед./л 9.37 ± 1.64 7,89 ± 0,95 5.61 ± 0,57 0.0-6.0

2 ЛДГ, ед./л 431,16 ±43,64 165,94 ±27.05* 142,25 ±20.46* 80.0-285.0

з АЛТ, ед./л 287,63 ± 22,59 68.26 ± 11.39* 53,86 ± 8,62* 31.0-105.0

4 ACT, ед./л 162.29 ±31,37 39,09 ± 3,16** 36,26 ± 4.39** 12.0-56.0

5 Коэффициент де Ритиса 0.56 ±0,037 0.57 ± 0.055 0.67 ±0.069 0.6-0.8

6 Альбумин, г/л 36,84 ±2,18 36.59 ± 1.08 35,9 ± 1,05 30.0-44.0

7 а -амилаза, ед./л 2087,14 ± 187.8 1299,5 ±76.18** 651.75 ±77,35* 365,0-948.0

8 Креатинин, мкмоль/л 105. 69 ±17.0 92,8 ± 9,53 81.85 ±10.80 20.0-150,0

У Глюкоза, ммоль/л 9.21 ± 0,63 6.85 ± 0,43*** 6,58 ± 0.44** 4.4-7,7

10 Общий белок, г/л 81,47 ±5,64 79,98 ±3,16 72.43 ± 3,54 57,0-79.0

11 Холестерин, мг/дл 194.88 ± 12,75 191,94 ± 13.46 161,08 ± 13,43 38.0-186.0

12 ЩФ, ед./л 254.57 ± 49,8 116,57 ±0.8**** 74,18 ± 7.29** 16,0-113.0

13 Триглицериды, мг/дл 108,02 ± 12.24 42.11 ±6,0* 45,8 ± 6,73* 10.0-114,0

* - достоверно по отношению к исходным данным (Р<0,001); ** - достоверно по отношению к исходным данным (Р<0,01); *** - достоверно по отношению к исходным данным (Р<0,02); **** - достоверно по отношению к исходным данным (Р<0,05).

По данным таблицы 7, уровень а -амилазы в крови опытных животных в начале исследования был значительно повышен и составлял 2087,14± 187,8 ед./л, при физиологической норме 365,0-948,0 ед./л. В дальнейшем (20-й день) уровень данного показателя постепенно понижался и составлял 651,75±77,35 ед./л (Р<0,001). Как было сказано выше, изменение уровня а-а.милазы не является критерием специфичного теста при заболеваниях печени. У кошек повышение данного показателя может наблюдаться при различных заболеваниях внутренних органов незаразной этиологии.

Количество глюкозы в сыворотке крови указывает на состояние углеводного обмена в организме. Так, в начале эксперимента ее уровень был повышен и составлял 9,21±0,63 ммоль/л, что в среднем на 19,6 % выше нормы. В дальнейшем наблюдалось нормализация данного показателя до 6,58+0,44 ммоль/л (Р<0,01), что соответствовало физиологической норме.

Уровень общего белка и холестерина был повышен в начале эксперимента на 3 % и 4,7 %, соответственно. Введение в схему лечения препарата Диронакс способствовало нормализации данных показателей.

Уровень щелочной фосфатазы у кошек, поступивших с диагнозом гепатит, был высокий и составлял 254,57±49,8 ед./л, что на 125,2 % выше нормы. При введении Диронакса на 20-й день эксперимента достоверно (Р<0,05) понизилась активность данного фермента в сравнении с исходными показателями.

Содержание триглицеридов в сыворотке крови находилось в верхних пределах физиологической нормы в начале эксперимента и затем понижалось при даче препарата Диронакс до 45,8±6,73 мг/дл (20-й день) (Р<0,001).

Анализ уровня альбуминов и креатинина показал, что данные показатели соответствовали физиологической норме.

При оценке клинической картины была выявлена положительная динамика у всех опытных животных. Терапевтический эффект Диронакса проявлялся восстановлением аппетита, прекращением диспепсических явлений и зуда, отсутствием болезненности в области печени.

Анализируя полученные данные, следует отметить, что введение в комплексную терапию при гепатите кошек гепатопротектора Диронакс способствовало нормализации морфологических и биохимических показателей крови, что видно по представленным результатам.

3.7 Экономическая эффективность применения Днронакса

В ходе исследования лечебных мероприятий в опыте на собаках и кошках с применением гепатопротекторного препарата Диронакс была установлена высокая степень его экономической эффективности.

Средняя стоимость одного животного составила 9200 руб. Предотвращенный в результате лечения больного животного ущерб: Пу=Мз*Ц, где Мз - количество заболевших животных, подвергнутых лечению, Ц — средняя стоимость одного животного. Таким образом, получаем Пу= 8*9200 = 73600 руб.

Исходя из стоимости субстанции 12000 руб. за 1 кг, в опыте на собаках было потрачено 17,5 г за 20 дней на 1 животное, что составляет 210 руб. Следовательно, затраты на лечение 8 животных составили 1680 руб.

Экономический эффект, полученный в результате лечения больных животных: Эв = Пу - Зв, где Пу - предотвращенный в результате лечения больного животного ущерб, Зв - затраты на ветеринарные мероприятия. Следовательно, Эв = 73600 - 1680 = 71920 руб.

Экономическая эффективность на рубль затрат: Эр = Эв/Зв. Таким образом, получаем, Эр = 71920/1680 = 42,81 руб.

Исходя из результатов исследования можно сделать вывод, что Диронакс имеет высокую степень экономической эффективности.

ВЫВОДЫ

1. Методом, основанным на реакции образования цветного комплекса диизо-пропиламмония дихлорацетата с бромтимоловым синим, установлено, что массовая доля основного вещества Диронакса составила 99,8%.

Срок годности Диронакса при 45°С в полимерных флаконах, укупоренных крышками с контролем первого вскрытия составляет 182 суток, что соответствует сроку годности в 2 года при 20° С.

Определена кристаллическая структура Диронакса методом монокристального рентгеноструктурного анализа (РСтА).

2 Среднесмертельная доза (Г^о) Диронакса составила при пероральном введении для белых мышей 5450 мг/кг. Согласно ГОСТ 12.1.007. - 76 Диронакс относится к четвёртому классу опасности (малоопасные вещества).

Применение Диронакса в течение 30 дней не вызывает изменений морфологических и биохимических показателей крови, не оказывает отрицательного влияния на центральную нервную систему, функцию почек, на массу органов и не вызывает гибели животных.

Диронаке не влияет на продолжительность снотворного действия гексенала и хлоралгидрата, но уменьшает продолжительность сна. вызванного тиопенталом.

3. При воспроизведении экспериментальных гепатитов, вызванных четырёххло-ристым углеродом, парацетамолом и этанолом, установлено, что Диронаке не оказывает отрицательного влияния на функциональное состояние печени, обладает гепато-защитным и желчегонным действием.

При введении Диронакса происходит активация компенсаторно-приспособительных процессов в печени, которые характеризуются гипертрофией гепатоцитов, активацией белкового обмена и регенерацией паренхимы печени.

4. При пероральном введении Диронакса в течение 20 дней происходит нормализация морфологических и биохимических показателей крови собак и кошек, заболевших гепатитом.

5. Экономическая эффективность Диронакса при лечении гепатита в течение 20 дней составила на рубль затрат 42,81 руб.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для улучшения функционального состояния печени домашних животных (собак и кошек) при гепатопатиях различной этиологии (в том числе при отравлениях), восстановления структуры повреждённой печени, а также для профилактики заболеваний печени рекомендуется применение гепатопротектора Диронаксе в дозировке 25 мг/кг в течение 20 дней. Препарат задавать животным индивидуально с кормом или небольшим количеством воды. Использование препарата регламентируется временной инструкцией по применению.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дударев, A.A. Эффективность нового гепатопротектора Диронаке при экспериментальном поражении печени четыреххлористым углеродом / А.А, Дударев, И.Р. Кильметова // Молодежная наука и АПК: проблемы и перспективы. Материалы V Ве-российской научно-практической конференции молодых ученых. - Уфа: Башкирский ГАУ, 2012.-С. 50-52.

2. Струнин, Б.П. Структура лекарственного средства днизопропнламмо-нпя днхлорацетата / Б.П. Струнин, П.А. Гуревчч, Т.Б. Нахомова, И.Р. Кильметова, A.A. Дударев, B.II. Калашник, Ю.Е. Сапожников, Л.Ф. СаттароВа, Я.Н. Львович // Вестник Казанского технол. ун-та. - 2013. - Л» 1. - С. 179-181.

3. Дударев, A.A. Влияние гепатопротекторного препарата Диронаке на биохимические показатели крови и ее морфологический состав / A.A. Дударев, И.Р. Кильметова // Наука молодых - инновационному развитию АПК: материалы VI Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых. - Уфа: Башкирский ГАУ, 2013.-С. 78-81.

4. Дударев, A.A. Влияние гепатопротекторного препарата Диронаке на функцию центральной нервной системы / A.A. Дударев, И.Р. Кильметова. Б.П. Струнин

// Научное обеспечение АПК. Итоги и перспективы. Материалы международной научно-практической конференции, посвяшенной 70-летию ФГБОУ ВПО Ижевская ГСХА.-2013.-Т. 1.-С. 176-178.

5.Дударев, A.A. Влияние гепатопротекторного препарата Диронакс на функцию почек при водной нагрузке / A.A. Дударев, И.Р. Кильметова, Б.П. Струнин Н Состояние и перспективы увеличения производства высококачественной продукции сельского хозяйства. Материалы II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Уфа: Башкирский ГАУ, 2013. - С. 45-46.

6. Дударев, A.A. Воздействие гепатопротекторного препарата Диронакс на внутренние органы крыс / A.A. Дударев, И.Р. Кильметова // Вестник Башкирского Государственного аграрного университета. - 2013. - JV» 4. - С. 36-38.

7. Дударев, A.A. Определение гепатопротекторного н желчегонного препарата Днронакс при поражении печени парацетамолом у крыс / A.A. Дударев, И.Р. Кильметова, Б.П. Струнин, С.Ф. Габдрахманова, Т.А. Сапожникова // Труды Кубанского Государственного аграрного университета. - 2013. - JV» 4. - С. 214-216.

8. Дударев, A.A. Эффективность пового гепатопротектора Диронакс при экспериментальном поражении печени этанолом / A.A. Дударев, И.Р. Кильметова, Б.П. Струнин, Р.Ю. Хнсамутдннова, Н.С. Макара // Ветеринария Кубани. -2013. - № 3. - С. 17-19.

Подписано в печать 23.07.2014 г. Формат бумаги 60^841/1б. Усл. печ. л. 1,09 Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Печать трафаретная. Заказ 271. Тираж 100 экз.

РИО ФГБОУ ВПО Башкирский ГАУ 450001, г. Уфа, ул. 50-летия Октября, 34

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Дударев, Артур Александрович, Уфа

ФГБОУ ВПО «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

0^201460409

ДУДАРЕВ АРТУР АЛЕКСАНДРОВИЧ

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГЕПАТОПРОТЕКТОРА ДИРОНАКС

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор ветеринарных наук, Кильметова И.Р.

Научный консультант доктор технических наук, Струнин Б.П.

Уфа-2014

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................................4

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................8

1.1 Печень и её роль в организме.................................................................8

1.2 Основные патологии печени.................................................................18

1.3 Современные гепатопротекторы, применяемые в ветеринарии...........40

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ....................................57

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................................................64

3.1 Производство Диронакса...........................................................................64

3.1.1 Физико-химические свойства Диронакса.....................................64

3.1.2 Качественное и количественное определение Диронакса..........68

3.1.3 Изучение стабильности Диронакса...............................................70

3.1.4 Определение кристаллической структуры Диронакса................74

3.2 Токсикологическая оценка Диронакса....................................................78

3.2.1 Острая токсичность Диронакса........................................................79

3.2.2 Субхроническая токсичность Диронакса........................................81

3.2.3 Влияние Диронакса на функцию почек...........................................84

3.2.4 Влияние Диронакса на центральную нервную систему................85

3.2.5 Влияние Диронакса на детоксицирующую активность печени.... 87

3.3 Оценка гепатопротекторного действия Диронакса..........................89

3.3.1 Эффективность Диронакса при экспериментальном поражении печени четырёххлористым углеродом...........................................89

3.3.2 Эффективность Диронакса при экспериментальном поражении

печени парацетамолом.....................................................................99

3.3.3 Эффективность Диронакса при экспериментальном

поражении печени этанолом..........................................................103

3.4 Эффективность применения Диронакса при гепатите

домашних животных.................................................................107

3.4.1 Влияние Диронакса на морфологические и биохимические

показатели крови собак..................................................................108

3.4.2 Влияние Диронакса на морфологические и биохимические

показатели крови кошек.................................................................118

3.5 Экономическая эффективность применения Диронакса.....................124

4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................................126

ВЫВОДЫ...............................................................'.........................................134

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ...........................................................135

СПИСОК СОКРАЩЕННЫХ ТЕРМИНОВ.................................... 136

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК..........................................................137

ПРИЛОЖЕНИЯ.......................................................................155

ВВЕДЕНИЕ

На отечественном рынке в настоящее время имеется широкий спектр препаратов и кормовых добавок, способствующих восстановлению печени при гепатопатиях различной этиологии, таких как гепатовет, лиарсин, глю-таМакс, гепалон, полифепан, гепавет, гепатоджект, дюфалайт, гептрал, эс-сенциале, гепатосан, хофитол, аллохол, метионин, силимарин, лив 52, билиг-нин, фосфоглив, липоевая кислота, зиксорин и другие [5, 15, 23, 32, 66, 133].

торов, имеющих невысокую стоимость и не требующих длительного курса лечения.

В настоящее время разработан отечественный гепатопротектор Диро-накс (диизопропиламмония дихлорацетат). Препарат синтезирован в ООО «Базис» (г.Уфа) под руководством доктора технических наук Б.П. Струнина.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- изучить влияние Диронакса на функциональное состояние печени на моделях экспериментальных гепатитов;

- определить терапевтическую эффективность Диронакса при гепатите собак и кошек;

- определить экономическую эффективность применения Диронакса в ветеринарии.

Научная новизна. Впервые по новой технологии синтезирован отечественный гепатопротекторный препарат Диронакс и доказана его химическая структура. Впервые проведены исследования широкого комплекса токсикологических показателей гепатопротектора Диронакс, позволившее выявить степень безопасности его применения. Установлено, что препарат Диронакс относится к четвёртому классу опасности.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- определение массовой доли основного вещества, подтверждение его структуры и стабильности;

- токсикологическая характеристика препарата Диронакс;

- фармакологическая эффективность препарата Диронакс при гепатите у кошек и собак.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Печень и её роль в организме

Печень представляет собой самую большую железу в организме, построенную из огромного количества работающих клеток.

Значение печени достаточно разнообразно, так как она служит барьером в кровообращении между желудочно-кишечным трактом и всеми остальными частями организма. У млекопитающих печень - единственный (кроме лёгких) орган в теле, в котором поступающая венозная кровь вновь растекается по капиллярным сосудам и вступает в очень близкое соприкосновение с клетками печени, меняя свой состав. В печени происходит предварительная обработка венозной крови с выходом из её состава углеводов, откладывающихся в печени в виде гликогена, происходит синтез мочевины и нейтрализация многих ядовитых веществ. Помимо этого, функция печени выражается в выделении в двенадцатиперстную кишку секрета - жёлчи. Также печени приписывается и значение железы внутренней секреции, вырабатывающей гормоны, которые выделяются в кровь, оттекающую через печёночные вены [2, 13, 96,120].

Печень необходима для поддержания полноценного функционирования организма. Она принимает участие практически во всех биохимических процессах организма, поддерживая в нем баланс обменных процессов (гомео-стаз). В связи с многочисленными функциями печени и её расположением относительно других органов она чаще подвергается негативному влиянию различных факторов, что приводит к развитию патологических процессов и метаболическим нарушениям в организме. В литературе последнего десятилетия проблемам нарушения функции печени у животных уделено большое внимание [101].

Данный орган обладает большими функциональными способностями, многие повреждения его переносятся без нарушения функции или клинических проявлений. Главным образом, это происходит благодаря замечатель-

ной регенеративной способности ткани печени, в основном при гиперплазии гепатоцитов [22, 74, 84].

Структурными компонентами печени являются паренхиматозные клетки (гепатоциты), эпителий желчных протоков, клетки ретикулоэндотелиаль-ной системы (РЭС), соединительная ткань. Соединительная ткань формирует капсулу печени и её нет среди упорядоченных в дольчатую структуру гепатоцитов.

Первичная структурная единица печени - гепатоциты, они составляют более 60% всей массы органа. 20% паренхимы печени составляют эндотели-альные клетки. Оставшиеся 20% занимает интерстиций (клетки протоков, соединительной ткани и пр.). Основа структуры печени - долька, формирующаяся из гепатоцитов. В центре дольки - центральная вена, являющаяся частью системы печёночной вены. От центральной вены к периферии дольки располагаются гепатоциты, образующие балки. По периметру дольки расположены портальные тракты, в которых выделяются разветвления воротной вены, печёночной артерии и желчных протоков. Печень имеет сегментарную структуру, в ней есть собственная система крово- и лимфотока, оттока желчи и иннервации [10, 111].

Немаловажная роль отводится печени в регуляции белкового обмена. В гепатоцитах происходит синтез, расщепление и перестройка белков и аминокислот, а также утилизация продуктов их обмена. Печень синтезирует более половины клеточных и сывороточных белков организма, в том числе 100% альбуминов, 75-90% а-глобулинов, 50%) [3-глобулинов, белки, участвующие в свертывании крови - фибриноген, протромбин, акцелерин, антигемофиличе-ские глобулины, компоненты противосвёртывающей системы (гепарин) [38, 39].

Одним из важнейших процессов, происходящих в печени, можно считать обмен аминокислот. В печени синтезируются различные аминокислоты, необходимые для обновления тканевых белков, и имеется множество ферментов, осуществляющих преобразования с аминокислотами. Весьма показа-

тельно, что в печени происходит не только синтез аминокислот, но и регулируется постоянство их состава.

В плазмоцитах, ретикулярных клетках печени, а также в купферовских клетках синтезируется у-глобулин. Помимо белков в чистом виде, в печени происходит синтез белковых комплексов гликопротеидов, липопротеидов, церулоплазмина, трансферрина [8, 66, 67].

При больших затратах энергии в гепатоцитах осуществляется синтез мочевины из аммиака (орнитиновый цикл), которая экскретируется почками в мочу.

Печень также принимает участие в липидном обмене. Содержащиеся в корме жиры в двенадцатиперстной кишке под воздействием желчных кислот (холевой, литохолевой, дезоксихолевой) и липазы эмульгируются и расщепляются до жирных кислот и глицерина. Полученные продукты частично участвуют в синтезе жира и фосфолипидов в кишечной стенке, а частично всасываются в кровь. В печень по воротной вене поступают синтезированный в кишечной стенке жир, жирные кислоты и глицерин, и под воздействием ферментов жир расщепляется до жирных кислот и глицерина. Часть жирных кислот тратится на синтез необходимых для организма липидов, часть окисляется с выделением энергии. При полном окислении в цикле Кребса образуются конечные продукты СОг и НгО, а при неполном - кетоновые тела: (3-оксимасляная кислота, ацетоуксусная кислота и ацетон.

Гепатоциты синтезируют фосфолипиды, нейтральные жиры и холестерин, ненасыщенные жирные кислоты превращают в насыщенные.

Холестерин в печени расщепляется с образованием стероидных гормонов, желчных кислот и витамина О. Желчные кислоты и свободный холестерин экскретируются желчью в двенадцатиперстную кишку. Часть холестерина из двенадцатиперстной кишки всасывается в кровь и поступает обратно в печень [58].

Изменение содержания холестерина, его концентрации довольно чётко

связано с функциональным состоянием печени. При большинстве функцио-

хи

нально компенсированных заболеваний печени до развития печёночной недостаточности наблюдается повышение содержания холестерина, в то время как при печёночной недостаточности его содержание падает. Состояние холестеринового обмена имеет прямое отношение к образованию камней, развитию желчнокаменной болезни. Как показали последние исследования, практически все камни билиарной системы на 95% состоят из холестерина и только 5% составляют желчные кислоты и некоторые другие соли. Следовательно, развитие желчнокаменной болезни тесно связано с нарушением ли-пидного обмена [55, 56, 75].

Одна из важных функций печени - регуляция углеводного обмена. Обычно состояние углеводного обмена в норме и при патологических состояниях ассоциируется с заболеваниями поджелудочной железы, однако печень сохраняет за собой все ключевые позиции в обмене углеводов.

Глюкоза - один из важных источников энергии. С обменом глюкозы связано образование основного источника энергии - АТФ и глюкуроновой кислоты. Последняя имеет отношение к синтезу гепарина. Печень поглощает большую часть всосавшихся в кишечнике углеводов. В гепатоцитах галактоза и фруктоза превращаются в глюкозу. Более того, глюкоза синтезируется из некоторых аминокислот, молочной и пировиноградной кислот. Благодаря печени сохраняется стабильность гликемии. Уже давно известно, что удаление печени влечет за собой гибель животного не в состоянии тяжелой печёночной клеточной комы, а тяжелейшей гипогликемии, которая развивается уже через 3-4 часа после гепатэктомии [11].

Печень обеспечивает синтез и регулирует обмен гликогена. Последний синтезируется из моносахаридов, поступающих из кишечника. Гликоген является одним из регуляторов уровня

Информация о работе

Дударев, Артур Александрович
кандидата биологических наук
Уфа, 2014
ВАК 06.02.03

Диссертация

Фармако-токсикологические свойства гепатопротектора Диронакс - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы