Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Фармакологические и токсикологические свойства препарата Афлогилекс

ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Фармакологические и токсикологические свойства препарата Афлогилекс"

РЫБАКОВА АННА ВЛАДИМИРОВНА

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ И ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТА АФЛОГИЛЕКС

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

16 МАЙ 2013

Санкт-Петербург

2013

005059148

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном

образовательном учреждении высшего профессионального образования

«Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Научный руководитель: Соколов Владимир Дмитриевич,

доктор ветеринарных наук, профессор

Официальные оппоненты: Щербаков Григорий Гаврилович,

доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», профессор кафедры внутренних болезней животных им. Синева A.B.

Абрамов Владислав Евгеньевич, доктор ветеринарных наук, профессор, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина» Россельхозакадемии, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия»

Защита состоится «11» июня 2013 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5. тел/факс 8(812) 388 36 31

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины.

Автореферат разослан « » мая 2013 г.

Автореферат размещен на сайте ВАК Минобразования и науки РФ: http//vak.ed.gov.ru « 6 » мая 2013 г.

Автореферат размещен на сайте http://spbgavm.nl « 6 » мая 2013 г.

Ученый секретарь ' Л

диссертационного совета Белова Лариса Михайловна

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы

Благодаря развитой системе профилактики целого ряда инфекционных заболеваний, значимость причиняемого ущерба от воспалительных заболеваний превосходит таковую, которая регистрируется при инфекционной патологии (Новикова C.B., 2004; Соколов В.Д., 2008). В настоящие время воспаление остается центральной проблемой медицины и ветеринарии (Soma L.R., 2012). В ветеринарии наиболее часто встречаются патологии воспалительного гепеза у крупного рогатого скота (маститы, эндометриты, болезни копыт, различные травмы) и мелких домашних животных (дерматиты, отиты, пододерматиты) (Соколов В.Д., 2009; Гуляева М.Е., 2011). В качестве лекарственных средств, для лечения воспалительных процессов применяют множество различных соединений, из них большую часть составляют антибактериальные, нестероидные противовоспалительные и гормональные препараты. Однако превосходящее их количество составляют препараты химической природы, которые, как известно, не всегда обладают достаточной фармакологической активностью, и которым присущи прогнозируемые и непрогнозируемые побочные эффекты, что, в значительной степени, при многих патологических состояниях и при взаимодействии с лекарствами базисной терапии или препаратами разных фармакологических групп затрудняет их применение (Петров В.А., 2000; Соколов В.Д., 2011).

Современные требования в ветеринарии диктуют необходимость поиска новых лекарственных препаратов для лечения воспалительных процессов различной этиологии, которые позволят снизить до минимума развитие нежелательных побочных реакций, осложняющих и удлиняющих процесс выздоровления животного, в т.ч. депрессию, страдание и боль (ВОЗЖ, 2010; Елесин A.B., 2004; Гугоннар М„ 2002).

В настоящее время терапия препаратами природного происхождения широко используется в мировой медицинской и ветеринарной практике.

Такие препараты находят применение для лечения и профилактики, а также комплексной терапии различных заболеваний (Соколов В.Д., 2010; Mayer A.M., 2009). Гидробионты, как источник новых ветеринарных препаратов активно привлекают внимание биологов и химиков всего мира в последние десятилетия (Соколов В.Д., 2011; Rodriguez A.D., 2009). Водная среда обитания является достаточно жесткой и агрессивной, поэтому гидробионты вынуждены продуцировать вещества с широким спектром биологической активности (Соколов В.Д., 2009; Kim S.-K., 2010). Зачастую вещества из морских организмов оказывают существенно больший эффект, чем известные фитопрепараты и синтетические средства. Чаще всего из гидробионтов выделяют: пептиды, липиды, полисахариды, полиненасыщенные жирные кислоты, антиоксиданты, ферменты, витамины и минералы (Cha К.Н., 2010). С использованием традиционных и оригинальных технологических подходов удалось разработать технологии высокоэффективных комплексов из гидробионтов с

противовоспалительными, противоаллергическими, антиоксидантными и иммуномодулирующими свойствами.

В ЗАО «Санкт-Петербургском институте фармации» был разработан оригинальный стандартизированный препарат Афлогилекс, который представляет собой экстракт из печени рыб тресковых пород. Препарат содержит в качестве действующего вещества пептидно-фосфолипидный комплекс, свободные аминокислоты и микроэлементы (Na, К, Са, Mg, Fe, Cu, Zn), которые играют существенную роль в обменных процессах.

Афлогилекс - является высокоселективным ингибитором ферментов ЦОГ-2 (циклооксигеназа-2) и 5-ЛОГ (5-липоксигеназа) (Крышень K.JI., Рыбакова А.В. и соавт., 2012). Препарат разрабатывался для лечения воспалительных и аллергических процессов.

Цель исследования

Изучить эффективность и безопасность нового

противовоспалительного ветеринарного препарата Афлогилекс в двух

лекарственных формах, применяемого для лечения острых и хронических воспалительных и аллергических процессов на коже и слизистых оболочках у животных, для предоставления соответствующих материалов в Россельхознадзор и получения разрешения на использование данного средства в ветеринарной практике.

Были поставлены следующие задачи:

1) Выяснить безопасность применения нового противовоспалительного препарата в двух лекарственных формах Афлогилекс - 0,02% гель и Афлогилекс - 0,1% раствор на лабораторных животных.

2) Определить фармакологическую активность препарата Афлогилекс на модели экспериментального адьювантного артрита.

3) Выяснить эффективность комбинированной терапии препаратом Афлогилекс у коров, кошек и собак.

4) Подготовить материалы для регистрации в Россельхознадзоре.

Научная новизна исследования

На основании данных доклинических и клинических исследований впервые установлены противовоспалительные свойства нового препарата Афлогилекс, полученного из печени тресковых рыб. Изучена токсичность препарата Афлогилекс в двух лекарственных формах на разных тест-системах, установлен класс его токсичности и отсутствие негативного действия на жизненно важные органы и системы, что обуславливает безопасность его применения у животных при воспалительных процессах.

Научно-практическая значимость

Экспериментально доказано, что Афлогилекс обладает противовоспалительным действием. Полученные результаты in vitro, по ингибированию ферментов ЦОГ-2 и 5-ЛОГ (Крышень К.Л., Рыбакова A.B. и соавт., 2012), были подтверждены in vivo на коровах и плотоядных животных.

Данные доклинических и клинических исследований полученные в результате работы были включены в регистрационное досье и поданы на

регистрацию в Россельхознадзор. В результате были зарегистрированы и внедрены в ветеринарию Афлогилекс-раствор для инъекций 0,1% Рег_№ПВР-3-3.0/02688 от 30.01.2012 и Афлогилекс-гель 0,02% Рег.№ПВР-3-3.0/02688 от 30.01.2012.

Положения, выносимые на защиту:

Результаты экспериментальных и клинических испытаний нового противовоспалительного препарата Афлогилекс в двух лекарственных формах, внедренного в ветеринарию.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на IV съезде фармакологов России в Казане (Казань, 2012), на XVI международном съезде Фитофарм (Санкт-Петербург, 2012), III международной интернет - конференции «Современные проблемы анатомии, гистологии и эмбриологии животных» (Казань, 2012), П международном конгрессе ветеринарных фармакологов и токсикологов (Санкт-Петербург, 2012). По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Личный вклад диссертанта заключается в непосредственном выполнении теоретической и экспериментальной части работы, а также в формировании выводов и основных положений, выносимых на защиту. Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 8 глав собственных исследований, обсуждение и выводы, научно-практические рекомендации, выводы, список литературы, включающий 158 отечественных и 53 зарубежных источника и приложение. Диссертация иллюстрирована 49 рисунками и содержит 47 таблиц.

2. Собственные исследования

Работа выполнена в период с 2009 по 2012 гг. на кафедре фармакологии и токсикологии федерального государственного бюджетного

образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на 442 белых крысах, 120 белых мышах, 40 коровах, 14 собаках и 12 кошках. Изучены эффективность и безопасность нового противовоспалительного ветеринарного препарата Афлогилекс. В качестве препаратов позитивного контроля на различных этапах исследования использовались: Алфлутоп раствор для инъекций (51сотес1, Румыния), Гентамицин 4% (ЗАО «Масакроген», Россия), Мастисан (ЗАО «Нита-Фарм», Россия), Цефтриаксон (ОАО «Синтез», Россия), Синулокс (Пфайзер Энимал Хелс, США).

Для изучения острой токсичности препарата Афлогилекс-гель 0,02% вводили крысам и мышам внутрижелудочно однократно в дозах 10, 20, 30, 45 и 60 г/кг, наносили накожно однократно в дозах 1.2, 2.4, 3.6, 4.8, 6.0 г/кг. Эвтаназия осуществлялась на 15-й день исследования путем обескровливания из полостей сердца

Во время изучения хронической накожной токсичности на аутбредных крысах препарат применяли многократно накожно в дозах 0.4, 2.0, 4.0 г/кг. Введение осуществляли 21 день. На 7-й, 14-й и 21-й день исследования проводилось взвешивание животных. В связи с возможностью более широкого использования препарата Афлогилекс (ветеринария, медицина) на 21-й день проводились физиологические тесты «Открытое поле» и «Приподнятый крестообразный лабиринт» (Миронов А.Н., 2012) по изучению локомоторной активности животных.

Эвтаназия осуществлялась на 22-й день исследования путем обескровливания из полостей сердца для анализа клинических и биохимических показателей.

Для изучения острой токсичности препарата Афлогилекс - раствор для инъекций 0,1% вводили крысам и мышам внутримышечно и подкожно однократно в дозах 5, 10, 15, 20, 25 мл/кг. На 2-й, 7-й и 14-й день

исследования проводилось взвешивание животных. Эвтаназия осуществлялась на 15-й день исследования путем обескровливания из полостей сердца.

Во время изучения хронической токсичности препарата Афлогилекс -раствор для инъекций 0,1% на аутбредных крысах препарат применяли многократно внутримышечно в дозах 1, 2,5, 5 мл/кг. Введение осуществляли 90 дней. На 14-й, 31-й, 60-й и 91-й дни исследования проводилось взвешивание животных и изучение локомоторной активности. Эвтаназия осуществлялась на 31-й и 91-й дни исследования путем обескровливания из полостей сердца для анализа клинических и биохимических показателей.

Гематологические показатели определяли в цельной крови с антикоагулянтом на гематологическом анализаторе «ABACUS junior vet» (Австрия). Определяли следующие показатели: гемоглобин, г/дл; гематокрит, %; эритроциты, 1012/л; лейкоциты, 109/л; палочкоядерные нейтрофилы, %; сегментоядерные нейтрофилы, %; базофилы, %; эозинофилы, %; моноциты, %; лимфоциты, %; плазматические клетки, %. Биохимические показатели крови определяли на биохимическом анализаторе «А-25» с использованием реагентов фирмы BioSystems. Оценивали следующие показатели: аминотрансферазы (АЛТ и ACT), билирубин, щелочная фосфатаза, креатинин, мочевина, общий белок, альбумин, холестерин, триглицериды.

Патоморфологическому исследованию подлежали все экспериментальные животные при изучении острой и хронической токсичности. Проводили некропсию, макроскопическое исследование, взвешивание и гистологическое исследование внутренних органов.

Перечень органов, подлежавших взвешиванию и гистологическому исследованию: сердце, легкие с трахеей, тимус, печень, селезенка, почки, надпочечники, яички (два) — самцы, яичники (два) — самки, головной мозг.

Изучение противовоспалительной активности препарата Афлогилекс -раствор для инъекций 0,1% проводили на модели экспериментального адъювантного артрита. Моделирование адъювантного артрита выполняли

однократным субплантарным введением полного адъюванта Фрейнда (Sigma-Aldrich, США) в заднюю правую конечность в объеме 100 мкл (0,1 мл).

Для оценки фармакологической активности препаратов

регистрировались следующие показатели: объем и температура пораженной конечности, количество лейкоцитов в периферической крови.

Температура кожи измерялась электронным термометром (A&D medical, Япония) на плантарной поверхности правой задней конечности.

Признаки деформации костной ткани в области суставов и признаки непосредственного повреждения костей оценивались по сумме рангов.

Дополнительно проводились апробация по применению препаратов Афлогилекс в двух лекарственных формах в комбинированной терапии лечения маститов различной этиологии у крупного рогатого скота. Скрининговое исследование проводились на 40 коровах черно-пестрой породы молочного направления.

В результате клинического осмотра и быстрых мастидиновых тестов (проба с 2% мастидином) было выбрано коровы с диагнозами: острый катаральный и острый серозный маститы. Для каждой группы были подобраны различные варианты комбинированной терапии, в качестве основного средства применялись комбинированный препарат мастисан и антибиотик гентамицин совместно с препаратом Афлогилекс до выздоровления.

Скрининговые клинические исследования по применению препарата Афлогилекс в двух лекарственных формах для лечения воспалительных процессов различной этиологии у мелких домашних животных, проводились в ветеринарных клиниках ЭлВет. Были сформированы группы из 12 кошек и 14 собак различного возраста, породы, пола с воспалительными, острыми и хроническими процессами на коже и слизистых: дерматиты различной этиологии, экземы, а также кожными поражениями после укусов эктопаразитов, пододерматитами. Лечебная терапия проводилась с

использованием антибиотиков (цефтриаксон, снулокс) и препаратом Афлогилекс в течение 5 дней. Для оценки терапевтической эффективности препарата разработана балльная система по клиническим показателям (представлены в результатах).

2.2. Результаты собственных исследований

Определение возможного токсического действия

В результате проведенных исследований острой токсичности препарата Афлогилекс - гель 0,02% и Афлогилекс - раствор для инъекций 0,1% на аутбредных мышах и крысах значения ДД50 установить не удалось, в связи с отсутствием гибели экспериментальных животных.

Выживаемость крыс и мышей (пало/всего) при внутрижелудочном введении препарата Афлогилекс-гель 0,02%

Вид/Доза, г/кг 0 10 20 30 45 60

Крысы 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10

Мыши 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10

Выживаемость крыс (пало/всего) при пакожиом нанесении препарата Афлогилекс-гель 0,02%

Вид / Доза, г/кг 0 1,2 2,4 3,6 4,5 6,0

Крысы 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10

Выживаемость крыс и мышей (пало/всего) при подкожном и внутримышечном введении препарата Афлогилекс-р-р/инъекций 0,1%

Вид / Доза, мл/кг Способ введения 0 5 10 15 20 25

Крысы подкожно 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10

Мыши 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10

Крысы внутримышечно 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10

При сравнении динамики массы тела групп, получивших препарат Афлогилекс - гель 0,02% и Афлогилекс - раствор для инъекций 0,1% с контрольной группой статистически значимых различий не выявлено. Масса животных равномерно увеличивался в группах у самцов на 9%, у самок на 8% (рис. 1-2).

230 225 и 220 Í 215

<L>

s 210

Í 205 §

200 195 190

Рис. 1. Влияние однократного накожного нанесения препарата на массу тела крыс - самцов, г (М±т)

230 -220 -

с_

к?

g 210-

н

я

g 200 -я

190 180

- -*- - Контроль 5 мл/кг •—10 мл/кг --*--15 мл/кг

20 мл/кг —•— 25 мл/кг

-wíi \-

0-й день 2-й день 7-й день 14-й день__

—*—Контроль —■— 1,2 г/кг —лг - 2,4 г/кг

— х- -3,6 г/кг —ж—4,8 г/кг —»—6,0 г/кг

Рис. 2. Влияние однократного подкожного введения препарата на массу тела крыс - самцов, г (М±ш)

При тестировании животных в «открытом поле» и «приподнятом крестообразном лабиринте» до и после введения Афлогилекс - гель 0,02% и Афлогилекс - раствор для инъекций 0,1% демонстрировали преимущественно уравновешенный тип поведения, с умеренной локомоторной и поисковой активностью без проявления признаков тревожности.

В результате анализа массовых коэффициентов органов крыс и мышей, получавших исследуемый препарат и контрольных животных, статистически значимых различий не установлено.

Таким образом, при изучении острой токсичности препарата Афлогилекс-гель 0,02% и Афлогилекс - раствор для инъекций 0,1% было установлено, что препарат не оказывает негативного влияния на общее состояние и индивидуальное поведение экспериментальных животных.

При изучении хронической токсичности препарата Афлогилекс-гель 0,02% при накожном нанесении в течение 21 дневного срока и Афлогилекс -раствор для инъекций 0,1% при внутримышечном введении в течение 3-х месяцев масса лабораторных животных равномерно увеличивалась на протяжении всего исследования, как в контрольных, так и в опытных группах (рис. 3,4). Увеличение дозы препарата в группах животных не оказывало влияния на динамику массы.

Рис. 3. Влияние 21-дневного накожного нанесения препарата Афлогилекс - гель 0,02% на массу тела крыс - самцов, г (М±т)

1-йдень 14-йдень 30-йдень 60-йдень 90-йдень I - -*- ■ Контроль в -■»- ■ 1.0 мл/кг 3 —'— 2,5 мл/кг г? —--5.0 мл/кг;? I

Рис. 4. Влияние 3-х-месячного внутримышечного введения препарата Афлогилекс - р-р/инъекций 0,1% на массу тела крыс-самцов, г (М±ш)

Гематологические и биохимические показатели крови животных в группах, получавших исследуемый препарат внутримышечно и накожно в разных дозах, при сравнении с контрольной группой статистически значимых отличий не имели. Все показатели находились в пределах физиологических норм (Трахтенберг И.М. 1991).

При сравнении массовых коэффициентов органов лабораторных животных в группах, получавших исследуемый препарат внутримышечно и накожно в разных дозах, с контрольной группой статистически значимых отличий не выявлено. Все показатели находились в пределах физиологических норм (Трахтенберг И.М. 1991).

По результатам некропсии и гистологического исследования ежедневное внутримышечное и накожное введение тестируемого препарата Афлогилекс -раствор для инъекций 0,1 % и Афлогилекс - гель 0,02% не вызывало развития дистрофических, деструктивных, очаговых склеротических изменений в паренхиматозных клетках и строме внутренних органов. Препарат Афлогилекс - раствор для инъекций 0,1% и Афлогилекс - гель 0,02% не оказывали местно-раздражающего действия.

Проведенные токсикологические исследования, направленные на установление токсических, максимально переносимых и летальных доз лекарственного препарата Афлогилекс - гель 0,02% и Афлогилекс - раствор для инъекций 0,1%, показали что, исследуемый препарат можно отнести 4 классу безопасных веществ.

Определение противовоспалительной эффективности препарата Афлогилекс - раствор для инъекций 0,1% на модели экспериментального адъювантного артрита

При изучении противовоспалительной активности препарата Афлогилекс - раствор для инъекций 0,1% на модели экспериментального адъювантного артрита индуцированного полным адъювантом Фрейнда, установлено, что исследуемый препарат Афлогилекс в оптимальной дозе (0,1 мг/кг) в сравнении с препаратом Алфлутоп снижает температуру поврежденной конечности на 10 %, объем пораженной конечности на 50 % (рис. 5), деформацию плюсневых костей, сужение суставной щели проксимальных и дистальных суставов плюсны и стопы, ревматоидных узелков на 25 %.

3,5 -1-

Интакгная Контрольная Алфлутоп Афлогилекс Афлогилекс Афлогилекс Афлогилекс

0,05 мг/кг 0,1 мг/кг 0,2 мг/кг 0,4 мг/кг

Рис. 5. Динамика объема пораженной конечности крыс, мл * - (здесь и далее) различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой (р<0,05).

Исследуемый препарат Афлогилекс - раствор для инъекций 0,1% с 9 по 16 дни эксперимента проявил жаропонижающий эффект в исследованных дозах, что нашло отражение в статистически значимом снижении температуры поврежденной конечности в среднем на 5,2% - 10,0% (рис. 6).

и

кГ

о 7А --

¿Г

4*

IV

Рис. 6. Измерение температуры поврежденной конечности на 9е сутки Комплексную оценку рентгенограмм поврежденной конечности проводили по системе рангов (рис. 7).

Ранжировали следующие признаки: патологическая установка ногтевых фаланг - ранг 1, деформация плюсневых костей, сужение суставной щели проксимальных и дистальных суставов плюсны и стопы - ранг 5 , ревматоидные узелки - ранг 10. Ранги рассчитывались следующим образом: количество животных в группе имеющих данный признак умножали на ранг признака.

70

— 60

U в 50

те а. 40

« 30

£ 20

и 10

о

* *

r

Jt

V v

Л*4 ^ A^ ^ ^ ^ ^

У

js-

Y*

Рис. 7. Комплексная оценка рентгенограмм поврежденной конечности, ранги

Рис. 8. Лапа крысы из контрольной группы индукции патологии

Полученные данные свидетельствуют о том, что Афлогилекс - раствор для инъекций 0,1% обладает жаропонижающим, противовоспалительным, хондро- и остеопротекторным действием. Препарат Афлогилекс - раствор для инъекций 0,1% являясь высокоселективным ингибитором ферментов ЦОГ-2 и 5-JIOK природного происхождения (Крышень К.Л., Рыбакова A.B. и соавт., 2012), может оказаться перспективным для лечения воспалительных процессов опорно-двигательного аппарата в ветеринарии, не обладая при

через 22 дня после

Рис. 9. Лапа крысы из группы Афлогилекс 0.1 мг/кг

этом побочными эффектами глюкокортикоидов и неселективных нестероидных противовоспалительных препаратов. Производственные испытания препарата Афлогилекс

В ходе проведенных производственных опытов препарата Афлогилекс в двух лекарственных формах в комбинированной терапии воспалительных процессов молочной железы у коров с различной этиологией, было установлено, что применение препарата Афлогилекс совместно с антибиотиками уменьшает воспалительный процесс на 35% эффективнее, восстанавливает удои молока на 60% в сравнении с монотерапией антибактериальными препаратами.

Применение препарата Афлогилекс позволяет сократить сроки лечения воспалительного процесса у коров антибиотиками и в кратчайшие сроки восстановить нормальный объем удоев. Использование в комплексной терапии эффективных селективных противовоспалительных препаратов природного происхождения является альтернативой применения гормональных препаратов и неселективных противовоспалительных средств.

В результате проведенных клинических исследований препарата Афлогилекс при комбинированной терапии с антибиотиками при лечении воспалительных процессов у кошек и собак различной этиологии, установлено снижение зуда на 75% в первые сутки после инъекции, снижение воспаления кожи и слизистой на 43% эффективнее в сравнении с монотерапией антибиотиками после 5 дневной терапии.

Препарат Афлогилекс может быть рекомендован как безопасное и эффективное средство в базисной терапии лечения воспалительных процессов кожи и слизистой у животных. ВЫВОДЫ

1. В ветеринарию внедрен новый безопасный (4 класс) противовоспалительный препарат Афлогилекс в двух лекарственных формах.

2. Подтверждено противовоспалительное действие препарата Афлогилекс.

3. Афлогилекс проявляет противовоспалительное и репаративное действия.

4. На модели экспериментального адъювантного артрита препарат Афлогилекс проявляет противоотечное, жаропонижающие действия.

5. Применение препарата Афлогилекс в комбинированнрй терапии позволяет сократить сроки использования антибиотиков и может служить альтернативой применения глюкокортикоидов и неселективных нестероидных противовоспалительных препаратов.

6. Зарегистрирован в Росельхознадзоре и внедрен в ветеринарию новый противовоспалительный препарат в двух лекарственных формах Афлогилекс - раствор для инъекций 0,1% Рег.№ПВР-3-3.0/02688 от 30.01.2012 и Афлогилекс - гель 0,02% Рег.№ПВР-3-3.0/02688 от 30.01.2012.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Отработаны оптимальные лечебно-профилактические дозы препарата, которые составляют 0,1мг/кг для Афлогилекс - раствор для инъекций 0,1%, и 0,4 г/кг для Афлогилекс - гель 0,02% .

2. На кафедре фармакологии с токсикологией разработаны рекомендации по применению препарата Афлогилекс в двух лекарственных формах. Препарат зарегистрирован в Россельхознадзоре и внедрен в ветеринарию.

3. Полученные результаты используются в учебном процессе на кафедрах: фармакологии с токсикологией, акушерства и гинекологии, терапии и внутренних незаразных болезнях ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Список опубликованных работ по теме диссертации:

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки

РФ:

1. Рыбакова A.B., Демченко Д.В., Макарова М.Н., Пожарш/кая О.Н., Шиков

A.Н., Макаров В.Г., Забозлаев A.A., Романов М.Г. Применение Афлогилекса для лечения коров с маститами различной этиологии // Ветеринария. -2012, № 1. -С. 35-38.

2. Рыбакова A.B., Авдеева О.И., Макаренко И.Е., Макарова М.Н., Соколов

B.Д. Оценка острой токсичности противовоспалительного препарата Афлогилекс - гель 0,02% на аутбредных крысах и мышах // Международный вестник ветеринарии. -2012, № 3. -С. 28-32.

3. Крышень K.JI., Демченко Д.В, Рыбакова A.B., Дадали В.А., Рыдловская A.B., Пожарицкая О.Н., Макарова М.Н., Шиков А.Н., Макаров В.Г. Оценка противоаллергенных свойств нового полипептидного препарата из печени тресковых // Экспериментальная и клиническая дерматокосметология. -2012, № 2. -С. 38-42.

4. Рыбакова A.B., Крышень КЛ., Макарова М.Н., Соколов В.Д. Сравнительная оценка эффективности полипептидного препарата при эндометритах коров // Международный вестник ветеринарии. -2012, № 4. -С. 38-41.

5. Крышень К.Л., Рыдловская A.B., Гущин Я.А., Рыбакова A.B., Дадали В.А., Макаров В.Г. Оценка механизмов противовоспалительного действия препарата Афлогилекс, полученного из печени трески // Медицинский академический журнал. -2012, № 4. -С. 88-89.

6. Рыбакова A.B., Крышень К.Л., Макарова М.Н., Соколов В.Д. Изучение противовоспалительной активности нового ветеринарного препарата Афлогилекс на модели экспериментального адъювантного артрита// Международный вестник ветеринарии. -2013, № 1. -С. 39-43.

Статьи, опубликованные в сборниках материалов конференций:

1. Рыбакова A.B., Авдеева О.И., Макарова М.Н., Макаренко И.Е. Изучение безопасности противовоспалительного препарата Афлогилекс - раствор для инъекций 0,1 % II Эффективные и безопасные лекарственные препараты в ветеринарии. -2012, 22-24 мая: Матер. II международного съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов. -Санкт-Петербург, Россия. -2012. -С. 232-233.

8. Рыбакова A.B., Ковалева М.А., Макарова М.Н. Оценка ранозаживляющего действия геля Афлогилекс на модели линейной кожной раны // Современные проблемы анатомии, гистологии и эмбриологии животных. -2012, 3-6 апреля: Матер. III международной интернет - конференции. -Казань, Россия. -2012. -С. 97.

9. Рыбакова A.B., Макарова М.Н. Фармакотерапия эндометритов различной этиологии у коров // Современные проблемы анатомии, гистологии и эмбриологии животных. -2012, 3-6 апреля: Матер. III международной интернет - конференции. -Казань, Россия. -2012. -С. 98.

10. Rybakova A.V., Kovaleva M.A., Kryshen K.L., Avdeeva O.I., Makarenko I.E., Makarova M.N., Makarov V.G. Anti-inflammatory properties of peptide complex obtained from the cod liver (gadidae) on the model of adjuvant arthritis in the rat // Обзоры no клинической фармакологии и лекарственной терапии - Фитофарм. -2012,9-11 июля: Матер. XVI международного конгресса. - Санкт-Петербург, Россия. -2012. -С. 93.

11. Kryshen K.L.,Demchenko D.V., Rybakova A.V., Rydlovskaya A.V., Atsapkina A.A., Makarova M.N., Makarov V.G. Biochemical basis of anti-inflammatory properties of peptide complex obtained from the cod liver (gadidae) // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии - Фитофарм. -2012, 9-11 июля: Матер. XVI международного съезда. -Санкт-Петербург, Россия. -2012.-С. 73.

12. Шиков А.Н., Пожарицкая О.Н., Уракова И.Н., Рыбакова А.В., Крышень К.Л., Макаров В.Г. Новые технологии переработки гидробионтов // Фармацевтические и медицинские биотехнологии. -2012,20-22 марта: Материалы Биотехнология: состояние и перспективы развития. - Москва, Россия. -2012.-С. 385.

13. Рыбакова А.В., Авдеева О.И., Макарова М.Н., Макаренко И.Е. Изучение безопасности противовоспалительного препарата Афлогилекс-гель 0,02% // Инновации в современной фармакологии. -2012, 18-21 сентября: Материалы IV съезда фармакологов России. - Казань, Россия. -2012. -С. 160-161.

14. Крышень K.JI., Ацапкина А.А, Рыбакова А.В., Демченко Д.В., Рыдловская

A.В., Пожарицкая О.Н., Макарова М.Н., Макаров В.Г. Двойной селективный ингибитор циклооксигеназы-2 и 5-липооксигеназы природного происхождения. -2012, 18-21 сентября: Материалы IV съезда фармакологов России. - Казань, Россия. -2012. - С. 105.

15. Крышень K.JI., Рыбакова А.В., Рыдловская А.В., Макарова М.Н., Дадали

B.А., Макаров В.Г. Биохимические основы противовоспалительного действия нового полипептидного комплекса, полученного из печени трески // Материалы всероссийской молодежной конференции «Фармакологическая коррекция процессов жизнедеятельности. Доклинические и клинические исследования новых лекарственных препаратов». - Уфа, 8-10 июля 2012. - С. 92-94.

Подписано в печать 6 мая 2013г. Усл. печ. л. 2,6 Формат 60x84 1/16 Офсетная бумага, офсетная печать Тираж 100 экз. Заказ №4112 195009, Санкт-Петербург, «ООО СВ-центр» Пл. Ленина, Ул. Комсомола,41

Q

t>

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Рыбакова, Анна Владимировна, Санкт-Петербург

Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение

Высшего Профессионального Образования Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины

На правах рукописи

04201:359087

РЫБАКОВА АННА ВЛАДИМИРОВНА

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ И ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

ПРЕПАРАТА АФЛОГИЛЕКС

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор В.Д. Соколов

Санкт-Петербург 2013

Оглавление

Список сокращений......................................................................................................4

Введение......................................................................................................................5

Глава 1. Литературный обзор......................................................................................9

1.1. Воспаление, как фактор выбраковки животных.............................................9

1.3. Воспалительные реакции с аллергической компонентой............................27

1.4. Лекарственные средства, применяемые для лечения воспалительных процессов..................................................................................................................31

1.5. Новое поколение препаратов из гидробионтов............................................45

Глава 2. Материалы и методы...................................................................................50

2.1. Исследуемые препараты..................................................................................50

2.3. Биометрические показатели лабораторных животных на модели адъювантного артрита.............................................................................................56

2.5. Методы оценки биохимических показателей крови....................................57

2.6. Патоморфологическое исследование.............................................................57

2.7. Статистическая обработка данных.................................................................59

Глава 3. Результаты исследований............................................................................60

3.1. Результаты доклинических исследований.....................................................60

3.1.1. Результаты исследования острой токсичности препарата Афлогилекс - гель 0,02%..........................................................................................60

3.1.3. Результаты исследования острой токсичности препарата Афлогилекс - раствор 0,1 % на аутбредных крысах и мышах..............................82

3.1.4. Результаты изучения хронической токсичности лекарственного препарата Афлогилекс - раствор для инъекций 0,1% на аутбредных крысах........................................................................................................................94

3.1.5. Результаты исследования противовоспалительной активности Афлогилекс - раствор для инъекций 0,1% на модели адъювантного артрита.....................................................................................................................105

3.2. Результаты производственных испытаний..................................................111

3.2.1. Результаты применения исследуемого препарата Афлогилекс при

лечении мастита различной этиологии у коров...................................................111

3.2.3. Результаты применения исследуемого препарата Афлогилекс при лечении воспалительных процессов различной этиологии у кошек и

собак........................................................................................................................114

Обсуждения и заключение.......................................................................................117

Выводы...................................................................................................................124

Практические рекомендации...................................................................................125

Литература................................................................................................................126

Приложение....................................................................................151

Список сокращений.

AJIT - аланинаминотрансфераза ACT - аспартатаминотрансфераза В/м - внутримышечно ГК - глюкокортикоиды ЛТ - лейкотриены

Hi IB С - нестероидное противовоспалительное средство

ПГ - простагландини

П/к - подкожно

ЦОГ - 1 - циклооксигеназа - 1

ЦОГ - 2 - циклооксигкназа - 2

ЩФ - щелочная фосфатаза

5 - ЛОГ - 5 - липоксигеназа

Введение.

Актуальность темы

Благодаря развитой системе профилактики целого ряда инфекционных заболеваний, значимость причиняемого ущерба от воспалительных заболеваний превосходит таковую, которая регистрируется при инфекционной патологии (Новикова C.B., 2004; Соколов В.Д., 2008). В настоящие время воспаление оставаться центральной проблемой медицины и ветеринарии (Soma L.R., 2012). В ветеринарии наиболее часто встречаются патологии воспалительного генеза у крупного рогатого скота (маститы, эндометриты, болезни копыт, различные травмы) и мелких домашних животных (дерматиты, отиты, пододерматиты) (Соколов В.Д., 2009; Гуляева М.Е., 2011). В качестве лекарственных средств, для лечения воспалительных процессов применяют множество различных соединений, из них большую часть составляют антибактериальные, нестероидные противовоспалительные и гормональные препараты. Однако превосходящее их количество составляют препараты химической природы, которые, как известно, не всегда обладают достаточной фармакологической активностью, и которым присущи прогнозируемые и непрогнозируемые побочные эффекты, что, в значительной степени, при многих патологических состояниях и при взаимодействии с лекарствами базисной терапии или препаратами базисной терапии или препаратами разных фармакологических групп затрудняет их применение (Петров В.А., 2000; Соколов В.Д., 2011).

Современные требования в ветеринарии диктуют необходимость поиска новых лекарственных препаратов для лечения воспалительных процессов различной этиологии, которая позволит снизить до минимума развитие нежелательных побочных реакций, осложняющих и удлиняющих процесс выздоровления животного, в т.ч. депрессию, страдание и боль (ВОЗЖ, 2010; Елесин A.B., 2004; Гугоннар М., 2002).

В настоящее время терапия препаратами природного происхождения широко используется в мировой медицинской и ветеринарной практике. Такие препараты находят применение для лечения и профилактики, а также

комплексной терапии различных заболеваний (Соколов В.Д., 2010; Mayer A.M., 2009). Гидробионты, как источник новых ветеринарных препаратов активно привлекают внимание биологов и химиков всего мира в последние десятилетия (Соколов В.Д., 2011; Rodriguez A.D., 2009). Водная среда обитания является достаточно жесткой и агрессивной, поэтому гидробионты вынуждены продуцировать вещества с широким спектром биологической активности (Соколов В.Д., 2009; Kim S.-K., 2010). Зачастую вещества из морских организмов оказывают существенно больший эффект, чем известные фитопрепараты и синтетические средства. Чаще всего из гидробионтов выделяют: пептиды, липиды, полисахариды, полиненасыщенные жирные кислоты, антиоксиданты, ферменты, витамины и минералы (Cha К.Н., 2010). С использованием традиционных и оригинальных технологических подходов удалось разработать технологии высокоэффективных комплексов из гидробионтов с противовоспалительными, противоаллергическими и антиоксидантными и иммуномодулирующими свойствами.

В ЗАО «Санкт-Петербургском институте фармации» был разработан оригинальный стандартизированный препарат Афлогилекс, который представляет собой экстракт из печени рыб тресковых пород. Препарат содержит в качестве действующего вещества пептидно-фосфолипидный комплекс, свободные аминокислоты и микроэлементы (Na, К, Са, Mg, Fe, Cu, Zn), играющие большую роль в обменных процессах.

Афлогилекс - является высокоселективным ингибитором ферментов ЦОГ-2 (циклооксигеназа-2) и 5-ЛОГ (5-липоксигеназа) (Крышень К.Л., Рыбакова А.В., 2012). Препарат разрабатывался для лечения воспалительных и аллергических процессов. Цель исследования

Изучить эффективность и безопасность нового противовоспалительного ветеринарного препарата Афлогилекс в двух лекарственных формах, применяемого для лечения острых и хронических воспалительных и аллергических процессов на коже и слизистых оболочках у животных, для

предоставления соответствующих материалов в Россельхознадзор для получения разрешения на использование данного средства в ветеринарной практике.

Были поставлены следующие задачи:

1) Выяснить безопасность применения нового противовоспалительного препарата в двух лекарственных формах Афлогилекс - 0,02% гель и Афлогилекс - 0,1 % раствор на лабораторных животных.

2) Определить фармакологическую активность препарата Афлогилекс на модели экспериментального адьювантного артрита.

3) Выяснить эффективность комбинированной терапии препаратом Афлогилекс у коров, кошек и собак.

4) Подготовить материалы для регистрации в Россельхознадзоре.

Научная новизна исследования

На основании данных доклинических и клинических исследований впервые установлены противовоспалительные свойства нового препарата Афлогилекс, полученного из печени тресковых рыб. Изучена токсичность препарата Афлогилекс в двух лекарственных формах на разных тест-системах, установлен класс его токсичности и отсутствие негативного действия на жизненно-важные органы и системы, что обуславливает безопасность его применения у животных при воспалительных процессах.

Научно-практическая значимость

Экспериментально доказано, что Афлогилекс обладает противовоспалительным действием. Полученные результаты in vitro, по ингибированию ферментов ЦОГ-2 и 5-ЛОГ (Крышень К.Д., Рыбакова A.B., 2012), были подтверждены in vivo на коровах и плотоядных животных.

Данные доклинических и клинических исследований полученные в результате работы были включены в регистрационное досье и поданы на регистрацию в Россельхознадзор. В результате были зарегистрированы и внедрены в ветеринарию Афлогилекс - раствор для инъекций 0,1% Рег.№ПВР-3-

3.0/02687 от 30.01.2012 и Афлогилекс - гель 0,02% Рег.№ПВР-3-3.0/02688 30.01.2012.

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Воспаление, как фактор выбраковки животных

Воспаление, как основной патологический процесс, составляющий основу большинства болезней, как человека, так и животных, продолжает оставаться центральной проблемой медицины и ветеринарии в наше время (Soma L.R., 2012).

В ветеринарии наиболее часто встречаются патологии воспалительного генеза у крупного рогатого скота (маститы, эндометриты, болезни копыт, различные травмы) и мелких домашних животных (дерматиты, отиты, пододерматиты). Перевод животноводства на промышленную основу привел к значительному изменению биотехнологических параметров содержания, кормления и эксплуатации сельскохозяйственных животных. В одних случаях это вызвало уменьшение частоты некоторых заболеваний, в других появление новых незаразных болезней (Лютинский С.И., 2001; Соколов В.Д., 2010).

Современное развитие животноводства направлено на интенсификацию отрасли за счет повышения уровня интенсивности молочной продуктивности коров и минимизации затрат на основные технологические операции. Последствием повышения уровня молочной продуктивности коров является нарушение воспроизводительной способности животных, рождение молодняка с низким уровнем жизнеспособности, что связано с высоким уровнем гормональных нарушений у коров в процессе реализации лактационной доминанты. При этом наблюдается неуклонное снижение поголовья молочного скота при одновременном сокращении сроков его производственного использования (Соколов В.Д., 2009; Гуляева М.Е., 2011). Одной из важнейших задач современного скотоводства является продление сроков хозяйственного использования коров. Длительная эксплуатация животных позволит лучше организовать, а также провести селекционную работу со стадом и повысить эффективность ведения этой отрасли скотоводства (Солдатов А.П., 2004). Анализ возрастных групп стад свидетельствует, что коров используют в среднем в течение 3-5 лактаций, телята часто болеют впервые дни жизни. В

патологии телят одно из ведущих мест занимают болезни желудочно-кишечного тракта (переболевают до 75% телят) и болезни органов дыхания в среднем -25%, при этом отход молодняка составляет до 2,7% к обороту стада (Аржанова E.H., 2012). Резко возросла заболеваемость животных незаразными болезнями, которые составляют 98% всех заболеваний (рис. 1) (Герцева К.А., 2012).

Маститы 16%

Болезни органо дыхания 20%

Прочее 5%

Травмы

2%

Болезни органов размножения

22%

Болезни органов пищеварения

33%

Болезни обмена веществ

2%

Рис. 1. Заболеваемость крупного рогатого скота незаразными болезнями

В настоящее время, благодаря развитой системе профилактики целого ряда инфекционных заболеваний, ущерб, причиняемый, ими не является настолько огромным. На первое место по значимости причиняемого ущерба вышли заболевания незаразной этиологии, которые в большинстве случаев являются следствием сочетанного воздействия целого ряда причин: плохое качество кормления, содержания и эксплуатации сельскохозяйственных животных (Новикова C.B., 2004; Соколов В.Д, 2008).

Основные незаразные болезни, в результате которых происходит выбраковка коров в России и за рубежом, можно разделить на группы: болезни вымени - 18%, болезни конечностей - 3%, нарушение обмена веществ - 22%, низкая продуктивность - 4%, яловость - 37% (Беженян И.В., Хабарова Г.В., 2012).

По данным Студенцова А.П. (1952), Шипилова B.C. (1967), Зверевой Г.В. (1979), Ильинского Е.В. (1983), Парикова В.А. (1990), Ивашуры А.И. (1998), Слободяника В.И. (2000) и ряда других отечественных и зарубежных специалистов, воспаление вымени занимает одно из ведущих мест в неинфекционной патологии у коров. Несмотря на очевидные научные достижения в изучении болезней молочной железы у животных наблюдается тенденция увеличения удельного веса мастита в стадах крупного рогатого скота. Данная проблема нашла свое отражение в работах многих авторов: Студенцов

A.П. (1949, 1965), Зверевой Г.В. (1953-1994), Хилькевича Н.М. (1967-1994), Парикова В.А. (1968-2001), Ильинского Е.В. (1977-1999), Никитина В .Я. (19701994), Ивашуры А.И. (1972-1998), Логвинова А.И. (1964-1979), Слободяника

B.И (1982-2000), Миролюбова М.Г. (1979-1991), Полянцева Н.И. (1971-1989) Солдатова А.П. (1983-1988), Бороздина Э.К. (1978-1989), Попова Л.К. (19852000) и других ветеринарных акушеров. Проводимые профилактические мероприятия не всегда достигают желаемой цели и нуждаются в постоянном усовершенствовании и конкретизации с учётом особенностей этиологии воспаления молочной железы у коров в каждом хозяйстве.

По данным Международной молочной федерации, маститом ежегодно болеет около 25% поголовья дойного стада, причем субклинический мастит имеет место у 80-90% заболевших животных (Белкин Б.Л., 1999; Париков В.А., 2000). Особенно широкое распространение мастит у коров принимает при запуске, сухостое и в начале лактации (Иритыкин М.П., 2005; Алиев А.Ю., 2007; Соколов В.Д., 2008). При этом экономический ущерб, наносимый хозяйствам от мастита складывается: из снижения годового удоя на 10 -15%, затрат на лечение и профилактику (около 10%), расходов, связанных с вынужденной выбраковкой коров по причине гипо- и агалактии, заболеваемости и гибели телят из-за выпойки им некачественного молозива и др. Следует отметить, что многие болезни (туберкулез, бруцеллез, ящур и кокковые инфекции) могут передаваться человеку с молоком, при мастите. (Шакиров О.Ф., 2001; Гончаров В.П., 2004).

Непременными условиями, обеспечивающими успешное развитие животноводства, являются: профилактика и ликвидация болезней маточного поголовья, интенсивное воспроизводство стада, максимальное получение и сохранение здорового приплода (Волосков П.А., 1960; Логвинов Д.Д., 1975; Шипилов B.C., 1977; Ильинский Е.В., 1983; Нежданов А.Г., 1995 и др., Дуников B.C., 2011; Беженян И.В., Хабарова Г.В., 2012).

В молочных животноводческих хозяйствах РФ наметилась тенденция к снижению процента получения телят на 100 коров (рис. 2)(Кривошлыков B.C., 2011; 2010).

84

Рис. 2. Динамика рождаемости телят

Среди множества причин, снижающих темпы воспроизводства стада, значительное место занимает послеродовой эндометрит. Изучению причин возникновения данного заболевания посвящены работы отечественных и зарубежных ученых (Никитин В.Я., 2003; Нежданов А.Г., 2001; Б.В.Гаврилов, 2006).

Главную роль в недополучении телят и снижении молочной продуктивности занимает симптоматическое бесплодие, возникающее чаще всего в результате послеродовых и других заболеваний. Иванов В.В. (1996) отмечает, что симптоматическое бесплодие коров в 52% случаев обусловлено

эндометритом. При неэффективном лечении животных с послеродовым эндометритом, после клинического выздоровления наблюдается осложнение в форме скрытого эндометрита у 63% коров, что приводит к длительному или постоянному бесплодию (Гавриш В.Г., 1997; Лободин К.А., 2010; Племяшов К.В., 2010). Яцина В.В. 2002 регистрировал субклиническую форму эндометрита у 20-77% бесплодных коров. В связи с этим выбраковка коров, безуспешно осемененных 3 и более раза, достигает 20-38%.

В этиопатогенезе воспалительной реакции в слизистом слое матки особое место отводится различным микроорганизмам, состоянию иммунной системы и системе детоксикации (Турченко А.Н., 2001; Колчина А.Ф., 2001; Степанова И.П., 2004; Ахмедов В.Т., 2009; и др.). Заболевание эндометритом часто наблюдается после аборта, задержании последа, а так же он возникает в послеродовом периоде после клинически нормальных родов и составляет 2026% (Логвинов Д.Д. и соавторы 1976; Полянцев Н.И., 1990; Авдиенко B.C., 1992; Безбородин В.В., 1997; Муртазин Б.Ф., 1997; Гавриш В.Г., 2000 и др.). Одним из факторов обуславливающих бесплодие, явл