Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Факторы и механизмы структурно-функциональных изменений поверхностного гликопротеина ВИЧ-1 gp120 в течение ВИЧ-инфекции
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Факторы и механизмы структурно-функциональных изменений поверхностного гликопротеина ВИЧ-1 gp120 в течение ВИЧ-инфекции"
На правах рукописи
НАБАТОВ АЛЕКСЕЙ АНАТОЛЬЕВИЧ
Факторы и механизмы структурно-функциональных изменений поверхностного гликопротеина ВИЧ-1 £р120 в течение ВИЧ-инфекции
Специальность 03.01.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Санкт-Петербург - 2010
003493286
Работа выполнена на базе следующих научно-исследовательских учреждений: ННИУ «Биомедицинский центр», ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства России (ФГУП ГосНИИ ОЧБ), Межведомственная лаборатория по изучению СПИДа, Академический Медицинский центр университета Амстердама (АМЦ) (Нидерланды), Медицинский центр Свободного Университета Амстердама (МЦСУ) (Нидерланды), Медицинская школа Иельского университета (США).
Научный консультант:
Официальные оппоненты:
Ведущее учреждение:
Доктор биологических наук, профессор Козлов Андрей Петрович ННИУ «Биомедицинский центр»
Доктор биологических наук, профессор Кокряков Владимир Николаевич
НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН
Доктор биологических наук Евтушенко Владимир Иванович
ФГУ РНЦ радиологии и хирургических технологий
Доктор биологических наук Падкина Марина Владимировна
ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»
НИИ гриппа РАМН
Защита состоится « »
2010 г. в_часов на заседании совета
Д 212.232.09 по защите кандидатских и докторских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете (СПбГУ) по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, ауд. 90.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. A.M. Горького СПбГУ.
Автореферат разослан "_"
Ученый секретарь совета кандидат биологических наук
2010 г.
Л.С.Курилова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Эпидемия ВИЧ-инфекции широко распространилась в мире и Российской Федерации. По различным оценкам, к настоящему времени в мире насчитывается 40 миллионов ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом.
Темпы прироста ВИЧ-инфекции в России также свидетельствуют о драматической ситуации, сложившейся здесь. Тем не менее, исследователями проделана огромная работа в области молекулярной эпидемиологии ВИЧ-инфекции на территории стран бывшего Советского Союза, что может помочь при разработке специфической для данной территории вакцины. В частности, было показано, что штаммы ВИЧ-1, циркулирующие в странах бывшего СССР, чрезвычайно генетически гомогенны. Тем не менее, успехи в области разработки вакцины против ВИЧ/СПИД остаются более чем скромными, что связано с множеством причин, связанных с особенностями биологии ВИЧ.
Высокая генетическая изменчивость является характерной чертой многих, особенно РНК-содержащих, вирусов. Данная изменчивость представляет собой серьезную проблему для практической медицины, вызывая, в частности, ускользание вирусов от иммунного ответа хозяина, быстрое развитие лекарственной резистентности при неадекватной терапии вирусных инфекций и др. Изменчивость поставляет лишь материал для отбора, который регламентирован достаточно жесткими критериями иммунного давления и возможности жизнедеятельности вируса. То есть изменчивость, направленная на преодоление иммунного давления на вирус, не может выходить за определенные рамки, задаваемые репликативными способностями вируса. Вследствие того, что ВИЧ-1 все же не элиминируется иммунной системой хозяина, можно предположить существование каких-то отработанных в процессе эволюции вируса механизмов, с помощью которых он становится способен преодолевать это давление. Изучение факторов и механизмов взаимодействия вируса и хозяина являются чрезвычайно важными при разработке вакцины против ВИЧ, учитывающей возможную постоянную адаптацию вируса к организму инфицированного.
Настоящая работа является частью глобальных усилий, связанных с решением широкого круга вопросов патогенеза ВИЧ. Решение данных вопросов является условием создания вакцины против ВИЧ.
Цели и задачи исследования. Настоящая работа была направлена на изучение закономерностей адаптации вируса в течение индивидуальной ВИЧ-инфекции. Целями работы являлись:
1. Изучение механизмов, опосредующих изменения поверхностного гликопротеина §р120 ВИЧ-1 в течение индивидуальной ВИЧ-инфекции.
2. Изучение факторов среды, определяющих механизм изменений поверхностного гликопротеина §р120 ВИЧ-1 в течение индивидуальной ВИЧ-инфекции.
Выбранный подход предусматривал использование генетически гомогенных вирусов, а также широкого набора иммунохимических, вирусологических и молекулярно-биологических методов. В связи с этим работа предусматривала решение следующих задач:
1) Изучить возможность выявления хозяин-специфических факторов в развитии гуморального ответа на ВИЧ.
2) Изучить взаимосвязь генетических изменений ВИЧ-1 и фенотипических характеристик ВИЧ-1 в течение ВИЧ-инфекции.
3) Изучить возможные факторы, помогающие вирусу во время ВИЧ-инфекции.
4) Изучить возможность манипулирования экспрессией хемокиновых рецепторов посредством статинов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1) Индивидуальный гуморальный иммунный ответ к УЗ-петле gpl20 ВИЧ-1 обладает выраженной специфичностью.
2) Изменения в структуре яр120 ВИЧ-1, которые происходят в течение ВИЧ-инфекции при смене фенотипа Я5->Х4, связаны с поддержанием баланса репликативных способностей вируса и его адаптации к иммунному давлению.
3) Изменение профиля гликозилирования gpl20 является одним из основных механизмов, посредством которых меняется конформация и функциональная специфичность gpl20.
4) Восстановление адаптированности вируса после приобретения новых свойств, связанных с изменениями в gpl20, происходит посредством компенсаторных мутаций в функционально-связанных областях gpl20.
5) Вирусы с наиболее уязвимой структурой С04-связывающсго домена, возникающие в процессе смены фенотипа R5—>Х4, имеют наибольший протективный потенциал со стороны DC-SIGN-экспрессирующих клеток.
6) Инкубация DC-SIGN-экспрессирующих клеток с нейтрализованным антителами ВИЧ-1 восстанавливает инфекционную способность вируса, если антитела не направлены на СБ4-связываюший домен gpl20.
7) Взаимодействие лангерина с gpl20 является ингибирующим фактором при передаче ВИЧ-1.
8) Применение статинов уменьшает представленность рецепторов CCR5 на цитоплазматической мембране CD4+ Т клеток и снижает уровень репликации Я5-вирусов.
Научная новизна исследования.
Данные, представленные в работе, отражают новые представления о процессах взаимодействия вирусных и иммунных факторов в процессе ВИЧ-инфекции и объясняют их влияние на патогенез ВИЧ-инфекции. Полученные в работе данные являются оригинальными и не были описаны ранее.
В данном исследовании впервые показано, что специфичность гуморального иммунного ответа на УЗ-пстлю поверхностного гликопротеина gpl20 ВИЧ-1 носит индивидуальный характер и не определяется всецело структурой УЗ-петли.
В данном исследовании впервые раскрыта взаимосвязь механизмов реструктуризации gpl20, которые происходят в течение индивидуальной ВИЧ-инфекции при смене фенотипа R5—>Х4, и устойчивости вируса к таким факторам, как наличие нейтрализующих антител и уровень хемокинов.
Впервые показана взаимосвязь между «открытой» конформацией CD4-связывающего домена и уровнем взаимодействия gp 120 с DC-SIGN.
Впервые раскрыт механизм, посредством которого уже нейтрализованные антителами вирусы способны вновь приобретать инфекционные свойства после захвата их DC-SIGN-экспрессирующими дендритными клетками.
Впервые показано, что статины - препараты, оказывающие подавляющее действие на синтез холестерина, способны подавлять репликацию Я5-штаммов ВИЧ-1 через подавление экспрессии CCR5 на клеточной поверхности, а также напрямую, понижая репликативные способности ВИЧ-1.
В данной работе впервые показана анти-ВИЧ-1-протективная роль клеток Лангерганса и их способность ингибировать репликацию вируса посредством взаимодействия лангерина с поверхностным гликопротеином gpl20 ВИЧ-1.
Научно-практическая значимость.
Исследование относится к разряду научно-практических работ.
Изучение компенсаторных механизмов, связанных с возможностью ВИЧ-1 поддерживать свою репликационную способность на фоне иммунного противодействия, имеет большое значение при разработке вакцины против ВИЧ-инфекции.
Достигнутое в данном исследовании повышение чувствительности и специфичности стандартного метода пептидного иммуноферментного анализа позволило выявить индивидуальные отличия гуморального иммунного ответа, что делает метод, изначально разработанный для типирования ВИЧ-1, мощным инструментом в иммунологии при изучении особенностей развития гуморального иммунного ответа.
Изучение защитной функции лангерина может иметь свое применение при разработке анти-ВИЧ-1-микробицидов, ибо сохранение ВИЧ-1-ингибирующего потенциала лангерина представляется чрезвычайно важным, вследствие схожести специфичности таких лектинов, как лангерин и DC-SIGN.
Показанная в исследовании возможность модуляции функциональной сети RANTES-CCR5 посредством статинов, а также прямое действие статинов на ВИЧ-1 позволяет рассматривать возможность включения статинов в курс анти-ВИЧ-терапии, особенно на ранних стадиях ВИЧ-инфекции.
Личный вклад автора
Работа выполнена автором на базе следующих научно-исследовательских учреждений: AHO «Биомедицинский центр», ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства России (ФГУП ГосНИИ ОЧБ), Межведомственная лаборатория по изучению СПИДа, Академический Медицинский центр университета Амстердама (АМЦ) (Нидерланды), Медицинский центр Свободного Университета Амстердама (МЦСУ) (Нидерланды), Медицинская школа Йельского университета (США). Автором выполнены планирование и проведение экспериментальных исследований, теоретическое обобщение полученных результатов и сформулированы выводы. Отдельные разделы выполнены совместно с бывшими и нынешними сотрудниками ФГУП ГосНИИ ОЧБ и Биомедицинского центра Козловым А.П., Емельяновым A.B., Машарским А.Э., Веревочкиным C.B., Мурашевым Б.В. Работа по изучению нейтрализации вирусов, а также выявлению взаимосвязей между адаптацией ВИЧ и хемокиновыми рецепторами, проводилась в тесном взаимодействии с Таисом фан Монтортом (Т. van Montfoort), Рохиром Сандерсом (R. Sanders), Вильямом Пакстоном (W.A. Paxton), Мишелем де Баром (Michel de Baar), Джордиусом Поллакисом (Georgios Pollakis) (АМЦ), что выразилось в ряде совместных публикаций. Работы по изучению взаимосвязи адаптации ВИЧ, патогенеза ВИЧ-инфекции и дендритных клеток проводились совместно с Тенисом Гяйтенбейком (Teunis Geijtenbeek), Иветтой фан Койк (Yvette van Kooik) и Лотой де Витте (Lot de Witte) (МЦСУ), что также нашло отражение в ряде совместных публикаций. Отдельные этапы работы, которые вылились в совместные публикации, проводились совместно с В. В. Лукашевым (Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского; АМЦ).
Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, докладывались на следующих конференциях:
- IAS 2007 - 4th IAS Conference on HIV Pathogenesis, Treatment and Prevention, 22-25 July 2007 - Sydney, Australia
- HIV Pathogenesis and HIV vaccines. Keystone Resort, Keystone, Colorado, USA, March 27 - April 2, 2006.
- 19th Meeting of the European Macrophage and Dendritic cell Society (EMDS) 2005, Amsterdam, The Netherlands, 6-8 October, 2005
- HIV Vaccines: Current Challenges and Future Prospects. Keystone, USA, April 9 - 15, 2005
- AIDS Vaccine 2004 International Conference, Lausanne, Switzerland, August SO^-September 1st, 2004.
- 12ш International Conference on «AIDS, Cancer and Related Problems», St.-Petersburg, Russia, May 24-28, 2004.
- 2nd European Conference on Experimental AIDS Research, Stockholm, Sweden, May 31 - June 3, 1997.
- 10lh Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, Boston, USA, 1014 February, 2003.
- 2nd IAS Conference on HIV Pathogenesis and Treatment, Paris, France, 13-16 July, 2003
- 3rd European Conference on Experimental AIDS Research, Munich, Germany, February 28 — March 3, 1998
- CIS Congress of Immunological and Allergological Societies, IV International Congress on Immunorehabilitation, I Conference "Vaccines of New Generation and Medical Diagnostic Systems of the Future", Sochi, Russia, July 5-9, 1998.
- 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28 —July 3, 1998.
Публикации. Основные результаты исследования, выводы и положения диссертации опубликованы в 14 статьях в отечественных и иностранных журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, включающих 3 раздела, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 251 источник. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами и 42 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава «Обзор литературы» содержит сведения о структуре вириона ВИЧ, его жизненном цикле и функции различных частей вируса. Особое внимание уделено механизмам изменчивости вируса, а также факторам, определяющим данную изменчивость. Кроме того, представлены современные данные о структуре и функции поверхностного гликопротеина ВИЧ-1 gpl20, а также факторах иммунологического давления, которые оказывают наибольше влияние на изменчивость gpl 20.
Материалы и методы исследования
В данном исследовании были использованы образцы крови от ВИЧ-инфицированных пациентов из Санкт-Петербурга и различных регионов Украины. Материалы были любезно предоставлены Городской иммунологической лабораторией (Санкт-Петербург, Россия) и Украинским национальным комитетом по профилактике наркомании и СПИДа (Киев, Украина). Оттуда же были получены и эпидемиологические данные о путях инфицирования. Образцы крови использовались для получения осветленных сывороток, плазм крови и ДНК мононуклеарных клеток периферической крови.
Все образцы были закодированы. Пациенты давали информированное согласие на использование их биологического материала в экспериментальных целях. Все манипуляции с инфекционно опасным материалом проводились в отдельном помещении с соблюдением правил противоэпидемического режима для работы с инфекционным материалом и возбудителями III группы патогенности в соответствии с "Временной инструкцией о противоэпидемическом режиме работы с материалом, зараженным ВИЧ, больными ВИЧ и при обследовании населения и доноров", утвержденной Министерством здравоохранения СССР 12.03.86 г. Культивирование ВИЧ-1 производилось в условиях, поддерживающих уровень биологической безопасности ML2 (Нидерланды) или BL2 (США).
В процессе исследования использовался ряд адгезионных и суспензионных культур клеток. Культивирование и хранение данных культур клеток проводилось согласно рекомендациям Американской коллекции тканей и клеток (АТСС -American Tissue and Culture Collection) для данных культур. Культуры первичных клеток крови были получены методом изоляции из донорской крови или нормальных тканей здоровых людей, полученных при пластической хирургии. Некоторая часть
первичных клеток была получена методом культивирования клеток-предшественников в присутствии соответствующих ростовых факторов.
В работе использовалась целая серия молекулярно-клонированных вирусов, имитирующих эволюцию ВИЧ-1 в течение ВИЧ-инфекции. Данные вирусы были получены на основе встроенного в плазмиду генома вируса LAI (gpl20 от штамма НхВ2), в котором участки, кодирующие регионы VI и V3, были заменены на соответствующие от пациента АСН168 (Amsterdam Cohorts Studies - Исследование амстердамской когорты геев и наркоманов). Данный пациент прогрессировал к СПИД, и на всем протяжении ВИЧ-инфекции проводился генетический анализ вирусов циркулирующих у него в крови. На основе этих данных генно-инженерным путем участки встроенного в плазмиду генома вируса заменялись таковыми от вирусов детектированных на разных стадиях заболевания. Для изучения ранних стадий заболевания участок, кодирующий петлю VI, в указанной плазмиде не менялся, ввиду схожести с таковых у пациента и штамма НхВ2. Последовательности УЗ-петли, соответствующие зарядам +3 (асимптоматичная стадия) и +6 (симптоматическая стадия), были аналогичны выявленным у пациента. Последовательности УЗ-петли, соответствующие зарядам +4 и +5, были воссозданы искусственно для имитации процесса роста заряда. Исчезновение сайта гликозилирования в УЗ-пстле наблюдалось у пациента только на стадии СПИДа. В работе также использовались лабораторно-адаптированные изоляты ВИЧ-1 различного фенотипа.
В работе использовались методы световой и конфокальной микроскопии.
Молекулярно-биологические методы включали методы генной инженерии, клонирования, бактериальной трансформации, изоляции нуклеиновых кислот, обратной транскрипции, амплификации специфичных последовательностей методом полимеразной цепной реакции, секвенирование нуклеотидных последовательностей. Иммунологические методы включали методы проточной цитофлюорометрии, иммуноферментного анализа, методы нейтрализации вирусов.
Для стандартного статистического анализа данных использовались приложения MS 0ffice-2007 «MS-Excel 2002» (Microsoft Corp., США), SSPS, «STATISTICA 5.0» (StatSoft Inc., США). Достоверность полученных результатов оценивали с использованием соответствующих статистических коэффициентов при уровне значимости тестируемой гипотезы р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
На первом этапе исследования изучались факторы иммунного ответа и возможность их регулировки. В частности, предметом изучения являлось соответствие реактивностей сывороток разных пациентов с определенной антигенной детерминантой уровню различия этой антигенной детерминанты между пациентами. При этом основные усилия были сфокусированы на изучении гуморального иммунного ответа к одному из наиболее иммуногенных участков gpl20, так называемому основному нейтрализуемому домену - УЗ-петлс. Для этого был выбран следующий алгоритм: I) изучение популяционного разнообразия первичной аминокислотной последовательности УЗ-петли и основ этого разнообразия; 2) изучение гуморального иммунного ответа на УЗ-петлю у ВИЧ-инфицированных при помощи панели УЗ-имитиругощих пептидов в форме множественных антигенных пептидов; 3) сопоставление данных разнообразия аминокислотной последовательности УЗ-петли от соответствующих пациентов с данными разнообразия гуморального ответа к этой антигенной детерминанте.
Методом сравнения дендрограммы структурной схожести УЗ-петли с дендрограммой кластерного анализа реактивности сывороток соответствующих пациентов (Рис. 1А и В, соответственно) было показано, что гуморальный иммунный ответ к изучаемому эпитопу носит ярко выраженный индивидуальный и консервативный характер. Это является первым доказательством индивидуальности гуморального иммунного ответа при ВИЧ-инфекции, что может быть связано с индивидуальностью главного комплекса гистосовместимости второго типа (ГКГС II), играющего важную роль при презентации антигена В-клетками. В свою очередь, консервативный характер гуморального иммунного ответа, более известный как феномен «первородного антигенного греха», также сочетается с данной теорией, которая подразумевает клональную экспансию В-клеток с наилучшим для данного индивида соотношением специфичностей антитела и ГКГС II.
А)
В)
Ф
0,3 0.4
игскадэ <1|5!апсе
Рисунок 1. Дендрограмма схожести УЗ-петли (А) и дендрограмма кластерного анализа реактивности сывороток соответствующих пациентов с пептидами, имитирующими УЗ-петлю (В). 4-х лучевые и 5-ти лучевые звездочки обозначают сыворотки групп ик-А и ик-В, соответственно. Буквы а, Ь и с указывают на сыворотки эпидемиологически связанных пар.
Следующая глава раздела "Результаты" посвящена влиянию ингибиторов синтеза холестерина - статинов на уровень репликации ВИЧ-1. Для изучения анти-ВИЧ активности статинов были выбраны следующие статины: лова-(Ьоуа), мева-(Meva) и CHMBa-(Simva (Sim)) статины. Последний использовался в неактивной (N) и активной (А) формах. При этом следует отметить, что неактивная форма все же могла активироваться клетками в процессе их жизнедеятельности.
На основании того, что репликация ВИЧ в присутствии статинов была снижена по сравнению с контролем, причем как для Х4-, так и для R5-BnpycoB (Рис. 2 А), было высказано предположение, что статины обладают прямым антивирусным действием.
Последнее может быть связано с тем, что холестерин является необходимым элементом вирусной мембраны, в противном случае вирус теряет свою инфекционность. Тем не менее, было показано, что статины обладают повышенным действием против R5-BHpycoB (Рис. 2 В и С). Дальнейшее изучение данного феномена показало, что обработка статинами приводит к снижению уровня представленности CCR5 на поверхности CD4+ Т-клеток. Данный феномен, видимо, связан с тем, что этот хемокиновый рецептор (корецептор Я5-вирусов) пальмитилирован и находится на мембране в составе так называемых «липидных плотиков», одним из основных компонентов которых является холестерин. Хемокиновый рецептора CXCR4 (корецептор Х4-вирусов, соответственно) не обладает данными свойствами. Более того, было показано, что статины приводят к повышенной секреции клетками хемокина RANTES, который способен ингибировать связывание RS-вирусов ВИЧ-1 с CCR5. Интересно, что уровень экспрессии гена RANTES при этом остается без существенных изменений.
о L20
Е £ 1 .00
—i ^
а з
о о.«ю
0,2(1
(i.l)ll
Lova
«leva SiiTi{A) Sim(N)
Lovs
Sim{A)
Sim!»4>
X4
U! 1.8 0,3
2.11 J.O 13 1.11
ï4v\
l.O 0,3 1.0
u 03 in Ratio treated/untreated
4t
a. 6
t.o iu i.o
2.ti 3.0 03 i.o
\
2.П 1.« 63 1.0
2.0 1.8 U 1-в Ratio treated/ontreatsd
Рисунок 2. Обработка статинами преимущественно ингибирует репликацию R5-вирусов по сравнению с Х4-вирусами. Репликация вируса отслеживалась по изменению концентрации вирусного корового антигена р24. (А) Инфекционный профиль (TCID50/ml) R5- (черные столбики) и Х4-вирусов (белые столбики) отслеживался на СБ4+-лимфоцитах, обработанных (treated) соответствующими статинами, и сравнивался с таковым у необработанных (untreated) клеток (отношение - ratio). (В и С) СБ4+-лимфоциты, преобработанные статинами в течение четырех дней, инфицировались Х4- (В) или RS-вирусами (С), после чего последние культивировались в отсутствие статинов и с клетками, необработанными статинами. Результаты представлены в сравнении с таковыми, полученными для необработанных клеток (черные кружки).
Следующая глава раздела "Результаты" посвящена влиянию таких гуморальных факторов как уровень хемокинов и присутствие нейтрализующих антител на выживаемость вирусов, представляющих разные этапы индивидуальной ВИЧ-инфекции и имитирующих эволюцию вируса от Я5-фенотипа к Х4-фенотипу. Основные отличия изучаемых вирусов заключались в уровне гликозилирования У1/2-и УЗ-петель поверхностного гликопротеина др120 ВИЧ-1. Кроме того, вирусы отличались зарядом УЗ-петли. Было показано, что вирусы, имитирующие ранние стадии ВИЧ инфекции и имеющие сайт гликозилирования в УЗ-петле, а также низкий заряд (+3) этой петли, имели повышенную резистентность к ингибированию репликации хемокином РАЫТЕБ. В свою очередь, вирусы, имитирующие позднюю стадию ВИЧ-инфекции (дополнительный сайт гликозилирования У1/2-петли, высокий заряд УЗ-петли и отсутствие в ней сайта гликозилирования), были более резистентны к ингибированию природным и синтетическим лигандами СХС1М 1 и АМБЗЮО, соответственно.
Изучение вирусов на предмет устойчивости к такому мощному нейтрализационному агенту как растворимый С 04 (вСВ4) показало, что чувствительность вирусов к нейтрализации посредством вСВ4 была схожей для вирусов, несущих признаки гликозилирования «ранних» и «поздних» стадий, и сильно отличалась от таковой «переходных» вирусов. При этом устойчивость вирусов к бС04 росла с ростом заряда УЗ-петли. Дальнейшее изучение устойчивости данной панели вирусов к действию нейтрализующих антител ЮН и Ы2, узнающая способность которых включает не только аминокислотные последовательности, но и стерическую составляющую, обнаружило дополнительные свидетельства схожести вирусов «ранних» и «поздних» стадий и их отличия от «переходных» вирусов (Рис. 3). Видимо, вследствие того, что сайт связывания антитела Ь12 на gpl20 частично перекрывается с С04-связывающим доменом §р120, профиль нейтрализации антителом Ь12 в целом совпадал с таковым растворимого С04. Антитело 2Б5 нейтрализовало все вирусы в одинаковой степени, что, видимо, связано с его специфичностью к gp41, который был одинаков у всех используемых в данном эксперименте вирусов.
1дС1Ы2[мкгГмл] 2Й12 [мкг/мл]
2Г5 [мкг/мл]
Рисунок 3. Нейтрализация ВИЧ-1 с зарядом УЗ-иетли +5 моноклональными нейтрализующими антителами Ь12, 2в12 и 2Р5. Вирусы X, Х.10, Х.10ДУ1 и Х.10АУЗ обозначены белыми кругами, черными кругами, черными квадратами и белыми квадратами, соответственно.
Данные результаты позволили нам предложить механизм эволюции вируса от Я5- к Х4-фенотипу в ходе индивидуальной ВИЧ-инфекции, представленный на рисунке 4.
СО»
+3
+6
Х.10. ХЛ04У1 "проие:*уточныи"
Х.10Ш
ХЛУЗ
"ПрОМПуТОЧНЫЙ"
Рисунок 4. Схема влияния изученных агентов (заряд УЗ-петли и мутации в сайтах гликозилирования VI- и УЗ-петель) на аффинность к СБ4 и корецепторам.
Последовательность появления мутаций во время инфекции, видимо, определяется характером иммунологического давления в данный момент. Мутация в Vl-петле, связанная с появлением дополнительного сайта гликозилирования и частичным удлинением последовательности (Х.10, X.lOAVl), как предполагается, «открывает» СВ4-связывающий сайт. Появление данной мутации может происходить либо во время угнетения иммунной системы, либо на фоне уже достаточно закрытого сайта (при высоком заряде или мутации в гликозилировании УЗ-петли (ДУЗ)). Возможно, именно вследствие доступности (открытости) сайта промежуточные формы практически не обнаруживаются in vivo. С другой стороны, вирус +6 AV3 был не способен реплицироваться, что может быть связано с чрезмерно закрытой конформацией С04-связывающего домена. Последнее показывает, что изменения в структуре gpl20 отбираются на основе баланса репликативных и анти-иммунных свойств вируса. Интересным также явилось то, что на примере событий, которые происходят в течение ВИЧ-инфекции, было обнаружено, что два из трех меняющихся компонентов, посредством которых и достигалось разнообразие фенотипических свойств ВИЧ, были связаны с гликозилированием gpl20.
В ходе ВИЧ-инфекции при изменении фенотипа вируса R5—>Х4 происходит постепенное уменьшение ингибирующего влияния RANTES при росте такового в случае SDF-1. С другой стороны, наличие Х4-вариантов, ассоциированное со стадией СПИДа, не является обязательным конечным этапом эволюции в процессе ВИЧ-инфекции. Только у 50% больных СПИДом обнаруживаются Х4-варианты, у второй половины инфицированных в течение всей ВИЧ-инфекции детектируются только R5-варианты. Эти данные, в свою очередь, могут свидетельствовать о том, что возможность промежуточных этапов является скорее результатом временного сбоя иммунной системы, предшествующего общей дисфункции иммунной системы при СПИДе. При этом вероятность данного сбоя тем выше, чем ближе стадия СПИДа.
Возникновение единичной мутации в отработанном в процессе эволюции структурно-функциональном состоянии вирусного белка зачастую приводит к снижению репликативных способностей вируса. Возникновение мутаций, которые способны полностью компенсировать эту потерю и таким образом закрепить возникшие в результате первичной мутации свойства вируса, - процесс многостадийный, и, видимо, продолжительный. Проблема возникновения и
механизма компенсаторных мутаций явилась отдельной темой исследования, которой посвящена отдельная глава раздела "Результаты".
Данная глава посвящена механизмам, посредством которых вирус может адаптироваться к потере репликационных свойств, связанных с нарушением в структуре gp 120. В ходе данного исследования была прослежена адаптация ВИЧ-1 к генно-инженерно индуцированной мутации (С418А), приводящей к разрушению дисульфидного мостика в основании У4-петли gpl 20. В результате длительного эксперимента, в котором молекулярный клон HIV-1 LAI (фенотип Х4) С418А пассировался (и таким образом свободно мутировал) на клеточной линии лимфоцитарного происхождения, экспрессирующей как CD4, так и CXCR4, было обнаружено восстановление репликативных свойств. Методом секвенирования участков гена env, который кодирует gpl 20, было обнаружено появление двух аминокислотных замен: N386D и А433Т. При этом в первом случае происходила элиминация сайта N-гликозилирования. Дальнейшее изучение данных мутаций показало, что мутация N386D появлялась первой и была связана с восстановлением репликативных свойств, сильно сниженных у изначального мутанта С418А. Дальнейшее изучение компенсаторных мутаций и связанных с ними конформационных изменений полученных вирусов включало эксперименты по нейтрализации соответствующих мутантов нейтрализующими моноклональными антителами Ы2 и 2G12 (Рис.5). Оказалось, что влияние гликозилирования в позиции 386 зависит от окружения. Так, в присутствии двух мутаций С418А и А433Т гликозилирование в позиции 386 становится некритичным для формирования эпитопа связывания 2G12, хотя изначально высокоманнозный олигосахарид в позиции 386 является одним из основных в формировании сайта связывания антитела 2G12.
А)
2G12 мАт[мкг/мл]
В)
Ы2 мАт[мкг/мл]
Рисунок 5. Нейтрализация ВИЧ-1 антителами 2G12(A) и Ь12 (В). Вирусы: дикий тип (ромбы); N386D (квадраты); С418А N386D (треугольники); С418А N386D А433Т (пунктир и открытые кружки) и С418А А433Т (закрытые кружки)
В целом, это показывает, что компенсация репликативных свойств первоначального мутанта была сопряжена, в том числе, и с восстановлением конформации нарушенного эпитопа. Эксперименты с антителом Ы2 показали, что вирусы, несущие мутацию N386D, становились чрезвычайно восприимчивыми к нейтрализации данным антителом, что хорошо согласуется с литературными данными о том, что гликан 386, расположенный на краю скрытой части gpl20 (gpl20's silent face), прикрывает сайт связывания CD4 и Ы2-эпитоп.
Олигосахаридный компонент поверхностного гликопротеина ВИЧ-1 остается гораздо менее изученным, чем его белковая составляющая, несмотря на то, что вес олигосахаридов составляет в совокупности порядка -50% всей молекулы.
Олигосахариды опосредуют различные функции и проявляют чрезвычайную пластичность в структуре, композиции и местах связывания. В данном исследовании было показано, что N-гликозилирование помимо прочего является очень эффективным механизмом компенсации первичных мутаций при эволюции вируса в течение индивидуальной ВИЧ-инфекции.
Дальнейшие главы диссертации посвящены изучению влияния лектинов (белков, специфично узнающих и связывающих различные олигосахаридные структуры), специфичных для дендритных клеток, на ВИЧ-1. Фокус данного исследования был сконцентрирован на лектинах С-типа (Са2+ зависимых): DC-SIGN и лангерине. Данные лектины, как было показано другими авторами, способны взаимодействовать с олигосахаридами gpl20. Предположительно, данное взаимодействие происходит посредством Са-зависимого связывания высокоманнозных олигосахаридов. В процессе исследования взаимодействия лектина DC-SIGN-экспрессирующих клеток с панелью вирусов, имитирующих эволюцию вируса (описана выше), было установлено, что предпочтительней с DC-SIGN взаимодействовали вирусы, представляющие «промежуточную» и «конечную» стадии индивидуальной ВИЧ-инфекции (Рис. 6).
25
1.2 0.6 0.3 0.15 0.08 0.04 Raji-DC-SIGN [106 клеток]
Рисунок 6. Прямое связывание вирусов с зарядом УЗ-петли +5 с клетками Г^-ОС-5ГС№ X (черные круги); Х.10 (квадраты); X.10ДgVl (ромбы) и XЛ0ДgVЗ (белые круги). После инкубирования Яа^-БС^КЖ-клеток с серийным разведением вирусов клетки отмывались, и измерялась концентрация р24 в лизатах клеток. Значения, полученные для Кар-клеток, использовались в качестве контроля, и значения р24 для этих клеток вычитались из таковых для 1?а]1-ОС-5КЖ-клеток.
Более того, было показано, что репликативные преимущества, связанные с взаимодействием с DC-SIGN и более адресным инфицированием CD-ГТ-клеток, также получали вирусы, представляющие «промежуточную» и «конечную» стадии индивидуальной ВИЧ-инфекции.
Дальнейшее изучение взаимодействия DC-SlGN-экспрессирующих клеток с меченным зеленым флюоресцентным белком (Green Fluorescent Protein - GFP) ВИЧ-1 методом конфокальной микроскопии выявило, что взаимодействие ВИЧ с нейтрализующими антителами, которые a priori должны способствовать элиминации вируса, приводило к повышенному захвату вируса DC-SIGN-экспрессирующими клетками (Рис. 7). Данный факт хорошо укладывается в систему устоявшихся представлений о том, что дендритные клетки и макрофаги (многие из которых являются DC-SIGN-экспрессирующими) способны захватывать иммунные комплексы, состоящие из антител и соответствующих антигенов. Согласно теории, антигены из таких иммунных комплексов должны процессироваться, теряя свои свойства, в том числе патогенные. Однако вопреки теории, в данном исследовании было обнаружено, что в основном вирусы иммунных комплексов не деградировали внутри DC-SIGN-экспрессирующих клеток, а оставались жизнеспособными. Причем основную роль, хотя и не исключительную, в связывании нейтрализованных антителами вирусов играл именно DC-SIGN, а не Fc-рецепторы, как это должно происходить в теории с захватом иммунных комплексов.
А)
Nî"
•й-*
Central Ш
В)
3.5.
32.5'
г.
f НА 1 в,» о-'
ci
С)
. jÖK'i .
Hu igst ïftigôl Hufgßl 2F5 (jGf
......»o't-sicN
Рисунок 7. Захват нейтрализованного мАт 2F5 вируса незрелыми дендритными клетками (нДК). Анализ числа меченых вирусных частиц (particles) на клетку (cell) (50 клеток) (А). Захват 2Р5-нейтрализованного и ненейтрализованного вируса нДК посредством СА-р24 ИФА (В). С, Анализ числа меченных вирусных частиц на клетку (число клеток = 40). NS - недостоверные отличия.
Помимо того, оказалось, что из опробованных в данном исследовании наиболее известных и сильных нейтрализующих антител только обработка вирусов антителом Ы2 приводила к снижению передачи вируса дендритными клетками СВ4+Т-клеткам. В остальных случаях передача вируса с последующей продуктивной инфекцией CD4+T клеток происходила на уровне отрицательного контроля (где вирус не обрабатывался нейтрализующими антителами) или даже превышало его, как в случае с антителом 2F5 (Рис.8).
Co^rej 2*5 1С 2G1I : 'I, УЗ-21
Nùafe 'jp41 gp12a
Рисунок 8. DC-SIGN-опосредованный захват ВИЧ-1, нейтрализованного aHTH-gp41 (2F5, 4Е10), анти-§р120 (2G12, 4.8d, Ы2), и анти-УЗ (V3-21) специфичными антителами, и его инфекционно продуктивная передача С04+Т-клеткам (transmission). ВИЧ-1 преинкубировался с антителами, после чего добавлялся к Raji-DC-SlGN-клеткам (А) или нДК (В). С, ВИЧ-1 преинкубировался с инактивированной теплом сывороткой (sera) ВИЧ-негативного донора и ВИЧ-положительного пациента в течение 2-х часов, после чего добавлялся к нДК. DC-SlGN-экпрессирующие клетки отмывались трижды и добавлялись к клеткам. Инфекция клеток измерялась
проточной цитофлюориметрией. Уровень переноса вируса от клеток к клеткам изображен как доля инфицированное™ по отношению к ненейтрализованному вирусу (/7 = 3). нДК-опосредованный перенос вируса, преинкубированного с сывороткой здорового донора представлен как доля к таковой от ВИЧ-положительного донора. Данные представляют три независимых эксперимента.
Суммируя вышесказанное, наши данные можно представить в виде модели, представленной на рисунке 9. Нейтрализованный вирус взаимодействует с DC-SIGN непосредственно (стадия 1 на рисунке) или после взаимодействия с Fc-рецептором (Г), после чего интернализуется (2). В эндосоме (возможно, вследствие повышенного рН) происходит распад как иммунного комплекса, так и связи между комплексом и рецепторами (3), после чего DC-SIGN возвращается на цитоплазматическую мембрану (4 и 5). Остатки иммунного комплекса поступают в компартменты, именуемые мультивезикулярными тельцами (А), откуда вирус либо поступает в
лизосомы и деградирует (В), либо транспортируется и освобождается в месте образования иммунного синапса между дендритной клеткой и Т-клеткой.
^ ОС-5ЮХ ф ВИЧ-1 V «г рецептор'^ ) Эюоеои» У Антитело
Дендритная Зкдостта клетка
Мулы;шеснкулярное тельце
Рисунок 9. Модель предполагаемого механизма ОС-вЮЫ-опосредованной реактивации нейтрализованного ВИЧ. Пояснения в тексте.
Дендритные клетки относятся к профессиональным антиген-презентирующим клеткам и являются, по сути, центральным звеном как врожденного, так и приобретенного иммунитета. То, что эти клетки в случае ВИЧ-1 способствуют не уничтожению, а распространению вируса, причем даже пренейтрализованного вируса, является чрезвычайно интересным фактом, бросающим определенную тень на возможность создания вакцины, основанной на использовании нейтрализующих антител.
Тем не менее, дендритные клетки чрезвычайно разнообразны. В зависимости от тканевого происхождения выделяют несколько популяций дендритных клеток. Некоторые из них характеризуются экспрессией специфичных лектинов. В частности, клетки Лангерганса, присутствующие в самых верхних слоях эпидермальных тканей
и слизистых, экспрессируют специфический лектин Лангерин, обладающий рядом общих свойств с DC-SIGN, в том числе и в способности узнавать высокоманнозные олигосахариды. Тем более удивительным оказался тот факт, что преинкубация ВИЧ с клетками Лангерганса (КЛ) или клетками, экспрессирующими лангерин, приводила к снижению репликации вируса, причем преинкубация КЛ с маннаном (маннозным полисахаридом) сводила данное снижение к минимуму (Рис. 10).
А) В)
Рисунок 10. А) КЛ ингибируют инфекцию Т-клеток (Т cells). Т-клетки инфицировались BH4-1JR_CS|. в присутствии различных популяций ДК (DC -дендритные клетки, экспрессирующие DC-SIGN, LC - КЛ). На рисунке обозначено стандартное отклонение трех экспериментов, п = 3 донора. (В) КЛ не передают ВИЧ-1. Субпопуляции ДК были преинкубированы с Bii4-1]R.CSF. после чего добавлялись Т-клетки. Маннан (mannan) использовался для блокирования лектинов С-типа. п = 3 донора. Инфекция самих ДК и КЛ была ниже уровня детекции (<2 ng/ml (нг/мл)).
Эти данные уже указывали на возможность того, что именно лангерин является ВИЧ-ингибирующим агентом КЛ. Дальнейшее изучение данного эффекта с моноклональным антителом, специфичным к лангерину (10Е2), показало, что преинкубация клеток с данным антителом нивелирует ингибирующий эффект КЛ на репликацию ВИЧ (Рис. 11). Из чего было сделано утверждение, что именно лангерин на поверхности КЛ способен ингибировагь ВИЧ инфекцию.
А)
—•—Medium —;>-Mannan
В)
LCs donor #11
LCs donor #12
10 100 1.00C ТС ID
100 1.000 10,000 ТС ID
■ Medium
□ Anti-Langerin (10E2)
tl
100 1.000 10.000 TCID
Рисунок 11. Влияние экспрессии лангерина на способность ЮТ (LC) передавать вирус СВ4+Т-клеткам в зависимости от времени соинкубации с Т-клетками (А) и инфекционной дозы (Tissue culture infectious dose (TCID)) (В). На правых графиках приведены результаты контрольных опытов на С04+Т-клетках в отсутствие КЛ. Medium - культуральная среда, используемая как отрицательный контроль.
То, что лангерин захватывает ВИЧ-1 с последующей деструкцией последнего, видимо, и является центральным моментом того, что КЛ ингибируют передачу ВИЧ-1, в полную противоположность к процессам, связанным с интернализацией ВИЧ-1 посредством DC-SIGN, где вирус частично сохраняется от деградации, что способствует его дальнейшей специфической передачи Т-клеткам. Схематически данные различия представлены на рисунке 12.
(а) КЛ
Лангерин
V ф Лангерин
ш
\ (i) Гранупа Веркбека ,..........
»-. ( тЯЙК-Л*
аю
у
ф .,
Щ» ВИЧ-1 /щ CD4/GCR5
(b) DC-SIGN*- AS
0*"" I
" - T
Щ Лдаосомз f
DC-SIGN DC-SIGN
;Г ?
ад
{п;МБТ ;j4i HpoieiicoMA .
* , I / W i.______ "Ж
# Ф
' ** ■-"= -------
Рисунок 12. Сходство и отличия взаимодействия клеток Лангерганса (КЛ) и DC-8ЮМ+-дендритных клеток (ДК) с ВИЧ-1. (а) Лангерин на КЛ взаимодействует с ВИЧ-1, посредством чего ВИЧ-1 поступает в КЛ-специфические структуры -гранулы Бербека (i). Данное взаимодействие приводит к деградации ВИЧ-1, хотя точная локализация компартмента, где происходит разрушение вируса, остается неясной, (ii) Блокирование функции лангерина (например, маннаном) приводит к инфицированию КЛ вирусом с последующим возможным заражением Т-клеток. (Ь) DC-SIGN также является рецептором ВИЧ-1 и тоже интернализует ВИЧ-1, что может приводить к следующим результатам: (i) ВИЧ-1 поступает в лизосомы, деградирует и презентируется на ГКГС класса II; (ii) Вирус поступает в мультивезикулярные тельца (МВТ), после чего передается Т-клеткам; (iii) из эндосомы вирус может поступать в протеасому, там разрушаться и презентироваться на ГКГС класса I; (iv) DC-SIGN+-дендритные клетки могут инфицироваться ВИЧ-1 с последующей передачей вируса Т-клеткам.
Таким образом, полученные в результате данного исследования результаты позволили сформулировать нижеследующие выводы.
ВЫВОДЫ
1. Гуморальный иммунный ответ на УЗ-петлю поверхностного гликопротеина др120 ВИЧ-1 в течение ВИЧ-инфекции носит ярко выраженный консервативный и индивидуальный характер.
2. ВС-ЗГСЬГ-зкспрсссиругошие дендритные клетки способны оказывать поддерживающее влияние не только на ранних стадиях ВИЧ-инфекции в организме, но также и на критических стадиях смены фенотипа Я5->Х4, связанных с большей доступностью С04-связывающего домена поверхностного гликопротеина gpl20 ВИЧ-1.
3. Изменения в структуре поверхностного гликопротеина ВИЧ-1 яр120, связанные с приобретением новых свойств, происходят по механизму компенсаторных мутаций, включающему три этапа: 1) возникновение и отбор первичной мутации, 2) появление мутации, направленной на восстановление репликативных способностей вируса, 3) тонкая настройка конформации под определенные условия окружающей среды.
4. Способность вируса к быстрому изменению профиля Ы-гликозилирования является механизмом не только избегания иммунного давления, но и восстановления его репликационных свойств.
5. Клетки Лангерганса способны оказывать ингибирующее влияние на репликацию ВИЧ-1 посредством связывания £р120 с лангерином.
6. Статины являются выраженными модуляторами функциональных взаимодействий сети ССЯ5-ЯАОТЕ5, вследствие чего они способны оказывать ингибирующее действие на репликацию К5-штаммов ВИЧ-1.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Щелканов М.Ю., Ярославцева Н.Г., Набатов А.А., Машарский А.Э., Юдин А.Н., Мирсков Ю. А., Ченцова Н.П., Кобыща Ю.В., Козлов А.П., Карамов Э.В. Серотипическая стратификация ВИЧ-1 в популяции внутривенных наркоманов в южной/юго-западной Украине. Вопр. вирусол. 1998. Т. 43 (4). С.176-82.
2. Nabatov АА, Kravchenko ON, Lyulchuk MG, Shcherbinskaya AM, Lukashov VV. Simultaneous introduction of HIV type 1 subtype A and В viruses into injecting drug users in southern Ukraine at the beginning of the epidemic in the former Soviet Union. AIDS Res Hum Retroviruses. 2002 Aug 10;18(12):891-5.
3. Nabatov AA, Pollakis G, Linnemann T, Kliphius A, Chalaby MI, Paxton WA. Intrapatient Alterations in the Human Immunodeficiency Virus Type 1 gpl20 VIV2 and V3 Regions Differentially Modulate Coreceptor Usage, Virus Inhibition by CC/CXC Chemokines, Soluble CD4, and the Ы2 and 2G12 Monoclonal Antibodies. J Virol. 2004 Jan;78(l):524-30.
4. Nabatov A.A., Masharsky, A.E., Verevochkin S.V., Emelyanov A.V., Kozlov A.P. Host-dependent serum specificity to the V3 domain of HIV-1. Scand J Immunol 2004;60 (5):471-76.
5. Alexey A. Nabatov, Thijs van Montfort, Teunis В. H. Geijtenbeek, Georgios Pollakis, William A. Paxton Interaction of HIV-1 with dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin-expressing cells is influenced by gpl20 envelope modifications associated with disease progression. FEBS Journal 273 (21), 4944-4958.
6. Thijs van Montfort, Alexey A. Nabatov, Teunis В. H. Geijtenbeek, Georgios Pollakis and William A. Paxton. Efficient Capture of Antibody Neutralized HIV-1 by Cells Expressing DC-SIGN and Transfer to CD4+ T Lymphocytes. The Journal of Immunology, 2007, 178:3177-3185.
7. Alexey A. Nabatov, Alexey E. Masharsky, Sergei V, Verevochkin, Alexander V. Emelyanov, Vladimir V. Lukashov, Robert Heimer, Robert W. Ryder , Jaap Goudsmit and Andrei P. Kozlov. The rate of epidemiological and virological
changes during the transition from nascent to concentrated HIV epidemic stage in the former Soviet Union countries. AIDS Res Hum Retroviruses.2007 Feb;23(2): 183-92.
8. Lot de Witte, Alexey Nabatov, Marjorie Pion, Donna Fluitsma, Marein A W P de Jong, Tanja de Gruijl, Vincent Piguet, Yvette van Kooyk & Teunis B H Geijtenbeek. Langerin is a natural barrier to HIV-1 transmission by Langerhans cells. Nat. Med 2007 Mar;13(3):367-71.
9. Alexey A. Nabatov. Georgios Pollakis. Thomas Linnemann, William A. Paxton, Michel P. de Baar. Statins disrupt CCR5 and RANTES expression levels in CD4+ T lymphocytes in vitro and preferentially decrease infection of R5 versus X4 HIV-1. PLOS One. 2007 May 23;2(5):e470.
10. Lot de Witte, Alexey Nabatov and Teunis B.H. Geijtenbeek. Distinct roles for DC-SIGN(+)-dendritic cells and Langerhans cells in HIV-1 transmission. Trends Mol Med. 2008 Jan;14(l):12-9.
11. Rogier W Sanders, Eelco van Anken, Alexei A Nabatov, I. Marije Liscaljet, Ilja Bontjer, Dirk Eggink, Mark Melchers, Els Busser, Martijn M Dankers, Fedde Groot, Ineke Braakman, Ben Berkhout and William A Paxton The carbohydrate at asparagine 386 on HIV-1 gpl20 is not essential for protein folding and function but is involved in immune evasion. Retrovirology 2008, 5:10.
12. Nabatov AA, de Jong MA, de Witte L, Bulgheresi S, Geijtenbeek TB. C-type lectin Mermaid inhibits dendritic cell mediated HIV-1 transmission to CD4+ T cells. Virology. 2008 Sepl;378(2):323-8.
13. Eelco van Anken, Rogier W Sanders, I. Marije Liscaljet, Ilja Bontjer, S.Tillemans, Alexei A Nabatov, William A Paxton, Ben Berkhout and Ineke Braakman, Only Five out of Ten Strictly Conserved Disulfide Bonds are Essential for Folding and Eight for Function of the HIV-1 Envelope Glycoprotein. Mol Biol Cell. 2008 Oct; 19( 10):4298-309.
14. Saeland E, de Jong MA, Nabatov AA, Kalay H, Geijtenbeek TB, van Kooyk Y. MUC1 in human milk blocks transmission of human immunodeficiency virus from dendritic cells to T cells. Mol Immunol. 2009 Jul;46(l 1-12):2309-16.
Подписано в печать 10.02.2010 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,7. Тираж 100 экз. Заказ № 1510.
Отпечатано в ООО «Издательство "ЛЕМА"»
199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д.24, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://www.Iemaprint.ru
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Набатов, Алексей Анатольевич
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1 Актуальность проблемы
1.2 Цели и задачи исследования
1.3 Основные положения, выносимые на защиту
1.4 Научная новизна работы
1.5 Практическая ценность
1.6 Личный вклад соискателя
1.7 Форма выполнения диссертационной работы
1.8 Апробация работы
1.9 Публикации
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Свойства вируса иммунодефицита человека
2.1.1. Таксономия, строение вириона и жизненный цикл ВИЧ.
2.1.2. Структурные белки ВИЧ
2.1.3. Регуляторные белки ВИЧ
2.2 Ген епу. Структура и функции поверхностных гликопротеинов ВИЧ-1.
2.3. Проникновение ВИЧ-1 в клетку.
2.4. Хемокины и хемокиновые рецепторы
2.5. Фенотипические характеристики изолятов ВИЧ-1.
2.6. Патогенез ВИЧ-1.
2.6.1. Клиническая картина ВИЧ-инфекции.
2.6.2. Причины снижения концентрации Т4-лимфоцитов и возникновения иммунодефицита
2.6.2.1. ВИЧ-индуцированное изменение в составе Т клеток
2.6.2.2. Изменения в составе дендритных клеток
2.7. Механизмы адаптации вируса в течение индивидуальной ВИЧ-1 инфекции.
2.7.1. Механизмы, определяющие генетическую изменчивость ВИЧ
2.7.2. Компенсаторные мутации '
2.8. Фенотипические изменения ВИЧ и их связь с патогенезом.
2.9. Роль УЗ петли в формировании фенотипа ВИЧ-1.
2.9.1. Структура УЗ петли.
2.9.2. Участие УЗ-петли во взаимодействии с рецепторами хемокинов.
2.10. Факторы определяющие изменение фенотипа ВИЧ
2.10.1. Уровень хемокинов и хемокиновых рецепторов
2.10.2. Гуморальный иммунный ответ на ВИЧ
2.10.3. Роль УЗ-петли влгейтрализации вируса и возможность изучения гуморального ответа на УЗ-петлю
2.11. ВИЧ-1 и дендритные клетки
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Пациенты
3.2. Доноры и донорский материал
3.3. Создание банка сывороток ВИЧ-инфицированных пациентов
3.3. Вирусы
3.4. Эксперименты по моделированию вирусной адаптации 48 3.4. Получение флюоресцентномеченного вируса
3.5. Культивирование эукариотических клеток
3.5.1. Выделение и культивирование первичных донорских клеток
3.5.1.1. Получение мононуклеарных клеток периферической крови (МКГ1К)
3.5.1.2. Выделение CD4+ лимфоцитов
3.5.1.3. Выделение клеток Лангерганса.
3.5.1.4. Получение ДК путем искусственной дифференцировки моноцитов (МДК)
3.5.2. Культуры клеток
3.5.2.1. Клеточные линии
3.5.2.2. Получение клеток имеющих фенотип клеток Лангерганса путем искусственной дифференцировки клеточной линии
3.5.2.3. Трапсфекция эукариотических клеток СЗЗА рекомбинантными плазмидами содержащими полный геном вируса, с целью получения инфекционного вируса
3.5.3. Статины и обработка клеток статинами
3.5.4. Определение вирусного антигена в культуральной жидкости.
3.5.5. Определение инфекционной дозы (ИД) ВИЧ-1.
3.5.6. Методы нейтрализации (ингибирования) вируса.
3.5.7. Определение корецепторной специфичности ВИЧ
3.5.8.Связывание Raji-DC-SIGN клетками ВИЧ
3.5.9. Вирусная репликация в присутствии RAJI-DC-SIGN клеток или ДК.
3.5.10. Ингибирование маннаном ВИЧ-1 инфекции
3.5.11. Нейтрализация ВИЧ-1 в присутствии Raji-DC-SIGN клеток
3.5.12. Перенос захваченного нейтрализованного вируса.
3.5.13. Проточная цитофлюорометрия.
3.5.13.1. Экстраклеточное окрашивание
3.5.13.2. Внутриклеточное окрашивание
3.6. Серологические методы
3.6.1. Определение RANTES в культуральной жидкости
3.6.2. Иммунотипирование ВИЧ с использованием синтетических пептидов.
3.6.2.1. Синтетические пептиды
3.6.2.2. Твердофазный иммуноферментный анализ
3.7. Методы работы с нуклеиновыми кислотами
3.7.1. Методы выделения и очистки НК 62 3. 7.1.1. Выделение ДНК из МКПК ВИЧ-инфицированных пациентов 62 3.7.1.2. Выделение плазмидной ДНК 62 3. 7.1.3. Выделение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы 63 3. 7.1.4. Очистка ДНК между ферментативными реакциями 63 3. 7.1.5. Универсальное выделение нуклеиновых кислот.
3.7.2. Амплификация ВИЧ-специфичных фрагментов
3.7.2.1. Полимеразная цепная реакция
3.7.2.2. Праймеры для амплификации 66 3. 7.2.3. Синтез кДНК с последующей ПЦР
3.7.2.4. Определение делетированной формы гена CCR5 у доноров крови. 67 3. 7.2.5. Амплификация на основе нуклеотидной последовательности РНКNucelic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)
3.7.3. Анализ нуклеиновых кислот
3.7.3.1. Электрофорез препаратов ДНК
3.7.3.2. Препаративный электрофорез препаратов ДНК в легкоплавкой агарозе
3.7.3.3. Электрофорез препаратов ДНК в ПААГ в неденатурирующих условиях
3.7.4. Клонирование амплифицированных ВИЧ-специфичных фрагментов 69 3.7.4.1. Подготовка плазмидного вектора для клонирования 69 3. 7.4.2. Подготовка амплифицированного фрагл1ента для клонирования
3.7.4.3. Модификация концов амплифицироваиных фрагментов
3.7.4.4. Фосфорширование концов амплифицироваиных фрагментов
3.7.4.5. Лигирование 71 3. 7.4. б. Подготовка компетентных клеток E.coli для трансформации 71 3. 7.4.7. Трансформация клеток E.coliрекомбинантными плазмидами
3.7.4.8. Отбор рекомбинантных клонов
3.7.4.9. Анализ клонированных фрагментов 72 3.7.5. Секвенирование фрагментов ДНК
3.7.5.1. Секвенирование клонированных фрагментов ДНК 1Ъ
3.7.5.2. Прямое секвенирование амплифицироваиных фрагментов ДНК 1Ъ
3.8. Математические методы анализа данных
3.8.1. [Методы анализа многомерных данных
3.8.2. Поиск и использование полученных ранее генетических последовательностей
3.8.3. Методы филогенетического анализа
3.8.3.1. Подготовка последовательностей для анализа
3.8.3.2. Определение генетических дистанций
3.8.3.3. Построение филогенетических деревьев
3.8.4. Анализ схожести аминокислотных последовательностей
3.8.5. Методы статистического анализа и математического моделирования
3.9. Методы микроскопии 78 3.9.1. Конфокальная микроскопия
3.9.1.1. Конфокальная микроскопия вирусного захвата клетками при 37°С. 78"
3.9.1.2. Конфокальная микроскопия захвата вируса при 4°С.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Взаимосвязь между изменениями фенотипических свойств ВИЧ-1 и гуморальных факторов иммунного ответа
4.1.1. Изучение популяционного разнообразия первичной аминокислотной последовательности УЗ-петли и основ этого разнообразия
4.1.2. Взаимосвязь между структурой УЗ-петли и специфичностью сыворотки к ней
4.1.3. Статиныкак средство манипуляции сети хемокин-хемокиновый рецептор при ВИЧ-инфекции.
4.1.3.1. Эффект статинов на предствленность CD4 и хемокиновых рецепторов на ЦПМ: Снижение представленности CCR
4.1.3.2. Статины усиливают секрецию RANTES CD4+ Тлимфоцитами.
4.1.3.3. Статины предпочтительнее сниэюают инфекцию CD4+ Тлимфоцитов вызванную R5 вирусами, чем Х4 вирусами.
4.1.4. Изменения в структуре gpl 20 в течение ВИЧ-инфекции как отражение приспособляемости к иммунным гуморальных факторам.
4.1.4.1. Влияние заряда V3 петли и профиля N-гликозилирования V1V2 и V3 петель на использование того или иного хемокинового рецептора.
4.1.4.2. Низкий заряд V3 петли приводит к низкой чувствительности к RANTES.
4.1.4.3. Высокий заряд V3 петли соответствует низкой чувствительности ВИЧ-1 к ингибированию хемокином SDF-1 альфа.
4.1.4.4. Чувствительность к нейтрализации ВИЧ-1 зависит от профиля гликозилирования VI и V3 доменов gpl20.
4.2. Механизмы изменений gpl20 в течение ВИЧ-инфекции
4.2.1. Механизмы восстановления функциональности дефектного по фолдингу gpl
4.2.2. Восстановление уровня вирусной репликации
4.2.3. Чувствительность мутантов к ингибированию растворимым CD4 и AMD
4.2.4. Чувствительность мутантов к нейтрализации антителами b 12 и 2G
4.3. Взаимодействие специфических лектинов дендритных клеток с gp 120 и влияние этих взаимодействий на ВИЧ
4.3.1. Уровень DC-SIGN-опосредованного усиления репликации ВИЧ-1 зависит от изменений в V1V2 и V3 петле.
4.3.2. Корреляция между уровнем усиления вирусной репликации и силой связывания вируса RAJI-DC-SIGN клетками.
4.3.3. Вирусная репликация в присутствии DC-SIGN эскпрессирующих клеток происходит без изменения вирусного тропизма
4.3.4. Повышенный захват 2Р5-нейтрализованного вируса нМДК
4.3.5. DC-SIGN усиливает захват 2F5-нейтрализованных вирусов
4.3.6. Нейтрализация вируса может быть обратима при кокультивированиии DC-SIGN-экспрессирующих клеток с CD4+ Т лимфоцитами
4.3.7. 2Р5-нейтрализованный вирус становится вновь инфекционным при трансмиссии посредством DC-SIGN-экспрессирующих клеток
4.3.8. ВИЧ-1 частицы, нейтрализованные антителами направленными на поверхностный гликопротеин gpl20, захватываются и освобождаются как инфекционные вирусы
4.3.9. Fe рецепторы усиливают DC-SIGN-опосредованный захват 2F5-нейтрализованного вируса нМДК клетками
4.3.10. Взаимодействие gpl20 с лангерином приводит к ингибированию ВИЧ инфекции в культуре.
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
5.1. Индивидуальная специфичность сывороток к V3-петле ВИЧ
5.2. Изменения в структуре gpl20 V1V2- и УЗ-регионов во время ВИЧ-инфекции в одном пациенте модулируют вирусную устойчивость к хемокинам и нейтрализующим антителам
5.3. Олигосахарид, ассоциированный с аспарагином 386 в gpl20 В1/1Ч-1 вовлечен в каскад компенсаторных мутаций, приводящих к восстановлению репликативных способностей вируса после разрушения цистеинового мостика 385-418.
5.4. Взаимодействие ВИЧ-1 с DC-SIGN зависит от модификаций gpl20, ассоциированных с прогрессией заболевания
5.5. Эффективный захват нейтрализованного антителами ВИЧ-1 клетками, экспрессирующими DC-SIGN, и его перенос С04+-лимфоцитам.
5.6. Статины дерегулируют представленность CCR5 и секрецию RANTES у CD4+ Т-лифоцигов in vitro и преимущественно снижают инфекцию R5 ВИЧ
5.7. Лангерин является естественным барьером для ВИЧ-1 трансмиссии КЛ
6. ВЫВОДЫ
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Набатов, Алексей Анатольевич
6. выводы
1. Гуморальный иммунный ответ на УЗ-петлю поверхностного гликопротеина §р\20 ВИЧ-1 в течение ВИЧ-инфекции носит ярко выраженный консервативный и индивидуальный характер.
2. БС-ЗЮИ-экспрессирующис дендритные клетки способны оказывать поддерживающее влияние не только на ранних стадиях ВИЧ-инфекции в организме, но также и на критических стадиях смены фенотипа Я5—>Х4, связанных с большей доступностью С04-связывающего домена поверхностного гликопротеина цр120 ВИЧ-1.
3. Изменения в структуре поверхностного гликопротеина ВИЧ-1 §р120, связанные с приобретением новых свойств, происходят по механизму компенсаторных мутаций, включающему три этапа: 1) возникновение и отбор первичной мутации, 2) появление мутации, направленной на восстановление репликативных способностей вируса, 3) гонкая настройка конформации под определенные условия окружающей среды.
4. Способность вируса к быстрому изменению профиля Ы-гликозилирования является механизмом не только избегания иммунного давления, но и восстановления его репликационных свойств.
5. Клетки Лангерганса способны оказывать ингибирующее влияние на репликацию ВИЧ-1 посредством связывания gpl20 с лангерином.
6. Статины являются выраженными модуляторами функциональных взаимодействий сети ССК5-ЯА]\ГГЕ8, вследствие чего они способны оказывать ингибирующее действие на репликацию Я5-штаммов ВИЧ-1.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Набатов, Алексей Анатольевич, Санкт-Петербург
1. Allan J.S., Coligan J.E., Barin F., McLane M.F., Sodroski J.G., Rosen C.A., Haseltine W.A., Lee T.H., and Essex M. Major glycoprotein antigens that induce antibodies in AIDS patients are encoded by HTLV-III // Science 1985. - V. 228. - P. 1091-1094
2. Ashish Garg R., Anguita J. and Krueger J.K. Binding of full-length HIV-1 gpl20 to CD4 induces structural reorientation around the gpl20 core// Biophys. 2006. - V. 91. - P.69-71
3. Back N.K.T., Smit L., de Jong J.J., Keulen W., Schutten M., Goudsmit J., and Tersmette M. An N-glycan within the human immunodeficiency virus type 1 gpl20 V3 loop affects virus neutralization// Virol. 1994. - V.199. - P.431-438
4. Baggiolini M. Chemokines and leukocyte traffic//Nature. 1998. - V.392. - P.565-568
5. Banchereau J., Briere F., Caux C., Davoust J., Lebecque S., Liu Y.J., Pulendran B., and Palucka K. Immunobiology of dendritic cells// Annu. Rev. Immunol. 2000. - V.18. - P.767-811
6. Banchereau J., Steinman R.M. Dendritic cells and the control of immunity// Nature. 1998. -V.392. - P.245-252
7. Bebenek K., Abbotts J., Roberts J.D., Wilson S.N., Kunkel T.A. Specificity and mechanism of error-prone replication by human immunodeficiency virus-1 reverse transcriptase// J. Biol. Chem. -1989. V.264.- P. 16948-16956
8. Berger E.A. HIV entry and tropism: the chemokine receptor connection// AIDS 11 Suppl A. 1997.- P.3-16
9. Berger E.A., Doms R.W., Fenyo E.M., Korber B.T., Littman D.R., Moore J.P., Sattentau Q.J., Schuitemaker H., Sodroski J., Weiss R.A. A new classification for HIV-1// Nature. 1998. - V.391.- P.240
10. Berger E.A., Murphy P.M., Farber J.M. Chemokine receptors as HIV-1 coreceptors: roles in viral entry, tropism, and disease// Annu. Rev. Immunol. 1999. - V.17. - P.657-700
11. Berkhout B., Jeang K.-T., Functional roles for the TATA promoter and enhancers in basal and Tat induced expression of the human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat// J. Virol. -1992. V.66. -P.139-149
12. Binette J., Cohen E.A. Recent advances in the understanding of HIV-1 Vpu accessory protein functions// Curr. Drug Targets. Immune. Endocr. Metabol. Disord. 2004. - V.4. - P.297-307
13. Bleul C.C., Farzan M., Choe H., Parolin C„ Clark-Lewis I., Sodroski J., Springer T.A., 1996. The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fiisin and blocks HIV-1 entry // Nature -1985 -V. 382 -P. 829-833
14. Bleul C.C., Wu L., Iloxie J.A., Springer T.A., Mackay C.R. The HIV coreceptors CXCR4 and CCR5 are differentially expressed and regulated on human T lymphocytes// Proc Natl Acad Sci U S A. 1997. - V.94. - P.1925-1930
15. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Jansen C.L., Wertheim-van Dillen P.M.E., van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids// J. Clin. Microbiol. 1990. -V.28- P.495-503
16. Boyer P.L., Gao H.Q., Hughes S.H. A mutation at position 190 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase interacts with mutations at positions 74 and 75 via the template primer// Antimicrob. Agents Chemother. 1998. - V.42. - P.447-452
17. Brinchmann J.E., Albert J., Vartdal F. Few infected CD4+ T cells but a high proportion of replication-competent provirus copies in asymptomatic human immunodeficiency virus type 1 infection//J. Virol. 1991. - V.65. - P.2019-2023
18. Bursch L.S., Wang L., Igyarto B., Kissenpfennig A., Malissen B., Kaplan D.H., Hogquist K.A. Identification of a novel population of Langerin+ dendritic cells// J. Exp. Med. 2007. - V.204. -P.3147-3156
19. Burton D.R., Parren P.W. Vaccines and the induction of functional antibodies: time to look beyond the molecules of natural infection?//Nat. Med. 2000. - V.6. - P. 123-125
20. Cameron P.U., Freudenthal P.S., Barker J.M., Gezelter S., Inaba K., Steinman R.M. Dendritic cells exposed to human immunodeficiency virus type-1 transmit a vigorous cytopathic infection to CD4+ T cells// Science. 1992. - V.257. - P.383-387
21. Carrillo A., Ratner L. Cooperative effects of the human immunodeficiency virus type 1 envelope variable loops VI andV3 in mediating infectivity for T cells//J Virol. -1996. V.70. - P. 1310-1316
22. Carrington M., Dean M., Martin M.P., O'Brien S.J. Genetics of HIV-1 infection: chemokine receptor CCR5 polymorphism and its consequences// Hum. Mol. Genet. 1999. - V.8. - P. 19391945
23. Chabot D.J., Broder C.C. Substitutions in a homologous region of extracellular loop 2 of CXCR4 and CCR5 alter coreceptor activities for HIV-1 membrane fusion and virus entry// J Biol Chem. -2000. V.275. - P.23774-23782
24. Chong Y., Ikematsu H., Ariyama I., Chijiwa K., Li W., Yamaji K., Kashiwagi S., and Hayashi, J. Evidence of B cell clonal expansion in HIV type 1-infected patients // AIDS Res. Hum. Retroviruses-2001 -V.17. P. 1507-1515
25. Cocchi F., DeVico A.L., Garzino-Demo A., Arya S.K., Gallo R.C., and Lusso P. Identification of RANTES, MIP-1 alpha, and MIP-1 beta as the major HIV-suppressive factors produced by CD8+ T cells // Science 1995 - V.270. - P. 1811 -1815
26. Constant S.L. B lymphocytes as antigen-presenting cells for CD4+ T cell priming in vivo // J. Immunol. 1999. - V.162. - P.5695-5703
27. Croteau G., Doyon L., Thibeault D., McKercher G., Pilote L., and Lamarre D. Impaired fitness of human immunodeficiency virus type 1 variants with high-level resistance to protease inhibitors // J. Virol. 1997.-V.71.-P. 1089-1096
28. Dohlman H.G., Thorner J., Caron M.G., and Lefkowitz R.J. Model systems for the study of seven-transmembrane-segment receptors // Annu. Rev. Biochem 1991. - V.60. - P. 653-688
29. Doyon L., Croteau G., Thibeault D., Poulin F., Pilote L., and Lamarre D. Second locus involved in human immunodeficiency virus type 1 resistance to protease inhibitors // J. Virol. 1996. - V.70. -P. 3763-3769
30. Dragic T., Litwin V., Allaway G.P., Martin S.R., Huang Y., Nagashima K.A., Cayanan C., Maddon P.J., Koup R.A., Moore J.P., and Paxton W.A. HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5 // Nature 1996 - V.3 81. - P. 667-673
31. Dykes C. and Demeter L.M. Clinical significance of human immunodeficiency virus type 1 replication fitness // Clin. Microbiol. Rev. 2007. - V.20. -P. 550-578
32. Eggink D., Melchers M., and Sanders R.W. Antibodies to HIV-1: aiming at the right target // Trends Microbiol. 2007. -V.15. -P. 291-294
33. Feinberg H., Mitchell D.A., Drickamer K.5 and Weis W.I. Structural basis for selective recognition of oligosaccharides by DC-SIGN and DC-SIGNR// Science 2001. -V.294. - P. 2163-2166
34. Fouchier R.A.M. and Schuitemaker H. Molecular determinants of human immunodeficiency virus type 1 phenotype variability // Eur. J. Clin. Invest. 1996. - V.26. - P. 175-185
35. Fredericksen B.L., Wei B.L., Yao J., Luo T., and Garcia J.V. Inhibition of endosomal/lysosomal degradation increases the infectivity of human immunodeficiency virus// J. Virol. 2002. - V.76. -P.11440-11446
36. Fust G. Enhancing antibodies in HIV infection//Parasitology 1997. - V.115 Suppl. - P. S127-S140
37. Geyer H., Holschbach C., Hunsmann G., and Schneider J. Carbohydrates of human immunodeficiency virus. Structures of oligosaccharides linked to the envelope glycoprotein 120//J. Biol. Chem. 1988. - V.263. - P. 11760-11767
38. Goodenow M., Huet T., Saurin W., Kwok S., Sninsky J., and Wain-Hobson S. HIV-1 isolates are rapidly evolving quasispecies: evidence for viral mixtures and preferred nucleotide substitutions//.!. AIDS 1989. - V.2. - P.344-352
39. Goudsmit J., BackN.K.T., and Nara P.L. Genomic diversity and antigenic variation of HIV-1: links between pathogenesis, epidemiology and vaccine development// FASEB J. 1991. - V.5. - P.2427-2436
40. Goudsmit J., Ljunggren K., Smit L., Jondal M., and Fenyo E.-M. Biological significance of the antibody response to HIV antigens expressed on the cell surface//Arch. Virol. 1988a. - V.103. -P. 189-206
41. Goudsmit J. and Lukashov V.V. Dating the origin of HIV-1 subtypes//Nature 1999. - V.400. -P.325-326
42. Goudsmit J., Smit L., and Meloen R.H. Conserved location and structure of a HIV-1 neutralization epitope with restricted antibody binding specificity//Proceedings UCLA symposia: Technological Advances in Vaccine Development 1988b. - V.84. - P.345-355
43. Gougeon M.L. and Montagnier L. Apoptosis in AIDS//Science 1993. - V.260. - P. 1269-1270
44. Gray E.S., Moore P.L., Pantophlet R.A., and Morris L. N-linked glycan modifications in gpl20 of human immunodeficiency virus type 1 subtype C render partial sensitivity to 2G12 antibody neutralization//.!. Virol. 2007. -V.81. - P. 10769-10776
45. Hahn B.H., Shaw G.M., Arya S.K., Popovic M., Gallo, R.C., and Wong-Staal F. Molecular cloning and characterization of the HTLV-III virus associated with AIDS// Nature 1984. - V.312. - P. 166169
46. Hart D.N. Dendritic cells: unique leukocyte populations which control the primary immune response//Blood 1997. - V.90. - P.3245-3287
47. Hazenberg M.D., Hamann D., Schuitemaker H., and Miedema F. T cell depletion in HIV-1 infection: how CD4+ T cells go out of stock //Nat. Immunol. 2000. - V.l - P.285-289
48. Heath S.L., Tew J.G., Szakal A.K., and Burton G.F. Follicular dendritic cells and human immunodeficiency virus infectivity//Nature 1995. - V.377. - P.740-744
49. Hill M., Tachedjian G., and Mak J. The packaging and maturation of the FIIV-1 Pol proteins//Curr. HIV. Res. 2005. - V.3 - P.73-85
50. Ho D.D., Neumann A.U., Perelson A.S., Chen W., Leonard J.M., and Markowitz M. Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection//Nature 1995. - V.373 - P. 123-126
51. Flomsy J., Meyer M., Tateno M., Clarkson S., and Levy J.A. The Fc and not CD4 receptor mediates antibody enhancement of HIV infection in human cells//Science 1989. -V.244 - P. 1357-1360
52. Hwang S.S., Boyle T.J., Lyerly PI.K., and Cullen B.'R. Identification of envelope V3 loop as the major determinant of CD4 neutralization sensitivity of FIIV-1//Science 1992. V.257. - P.535-537
53. Jansson M., Popovic M., Karlsson A., Cocchi F., Rossi P., Albert J., and Wigzell H. Sensitivity to inhibition by beta-chemokines correlates with biological phenotypes of primary HIV-1 isolates//Proc Natl Acad Sci U S A 1996. - V.93. - P. 15382-15387
54. Jolly C., Kashefi K., Hollinshead M., and Sattentau Q.J. FIIV-1 Cell to Cell Transfer across an Env-induced, Actin-dependent Synapse//J Exp Med 2004. - V.l99. - P.283-293
55. Kameyoshi Y., Dorschner A., Mallet A.I., Christophers E., and Schroder J.M. Cytokine RANTES released by thrombin-stimulated platelets is a potent attractant for human eosinophils//J Exp Med -1992. V.176. - P.587-592
56. Kimura M. Estimation of evolutionary distances between homologous nucleotide sequences//Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981. - V.78. - P.454-458
57. Kimura M. The neutral theory of evolution. Cambridge: Cambridge University Press, 1983.
58. Koito A., Stamatatos L., and Cheng-Mayer C. Small amino acid sequence changes within the V2 domain can affect the function of a T-cell line-tropic human immunodeficiency virus type 1 envelope gpl20//Virol. 1995. - V.206 - P.878-884
59. Kramer B., Pelchcn-Matthews A., Deneka M., Garcia E., Piguet V., and Marsh M. HIV interaction with endosomes in macrophages and dendritic cells//Blood Cells Mol. Dis. 2005. - V.35. - P. 136142
60. Kremer M. and Schnierle B.S. HIV-1 Vif: HIV's weapon against the cellular defense factor APOBEC3G//Curr. HIV. Res. 2005. -V.3. -P.339-344
61. Kuiken C.L., Lukashov V.V., Baan E., Dekker J., Leunissen J.A.M., and Goudsmit J. Evidence for limited within-person evolution of the V3 domain of the HIV-1 envelope in the Amsterdam population//AIDS 1996. - V.10. - P.31-37
62. Kulkarni P.S., Butera S.T., and Duerr A.C. Resistance to HIV-1 infection: lessons learned from studies of highly exposed persistently seronegative (HEPS) individuals//AIDS Rev. 2003. - V.5 -P.87-103
63. Kwon O.J., Jose P.J., Robbins R.A., Schall T.J., Williams T.J., and Barnes P.J. Glucocorticoid inhibition of RANTES expression in human lung epithelial cells//Am J Respir. Cell Mol Biol -1995. V.12.-P.488-496
64. Mammano F., Kondo E., Sodroski J., Bukovsky A., and Gottlinger II.G. Rescue of human immunodeficiency virus type 1 matrix protein mutants by envelope glycoproteins with short cytoplasmic domains//J. Virol. 1995. -V.69. - P.3824-3830
65. Mammano F., Petit C., and Clavel F. Resistance-associated loss of viral fitness in human immunodeficiency virus type 1: phenotypic analysis of protease and gag coevolution in protease inhibitor-treated patients//J. Virol. N,12. - P.7632-7637
66. Manes S., Mira E., Gomez-Mouton C., Lacalle R.A., Keller P., Labrador J.P., and Martinez A. Membrane raft microdomains mediate front-rear polarity in migrating cells//EMBO J 1999. -V. 18. - P.6211-6220
67. Martinez-Picado J., Savara A.V., Sutton L., and D'Aquila R.T. Replicative fitness of protease inhibitor-resistant mutants of human immunodeficiency virus type 1// J. Virol. 1999. - V.73. -P.3744-3752
68. Masharsky A.E., Klimov N.A., and Kozlov A.P. Molecular cloning and analysis of full-length genome of HIV type 1 strains prevalent in countries of the former Soviet Union//AIDS Res Hum Retroviruses 2003. - V.19. - P.933-939
69. McCune J.M., Rabin L.B., Feinberg M.B., Lieberman M., Kosek J.C., Reyes G.R., and Weissman I.L. Endoproteolytic cleavage of gpl60 required for the activation of human immunodeficiency virus//Cell 1988. - V.53. - P.55-67
70. McDonald D., Wu L., Bohks S.M., KewalRamani V.N., Unutmaz D., and Hope T.J. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions//Science 2003. - V.300. - P.1295-1297
71. McKnight A., Weiss R.A., Shotton C., Takeuchi Y., Hoshino PI., and Clapham P.R. Change in tropism upon immune escape by human immunodeficiency virus//J. Virol. 1995. V.69. - P.3167-3170
72. Michael N.L. and Moore J.P. Viral phenotype and CCR5 genotype//Nat. Med. 1999. - V.5.-P.1330.
73. Milich L., Margolin B., and Swanstrom,R. V3 loop of the human immunodeficiency virus type 1 env protein: interpretating sequence variability//Journal of Virology 1993. - V.67. - P.5623-5634
74. Miller C.J., McChesney M., and Moore P.F. Langerhans cells, macrophages and lymphocyte subsets in the cervix and vagina of rhesus macaques//Lab Invest 1992. - V.67. - P.628-634
75. Mitchell D.A., Fadden A. J., and Drickamer K. A novel mechanism of carbohydrate recognition by the C-type lectins DC-SIGN and DC-SIGNR. Subunit organization and binding to multivalent ligands//J Biol Chem 2001. - V.276. - P.28939-28945
76. Moore J.P. and Ho D.D. HIV-1 neutralization: the consequences of viral adaptation to growth on transformed T cells//AIDS 1995. - V.9 Suppl A. - P.S117-S136
77. Moore J.P., Kitchen S.G., Pugach P., and Zack J.A. The CCR5 and CXCR4 coreceptors-central to understanding the transmission and pathogenesis of human immunodeficiency virus type 1 infection//AIDS Res. Hum. Retroviruses 2004. - V.20. - P.111-126
78. MRC/BIIF Heart Protection Study of cholesterol lowering with simvastatin in 20,536 high-risk individuals: a randomised placebo-controlled trial// Lancet 2002.- V.360. - P.7-22
79. Mullcr S., Wang H., Silverman G.J., Bramlet G., Haigwood N., and Kohler H. B-cell abnormalities in AIDS: stable and clonally-restricted antibody response in HIV-1 infection//Scand. J. Immunol. -1993. V.38. - P.327-334
80. Nabatov A.A., Masharsky A.E., Verevochkin S.V., Emelyanov A.V., and Kozlov A.P. Host-dependent serum specificity to the V3 domain of HIV-l//Scand. J Immunol 2004a. - V.60. -P.471-476
81. Nabatov A.A., Pollakis G., Linnemann T., Paxton W.A., and De Baar M.P. Statins Disrupt CCR5 and RANTES Expression Levels in CD4 T Lymphocytes In Vitro and Preferentially Decrease Infection of R5 Versus X4 HIV-l//PLoS. ONE. 2007b. - V. 2. - P. e470
82. Nakowitsch S., Quendler H., Fekete H., Kunert R., Katinger H., and Stiegler G. HIV-1 mutants escaping neutralization by the human antibodies 2F5, 2G12, and 4E10: in vitro experiments versus clinical studies//AIDS 2005. - V.19. - P. 1957-1966
83. Narayan O. and Clements J.E. Review article: Biology and pathogenesis of lentiviruses//J. Gen. Virol. 1989. - V.70. - P.1617-1639
84. Nekhai S. and Jeang K.T. Transcriptional and post-transcriptional regulation of HIV-1 gene expression: role of cellular factors for Tat and Rev// Future. Microbiol. 2006. - V.l. - P.417-426
85. Nelson P.J. and.Krensky A.M. Chemokines, lymphocytes and viruses: what goes around, comes around//Curr. Opin. Immunol 1998. - V.l0. - P.265-270
86. Neuhaus O., Strasser-Fuchs S., Fazekas F., Kieseier B.C., Niederwieser G., Hartung H.P., and Archelos J.J. Statins as immunomodulators: comparison with interferon-beta lb in MS//Neurology -2002. V.59. - P.990-997
87. Nguyen D.H. and Taub D. CXCR4 function requires membrane cholesterol: implications for HIV infection//J Immunol 2002b. - V.168. - P.4121-4126
88. Nguyen D.H. and Taub D. Cholesterol is essential for macrophage inflammatory protein 1 beta binding and conformational integrity of CC chemokine receptor 5// Blood 2002a. - V.99. - P.4298-4306
89. O'Brien T.R., Winkler C., Dean M., Nelson J.A., Carrington M., Michael N.L., and White G.C. HIV-1 infection in a man homozygous for CCR5 delta 32//Lancet 1997. - V.349. - P.1219
90. Onuffer J.J. and Horuk R. Chemokines, chemokine receptors and small-molecule antagonists: recent developments//Trends Pharmacol. Sci. 2002. - V.23 - P. 459-467
91. Papsidero L.D., Sheu M., and Ruscetti F.W. Human immunodeficiency virus type 1-neutralizing monoclonal antibodies which react with pi7 core protein: characterization and epitope mapping//J. Virol. 1989. - V.63. - P.267-272
92. Paxton W.A., Kang S., Liu R., Landau N.R., Gingeras T.R., Wu L., Mackay C.R., and Koup R.A. HIV-1 infectability of CD4+ lymphocytes with relation to beta-chemokines and the CCR5 coreceptor//Immunol Lett. 1999. - V.66. - P.71-75
93. Pazhanisamy S., Partaledis J.A., Rao B.G., and Livingston D.J. In vitro selection and characterization of VX-478 resistant HIV-1 variants//Adv. Exp. Med. Biol. 1998. - V.436. - P.75-83
94. Percherancier Y., Planchenault T., Valenzuela-Fernandez A., Virelizier J.L., Arenzana-Seisdedos
95. F., and Bachelerie F. Palmitoylation-dependenl control of degradation, life span, and membrane expression of the CCR5 receptor//J Biol Chem 2001. - V.276. - P.31936-31944
96. Plantier J.C., Damond F., Souquieres S., Brun-Vezinet F., Simon F., and Barin F. V3 serological subtyping of human immunodeficiency virus type 2 infection is not relevant//J Clin Microbiol. -2001. V.39. - P.3803-3807
97. Pope M., Betjes M.G., Romani N., Hirmand H., Cameron P.U., Hoffman L., Gezelter S., Schuler
98. G., and Steinman R.M. Conjugates of dendritic cells and memory T lymphocytes from skin facilitate productive infection with HIV-l//Cell 1994. - V.78. - P.389-398
99. Popovic M., Sarngadharan M.G., Read E., and Gallo R.C. Detection, isolation, and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS//Science -1984. V.224.-P.497-500
100. Preston B.D., Poiesz B.J., and Loeb L.A. Fidelity of HIV-1 reverse transcriptase// Science 1988. -V.242. -P.l 168-1171
101. Profy A.T., Salinas P.A., Eckler L.I., Dunlop N.M., Nara P.L., and Putney S.D. Epitopes recognized by the neutralizing antibodies of an HIV-1-infected individual// J. Immunol. 1990. - V.144. -P.4641-4647
102. Robert-Guroff M., Brown M., and Gallo R.C. HTLV-III-neutralizing antibodies in patients with AIDS and AIDS-related complex//Nature 1985. - V.316. - P.72-74.
103. Roberts J.D., Bebenek K., and Kunkel T.A. The accuracy of reverse transcriptase from HIV-1//Science 1988. - V.242. - P.1171-1173
104. Roeth J.F. and Collins K.L. Human immunodeficiency virus type 1 Nef: adapting to intracellular trafficking pathways. Microbiol//Mol. Biol. Rev. 2006. - V.70. P.548-563
105. Roncalli M., Sideri M., Gie P., and Servida E. Immunophenotypic analysis of the transformation zone of human cervix//Lab Invest 1988. - V.58. - P. 141-149
106. Roux K.H. and Taylor K.A. AIDS virus envelope spike structure//Curr. Opin. Struct. Biol. 2007. -V.17. - P.244-252
107. Rudolph M.G., Stanfield R.L., and Wilson I.A. How TCRs bind MIICs, peptides, and coreceptors//Annu. Rev. Immunol. 2006. - V.24. - P.419-466
108. Samson M., Labbe O., Mollereau C., Vassart G., and Parmentier M. Molecular cloning and functional expression of a new human CC-chemokine receptor gene// Biochem. 1996a. - V.35. -P.3362-3367
109. Samuelsson A., Sonnerborg A., Heuts N., Coster J., and Chiodi F. Progressive B cell apoptosis and expression of Fas ligand during human immunodeficiency virus type 1 infection//AIDS Res. Hum. Retroviruses 1997. - V. 13. - P. 1031-1038
110. Sattentau Q.J., Dalgleish A.G., Weiss R.A., and Beverley P.C.L. Epitopes of the CD4 antigen and IIIV infection// Science 1986. - V.234. - P.l 120-1123
111. Scarlata S. and Carter C. Role of HIV-1 Gag domains in viral assembly// Biochim. Biophys. Acta -2003.- V.1614. -P. 62-72
112. Schall T.J., Bacon K., Toy K.J., and Goeddel D.V. Selective attraction of monocytes and T lymphocytes of the memory phenotype by cytokine RANTES//Nature 1990. - V.347. - P.669-671
113. Schock H.B., Garsky V.M., and Kuo L.C. Mutational anatomy of an HIV-1 protease variant conferring cross-resistance to protease inhibitors in clinical trials. Compensatory modulations of binding and activity//J Biol Chem 1996. - V.271. - P.31957-31963
114. Selvan R.S., Butterfíeld J.H., and Krangel M.S. Expression of multiple chemokine genes by a human mast cell leukemia//J Biol Chem 1994. - V.269. - P. 13893-13898
115. Soilleux E.J., Morris L.S., Rushbrook S., Lee B., and Coleman N. Expression of human immunodeficiency virus (HlV)-binding lectin DC-SIGNR: Consequences for HIV infection and immunity//Hum Pathol. 2002. - V.33. - P.652-659
116. Spear G.T., Zariffard M.R., Xin J., and Saifuddin M. Inhibition of DC-SIGN-mediated trans infection of T cells by mannose-binding lectin//Immunol. 2003. - V.l 10. - P.80-85
117. Spenlehauer C., Kirn A., Aubertin A.M., and Moog C. Antibody-mediated neutralization of primary human immunodeficiency virus type 1 isolates: investigation of the mechanism of inhibition//J. Virol. 2001. - V.75. - P.2235-2245
118. Steinman R.M. and Nussenzweig M.C. Avoiding horror autotoxicus: the importance of dendritic cells in peripheral T cell tolerance//Proc Natl Acad Sci U S A 2002. - V.99. - P.351-358
119. Stoiber PL, Kacani L., Speth C., Wurzner R., and Dierich M.P. The supportive role of complement in HIV pathogenesis//Immunol Rev. 2001. - V.180. - P. 168-176
120. Su S.V., Hong P., Baik S„ Negrete O.A., Gurney K.B., and Lee B. DC-SIGN binds to HIV-1 glycoprotein 120 in a distinct but overlapping fashion compared with ICAM-2 and ICAM-3//J Biol Chem 2004. - V.279. - P.19122-19132
121. Takeuchi S. and Furue M. Dendritic cells: ontogeny//Allergol. Int. 2007. - V.56. - P.215-223.
122. Thelen M. Dancing to the tune of chemokines//Nat. Immunol 2001. - V.2. - P. 129-134.
123. Tscherning C., Alaeus A., Fredriksson R., Bjorndal A., Deng H., Littman D.R., Fenyo E.M., and Albert J. Differences in chemokine coreceptor usage between genetic subtypes of HIV-1//Virol. -1998. V.241. - P.181-188
124. Turville S., Wilkinson J., Cameron P., Dable, J., and Cunningham, A.L. The role of dendritic cell C-type lectin receptors in HIV pathogenesis// J Leukoc. Biol 2003.- V.74. - P.710-718
125. Turville S.G., Arthos J., Donald K.M., Lynch G., Naif H., Clark G., Hart D., and Cunningham A.L. HIV gpl20 receptors on human dendritic cells//Blood 2001. - V.98. - P.2482-2488
126. Turville S.G., Cameron P.U., Handley A., Lin G., Pohlmann S., Doms R.W., and Cunningham A.L. Diversity of receptors binding HIV on dendritic cell subsets//Nat. Immunol. 2002. - V.3. - P.975-983
127. Unutmaz D., KewalRamani V.N., and Littman D.R. G protein-coupled receptors in HIV and SIV entry: new perspectives on lentivirus-host interactions and on the utility of animal models//Semin. Immunol 1998. - V.10. - P.225-236
128. Vartanian J.-P., Meyerhans A., Asjo B., and Wain-Hobson S. Selection, recombination and G X A hypermutation of human immunodeficiency virus type 1 genomes//J. Virol. 1991. - V.65. -P.1779-1788
129. Vieillard V., Strominger J.L., and Debre P. NK cytotoxicity against CD4+ T cells during HIV-1 infection: a gp41 peptide induces the expression of an NKp44 ligand// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2005. - V.102. - P.10981-10986
130. Wain-Hobson S., Sonigo P., Danos O., Cole S., and Alizon M. Nucleotide sequence of the AIDS virus, LAV// Cell 1985. - V.40. - P.9-17
131. Weiss R.A., Clapham P.R., Cheingsong-Popov R., Dalgleish A.G., Carne C.A., Weller I.V.D., and Tedder R.S. Neutralization of human T-lymphotropic virus type III by sera of AIDS and AIDS-risk patients/ZNature 1985. - V.316. - P.69-72
132. Wiley R.D. and Gummuluru S. Immature dendritic cell-derived exosomes can mediate HIV-1 trans infection//Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2006. - V.103. - P. 738-743
133. Wong-Staal F., Shaw G.M., Hahn B.H., Salahuddin S.Z., Popovic M„ Markham P., Redfield R., and Gallo R.C. Genomic diversity of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III)//Science -1985.-V.229.-P.759-762
134. Wu L., Martin T.D., Carrington M., and KewalRamani V.N. Raji B cells, misidentified as THP-1 cells, stimulate DC-SIGN-mediated HIV transmission//Virol. 2004. - V.318. - P. 17-23
135. Wyatt R., Kwong P.D., Desjardins E., Sweet R.W., Robinson J., Hendrickson W.A., and Sodroski J.G. The antigenic structure of the HIV gpl20 envelope glycoprotein// Nature 1998. - V.393.
136. Wyatt R. and Sodroski J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens//Science 1998. - V.280. - P. 1884-1888
137. Xiao L., Rudolph D.L., Owen S.M., Spira T.J., and Lai R.B. Adaptation to promiscuous usage of CC and CXC-chemokine coreceptors in vivo correlates with HIV-1 disease progression//AIDS -1998. V.12 -P.F137-F143
138. Yamamoto H. and Matano T. Anti-HIV adaptive immunity: determinants for viral persistence// Rev. Med. Virol. 2008. - V.18. - P.293-303
139. Zhang J. and Temin H.M. Retrovirus recombination depends on the length of sequence identity and is not error prone//J. Virol. 1994. - V.68. - P.2409-2414
140. Zhang Y.J. and Moore J.P. Will multiple coreceptors need to be targeted by inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 entry?// J Virol 1999. - V.73. - P.3443-3448.
141. Zou Y.R., Kottmann A.H., Kuroda M., Taniuchi I., and Littman D.R. Function of the chemokine receptor CXCR4 in haematopoiesis and in cerebellar development// Nature 1998. - V.393. - P.595
-
Набатов, Алексей Анатольевич
-
доктора биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2009
-
ВАК 03.01.04
- Каталитические антитела - протеазы
- Механизмы резистентности при ВИЧ-инфекции
- Ингибиторы проникновения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в клетку
- Биологические свойства изолятов ВИЧ-1, выделенных от пациентов с территорий СНГ
- ВИЧ-инфекция в Республике Беларусь (вирусологические, серологические и молекулярно-биологические исследования)
