Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эволюция вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в процессе развития СПИД

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Эволюция вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в процессе развития СПИД"

И 6 од

- 8 ОКТ 1996

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫИ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

УДК: 577. 112.5. 0.87

СТРУН"НИКОВА Наталья Валерьевна

ЭВОЛЮЦИЯ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОБЕКА (ВИЧ-1) В ПРОЦЕССЕ РАЗВИТИЯ СПИД

/

специальность: 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

1996

Рабата выполнена в лаборатории молекулярной вирусологии Университета Джонса Гопкинса (США).

Научный руководитель:

профессор Рафаель Виссиди (Университет Джонса Гопкинса, Балтимор, США) Научный консультант: профессор В.А. Ланцов.

Официальные оппоненты:

чл-корр. РАМН, доктор медицинских наук B.C. Гайцхоки (ВИЭМ), кандидат биологических наук А.П. Козлов (зав. лаб. ГосНИИ ОЧБ).

Ведущее учреждение: Институт цитологии РАН .

3ai пята состоится "J * 1996 г.

в ? Ь часов на заседании Диссертационного совета Д,063.57.21 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского. государственного университета

Автореферат разослан 5 С У- '-'^1996 г..

<г

Ученый секретарь Диссертационного совета

Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуапкнгхугь рробчдмн. С момента описания в 1984 г, ретровируса, . вызывающего развитие острого иммунодефицита у человека (ВИЧ-1), и до настоящего времени всё проведенные исследования не раскрыли полностью как особенности молекулярной организации самого вируса, так и механизмы разрушения иммунной системы человека. Попытки создания вакцинь' или противовирусного препарата до настоящего времег i также не увенчались успехом. Наиболее вероятной причиной этих неудач может быть то, что вирус обладает чрезвычайно высоким уровнем генетического разнообразия и, вследствие этого, широко варьирует по своим биологическим свойствам (Coffin, 1995). Такое уникальное внутривидовое генетическое разнообразие вируса иммунодефицита Привело к необходимости использования понятия "квазивида" для описания популяции близкородственных, но не идентичных геномов.

В организме пораженного вирусом человека одновременно может находиться до 10е генетически различных вирусных частиц, причем с развитием > заболевания это число может увеличиваться (Wei, 1995). В основе такой "вариабельности лежит отсутствие корректорской функции у РНК-зависимой ДНК полимеразы вируса. В результате этого при синтезе ДНК частота возникновения мутаций составляет величину порядка 10"4/10"5 на геном вируса (Klarman et al., 1993; Roberts et al., 1988).

Дальнейшими исследованиями было показано, что степень изменчивости различна для разных районов генома вируса (Dellasus et al., 1991). Одним из объектов для изучения генетического разнообразия вируса является ген env, кодирующий поверхностный гликопротеин др120 Он имеет в своем составе пять вариабельных участков, причем генетическая изменчивость одного из них (V3) оказывает непосредственное влияние на тд^е важнейшие биологические свойства вируса, как способность индуцировать слияние клеток, патогенностъ, вирулентность и клеточный тропизм (Fouchier et al., 1992; Willey et al., 1994). Было показано, что в основе синдрома иммунодефицита у человека может лежать как увеличение генетического разнообразия популяции вируса, так и появление в процессе развития заболевания новых более вирулентных вариантов вируса (Donaldson et al., 1994; Nowak et al., 1991). Однако недостатком проведенных исследований является отсутствие систем:;гического и долговременного анализ-*

вирусной популяции от момента заражения ерганизма вирусом до развития синдрома иммунодефицита.

Одним из новых подходов к изучению изменчивости и эволюции вирусных вариантов в популяции /л vivo является выделение и секвенирование коротких фрагментов геном.? вируса с последующим количественным анализом филогенетических взаимоотношений между различными вирусными вариантами. Научный и практический интерес к такого рода исследованиям в настоящее время очевиден, поскольку они дают возможность выяснить взаимосвязь между эволюцией вирусной популяции и развитием заболевания.

Цели и запачи исследования. Целью данной работы было изучение динамики и разнообразия генетических изменений в популяции ВИЧ-1 с развитием заболевания у педиатрических пациентов /л vivo. В связи с этим работа предусматривала решение следующих задач:

1. Используя метод гетеродуплексного анализа ДНК, а также »информационный анализ одноцепочечных молекул ДНК, оценить динамику распределения квазивидов ВИЧ-1 в популяции. Проследить, как изменяется доля каждого уникального вирусного варианта с течением заболевания у отдельного пациента.

2. Филогенетическими методами исследовать эволюционные взаимоотношения между различными квазивидами ВИЧ-1 путем сравнения нуклеотидных последовательностей двух гипервариабельных районов гена env.

3. Путем сравнения аминокислотных последовательностей двух гипервариабельных районов гена ел^у шести педиатрических пациентов провести анализ взаимоотношений между вирусными вариантами и установить взаимосвязь между генетической изменчивостью вируса и развитием иммунодефицита.

4. Используя оригинальную компьютерную программу, оценить скорость возникновения несинонимических и синонимических мутаций в различных районах генома ВИЧ-1 и провести сравнение с другими методами вычисления скоростей мутирования в вирусной популяции.

5. Определить, существует ли корреляция между скоростью возникновения различных типов мутаций в геноме вируса и степенью развития заболевания у каждого индивидуума и установить взаимосвязь между возникновением специфических аминокислотных замен в функциональных районах генома ВИЧ-1,

исследования генетических изменений в популяции ВИЧ-1 у педиатрических пациентов на разных стадиях заболевания. Методами молекулярно-филогенетического анализа популяции впервые было продемонстрировано явление "конвергентной" или "параллельной" эвэлкгции на примере появления общего функционального мотива в районе петли УЗ оболочки белка ВИЧ-1. Показана взаимосвязь между развитием иммунодефицита и появлением в популяции новых вирусных частиц с описанным ранее Т-лимфотропным мотивом в районе УЗ белка оболочки вируса. С использованием нового подхода даны более реалистичные оцемки скорости возникновения несйнонимичьских и синонимических мутаций в разных районах генома вируса и проведено сравнение между новым и традиционным методами расчета скоростей мутироЬания. Для района С2/УЗ белка оболочки гена ет впервые выявлена корреляция между скоростью возникновения мутаций и прогрессированием иммунодефицита.

использованием РНК из свободных вирусных частиц плазмы крови. В соавторстве разработана («бвая компьютерная программа для вычисления скорости мутирования вирусной популяции. При расчете генетического расстояния данная программа позволяет наиболее полно учитывать всю информацию о генетическом разнообразии и частоте встречаемости каждого квазивида в постоянно меняющейся популяции вируса. Разработан подход для сравнительного анализа большой выборки нуклеотидных последовательностей, позволяющий отбор и дальнейшее исследование отличающихся вариантов. Усовершенствован метод выделения РНК-содержащих вирусных частиц из плазмы крови. Апробация работы. Результаты работы были доложены на конференции по генетическим вариациям генома ВИЧ-1 и статистическим методам (Rutgers University, New Jersey, USA, May 1995); ll-ом Национальном конгрессе по человеческим ретровирусам (Washington, январь 1995); симпозиуме по молекулярной биологии ВИЧ (Keystone, Symposia, Taos, New Mexico, USA, 1996); на IV-ой международной конференции "СПИД, РАК и родственные проблемы" (С-

Созда.ч банк нуклеотидных последовательностей с

Петеобург, май 1996 г.); на межлабораторном семинаре ОМРБ ПИЯФ РАН (апрель 1996 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения,

обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты

исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 92

источника. Работа изложена на 114 страницах и содержит 18 рисунков и 4

таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили образцы крови новорожденных детей, инфицированных ВИЧ-1 (коллекция Университета Джонса Гопкинса). Вирусные частицы, содержащие РНК, осаждали из плазмы крови при помощи ультрацектрифугирования, обрабатывали протеиназой К (1 мг/мл) и осаждали на холоду 95% этанола. Одну десятую часть РНК использовали в реакции синтеза' кДНК, проводимой с помощью фермента обратной транскригттазы. Реакцию проводили в буфере ТЕ, содержащем 75 mM KCI, 3 тМ MgCfe, 0,5 тМ нуклеозидтрифосфатов, 200 единиц фермента обратной транскригттазы вируса Молони (GIBCO BRL) и 10 пкМ случайных шестичленных праймерое (37° С, 1 час).

Пол! /еразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием 'внешней" и 'внутренней" лары лраймеров ("гнездовой" метод) с целью получения фрагментов C2/V3 и V1/V2 гена белка оболочки env. Реакцию проводили в буфере ТЕ, содержащем 2,5 тМ MflClj, по 0,25 мкМ каждого праймера и две единицы ДНК полимеразы Taq (Perkin Elmer). .Каждый из 30 циклов ПЦР включал: плавление ДНК при 94° С - 15 сек, отжиг при 55° С - 15 сек и синтез ДНК при 72° С - 30 сек. Продукт реакции с внешними праймерами разбавляли в воде 1:100, и 5 мкл полученного раствора использовали во второй реакции с внутренними праймерами.

Продукт второй реакции ПЦР лигировали в веетор с Т-адаптором (Novagen), и полученной смесью трансформировали клетки £co//'(Man¡at¡s el а!., 1993). Продукт ПЦР использовали для выявления уникальных нуклеотидных последовательностей на основа различия в элекгрофоретической подвижности гибридов, образованных между фрагментами ДНК опытной и контрольной линий (гетеродуплексный анализ). В том случае, когда образование дуплексов между

последовательностями ДНК было невозможным,применяли метод, основанный на явлении конформационного полиморфизма одноцепочечных молекул ДНК (КПОМ) (Orita et al., 1989). Плазмидную ДНК с вирусной вставкой использовали для секвенирования вставки в обоих направле ниях при помощи автоматического секвенатора ALF (Pharmacia).

Молекулярно-филогенетический анализ проводили после выравнивания всех нуклеотидных последовательностей по программе ESEE 3.0 (Cabot et al., 1989). Генетическое расстояние между различными вариантами этих последовательностей было вычислено с использованием программы DNADIST из пакета программ PHYLIP (версия 3.55; Felsenstein, 1989). Полученную двумерную матрицу дистанций использовгти для построения филогенетических древ по программе FUCH. Топологию каждого древа проверяли при помощи статистического анализа с использованием программ SEQBOOT (сто повторов), DNADIST и CONSENSE 'пакет PHYUP). Аминокислотные последовательности выводили из нуклеотидных последовательностей с использованием программы DIFFSEQ, DNASTAR (пакет PHYUP). Двумерную матрицу дистанций получали при помощи программы PROTDIST и использовали для конструирования эволюционных древ в программе FITCH.

Для вычисления скорости мутирования генов в соавторстве с д-ром Рэем была разработана программа DISTRATE, которая позволяет анализировать изменения генетического расстояния между последовательностями ДНК в зависимости от премени. В программе DISTRATE были испольэозалы даты рождения пациентов, даты забора образцов крови и двумерные матрицы генетических расстояний между последовательностями ДНК из первого образца и всеми последовательностями из последующих образцов. В расчетах учитывали пропорции каждой последовательности в сбразце на основании данных гетеродуплексного анализа или анализа КПОМ. Это позволило использовать информацию о генетической частоте каждого варианта, а также и данные о разнообразии вариантов, для вычисление реальной скорости мутирования.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исходный материал. Работа была проделана на образцах крови, полученных от шести независимых педиатрических пациентов - носителей вируса иммунодефицита ВИЧ-1 подтипа В. Коллекция содержала образцы коови,

полученные от пациентов через каждые 2-4 месяца в ходе развития заболевания. Изучение развития иммунодефицита у педиатрических пациентов в течение ' длительного времени представляется более информативным, т.к. время начала инфекции известно с большей достоверностью. Кроме того, до 25% пораженных детей приобретают острый иммунодефицит в течение первых двух лет после рождения.

Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов генома ВИЧ-1.

Для анализа скорости и направления эволюции вируса были выбраны два участка - С2/УЗ и Щ/\12 гена ет, кодирующего поверхностный гликопротеин вируса. Они содержали три гипервариабельных домена, которые играют важную роль во взаимодействии вируса с иммунной системой клетки. Район С2/УЗ обладает чрезвычайно высокой степенью генетической вариабельности, затрагивающей различные биологические свойства вируса (клеточный тропизм, вирулентность и патогенность). Кроме того, этот район является основной миг:енью для воздействия антител, инактивирующих вирус ^ауаИепап е1 а1., 1990). Ряд исследований (вгоелтк ег а!., 1993; КоНо е1 а1., 1994) указывает на то, что генетические вариации в участке У1/\/2 гена елV также могут влиять на клеточный тропизм, патогенность и вирулентность.

Были определена 131 уникальная нуклеотидная последовательность, содержащая райо« С2/\/3 гена ет вирусных частиц, выделенных у 6 пациентов (обозначены буквами от А до Е). Для изучения эволюционных взаимоотношений между вирусными вариантами эти нуклеотидные последовательности были подвергнуты филогенетическому анапизу (рис, 1). Как видно, последовательности, принадлежащие разным пациентам, образуют на филогенетическом древе отдельные группы. Это, с одной стороны, доказывает независимую природу происхождения вирусов у этих пациентов, а с другой стороны, показывает отсутствие контаминации в ходе эксперимента. Филогенетический анализ, проведенный с использованием '¡56 уникальных нуклеотидных последовательностей, содержащих другой район - VI/N/2 гена епу, также продемонстрировал образование отдельной группы для каждого пациента, что подтверждает выводы о независимости происхождения вирусов у пациентов.

Такая структура филогенетических отношений сохранялась и при использовании других методов, таких как метод "максимальной экономии"

Рис. 1. Бескорневое филогенетическое древо, созданное на основе анализа 9)-ой аминокислотной последовательности, выявленной у шести педиатрических пациентов (А-Е), пораженных ВИЧ-1. Исследуемые фрагменты содержали участок C2/V3 белка оболочки вируса. Числа у основания ветвей, выделенные обводкой, показывают частоту возникновения данной группировки вариантов вирусных частиц при статистической обработке (100 повторов). Символ п для каждого пациента обозначает число аминокислотных последовательностей, взятых в .нализ. Длина ветвей изображена в масштабе, который соответствует определенному генетическому расстоянию.

(parsimony) и метод "связки соседей" (netQhbour-joining). Длина ветвей древа отражает эволюционное расстояние, которое отделяет вирусные варианты друг от друга, от контрольной последовательности и от гипотетического начального варианта. Для двух пациентов с острым иммунодефицитом усредненная длина ветвей 0,049 и 0,033 оказалась большей по сравнению с длиной ветвей у бессимптомных пациентов: 0,013, 0,008, 0,019 и 0,019. Это означает, что вирусные варианты участка C2/V3 имеют больше генетических различий у пациентов

с более продвинутым заболеванием. Схемы расположения вирусных вариантов на древе внутри каждой индивидуальной филогенетической группы

также отличались. У двух пациентов с острым иммунодефицитом в районе C2/V3 наблюдалась последовательная замена вирусных вариантов из ранних образцов на более поздние варианты; при этом эволюционное расстояние между ними увеличивалось. Для бессимптомных пациентов подобной закономерности не наблюдали. Филогенетический анализ 15 уникальных последовательностей из района V1/V2 также выявил различия в схеме ветвления, длине ветвей и скорости эволюционного процесса у пациентов с различной степенью развития заболевания. Для двух пациентов с острым иммунодефицитом усредненная длина ветвей (0,069 и 0,051) оказалась большей по сравнению с длиной ветвей у бессимптомных пациентов (0,019, 0,024, 0,031 и 0,039), что согласуется с результатами, полученными для района C2/V3.

Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей.

Древа, сконструированные для полноразмерных аминокислотных фрагментов C2/V3 и V2/V2 с использованием различных методов, продемонстрировали филогенетические отношения, сходные с теми, какие были выявлены ранее для нуклеотидных последовательностей. Этот результат подтверждает предположение об отсутствии эпидемиологической связи между пациентами. Кроме того, район петли V3 (35 аминокислот), который представляет собой функ .иональный домен белка оболочки вируса, был проанализирован отдельно. Подобный подход был применен ранее (Stewart et а)., 1989) и позволил описать явление функциональной конвергентной эволюции между последовательностями фермента лизоцима коровы и лангура, видоаое различие которых очевидно. В ходе анализа.древа, сконструированного ло методу Фитча-Марголиша, выявилась необычная группировка вирусных вариантов (рис. 2). Детальный анализ строения древа обнаружил^ что аминокислотные последовательности петли V3, выделенные у двух пациентов с острым иммунодефицитом (из позднего забора образцов крови), образовали общую группу. Варианты же вирусов, выделенные у тех же индивидуумов на ранней стадии заболевания, принадлежали к двум филогенетически неродственным группам. Аналогичный результат был получен с использованием других филогенетических методов (parsimony и neighbour-joining) и подтвержден статистическими методами (при 500-кратном повторе подобный результат был получен в 456 случаях). Подобное группирование двух исходно неродственных

мн

Рис. 2. Филогенетический анализ 37 преобладающих аминокислотных последовательностей петли УЗ белка оболочки ВИЧ-1. В процессе исследования у пациентов Г и Д развился синдром острого иммунодефицита, у пациентов А, Б, В и Е симптомы заболевания отсутствовали. Преобладающей последовательностью для каждой временной точки являлась последовательность, составляющая более 50% в вирусной популяции. .Частоту встречаемости вирусных вариантов определяли при помощи гетеродуплексного анализа. Числа в разветвлениях показывают процент древ с аналогичной топологией, полученных в результате статистической обработки (500 повторов). Для каждого варианта показан возраст пациента (дни) в момент забора крови. Длина ветвей изображена в соответствии с масштабом, который составляет определенное генетическое расстояние. В качестве контроля для построения древа использована последовательность на петли УЗ лабораторной линии МН ВИЧ-1.

вирусных популяций может быть объяснено явлением конвергентной эволюции в районе петли УЗ белка оболочки вируса, основанном на сходстве биологических функций этих доменов.

Сопоставление белковых последовательностей участка С2/УЗ и сравнение

Таблица 1

Изменение структуры консенсус-последоаательности петли \/3 в раннем и позднем периоде исследования у шести пациентов.

Пациент Период заболевания Консенсус аминокислотного состава петли V3

А Ранний Поздний СIRPNNNTRKSINMG PGRAF YTTGDIRQ АНС

Б Ранний Поздний CTRPNNKTRKSXNMGPGRAFÏTTGDIRQAHC

В Ранний Поздний CTRPNNNTRRSINMGPGRAFYTTGEIRQAHC

Г Ранний Поздний CTRPSNNTRKSIPMGPGRAFYTTGDIRQAHC. ——H-----E-I----да-—Q—К—

Д 'Раиний Поздний CTRPNNNTRKSITMGPGRAFYTTGDIRQAHC ----------EMJL---KJÍ--------К---

Е Ранний Поздний CXRPf-TNWTRRSIt-IMGPGRAFYTTGDIRQAHC

Примечание: Под ранним и поздним периодами подразумевается первая и вторая половины всего периода заболевания. Знак -- обозначает аминокислоту, идентичную в двух последовательностях каждой пары.

вирусных вариантов из ранних и поздних по времени заборов образцов крови у каждого пациента (Табл. 1) выявили большое число аминокислотных замен у пациентов с острым иммунодефицитом (Г и Д). В частности, в районе петли V3 аминокислотные последовательности из ранних и поздних периодов развития заболевания у этих пациентов отличались по 6-7 позициям, в то время как у пациентов без выраженного симптома иммунодефицита наблюдали не более одной замены. Кроме того, аминокислотные последовательности петли V3, возникшие в поздний период заболевания у пациентов с острым иммунодефицитом, содержали четыре уникальные замены, которые оказались общими для пациентоь Г и Д. Эти замены на аргинин, треонин, валиНи лизин в позициях И, 13. 19 и 32, соответственно. Учитывая тот факт, что изменения в районе C2/V3 могут оказывать влияние на биологические свойства вируса, логично предположить, что вирус с описанным мотивом или обладает преимуществами в популяции,или избегает узнавания антителами.

Как было показано в экспериментах с использованием направленного мутагенеза, аминокислоты Aro, Val, Lys и Thr являются необходимыми для

приобретения вирусом фенотипа повышенной вирулентности и тропизма к Т-лимфоцитам (Chesebro et а!., 1992; Willey et al., 1994; Korber et al., 1994). К концу исследования у двух пациентов" с острым иммунодефицитом вирус с описанным генотипом петли V3 вытеснил все другие варианты и составил до 99% популяции вируса. Повышенная частота возникновения замен в районе петли V3 у пациентов Г и Д может быть объяснена или увеличением частоты возникновения всех типов мутаций в результате повышения уровня вирусной рёпликации,или наличием положительного селективного отбора в сторону закрепления определенных мутаций. Для проверки этих предположений мы провели детальный анализ взаимосвязи между возникновением несинскиыических и синонимических мутаций и развитием заболевания.

Анализ скорости эволюционных процессов при помощи программы DISTRATE.

Наблюдение за количеством и типом нуклеотидных замен, возникающих 8 различных частях генома вируса,- играет важную роль в понимании природы • происходящих эволюционных изменений. Соотношение частот возникновения синонимических (не изменяющих аминокислоту) и несинонимических (изменяющих аминокислоту) замен может являться показателем наличия или отсутствия селективного отбора в исследуемом районе.

Взаимосвязь между увеличением частоты аминокислотных замен в некоторых районах генома и клинической картиной заболевания может свидетельствовать о том, что молекулярно-генетические изменения в данном районе вносят свой вклад в изменение биологических свойств вируса. С помощью программы DISTRATE была исследована динамика вирусной популяции и скорость эволюции вирусных вариантов. Полученные данные представлены на рисунках ЗА и В. Для района C2/V3 результаты, полученные с использованием программы DISTRATE и традиционного метода, существенно не отличались для всех пациентов. Исключение составила скорость синонимических замен у индивидуума Е. Однако данные по скорости мутирования для района V1/V2 различались в зависимости от применяемого метода. Мы считаем, что применение программы DISTRATE дает возможность получить более точные результаты, так как при расчетах учитывается информация, касающаяся не только генетического разнообразия, но и эволюционных изменений в популяции вируса. Скорость синонимических замен s районе V1/V2 оказалась схожей у шести обследованных

пациентов (разброс от 0,2 до 2.1x10'2 замен для каждой позиции в течение года), в то время как для района C2/V3 эти значения чрезвычайно различались (разброс от 0,02 до 10,44"2 замен для каждой позиции в течение года). Этот результат не согласуется с предпосылками нейтральной теории эволюции, предполагающей отсутствие селекции по отношению к мутациям, не изменяющим структуру белка. Это разногласие частично может быть объяснено явлением "предпочтения кодонов" во время синтеза белка (Grantham, 1980; Ikemura, 1985), которое было описано ранее для многих организмов. В двух районах гена env скорости возникновения несинонимических мутаций в большинстве случаев были выше или близки по значению к скоростям возникновения синонимических мутаций: для C2/V3 от 0,8 до 6,5x10"2 и для V1/V2 от 0,016 до 4,8Х10"г замен для каждой позиции в течение года. Это привело к снижению величины отношения скоростей синонимических и иесинонимических мутаций (Кс/Кнс), .что подтверждает предположение о существовании положительного селективного отбора в этих двух

Пациент

Рис. 3. Скорость возникновения несинонимических и синонимических нуклеотидных замен для районов C2/V3 (А) и V1/V2 (Б) гена белка оболочки ВИЧ-1. Под скоростью возникновения нуклеотидных замен для каждого пациента подразумевается количество замен, возникших в популяции вируса за один год. Кс/Кнс - отношение скоростей синонимических и несинонимических замен.

районах. Появление большего числа несинонимических нуклеотидных замен у пациентов с острым иммунодефицитом согласуется с филогенетическими данными, свидетельствующими об увеличении скорости эволюции вируса у тех же

пациентов. Данное наблюдение также согласуется с предположениями о селективных процессах, происходящих я некоторых районах белка оболочки и направленных на такие изменения генотипа вируса, которые приводят к отбору вариантов вируса, устойчивых к иммунному ответу организма. Интересно, что скорости появления несинонимических мутаций у одного и того же пациента различаются в районах С2/УЗ и У1/У2, что, возможно, отражает различия между селективными силами, воздействующими на них.

Изменения в участках С2/уЗ и VI/У2 могут быть результатом селективного отбора, направленного на получение вирусов с более вирулентным и патогенным фенотипом, возможно, влияющим на скорость развития заболевания. Чтобы проверить эту гипотезу, мы рассчитали усредненное количество Т-лимфоцитов в течение всего периода исследования как меру степени развития иммунодефицита у каждого пациента. Для пациентов А, Б, 8, Г, Д и'Е эта величина составила, соответственно^614,1717, 2528,-288,1106 и 1953 клеток в мкп3. Приведенные расчеты показали, что увеличение скорости замен, изменяющих белковую последовательность в районе С2/\/3, коррелирует с числом Т-лимфоцитов в крови больного и степенью развития заболевания (коэффициент корреляции Пирсона г = 0,92 при р = 0,017). В то же время для района У1/У2 такой зависимости но было обнаружено (коэффициент корреляции Пирсона г = 0,0147 при р = 0,98). Это интересное наблюдение, вероятно, означает, что увеличение скорости несинонимических замен под воздействием положительного отбора может приводить к возникновению новых вирусных вариантов с измененными биологическими свойствами. В частности, данный тип вируса может быть более патогенным по отношению к Т-лимфоцитам крови, что может приводить к снижению их числа.

ВЫВОДЫ

1. Проведено исследование динамики генетической изменчивости в популяции ВИЧ-1 у шести независимых пациентов в течение продолжительного периода времени (7-19 мес).

2. Создана обширная база данных, включающая последоватрпьности ДНК др^х ключевых районов ВИЧ-1: участков С2/У3 и У1/\/2 гена белка оболочки ВИЧ 1.

3. С помощью филогенетических методов выявлена независимая природа происхождения вируса у шести исследуемых пациентов.

, 4. Филогенетический анализ районов C2/V3 и V1/V2 гена env ВИЧ-1 показал особый характер эволюционных взаимоотношений между вирусными вариантами в ходе развития заболевания у пациентов с острым иммунодефицитом.

5. Впервые для двух пациентов выявлена корреляция между развитием острого иммунодефицита и появлением общего Т-лимфотропного аминокислотного мотива в районе функционального участка V3 белка оболочки ВИЧ-1, характерного для вирусов, способных поражать Т-лимфоциты в культуре.

6. Анализ частоты возникновения замен в районах C2/V3 и V1/V2 белка оболочки ВИЧ-1 показал, что для большинства пациентов частота возникновения несинонимических замен в этих районах повышена и соотношение скоростей возникновения несинонимических и синонимических мутаций составляет величину, близкую к единице. Это согласуется с предположением о наличии положительного селективного отбора в данных участках генома.

7. Впервые показано, что скорость возникновения нуклеотцдных замен у шести индивидуумов в районе C2/V3 гена оболочки строго коррелирует с развитием заболевания. Для района V1/V2 этого гена подобной закономерности обнаружено не было.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Strunnikova N.V., S, Ray, R. Livingston, E. Rubalcaba, R. Viscidi. Convergent evolution within the V3 loop domain of Human Immunodeficiency Virus type 1 in association with disease progression. // Journal of Virology. 1995, V. 69, P. 7548-7558.

2. Strunnikova N.V., S. Ray, R. Viscidi. Evolutionary changes correlate with disease progression in C2/V3 region of HIV-1 envelope but not in V1/V2. // Abstracts of the, International Conference on HJV Sequence Variations and Statistical Methods. 1995. Rutgers University, New Jersey, USA,P. 11.

3. Strunnikova N.V., S. Ray, R. Viscidi. Convergent evolution in C2/V3 correlates with desease progression. // Abstracts of the II National Conference "Human Retroviruse ; and Related Infections". 1995, Washington. USA P. 255.

4. Strunnikova N.V., S. Ray, R. Viscidi. The nonsynonimous substitution rate in C2/V3

. correlates with a rapid decline in CD4+ cell number. // Adstracts of Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology "Molecular Biology of HIV" . 1996. Taos, New Mexico, USA.P. 61.

5. Струнникова Н.В., С. Рэй, Р. Виссиди, В. Ланцов. Скорость несинонимических замен в етС2/Ч2 районе ВИЧ-1 коррелирует с быстрым уменьшением С04+ клеток у вирус-инфицированных больных детей // "СПИД, рак и родственные проблемы". 1996, Санкт-Петербург, Россия.Стр, 121-122.

Отпечатано в типографии ПИЯФ

Зак. 350, тир. 100, уч.-изд. л. 1; 18т-1996 г. Бесплатно