Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Естественные антитела к белкам ОБМ, S100, ACBP14/18 и МР65 в регуляции развития эмбриона плода
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Естественные антитела к белкам ОБМ, S100, ACBP14/18 и МР65 в регуляции развития эмбриона плода"

На правах рукописи

pre од

-с ноя ш

ВАБИЩЕВИЧ НАТАЛИЯ КОНСТАНТИНОВНА

ЕСТЕСТВЕННЫЕ АНТИТЕЛА К БЕЛКАМ ОБМ, S100, АСВР14/18 И

MP 65

В РЕГУЛЯЦИИ РАЗВИТИЯ ЭМБРИОНА И ПЛОДА

(03.00.04 - биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских, наук

МОСКВА - 2000 г.

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной медицины Медико-Экологического Фонда "Чернобыль-тест" и Отделении клинической и экспериментальной иммунологии ГКБ Аг°29 им Н.Э. Баумана г. Москвы.

Научные руководители: доктор медицинских наук,

Полетаев А.Б.

кандидат медицинских наук, Будыкина Т.С.

Официальные оппоненты: профессор, д.м.н., академик РАЕН И.Е. Ковале!: (специальность 03.00.04 - биохимия, Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН); профессор, д.м.н. И.Я. Конь (специальность 03.00.04 - биохимия. Институт питания РАМН).

Ведущая организация: Институт биомеднцннской химии РАМН г.Москва. Защита состоится [6ук^Г2000 г. в часов

на заседании Специализированного совета Д.001.02.01 при Институте пи тания РАМН по адресу: 109240, г. Москва, Устьинский проезд 2/14, в зал( конференций.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института. Автореферат разослан 2000 года.

"Ученый секретарь

Специализированного совета

к.м.н. В.М. Жменченко.

ОБЩ АЛ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Известно, что внутриутробное развитие будущего ребенка определяется двумя основными системами. Во-первых, это геном, в котором "записана" информация о первичной структуре всех белков будущего организма. Однако, генетический аппарат - это весьма устойчи-. вая и инертная система. Поэтому, нарушения развития, обусловленные дефектами на уровне отдельных генов и хромосом, составляют не более 2-3% от общего числа врожденных уродств. Вторая, важнейшая система регуляции эмбрио/фетогенеза - это иммунная система, реализующая свое влияние через продукцию молекул-регуляторов развития, так называемых факторов дафференцировки и морфогенеза. Именно от этих регупяторных молекул во многом зависит экспрессия генов раннего развития, формирование нервной трубки, функциональное и морфологическое созревание клеток разных органов и тканей. Посредством органо-специфических иммунных реакций (гуморального и клеточного типа) иммунная система принимает непосредственное участие в процессах органогенеза на этапах раннего эмбрионального развития.

Признавая важную роль иммунной системы в раннем онтогенетическом развитии, многие исследователи ограничиваются лишь констатацией зависимости эмбриогенеза от некоторых (неидентифицированных) материнских антител, без детального анализа самого феномена, что, в частности, не позволяет использовать соответствующие эмпирические находки для разработки новых методов акушерской диагностики и прогноза. Следует подчеркнуть, что если участие иммунной системы и, в частности, регуля-торных эмбриотропных антител в механизмах внутриутробного развития не вызывает сомнений, то механизмы этого участия остаются пока мало изученными и далекими от понимания. В этой связи исследования, направленные на идентификацию эмбриотропных антител, их антигенов-мишеней и систематическое изучение зависимости нормального эмбриогенеза от содержания в кровотоке матери определенных видов антител представляются весьма актуальными.

з

Цель и задачи работы. Цель настоящей работы - разработка, клиническая апробацйя и внедрение в практику здравоохранения нового яабора-торно-диагностического метода прогноза развития беременности, основанного на оценке содержания ряда естественных эмбриотропных антител в сыворотке крови женщины.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие основные задачи:

1. Выявить и выделить основные белковые антигены клеток человека, изменения содержания естественных (физиологических) антител к которым, наиболее часто сопровождают неблагоприятные исходы беременности.

2. Разработать эффективные методы хроматографической очистки указанных антигенов.

3. Изучить особенности развития беременности у экспериментальных животных с индуцированными изменениями в содержании эмбриотропных антител к одному из таких антигенов - белку Б100.

4. Оценить содержание циркулирующих антител к выделенным антигенам у женщин фертильного возраста при различных (благоприятных и неблагоприятных) исходах их беременности.

5. Собрать и проанализировать репрезентативные банки данных, отражающие исходы беременности у женщин, имевших разной степени отклонения в содержании определяемых эмбриотропных антител.

6. Изучить популяционные особенности показателей содержания эмбриотропных антител у женщин, проживающих в экологически благоприятных и неблагоприятных рег ионах.

Научная новизна.

1. Впервые установлено, что поддержание определенной концентрации в крови матери естественных, эмбриотропных антител класса к белкам ОБМ, БЮО, АСВР14/18 и МР-65 является важным моментом в обеспечении нормального развития эмбриона и плода.

2. Впервые выделены й охарактеризованы новые, ранее не описанные белки АСВР 14/18 (анионный белок ядерного хроматина) и МР-65

(поверхностный мембранных белок из семейства интегринов), являющиеся эндогенными мишенями физиологических эмбриотропных антител.

3. В модельных экспериментах впервые показано, что за счет дозированного изменения содержания антител к белку S100 в кровотоке беременных животных, можно влиять на количество приносимого приплода и повышать жизнестойкость детенышей, либо напротив, препятствовать развитию беременности.

4. Впервые проведена оценка содержания антител к вышеназванным белкам в крови женщин в условиях нормального развития беременности и при разных формах патологии развития эмбриона и плода. Созданы банки данных о содержании естественных эмбриотропных антител к белкам ОБМ, S-100, АСВР14/18 и МР-65 в крови женщин детородного возраста, необходимые для прогноза вероятности патологии развития эмбриона и плода при обследовании женщины уже в первые недели беременности.

Практическая значимость работы. На основании результатов выполненных исследований, разработан и адаптирован к условиям широкого практического применения новый лабораторно-диагностический метод прогноза аномалий развития эмбриона/плода, получивший наименование ELI-P-TEST (от ELISA-detected Probability of Pathology m Pregnancy). Данные, полученные в ходе научно-клинического использования разработанного метода, свидетельствуют о его эффективности в качестве способа прогноза нормального развития эмбриона и плода.

Внедрение результатов работы в практику. Разработанный метод и необходимые для его выполнения тест-наборы реагентов прошли испытания на клинических базах, рекомендованных Минздравом РФ (1994-1996). По результатам испытаний Комиссия по ИФА и РИА наборам Комитета по новой технике МЗ РФ приняла решение о возможности практического применения набора ELI-P-Test (Приказ Минздрава РФ № 219 от 20 июля 1998 г.).

Апробация работы. Основные материалы диссертации опубликованы в работах [1-12], докладывались на IV Всероссийском Конгрессе «Экология

и здоровье детей» (СПб, 1998), а также на научных семинарах ОКЭИ ГКБ 1 ■ №29. ' '

' Структура й объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, в котором сформулированы основные выводы, списка цитируемой литературы из 111 наименований. Содержание работы изложено на 91 странице основного текста, проиллюстрировано 10 табли-. цами, 4 рисунками и б схемами. Общий объем диссертации составляет 107 листов.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Нами были обнаружены четыре видонеспецифических белковых антигена, изменения содержания антител класса IgG к которым было показательным с точки зрения прогноза возможной патологии развития эмбриона и плода. Выявленные белки, а именно основной белок миелина (ОБМ), белок S100, белок АСВР14/18 и белок МР-65, послужили основой для разработки диагностической тест-системы ELI-P-Test, пригодной для выявления соответствующих антител с помощью твердофазного иммуноферментного анализа.

Получение белков осуществлялось из тканей мозга крупного рогатого скота по методам Полетаева и соавторов и Дейблера.

Основные этапы выделения включали гомогенизацию исходного сырья, дифференциальное центрифугирование на градиентах плотности сахарозы (для АСВР 14/18 и МР-65), осаждение/термообработку (для S100), разделение к очистку белков с помощью анионообменной хроматогра-фии/рехроматографии (катионообменной для ОБМ) и гель-фильтрации.

Получение белка S100 вели из водно-солевых экстрактов цельного мозга.

Белок ОБМ получали из кислотных тритон ХЮО/мочевинных экстрактов отмытой фракции клеточных мембран.

Получение А СВР 14/18 схема 1

Ткань мозга

Гомогенизация в_

0.15 М ШС1

Дифференци альн ое центрифугирование в градиенте сахарозы

Гомогенизация ядер в 0,15 М ИаС1

Экстракция хроматина (тритон/мочевина)

Получение фракции клеточных ядер

Хроматография на колонке РВЕ-94 в градиенте ЫаС1

Диализ

' Обор фракции 0,4-0,7 М Ыя

Рехроматография на колонке Монй-<3

Очищвнный АСВР И/18

/

Получение МР-65 схема 2

Гомогенизация

в физ растворе -»

СВЕЖИЙ МОЗГ

Дифференциальное центрифугирование в градиенте сахарозы

/

41/

Получение фракции клеточ^шх мембран Тритон XI ОО/мочевинная экст^ак£щя клеточных мембран

Хроматография в градиенте на колонке РВЕ-94

Хроматография в градиенте КЭСК на колонке Мопо-О

Белок АСВР получали из тритон ХЮО/мочевинных экстрактов отмытой ядерной фракции клеток мозга (схема 1).

Белок МР65 получали из тритон ХЮО/мочевинных экстрактов отмытой фражции клеточных мембран (схема 2).

Полуколичественную оценку уровней сывороточной иммунореахтив-ности и количественное определение сывороточного содержания антител класса IgG к выделенным белкам проводили с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Постановка иммуноферментного.анализа проводилась с помощью стандартных процедур на 96-луночных ИФА-планшетах с фотометрической оценкой. Полученные значения оптической плотности перерасчитывали в относительные единицы отреажции внутреннего контроля с каждым из антигенов.

С целью выявления эмбриотропного эффекта анител к белку S 100 проводились экспериментальные работы на лабораторных животных.

Самки крыс были подразделены на 3 группы. Первая группа - это самки получавшие инъекции белка S100 (иммунизация) двукратно до беременности и затем третья реиммунизация им проводилась в различные сроки беременности. Вторая группа была представлена самками крыс, получавших инъекции белка S100 только во время беременности. Животные группы контроля не иммунизировались белком S100. У активно иммунизированных самок крыс и их детенышей определяли среднюю сывороточную анти-SlOO иммунореактивность. Она оценивалась как отношение оптической плотности реакции с белком S100 у детенышей от иммунизированых самок к оптической плотности детенышей от самок контрольной группы.

В ходе выполнения научно-клинической работы были проанализированы исходы 1786 беременностей у женщин Московского региона в возрасте от 17 до 44 лет, обследовавшихся с помощью метода ELI-P:Test., Большая часть женщин при первичном обследовании имела сроки,беременности от 3 до 15 недель (п = 1644); 142 образца были получены от,женщин, беременность которых наступила 1 -2 месяца спустя после обследования. Исходы беременности оценивались акушерами-гинеколагами и неонатола-

гами следующим образом, к хорошим исходам беременности относили рождение клинически здорового новорожденного, к удовлетворительным -рождение новорожденных с признаками гипотрофии, нарушениями мьг шечного тонуса, нарушениями возбудимости, врожденными подвывихами бедра, пупочной грыжей и т.п., но без значительных аномалий развития. К неудовлетворительным исходам относили остановки развития беременности, самопроизвольные выкидыши, мертворождения или рождение живых детей с врожденными пороками развития, а также выраженные соматические или психоневрологические нарушения, ведущие к полной или частичной инвалидности (табл.1).

Таблица 1. Исходы беременностей у женщин, обследованных по методу Е1Л-Р-ТеБ1

Хорошие Удовлетворительные Неудовлетворительные

- клинически - гипотонус мышц - гибель эмбриона, плода

здоровые - гипертонус мышц или новорожденного

новорожденные - гипотрофия - множественные пороки

- гипертрофия развития

- повышенная или - нарушения развития

пониженная скелета

нервномышечная - висцеральные дефекты

возбудимость - развития

- подвывих - нарушения развития

тазобедренного цнс

сустава - генетические дефекты и

- пупочная грыжа хромосомные аберрации

- паховая грыжа

-крипторхизм

С целью изучения популяционных особенностей показателей содержания эмбриотропных антител у женщин, проживающих в экологически благоприятных и неблагоприятных регионах проведен анализ показателей ELI-P-Тест у женщин, проживающих в различных по степени загрязненности регионах. В умеренно загрязненной зоне Московского региона были обследованы 3780 женщин детородного возраста. В загрязненных зонах, а именно в г. Новокуйбышевск, Самарской области были обследованы 326 женщин, в г. Казань были обследованы 203 женщины. Пробы 512 сывороток женщин были получены из г.Абердин (Великобритания), относимого к чистой зоне. :

Получаемые результаты оценивались с помощью специализированных компьютерных программ ELITEST и VISUAL, основанныхна методах непараметрического статистического анализа (метод Уилклксона-Манна-Уитни, метод Фишера). Часть материалов анализировалась с использованием кластерного анализа и анализа частотновзвешенного распределения (прикладные пакеты программ EXCEL и SIGMAPLOT).

Результаты исследования и их обсуждение.

По данным электрофореза в градиентном (8-20 %) полиакриламидном геле в нативных и денатурирующих условиях (с додецилсульфатом натрия) и последующей окраской кумасси К.-250 хроматографически очищенные белки, использованные в качестве антигенных компонентов тест-системы ЕЕ1-Р-Тест, характеризовались следующим образом. Белок ОБМ давал одну дискретную интенсивно окрашиваемую зону, характеризующуюся молекулярной массой 18 кД, белок БЮО давал одну зону с молекулярной массой 20 кД в нативных условиях и одну зону с мол. массой 10 кД при электрофорезе с додецилсульфатом натрия, белок АСВР14/18 был представлен тремя субъединицами с молекулярной массой 14, 16 и 18 кД (при электрофорезе с додецилсульфатом натрия), белок МР65 давал при электрофорезе одну зону с молекулярной массой 65 кД.

В ходе модельных экспериментов на лабораторных животных было обнаружено, что у детенышей от самок крыс иммунизированных с 3-го по10-й дни беременности наблюдлась повышенная анти-БЮО-иммунореактивность (в сравнении сданными контрольных детенышей). Самки крыс, иммунизированные на 7-й день беременности, потомства не имели. Можно предположить, что у них происходила остановка развития беременности и рассасывание эмбрионов. В группе самок, предварительно (до беременности) иммунизированных и реиммунизированных во время беременности, наблюдались случаи мертворождений и рождения детенышей с

нарушением развития ЦНС, проявлявшимся в парезах задних конечностей. Детеныши от самок иммунизировавшихся о 10-го дня беременности по уровню иммунореактивности не отличались от детенышей контрольной группы (табл.2).

..; Полученные данные указывают на то, что антителак белку БЮО регулируют развитие эмбриона, в том числе участвуют в развитии нервной трубки. Регулирующее влияние материнских антител на развитие эмбриона ограничено во времени, что свидетельствует о наличии критических периодов беременности, когда их воздействие бывает фатальным для эмбриона.

Таблица 2. Иммунореактивность детенышей от самок, иммунизировавшихся в различные сроки беременности (оценивалась как отношение оптической плотности реакции с белком 5100 у детенышей отиммунизированых самок к оптической плотности детенышей контрольной группы).

Сроки беремен- за 3 1-й 3-й 5-й 7-й 10-й 13-й 18-й

ности в которые дня до день день день день день день день

проводилась им- бреме берем беремен берем берем берем берем береме-

мунизация самок нност еннос ности енност енност енност енност нности

белком 3100 и ти и и и и

Иммунореактивнос ть детенышей от 1.09 . 0.9 1.24 1.1 1.1 09 1.1

неиммунных самок

Йммунореактивнос ть детенышей от 1.8 0.9 09 3.1 _ 2.2 2.0 2 25

иммунных самок

Уровни естественных эмбриотропных антител в сыворотке крови здоровых женшин фертильного возраста В работе определен уровень нормального содержания регуляторных антител у здоровых женщин, не имевших признаков соматических, эндокринных, иммунных и психо-неврологических нарушений, не менее 2-х месяцев не страдавших инфекционными и воспалительными заболеваниями и позже родивших практически здоровых новорожденных. Было установлено, что уровень таких антител имеет достаточно узкие пределы (от -15 % до +40% от уровня внутреннего контроля)!

Была проведена также количественная огдажа содержания регулятор-ных антител, в ходе которой было установлено, что их содержание в сыворотке крови у здоровых женщин находится в пределах 120-250 нг/мл (табл.3)

Таблица 3. Средний (физиологический) уровень содержания эмбриотропных антител в сыворотке крови здоровых женщин фертильнопо возраста, отнесенных к группе нормы

Сывороточная концентрация антител (в нг/мл)

Содержание ауто-АТ к ОБМ 120-180

Содержание ауто-АТ к Б-100 130-200

Содержание ауто-АТ к АСВР14/18 150-250

Содержание ауто-АТ к МР-65 120-190

При ретроспективном анализе 476 исходов беременности у женщин, отнесенных к группе нормы (К-1), обследованных в первом триместре беременности, а также 46 женщин, обследованных за 1-2 месяца до наступления беременности и отнесенных к группе К-1, не было выявлено ни одного случая рождения детей с пороками развития (табл.4).

Таблица 4 Исходы беременности у женщин, отнесенных к группе нормы (К-1)

Число анализировавших ся случаев Бесплодие неясного генеза Остановка внут^риутро бного развития Самопроизвольные выкидыши Антенатальная гибель Пороки развития Небольшие отклонения Клинич. здоровые новорожденные

522 не наблюдалось 0 4 % 0.8% не наблюдалось не наблюдалось 6.4% 92.4%

Сывороточное содержание антител к антигенам тест-системы ЕЫ-Р-

ТеБ); при патологическом исходе беременности По уровню содержания регуляторных антител женщины были разде--лены на шесть классификационных групп (табл.5).

Таблица 5. Ранжирование обследованных женщин по величине сывороточной иммуно-реактивности________

Классификационная Границы

группа иммунореакгивносги

к! -15% . +40%

к2 -25% .. -15%

+40% . +65%

кЗ -45%...-25%

+ 65%:. +100%

к4 -65% ...-45%

+ 100%... +150%

к5 -75%... -65%

+ 150% .. +200%

Кб < -75%

> +200%

Данные об исходах, беременности у 1786 женщин, обследовавшихся методом ЕЫ-Р-Теэ! в первом триместре их беременности и отнесенных к группам с измененной иммунореактивностью, представлены в табл.6.

Таблица 6. Исходы беременности женщин, отнесенных к группам с измененной иммунореактивностью К-2 ... К-6 за 1-2 месяца до наступления беременности, либо в первом триместре беременности. ______

Число анализировавшихся случаев Бесплодие неясного генеза Остановка внутри утробног о развития Самопроизвольные выкидыши Антенатальная гибель Пороки развития Небольшие отклонения Юшняч. здоровые новорожденные

Группа К-2 (слабые отклонения) п = 634 1.6% 2.3% 2 8% 2.1% 9.0% 16 4% 65.5%

Группа К-3 (умеренные отклонения) п = 359 2.3% 4.5% 9.1% 3.2% 15 9% 20 5% 44.5%

Группа К-4 (выраженные отклонения) п — 197 6.8% 6.0% 12 8% 3 4% 24.8% 20.8% 25.4%

Группа К-5 (резкие отклонения) п = 49 0.0% не наблюдалось 10 0% 6.7% 51.3% 21.3% 10.7%

Группа К-6 (эксквизит-ные откл-я) п = 26 0.0% 15.4% не наблюдалось 3 9% 61.5% 19.2% не наблюдалось

N

Было обнаружено, что частота неблагоприятных исходов, т.е. случаев внутриутробной и антенатальной гибели и рождений детей с резкими нарушениями физического и/или неврологического статуса, имела ярко выраженную тенденцию к возрастанию с увеличением уровня отклонений анализируемых параметров от экспериментально установленных границ нормальной иммунореактивности.

У женщин, отнесенных к группам с измененной иммунореактив-ностью эмбриотропных антител (группы К-2...К-6), отмечалась, в частности, повышенная частота случаев рождения детей с такими аномалиями развития, как множественные пороки развития, микроцефалия, краниосте-ноз, детский церебральный паралич, болезнь Дауна, врожденные пороки сердца, атрезия мочеточников, гидронефроз, поликистоз почек, муковисце-дозидр.

При этом частота рождения детей, имеющих разного рода грубые нарушения развития, возрастала пропорционально степени отклонений иммунореактивности у их матерей от нормальных значений. Так, если у матерей, отнесенных к группе слабых отклонений (К-2), частота рождений детей с аномалиями составляла с 4%, то у матерей, отнесенных к группе выраженных отклонений (К-4) она возрастала до 28%, а у матерей, отнесенных в начале беременности к группам резко выраженных отклонений (К-5 и К-6) - до 58% и 65% соответственно. Аналогичная зависимость была характерна и для случаев остановки внутриутробного развития и самопроизвольных выкидышей (с 3% у матерей группы К-2 до 10-15% у матерей, отнесенных к группам К-5 и К-6).

Во всех группах наблюдалась примерно одинаковая частота случаев рождения детей, имевших по заключению неонатологов небольшие отклонения от клинической нормы (случаи гипо- и гипертрофии, повышенной или пониженной нервномышечной возбудимости, диатезы, нарушения моторики желудочно-кишечного тракта, пупочные грыжи, косолапость, дис-плазия тазобедренных суставов, непроходимость слезных каналов, крип-тор хизм).

Частота рождения практически здоровых, новорожденных у женщин, имевших разной выраженности отклонения в иммунореактивности эмбриотропных'антител была обратно пропорциональна степени отклонений. Так, процент клинически здоровых детей был максимален у матерей; отнесенных к группе К-2 (66% новорожденных) и снижался до 10% у матерей группы К-5. У матерей, отнесенных в начале беременности к группе К-6," случаев рождения здоровых детей мы не наблюдали.

Влияние региональной экологической обстановки (факторов среды) на содержание эмбриотропных антител у женщин детородного возраста Иммунная система организма относится к системам, которые рано реагируют на любые потенциально вредящие воздействия окружающей среды. В экологичзски неблагоприятных регионах отмечается повышенная частота рождений детей с разного рода врожденными аномалиями развития. Можно предположить, что в значительной мере это положение обусловлено вызываемыми средой нарушениями со стороны механизмов иммунорегуляции развития беременности у их матерей.

При обследовании женщин, проживающих в различных по степени загрязненности регионах с помощью метода ЕЫ-Р-Тевг получены следующие данные, представленные в табл.7.

Табяица 7. Сравнительная частота отклонений иммунореактивности в популяциях женщин фертильного возраста (данные ЕИ-Р-Т«!), проживающих в зонах с разным уровнем загрязненности_____

АБЕРДИН ("чистая зона") МОСКВА ("умеренно загрязненная зона") КАЗАНЬ ("загрязненная зона") НОВОКУЙ-БЫШЕВСК ("загрязненна зона")

В %% ОТ ОБЩЕГО. г-Г ¡л II 3 (п = 3780) (п = 203) (п = 326)

Группа нормы (К-1) 48 0°/о 37.9% 27.6 % 26.6%

Слабые отклонения (К-2) 45 9% 38.4% 35.5% 33.2%

Умеренные отклонения (К-3) 5.7% 13 2% 24.6% 26 0%

Выраженные отклонения (К-4) 0.4% 9 1% 8.4% 12.1%

Резкие отклонения (К-5/К-6) Не отмечены 1.3% 3.9% 2 1% ■

Из представленных данных видно, что с ухудшением экологических условий возрастает общепопуляционная частота встречаемое™ женщин фертильного возраста, имеющих разной степени отслонения в содержании эмбриотропных антител, отражающие изменения со стороны механизмов иммунорегуляции беременности. Полученные результаты вызывают определенное беспокойство в виду повышения прогнозируемой частоты случаев внутриутробной гибели эмбриона/плода, мертворождений и рождения детей с пороками развития в экологически неблагоприятных регионах России.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены и выделены основные видонеспецифичные белковые антигены (а именно, белки ОБМ, S100, АСВР 14/18 и МР65), изменения содержания естественных антител к которым, наиболее часто сопровождают неблагоприятные исходы беременности.

2. Разработаны и стандартизованы способы хроматографического получения высокоочищенных белков ОБМ, S100, АСВР 14/18 и МР65 из ткани мозга крупного рогатого скота (основных компонентов тест-системы ELI-P-Test).

3. В модельных экспериментах на беременных самках крыс, активно или пассивно иммунизированных белком S100 установлено, что в зависимости от сроков иммунизации наблюдается внутриутробная гибель эмбрионов, мертворожденна, яибо рождение более крупных и жизнестойких детенышей, имеющих стойкое и специфическое повышение сывороточной иммунореажтивности к белку S100.

4. Установлено, что нормальная сывороточная концентрация определяемых с помощью тест-системы ELI-P-Test антител, циркулирующих в кровотоке матери, находится в пределах 120-250 нМ, а отклонение их содержания за пределы как вершей, так и нижней границы нормы, чревато нарушениями развития или гибелью эмбриона.

5. При анализе исходов беременности у 1786 женщин, обследованных с помощью метода ELI-P-Test в первом триместре беременности, устано-

влено, что вероятность рождения здорового новорожденного лр^мо зависит от поддержания сывороточных уровней антител к белкам OEM, S J 00, АСВР 14/18 и МР65 в узких физиологических пределах, тогда как частоты внутриутробной гибели эмбриона и плода, случаев мертворождений и рождений новорожденных с пороками развития прямо коррелирует с выраженностью (уровнем) отклонений в содержании антител от физиологической нормы.

6. Показано, что чем хуже общая экологическая ситуация региона и чем более загрязненной оказывается Среда обитания женщин детородного возраста, тем чаще среди них встречаются лица с аномальным содержанием антител к белкам ОБМ, S100, АСВР 14/18 и МР65.

7. Разработан и стандартизован метод оценки содержания антител к белкам ОБМ, S100, АСВР 14/18 и МР65, получивший наименование ELI-P-test (от ELISA-detected Probability of Pathology m Pregnancy), который успешно прошел экспериментально-клинические испытания по заданию Минздрава РФ, и был рекомендован для практического использования.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты, полученные в ходе выполнения данной работы, позволяют рекомендовать метод ELl-P-Test дата использования в качестве скрин-нингового метода обследования женщин на ранних сроках беременности, либо до планирования беременности, с целью индивидуального прогноза развития эмбриона и плода, исходя из следующих эмпирически установленных градаций:

• Если женщина по содержанию регуляторных антител принадлежит к группе К-1, следует ожидать благоприятный исход беременности.

• Если женщина по содержанию регуляторных антител принадлежит к группе К-2, то она относится к группе слабого риска по прогнозу развития беременности.

• Если женщина по содержанию регуляторных антител принадлежит к группе К-3, то она относится к группе умеренного риска по прогнозу развития беременности. » Если женщина по содержанию регуляторных антител принадлежит к группам К-4, К-5 или К-б, то она относится к группе высокого риска возможного неблагоприятного исхода беременности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 12 работ, в которых полностью отражено основное содержание работы:

1. Полетаев А.Б., Вабищевич Н.К., Морозов С.Г. Способ скриннинго-вого обследования женщин детородного возраста с помощью тест-системы ELI-P для прогноза развития эмбриона и плода и рождения здорового либо аномального ребенка. Российский патент № 2107913 от 27 марта 1998.

2. Вабищевич Н.К., Полетаев А.Б., Гнеденко Б.Б., БудыкинаТ.С., Петрухин В.А., Котов Ю.Б., Федорова М.В., Демин В.Ф. О возможных нарушениях развития нервной системы ребенка при диабетической фетопа-тии. //Вестник Росс. Ассоц. Акуш-Гинекол., 1998, № 3, с.31-35.

3. Полетаев А.Б., Вабищевич Н.К., Калмыков М.А., Морозова И.В., Леонова И.П., Яголович Е.В., Замалеева P.C., Зверева O.A., Харрис В.Дж. Региональные особенности естественного иммунитета у женщин фертиль-ного возраста: связь с уровнем риска возникновения аномалий развития эмбриона и плода. // Вестник Росс. Ассоц. Акуш. Гинекоя., 1998, №1, с.29-31.

4. Вабищевич Н.К., Полетаев А.Б., БудыкинаТ.С., Замалеева P.C. К вопросу о переносе особенностей иммунного статуса матери ее потомству (иммунологический импринтинг). //Медицинская консультация, 1998, т. 18, №2, с.14-16.

5. Вабишевич Н.К., Полетаев А.Б., Дёмин В.Ф., Ключников С.О., БудыкинаТ.С., Замалеева P.C., Генералова Г.А., Ключникова М.А. Содержание регуляторных аутоантител у детей в норме и патологии. Основы кон-

цепции экопатологии детского возраста. В сб. Материалов IV Всерос. Конгресса «Экология и здоровье детей», СПб, 1998, с. 25-27.

6. Полетаев А.Б., Вабищевич Н.К. Состояние системы естественного иммунитета у женщин фертильного возраста и риск нарушений развития эмбриона и плода.//Вестник Росс. Ассоц. Акуш. Гинекол., 1997, №4, с:21-24.

7. Полетаев А.Б., Вабищевич Н.К., Зверева О. А. Оценка уровня риска аномального развития эмбриона и плода с помощью метода ELI-P. /В кн.: Экопатология детского возраста (под ред.: Пивоварова Ю.П., Демина В.Ф., Ключникова С.О.), М., ГИПП "Измайлово", 1995, с.294-300.

8. Poletaev А.В., Vabyschevich N.K. Natural autoantibodies content in maternal serum and embryo/fetus developmental anomalies (in early pregnancy prognosis in humans). 6th Int. Conf. "Human Antibodies & Hybridomas" 15-17 Apryl, 1998, Washington, p. 20. ' •

9. Poletaev А.В., Vabischevich N.K., Gnedenko B.B. Natural autoantibodies m maternal serum and embryo/foetus developmental anomalies (a new approach for in early pregnancy prognosys in humans). 13th Congr. Europ. Assoc. Gynaecol. &Obstetr., Jerusalem, May 10-14, 1998; Book of Abstracts, p. 81.

10. Poletaev A.B., Gnedenko B.B., Kudryashova O.V., Vabyschevich N.K. Antibodies to S100 brain protein influence upon reproductive functions in mammals. //Soc. Neurosci. Abstr., 1997, v.23,pt.l,p.997.

11. Vabishevich N.K., Poletaev А.В., Morozov S.G., Gnedenko B.B., Zavalishm I.A., Demidenko T.I. Regulatory autoantibodies during neuropsyhyatnc disorders. //Soc. Neurosci. Abstr., 1996, v.22, pt.3, p. 1794.

12. Vabishevich N.K., Poletaev A.B. To the mechanisms of prenatal epygenetic transfer of maternal "anti-brain" autoimmunity. //Soc. Neurosci. Abstr., 1994, v.20, pt.2, p. 948.

"Принт" Зак 117 Тираж 120