Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование эффектов действия антител к кальций-связывающему белку S100 на изменения поведения у виноградной улитки и нематоды C.elegans

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование эффектов действия антител к кальций-связывающему белку S100 на изменения поведения у виноградной улитки и нематоды C.elegans"

На правах рукописи

•Тимошенко Алия Халиловна

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТОВ ДЕЙСТВИЯ АНТИТЕЛ К КАЛЬЦИЙ-СВЯЗЫВАЮЩЕМУ БЕЛКУ в 100 НА ИЗМЕНЕНИЯ ПОВЕДЕНИЯ У ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ И НЕМАТОДЫ С.е^аю

03 00.13 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2007

003160790

Работа выполнена в лаборатории биофизики Казанского физико-технического института им Е К Завойского Казанского Научного Центра Российской Академии Наук и в отделе экспериментальной экологии Института экологии природных систем Академии Наук Республики Татарстан

Научный руководитель - кандидат биологических наук

Калинникова Татьяна Борисовна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Защита состоится « 30 »ОкТ&$ря 2007 г в «№ » часов

на заседании диссертационного Совета Д.212078 02 по присуждению ученой -степени доктора биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология при ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» по адресу 420021, г Казань, ул Татарстан, д. 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» по адресу 420021, г Казань, ул. Татарстан, д 2 Автореферат разослан «2& » ыНТ*£р4 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

Волков Евгений Михайлович,

ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет»,

доктор биологических наук Захаров Игорь Сергеевич,

Институт биологии и развития РАН,

Институт ^ высшей нервной деятельности и

нейрофизиологии РАН

Ведущая организация - Московский государственный университет

им М В Ломоносова

профессор

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования Известно, что в долговременных формах пластичности важную роль играют ионы кальция (Hawkins R D et al, 1993, Schaffhausen J H et al, 2001, Balaban P M et al, 2004) Ионы Са2+ участвуют в регуляции разнообразных нейрональных процессов, что обусловлено их специфическими физико-химическими характеристиками, благодаря которым они являются наиболее универсальными внутриклеточными посредниками (Костюк П Г и др , 1998, Бухараева Э А и др , 2001, Зефиров А Л , Ситдикова Г Ф , 2002, Rizzuto R et al, 2002, Rusakov D A, 2006) Ионы Ca2+, осуществляя связь между электрическими явлениями, происходящими в поверхностной мембране клетки, и реакциями, протекающими внутри нее, принимают непосредственное участие в интегративной деятельности нервной клетки (Berridge М J, 1998, Verkhratsky А , 2005) Исключительно высокая способность внутриклеточной среды связывать Са2+ определяется наличием в ней эффективных буферных систем Они состоят главным образом из Са2+-связывающих белков (Костюк П Г, 1986, Brim М, Carafoh Е , 2000) Все Са2+ -связывающие белки классифицируют на три группы EF-hand белки, Са2+/фософолипид-связывающие белки и Са2+-запасающие белки (Brauneweü К -Н , Gundelfmger Е D , 1999, Северин ЕС и др , 2001) Интенсивно исследуются в последнее время функции такого Са2+-связывающего белка, как белок S100 (Heizmann С W et al, 2002, Donato R, 2003)

S100 - это группа белков, характеризуемых наличием Са2+- связывающих доменов и наличием таких фундаментальных свойств как ткане- (мозго-) специфичность, эволюционная стабильность- и способность связывать Са3', взаимодействуя с ними (Baudier J , et al, 1986, Kubista H et al, 1999, Santamana-fCisiel L et al, 2006) Эволюционная стабильность этого белка была отмечена еще в первых исследованиях его распределения в тканях разных животных S100 обнаруживаются у всех позвоночных (Moore В W, 1973) и у многих беспозвоночных (Donato R , 1999), например, у виноградной улитки (Jankovic В D , 1985, Штарк МБ, 1985, Kubista Н et al, 1996) Функции белков S100 можно разделить на внутриклеточные и внеклеточные (Donato ,R, 1999, 2003) Внутриклеточные функции белков S100 разделяются по следующим разделам регуляция фосфорилирования белков, регуляция ферментативной активности, регуляция Са2+-гомеостаза, регуляция динамики цитоскелета и его компонентов Внеклеточные функции белков S100 разделяются по следующим разделам нейротропные эффекты дисульфидно-связанного димера белка S100, участие этого белка в дегенеративных заболеваниях, участие в формировании когнитивного поведения и ряд других функций Белок S100B является успешным маркером

Л

мозговых нарушений (Anderson RE et al, 2001, PelmkaL E et al, 2004, Delgado P et al, 2006)

Оксид азота (Ii) (NO) является внутри- и межклеточным посредником, выполняющим различные сигнальные функции (Schuman E M , Madison D V , 1994, Ванин А Ф , 1998, Реутов В П и др , 1998, Уразаев А X , Зефиров А Л , 1999) В последние годы NO-синтезирующие нейроны обнаружены и в нервной системе беспозвоночных, в том числе моллюсков (Huang Е Р , 1997, Gelperm A et al, 2000) Показано, что серотонин и доноры NO взаимно усиливают эффекты друг друга (Дьяконова TJI, 2000) Найдены доказательства, что белок S100В производит нейротоксический эффект m vitro, вызывая апогггоз как в нейрональных, так и глиальных клетках за счет активации NO-синтазной активности (Hu J et al, 1996) Имеющиеся результаты предполагают, что пока белок S100B удерживается внутри клетки на физиологическом уровне экспрессии он оказывает протекторный эффект, в то время как повышение или понижение его концентрации будут нарушать нормальное протекание процессов в клетке (Scotto С et al, 1998)

Молекулярные механизмы сохранения следов памяти широко исследуются в контексте взаимоотношений ассоциативного обучения с сенситизацией как элементарной формой обучения, при которой животное учится усилению ответной реакции на ранее неэффективный стимул, следующей за нанесением сильных стимулов в другом участке (Балабан П M , Захаров И С , 1992, Гайкутдинов X Л и др., 2002) В настоящее время большое внимание привлекает такая нейробиологическая модель долговременных модификаций поведения как долговременная сенситизация (ДС) (Cleary L J et al, 1998, Philips G T et al, 2006) Она позволяет успешно исследовать мембранные механизмы формирования устойчивых очагов возбуждения в нервной системе животного (Castellucci V F et al, 1986, Гайнутдинов X Л , Береговой H А , 1994, Никитин В П , Козырев С А , 1995, Antzoulatos E G, Byrne J H, 2007) ДС, являясь видонеспецифическим феноменом, т е присущим животным разного уровня организации (Кэндел Э, 1980, Antzoulatos EG et al, 2006), позволяет проводить исследование реакций высших животных на относительно простых объектах или моделях, удобных для анализа

Таким образом, анализ литературы показывает, что роль Саг+-связывающего белка S100В, кальциевой системы, а также NO в проявлении долговременных эффектов сенситизации на уровне поведения животного и характеристик нейрональной мембраны выяснены недостаточно и их исследования являются актуальными

Цель и основные задачи исследования. Целью работы явилось исследование эффектов действия антител к Са2+-связыеающему белку Я100В на формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки и на нарушения локомоции тепловым стрессом и сенсорной изоляцией у нематоды С е^аж В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи

1 провести анализ эффектов действия антител к Са2+-связывающему белку Б100В на формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки,

2 исследовать мембранные механизмы и роль оксида азота в развитии эффектов действия антител к Са2+-связывающему белку Б100В на формирование долговременной сенситизации,

3 провести анализ эффектов действия антител к Са2+-связывающему белку Б100В на нарушения локомоции у нематоды С elegans тепловым стрессом,

4 исследовать эффекты действия антител к Са2+-связывающему белку Б100В на нарушения локомоции у нематоды С elegans сенсорной изоляцией

Положения, выносимые на защиту

1 Введение антител к Са2 '-связывающему белку Э100 в разведении 1(Г2 перед началом формирования долговременной сенситизации оказывает протекторный эффект на оборонительное поведение виноградной улитки Найдено, что данный протекторный эффект сопровождается частичным восстановлением мембранного и порогового потенциалов командных нейронов и уровня синтеза оксида азота в нервной системе и сердце виноградной улитки

2 Преинкубация нематоды С е1е%ат в среде, содержащей антитела к Са2+-связывающему белку Б100 в разведении 10"12, повышает как базовую термостабильность локомоции С е1щат, так и эффективность быстрой адаптации червей к переносимому организмом повышению температуры среды (вызывает увеличение среднего времени появления ошибок моторной программы плавания, индуцированного повышением температуры)

Научная новизна Впервые обнаружено, что введение антител к Са2+-связывающему белку Б100 в разведении 10"12 препятствует формированию ДС оборонительных реакций у виноградной улитки без влияния на двигательную активность животного Впервые найдено, что при предварительном введении антител к Са^-связывающему белку Б100 при нанесении электрошоков улитке мембранный и пороговый потенциалы командных нейронов имеют более высокое значение, чем после ДС Экспериментально методом ЭПР спектроскопии показано, что после формирования ДС в нервной системе и сердце виноградной улитки происходит снижение продукции N0 Впервые найдено, что протекторный эффект

б

антител к Са2+-связывающему белку S100 у виноградной улитки сопровождается частичным восстановлением уровня синтеза N0 в нервной системе и сердце

Впервые показано, что преинкубация С elegans при 20°С в среде, содержащей антитела к Са2+-связывающему белку S100 в разведении 10"12, вызывает увеличение среднего времени появления ошибок моторной программы плавания, индуцированного повышением температуры до 36°С Впервые показано, что ингибитор синтеза белков циклогексимид не оказывает влияния на эффективность адаптации С elegans к высокой температуре, т е экспрессия генов стрессовых белков не может быть причиной повышения термостабильности локомоции С elegans двухчасовой экспозицией к температуре +30°С Впервые показано, что AS 100 в разведении 10"12 замедляют развитие нарушений спонтанной локомоции сенсорной изоляцией, причем максимальный протекторный эффект AS 100 наблюдается в первые 30 минут изоляции

Научно-практическая ценность Полученные результаты позволяют составить более полное представление о роли Са2+-связывающих белков в механизмах пластичности и в изменениях поведения Протекторный эффект антител к Са2+-связывающему белку S100 в разведении 10"12 при применении перед началом формирования нейробиологической модели тревожности и депрессивного состояния позволяет определить пути поиска фармакологических веществ, способных влиять на нарушения поведения Полученные результаты, видимо, свидетельствуют, что дисбаланс Са2+-связывающего белка S100 может привести к торможению или изменению хода определенных процессов, развивающихся при формировании пластических перестроек в организме и, особенно при патологических процессах Полученные результаты позволяют составить более полное представление о роли NO в механизмах ДС Полученные результаты могут помочь в выборе стратегии применения фармакологических веществ при нарушениях поведения и деятельности нервной системы Полученные результаты используются при чтении курсов лекций в КГУ и ТГГПУ.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Kaliningrad, 2003 г), Международной научной конференции «Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных» (Саранск, 2005 г), 9-ой и 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2005, 2006 гг), 9-ой Всероссийской конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006 г), Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Kazan, 2006 г), VIII Всероссийском

симпозиуме "Растущий организм" (Казань, 2006 г), Международном симпозиуме "Активные формы кислорода, азота и хлора в регуляции клеточных функций в норме и при патологии" (Гродно, 2006 г), Самойловских чтениях (Казань, 2007 г), XX съезде физиологического общества имени И П Павлова (Москва, 2007 г), International Conference "Modern Developments in Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy in Medicine" (Kazan, 2007 г )

Реализация результатов исследования Материалы исследования отражены в 4 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, и в 16 тезисах докладов

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа объемом 142 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, главы результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы Список цитируемой литературы включает 275 источника, из них 173 - иностранных авторов Диссертация иллюстрирована 30 рисунками

Список используемых сокращений. ДС - долговременная сенситизация, ЭПР - электронный парамагнитный резонанс, ФР - физиологический раствор, ПД - потенциал действия, Vm - потенциал покоя, Vt - порог генерации потенциалов действия, СВН - среда выращивания нематод, ТС — тактильный стимул ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты проводились на наземном легочном моллюске Helix lucorum (виноградная улитка), крымской популяции и на свободноживущей почвенной нематоде Caenorhabdiíts elegans дикой линии N2 Helix lucorum перед началом экспериментов не менее 2-х недель находились в активном состоянии в комфортных условиях Культуру С elegans выращивали при температуре +18°С в чашках Петри со стандартной средой выращивания нематод (СВН) (Brenner S, 1974), на которую высевали Е coli ОР50

Для тестирования поведения Helix lucorum были выбраны оборонительное поведение, как одно из наиболее удобных и хорошо изученных форм поведения у виноградных улиток (Захаров И С , 1992, 2001), а также локомоция - способность животного целенаправленно, самостоятельно передвигаться в пространстве с помощью эффективных механизмов, предназначенных для этих целей (Павлова ГА, 1994, Цыганов В В и др, 2004) Тесты проводились на протяжении всего эксперимента до ежедневной серии электрических стимулов Все реакции животных во время тестирования регистрировались на видеокамеру

Регистрировали 1) время закрытия пневмостома после нанесения тактильного стимула (ТС) в область мантийного валика Реакция закрытия пневмостома была выбрана постольку, поскольку она является начальной компонентой оборонительных реакций и позволяет проводить объективную регистрацию (Максимова О А, Балабан П М, 1983) Тестовое раздражение наносилось вручную тонким волоском, диагональным движением поперек дыхательного отверстия (Максимова О А, Балабан ПМ, 1983, Balaban РМ, Bravarenko NI, 1993) 2) Изменение амплитуды втягивания омматофоров в ответ на ТС и визуально оценивали сокращение омматофоров в процентах (100%-максимальная длина) (Gamutdmova Т Н et al, 2005) 3) Среднюю скорость (см/мин) передвижения улитки при движении по прямому отрезку в течение минуты (Павлова Г А , 1994)

ДС оборонительного рефлекса вырабатывали по ранее отработанной схеме (Гайнутдинов X J1, Береговой Н А , 1994) Животные получали электрический стимул в область головы 4 раза в день в течение 4-х дней с интервалом в 1,5-2 часа Длительность каждого стимула составляла 1/2 с Ток имел следующие характеристики прямоугольные импульсы тока амплитудой 6-8 мА, длительностью 10 мс, частотой 50 Гц (Греченко ТН, 1977) В работе использовался раствор антител к Са2+-связывающему белку SIGO (AS100) в разведении 10"12 (что соответствует 6x10'" мг/мл), предоставленную дмн О И Эпштейном (НПФ "Материа Медика", г Москва). AS 100 вводили шприцем во внутреннюю полость животного (в объеме жидкости 0,1 мл) в область синусного узла один раз в сутки Контролем для всех групп служила группа интактных моллюсков и группа активного контроля, которая получала инъекции ФР (NaCl-80 mM, КС1-4 шМ, СаСЬ-10 mM, MgCl2-5 шМ, NaHC03-5 mM, рН- 7,6-7,8), в том же объеме и в те же временные сроки, как и в опытных сериях

Электрофизиологические измерения проводились при комнатной температуре с применением внутриклеточных стеклянных микроэлектродов, имевших сопротивление 5-50 МОм и заполненных раствором 2,5М КС1 Работа велась на нейронах дуги оборонительного рефлекса - командных нейронах оборонительного поведения ЛПа2, 3, ППа2, 3 Эти измерения проводили на препаратах изолированной нервной системы животных Перед препаровкой улитки в целях анестезии помещались в смесь воды со льдом на 15-30 минут Регистрировались потенциал покоя (Vm) и порог генерации потенциалов действия (Vt) В работе приведены средние значения измеряемых величин и стандартные ошибки среднего (принятое международное обозначение М ± SEM) Результаты

были статистически обработаны с применением t- критерия Стьюдента и Ii-критерия Манна-Уитни с помощью программы «SigmaStat»

Для определения изменения количества N0 при формировании ДС, мы применили методику введения спиновой ловушки, предложенную коллективом под руководством профессора А Ф Ванина (Микоян В Д и др, 1994) Трем группам улиток (интактным, улиткам с выработанной ДС и улиткам с выработанной ДС + ASI00) для формирования мононитрозильного комплекса железа вводили диэтилдитиокарбомат (ДЭТК) натрия в дозе 500 мг/кг (Na-ДЭТК, хч), цитрат натрия 187,5 мг/кг и сульфат железа 37,5 мг/кг (FeS04 7 Н20, Sigma, USA) В результате реакций образуется стабильный радикал (/X3TK)2-Fe2+-NO, который может быть зарегистрирован методом ЭПР спектроскопии Регистрация спектров ЭПР проводились на образцах из тканей нервной системы и сердца Измерения ЭПР проводились в Х-диапазоне на спектрометре ЭПР ER-200 фирмы Брукер при температуре 77 К

Изучение влияния высокой температуры и сенсорной изоляции проводили на 3 дневных червях С elegans в термостатируемой водяной бане при поддержании постоянной температуры В экспериментах исследовалось влияние AS100 (1013-10~12), на термостабильность локомоции червей Эти эксперименты проводились в трех вариантах 1) Черви подвергались двух часовой экспозиции к AS 100 при температуре выращивания +19°С, переносились в свежую среду без AS 100, в которой при постоянной температуре +36СС измерялась теплоустойчивость локомоции индуцированной механическим стимулом, 2) Черви подвергались двух часовой экспозиции к AS 100 при температуре +30°С, которая является стрессовой, но переносимой организмом С elegans, 3) Экспозиция червей к AS 100 проводилась в условиях тепловой закалки организма червей, проходившей по схеме 1 час при +33°С, далее 1 час при +19°С Термотолерантность организма С elegans исследовали при действии постоянной температуры 36° или 37°С, и ее показателями являлись среднее время появления ошибок моторной программы плавания, индуцированного сильным механическим стимулом (встряхивание пробирки с червем) и среднее время тепловой смерти (полное и необратимое в течение 2 часов после снижения температуры до 20°С прекращение двигательной активности) Сенсорную изоляцию червей вызывали инкубацией их индивидуально при температурах 19°С, 22°С, 25°С в I мл СВН, из которой были исключены агар, пептон и холестерин В этих экспериментах регистрировали спонтанную локомоцию, критериями которой были сохранение, как спонтанной локомоторной активности, так и координации локомоторных мышц

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование эффектов влияния антител к Са2+- связывающему белку S100 на формирование ДС у виноградной улитки. Исключительно высокая способность внутриклеточной среды связывать ионы кальция определяется наличием в ней эффективных буферных систем, которые включают в себя также такой Са2+-связывающий белок, как белок S100 (Brim М , Carafoli Е , 2000, Donato R, 2003) При исследовании роли Са2+- связывающего белка S100 в деятельности нервной системы широко используются в качестве «инструмента» моноспецифические антитела к этому белку (AS100) (Shtark MB et al, 1987, Rebaudo R et al, 2000, Epstein OI et al, 2003) В последнее время появились работы, демонстрирующие, что AS 100 оказывают модулирующий эффект на электрическую активность нервной системы виноградной улитки (Андрианов В В и др, 2003), а также показано, что эти антитела могут модулировать действие блокатора Са2+-зависимых К+-каналов хинина (Эпштейн О И и др , 2006) Поэтому нами была поставлена задача исследования механизмов эффекта действия AS 100 на нейробиологической модели тревожности, реализуемой на виноградной улитке - долговременной сенситизации

На рисунке 1 показан типичный пример регистрации закрытия пневмостома улитки и последующего его открытия при нанесении ТС контрольной и сенситизированной улитки

Рис 1 Типичная регистрация закрытия пневмостома улитки при нанесении тестирующего

тактильного раздражения мантии и последующего его открытия у животных контрольной группы (контроль) и группы с выработанной сенситизацией ЩС) □ - пневмостом открыт, ■ -пневмостом закрыт Стрелками обозначены моменты тактильного раздражения

Предварительное введение

ФР улиткам перед серией

злектрошоков не меняла хода

формирования ДС, у них

наблюдалось увеличение времени

закрытого состояния пневмостома

(рис 2), увеличение реакции

отдергивания омматофор (рис 3) и

Контроль

Т-1-I-i-1-1-1-г

0 5 10 15 20 25 30 35 время, сек

дс

время, сек

снижение скорости локомоции (рис 4) В случае предварительного введения АвЮО формирования ДС не происходит нет увеличения оборонительной реакции пневмостома (рис 2), нет увеличения оборонительной реакции омматофоров (рис 3), но двигательные функции (тестируемые по скорости локомоции) не изменяются

—■— LAS 100 -ФР

3 4

время, дни

-LAS100 -ФР

(рис 4)

Рис 2 Изменение оборонительной реакции пневмостома (времени закрытого состояния) в ответ на тактильную тестовую стимуляцию (в сек) ФР - улитки, которым был введен физиологический раствор для улитки в объеме 0 1 мл, LAS 100 - улитки, которым были введены антитела к S100 в разведении 10 в объеме 0 1 мл

Рис 3 Изменение оборонительной реакции отдергивания омматофор (глазных щупалец) в ответ на тестовое касание (в % от максимального втягивания) ФР -улитки, которым был введен физиологический раствор для улитки в объеме 0 1 мл, ЬАвЮО -улитки, которым были введены антитела к Б100 в разведении 10"'2 в объеме 01мл

3 4 5

время, дни

-■-LAS100 Рис 4 Изменение скорости

~ _ локомоции (при вертикальном

движении по стенке террариума) (см/мин) ФР - улитки, которым был введен физиологический раствор для улитки в объеме 0 1 мл, LAS 100 - улитки, которым были введены антитела к S100 в разведении 10 в объеме 0 1 мл

Таким образом, было

показано, что AS 100 в разведении

1 2 3 4 5 ,,

время, дни 10 препятствуют формированию

ДС Есть мнение, что наномолярные концентрации мозгового внеклеточного S100B могут оказывать регуляторное воздействие, в то время как его микромолярный уровень может оказывать разрушающее действие (Donato R, 1999, 2003) Тогда протекторный зффекг в целом ряде случае представляется вполне объяснимым, как уменьшающий концентрацию S100B до физиологического уровня

Исследование мембранных механизмов влияния антител к Си'*-свнзываюшему белку 810(1 на формирование ДС. Так как спонтанная активность И поведение нейронов в ответ на стимуляцию регулируется Са^-зависимыми ионными токами и механизмами фосфорилирования и дефосфорилирования, то можно предположить, что белки 8 [00 могут модулировать электрические свойства нервных клеток. Действительно, было обнаружено, что некоторые представители этого семейства мопп воздействовать на электрические характеристики нервных клеток. Например, белок 5100В увеличивает мембранный потенциал, укорачивает продолжительность ПД и уменьшает спонтанную активность нейронов париетального и висцерального ганглиев виноградной улитки (КиЫз1а И. е! а!., 1999). В командных нейронах оборонительного рефлекса виноградной улитки

показано снижение мембранного и

-V m. м в

ч

sí-!

LAS 100

Д С

Рис. 5. Мембранный потенциал покоя (Ут). ДС - группа, у которой вырабатывалась

сенситизация, ФР - улитки, которым был введен

физиологический раствор для улитки в объеме 0.1 мл, [^А5100 -улитки, которым были введены антитела к 8100 в разведении 10"' в объеме 0.1мл. Ось ординат -потенциал, в мВ. * - достоверное отличие (Р<0.01).

LAS100

Д С

Рис. 6. i lopor генерации потенциала действия (Vt). ДС группа, у которой вырабатывалась сенситизация, ФР - улитки, которым был введен

физиологический раствор для улитки в объеме 0.1мл, LAS100 -улитки, которым были введены антитела к S100 а разведении 10 в объеме 0.1 мл. Ось ординат -потенциал, в мВ. * - достоверное отличие (Р<0,01).

порогового потенциалов при формировании ДС (Гайнутдинов Х.Л., Береговой H.A., 1994; Гайнутдинова Т.Х. и др., 1999). Поэтому представлялось интересным проследить, как будут меняться эти параметры нейронов у сенс чт из и рованных животных при предварительном введении антител к Ca2'- связывающему белку SIOO.

Олектрофизиологические измерения показывают, что в случае предварительного введения антител к Са2*-"связываюшему белку S100 при

процедуре нанесения электрошоков улитке и мембранный потенциал покоя (рис 5), и пороговый потенциал (рис 6) командных нейронов имели более сниженное значение по сравнению с улитками после предварительного введения ФР, однако они были больше, чем у улиток после формирования ДС, т е протекторный эффект антител к Са2+ -связывающему белку S100 на формирование ДС сопровождается частичным восстановлением величин мембранного и порогового потенциалов

Полученные результаты, свидетельствуют, что дисбаланс Са2+-связывающего белка S100 может привести к торможению или изменению хода процессов, развивающихся при формировании пластических перестроек в организме и, особенно при патологических процессах Наши результаты показывают участие мембранных структур в развитии протекторного эффекта антител к S100 на формирование ДС

Исследование роли оксида азота в эффектах влияния антител к Са2+-связывающему белку S100 на формирование ДС методом ЭПР спектроскопии. В последнее десятилетие было установлено, что простейшее химическое соединение - оксид азота (N0) - является внутри- и межклеточным посредником, выполняющим различные сигнальные функции (Реутов В П и др , 1998, Уразаев А X, Зефиров A J1, 1999) Поскольку показано, что для формирования ДС необходим серотонин (Castellucci VF et al, 1986, Clark GA, Kandel E, 1993, Гайнутдинов X Л и др, 2002), то мы провели исследования, направленные на поиск возможных корреляций эффектов на серотонинергическую систему и систему NO

Рис 7 Сигнал ЭПР ткани нервной системы (А), от меди (Б) и ткани нервной системы улитки после вычета сигнала от меди (В) Масштаб интенсивности спектра (В) в 3 раза больше, чем у А и Б

А

Б

В

яямялаия» эзбзго зв> ш зав зет

Магнитное поле (Гс)

Конгиогь

Ш

2.038

3200

3300 3400

Магнитное попе (Гс) №100

3500

3200

3300 3400

Магнитное поле (Гс) ДС+А&ЮО

3500

}

2038 2038

3200 3300 3400 3500 3200 3300 3400 3500

Магнитное попе (Гс) Магнитное попе (Гс)

Рис 8 ЭПР сигналы от нервной системы (с вычетом сигнала от Си) экспериментальных улиток ДС - улитки с выработанной ДС, А8100 - улитки, которым были введены антитела к Б100 в разведении 10" , ДС+А8Ю0 - улитки, которым перед выработкой ДС были введены антитела к Б100 в разведении 10, контроль - интактные улитки

На рисунке 7 (А и В) приведены типичные спектры ЭПР нервной системы виноградной улитки На рисунках хорошо видны триплетные сигналы от комплекса спиновой ловушки с железом и N0 Интенсивность и площадь этих сигналов являются мерой количества N0, который продуцируется за время нахождения спиновой ловушки в организме животного Однако у виноградной

улитки связывающим ионом в гемолимфе является медь, которая дает свой специфический сигнал в спектре ЭПР в области, лежащей около триплетного сигнала (рис 7 Б) Чтобы определить сигнал от N0 необходимо из суммарного спектра вычесть сигнал от меди Эта процедура показана на рисунке 7

Прямое измерение N0 показывает, что после формирования ДС оборонительного рефлекса интенсивность продукции NO в организме улитки уменьшается (рис 8) Дальнейший анализ содержания NO у улиток, получивших инъекции антител к Са2+-связывающему белку S100, а также сенситизированных улиток, получивших и не получивших инъекции антител к Са2+-связывающему белку S100, показал, что инъекции AS100 вызывают незначительное увеличение содержания NO в тканях нервной системы улитки, а продукция N0, которая была снижена после выработки ДС, восстанавливается в случае предварительной инъекции антител к Са2+-связывающему белку S100 (рис 8)

Исследование эффектов влияния антител к Са2+- связывающему белку S100 на нарушения локомоции нематоды C.elegans тепловым стрессом.

Известно, что как предварительное действие постоянной высокой температуры (акклимация), так и тепловая закалка, заключающаяся в кратковременном действии на организм сублетальной высокой температуры, вызывающая экспрессию генов стрессовых белков, у позвоночных и высших беспозвоночных повышают устойчивость синаптических связей в системах нейронов, регулирующих поведение к тепловым воздействиям, которые не повреждают нейроны, но нарушают синаптические связи между нейронами (Fnendlander M J et al., 1976, Cunningham J R С, Hyde D, 1995, Roder J К et al, 1996, Karunanithi S et al, 1999, Kelty J D , 2002)

Рис 9. Влияние AS 100 на термостабильность локомоции

Caenorhabditis elegans По оси ординат - среднее время появления ошибок моторной программы плавания,

индуцированного сильным механическим стимулом, в условиях действия постоянной высокой температуры 36°С В каждом варианте дано среднее значение трех экспериментов, в каждом из которых использовано 20 червей.

Исследования показали, что как двух часовая экспозиция червей к

время (минуты) 80,

7G 6Q 50 4030 2010-1

Й

il

■Ь

0 1.25X10 □ Базоезя

10

кость лоююшдак

МП 5x10

□ Термостабнльностъ локюнэдюс после 2 часоишзяслозшошк температуре 30ЬС

Концентрация ~ A si 00

температуре +30°С, так и тепловая закалка организма С elegans повышают термостабильность локомоции С ele gans (рис 9, 10) Действие AS 100 выявило протекторный эффект на термостабильность локомоции Celegans во всех 3 вариантах эксперимента, но наиболее ярко выражен в условиях совместного действия на организм AS 100 и адаптации к температуре +30°С (рис 9) Результаты этих экспериментов показывают, что AS 100 повышают не только базовую термостабильность локомоции С elegans, но и эффективность быстрой адаптации червей к переносимому организмом повышению температуры среды

В то же время AS 100 оказывают незначительный эффект на тепловую закалку Celegans (рис 10) Следовательно, двух часовая экспозиция червей к температуре+30°С и тепловая закалка С elegans являются адаптациями организма к

ьремш

(минуты) 60*

303020 10-

rt\

|í

Концентрация Asi 00

О 1.35КИГ 25ХЦГ" 5x10"" ИГ □ Базовая ОТсрмостабил&хость

ириостабнль- лякю&шкк после теюювак яость закалкн С efegara <1 чае

люквнвцкк при ЗГС+1 час лрн 20*0

Рис 10 Влияние тепловой закалки и А8100 на термостабильность локомоции Саепог/гаЬЛш е1е%ат По оси ординат - среднее время появления ошибок моторной программы плавания,

индуцированного сильным

механическим стимулом, в условиях действия постоянной высокой температуры 36°С В каждом варианте дано среднее значение трех экспериментов, в каждом из которых использовано 20 червей

высокой температуре, различающимися по их механизмам

Наши эксперименты показали, что экспрессия генов стрессовых белков не может быть причиной повышения термостабильности локомоции С е1е%ат двухчасовой экспозицией к температуре +30°С. Так как двух часовая экспозиция С е^апз к температуре +30°С является подпороговой для экспрессии генов стрессовых белков (Уокоуаша К е1 а1, 2002), а в наших эксперимантах циклогексимид (ингибитор синтеза белков), не оказывает влияние на

эффективность адаптации С е^ат к высокой температуре (рис 11).

Рис 11 Влияние адаптации к высокой температуре среды и циклогексимида на термотолерантность организма С elegans Циклогексимид (200 мг/л) вводили в среду до адаптации С е^ат при 30°С По оси ординат - доля червей, сохранивших координацию движений в % 1 - контроль, 2 -циклогексимид, 3-2 часа при 30°С, 4 -циклогексимид + 2 часа при 30°С

%

225 200 175 150 -125 100 75 -50 25

Наиболее вероятной причиной чувствительного к AS100 повышения термостабильности локомоции C.etegans повышением температуры до +30°С является стимуляция этой температурой неадаптируемых или частично адаптируемых терморецепторов, сигналы из которых поступают в нервную систему и повышают термостабильность систем нейронов, регулирующих локомоцию С.elegans.

Исследование эффектов влияния антител к Са2*- связывающему белку SIDO н;« нарушения локомоции нематоды C.etegans сенсорной изоляцией. В эксперимента* на человеке и млекопитающих показано, что резкое снижение общего объема сенсорной информации нызыкает дезинтеграцию нормального поведения (Хайнд Р., 1975). Из-за отсутствия у С.elégans органов зрения и слуха вся сенсорная информация поступает н нервную систему из механосенсориой, хемосенСорной и термосенсорной систем (Bargmarm C.I., 1991; 1993). Нами были подобраны условия экспериментов, в которых нарушения поведения вызывались сенсорной изоляцией C.elegans.

Рис. 12. Влияние температуры на развитие нарушений спонтанной локомоции C.elegans при сенсорной изоляции червей. По оси ординат -доля червей, сохранивших координацию движений в %.

%

lÜO-i

70 SO :•» 40 3020 !0

rh

т.

iaíc

□ 30 минут инкубации

22Х

3"!

2?С □ 60 мкнут КККуйзднл

Теыги среды

Сенсорная изоляция при температуре выращивания 19.5°С вызывает нарушение спонтанной локомоции червей уже через 30 минут. 11ри увеличении температуры выращивания до 22°С и 25"С (рис. 12) наблюдается стабилизация спонтанной

локомоции червей, инкубированных индивидуально в жидкой среде. %

100.

ÉL

1.15*10' 2.5 >40

□ 30 минут npiilPT

О 6U минут ирн19*С

Рис, 13. Влияние АЙШО на развитие нарушений спонтанной локомоции СаепогЬаЬфШ е1е%ат, индуцированных сенсорной

изоляцией червей. По оси ординат - доля червей, сохранивших координацию

движений при спонтанной локомоции через 30 и 60 минут сенсорной изоляции, в %. В ^ошетрацня каждом варианте дано среднее значение для трех экспериментов, в каждом из которых использовано 20 червей. По оси абсцисс — концентрация АБЮО,

Наши последующие эксперименты выявили протекторный эффект AS 100 в условиях сенсорной изоляции С elegans Введение в среду AS 100 замедляет развитие нарушений спонтанной локомоцни сенсорной изоляцией, максимальный эффект AS 100 наблюдается в первые 30 минут этой изоляции (рис 13) Эти данные показывают участие белков S100 в функциях систем нейронов, которые необходимы для непрерывной спонтанной двигательной активности С elegans при оптимальной температуре среды

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ионы Са2+ играют огромную роль в запуске различных клеточных реакций Биохимический механизм такого запуска состоит из двух основных звеньев во-первых, поступающие в клетку во время ее возбуждения ионы С,а2' взаимодействуют со специфическими нейронными белками, кальмодулином и тропонином С, во-вторых, комплексы Са2+-белок, которые взаимодействуют со специфическими энзиматическими системами, обеспечивающими фосфорилирование других белков, непосредственно участвующих в выполнении соответствующей клеточной функции (Костюк ПГ, 1986, Blackwell К.Т, Alkon D L, 1999, Verkhratsky A, 2005) Интенсивно исследуются в последнее время функции такого Са2+-связывающего белка, как белок S100 (Heizmann С W et ai, 2002,' Donato R, 2003, Santamana-Kisiel L et al, 2006). Эволюционная стабильность этого белка была отмечена еще в первых исследованиях его распределения в тканях разных животных S100 обнаруживаются у всех позвоночных (Мооге В W , 1973, Donato R, 1999) и у многих беспозвоночных, например, у виноградной улитки (Jankovic В D, 1985, Штарк МБ, 1985, Kubista Н et al, 1996) Внутриклеточные функции белков S100 (Donato R, 1999, 2003) относятся преимущественно к регуляции функционирования внутриклеточных сигнальных систем (фосфорилирование белков, ферментативная активность внутриклеточных ферментов, регуляция Са2+-гомеостаза, регуляция динамики цитоскелета) Внеклеточные функции белков S100 включают нейротропные эффекты белков S100, участие этих белков в формировании когнитивного поведения и их роль в дегенеративных заболеваниях Эти функции белков S100 определяют выбор нами нейробиологической модели ДС, которая в зависимости от параметров его формирования может служить моделью пластичности, но, с другой стороны, может отражать состояние тревожности животного и депрессивного состояния (Кэндел Э, 1980, GasulI X et al, 2005, Antzouíatos ВС et al, 2006)

В данном исследовании нами получены результаты, которые показывают, что AS 100 препятствуют формированию ДС, в то же время изменений

двигательной активности не наблюдается Показанное частичное восстановление значений мембранного и порогового потенциалов командных нейронов свидетельствует, что часть протекторного эффекта AS 100 реализуется за счет внутриклеточных функций белка S100, а часть является следствием изменений в нейронной сети (синаптическая активность), т е является проявлением внеклеточных функций белка S100

Другой моделью для исследования эффектов S100 были термостабильность локомоции С elegans и их сенсорная изоляция Преинкубация С elegans при 20°С в среде, содержащей AS 100, вызывает увеличение среднего времени появления ошибок моторной программы плавания, индуцированного повышением температуры до 36°С Результаты этих экспериментов показывают, что AS 100 повышают не только базовую термостабильность локомоции С elegans, но и эффективность быстрой адаптации червей к переносимому организмом повышению температуры среды Протекторный эффект AS 100 в условиях нарушения поведения С elegans тепловым стрессом свидетельствует о значительной роли Са2+-связывающих белков S100 в развитии обратимых тепловых нарушениях поведения червей

Следующий аспект проведенного исследования связан с ролью оксида азота (NO), который является внутри- и межклеточным посредником, выполняющим различные сигнальные функции (Schuman Е M , Madison D V , 1994, Реутов В П и др, 1998, Уразаев АХ, Зефиров АЛ, 1999) Показано, что серотонин и доноры NO взаимно усиливают эффекты друг друга (Дьяконова Т JI, 2000) Найдены доказательства, что белок S100В производит нейротоксический эффект in vitro, вызывая апоптоз как в нейрональных, так и глиальных клетках за счет активации NO-синтазной активности, что ведет в итоге к апоптической смерти клетки (Hu J et al, 1996, 1997). Поэтому нами были проведены исследования изменений содержания NO в органах улитки при влиянии AS100 на формирование ДС, где основным медиатором является серотонин (Castellucci VF et al, 1986, Clark G A , Kandel E , 1993) В проведенном исследовании нами показано, что выработка ДС сопровождается снижением интенсивности формирования NO в организме улитки Поскольку выработка ДС является следствие резкого выброса серотонина, то эти результаты свидетельствуют о том, что серотонин и NO действуют либо однонаправлено, либо эффект одного выражается через действие другого Вторая половина наших исследований демонстрирует, что антитела к Са2+-связывающему белку S100 оказывают протекторное действие на формирование ДС, т е они могут снимать феномены или проявления тревожности Причем этот эффект связан с

изменением динамики синтеза N0, поскольку этот эффект сопровождается частичным восстановлением содержания N0

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что дисбаланс Са2+-связывающего белка Б100 может привести к торможению или изменению хода определенных процессов, развивающихся при формировании пластических перестроек в организме

ВЫВОДЫ

1 Введение антител к кальций-связывающему белку ЭЮО в разведении 10~12 перед началом процедуры сенситизации блокирует формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки препятствует увеличению оборонительных реакций закрытия пневмостома и отдергивания омматофоров

2 Введение антител к кальций-связывающему белку 8100 в разведении 10~12 перед началом формирования долговременной сенситизации не оказывает влияния на локомоторную активность виноградной улитки

3 Введение антител к кальций-связывающему белку БЮО в разведении 10~12 перед началом процедуры сенситизации препятствует снижению мембранного и порогового потенциалов командных нейронов до уровня, характерного для долговременной сенситизации

4 После формирования долговременной сенситизации у виноградной улитки в тканях нервной системы и сердца происходит снижение продукции оксида азота

5 При введении антител к кальций-связывающему белку БЮО в разведении 10"12 перед началом формирования долговременной сенситизации происходит частичное восстановление содержания оксида азота в тканях нервной системы и сердца виноградной улитки

6 Преинкубация нематоды Celegans при 20°С в среде, содержащей антитела к кальций-связывающему белку Б100 в разведении 10"12, вызывает увеличение среднего времени появления ошибок моторной программы плавания, индуцированного повышением температуры до Зб°С

7 В жидкой среде, без агара, большие группы червей (нематода С е^ат) при высокой их плотности не только сохраняют способность к спонтанной локомоции в течение 4 часов при 19°С, но и повышают устойчивость спонтанной локомоции червей при последующем ее индивидуальном измерении

8 Введение в среду AS 100 в разведении 10"'2 замедляет развитие нарушений спонтанной локомоции сенсорной изоляцией, причем максимальный протекторный эффект AS 100 наблюдается в первые 30 минут изоляции

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Калинникова Т Б Адаптация нематоды Caenorhabditis elegans к высокой температуре среды / Т Б Калинникова, А X Тимошенко, Т М Гайнутдинов, В В Гиндина, М X Гайнутдинов // Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2006 - Т 42, №5 -С 457-462

2 Гайнутдинов М X Адаптация лабораторных популяций Caenorhabditis elegans к высокой температуре как модель эволюции термотолерантности пойкилотермных Metazoa / М X Гайнутдинов, А X Тимошенко, В В Гиндина, Т М Гайнутдинов Т Б Калинникова //Доклады РАН -2007 -Т 413 -С 1-4

3 Эпштейн О И Протекторный эффект антител к белку S100 в малых дозах на формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки / О И Эпштейн, М Б Штарк, А X Тимошенко, Т X Гайнутдинова, X Л Гайнутдинов К Бюлл экспер биол мед - 2007 - № 5 - С 490-493

4 Гайнутдинов М X Характеристика новых линий Caenorhabditis elegans с высокой и низкой термотолерантностью / М X Гайнутдинов, А X Тимошенко, Т М Гайнутдинов, ТБ Калинникова Н Генетика -2007 -Т 43, №9 - С 1218-1225

5 Sylantieva D I Effects of changes of extra- and intracellular calcium on electrical characteristics of withdrawal interneurons of learned snails / D I Sylantieva, V V Andrianov, Kh L Gamutdinov, A H Timoshenko // Book of Abstracts Abstracts of the 7-th East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology - Kaliningrad, 12 0916 09 2003 -P 106

6 Гайнутдинов MX О механизмах термотолерантности организма нематоды Caenorhabditis elegans /МХ Гайнутдинов, T Б Калинникова, Т М Гайнутдинов, А X Тимошенко, Р П Токинова // Материалы Международной научной конференции

Актуальные проблемы экологической физиологии биохимии и генетики животных" -Саранск - 2005 - С 93-94

7 Тимошенко АХ О механизме теплового угнетения поведения нематоды Caenorhabditis elegans /АХ Тимошенко, В В Гиндина // Сборник тезисов IX Международной Путинской школы-конференции молодых ученых "Биология — наука XXI века" -Пущино -2005 -С 310

8 Тимошенко А X Исследование термотолерантности почвенной нематоды Caenorhabditis elegans / АХ Тимошенко, В В Гиндина // Сборник тезисов IX Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей "Человек и его здоровье" - Санкт-Петербург - 2006 - С 331-332

9 Тимошенко А X Механизмы термотолерантности организма нематоды С elegans / А X Тимошенко, В В Гиндина // Сборник тезисов X Международной Путинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" -Пущино -2006 -С 319

10 Timoshenko A Kh Effects of changes of intracellular calcium m command neurons of snails after learning and long-term sensitization / A Kh Timoshenko, T Kh Gainutdinova, D I Sylantieva // Book of Abstracts of the 8-th East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology 'Simpler Nervous Systems" - Kazan, 13 09-17 09 2006, P 87

11 Gamutdinov M Ch Production by artificial selection of Caenorhabditis elegans lines with different sensitivity of behavior to heat stress / M Ch Gamutdinov. A Ch Timoshenko, V V Gindma, T M Gamutdinov, T В Kalmmkova // Book of Abstracts of the 8-th East

European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology 'Simpler Nervous Systems'" - Kazan, 13 09-17 09 2006, - P 21

12 Kahnmkova ТВ Caenorhabditis elegans as a model organism for investigation of nervous system adaptation to heat stress /ТВ Kalinmkova, A Ch Timoshenko, V V Gindina, T M Gainutdmov, M Ch Gamutdmov // Book of Abstracts of the 8-th East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology 'Simpler Nervous Systems' - Kazan, 13 09-17 09 2006, - P 35

13 Гайнутдинов XJI Роль ионов кальция в обеспечении долговременной памяти у виноградной улитки / X JI Гайнутдинов, В В Андрианов, Д И Силантьева. А X Тимошенко // Тезисы докладов VIII Всероссийского симпозиума "Растущий организм адаптация к физической и умственной нагрузке" - Казань, 22 09-24 09 2006 - С 22-24

14 Тимошенко АХ Эффекты влияния антител к белку S100 в малых дозах на выработку долговременной сенситизации у виноградной улитки /АХ Тимошенко, Г Г Яфарова, Р Р Тагирова, Т X Гайнутдинова, А И Исмаилова, X J1 Гайнутдинов, М Б Штарк, О И Эпштейн // Тезисы докладов VIII Всероссийского симпозиума 'Растущий организм адаптация к физической и умственной нагрузке" — Казань 22 09-24 09 2006 -С 107

15 Юртаева С В Исследование методом ЭПР-спектроскопии изменения содержания оксида азота в тканях виноградной улитки при выработке долговременной сенситизации / С В Юртаева, Г Г Яфарова, Т X Гайнутдинова, А X Тимошенко, А А Обыночный, X JI Гайнутдинов // Материалы Международного симпозиума "Активные формы кислорода, азота и хлора в регуляции клеточных функций в норме и при патологии" - Гродно, 28 0929 09 2006 - Часть И, - С 194-197

16 Тимошенко А X Эффекты действия антител к кальций-связывающему белку S100 на выработку долговременной сенситизации у виноградной улитки /АХ Тимошенко ТХ «Гайнутдинова // Тезисы докладов X Всероссийской конференции молодых исследователей "Человек и его здоровье" - Санкт-Петербург, 20 04-21 04 2007 - С 445446

17 Гайнутдинов Т М Caenorhabditis elegans - модель для изучения адаптации нервной системы к тепловому стрессу / Т М Гайнутдинов, А X Тимошенко, В В Гиндина, М X Гайнутдинов // Тезисы докладов XX Съезда физиологического общества имени И П Павлова - Москва, 4 06-8 06 2007 - С 189

18 Тимошенко АХ Результаты искусственного отбора Caenorhabditis elegans по термостабильности поведения /АХ Тимошенко, В В Гиндина, Т М Гайнутдинов, Т Б Калиникова // Тезисы докладов XX Съезда физиологического общества имени И П Павлова - Москва, 4 06-8 06 2007 - С 442

19 Тимошенко АХ Влияние антител к белку S100 в малых дозах на выработку долговременной сенситизации у виноградной улитки /АХ Тимошенко, М Б Штарк, О И Эпштейн // Тезисы докладов XX Съезда физиологического общества имени И П Павлова - Москва, 4 06-8 06 2007 - С 442

20 Гайнутдинов X JI ЭПР исследование образования оксида азота и других парамагнитных частиц при патологических нарушениях поведения у виноградной улитки / X Л Гайнутдинов, Г Г Яфарова, С В Юртаева А А Обыночный, В В Андрианов, Т X Гайнутдинова, Л Н Муранова, А X Тимошенко // Book of Abstracts of International Conference "Modern Developments m Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy m Medicine" - Kazan, 2 07-5 07 2007 - С 54

Подписано в печать 27 09 2007 Форм 60 x 841/16 Гарнитура «Times New Roman» Печать ризографическая Печл 1,5 Тираж 120 Заказ 72/9

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства Казанского государственного университета 420008, Казань, ул Профессора Нужина, 1/37 Тел 231-53-59

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тимошенко, Алия Халиловна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Внутриклеточные сигнальные системы.

2.1.1. Аденилатциклазная сигнальная система.

2.1.2.140-сигнальная система.

2.2. Внутриклеточная кальциевая система сигнализации.

2.2.1. Са как универсальный вторичный посредник.

2.2.2. Внутриклеточная регуляция свободного кальция.

2.2.3. Внутриклеточные кальциевые буферы.

2.3. Кальций-связывающий белок 8100 и его функции.

2.3.1. Кальций-связывающий белок 8100: открытие и специфические особенности.

2.3.2. Функциональная роль кальций-связывающего белка Б

2.3.2.1. Внутриклеточные функции белков 8100.

2.3.2.2. Внеклеточные функции белков 8100.

2.3.3. Исследования роли кальций-связывающего белка 8100 с применением антител к нему.

2.3.4. Кальций-связывающий белок 8100 и нервно-патологические процессы.

2.4. Пластичность поведения.

2.4.1. Оборонительное поведение и локомоция у виноградной улитки.

2.4.2. Простые формы обучения и ассоциативное обучение у виноградной улитки.

2.4.3. Тепловой стресс и сенсорная изоляция свободноживущей почвенной нематоды СаепогкаЪйШз е1е%ат как модели экстремального воздействия.

2.5. Долговременная сенситизация.

2.5.1. Долговременная сенситизация оборонительного рефлекса у виноградной улитки, длительность его сохранения.

2.5.2. Роль серотонина и дофамина в формировании долговременной сенситизации.

2.5.3. Мембранные и кальций-зависимые метаболические механизмы долговременной сенситизации.

3. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Объекты исследования.

3.1.1. Виноградная улитка Helix lucorum.

3.1.2. Почвенная нематода Caenorhabditis elegans.

3.2. Растворы, использованные в исследовании.

3.2.1. Использованные антитела.

3.3. Методы исследования.

3.3.1 Выработка долговременной сенситизации и тестирование поведенческих реакций

3.3.2. Экспериментальные группы животных (виноградная улитка).

3.3.3. Количественное измерение содержания оксида азота.

3.3.4. Препарат. Регистрация электрических характеристик нейронов.

3.3.5. Определение термостабильности локомоции свободноживущей почвенной нематоды С.elegans.

3.3.6. Тестирование локомоции C.elegans.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Исследование эффектов влияния антител к Са - связывающему белку S100 на формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки.

4.1.1. Динамика формирования долговременной сенситизации: анализ оборонительного поведения и локомоции.

4.1.2. Эффекты влияния антител к Са2+- связывающему белку S100 на формирование долговременной сенситизации.

4.2. Исследование роли оксида азота и мембранных механизмов влияния антител к Са2+- связывающему белку S100 на формирование долговременной сенситизации

-у ¡.

4.2.1. Исследование мембранных механизмов влияния антител к Са" -связывающему белку S100 на формирование долговременной сенситизации.

4.2.2. Исследование роли оксида азота в эффектах влияния антител к Са2+- связывающему белку 8100 на формирование долговременной сенситизации методом ЭПР спектроскопии.

4.3. Исследование эффектов влияния антител к Са2+- связывающему белку 8100 на нарушения локомоции нематоды C.elegans тепловым стрессом и сенсорной изоляцией

4.3.1. Исследование влияния антител к Са - связывающему белку 8100 на нарушения локомоции нематоды С.е1е%ат тепловым стрессом.

4.3.2. Исследование влияния антител к Са - связывающему белку 8100 на нарушения локомоции нематоды С.е^ат сенсорной изоляцией.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование эффектов действия антител к кальций-связывающему белку S100 на изменения поведения у виноградной улитки и нематоды C.elegans"

Актуальность исследования. Известно, что в долговременных формах пластичности важную роль играют ионы кальция (Hawkins R.D. et al., 1993; Schaffhausen J.H. et al., 2001, Balaban P.M. et al., 2004). Ионы Са2+ участвуют в регуляции разнообразных нейрональных процессов, что обусловлено их специфическими физико-химическими характеристиками, благодаря которым они являются наиболее универсальными внутриклеточными посредниками (Костюк П.Г. и др., 1998; Бухараева Э.А. и др., 2001; Зефиров A.JL, Ситдикова Г.Ф., 2002; Rizzuto R. et al., 2002; Rusakov D.A., 2006). Ионы кальция, осуществляя связь между электрическими явлениями, происходящими в поверхностной мембране клетки, и реакциями, протекающими внутри нее, принимают непосредственное участие в интегративной деятельности нервной клетки (Berridge M.J., 1998; Verkhratsky А., 2005). Исключительно высокая способность внутриклеточной среды связывать ионы кальция определяется наличием в ней эффективных буферных систем. Они состоят главным образом из Са2+ -связывающих белков (Костюк П.Г., 1986; Brini M., Carafoli Е., 2000). Все Са2+-связывающие белки классифицируют на три группы: EF-hand белки, Са2+/фософолипид-связывающие белки и Са2+-запасающие белки (Braunewell К.-Н., Gundelfînger E.D., 1999; Северин Е.С. и др., 2001). Интенсивно исследуются в последнее время функции такого Са -связывающего белка, как белок S100 (Heizmann C.W. et al., 2002; Donato R., 2003).

S100 - это группа белков, характеризуемых наличием Са2+- связывающих доменов и наличием таких фундаментальных свойств как ткане- (мозго-) специфичность, эволюционная стабильность и способность связывать ионы Са2+, взаимодействуя с ними (Baudier J., et al., 1986; Kubista H. et al., 1999; Santamaria-Kisiel L. et al., 2006). Эволюционная стабильность этого белка была отмечена еще в первых исследованиях его распределения в тканях разных животных. S100 обнаруживаются у всех позвоночных (Moore B.W., 1973) и у многих беспозвоночных (Donato R., 1999), например, у виноградной улитки (Jankovic B.D., 1985; Штарк М.Б., 1985; Kubista H. et al., 1996). Функции белков SlOO можно разделить на внутриклеточные и внеклеточные (Donato R., 1999; 2003). Внутриклеточные функции белков S100 разделяются по следующим разделам: регуляция фосфорилирования белков, регуляция ферментативной активности, регуляция Са2+-гомеостаза, регуляция динамики цитоскелета и его компонентов. Внеклеточные функции белков S100 разделяются по следующим разделам: нейротропные эффекты дисульф и дно-связанного димера белка S100, участие этого белка в дегенеративных заболеваниях, участие в формировании когнитивного поведения и ряд других функций. Белок S100В является успешным маркером мозговых нарушений (Anderson R.E. et al., 2001; PelinkaL.E. et al., 2004; Delgado P. et al., 2006).

Оксид азота (II) (NO) является внутри- и межклеточным посредником, выполняющим различные сигнальные функции (Schuman Е.М., Madison D.V., 1994; Ванин А.Ф., 1998; Реутов В.П. и др., 1998; Уразаев А.Х., Зефиров А.Л., 1999). Эффекты оксида азота связаны с его влиянием на ионные каналы, секрецию медиатора, обмен ионов кальция, метаболизм клетки и ее геном (Мухтаров М.Р. и др., 2000; Erxleben С., Hermann А., 2001; Яковлев A.B. и др., 2002;). В последние годы NO-синтезирующие нейроны обнаружены и в нервной системе беспозвоночных, в том числе моллюсков (Huang Е.Р., 1997; Gelperin А., 2000). Показано, что серотонин и доноры NO взаимно усиливают эффекты друг друга (Дьяконова Т.Л., 2000). Найдены доказательства, что белок S100B производит нейротоксический эффект in vitro, вызывая апоптоз как в нейрональных, так и глиальных клетках за счет активации NO-синтазной активности (Hu J. et al., 1996). Имеющиеся результаты предполагают, что пока белок S100В удерживается внутри клетки на физиологическом уровне экспрессии он оказывает протекторный эффект, в то время как повышение или понижение его концентрации будут нарушать нормальное протекание'процессов в клетке (Scotto С. et al., 1998 а).

Молекулярные механизмы сохранения следов памяти широко исследуются в контексте взаимоотношений ассоциативного обучения с сенситизацией как элементарной формой обучения, при которой животное учится усилению ответной реакции на ранее неэффективный стимул, следующей за нанесением сильных стимулов в другом участке (Балабан П.М., Захаров И.С., 1992; Гайнутдинов X.JI. и др., 2002). В настоящее время большое внимание привлекает такая нейробиологическая модель долговременных модификаций поведения как долговременная сенситизация (Cleary L.J. et al., 1998; Philips G.T. et al., 2006). Она позволяет успешно исследовать мембранные механизмы формирования устойчивых очагов возбуждения в нервной системе животного (Castellucci V.F. et al., 1986; Гайнутдинов Х.Л., Береговой H.A., 1994; Никитин В.П., Козырев С.А., 1995; Antzoulatos E.G., Byrne J.H., 2007). Долговременная сенситизация (ДС), являясь видонеспецифическим феноменом, т.е. присущим животным разного уровня организации (Кэндел Э., 1980; Antzoulatos E.G. et al., 2006), позволяет проводить исследование реакций высших животных на относительно простых объектах или моделях, удобных для анализа.

Таким образом, анализ литературы показывает, что роль Са2+-связывающего белка S100B, кальциевой системы, а также оксида азота в проявлении долговременных эффектов сенситизации на уровне поведения животного и характеристик нейрональной мембраны выяснены недостаточно и их исследования являются актуальными.

Цель и основные задачи исследования. Целью работы явилось исследование эффектов действия антител к Са2+-связывающему белку S100B на формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки и на нарушения локомоции тепловым стрессом и сенсорной изоляцией у нематоды C.elegans. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. провести анализ эффектов действия антител к Са2+-связывающему белку S100B на формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки,

2. исследовать мембранные механизмы и роль оксида азота в развитии эффектов действия антител к Ca -связывающему белку S100B на формирование долговременной сенситизации,

3. провести анализ эффектов действия антител к Са2+-связывающему белку S100B на нарушения локомоции у нематоды C.elegans тепловым стрессом,

4. исследовать эффекты действия антител к Са2+-связывающему белку S100В на нарушения локомоции у нематоды C.elegans сенсорной изоляцией.

Положения, выносимые на защиту:

1. Введение антител к Са2+-связывающему белку S100 в разведении 10~12 перед началом формирования долговременной сенситизации оказывает протекторный эффект на оборонительное поведение виноградной улитки. Найдено, что данный протекторный эффект сопровождается частичным восстановлением мембранного и порогового потенциалов командных нейронов и уровня синтеза оксида азота в нервной системе и сердце виноградной улитки.

2. Преинкубация нематоды САе^ат в среде, содержащей антитела к Са2+-связывающему белку Б100 в разведении 10"12, повышает как базовую термостабилыюсть локомоции С.е\е%ат, так и эффективность быстрой адаптации червей к переносимому организмом повышению температуры среды (вызывает увеличение среднего времени появления ошибок моторной программы плавания, индуцированных повышением температуры).

Научная новизна. Впервые обнаружено, что введение антител к Са2+-связывающему белку 8100 в разведении 10"12 препятствует формированию долговременной сенситизации оборонительных реакций у виноградной улитки без влияния на двигательную активность животного. Впервые найдено, что при л . предварительном введении антител к Са -связывающему белку 8100 при нанесении электрошоков улитке мембранный и пороговый потенциалы командных нейронов имеют более высокое значение, чем после ДС. Экспериментально методом ЭПР спектроскопии показано, что после формирования долговременной сенситизации в нервной системе и сердце виноградной улитки происходит снижение продукции оксида азота. Впервые найдено, что протекторный эффект 2+ антител к Са -связывающему белку 8100 у виноградной улитки сопровождается частичным восстановлением уровня синтеза оксида азота в нервной системе и сердце.

Впервые показано, что преинкубация C.elegans при 20°С в среде,

2+ 12 содержащей антитела к Са -связывающему белку 8100 в разведении 10" , вызывает увеличение среднего времени появления ошибок моторной программы плавания, индуцированные повышением температуры до 36°С. Впервые показано, что ингибитор синтеза белков циклогексимид не оказывает влияния на эффективность адаптации C.elegans к высокой температуре, т.е. экспрессия генов стрессовых белков не может быть причиной повышения термостабильности локомоции С.е1е%ат двухчасовой экспозицией к температуре +30°С. Впервые показано, что А8100 в разведении 10"12 замедляют развитие нарушений спонтанной локомоции сенсорной изоляцией, причем максимальный протекторный эффект

А8100 наблюдается в первые 30 минут изоляции.

Научно-практическая ценность. Полученные результаты позволяют составить более полное представление о роли Са2+-связывающих белков в механизмах пластичности и в изменениях поведения. Протекторный эффект антител к Са2+-связывающему белку S100 в разведении 10"12 при применении перед началом формирования нейробиологической модели тревожности и депрессивного состояния позволяет определить пути поиска фармакологических веществ, способных влиять на нарушения поведения. Полученные результаты, видимо, свидетельствуют, что дисбаланс Са -связывающего белка S100 может привести к торможению или изменению хода определенных процессов, развивающихся при формировании пластических перестроек в организме и, особенно при патологических процессах. Результаты свидетельствуют об участии мембранных структур в развитии протекторного эффекта антител к S100 на формирование долговременной сенситизации. Полученные результаты позволяют составить более полное представление о роли оксида азота в механизмах долговременной сенситизации. Прямыми измерениями N0 методом ЭПР спектроскопии показано, что формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки сопровождается снижением продукции оксида азота. Данный результат может помочь в выборе стратегии применения фармакологических веществ при нарушениях поведения и деятельности нервной системы. Полученные результаты используются при чтении курсов лекций в КГУ и ТГГПУ.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на: Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Kaliningrad, 2003 г), VI Республиканской научной конференции Актуальные экологические проблемы республики Татарстан (Казань, 2004 г), Международной научной конференции «Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных» (Саранск, 2005 г), 9-ой и 10-ой Путинской Международной школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2005, 2006 гг), 9-ой Всероссийской конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006 г). Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Kazan, 2006 г), VIII Всероссийском симпозиуме "Растущий организм" (Казань, 2006 г.), Международном симпозиуме "Активные формы кислорода, азота и хлора в регуляции клеточных функций в норме и при патологии" (Гродно, 2006 г.), Самойловских чтениях (Казань, 2007 г.), XX Съезде физиологического общества имени И.П.Павлова (Москва, 2007 г.), Conference of the International "Modern Developments in Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy in Medicine" (Kazan, 2007 г.).

Реализация результатов исследования. Материалы исследования отражены в 4 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, и в 16 тезисах докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа объемом 142 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, главы результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 275 источника, из них 173 - иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 30 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Тимошенко, Алия Халиловна

выводы

1. Введение антител к кальций-связывающему белку S100 в разведении 10"12 перед началом процедуры сенситизации блокирует формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки: препятствует увеличению оборонительных реакций закрытия пневмостома и отдергивания омматофоров.

2. Введение антител к кальций-связывающему белку S100 в разведении 10"12 перед началом формирования долговременной сенситизации не оказывает влияния на локомоторную активность виноградной улитки.

3. Введение антител к кальций-связывающему белку S100 в разведении 10"12 перед началом процедуры сенситизации препятствует снижению мембранного и порогового потенциалов командных нейронов до уровня, характерного для долговременной сенситизации.

4. После формирования долговременной сенситизации у виноградной улитки в тканях нервной системы и сердца происходит снижение продукции оксида азота.

12

5. При введении антител к кальций-связывающему белку S100 в разведении 10' перед началом формирования долговременной сенситизации происходит частичное восстановление содержания оксида азота в тканях нервной системы и сердца виноградной улитки.

6. Преинкубация нематоды C.elegans при 20°С в среде, содержащей антитела к

1 "7 кальций-связывающему белку S100 в разведении 10" , вызывает увеличение среднего времени появления ошибок моторной программы плавания, индуцированных повышением температуры до 36°С.

7. В жидкой среде, без агара, большие группы червей (нематода C.elegans) при высокой их плотности не только сохраняют способность к спонтанной локомоции в течение 4 часов при 19°С, но и повышают устойчивость спонтанной локомоции червей при последующем ее индивидуальном измерении.

8. Введение в среду AS 100 в разведении 10"12 замедляет развитие нарушений спонтанной локомоции сенсорной изоляцией, причем максимальный протекторный эффект AS 100 наблюдается в первые 30 минут изоляции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ионы Са играют огромную роль в запуске различных клеточных реакций. Биохимический механизм такого запуска состоит из двух основных звеньев: во-первых, поступающие в клетку во время ее возбуждения ионы Са2+" взаимодействуют со специфическими нейронными белками, кальмодулином и тропонином С; во-вторых, комплексы Са2+-белок, которые взаимодействуют со специфическими энзиматическими системами, обеспечивающими фосфорилирование других белков, непосредственно участвующих в выполнении соответствующей клеточной функции (Костюк П.Г, 1986; Blackwell К.Т, AIkon D.L, 1999; Verkhratsky А, 2005). Очень интересно, что в запуске биохимических процессов непременно принимают участие ионы Са2+, запускающие каскад вторичных посредников, набор которых одинаков в пре- и постсинаптических нейронах, но изменения могут идти разными путями (Smith С. et al, 1998; Brini М, Carafoli Е, 2000; Rizzuto R, Pozzan T, 2006). В отличие от большинства других вторичных посредников, например циклических нуклеотидов, диацилглицерина, фософоинозитидов и др, представляющих собой быстро метаболизирующие эффекторные молекулы,

Са2+ является неметаболизирующим (стабильным) посредником. Следовательно, его внутриклеточный уровень регулируется иным способом, а именно посредством изменения концентрации, доступной Са -связывающим белкам-мишеням (Пивоваров А.С. и др, 1989; Brini М, Carafoli Е, 2000; Крутецкая З.И. и др, 2003). К последним относятся также Са -связывающие белки, которые непосредственно модулируют активность различного рода эффекторных молекул. Согласованная работа всех перечисленных механизмов приводит к тому, что выполняется главное условие, определяющее возможность выполнения кальцием функции вторичного посредника - наличие высокого концентрационного градиента. После прекращения действия сигнала системы активного и пассивного связывания ионов понижают концентрацию Са2+ в цитоплазме до исходного уровня (Meldolesi J, Pozzan Т, 1998; Северин Е.С. и др, 2001; Berridge M.J. et al, 2003; Нистратова В.Л, Пивоваров А.С, 2004).

Интенсивно исследуются в последнее время функции такого Са -связывающего белка, как белок S100 (Heizmann C.W. et al, 2002; Donato R, 2003). SI00 - это группа белков, характеризуемых наличием Са2+- связывающих доменов рис. 29) и наличием таких фундаментальных свойств как ткане- (мозго-) специфичность, эволюционная стабильность и способность связывать ионы Са2\ взаимодействуя с ними (Baudier J, Gerard D, 1983; Fano G. et al, 1995; Kubista H. et al, 1999; Santamaria-Kisiel L. et al, 2006). Эволюционная стабильность этого белка была отмечена еще в первых исследованиях его распределения в тканях разных животных. S100 обнаруживаются у всех позвоночных (Moore B.W, 1973; Donato R, 1999) и у многих беспозвоночных, например, у виноградной улитки (Jankovic B.D., 1985; Штарк М.Б, 1985; Kubista H. et al, 1996).

Ca -связывающий белок S100 обладает большим набором функций (рис. 30), которые можно разделить на внутриклеточные и внеклеточные (Donato R, 1999; 2003). Внутриклеточные функции белков S100 относятся преимущественно к регуляции функционирования внутриклеточных сигнальных систем, таким, как фосфорилирование белков, ферментативная активность внутриклеточных

Л I ферментов (прежде всего протеинкиназ), регуляция Са -гомеостаза, регуляция динамики цитоскелета и его компонентов. Одной из важнейших функций белков S100 является регуляция Са2+-гомеостаза. Внеклеточные функции белков S100 включают нейротропные эффекты белков S100, участие этих белков в формировании когнитивного поведения и их роль в дегенеративных заболеваниях. Эти функции белков S100 определяют актуальность исследований их физиологической роли, как на уровне поведенческих реакций, так и на уровне нейронных сетей. Это и определило выбор нами нейробиологической модели долговременной сенситизации, которая в зависимости от параметров его формирования может служить моделью пластичности, но, с другой стороны, может отражать состояние тревожности животного и депрессивного состояния (Кэндел Э, 1980; Гайнутдинов Х.Л. и др., 2002; Gasull X. et al, 2005; Antzoulatos E.G. et al. 2006).

Нами у виноградной улитки была получена долговременная сенситизация -выраженное усиление оборонительной реакции закрытия пневмостома. ДС в настоящее время привлекает большое внимание как модель, которая позволяет успешно исследовать мембранные механизмы формирования устойчивых очагов возбуждения в нервной системе животного (Cleary L.J. et al, 1998; Antzoulatos E.G. et al, 2006; Philips G.T. et al, 2006). Во многих экспериментах была показана возможность существования долговременной формы сенситизации, зависимой от белкового синтеза (Castellucci V.F. et al, 1989; Balaban P.M., Bravarenko N.I, 1993; ClarkG.A,Kandel E.R, 1993; Гайнутдинов X.JI, Береговой H.A., 1994; Никитин В.П, Козырев С.А, 1995; Cleary L.J. et al, 1998). При исследовании мембранных механизмов формирования ДС изменения были найдены, прежде всего, в эффективности синаптической передачи (Castellucci F.V. et al, 1986; Clark G.A, Kandel E.R, 1993) и увеличении возбудимости сенсорных и командных нейронов (Dale N. et al, 1987; Walters E.T, 1987; Никитин В.П. и др., 1992; Гайнутдинов Х.Л, Береговой H.A., 1994; Cleary L.J. et al, 1998). Нами также показано снижение мембранного и порогового потенциалов в командных нейронах, что свидетельствует о повышении возбудимости при ДС.

В данном исследовании нами получены результаты, которые показывают, что AS 100 в определенном разведении препятствуют формированию ДС, которая является нейробиологической моделью состояния тревожности (Кэндел Э, 1980; Гайнутдинов Х.Л. и др, 2002; Gasuli X. et al, 2005; Antzoulatos E.G., Byrne J.H, 2007), в то же время изменений двигательной активности не наблюдается. Следует отметить, что оборонительные реакции у виноградной улитки определяются командными нейронами, а двигательная активность контролируется мотонейронами педального ганглия, имеющими совершенно другой характер активности. Разный тип активности этих нейронов может свидетельствовать о том, что в их функционировании внутриклеточные сигнальные системы действуют по-разному. Показанное частичное восстановление значений мембранного и порогового потенциалов командных нейронов свидетельствует, что часть протекторного эффекта AS 100 реализуется за счет внутриклеточных функций белка S100, а часть является следствием изменений в нейронной сети (синаптическая активность), т.е. является проявлением внеклеточных функций белка S100.

Другой моделью для исследования эффектов S100 были термостабильность локомоции C.elegans и их сенсорная изоляция. Преинкубация C.elegans при 20°С в среде, содержащей низкие (10"13-10'12 М) концентрации AS100, вызывает увеличение среднего времени появления ошибок моторной программы плавания, индуцированные повышением температуры до 36°С. Сходное с эффектом AS100, но более сильное влияние на термостабилыюсть локомоции C.elegans вызывает двухчасовая экспозиция червей к температуре 30°С. При совместном действии AS 100 и адаптации к температуре 30°С выявляется синергизм этих двух воздействий на организм. Результаты этих экспериментов показывают, что AS 100 повышают не только базовую термостабильность локомоции C.elegans, но и эффективность быстрой адаптации червей к переносимому организмом повышению температуры среды. Протекторный эффект AS100 в условиях нарушения поведения C.elegans тепловым стрессом свидетельствует о значительной роли Са -связывающих белков S100 в развитии обратимых тепловых нарушениях поведения червей.

Полученные результаты, видимо, свидетельствуют, что дисбаланс Са2+-связывающего белка S100 может привести к торможению или изменению хода процессов, развивающихся при формировании пластических перестроек в организме, в том числе при патологических процессах. Наши результаты показывают участие мембранных структур в развитии протекторного эффекта антител к S100 на формирование ДС. В пользу такой возможности свидетельствуют данные, демонстрирующие участие S100 в работе Са2+-зависимых К+- каналов (Kubista H. et al., 1999), a также наличие прямого эффекта антител к белку S100 на Са2+-каналы (Солнцева Е.И., 1988; Гайнутдинов X.JI. и др., 1996) и возможность модуляции изменениями внеклеточной концентрации ионов Са эффекта AS 100 вплоть до полного его ингибирования (Shtark М.В. et al., 1987).

Другой аспект проведенного исследования связан с ролью оксида азота (NO), который является внутри- и межклеточным посредником, выполняющим различные сигнальные функции (Schuman Е.М., Madison D.V., 1994; Реутов В.П. и др., 1998; Уразаев А.Х., Зефиров АЛ., 1999). В последние годы NO-сшггезирующие нейроны обнаружены и в нервной системе беспозвоночных, в том числе моллюсков (Huang Е.Р., 1997). Показано, что серотонин и доноры NO взаимно усиливают эффекты друг друга (Дьяконова Т.Д., 2000). Найдены доказательства, что белок S100В производит нейротоксический эффект in vitro, вызывая апоптоз как в нейрональных, так и глиальных клетках за счет активации NO-синтазной активности, что ведет в итоге к апоптической смерти клетки (Ни J. et al., 1996; 1997). Поэтому нами были проведены исследования изменений содержания NO в органах улитки при влиянии AS 100 на формирование ДС, где основным медиатором является серотонин (Castellucci V.F. et al, 1986; Clark G.A, Kandel E.R., 1993).

В проведенном исследовании нами показано, что выработка ДС сопровождается снижением интенсивности формирования N0 в организме улитки. Поскольку выработка ДС является следствие резкого выброса серотонина, то эти результаты свидетельствуют о том, что серотонин и N0 действуют либо однонаправлено, либо эффект одного выражается через действие другого. Вторая половина наших исследований демонстрирует, что антитела к Са2+-связывающему белку S100 оказывают протекторное действие на формирование ДС, т.е. они могут снимать феномены или проявления тревожности.

Таким образом, полученные результаты, видимо, свидетельствуют, что дисбаланс Са2+-связывающего белка S100 может привести к торможению или изменению хода процессов, развивающихся при формировании пластических перестроек в организме.

Рис. 29. Модель действия 8100В на клеточную мембрану.

8100А12 ог г* 5100В2 ог

Бевшш т с

2+

Рис. 30. Схема строения димерной структуры белка Б100В с Са -связывающими участками.