Пренатальная дифференцировка и иннервация вкусового рецепторного аппарата языка человека

Куртова, Анастасия Игоревна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Пренатальная дифференцировка и иннервация вкусового рецепторного аппарата языка человека
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Пренатальная дифференцировка и иннервация вкусового рецепторного аппарата языка человека"

На правах рукописи

Куртова Анастасия Игоревна

ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА И ИННЕРВАЦИЯ ВКУСОВОГО РЕЦЕПТОРНОГО АППАРАТА ЯЗЫКА ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2014

1 С Г МП! -7П1.1 I . I „•,;( ¡.ои

005548917

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Профессор,

доктор биологических наук Савельев Сергей Вячеславович

Официальные оппоненты:

Руководитель группы клеточных взаимодействий ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН, профессор,

доктор медицинских наук Бархина Татьяна Григорьевна

Доцент кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова,

кандидат биологических наук, Липина Татьяна Владимировна

Ведущее учреждение:

Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова

Защита диссертации состоится «22» мая 2014 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 при ФГБУ «НИИ морфологии человека»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы д. 3.

РАМН

Автореферат разослан «/?» апреля 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Л. П. Михайлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Хеморецепторы являются наиболее древними сенсорными системами позвоночных животных, осуществляющими контроль над основными жизненными функциями организма. Вкусовой аппарат языка во многом определяет особенности питания, опосредованно влияет на массу тела и энергетический обмен млекопитающих. Несмотря на то, что изучение вкусового анализатора продолжается уже около ста лет, механизмы дифференцировки вкусовых луковиц в процессе внутриутробного развития млекопитающих до сих пор не выяснены. В настоящее время существует несколько гипотез, каждая из которых имеет экспериментальные подтверждения. Классическая точка зрения основывается на нейрогенной дифференцировке вторичных сенсорных органов, к которым также относятся вкусовые луковицы позвоночных (Zelena, 1994). Эксперименты с повреждением нервов языка хирургическим (Hosley et al., 1987; Nagato et al., 1995; Sollars, 2005) и химическим путем (Morris-Wiman et al., 1999) показывают, что вкусовые луковицы млекопитающих развиваются только при наличии в эпителии языка интактных афферентных нервных окончаний. Зависимость вкусового аппарата от иннервации также подтверждается клиническими данными; у человека при некоторых неврологических расстройствах наблюдается отсутствие или деградация вкусовых сосочков (Axelrod, Gold-von Simson, 2007; Gardiner et al., 2008; Rubin, Anderson, 2008). В течение эмбрионального развития человека зачатки вкусовых луковиц появляются только после проникновения нервных окончаний в эпителий языка (Witt, Reutter, 1996, 1998), что также подтверждает нейрогенную гипотезу. Однако, исследования развития вкусовой системы амфибий показали, что формирование вкусовых луковиц может происходить без участия иннервации (Barlow et al., 1996; Barlow, Northcutt, 1997). При этом дифференцировка клеток вкусовых луковиц является результатом местного эпителиально-мезенхимального взаимодействия, осуществляемого с помощью дифференциальной экспрессии сигнальных молекул и транскрипционных факторов (Parker et al., 2004). На

данный момент влияние нервных и эпителиально-мезенхимальных сигналов на эмбриональное развитие вкусового аппарата млекопитающих активно изучается на экспериментальных животных - крысах и мышах (Hall et al., 1999; Okubo et al., 2006; Thirumangalathu et al., 2009). В отличие от человека, морфологически обособленные вкусовые луковицы у грызунов появляются непосредственно перед рождением или в течение неонатального периода после формирования на поверхности языка вкусовых сосочков (Farbman, 1965; Farbman, Mbiene, 1991). В эпителии языка грызунов обнаружено множество факторов и сигнальных молекул, влияющих на дифференцировку клеток эпителиальных и нервных тканей: сигнальная молекула Sonic hedgehog (Shh), костные морфогенетические белки - Втр 2 и 4, белки семейства Noggin, фактор роста фибробластов FGF8, транскрипционный фактор Sox2 и лиганды сигнальной системы Wnt (Bitgood, McMahon, 1995; Hall et al., 1999; Jung et al., 1999; Zhou et al., 2006; Okubo et al., 2006). Но, несмотря на активные исследования, определение специфической роли каждого из факторов в регуляции развития вкусовых луковиц грызунов на данный момент затруднено из-за отсутствия маркеров для их клеток-предшественников и раннего морфогенеза сосочков языка, предшествующего их дифференцировке (Krimm, 2007).

Морфологически обособленные зачатки вкусовых луковиц (вкусовые примордии) у человека появляются в течение эмбрионального периода развития до формирования сосочков языка (Witt, Reutter, 1996, 1998). Большая часть исследований, проведенных на эмбриональном материале человека, посвящена оценке влияния иннервации на развитие вкусовых луковиц (Bradley, Stern, 1967; Witt, Reutter, 1996, 1998; Tamatsu, Gasser, 2004). Благодаря раннему появлению морфологически обособленных клеток-предшественников вкусовых луковиц, человек является удачным объектом для изучения влияния нервных и эпителиальных сигналов на дифференцировку вкусового аппарата языка, а полученные результаты могут быть применены к развитию других вторично-чувствующих рецепторов. Однако, активность эпителиальных сигнальных каскадов, определяющих дифференцировку эпителия языка грызунов, у человека

остается неизученной. Приведенные выше данные демонстрируют необходимость комплексных исследований механизмов дифференцировки клеток вкусовых луковиц на эмбриональном материале человека.

Цель исследования - изучение закладки, раннего эмбрионального развития, иннервации и дифференцировки вкусового рецепторного аппарата языка человека.

Задачи исследования:

1. Изучение эмбриональной закладки и первичной морфологической дифференцировки нервного аппарата языка человека, начиная с 4-й недели внутриутробного развития, с помощью иммуногистохимических маркеров к белкам нервной системы фз-тубулину, ЫЗЕ, Б100).

2. Гистологическое и иммуногистохимическое типирование вкусовых рецепторных комплексов и их предшественников в развитии вкусового аппарата языка человека.

3. Анализ топологических закономерностей распределения дифференцирующихся вкусовых луковиц в эпителии сосочков языка плодов человека.

4. Изучение морфогенеза вкусовых луковиц и сосочков языка человека с помощью маркеров пролиферации (Кл67, РСЫА) и антител к транскрипционным факторам, влияющим на дифференцировку нервных и эпителиальных клеток (Бох2, ИеигоО!).

5. Иммуногистохимическое и электронномикроскопическое исследование реснитчатых клеток эпителия ротовой полости эмбрионов и плодов человека.

Научная новизна

В работе с помощью иммуногистохимических методов детально исследовано формирование нервного аппарата языка эмбрионов человека с 3-й по 7-ю неделю внутриутробного развития. Впервые описано раннее проникновение нервных волокон в мезенхиму языка человека на 4-й неделе, а также формирование язычного нерва на 5-й неделе внутриутробного развития.

В клетках вкусовых примордиев, появляющихся на поверхности языка человека в конце 6-й недели развития, впервые обнаружена апикальная

локализация ядер, а также цитоплазматическая экспрессия нейрон-специфического белка Рз-тубулина.

С помощью ядерных пролиферативных маркеров Кл67 и РСЫА установлено, что клетки вкусовых луковиц и примордев человека с 6-й по 15-ю неделю внутриутробного развития обладают пролиферативной активностью.

В эпителии языка человека впервые исследована экспрессия транскрипционных факторов Бох2 и N6111001. На стадии закладки вкусовых примордиев (конец 6-й недели развития) специфическая экспрессия транскрипционных факторов Бох2 и Ыеиго01 в эпителии языка отсутствует. №игоВ1 обнаружен в зонах пролиферации эпителия языка и в клетках вкусовых луковиц, начиная с 8-й недели и на всех последующих исследованных сроках развития; Бох2 - с 10-й по 15-ю неделю выявлялся как в клетках вкусовых луковиц, так и в очагах пролиферации эпителия языка, а после 18-й недели только в клетках вкусовых луковиц.

Впервые изучено топологическое распределение и иннервация реснитчатых клеток в эпителии ротовой полости эмбрионов и плодов человека.

Научно-практическая значимость

Результаты работы представляют собой детальное описание формирования вкусового рецепторного аппарата языка человека и дополняют имеющиеся к настоящему моменту сведения. Полученные данные могут быть использованы при экстраполяции результатов исследований дифференцировки вкусовой системы экспериментальных животных на человека, а также при изучении морфогенеза других вторично чувствующих рецепторных органов.

Обнаруженные цитологические и иммуногистохимические особенности вкусовых примордиев человека позволят выявлять зоны их первичного обособления на ранних стадиях дифференцировки, протекающих до иннервации и специфической экспрессии транскрипционных факторов Бох2 и №игоВ1, а также могут быть использованы для типирования клеток-предшественников вкусовых луковиц у экспериментальных животных.

Результаты исследования экспрессии транскрипционных факторов 8ох2 и №иго01, показывают, что в течение эмбрионального и раннефетального периода внутриутробного развития человека возрастает опасность возникновения отклонений в развитии, связанная с нарушением процессов пролиферации и дифференцировки в эпителиальных дериватах ротовой полости. Выявленные особенности экспрессии данных факторов могут быть использованы при изучении механизмов развития онкологических заболеваний ротовой полости человека и их диагностике. Полученные результаты также необходимы для уточнения функций 8ох2 и ЫеигоЭ1 в разных эпителиальных тканях в течение пренатального онтогенеза человека.

Наличие реснитчатых клеток в эпителии ротовой полости эмбрионов и плодов человека необходимо учитывать при изучении развития и патологий эпителиальных дериватов первичной ротовой полости. Формирование описанных в тератологии врожденных кист языка, содержащих клетки с реснитчатыми структурами, может быть следствием нарушения процессов дифференцировки в эпителии языка в течение эмбрионального и раннего фетального периода развития.

Внедрение в практику в курс лекций на кафедре гистологии и биологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Положения, выносимые на защиту:

1. Вкусовые примордии структурно обособляются из эпителия языка эмбрионов человека в конце 6-й недели внутриутробного развития до начала его иннервации. Их ранняя дифференцировка характеризуется локализацией ядер в апикальной области клетки и цитоплазматической экспрессией нейрон-специфического Рз-тубулина.

2. Транскрипционные факторы Бох2 и №ипЮ1 не являются специфическими маркерами ранней дифференцировки вкусовых луковиц человека. 8ох2

выявляется в зонах пролиферации эпителия языка и во вкусовых луковицах с 10-й недели внутриутробного развития, а после 18-й недели только в клетках вкусовых луковиц и прилежащего к ним эпителия. №иго01 обнаружен как в клетках вкусовых луковиц и примордиев, так и в очагах пролиферации эпителия языка человека с 8-й по 21-ю неделю внутриутробного развития.

3. В эпителии ротовой полости эмбрионов и плодов человека, начиная с 7-й недели развития, выявляются реснитчатые клетки. Количество реснитчатых клеток в эпителии языка максимально в период с 10-й по 12-ю неделю внутриутробного развития, в течение которого их локализация не связана с морфогенезом вкусовых сосочков и желез языка.

Апробация работы

Основные результаты исследования были представлены на V Всероссийской научно-практической конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2013), XI международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: вопросы математики, физики, химии, биологии» (Москва, 2013), XI международной научно-практической конференции «Проблемы современной биологии» (Москва, 2014), межлабораторной конференции ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН (Москва, 2013).

Публикации материалов исследования

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, состоит введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, описания результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 26 рисунками и 4 таблицами. Список литературы включает 274 источника, из них 22 работы на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Работа выполнена на аутопсийном материале эмбрионов и плодов человека из коллекции лаборатории развития нервной системы ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН, патологоанатомических отделений ГКБ 72 и МОНИИАГ. Всего в работе было использовано 44 эмбриона и плода человека с 3-й по 21-ю неделю внутриутробного развития. При сборе образцов учитывали пол, гестационный возраст и теменно-копчиковую длину. Если клинические данные отсутствовали, то определение возраста проводили по теменно-копчиковой длине согласно морфометрическим таблицам (Пэттен, 1959). Для эмбрионов возрастом до 9-ти недель определялись стадии развития по коллекции института Карнеги (Савельев, 2002). Кроме того, в сравнительных целях был использован аутопсийный материал слизистой оболочки языка мужчины (72 года) и женщины (40 лет), полученный в патологоанатомическом отделении AHO ЦКБ Святителя Николая.

Материал фиксировали в 10% формалине. В зависимости от возраста и методов исследования для работы вырезали язык или нижнюю часть головы, отделенную горизонтальным разрезом на уровне верхней челюсти, для исследования ранних сроков развития выделяли голову или брали эмбрион целиком. При необходимости после препаровки материал помещали в декальцинирующую смесь, состоящую из 70° этилового спирта, глицерина и концентрированной азотной кислоты. Время декальцинации зависело от размера образцов и плотности костных и хрящевых компонентов и составляло от одной до трех недель.

Методы гистологического исследования. Материал обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и диоксане и заливали в гистомикс (Histomix, BioVitrum, Россия). Для ранних эмбрионов (3-7-я неделя развития) готовили сагиттальные срезы толщиной 5-10 мкм. Материал, взятый у эмбрионов и плодов после 7-й недели внутриутробного развития, а также из языка взрослых лиц, резался фронтально, толщина срезов 10 мкм. Каждый 10-й срез наклеивали на предметные стекла и окрашивали по Маллори. Для ряда образцов приготовлены

гистологические препараты, окрашенные с помощью импрегнации серебром по модифицированной методике Бильшовского-Гросс.

Методы иммуногистохимического исследования. При проведении иммуногистохимических реакций депарафинированные, гидратированные срезы обрабатывали 3%-м раствором Н2О2 в течение 20 мин для блокировки эндогенной пероксидазы. При необходимости проводили демаскирование антигенов с помощью кипячения в 0,01М цитратном буфере pH 6,0 в микроволновой печи в течение 5 мин с последующим остыванием в течение 20 мин. В целях блокировки неспецифического связывания срезы обрабатывали раствором Ultra V Block (Lab Vision) в течение 5 мин и ополаскивали в фосфатном буфере (PBS) pH 7,3-7,5.

В работе использовали первичные антитела к некоторым антигенам нервной системы: нейрон-специфическому р3-тубулину, нейрон-специфической енолазе (NSE), Са2+-связывающему нейроглиальному белку (S100). Также использовали антитела к ядерным антигенам пролиферирующих клеток KÍ67 и PCNA и транскрипционным факторам, влияющим на рост и развитие нервных и эпителиальных клеток, Sox2 и NeuroDl. В качестве вторых антител использовали готовую систему визуализации Ultra Vision LP Detection System HRP-Polymer (Lab Vision) согласно спецификации фирмы. На заключительном этапе срезы обрабатывали свежим раствором хромогена (DAB, Lab Vision).

Методы электронномикроскопического исследования. Для уточнения ультраструктуры апикальной поверхности обнаруженных в эпителии языка реснитчатых клеток, эпителий дорсальной поверхности языка двух плодов человека на 11-й и 12-й неделе внутриутробного развития был исследован с помощью методов электронной микроскопии.

При подготовке препаратов для трансмиссионного микроскопа из левой половины языков обоих плодов вырезали кусочки слизистой оболочки языка. Материал, фиксированный в 4% растворе параформальдегида, промывали в 0,1М фосфатном буфере (PBS) и дофиксировали в 2% растворе глутаральдегида. Затем кусочки промывали в PBS и дофиксировали 1% раствором OSO4 в течение 1,5 часов. После промывки в буфере материал обезвоживали в спиртах возрастающей

крепости: 30°, 50° и 70°. Затем кусочки контрастировали в 0,5% растворе уранилацетата на 70° спирте. После этого проводили дополнительное дегидратирование в 96° и 100° спирте и заливали в смесь эпона с аралдитом. Полутонкие и ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме 8800 Ultrotome III (LKB, Швеция). Полутонкие срезы окрашивали раствором толуидинового синего. Ультратонкие срезы дополнительно контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу (Reynolds, 1963) и просматривали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа Libral20 (Carl Zeiss, Германия).

При подготовке препаратов для сканирующего электронного микроскопа брали правые продольные половины языков обоих плодов. Материал дофиксировали в 2% глютаральдегиде, обрабатывали 1% раствором OsC>4 и обезвоживали по той же методике, что и в случае препаратов для трансмиссионного микроскопа. После дегидратирования материал пропитывали мономером гексаметилдисилазана (Sigma) и сушили на воздухе при комнатной температуре по методике Буравкова и др. (2011). Готовые препараты просматривали с помощью сканирующего электронного микроскопа Hitachi S-500 (Hitachi, Япония).

Методы микроскопического исследования гистологических и иммуногистохимических препаратов. Все полученные препараты оценивали визуально с помощью микроскопа Leica DM2500. Видеозахват осуществляли с помощью камеры Lomo ТСА-9.0С и программы Микро-View.

При просмотре гистологических препаратов описывали структуру слизистой оболочки языка всех образцов. Для плодов человека разных сроков развития отмечали степень зрелости вкусовых луковиц и сосочков, особенности их организации в зависимости от срока развития. При оценке иммуногистохимических препаратов отмечали наличие или отсутствие специфической иммунопозитивной реакции, распределение иммунореактивного материала в тканях языка, распределение иммунореактивного материала внутри клеток (ядерная или цитоплазматическая локализация). На основе серийных

срезов, окрашенных р3-тубулином, в программе Paint.Net были сделаны реконструкции иннервации языка для ранних сроков развития.

На препаратах, окрашенных по Маллори, с помощью иммерсионных обективов производили идентификацию и подсчет клеток с ресничками в эпителии языка 18-ти эмбрионов и плодов человека с 8-й по 16-ю неделю развития. Так как нашей задачей было сравнить относительное количество реснитчатых клеток на разных гестационных сроках, для подсчёта выбиралось по 7 случайных участков эпителия языка, содержащих 50 клеток в поверхностном слое эпителия для каждого исследованного образца. Результаты подсчета представлены количеством реснитчатых клеток на 50 клеток апикального слоя эпителия языка.

На сериях срезов языка 14-ти эмбрионов и плодов человека с 6-й по 13-ю неделю развития, иммуногистохимически окрашенных антителами к Рз-тубулину, производился подсчет вкусовых примордиев и вкусовых луковиц, расположенных в грибовидных сосочках. Чтобы избежать повторного подсчета одной вкусовой луковицы, подсчет во всех случаях производили на срезах с интервалом 200 мкм.

По результатам обоих подсчетов были построены графики в пакете программ ЗТАИБИСА.

Результаты исследования и их обсуждение Эмбриональное развитие иннервации языка человека

Дифференцировка нервного аппарата языка человека была исследована на кассированных сериях срезов эмбрионов с 3-й по 7-ю неделю внутриутробного развития с помощью антител к Рз-тубулину. Проведенное исследование показало, что Рз-тубулин является чувствительным иммуногистохимическим нейромаркером, позволяющим выявлять нервные окончания на ранних стадиях эмбрионального развития человека. Антитела к Б100 окрашивали только часть волокон, расположенных в мезенхиме языка, а интенсивность иммунопозитивной реакции на на данных сроках развития была низкой.

Установленные сроки формирования чувствительных ганглиев и главных стволов черепно-мозговых нервов эмбрионов человека совпадают с результатами других исследователей (Streeter, 1905, 1908; Gasser, 1967; O'Rahilly, Müller, 1984). Применение иммуногистохимических методов позволило обнаружить в мезенхиме языка эмбрионов человека волокна V, VII, IX и XII черепно-мозговых нервов уже на 4-й неделе развития (14-я стадия), что на неделю раньше, чем в работах, выполненных с помощью техники импрегнации серебром (Vij, Kanagasuntheram, 1972; Sataloff, 1990; Tamatsu, Gasser, 2004). Время появления нервных волокон в мезенхиме языка эмбрионов человека, обнаруженных с помощью антител к Рз-тубулину, совпадает с результатами исследований иннервации языка мышей и крыс, выполненных с помощью других иммуногистохимических нейромаркеров (Mbiene, Mistretta, 1997; Mbiene, 2004).

С помощью иммуногистохимических реакций на фронтальных и сагиттальных срезах эмбрионов человека удалось показать образование язычного нерва путем слияния волокон барабанной струны и язычной ветви тройничного нерва на 15-й стадии развития (5-я неделя). По данным литературы волокна барабанной струны объединяются с волокнами тройничного нерва в язычный нерв к 19-20-й стадии (7-я неделя), что совпадает с формированием подъязычного ганглия рядом с главным стволом нерва (Sataloff, 1990; Tamatsu, Gasser, 2004). В проведенном исследовании подъязычный ганглий обнаружен после образования язычного нерва в конце 18-й стадии развития (6-я неделя), что совпадает с результатами исследования дифференцировки нейронов подъязычного ганглия человека (Crouse, Cucinotta, 1965). Полученные данные также подтверждаются результатами трассирования нервов языка эмбрионов мышей, которые показали, что аксоны барабанной струны появляются в ростральных частях языка сразу после его формирования на стадии El 1.5 (Mbiene, 2004). Наличие волокон язычного нерва в мезенхиме языка на ранних стадиях развития языка мыши и человека свидетельствуют о важной морфогенетической роли данного нерва.

Волокна язычного нерва приближаются к базальной мембране языка к концу 6-й недели развития, и проникают в эпителий языка на 7-й неделе

внутриутробного развития под зачатками вкусовых луковиц - вкусовыми примордиями. Язычная ветвь IX нерва достигает рострального края задней трети языка на 5-й неделе развития и проникает в эпителий языка в базальной части зачатка медиального желобоватого сосочка на 7-й неделе развития.

Формирование вкусовых примордиев в эпителии языка человека Первые вкусовые примордии обнаружены в эпителии языка человека в конце 6-й недели развития (18-19 стадия), а к 7-й неделе (19 стадия) они покрывают всю его дорсальную поверхность. Большая часть исследований описывает начало дифференцировки вкусовых примордиев в эпителии языка человека только с 8-й недели развития (Witt, Reutter, 1996, 1998; Tamatsu, Gasser, 2004). Полученные хронологические различия, скорее всего, являются следствием отсутствия маркеров для клеток вкусовых примордиев, позволяющих выявлять эти структуры на ранних сроках развития. Отличительной особенностью обнаруженных в конце 6-й недели развития вкусовых примордиев от других клеток эпителия языка является удлинение тел клеток и локализация ядер- в апикальной области клетки. При этом тела клеток примордиев иммунопозитивны к Рз-тубулину, который является нейрон-специфическим белком цитоскелета. В медиальной части зачатка желобоватого сосочка в конце 6-й недели развития также присутствуют иммунопозитивные к Рз-тубулину клетки, но из-за сильного утолщения эпителия идентифицировать среди них вкусовые примордии не удалось. К 7-й неделе на апикальной части зачатка формируется примордий, и иммунопозитивная реакция на р3-тубулин локализуется только в его клетках. Локализация иммунопозитивной окраски на р3-тубулин совпадает с экспрессией нейротрофина BDNF, выявленной в эпителии языка эмбрионов человека на тех же сроках развития (Nostrat et al., 2000). На этапе появления первых примордиев (конец 6-й недели развития) нервных окончаний, подходящих к их клеткам выявлено не было. Возможно, иммунопозитивная реакция на Рз-тубулин в их клетках, также как BDNF (Nostrat et al., 2000), выявляет начальные стадии их дифференцировки, которые индуцируются местными межклеточными

взаимодействиями, либо паракриниым влиянием нервных окончаний, расположенных под эпителием языка. При использовании других нейромаркеров (NSE, PGP 9.5) тела клеток вкусовых примордиев человека были к ним иммунонегативны (Witt, Reutter, 1998), что может объяснить более позднее выявление вкусовых примордиев в эпителии языка человека данными авторами.

• Развитие вкусовых сосочков человека Морфогенез вкусовых сосочков у человека начинается на 5-й неделе внутриутробного развития, когда в районе слепого отверстия языка образуется эпителиальная плакода желобоватого сосочка. В эпителии плакоды нервные окончания не обнаружены, но волокна языкоглоточного нерва приближаются к базальной мембране эпителия под основанием плакоды. Полученные результаты совпадают с начальными этапами морфогенеза желобоватых сосочков грызунов, у которых формирование эпителиальных плакод протекает без участия иннервации под влиянием эпителиальных и мезенхимальных факторов дифференцировки (Morris-Wiman et al, 1999; Kim et al., 2009). Стадия эпителиальной плакоды у человека описана впервые. Несмотря на отличия в ранней дифференцировке грибовидных и желобоватых сосочков человека в конце 6-й недели внутриутробного развития, на 7-й неделе развития на апикальной поверхности сосочков обоих типов присутствует один вкусовой примордий. На 8-й неделе развития в районе формирования листовидных сосочков обнаружены вкусовые примордии, часть из которых иннервируется IX нервом, а остальные волокнами язычного нерва. Локализация и смешанная иннервация данных примордиев позволяют отнести их к листовидным сосочкам, т.к. чувствительная иннервация листовидных сосочков взрослых людей осуществляется как волокнами IX нерва, так и волокнами язычного нерва (Doty et al., 2009). Таким образом, результаты проведенного исследования показывают, что начальные этапы формирования всех типов вкусовых сосочков человека протекают с 5-й по 9-ю неделю развития, и в течение этого периода для всех формирующихся сосочков обязательно наличие одного вкусового примордия, расположенного на апикальной

поверхности. Тела клеток вкусовых примордиев на данной стадии развития иммунопозитивны к Рз-тубулину, иммунонегативны к S100, а при реакции на NSE в некоторых примордиях выявляются единичные иммунопозитивные клетки, наличие которых также отмечено рядом авторов в зрелых вкусовых луковицах человека и других млекопитающих (Yoshie et al., 1988; Astbäck et al., 1995).

С 10-й недели внутриутробного развития на дорсальной поверхности языка человека начинается активный морфогенез сосочков, в ходе которого вкусовые сосочки разных типов приобретают характерные для них структуры. Грибовидные сосочки образованы выростами собственной пластинки языка, в эпителии которых расположены вкусовые луковицы. С 10-й по 14-ю неделю развития в грибовидных сосочках человека присутствует по одной вкусовой луковице, при этом в эпителии языка вкусовых примордиев, характерных для предыдущих стадий развития, не выявлено. Полученные данные совпадают с результатами других исследований (Witt, Reutter, 1996, 1997; 1998). Если все вкусовые луковицы грибовидных сосочков являются потомками вкусовых примордиев, то общее количество вкусовых луковиц в грибовидных сосочках до 14-й недели развития должно совпадать с числом вкусовых примордиев, появившихся на поверхности передних двух третей языка до 10-й недели развития. Для проверки этой гипотезы был произведен подсчет всех вкусовых луковиц и примордиев, расположенных в эпителии грибовидных сосочков с 6-й по 13-ю неделю развития (Рис.1).

Результаты подсчета показали, что количество вкусовых луковиц на 13-й неделе развития в два раза превосходит количество вкусовых примордиев на 9-й неделе (Рис.1). Следовательно, половина вкусовых луковиц грибовидных сосочков языка на 13-й неделе развития, являются либо результатом миграции клеток вкусовых примордиев из других грибовидных сосочков, либо производными дифференцировки других эмбриональных источников.

Рис.1. Общее количество вкусовых примордиев и луковиц в грибовидных сосочках эмбрионов и плодов человека с 6-й по 13-ю неделю развития

С 15-й недели развития в некоторых грибовидных сосочках присутствует по 2-3 вкусовых луковицы, при этом они расположены вплотную, либо разделены тонким слоем эпителия.

Формирование листовидных сосочков начинается с образования складок на латеральных поверхностях языка на 10-й неделе внутриутробного развития. В эпителии латеральных стенок листовидных сосочков вкусовые луковицы обнаружены на 11-12-й неделе развития, и в течение дальнейшего роста сосочков в этой зоне формируются скопления вкусовых луковиц, характерные для листовидных сосочков взрослых лиц.

В желобоватых сосочках на 10-й неделе внутриутробного развития начинается формирование желоба, в ходе которого единичная апикально расположенная вкусовая луковица может смещаться на латеральную поверхность сосочка или разделяться на две. Количество желобоватых сосочков на поверхности языка человека к 10-й неделе развития достигает 6-9 штук. После 10-й недели развития вкусовые луковицы в желобоватых сосочках обнаружены как на апикальной поверхности, так и в стенках желоба, где они образуют большие скопления. Для зрелых желобоватых сосочков человека характерно

латеральное расположение вкусовых луковиц в эпителии стенок желоба (Kusakabe et al., 1998). В литературе существует несколько гипотез, объясняющих механизм перемещения вкусовых луковиц с апикальной поверхности желобоватых сосочков в стенки желоба в процессе внутриутробного развития. По одной из версий апикальные вкусовые луковицы в процессе развития исчезают и замещаются латеральными (Witt, Reutter, 1997), но тогда не понятна их функция в течение ранних этапов развития, т.к. все вкусовые луковицы языка готовы к рецепции только с 15-й недели (Witt, Reutter, 1996). Другие авторы высказали гипотезу, что формирующиеся вкусовые клетки обладают способностью к миграции и в процессе развития они перемещаются из апикального положения в стенки желоба (Hirata, Kanaseki, 1989; Hosley et al., 1987; Zhang et al., 1995). Гипотеза о миграции клеток может объяснить образование новых вкусовых луковиц в желобоватых и листовидных сосочках, а также увеличение количества вкусовых луковиц в грибовидных сосочках после 15-й недели развития, т.к. новые вкусовые луковицы появляются в пределах одного сосочка рядом с уже сформированными. Но механизм появления вкусовых луковиц в новых грибовидных сосочках, появляющихся после 10-й недели развития, остается неизвестным и может объясняться как миграцией клеток вкусовых луковиц и примордиев из других сосочков, так и наличием в эпителии языка других клеток-предшественников.

Вкусовые сосочки человека на всех стадиях развития хорошо иннервированы. Нервное сплетение в желобоватых сосочках начинает формироваться на 8-9-й неделе развития, а в грибовидных и листовидных - на 10-й неделе. Ганглионарные клетки выявляются в нервном сплетении желобоватых сосочков на 10-й неделе, а в листовидных сосочках на 13-й неделе развития. Клетки желез, расположенных под желобоватыми и листовидными сосочками, иммунопозитивны к S100. S100 широко применяется как маркер клеток нейро-эктодермального происхождения (Marettova, Maretta, 2004), однако, также S100 выявляется в секреторных клетках (Lauboeck, Egerbacher, 1997; Marettova et al., 2001). Во вкусовых луковицах плодов человека экспрессия S100 не обнаружена.

Пролиферативная активность клеток эпителия языка человека

Экспрессия Ki67 и PCNA обнаружена в эпителии языка всех исследованных эмбрионов и плодов человека. До 15-й недели внутриутробного развития количество иммунореактивных к обоим маркерам ядер совпадало, а после 15-й недели иммунопозитивных ядер к Ki67 было заметно меньше, чем к PCNA. Полученные результаты могут быть объяснены различными функциями данных белков. PCNA участвует не только в пролиферации клеток, но и в репарации ДНК после ее повреждения, что делает данный антиген условно специфичным к клеточному циклу, так как восстановление ДНК может осуществляться в фазе покоя (Bromley et al., 1996). Различия в экспрессии Ki67 и PCNA в эпителии языка человека после 15-й недели развития, по-видимому, являются следствием завершения периода активной пролиферации эпителия и выходом части клеток в фазу покоя.

До 15-й недели развития в клетках вкусовых примордиев и вкусовых луковиц выявляются иммунопозитивные к Ki67 и PCNA ядра, т.е. дифференцирующиеся клетки вкусовых луковиц человека способны к пролиферации. На 15-й неделе экспрессия маркеров пролиферации в клетках вкусовых луковиц слабеет, и к 16-й неделе исчезает, оставаясь только в клетках не вкусового эпителия сосочков. Многочисленные исследования показывают, что клетки зрелых вкусовых луковиц, в т.ч. и базальные клетки, находятся на постмитотической стадии клеточного цикла и не экспрессируют маркеры пролиферации, такие как Ki67 и PCNA (Hirota et al., 2001; Miura et al., 2004). Обновление вкусовых луковиц происходит за счет перигеммальных клеток, которые окружают вкусовые луковицы, обладают митотической активностью и иммунопозитивны к Ki67 и PCNA (Hirota et al., 2001; Miura et al., 2004). Характерная для зрелых вкусовых луковиц экспрессии маркеров пролиферации обнаружена в эпителии вкусовых сосочков плодов человека после 15-й недели внутриутробного развития. По данным литературы вкусовые луковицы человека заканчивают свою дифференцировку на 15-й неделе внутриутробного развития (Witt, Reutter, 1996). Потеря способности к пролиферации после 15-й недели

развития, по-видимому, является следствием окончания дифференцировки вкусовых луковиц и выходом их клеток в фазу покоя клеточного цикла.

Сравнительная характеристика экспрессии транскрипционных факторов Sox2 и NeuroDl в эпителии языка человека Экспрессия транскрипционных факторов Sox2 и NeuroDl в эпителии языка эмбрионов и плодов человека была изучена впервые. На ранних стадиях развития (до 10-й недели) четкая иммунопозитивная реакция на Sox2 в эпителии языка не обнаружена, что может быть следствием низкого уровня экспрессии данного маркера. Экспрессия NeuroDl обнаружена у всех исследованных эмбрионов и плодов человека, начиная с 8-й недели внутриутробного развития. На ранних стадиях развития (до 10-й недели) иммунопозитивные к NeuroDl ядра выявлялись во всех слоях эпителия, в. т.ч. в клетках вкусовых примордиев. Полученные результаты показывают отсутствие специфической экспрессии транскрипционных факторов Sox2 и NeuroDl в клетках вкусовых примордиев языка человека.

Высокий уровень экспрессии Sox2 в эпителии языка человека наблюдается с 10-й по 15-ю неделю развития. Реакция на Sox2 и NeuroDl в течение этого периода локализована в клетках вкусовых луковиц, а также в не вкусовом эпителии языка. Наибольшее количество иммунопозитивных к Sox2 и NeuroDl ядер расположено в базальном слое эпителия языка, а также в растущих базальных частях сосочков, т.е. в местах активной пролиферации и дифференцировки эпителиальных клеток. В течение дальнейших исследованных стадий развития (до 21-й недели) характер и локализация экспрессии NeuroDl не изменяется, а реакция на Sox2 в эпителии языка слабеет и к 18-й неделе остается только в клетках вкусовых луковиц и окружающего их эпителия. Такая локализация экспрессии соответствует распределению Sox2 в клетках вкусовых луковиц взрослых мышей (Suzuki, 2008). В ходе исследования вкусовых сосочков взрослых людей реакция на оба транскрипционных фактора в большей части эпителия отсутствовала, но были выявлены иммунопозитивные к Sox2 и NeuroDl ядра в некоторых клетках вкусовых луковиц.

Таким образом, результаты проведенного исследования показывают, что Sox2 и NeuroDl регулируют дифференцировку всего эпителия языка человека, включая морфогенез вкусовых сосочков, а также участвуют в обновлении клеток вкусовых луковиц в позднем постнатальном онтогенезе человека. При этом на стадии вкусовых примордиев дифференциальной экспрессии Sox2 и NeuroDl не наблюдается. Результаты работ, проведенных на мышах, показывают, что Sox2 и NeuroD специфически экспрессируются клетками вкусовых луковиц и определяют их дифференцировку (Suzuki et al., 2002; Okubo et al., 2006, 2009). Выявленные различия в экспрессии транскрипционных факторов у человека и мыши могут объясняться особенностями развития вкусового аппарата языка мышей. Вкусовые луковицы у мышей появляются в эпителии языка только после завершения морфогенеза вкусовых сосочков (Farbman, Mbiene, 1991), т.е. когда экспрессия Sox2 и NeuroDl в не вкусовом эпителии языка снижается, оставаясь на высоком уровне только в клетках вкусовых луковиц.

Реснитчатые клетки в эпителии ротовой полости плодов человека

При исследовании срезов языка плодов человека, импрегнированных серебром, в поверхностном слое эпителия были обнаружены клетки с ресничками, направленными в ротовую полость. Для уточнения ультраструктуры апикальной поверхности обнаруженных клеток, дорсальный эпителий языка плодов человека был исследован с помощью методов электронной микроскопии. Результаты исследования показали, что от апикальной поверхности этих клеток отходят многочисленные реснички, аксонема которых состоит из 9 периферических дублетов микротрубочек и двух центральных микротрубочек-синглетов. Подобные клетки были обнаружены другими исследователями в эпителии желоба желобоватых сосочков языка взрослого человека (Mattern et al., 1970) и некоторых млекопитающих - крысы (Toyoshima, Shimamura, 1979) и коалы (Kobayashi et al., 2003).

недели развития

Рис. 2. Количество реснитчатых клеток в эпителии языка эмбрионов и плодов человека с 8-й по 16-ю неделю развития

С помощью иммерсионных объективов было исследовано распределение реснитчатых клеток в эпителии ротовой полости эмбрионов и плодов человека, а также произведен подсчет реснитчатых клеток в эпителии языка для каждой стадии развития (Рис.2). Единичные реснитчатые клетки в эпителии ротовой полости человека появляются на 7-й неделе внутриутробного развития и достигают своего максимального количества в период с 10-й по 12-ю неделю развития (Рис. 2). Морфогенез вкусовых сосочков и желез языка на ранних этапах внутриутробного развития человека (с 9-й по 12-ю неделю) не отражается на локализации реснитчатых клеток, которые на данных сроках равномерно распределены в эпителии языка и мягкого нёба. С 13-й недели развития, количество реснитчатых клеток в эпителии языка человека начинает сокращаться (Рис.2), а к 17-й неделе они остаются только рядом с протоками желёз в желобоватых и листовидных сосочках, как и у исследованных взрослых млекопитающих (Mattern et al., 1970; Toyoshima et al., 1979). В желобоватых сосочках взрослого человека и млекопитающих реснитчатые клетки редки и

ассоциированы с протоками желез и вкусовыми луковицами (Mattern et al., 1970;

Toyoshima, Shimamura, 1979; Kobayashi et al., 2003). На основании такого расположения этих клеток, исследователи выделяют три основных функции реснитчатых клеток: очищение вкусовых органов, поддержание циркуляции вкусовых стимулов и увлажнение вкусовой поры (Toyoshima, Shimamura, 1979). Вкусовые луковицы у человека готовы к функционированию к 15-й неделе внутриутробного развития, когда во вкусовой ямке появляется слизь, без которой невозможна вкусовая рецепция, а первые вкусовые поры появляются только на 13-й недели развития (Witt, Reutter, 1996). Исходя из этого, реснитчатые клетки в эпителии языка плодов человека могут участвовать в очищении вкусовой поры только после 13-й недели и нутр иутроб по го развития, а необходимость в этом появляется только с 15-й недели развития. Таким образом, функция реснитчатых клеток в ротовой полости человека до 15-й недели развития не связана с обеспечением условий для рецепции вкусовых стимулов.

На 10-11-й неделе внутриутробного развития в эпителии языка плодов человека обнаружены нервные окончания, ассоциированные с реснитчатыми клетками. После 13-й недели таких нервных окончаний обнаружить не удалось, что может быть следствием уменьшения общего количества клеток и, соответственно, уменьшением вероятности попадания на срез ассоциированных с ними нервных окончаний. Данные по иннервации реснитчатых клеток в эпителии языка взрослого человека и других млекопитающих в литературе отсутствуют, поэтому является ли наличие иннервации характерным признаком стадии развития реснитчатых клеток, совпадающей с их наибольшей численностью, установить не удалось. При иммуногистохимическом исследовании эпителия языка плодов человека с антителами к NSE наблюдалась позитивная реакция в телах реснитчатых клеток, особенно интенсивная с 8-й по 12-ю неделю развития. Экспрессия NSE является одним из признаков нейроэвдокринных клеток (Bonner et al., 2000). Таким образом, пик численности реснитчатых клеток сопровождается их иннервацией и цитоплазматической экспрессией NSE, что может свидетельствовать об участии этих клеток в регуляции дифференцировки клеток окружающего их эпителия.

выводы

1. В результате комплексного гистологического и иммуногистохимического исследования ранних эмбриональных закладок вкусовых луковиц обнаружена их автогенетическая дифференцировка. Вкусовые примордии структурно обособляются из эпителия языка человека в конце 6-й недели внутриутробного развития до начала его иннервации и дифференциальной экспрессии транскрипционных факторов 8ох2 и КеигоБ1.

2. В базальном слое эпителия языка обнаружен феномен перемещения ядер в апикальную область клетки, маркирующий зоны первичного обособления вкусовых примордиев. Морфологическая дифференцировка примордиев сопровождается экспрессией нейрон-специфического Рз-тубулина, которая позволяет выявить эмбриональные вкусовые структуры с конца 6-й недели внутриутробного развития человека.

3. Зачатки грибовидных, листовидных и желобоватых сосочков на 9-й неделе развития имеют по одному вкусовому примордию на апикальной поверхности. Вкусовые примордии выявляются с помощью р3-тубулина, а Б100, ИБЕ и транскрипционные факторы Бох2 и Кеиго01 не проявляют специфичности к данной клеточной популяции.

4. Дифференцировка вкусовых луковиц в пределах одного вкусового сосочка языка происходит разделением эмбриональной закладки на две и более частей или перемещением развивающихся вкусовых луковиц в процессе морфогенеза сосочков. Вкусовые луковицы в грибовидных сосочках, появившихся после 10-й недели развития, могут быть следствием миграции клеток вкусовых примордиев или результатом дифференцировки других эмбриональных источников.

5. Пролиферативная активность клеток вкусовых луковиц и примордиев человека, выявленная при помощи антител к ядерным пролиферативным белкам (Кл67, РСЫА), сохраняется с 6-й по 15-ю неделю внутриутробного развития.

6. В эпителии языка плодов человека впервые описана экспрессия транскрипционных факторов 5ох2 и №иго01. С 10-й по 15-ю неделю развития 8ох2 выявляется в зонах пролиферации эпителия языка и во вкусовых луковицах,

а после 18-й недели только в клетках вкусовых луковиц и прилежащего эпителия. NeuroDl обнаружен как в клетках вкусовых луковиц и примордиев, так и в очагах пролиферации эпителия языка с 8-й по 21-ю неделю развития.

7. Иммуногистохимическими методами описана динамика проникновения волокон V, VII, IX и XII черепно-мозговых нервов в мезенхиму языка человека. Перечисленные нервы проникают в язык одновременно на 14-й стадии развития (30-32-й день), тогда как язычный нерв (композитная ветвь V и VII нервов) формируется только на 15-й стадии развития (33-36-й день).

8. На поверхности языка и в эпителии ротовой полости эмбрионов и плодов человека обнаружены реснитчатые клетки, ультраструктура которых сходна с организацией клеток мерцательного эпителия. Эти клетки выявлены с 7-й по 21-ю неделю внутриутробного развития и представляют собой ранее неизвестную особенность онтогенеза человека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК для защиты диссертаций:

1. Куртова А.И., Черников В.П., Савельев C.B. Ранний онтогенез реснитчатых клеток в ротовой полости человека // Онтогенез. - 2013. - Т. 44. - №6. - С. 389-

2. Куртова А.И. Иммуногистохимическое исследование распределения транскрипционного фактора Sox2 в эпителии языка эмбрионов и плодов человека // Современные технологии в медицине. - 2014. - Т. 6. - № 1. - С. 23-26.

Статьи, опубликованные в рецензируемых научных зкурналах, продолжающихся изданиях и сборниках:

3. Куртова А.И., Савельев C.B. Первичная эмбриональная иннервация желобоватых сосочков языка плодов человека // Клиническая и экспериментальная морфология. - 2013. — Т.З. - №7. - С. 33-37.

4. Куртова А.И. Экспрессия транскрипционного фактора NeuroDl в эпителии языка плодов человека // Материалы V Всероссийской научно-практической конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина». Москва. - 2013. -

5. Куртова А.И. Эмбриональное развитие иннервации языка человека // Материалы XI международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: вопросы математики, физики, химии, биологии». Москва. -2013.-С. 66-71.

6. Куртова А.И. Морфогенез и иннервация листовидных сосочков языка плодов человека // Материалы XI Международной научно-практической конференции «Проблемы современной биологии». Москва. - 2014. - С. 61-63.

395.

С. 44.

Соискатель

А.И. Куртова

Заказ № 40-А/04/2014 Подписано в печать 14.04.14 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

(П?П 00° "ЦиФРовичок"'тел- (495) 797-75-76 ■г -У/ www.cfr.ru; е-таП:info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Куртова, Анастасия Игоревна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук

На правах рукописи

04201457203

КУРТОВА Анастасия Игоревна

ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА И ИННЕРВАЦИЯ ВКУСОВОГО РЕЦЕПТОРНОГО АППАРАТА ЯЗЫКА ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03.03.04 - клеточная биология, цитология,

гистология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель - д.б.н., профессор САВЕЛЬЕВ С.В.

Москва 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

1.ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................5

1.1. Актуальность темы.......................................................................................5

1.2. Цель и задачи исследования........................................................................7

1.3. Положения, выносимые на защиту.............................................................8

1.4. Научная новизна...........................................................................................8

1.5. Научно-практическая значимость...............................................................9

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................11

11.1. Строение дорсальной поверхности языка млекопитающих.................11

II. 1.1. Характеристика сосочков языка млекопитающих..........................11

Н.1.2.Структура и функции вкусовых луковиц.........................................15

11.2. Иннервация языка человека и млекопитающих.....................................17

11.3. Развитие вкусового аппарата языка млекопитающих...........................20

И.3.1.Формирование языка в фило- и эмбриогенезе.................................20

И.3.2. Эмбриональное развитие иннервации языка...................................24

II.3.3. Онтогенез вкусовых луковиц и сосочков млекопитающих...........28

11.3.3.1. Развитие вкусовых луковиц и сосочков человека.......................30

11.3.3.2. Развитие вкусовых луковиц и сосочков грызунов.......................34

11.4. Заключение.................................................................................................38

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...................................................................41

III. 1. Характеристика материала......................................................................41

III.2. Методы исследования..............................................................................42

111.2.1. Методы гистологического исследования.......................................42

111.2.2. Методы иммуногистохимического исследования.........................42

111.2.3. Методы электронномикроскопического исследования................44

Ш.2.4. Методы микроскопического исследования гистологических и иммуногистохимических препаратов.............................................................45

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ..........................................................................................54

1У.1. Развитие языка человека с 3-й по 7-ю неделю эмбриогенеза.............54

IV. 1.1. Гистологическая дифференцировка эпителия языка....................54

IV. 1.2. Формирование нервного аппарата языка.......................................61

14.2. Морфогенез и иннервация вкусовых луковиц и сосочков языка плодов человека.................................................................................................70

1У.З. Оценка пролиферативной активности эпителия языка плодов человека с помощью маркеров Кл67 и РСЫА................................................86

ГУ.4. Выявление эпителиальных транскрипционных факторов в процессе дифференцировки вкусовых центров языка человека..................................91

ГУ.4.1. Экспрессия 8ох2 в эпителии языка плодов человека...................91

Г/.4.2. Экспрессия №иго01 в эпителии языка плодов человека.............94

IV.5. Онтогенез реснитчатых клеток в эпителии ротовой полости эмбрионов и плодов человека..........................................................................96

V. ОБСУЖДЕНИЕ........................................................................................103

V. 1. Эмбриональное развитие иннервации языка человека......................103

У.2. Формирование вкусовых примордиев в эпителии языка человека ... 105

У.З. Развитие вкусовых сосочков человека..................................................108

У.4. Пролиферативная активность клеток вкусовых луковиц и эпителия языка человека с 3-й по 21-ю неделю внутриутробного развития............113

У.5. Сравнительная характеристика экспрессии транскрипционных факторов 8ох2 и Кеиго01 в эпителии языка плодов человека...................115

У.6. Реснитчатые клетки в эпителии ротовой полости человека и млекопитающих...............................................................................................120

VI. ВЫВОДЫ.................................................................................................125

VII. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ....................................127

1.ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность темы

Хеморецепторы являются наиболее древними сенсорными

системами позвоночных животных, осуществляющими контроль над

основными жизненными функциями организма. Вкусовой аппарат языка

во многом определяет особенности питания, опосредованно влияет на

массу тела и энергетический обмен млекопитающих. Несмотря на то, что

изучение вкусового анализатора продолжается уже около ста лет,

механизмы дифференцировки вкусовых луковиц в процессе

внутриутробного развития млекопитающих до сих пор не выяснены. В

настоящее время существует несколько гипотез, каждая из которых имеет

экспериментальные подтверждения. Классическая точка зрения

основывается на нейрогенной дифференцировке вторичных сенсорных

органов, к которым также относятся вкусовые луковицы позвоночных

(Zelena J., 1994). Эксперименты с повреждением нервов языка

хирургическим (I-Iosley М. et al., 1987; Nagato Т. et al., 1995; Sollars S.I.,

2005) и химическим путем (Morris-Wiman J. et al., 1999b) показывают, что

вкусовые луковицы млекопитающих развиваются только при наличии в

эпителии языка интактных афферентных нервных окончаний. Зависимость

вкусового аппарата от иннервации также подтверждается клиническими

данными; у человека при некоторых неврологических расстройствах

наблюдается отсутствие или деградация вкусовых сосочков (Axelrod F.B.,

Gold-von Simson G., 2007; Gardiner J. et al., 2008; Rubin В. Y., Anderson S.L.,

2008). В процессе эмбрионального развития человека зачатки вкусовых

луковиц появляются только после проникновения нервных окончаний в

эпителий языка (Witt М., Reutter К., 1996, 1998), что также подтверждает

нейрогенную гипотезу. Однако исследования развития вкусовой системы

амфибий показали, что формирование вкусовых луковиц может

происходить без участия иннервации (Barlow L.A. et al., 1996; Barlow L.A.,

Northcutt R.G., 1997). При этом дифференцировка клеток вкусовых

луковиц является результатом местного эпителиально-мезенхимального взаимодействия, осуществляемого с помощью дифференциальной экспрессии сигнальных молекул и транскрипционных факторов (Parker М.А. et al., 2004). На данный момент влияние нервных и эпителиально-мезенхимальных сигналов на эмбриональное развитие вкусового аппарата млекопитающих активно изучается на экспериментальных животных -крысах и мышах (Hall J.M. et al., 1999; Okubo Т. et al., 2006; Thirumangalathu S. et al., 2009). В отличие от человека, морфологически обособленные вкусовые луковицы у грызунов появляются непосредственно перед рождением или в течение неонатального периода после формирования на поверхности языка вкусовых сосочков (Farbman A.I., 1965; Farbman A.I., Mbiene J.P., 1991). В эпителии языка грызунов обнаружено множество факторов и сигнальных молекул, влияющих на дифференцировку клеток эпителиальных и нервных тканей: сигнальная молекула Sonic hedgehog (Shh), костные морфогенетические белки - Вшр 2 и 4, белки семейства Noggin, фактор роста фибробластов FGF8, транскрипционный фактор Sox2 и лиганды сигнальной системы Wnt (Bitgood M.J., McMahon А.Р., 1995; Hall J.M. et al., 1999; Jung И. et al., 1999; Zhou Y. et al, 2006; Okubo Т. et al., 2006). Но, несмотря на активные исследования, определение специфической роли каждого из факторов в регуляции развития вкусовых луковиц грызунов на данный момент затруднено из-за отсутствия маркеров для их клеток-предшественников и раннего морфогенеза сосочков языка, предшествующего их дифференцировке (Krimm R.F., 2007).

Морфологически обособленные зачатки вкусовых луковиц

(вкусовые примордии) у человека появляются в течение эмбрионального

периода развития до формирования сосочков языка (Witt М., Reutter К.,

1996, 1998). Большая часть исследований, проведенных на человеческом

эмбриональном материале, посвящена оценке влияния иннервации на

развитие вкусовых луковиц (Bradley R.M., Stern I.B., 1967; Witt М., Reutter

К., 1996, 1998; Тап^эи У., ваэзег Я.Р., 2004). Благодаря раннему появлению морфологически обособленных клеток-предшественников вкусовых луковиц, человек является удачным объектом для изучения влияния нервных и эпителиальных сигналов на дифференцировку вкусового аппарата языка, а полученные результаты могут быть применены к развитию других вторично-чувствующих рецепторов. Однако, активность эпителиальных сигнальных каскадов, определяющих дифференцировку эпителия языка грызунов, у человека остается неизученной. Приведенные выше данные демонстрируют необходимость комплексных исследований механизмов дифференцировки клеток вкусовых луковиц на эмбриональном материале человека.

1.2. Цель и задачи исследования

Целью исследования являлось изучение закладки, раннего эмбрионального развития, иннервации и дифференцировки вкусового рецепторного аппарата языка человека.

В задачи исследования входило:

4. Изучение морфогенеза вкусовых луковиц и сосочков языка человека с помощью маркеров пролиферации (Кл67, РСМА) и антител к транскрипционным факторам, влияющим на дифференцировку нервных

и эпителиальных клеток (8ох2, КеигоВ1).

1.3. Положения, выносимые на защиту

2. Транскрипционные факторы Бох2 и Ыеиго01 не являются специфическими маркерами ранней дифференцировки вкусовых луковиц человека. 8ох2 выявляется в зонах пролиферации эпителия языка и во вкусовых луковицах с 10-й недели внутриутробного развития, а после 18-й недели только в клетках вкусовых луковиц и прилежащего к ним эпителия. Ыеиго01 обнаружен как в клетках вкусовых луковиц и примордиев, так и в очагах пролиферации эпителия языка человека с 8-й по 21-ю неделю внутриутробного развития.

1.4. Научная новизна

В клетках вкусовых примордиев, появляющихся на поверхности языка человека в конце 6-й недели развития, впервые обнаружена апикальная локализация ядер, а также цитоплазматическая экспрессия нейрон-специфического белка р3-тубулина.

С помощью ядерных пролиферативных маркеров ¥л67 и РСКА установлено, что клетки вкусовых луковиц и примордев человека с 6-й по 15-ю неделю внутриутробного развития обладают пролиферативной активностью.

В эпителии языка человека впервые исследована экспрессия транскрипционных факторов Бох2 и №иго01. На стадии закладки вкусовых примордиев (конец 6-й недели развития) специфическая экспрессия транскрипционных факторов 8ох2 и КеигоБ 1 в эпителии языка отсутствует. №иго01 обнаружен в зонах пролиферации эпителия языка и в клетках вкусовых луковиц, начиная с 8-й недели и на всех последующих исследованных сроках развития; Бох2 - с 10-й по 15-ю неделю выявлялся как в клетках вкусовых луковиц, так и в очагах пролиферации эпителия языка, а после 18-й недели только в клетках вкусовых луковиц.

1.5. Научно-практическая значимость

Выявленные цитологические и иммуногистохимические особенности

вкусовых примордиев человека позволят выявлять зоны их первичного

обособления на ранних стадиях дифференцировки, протекающих до иннервации и специфической экспрессии транскрипционных факторов 8ох2 и №игоВ1, а также могут быть использованы для типирования клеток-предшественников вкусовых луковиц у экспериментальных животных.

Результаты исследования экспрессии транскрипционных факторов Бох2 и КеигсЮ1, показывают, что в течение эмбрионального и раннефетального периода внутриутробного развития человека возрастает опасность возникновения отклонений в развитии, связанная с нарушением процессов пролиферации и дифференцировки в эпителиальных дериватах ротовой полости. Выявленные особенности экспрессии данных факторов могут быть использованы при изучении механизмов развития онкологических заболеваний ротовой полости человека и их диагностике. Полученные результаты также необходимы для уточнения функций 8ох2 и НеигоБ1 в разных эпителиальных тканях в течение пренатального онтогенеза человека.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ II.1. Строение дорсальной поверхности языка млекопитающих II.1.1. Характеристика сосочков языка млекопитающих

Дорсальная поверхность языка млекопитающих традиционно разделяется на две зоны: тело (передние две трети, передняя часть языка) и корень (задняя треть языка). Границей между телом и корнем языка служит линия, называемая терминальной бороздой, образующая на поверхности языка угол, в вершине которого расположено небольшое углубление, называемое слепым отверстием (Jung Н. et al., 2004).

Слизистая оболочка языка млекопитающих покрыта плоским многослойным эпителием. Базальный слой эпителия образован клетками кубической или призматической формы с овальным ядром и высоким ядерно-цитоплазматическим отношением (Боровский Е.В., Леонтьев В.К., 2001). Клетки базального слоя обладают большой митотической активностью, благодаря которой происходит обновление клеток эпителия (Сапронова Е.А. и др., 2004). При делении клеток базального слоя дочерние клетки, оказывая боковое давление на материнские клетки, выталкивают их в вышележащие слои для дальнейшей дифференцировки (Явишева Т.М. и др., 2000). Подготовка к делению включает в себя синтез ДНК, а также характерных для данного эпителия белков цитокератинов, входящих в состав тонофиламентов (Билич Г. и др., 1999). Состав цитокератинов генетически детерминирован и различается в разных участках ротовой полости (Dhouailly D. et al., 1989). Также экспрессия цитокератинов является маркером дифференцировки эпителиоцитов, т.к. состав цитокератинов изменяется по мере перехода клетки из базального в верхние слои эпителия (Sawaf М.Н. et al., 1991).

На дорсальной поверхности языка собственная пластинка вместе с покрывающим ее эпителием образует выступы, называемые сосочками. У млекопитающих различают четыре типа сосочков: нитевидные,

грибовидные, листовидные и желобоватые (Фалин Л.И., 1963; Быков В.Л., 1999).

Нитевидные сосочки не являются вкусовыми сосочками, т.к. в их эпителии отсутствуют вкусовые луковицы. Они покрывают большую часть дорсальной поверхности языка. Нитевидные сосочки образованы узкими выростами соединительной ткани, покрытыми многослойным эпителием, клетки которого выделяют кератины, подобные кератинам волос (Dhouailly D. et al., 1989). Степень кератинизации дорсального эпителия языка зависит от образа жизни и объектов питания животных. У грызунов, питающихся твердой пищ

Информация о работе

Куртова, Анастасия Игоревна
кандидата биологических наук
Москва, 2014
ВАК 03.03.04

Диссертация

Пренатальная дифференцировка и иннервация вкусового рецепторного аппарата языка человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы