Эпидемиологическое и молекулярно-генетическое исследование несовершенного остеогенеза

Надыршина, Дина Даяновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эпидемиологическое и молекулярно-генетическое исследование несовершенного остеогенеза
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Эпидемиологическое и молекулярно-генетическое исследование несовершенного остеогенеза"

005006212

На правах рукописи

НАДЫРШИНА ДИНА ДАЯНОВНА

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕСОВЕРШЕННОГО ОСТЕОГЕНЕЗА

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание уяепой степепи кандидата биологических наук

1 5 ЛЕК 2011

Уфа-2011

005006212

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Учреждения Российской академии наук Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Хуснутдинова Эльза Камилевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Спицын Виктор Алексеевич ГУ Медико-генетический научный центр РАМН

доктор медицинских наук, профессор Викторова Татьяна Викторовна ГОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится «Х1у> декабря 2011 г. в «"/У "»часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и генетики УНЦ РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71 и на сайте ИБГ УНЦ РАН: www.ibg.anrb.ru/dissov.html

e-mail: molgen@anrb.ru.

Автореферат разослан « ХЬу> ноября 2011г.

Ученый секретарь /Л

диссертационного совета ^^¡¿/ ^ С.М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Несовершенный остеогенез (НО) или синдром голубых склер - это клинически и генетически гетерогенное наследственное заболевание соединительной ткани, встречающееся с частотой от 1:10000 до 1:30000 населения в различных странах мира (Byers et al., 1992; Prockop et al., 1993; Prockop et al, 1995; Lee et al., 2006; Pollitt et al., 2006; Kataoka et al., 2007; Liu et al., 2007; Witecka et al., 2008; Bodian et al., 2009; Swinnen et al., 2009; Zhang et al., 2011). К основным клиническим признакам несовершенного остеогенеза относятся повышенная ломкость костей, голубые склеры, низкий рост, снижение слуха, деформация костей скелета и аномалии дентина (Pollitt et al., 2006; Kataoka et al., 2007; Liu et al., 2007).

Существует 11 клинических форм HO, тяжесть заболевания варьирует от легкой до внутриутробной летальной и наследуется как по аутосомно-доминантному, так и аутосомно-рецессивному типу (Bodian et al., 2009; Swinnen et al., 2009). Рядом исследователей отмечается 5-7% спорадических случаев заболевания, обусловленных мутациями de novo, приводящих, как правило, к 2 или 3 типу НО (Thompson et al., 1987; Benusiene, 2003; Venturi et al., 2006)

Генетическим дефектом в 90% случаях заболевания являются мутации в двух генах коллагена I типа - al цепи (COL1A1) и а2 цепи (COL1A2). Остальные 10% случаев заболевания обусловлены мутациями в генах хрящ-ассоциированного белка (CRTAP), лейцин-пролин обогащенного протеогликана (LEPRE1) и циклофшгана В (PPIB), участвующих в постраасляционной модификации коллагена I типа, в генах серпина Hl (SERP1NH1) и ядерного фактора каппа В (FKBP10), выполняющих шаперонную функцию при фолдинге белка коллагена I типа, а также в гене серпин Fl (SERPINF1), кодирующего производное фактора пигментного эпителия (Barnes et al., 2006; Baldridge et al., 2008; Van Dijk et al., 2009; Alanay et al, 2010; Barnes et al., 2010; Christiansen et al., 2010; Becker et al., 2011). Известно более 1000 изменений нуклеотидной последовательности вышеперечисленных генов у больных НО (https://oi.gene.le.ac.uk/).

понимании молекулярно-генетических основ несовершенного остеогенеза, остается открытым ряд ключевых вопросов, касающихся патогенеза этого заболевания. Многими исследователями отмечаются значительные трудности в сопоставлении результатов молекулярно-генетического анализа с клинической картиной НО. Также установлено, что схожие фенотипические признаки нарушения костного ремоделирования могут наблюдаться и при других заболеваниях (УепШп й а1., 2006). Учитывая инвалидизирующее течение, клиническую и генетическую гетерогенность, наследственный характер заболевания, а также отсутствие эффективных способов лечения пациентов, определение первичного генетического дефекта является необходимым условием для разработки оптимальных подходов ДНК-диагностики НО с целью предотвращения рождения больных детей в отягощенных семьях с учетом этнических особенностей региона.

Цель работы:

Анализ эпидемиологических особенностей несовершенного остеогенеза в Республике Башкортостан и поиск структурных изменений в генах коллагена I типа.

Задачи исследования:

1. Провести анализ распространенности, типов наследования и клинических форм несовершенного остеогенеза в Республике Башкортостан.

2. Создать банк ДНК больных несовершенным остеогенезом и членов их семей.

3. Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в генах СОЫА1 и СОЫА2 у больных несовершенным остеогенезом.

4. Провести анализ корреляций обнаруженных мутаций изученных генов с формой и типом наследования заболевания.

5. Провести исследование роли идентифицированных полиморфных вариантов генов СОЫА1 и СОЫА2 в развитии несовершенного остеогенеза. Научная новизна. Впервые дана эпидемиологическая характеристика

несовершенного остеогенеза в Республике Башкортостан, с учетом административно-территориальной и этнической подразделенности населения региона. Впервые в России проведено исследование структурных изменений генов а1 и а2 цепей коллагена I типа (СОЫА1 и СОЫА2) у больных несовершенным остеогенезом из Республики Башкортостан и Республики Саха (Якутия). Впервые описаны нонсенс-мутация с.9670>Т (р.01у323Х) в гене СОЫА1 у больного русской этнической принадлежности из РБ, приводящая к НО 1 типа с аутосомно-

доминантным наследованием, и мутация сдвига рамки считывания c.3540_3541insC (p.Glyll81AlafsX293) в гене COL1A1 с легкой формой НО 1 типа у пациента якутского происхождения из Республики Саха (Якутия). Впервые выявлены два изменения нуклеотидной последовательности С.544-240Т и c.957+10insA в гене COL1A1 у больного русской этнической принадлежности, у которого также была выявлена нонсенс-мутация С.28690Т (p.Gln957X). Впервые определен спектр и частоты полиморфных вариантов генов al и а2 цепей коллагена I типа, характерных для больных НО и здоровых индивидов из Республики Башкортостан.

Научно-практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить представление о молекулярно-генетических основах развития несовершенного остеогенеза, служат основой для разработки ДНК-диагностики данного заболевания, в том числе пренатальной, оптимальной для Башкортостана и Якутии. Результаты исследования внедрены в практику медико-генетической консультации при ГУЗ «Республиканский перинатальный центр» РБ. Материалы диссертации могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Апробация работы

Основные положения диссертации были представлены на Международной конференции по медицинской генетике «Плод как часть семьи» (Харьков, 2009), Международных конференциях европейского общества генетиков человека «European Human Genetics Conference» (Вена, 2009; Гётеборг, 2010; Амстердам, 2011), VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону,

2010), II Всероссийской школе-семинаре «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011), Международной научной конференции генетиков человека «Human Genome Meeting» (Дубай, 2011) и 11-ой Международной конференции по несовершенному остеогенезу «11th International Conference of osteogenesis imperfecta» (Дубровник,

2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 3 статьи в журналах из Перечня ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов и

списка литературы (157 источников, в том числе 15 отечественных и 142 зарубежных). Иллюстративный материал содержит 72 рисунка и 30 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Для проведения эпидемиологических исследований использована база данных по больным несовершенным остеогенезом, состоящим на учете в медико-генетической консультации при ГУЗ «Республиканский перинатальный центр» РБ и членов их семей за 40-летний период. Карта территориальной распространенности НО в РБ построена с помощью пакета программы АгсМе^СИЗу.З.О.

В качестве материала для молекулярно-генетических исследований были использованы образцы ДНК 41 больного с установленным клиническим диагнозом «несовершенный остеогенез» из 33 семей из Республики Башкортостан и 70 их родственников, а также 15 больных из 12 семей из Республики Саха (Якутия), состоящих на учете в учреждении Российской академии медицинских наук Якутского научного центра комплексных медицинских проблем Сибирского отделения РАМН.

Для анализа распределения частот аллелей и генотипов выявленных полиморфных вариантов в генах СОЫА1 и СОНА2 использована контрольная группа, состоящая из 50 здоровых индивидов с нормальным уровнем минеральной плотности костной ткани (МПКТ), сопоставимых по полу, возрасту и этнической принадлежности с обследуемой группой больных НО.

Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции по МаЛете (1984). Поиск изменений нуклеотидной последовательности в генах СОЫА1 и СОЫА2 проводили методом анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (ББСР) по методике (Огка а а1., 1989) с щелочной и температурной денатурацией. Использованы описанные ранее пары праймеров, фланкирующих экзоны и прилегающие интронные области (Когкко е! а1., 1998). После денатурации образцы наносили на 8% полиакриламидный гель (ПААГ); электрофорез проводили при комнатной температуре при напряжении 100В в течение 20-40 часов. Гель окрашивали в течение 25 минут 0,09% раствором азотнокислого серебра (А^03). Анализ образцов осуществляли по критерию присутствия или отсутствия дополнительных полос по сравнению с контрольной ДНК (норма). Определение последовательности нуклеотидов у образцов с измененной подвижностью однонитевой ДНК проводили с помощью автоматического секвенатора АВ1

PRISM модель 310 («Applied Biosystems») с использованием набора для флюорисцентного мечения DYEnamic™ ET, согласно протоколу фирмы производителя («Amersham Pharmacia Biotech» DYEnamic™ ET Terminator Cycle Sequencing Kit). Для «прочтения» последовательности нуклеотидов использовали приложение BioEdit v.5.0.9. (1997- 2001), а для анализа полученных результатов -MegAlign из пакета программ DNAStar Inc (1993-2002).

Оценку влияния впервые выявленных замен на вероятность возникновения/потери сайтов сплайсинга проводили при помощи программы Splice Prediction using Consensus Sequences (WebGene): http://www.itba.mi.cnr.it/webgene.

Для анализа полиморфных вариантов в регуляторном регионе гена COL1A1 нами были использованы ферменты рестрикции ЕсоЗП для g.3011I>G (rsl 107946) полиморфизма и Van91I для c,104-441G>T (rsl800012) полиморфного варианта с последующим проведением электрофореза в 7% ПААГ, окрашиванием бромистым этидием и визуализацией в проходящем УФ свете.

Исследование генов коллагена I типа COLI AI и COL1A2 проводили на уровне ДНК, без изучения РНК и экспрессии белка. Влияние мутаций на уровень белка рассчитано гипотетически на основе анализа нуклеотидной последовательности ДНК. Предположения о возможном влиянии на фенотип структурных или нулевых мутаций были сделаны, основываясь на клинических данных заболевания и ориентируясь на исследования других исследователей.

При попарном сравнении частот аллелей и генотипов полиморфных локусов применяли критерий у? для таблиц сопряженности 2x2 с поправкой Йейтса на непрерывность (Epstein and Satten 2003; http://\vww.biometrica.tomsk.ru). В случае наличия достоверных отличий в исследуемых выборках проводили оценку показателя отношения шансов (odds ratio, OR), а также границ его 95% доверительного интервала (С195%). Расчет показателя D', используемого для оценки неравновесия по сцеплению каждой пары полиморфных локусов, а также определение частот гаплотипов и тестирование различий в распределении частот гаплотипов в группах больных и в контроле осуществляли с помощью программы Haploview 4.2. (Barret et al., 2005).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Эпидемиология несовершенного остеогенеза в Республике Башкортостан

В Республике Башкортостан (РБ) зарегистрированы 105 больных НО из 94 семей, частота заболевания составила 1:45011 населения, в то время как в других странах мира она варьирует от 1:10000 до 1:30000 (Prockop et al, 1995; Pollitt et al., 2006; Kataoka et al., 2007; Liu et al, 2007; Witecka et al., 2008; Bodian et al., 2009; Zhang et al., 2011). Результаты наших исследований показали, что НО на территории РБ распространен неравномерно (рис. 1). Заболевание зарегистрировано в 29 из 54 административных районов и в 11 из 21 города республики. Наибольшие показатели распространенности заболевания выявлены в Кушнаренковском (17,5:100000 населения), Нуримановском (14,2:100000 населения) и Аскинском районах (16,8:100000 населения). Среди больных НО из РБ выявлены 57 мальчиков (54%) и 48 девочек (46%). Средний возраст больных НО на момент обращения в медико-генетическую консультацию Республиканского перинатального центра составил примерно 6 лет (начиная с рождения и до 16 лет).

Рис. 1. Распространенность несовершенного остеогенеза в Республике Башкортостан.

В РБ распределение больных НО по этническому составу оказалось следующим: 34% составили татары, русских - 30%, башкир- 20% и 16%-

составили метисы и больные из армянских, марийских, украинских и чувашских семей.

Аутосомно-доминантный (АД) тип наследования выявлен у 22 больных НО из РБ (23%), аутосомно-рецессивный (АР) - у 70 (75%) и 2 (2%) - спорадических случая.

Таким образом, частота НО в РБ и формы заболевания значительно отличаются от данных других исследователей (Tinkle et al., 2005; Zhang et al., 2011). В РБ частота НО на порядок ниже, чем в других странах и преобладают AJP формы заболевания, по сравнению с АД формами НО.

Анализ нуклеотидной последовательности генов коллагена I типа у больных несовершенным остеогенезом

Нами проведен поиск изменений нуклеотидной последовательности в 51 экзоне гена al цепи COL1A1 и 52 экзонах гена а2 цепи СОЫА2 коллагена I типа у 41 больного с установленным клиническим диагнозом «несовершенный остеогенез» из 33 семей и у 70 их родственников из Республики Башкортостан, а также у 15 больных из 12 семей из Республики Саха (Якутия).

У больных из РБ исследовались как мутации, так и полиморфные варианты, а у больных из Якутии осуществлялся поиск только мутаций (ввиду малочисленной выборки) с целью выявления эффекта основателя.

В качестве основного метода поиска мутаций нами был использован метод SSCP, преимуществом которого является его простота, наряду с достаточно высокой чувствительностью (Orita et al., 1989). Однако есть и недостатки, в числе которых резкая потеря чувствительности метода, если анализируемый фрагмент достигает свыше 400 п.н. и длительная продолжительность электрофоретического разделения продуктов амплификации. Тем не менее, метод достаточно широко применяется многими исследователями для поиска полиморфных участков ДНК (Natari et al., 1999). Экзоны 49, 50 и 51 гена COL1A2, протяженностью более 400 п.н. подверглись прямому секвенированию.

Обнаруженные в ходе SSCP-анализа образцы с измененной, по сравнению с контролем, электрофоретической подвижностью одноцепочечной ДНК, в дальнейшем исследовались с помощью метода секвенирования.

Поиск мутаиий в гене COL1A1 у больных несовершенным остеогенезом из Республики Башкортостан Ген COL1A1, кодирующий альфа 1 цепь гена коллагена I типа, содержит 51 экзон и состоит из 38 тысяч п.н. В настоящее время обнаружено около 600 мутаций у больных НО в различных популяциях мира (https://oi.gene.le.ac.uk/).

Исследование 51 экзона и регуляторного региона гена COL1A1 у больных НО выявило 23 типа изменений подвижности однонитевой ДНК в 16 экзонах (3, 7, 9, 13-15, 17, 19, 24, 27, 29, 31, 36, 38, 41, 45) и прилегающих к ним интронных областях, а также в 5' фланкирующем регионе гена. В остальных 35 экзонах гена COL1A1 изменений не было обнаружено. Последующее секвенирование образцов с измененной подвижностью позволило идентифицировать 6 различных мутаций, приводящих, в конечном счете, к образованию стоп-кодона и уменьшению количества коллагена, а также 17 различных однонуклеотидных полиморфных вариантов (SNP). Четыре мутации приводили к аутосомно-доминантной форме НО, две возникли de novo (табл. 1).

Таблица 1

Спектр мутаций в гене СОЫА1 у больных несовершенным остеогенезом _из Республики Башкортостан _

Мутация Экзон Тип мутации Изменение аминокислотной последовательности Наследование

c.579delT 7экзон делеция p.Glyl94ValfsX71 de novo и АД

c.967G>T 15 экзон трансверсия p.Gly323X АД

С.10810Т 17 экзон транзиция p.Arg361X АД

С.12430Т 19 экзон транзиция p.Arg415X de novo

c.2444delG 36 экзон делеция p.Gly815 AlafsX293 АД

с.2869С>Т 41 экзон транзиция p.Gln957X АД

Мутация сдвига рамки считывания c.579delT (p.Glyl94ValfsX71) была обнаружена у трех пациентов из 2-х семей татарской этнической принадлежности (рис. 2). В первой семье данная мутация, возникшая de novo, была выявлена у девятилетнего пробанда с клиническими проявлениями заболевания, характерными для НО 1 типа, за 4 первых года жизни у него зарегистрировано 20 переломов. Во второй семье p.Glyl94ValfsX71 мутация наследовалась по аутосомно-доминантному типу по материнской линии. У 16-летнего пробанда наблюдались голубые склеры, укорочение нижних конечностей и 15 переломов

различных отделов скелета, у матери также были голубые склеры и 3 перелома в течение жизни.

с.57,ад<?1Т I \ [\ А I \ <р!сйу194Уа1&Х71) / \ I | П 1 I \

Рис. 2. Идентификация мутации c.579delT (p.GIyl94ValfsX71) в гене COL1A1 у больного несовершенным остеогенезом.

Ранее мутация c.579delT (p.Glyl94ValfsX71) описана у больных с НО 1 типа из Испании, Италии, Нидерландов и Китая fVenturi et al., 2006; Swinnen et al., 2009; Fuccio et al., 2011; Zhang et al, 2011). Пациенты, охарактеризованные зарубежными исследователями, имели схожую клиническую картину с больными из РБ.

В экзоне 15 гена COL1A1 нами была обнаружена ранее неописанная в литературе нонсенс-мутация c.967G>T (p.Gly323X) в семье русской этнической принадлежности у пробанда и ее матери, вызванная трансверсией гуанина на тимин в положении 967, приводящая к образованию стоп-кодона (GGA—>TGA) (рис. 3). Для пробанда характерны голубые склеры, в течение 14 лет жизни у нее было зарегистрировано 8 переломов. У матери - голубые склеры, тугоухость, небольшие деформации нижних конечностей, ежегодно случалось по одному перелому. У клинически здорового сибса и отца мутация c.967G>T (p.Gly323X) не

C.967G-T

(р.ШуЗЗЗхГ ; Л \ Д д

; \ ? : 1> \ ! ' : i / • / У ;.;'

Рис. 3. Идентификация мутации c.967G>T (p.Gly323X) в гене COL1A1 у больных несовершенным остеогенезом.

обнаружена.

В экзоне 17 гена COLI AI в семье марийского этнического происхождения у пробанда и его отца обнаружена мутация p.Arg361X, генетический дефект которой обусловлен транзицией С на Т в 1081 положении кДНК, приводящая к образованию стоп-кодона и к продукции только 50% нормальных проколлагеновых цепей (рис. 4). По литературным данным данная мутация приводит к легкому НО 1 типа с доминантной формой наследования. В нашем случае у отца зарегистрирована также легкая форма НО, однако у пробанда наблюдается утяжеление клинических признаков. За 5 лет жизни у пробанда зарегистрировано 19 переломов, которые привели к деформации конечностей и инвалидизации пациента.

-4 bm- Ш \ .. щ ililiilll liiiii ШтШШШШХ: ЩШЩШ0&Ш ж ,„„,,.» J«

ШШшШшШЩШШШ sllplllllllilllll ШШ/г: iff ■:

Рис. 4. Идентификация мутации c,10810T(p.Arg361X) в гене COL1A1 у больных несовершенным остеогенезом.

Как отмечается зарубежными исследователями, между больными из одной семьи и неродственными индивидами, имеющими одну и ту же мутацию, могут быть различия в тяжести течения заболевания (Marini et al., 2007). Одним из объяснений этой особенности может быть существование модифицирующих генетических и эпигенетических факторов, влияющих на тяжесть заболевания. Мутация p.Arg361X выявлена многими исследователями у больных с НО 1 типа из Канады, США, Испании, Литвы, Израиля и Китая (Korkko et al., 1998; Benusiene et al, 2003; Ries-Levavi et al., 2004; Roschger et al, 2008; Zhang et al, 2011).

У больного НО русской этнической принадлежности в экзоне 19 гена COL1A1 нами выявлена транзиция С на Т в основании 1243 кДНК (p.Arg415X), приводящая к образованию стоп-кодона в положении 415 (рис. 5). Как описывалось ранее, большинство мутаций, которые превращают кодон аргинина CGA в преждевременно-терминирующий кодон TGA, были найдены в сиквенсном контексте G/CCC CGA GG/T гена СОЫА1 (Korkko et al, 1998). Эта мутация ранее описана у больных НО 1 типа из США и Италии, а также при НО 4 типа у

пациентов из Бразилии (Willing et al, 1996; Redford-Badwal et al, 1996; Reis et al, 2005). У пациента из РБ за 10 лет жизни было зарегистрировано 9 переломов и он имеет клинические проявления, характерные для 3-го типа НО. Данная мутация не выявлена у родителей пробанда. Мы подтвердили биологическое родство членов семьи, что позволило нам сделать вывод о возникновении мутации de novo.

Анализ белков коллагена, синтезированных в культивированных фибробластах пациентов с данной мутацией, показал, что синтез коллагена уменьшался примерно на 50%, по сравнению с контрольным уровнем. Отношение а 1/ а 2 мРНК было < 2. что указывает на снижение уровня а 1 мРНК (Redford-Badwal et al, 1996). Транзиция С на Т в основании 1243 экзона 19 гена COL1A1 приводит к образованию сайта узнавания для рестриктазы Bsu36I (EcoSlI), что позволяет идентифицировать мутацию p.Arg415X методом ПДРФ-анализа, которая упрощает процедуру детекции.

Рис. 5. Идентификация мутации с.1243С>Т(р.А^415Х) в гене СОЫА1 у больного несовершенным остеогенезом.

Мутация сдвига рамки считывания c.2444delG (р.01у815АМБХ293), ранее описанная только у больного из Японии (КЖаока е1 а1, 2007), выявлена у пробанда татарской этнической принадлежности (рис. 6). Эта мутация была определена в контексте ОСТ ООТ БСТ. Данная мутация у пациента японской этнической принадлежности приводила к НО 1 типа. Пациенты имели голубые склеры, нормальный рост без деформации конечностей, переломы наблюдались примерно 1-2 раза в год. Для нашего пациента характерны схожие клинические признаки, соответствующие 1 типу НО. Родители пробанда не были доступны для ДНК-анализа, однако, анализ родословной предполагает аутосомно-доминантный тип наследования заболевания по линии отца.

»4 ф* * ' J* ф

'1 Л

f) I i

dJi.....УШ \I.\Lm. 1

Рис. 6. Идентификация мутации c.2444delG (p.Gly815AlafsX293) в гене COLI AI у больного несовершенным остеогенезом.

Мутация p.Gln957X, вызванная транзицией С на Т в основании 2869, была выявлена в гетерозиготном состоянии в семье русской этнической принадлежности и приводила к развитию НО 1 типа с аутосомно-доминантным типом наследования (рис. 7). По литературным данным, мутация p.Gln957X встречалась у больных из Англии и Израиля (Ries-Levavi et al., 2004). У этого же пациента нами были обнаружены 3 полиморфных варианта: с.544-24С>Т, с.643-36delT, c.957+10insA, которые ни в контроле, ни у остальных больных НО не были определены. Пробанд в анамнезе имел 11 переломов, в результате которых произошли саблевидные деформации бедер и вальгусная деформация коленных и локтевых суставов, у девочки голубые склеры.

С.28690Т {|xöi.!>»5?>0

Рис. 7. Идентификация мутации С.28690Т (p.Gln957X) в гене COL1A1 у больного несовершенным остеогенезом.

Таким образом, в гене СОИА1 мутации были обнаружены у 21.2% исследованных семей с НО из РБ. Все выявленные мутации приводят, в конечном счете, к преждевременной остановке синтеза белка и обуславливают развитие относительно легких клинических форм НО. По литературным данным преждевременно-терминирующие кодоны и мутации сдвига рамки считывания ведут к аллель-специфичному уменьшению ядерной мРНК и образованию нулевых аллелей, снижающих экспрессию гена СОЫА1. Мутантная про-альфа

цепь белка деградирует внутриклеточно, что приводит к секреции только 50% нормальных проколлагеновых цепей (Korkko et al., 1998). Тяжелое течение заболевания, главным образом, обусловлено однонуклеотидными заменами, превращающими глициновый кодон в повторяющейся последовательности Gly-X-У тройной спирали белка в кодон аминокислоты с большей боковой цепью, что вызывает нарушение формирования спиральной структуры и изменение стабильности коллагена I типа (Pol)itt et al., 2006). В нашем исследовании мы не обнаружили ни одной миссенс мутации у больных НО.

Поиск мутаций в гене COLI AI у больных несовершенным остеогенезом из

Республики Саха (Якутия) В Якутии зарегистрировано 12 семей с НО, из них 10 - якутской, одна семья - русской и 1- эвенской этнической принадлежности.

Высокая степень генетической гомогенности популяции якутов из-за высокого уровня изоляции (низкой частоты межнациональных браков) позволяет отнести эту популяцию к «идеальным» в отношении возможности идентификации этноспецифических мутаций генов и менделевских болезней, а также картирования генов широко распространенных заболеваний (Пузырев, Максимова, 2008). С целью идентификации мутации эффекта основателя нами проведено молекулярно-генетическое исследование у 15 больных НО из 12 семей.

Методом SSCP-анализа в экзоне 49 гена COL1A1 был зафиксирован 1 тип изменения подвижности одноцепочечной ДНК у больного НО якутской этнической принадлежности. В результате секвенирования была обнаружена ранее неописанная мутация c.3540_3541insC (p.Glyl 181AlafsX38) (рис. 8).

«-3S-M 3541k>sC ohi 131 АЬВ-ххад

Рис. 8. Идентификация мутации с.3540 3541тшС (р.01у1181АЫзХ293) в гене СОИА1 у пробанда якутской этнической принадлежности.

У пробанда наблюдается тугоухость, голубые склеры. Как сопутствующие заболевания проявляются резидуальная энцефалопатия, цереброастенический

щшШ

jpli щ^шЩШШШ

синдром, нейропатия и миотонический синдром. У родителей данная мутация не была выявлена, что предполагает возникновение этой мутации de novo.

Мутация сайта сплайсинга с.4005+Ш>Т в гене COLI AI была выявлена в гетерозиготном состоянии в семье русской этнической принадлежности из Якутии (рис. 9). Данная мутация ранее была описана только у больного итальянского этнического происхождения (https://oi.gene.le.ac.uk). Пациент имел голубые склеры, множественные переломы верхних и нижних конечностей, ребер, компрессионный перелом позвоночника и несовершенный дентиногенез, а также сопутствующие заболевания: расщелина мягкого и твердого неба, резидуальная энцефалопатия и поллиноз. Родители пробацда не были доступны для ДНК-анализа, однако, анализ родословной предполагает аутосомно-доминантный тип наследования заболевания по линии отца.

—1 . . . "i %

ШшШШШШ/'ШШшШШ, "Щ с 4005 hg>t

ШЛШжШШШ ШЩ ' д h - л i {

У \ s \ ! i ; / \ h у /ч

Рис. 9. Идентификация мутации с.4005+Ш>Т в гене COLI AI у больного русской этнической принадлежности из Якутии.

Зарубежными исследователями отмечается, что мутации сдвига рамки считывания и сплайсинговые мутации чаще всего приводят к НО 1 типа с легким течением (Xia et al., 2008), что согласуется с нашими данными. У обоих больных НО из Якутии с выявленными мутациями 4005+lG>T и c.3540_3541insC (p.Glyl 181AlafsX38) в гене COLI AI зарегистрирован НО 1 типа с наличием сопутствующих заболеваний.

Таким образом, нами не были найдены мутации, обусловленные эффектом основателя в гене COL1A1 у больных НО из Республики Саха (Якутия).

Ученые из Израиля также провели анализ мутаций в гене COLI AI у пациентов с НО еврейского происхождения с целью выявления эффекта основателя. Ими были определены 14 различных мутаций (миссенс-, нонсенс-мутации, мутации сдвига рамки считывания и сайта сплайсинга), однако, все обнаруженные мутации оказались уникальными для каждой семьи и были

разбросаны по всему гену (Ries-Levavi et.al, 2004), что также сопоставимо с нашими данными. Таким образом, для НО не характерны мутации, связанные с эффектом основателя, даже в относительно изолированных популяциях.

Исследование полиморфных вариантов гена COLI AI v больных несовершенным остеогенезом и в группе контроля из Республики Башкортостан У больных НО в гене COLI AI обнаружено 17 полиморфных локусов, 3 из которых расположены в промоторном регионе, 13 - в интронных участках и 1- в экзоне: +1245G>T (с.104-44Ю>Т (rsl800012), -1997G>T (g.3011T>G, rsl 107946), -1663IndelT (g.3344 3345delTT, rs2412298), c.299-200G (rs2256835), c.859-14T>G (rsl7639446), C.544-240T, c.643-36delT (rs67207840), c.957+10insA, c,1002+52A>G (rs2734281), c,1002+77A>G (rs214l279), c,1669-31T>C (rsl007086), c,1876-44C>T (rsl800695), c,1930-14T>C (rs2696247), С.2028+390Т (rs2857396), c.2560-18C>G (rs2075559), c.3223G>A (rsl 800215), c.3261+311>C (rs2586488).

У пробанда русской этнической принадлежности, у которого также была выявлена нонсенс-мутация в 41 экзоне гена COLIA1, нами выявлены 3 изменения c.643-36delT (rs67207840), с.544-24 С>Т и с.957+1 OinsA, которые не обнаружены ни в контроле, ни у остальных больных НО.

Полиморфный вариант c.643-36delT, расположенный в 8 интроне гена COL1A1, был обнаружен у пробанда и ее матери (рис. 10). Ранее данный полиморфный вариант выявлен с частотой 5% у здоровых индивидов в популяции итальянского происхождения и, предположительно, является нейтральным для развития заболевания (Fuccio et al, 2011).

Ир «t; iL •!

{ ■ \

c(>43-3ödciT

fl -

| (re67207S40)

Рис. 10. Идентификация полиморфного варианта c.643-36delT (ге67207840) гена C0L1A1 у больного НО русской этнической принадлежности.

Два других полиморфных варианта С.544-240Т (рис. 11, А) и c.957+10insA (рис. 11, Б), расположенные в 6 и 14 интронах гена COLI AI, ранее не были описаны. Полиморфный вариант с.544-24С>Т наследовался по материнской линии, а c.957+10insA - по линии отца. Оценка влияния обнаруженных замен на вероятность возникновения сайтов сплайсинга, проведенная с помощью программы математического моделирования (http://www.itba.mi.cnr.it/webgene), не выявила их роль в сплайсинге гена COL1A1. Таким образом, мы предполагаем нейтральный характер этих полиморфных вариантов в гене COL1A1 в утяжелении клинической картины заболевания.

4 ' ^ 4 % '!

С.544-240Т

шш ■- - - - - /.•' , -' ¡¡§1

Рис. 11. Идентификация полиморфных вариантов в гене СОЫА1 у больного НО русской этнической принадлежности: А - с.544-24С>Т; Б- с.957+ШшА.

Выявленные нами остальные полиморфные варианты в гене СОЫА1 встречаются как у больных, так и у здоровых индивидов и поэтому для определения функциональной значимости полиморфных вариантов в развитии заболевания нами был проведен сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов между больными и контролем.

Полиморфные локусы (+1245G>T (c,104-441G>T (rsl800012), -1997G>T (g.3011T>G, rsl 107946), -1663IndelT (g.3344_3345delTT, rs2412298), находящиеся в регуляторном регионе гена, влияют на транскрипцию гена COL1A1 и воздействуют на уровень МГГКТ (Garcia Giralt et al., 2002; Liu et al., 2004; Yamada et al., 2005; Zhang et al., 2005; Stewart et al., 2006; Yazdanpanah et al., 2007; Huilin et al., 2009).

В изученных нами выборках гомозиготный генотип *ТТ полиморфизма +1245G>T (c.l04-441G>T) встречался у одного больного НО, гетерозиготный генотип *GT выявлен у 21,2 % пациентов, тогда как в контрольной выборке аллель *Т не встречался в гомозиготном состоянии и обнаружен у 10% индивидов в гетерозиготном состоянии. Обнаружена тенденция увеличения частоты аллеля *D полиморфного локуса -1663indelT и генотипа *ТТ полиморфного варианта -1997G>T у больных, по сравнению с контролем. Однако статистически значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов этих полиморфных вариантов между больными и контролем не выявлено.

Анализ распределения частот гаплотипов по трем полиморфным вариантам регуляторного региона гена COLI A J у больных НО и в группе контроля показал, что гаплотип *T*del*T, ассоциированный с низким значением МПКТ и переломами, был обнаружен у 15% больных с множественными переломами и отсутствовал в группе контроля. Значения достигают статистически значимых различий х2 =4,99 р=0,025 (OR=3,53 С1(1,23-10,11) (рис. 12).

Таким образом, мы предполагаем влияние полиморфных вариантов, расположенных в регуляторном регионе гена COLI AI, на утяжеление клинической картины и частоту переломов у больных НО.

Tdel'T 5 ins G

I □ больныеEä контроль I

Рис. 12. Распределение частот гаплотипов

полиморфных вариантов -1663нк1е1Т, -19970>Т и +1245й>Т гена СОЫА1 у больных НО и в контроле

Обнаружены достоверные различия в частоте аллеля полиморфного локуса с.859-14Г>0 (гб17639446), расположенного в 12 интроне гена C0L1A1,

между больными и контрольной группой (%2=3,91, р=0,048) (011=3,310 (С1 (0,95411,48) (рис. 13). Ранее этот полиморфный вариант был описан в популяции итальянцев, которые предполагают нейтральный его характер в развитии заболевания (Биссю ег а1., 2011).

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов остальных полиморфных локусов гена СОИА1 не выявил статистически значимых различий между больными НО и контролем.

Таким образом, у больных НО из РБ обнаружено 17 полиморфных локусов в гене COLI AI. Достоверные различия показаны в распределении частоты аллеля *G полиморфного локуса rsl7639446 (£=3,91, р=0,048) (OR=3,310 (С1 (0,95411,48), а также в частоте гаплотипа *T*del*T полиморфных вариантов -1997G>T, -1663indelT и +1245G>T (%2=4,99, р=0,025; (OR=3,53) между больными НО и контрольной группой. Полиморфные локусы с.544-24С>Т и c.957+10insA в гене COL1A1 описаны впервые.

несовершенным остеогенезом и в группе контроля из Республики Башкортостан Ген COLlA2, кодирующий альфа 2 цепь коллагена I типа, состоит из 38 тыс. п.н., локализован на 7q22 хромосоме и содержит 52 экзона (Катоип-ОоИга1 е1 а!., 2008; \Vitecka е1 а1., 2008; Бтоппеп й а!., 2009). Известно более 400 мутаций в гене СОЫА2, приводящих к развитию НО (Хи е1 а1., 2011).

В результате проведенного нами исследования 52-х экзонов, промоторного региона и прилегающих к ним интронных областей гена COLlA2 у больных НО выявлены изменения подвижности однонитевой ДНК! в четырех интронах (18, 19, 25, 28) и двух экзонах (25, 28). В остальных участках гена COLlA2 изменений не обнаружено. Последующее секвенирование образцов с измененной подвижностью позволило идентифицировать 7 различных однонуклеотидных полиморфных

Рис. 13. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта с.859-140>Т гена C0L1A1 у больных НО и в контрольной группе

Исследование структурных изменений в гене COL1A2 у больных

вариантов (SNP), 5 из которых располагаются в интронных участках и 2 - в экзонной области гена COL1A2 (с.936+140Т (rs42518), c.936+46G>A (rs28754326), c,1035+54A>G (rs2521206), C.1446A>C (rs412777), C.16450G (rs42524), c.l665+15A>G (rs421587), c,1666-41G>A (rs2301643). Достоверных различий в распределении частот аллелей и генотипов выявленных полиморфных вариантов между больными и контролем обнаружено не было, что предполагает их нейтральный характер для развития НО. Мутаций в гене COL1A2 у больных НО из РБ не выявлено.

***

Таким образом, у больных несовершенным остеогенезом в гене COL1A1 обнаружены 8 мутаций (у 21,2% исследованных семей из РБ и 20 % - из PC (Я), которые были зарегистрированы в базе данных по мутациям при НО на сайте https://oi.gene.le.ac.uk/. Все выявленные мутации определены в гетерозиготном состоянии и являются уникальными для каждой семьи (за исключением мутации c.579delT, идентифицированной в двух неродственных семьях). Мутации c.967G>T (p.Gly323X) и c.3540_3541insC (p.Glyll81AlafsX293) описаны впервые в мире. Обнаруженные мутации относятся к количественным, т.е. приводят к уменьшению на 50% количества al цепи коллагена I типа. У больных НО в гене COL1A1 также определены 17 полиморфных вариантов, два из которых с.544-24С>Т и c.957+10insA описаны впервые. В гене COL1A2 у больных НО мутации не обнаружены, определены 7 однонуклеотидных полиморфных вариантов.

ВЫВОДЫ

1. Распространенность несовершенного остеогенеза в Республике Башкортостан составляет 1:45000 населения, что на порядок ниже, чем в среднем по миру. Установлена неравномерность территориального распространения заболевания в РБ с преобладанием аутосомно-рецессивных форм НО.

2. У 21,2% больных несовершенным остеогенезом из Республики Башкортостан в гене COL1A1 выявлено 6 мутаций: 4 нонсенс-мутации c.967G>T (p.Gly323X), С.10810Т (p.Arg361X), с. 1243ОТ (p.Arg415X), С.28690Т (p.Gln957X) у пациентов русского происхождения и две мутации сдвига рамки считывания c.579delT (p.Glyl94ValfsX71), c.2444delG (p.Gly815AlafsX293) у больных татарской этнической принадлежности. Мутация c.967G>T (p.Gly323X) описана впервые.

3. У больных НО в гене COLI AI обнаружены 17 однонуклеотидных полиморфных вариантов. Аллель *G полиморфного локуса rsl7639446 (%z=3,91,

p=0,048; (OR=3,310 (CI (0,954-11,48) и гаплотип *T*del*T полиморфных вариантов -1997G>T, -1663indelT и +1245G>T (%2=4,99, р=0,025; (OR=3,53) являются рисковыми. Полиморфные варианты С.544-240Т и c.957+10insA в гене COLI AI описаны впервые.

4. У 20% больных несовершенным остеогенезом из Республики Саха (Якутия) в гене COLIA1 выявлены 2 различные мутации: c.3540_3541insC (p.Glyll81AlafsX38) у больного НО якутской этнической принадлежности и мутация сплайсинга c.4005+lG>T у пробанда русской этнической принадлежности. Мутация c.3540_3541insC (p.Glyll81AlafsX38) описана впервые.

5. Гено-фенотипический анализ показал, что мутации c.967G>T (p.Gly323X), С.10810Т (p.Arg361X), С.28690Т (p.Gln957X), c.579delT (p.Glyl94ValfsX71) и c.4005+lG>T гена C0L1A1 приводят к легкой форме НО 1 типа с аутосомно-доминантным типом наследования, мутация с.1243С>Т (p.Arg415X) - к спорадическому случаю НО 3-го типа тяжелой формы, мутации c.2444delG (p.Gly815AlafsX293) и c.3540_3541insC (p.Glyl 181AlafsX38), возникшие de novo, приводили к легкому фенотип)' заболевания с 1 типом НО.

6. У больных несовершенным остеогенезом в гене COL1A2 обнаружено 7 полиморфных вариантов, мутаций не выявлено. Достоверных различий в распределении частот аллелей и генотипов идентифицированных полиморфных локусов между больными и группой контроля не обнаружено.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хусаинова Р.И., Селезнева Л.И., Фазлыева Э.А., Нурлыгаянов Р.З., Надыршина Д.Д., Лесняк О.М., Хуснутдинова Э.К. Роль полиморфных вариантов гена рецептора эстрогена-а (ESR1) в развитии постменопаузального остеопороза в Волго-Уральском регионе России // Якутский медицинский журнал. 2009. № 2 (26). С. 96-99.

2. Надыршина Д.Д., Хусаинова Р.И., Хуснутдинова Э.К. Современное состояние клинико-генетических аспектов несовершенного остеогенеза // Медицинская генетика. 2010. №4. С. 12-21.

3. Хидиятова И.М., Ахметова В.Л., Хусаинова Р.И., Карунас A.C., Джемилева Л.У., Скачкова И.А., Надыршина Д.Д., Рахимкулова A.A., Марданова А.К., Мурзабаева С.Ш., Магжанов Р.В., Хуснутдинова Э.К. Популяционное исследование структурных особенностей генов моногенных заболеваний в Республике Башкортостан II Медицинская генетика. 2011. № 6. С. 13-22.

4. Nadyrshina D, R. Khusainova, A. Mardanova, E. Khusnutdinova. Epidemiological aspects of Osteogenesis Imperfecta in Bashkortostan Republic of Russia // European Human Genetics Conference. 2009. Vienna, Austria. P. 10.67.

5. Надыршина Д.Д, Хусаинова Р.И, Хуснухдинова Э.К. Эпидемиологические аспекты несовершенного остеогенеза в Республике Башкортостан // Международная конференция по медицинской генетике «Плод как часть семьи». 2009. Харьков-Одесса. Р.ООЗ.

6. Надыршина Д.Д, Р.И, Хусаинова, Э.К. Хуснутдинова. Анализ гена COL1AJ у пациентов с несовершенным остеогенезом из Республики Башкортостан // Медицинская генетика. Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков. 2010. Ростов-на-Дону. С. 123-124.

7. Nadyrshina D,, R. Khusainova, Е. Khusnutdinova. Analysis of COL1A1 gene in Osteogenesis Imperfecta patients in Bashkortostan Republic of Russia // European Human Genetics Conference. 2010. Gothenburg, Sweden. P. 12.133.

8. Nadyrshina D., R. Khusainova, E. Khusnutdinova. Mutation analysis of COL1A1 gene in osteogenesis imperfecta patients from Russia // European Human Genetics Conference. 2011. Amsterdam, Netherlands. P. 432-433.

9. Nadyrshina D, R. Khusainova, E. Khusnutdinova. Identification of novel mutation in COL1A1 gene in patient with osteogenesis imperfecta from Russia // Human Genome Meeting. 2011. Dubai, United Arab Emirates. P. 230.

10. Надыршипа Д.Д, Хусаинова Р.И, Филинских Е.С, Хуснутдинова Э.К. Анализ мутаций гена COLIA1 у больных несовершенным остеогенезом // Биомика/Biomics. Электронный журнал ИБГ УНЦ РАН. 2011. №2. С. 91-92.

11. Nadyrshina D, R. Khusainova, Е. Filinskyh, Е. Khusnutdinova. Two novel COLI AI mutations in patients with Ol from Russia //11th International Conference of osteogenesis imperfecta. 2011. Dubrovnik, Croatia. P.54.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АД Аутосомно-доминатное наследование

АР Аутосомно-рецессивное наследование

МПКТ Минеральная плотность костной ткани

НО Несовершенный остеогенез

ПААГ Полиакриламвдный гель

COL1A1 Ген а 1 цепи коллагена I типа

COL1A2 Ген а 2 цепи коллагена I типа

PPIB Ген циклофилина В

CRT АР Ген хрящ ассоциированного белка

LEPRE1 Ген лейцин-пролин обогащенного протеогликана

SERPINH1 Ген серпина HI

FKBP10 Ген ядернго фактора каппа В

SERPINF1 Ген серпина F1

SSCP Single strand conformation polymorphism (конформационный полиморфизм одноцепочечной ДНК)

OR Odds Ratio (соотношение шансов)

SNP Single-nucleotide polymorphism (однонуклеотидный полиморфизм)

95%CI Confidence interval (доверительный интервал)

Подписано в печать 24.11.11 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать рюографическая. Тираж 100 экз. Заказ 571. Гарнитура «"Пте5№\\К.отап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1 п л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Надыршина, Дина Даяновна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эпидемиология несовершенного остеогенеза.

1. 2. Клинические особенности несовершенного остеогенеза.

1.3. Классификация несовершенного остеогенеза.

1. 4. Структура, функция и процессинг белка коллагена I типа.

1.5. Генетические аспекты несовершенного остеогенеза.

1.5.1. Гены коллагена I типа, ответственные за развитие доминантных форм несовершенного остеогенеза.

1.5.2. Гены, ответственные за развитие рецессивных форм несовершенного остеогенеза.

1.6. Гено-фенотипические корреляции.

1. 7. Диагностика несовершенного остеогенеза.

1.7.1. Дифференциальная диагностика.

1.8. Современные подходы к лечению больных несовершенным остеогенезом.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы исследования.

2. 2. Молекулярно-генетические методы исследования.

2.2.1. Выделение геномной ДНК человека.

2.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК. •

2.2.3. Рестрикционный анализ.

2.2.4. Метод электофореза.

2.2.5. Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (БВСР-анализ).

2.2.6. Секвенирование.

2.3. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Эпидемиологическое исследование несовершенного остеогенеза в Республике Башкортостан.

3.2. Анализ нуклеотидной последовательности генов коллагена I типа у больных несовершенным остеогенезом.

3.2.1. Поиск мутаций в гене COLI AI у больных несовершенным остеогенезом из Республики Башкортостан.

3.2.2. Исследование полиморфных вариантов в гене COLI AI у больных несовершенным остеогенезом и в группе контроля из Республики Башкортостан.

3.2.3. Анализ мутаций в гене COL1A1 у больных несовершенным остеогенезом из Республики Саха (Якутия).

3.2.4. Изучение структурных изменений в гене COL1A2 у больных несовершенным остеогенезом и в группе контроля из Республики Башкортостан.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эпидемиологическое и молекулярно-генетическое исследование несовершенного остеогенеза"

Несовершенный остеогенез (НО) или синдром голубых склер — это клинически и генетически гетерогенное наследственное заболевание соединительной ткани, встречающееся с частотой от 1:10000 до 1:30000 населения в различных странах мира [Byers et al., 1992; Prockop et al., 1993; Prockop et al., 1995; Lee et al., 2006; Pollitt et al., 2006; Kataoka et al., 2007; Liu et al., 2007; Witecka et al., 2008; Bodian et al., 2009; Swinnen et al., 2009; Zhang et al., 2011]. К основным клиническим признакам НО относятся повышенная ломкость костей, голубые склеры, низкий рост, снижение слуха, деформация костей скелета и аномалии дентина [Pollitt et al., 2006; Kataoka et al., 2007; Liu et al., 2007]. Изначально врачи связывали заболевание с нарушениями метаболизма минералов и пытались лечить заболевание диетой, обогащенной кальцием. Однако с 1970 года стало ясно, что НО — результат аномалий в главном белке экстрацеллюлярного матрикса — коллагене I типа [Willing et al., 1994; Byers et al., 1991; Slayton et al., 2000; Ward et al., 2002].

Существует 11 клинических форм НО, тяжесть заболевания варьирует от легкой до внутриутробной летальной, наследуются как по аутосомно-доминантному, так и аутосомно-рецессивному типу [Bodian et al., 2009; Swinnen et al., 2009] (табл. 2). Рядом исследователей отмечается 5-7% спорадических случаев заболевания, обусловленных мутациями de novo, приводящих, как правило, к 2 или 3 типу НО [Thompson et al., 1987; Benusiene et al., 2003; Venturi et al., 2006]

Генетическим дефектом в 90% случаях заболевания являются мутации в двух генах коллагена I типа - al цепи (COL1A1) и а2 цепи (COL1A2). Остальные 10% случаев заболевания обусловлены мутациями в генах хрящ-ассоциированного белка (CRTAP), лейцин-пролин обогащенного протеогликана (LEPRE1) и циклофилина В (PPIB), участвующих в пострансляционной модификации коллагена I типа, в генах серпина HI (SERPINH1) и ядерного фактора каппа В (FKBP10% выполняющих шаперонную функцию при фолдинге белка коллагена I типа, а также в гене серпин Fl (SERPINF1), кодирующего производное фактора пигментного эпителия [Barnes et al., 2006; Baldridge et al., 2008; Van Dijk et al., 2009; Alanay et al., 2010; Barnes et al., 2010; Christiansen et al., 2010; Becker et al., 2011]. Известно более 1000 изменений нуклеотидной последовательности вышеперечисленных генов у больных НО [https://oi.gene.le.ac.uk/].

В последние годы появились новые данные о патогенезе заболевания, гено-фенотипических корреляциях, расширена классификация и созданы новые принципы лечения больных несовершенным остеогенезом [Barnes et al., 2006; Baldridge et al., 2008; Cheung et al., 2008; Witecka et al., 2008; Van Dijk et al., 2009; Alanay et al., 2010; Barnes et al., 2010; Christiansen et al., 2010; Becker et al., 2011; Ben Amor et al., 2011]. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в понимании молекулярно-генетических основ несовершенного остеогенеза, остается еще открытым ряд ключевых вопросов, касающихся патогенеза этого заболевания. Многими исследователями отмечаются значительные трудности в сопоставлении результатов молекулярно-генетического анализа с клинической картиной НО. Также установлено, что схожие фенотипические признаки нарушения костного ремоделирования могут наблюдаться и при других заболеваниях [Venturi et al., 2006]. Учитывая инвалидизирующее течение, клиническую и генетическую гетерогенность, наследственный характер заболевания, а также отсутствие эффективных способов лечения пациентов, определение первичного генетического дефекта является необходимым условием для разработки оптимальных подходов ДНК-диагностики НО с целью предотвращения рождения больных детей в отягощенных семьях с учетом этнических особенностей региона.

Цель работы:

Задачи исследования:

2. Создать банк-ДНК больных несовершенным остеогенезом и членов их .семей. .

3. Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в генах COLI AI и COLlA2y больных несовершенным остеогенезом.

4. Провести анализ корреляций обнаруженных;мутаций изученных генов с формой и типом наследования заболевания.

5. Провести исследование роли идентифицированных , полиморфных вариантов генов COLI AI и COL1A2 в развитии несовершенного остеогенеза.

Научная новизна.: Впервые дана эпидемиологическая характеристика несовершенного отсеогенеза« в Республике Башкортостан с учетом административно-территориальной и- этнической подразделенностш населения региона; Впервые в России проведено исследование; структурных изменений - генов аГ и а2 цепей коллагена I типа (COLIAI и COL1A2) у, больных несовершенным остеогенезом из. Республики Башкортостан (РБ) и Республики Саха (Якутия): Впервые описаны нонсенс-мутация с.967G>T (p.Gly323X) в-гене COLI AI у больного русской этнической; принадлежности из РБ, приводящая к НО 1 типа с аутосомно-доминантным наследованием, и мутация сдвига рамки- считывания с.З540^354linsC (p.Gly l:181AlafsX293) в гене COLI AI у пациента якутского происхождения с легкой; формой НО 1 типа из Рёспублики Якутия. Впервые, определены два изменения нуклеотидной последовательности1 с.544-24С>Т; и c:957+10insA в гене COLI AI у больного русской этнической принадлежости, у которого также была выявлена нонсенс-мутация с.2869С>Т (р.Gln957X). Впервые определен спектр и;частоты полиморфных вариантов генов al и а2 цепей коллагена I типа, характерных для больных НО и здоровых индивидов из Республики Башкортостан.

Научно-практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить представление . о; молекулярно-генетических основах развития несовершенного остеогенеза, служат основой для, разработки: ДНК-диагностики данного заболевания, в том числе пренатальной, оптимальной . ; для Башкортостана и Якутии и внедрения в практику Республиканского перинатального центра, РБ, медицинских диагностических центров и , лечебных учреждений республики. Результаты; исследования могут быть использованы при чтении, курсов медицинской генетики на биологических факультетах: университетов, в медицинских ВУЗах, и на. курсах повышения квалификации медицинских работников:

Положения, выносимые на защиту:

1. Неравномерность территориального распространения несовершенного' остеогенеза в Республике Башкортостан- с преобладанием аутосомно-рецессивных форм. . ■ .','.;. .: " . '

2. Идентификация, мутацию с.579с1е1Т (р.01у1?4¥а1йХ71); ; с.9676>Т • (р.01у323Х), с.1081С>Т (р.Агё361Х), с.124ЭОТ (р.А^415Х), с.2869С>Т (р.01п957Х), и с.2444аеЮ'(р.01у815А1аГзХ293) в гене СОЫЛ1 у больных, несовершенным остеогенезом из:Республики Башкортостан

3. Определение . 17 полиморфных локусов в гене. СОЫА1 и анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов в гене СОЬ1 Л ] у больных НО и в группе контроля из РБ.

4. Идентификация мутаций с.3540354НпйС . (р.(Шу П81А1аГзХ38) и с.4005+10>Т в гене СОЫА1 у больных несовершенным остеогенезом из Республики Саха (Якутия).

5. Гено-фенотипические корреляции мутаций: с.967С>Т (р.01у323Х), с. 1081 С>Т (р.Аг§36ГХ), с-2869С>Т (р.С1п957Х), с.579(1е1Т (р.О!у 194Уа1ГзХ71), с.4005+Ш>Т, с.2444с1е1е (р.С1у815А1аГзХ293) и c.35403541insC (p.Glyl 181AlafsX38) с НО 1 типа, мутации с.1243С>Т (p.Arg415X) с НО 3 типа.

6. Идентификация 7 полиморфных локусов гена COL1A2 у больных НО и в группе контроля из РБ и анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов в гене COL1A2 у больных НО и в группе контроля из РБ.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Надыршина, Дина Даяновна

ВЫВОДЫ

2. У 21,2% больных несовершенным остеогенезом из Республики Башкортостан в гене COLI Al выявлено 6 мутаций: 4 нонсенс-мутации c.967G>T (p.Gly323X), С.10810Т (p.Arg361X), с.1243С>Т (p.Arg415X), С.28690Т (p.Gln957X) у пациентов русского происхождения и две мутации сдвига рамки считывания c.579delT (p.Glyl94ValfsX71), c.2444delG (p.Gly815AlafsX293) у больных НО татарской этнической принадлежности. Мутация c.967G>T (p.Gly323X) описана впервые.

3. У больных НО в гене COLI Al обнаружены 17 однонуклеотидных полиморфных вариантов. Аллель *G полиморфного локуса rs 1763 9446 (Х2=3,91, р=0,048; (OR=3,310 (С1 (0,954-11,48) и гаплотип *T*del*T полиморфных вариантов -1997G>T, -1663indelT и +1245G>T (%2=4,99, р=0,025; (OR=3,53) являются рисковыми. Полиморфные варианты С.544-240Т и c.957+10insA в гене COLI Al описаны впервые.

4. У 20% больных несовершенным остеогенезом из Республики Саха (Якутия) в гене COL1A1 выявлены 2 различные мутации: c.35403541insC (p.Glyll81AlafsX38) у больного НО якутской этнической принадлежности и мутация сплайсинга с.4005+1 G>T у пробанда русской этнической принадлежности. Мутация c.35403541insC (p.Glyll81AlafsX38) описана впервые.

5. Гено-фенотипический анализ показал, что мутации c.967G>T (p.Gly323X), С.10810Т (p.Arg361X), с.2869С>Т (p.Gln957X), c.579delT (p.Gly 194ValfsX71) и c.4005+lG>T гена COL1A1 приводят к легкой форме НО 1 типа с аутосомно-доминантным типом наследования, мутация с.1243С>Т (p.Arg415X) - к спорадическому случаю НО 3 типа тяжелой формы, мутации c.2444delG (p.Gly815AlafsX293) и c.35403541insC (p.Glyl 181AlafsX38), возникшие de novo, приводили к легкому фенотипу заболевания с 1 типом НО.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

НО является клинически и генетически гетерогенным наследственным заболеванием соединительной ткани. На сегодняшний день выявлено 8 генов, ответственных за развитие 11 типов НО. Генетический дефект, который обуславливает развитие НО 5 типа, до сих пор еще не определен.

Эпидемиологические, клинические, а также молекулярно-генетические аспекты НО изучены многими группами зарубежных исследователей. Однако в России нет официальных данных о распространенности данного заболевания, молекулярно-генетическое изучение НО не проводилось.

Эпидемиологическое исследование НО в РБ показало неравномерный характер распространения заболевания, составляя в среднем - 1 на 45000 населения с преобладанием аутосомно-рецессивных форм. Заболевание зарегистрировано в 29 из 54 административных районов ив 11 из 21 города Республики. Наибольшие показатели распространенности заболевания выявлены в Кушнаренковском (17,5:100000 населения), Нуримановском (14,2:100000 населения) и Аскинском районах (16,8:100000 населения). Среди больных НО из РБ выявлены 57 мальчиков (54%) и 48 девочек (46%). Средний возраст больных НО на момент обращения в медико-генетическую консультацию Республиканского перинатального центра составил примерно 6 лет (начиная с рождения и до 16 лет). В РБ распределение больных НО по этническому составу оказалось следующим: 34% составили татары, русских - 30%, башкир- 20% и 16%- составили метисы и больные из армянских, марийских, украинских и чувашских семей.

Проведен анализ нуклеотидной последовательности 51 экзона, прилегающих интронных областей и регуляторного региона гена al цепи (COL1A1) и 52 экзонов и прилегающих интронных областей гена а2 цепи (СОЫА2) коллагена I типа у 41 больного несовершенным остеогенезом из 33 семей и 70 их родственников из Республики Башкортостан (РБ), а также у 15 больных НО из 12 семей из Республики Саха (Якутия).

У больных НО из РБ в гене COLI AI выявлено 6 различных мутаций: 4 нонсенс-мутации c.967G>T (p.Gly323X), С.10810Т (p.Arg361X), с.1243С>Т (p.Arg415X), C.28690T (p.Gln957X) у пациентов русского происхождения и две мутации сдвига рамки считывания c.579delT (p.Glyl94ValfsX71), c.2444delG (p.Gly815AlafsX293) у больных НО татарской этнической принадлежности. Мутация c.967G>T (p.Gly323X) описана впервые.

У больных НО из Якутии в гене COLI AI были выявлены 2 различные мутации: мутация сдвига рамки считывания c.35403541insC (p.Glyll81AlafsX38) у больного НО якутской этнической принадлежности и мутация сайта сплайсинга c.4005+lG>T у пробанда русской этнической принадлежности.

Таким образом, у больных НО из РБ и Якутии были определены 3 типа мутаций: нонсенс-мутации, мутации сдвига рамки считывания и мутация сайта сплайсинга, которые относятся к количественным мутациям, приводящим к уменьшению количества нормального коллагена из-за нестабильности аномальной РНК. Количественные мутации приводят к более легким клиническим проявлениям заболевания. Так, все обнаруженные нами мутации приводили к легкому НО 1 типа, за исключением мутации с.1243С>Т (p.Arg415X), которая приводила к более тяжелому 3 типу НО. Мутации в гене COLI AI были определены у 21,2% исследованных семей из Республики Башкортостан и у 20% исследованных семей из Республики Саха (Якутия), которые оказались информативны для проведения пренатальной диагностики. Все выявленные мутации являлись уникальными для каждой семьи (за исключением c.579delT (p.Glyl94ValfsX71, обнаруженной в двух неродственных семьях).

У больных НО в гене COLI AI было выявлено 17 различных однонуклеотидных полиморфных вариантов (SNP), 3 из которых расположены в промоторном регионе, 13 - в интронных участках и 1- в экзонной области гена COL1A1. Для определения функциональной значимости полиморфных вариантов в развитии заболевания нами был проведен сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов между больными и контролем. Статистически значимые различия между больными и контролем были определены в распределении частоты аллеля *G полиморфного локуса rsl7639446 (х2=3,91, р=0,048; (Ж=3,310 (С1 (0,95411,48) и гаплотипа *T*del*T полиморфных вариантов -1997G>T, -1663indelT и +1245G>T (х2=4,99, р=0,025; (OR=3,53 (1,23-10,11), носительство которых является рисковым. Два изменения нуклеотидной последовательности с.544-24С>Т и c.957+10insA описаны впервые.

Учитывая, что все выявленные полиморфные варианты гена COLI Al располагаются в одном гене, мы провели анализ сцепления. Из анализа были исключены полиморфные варианты с.544-24С>Т, c.643-36delT и c.957+10insA, т.к. они были выявлены лишь в одной семье и не обнаружены в контроле и в других семьях больных НО. Было показано, что в тесном сцеплении межу собой находились полиморфные локусы rs2256835 и rs 1800012 (второй блок). В результате гаплотипического анализа было выявлено, что частота гаплотипа *CG полиморфных вариантов rs2256835 и rs 1800012 достоверно различалась между больными и контролем, носительство данного гаплотипа оказалось протективным (% =6,76, р=0,009) (OR=0,44 (С1 (2,52-0,78).

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов остальных полиморфных локусов гена COLI Al не выявил статистически значимых различий между больными НО и контролем, что предполагает их нейтральный характер.

В гене COL1A2 у больных НО изменения подвижности однонитевой ДНК были определены в четырех интронах (18, 19, 25, 28) и двух экзонах (25, 28). В остальных участках гена COL1A2 изменений не было обнаружено. Последующее секвенирование образцов с измененной подвижностью позволило идентифицировать 7 различных однонуклеотидных полиморфных вариантов (SNP). При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов гена COL1A2 статистически значимых различий между больными и контролем выявлено не было: Достоверные значимые различия между больными и группой контроля были выявлены в распределении, частот гаплотипа *ТАА полиморфных вариантов rs42518, rs28754326 и rs2521206 (х2=4,82, р=0,028) (OR=0,06 (С1(0,003-1,1) (первый блок) и *TGCA полиморфных, локусов rs42524, rs421587, rs42518 и rs28754326 (%2=7.023- р=0Ю08) (OR==0,043; (01(0,002-0^,742) (третий-блок) гена COLJA2, которые являлись протективными.

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов остальных полиморфных локусов гена COLJA2 не выявил статистически значимых различий-между больными НО и контролем, что предполагает их нейтральный характер в развитии НО.

Проведенное; нами исследование показало, что для больных НО из РБ и Республики Саха (Якутия) поиск . мутаций. в гене GOL1A2 является нецелесообразным. Вероятно, в семьях, где не выявлены мутации в генах коллагена? I типа, необходимо исследовать гены, участвующиие в процессинге и модификациях коллагена 1\ типа. Наши данные не противоречат результатам1 ряда* исследователей;, Так, у . больных НО из Литвы, Китая и Израиля также обнаружены: мутации только в а! цепи- и.не: выявлены в?а2"цепшгена коллагена Ктипа [Benusiene et al., 2003; Ries-Levavi etal, 2004; Yang et al., 2011]. : : . ; .

Таким образом, проведенные нами исследования вносят существенный вклад в понимание, молекулярно-генетических особенностей; заболевания и гено-фенотипических корреляций; при- несовершенном, остеогенезе. Результаты данной работы могут также послужить теоретической и методической основой для разработки и оптимизации молекулярно-генетической диагностики такого сложного заболевания» как несовершенный, остеогенез.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Надыршина, Дина Даяновна, Уфа

1. Галеева Н.М., Назаренко Л.П., Назаренко С.А. Молекулярно-генетическая причина наследственной метгемоглобинемии первого типа в Якутии // Мед.генетика.- 2006. Т. 5. —С. 15-20.

2. Генофонд и геногеография народонаселения // Под ред. Ю.Г. Рычкова. Т.1. Генофонд населения России и сопредельных стран. СПб.: Наука, 2000. 611с.

3. Гоголев А.И. Этническая история народов Якутии (до начала XX в.): Якутск, изд. ЯГУ, 2004.- 104с.

4. Иллариошкин С.Н., Руденская Г.Е., Иванова-Смоленская И.А. и др. Наследственные атаксии и параплегии // М.: МЕДпресс-информ. —2006.-416с.

5. Кадурина Т.И. Наследственные коллагенопатии (клиника, диагностика, лечение и диспансеризация). СПб: Невский Диалект. -2000. -271с

6. Максимов Г.Н. Родная Якутия: Природа, люди, природопользование. Якутск: Бичик.- 2003. -168с.

7. Попова С.Н., Сломинский П.А., Галушкин С.М. и др. Анализ аллельного полиморфизма триплетных повторов (CTG)n и (CAG)n в генах DM, DRPLA и SC AI в различных популяциях России // Генетика. 2002. - Т. 38,-№ 11.- С. 1549-1553.

8. Пузырев В.П. Генетика мультифакториальных заболеваний: между прошлым и будущим // Мед. генетика. 2003. - Т. 2. - № 12.- С.498-508.

9. Пузырев В.П., Максимова Н.Р. Наследственные болезни у якутов // Генетика. -2008.- Том 44. № 10.- С. 1308-1314.

10. Пузырев В.П., Фрейдин М.Б., Кучер A.H. Генетическое разнообразие народонаселения и . болезни человека // Томск: Печатная мануфактура.- 2007.- 320с.

11. Степанов В.А. Этногеномика населения Северной Евразии. Томск: Печатная мануфактура. 2002. - 244с.

12. Федорова CA., Хусаинова P.M., Кутуев И.А. и др. Полиморфизм (CTG)-noBTopoB гена миотонинпротеинкиназы в популяциях Республики Саха (Якутия) и Средней Азии // Молекулярная биология. 2005. - Т. 39. - № 3. - С.385-393.

13. Aarabi М., Rauch F., Hamdy R.C., Fassier F. High prevalence of coxa vara in patients with severe osteogenesis imperfecta // J Pediatr Orthop. -2006. Vol. 26. - P. 24-28.

14. Alanay Y., Avaygan H., Camacho N., Utine G. E., Boduroglu K. et.al. Mutations in- the Gene Encoding the RER Protein FKBP65 Cause Autosomal-Recessive Osteogenesis Imperfecta // The American Journalof Human Genetics. -2010. -V.86. -P.551-559.

15. Anum E.A., Hill L.D., Pandya A., Strauss J.F. Connective Tissue and Related Disorders and Preterm Birth: Clues to Genes Contributing to Prematurity // Placenta. 2009. - Vol. 30. - P. 207-215.

16. Baldridge D., Schwarze U., Morello R., Lennington J., Bertin T. K., Pace J.M., et.al. CRTAP and LEPRE1 mutations in recessive osteogenesis imperfecta // Hum Mutat. 2008. - P. 1435-1442.

17. Barnes A.M., Carter E.M., Cabral W.A. et al. Lack of Cyclophilin B in Osteogenesis Imperfecta with Normal Collagen Folding // The new england journal of medicine. 2010. -V.362. - P.521-528.

18. Barnes A.M., Chang W., Morello R., Cabral W.A., Weis M., Eyre D.R., Leikin S. et al. Deficiency of Cartilage-Associated Protein in Recessive Lethal Osteogenesis Imperfecta // N Engl J Med. 2006. - Vol. 355. - P. 2757-64.

19. Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps // Bioinformatics. 2005. -21(2). -P. 263-265.

20. Ben Amor I.Mouna, Glorieux Francis H., Rauch Frank. Genotype-Phenotype Correlations in Autosomal Dominant Osteogenesis Imperfecta // Journal of Osteoporosis. 2011. - P. 9.

21. Benusiene E, Kucinskas V. COL1A1 mutation analysis in Lithuanian patients with osteogenesis imperfect // J Appl Genet. 2003. - V.44(l). — P. 95-102.

22. Breslau-Siderius E.J., Engelbert R.H., Pals G., Van der Sluijs J*.A. Bruck syndrome: a rare combination of bone fragility and multiple congenitaljoint contractures // J Pediatr Orthop B. 1998. - Vol. 7. - P. 35-38. »

23. Byers P.H. Oseogenesis imperfecta: perspective and opportunities // Curr Opin Pediatr. 2000. - P. 603-609.

24. Byers P.H. Osteogenesis imperfecta. In: Royce PM, Steinmann B, eds. Connective tissue and its heritable disorders: molecular, genetic and medical aspects. New York. -Wiley-Liss. - 1992. - P. 317-350.

25. Byers P.H., Krakow D., Nunes M.E., Pepin M. Genetic evaluation of suspected osteogenesis imperfecta (OI) // Genet Med. 2006. - Vol. 8. — P. 383-388.

26. Byers P.H., Steiner R.D. Osteogenesis imperfecta // Annu Rev Med. -1992.-Vol. 43.-P. 269-282.

27. Byers P.H., Wallis G.A., Willing M.C. Osteogenesis imperfecta: translation of mutation to phenotype // J Med Genet. — 1991. Vol. 28. -P. 433-442.

28. Cabral W.A., Marini J.C. Hihg proportion of mutant osteoblast is compatible with normal skeletal function in mosaic carriers of osteogenesis imperfecta. Am.J.Hum.Genet. 2004. - Vol. 7. - P. 752-760

29. Chan TF, Poon A, Basu A, Addleman NR, Chen J, Phong A, Byers PH, Klein TE, Kwok PY. Natural variation in four human collagen genes across an ethnically diverse population // Genomics. — 2008. Vol. 91(4). -P. 307-14.

30. Cheung M.S., Glorieux F.H. Osteogenesis Imperfecta: Update on presentation and management // Rev Endocr Metab Disord. — 2008. Vol. 9.-P. 153-160

31. Cinman N. Osteogenesis imperfecta. A life not so fragile // Lancet 358 Suppl: S46.-2001.

32. Cole D.E., Carpenter T.O. Bone fragility, craniosynostosis, ocular proptosis, hydrocephalus, and distinctive facial features: a newly recognized type of osteogenesis imperfecta // J Pediatr. — 1987. — Vol. 110.-P. 76-80.

33. Cole WG, Dalgleish R. Perinatal lethal osteogenesis imperfecta // J Med Genet.- 1995.-Vol.32.-P. 284-289.

34. Cooper C., Dennison E.M., Leufkens H.G., Bishop N.,. Van Staa T.P: Epidemiology of childhood fractures in Britain: a study using the general' practice research database // J Bone Miner Res.- 2004. -Vol. 19.- P.-1976-1981.

35. Cubert R:, Cheng E.Y., Mack S., Pepin M:G., Byers P.H. Osteogenesis imperfecta: mode of delivery and neonatal outcome // Obset Gynecol. 2001. Vol. 97(1).-P. 66-9.

36. Engelbert R.H:, Pruijs H.E.-, Beemer F.A., Helders P.J. Osteogenesis imperfecta in childhood: treatment strategies // Arch Phys Med Rehabil.1998. Vol. 79. - P. 1590-1594.

37. Epstein M.P., Satten G.A. Inference on haplotype effects in case-control studies using unphased genotype data // Am. J. Hum. Genet. 2003. — Vol.73.-P. 1316-1329.

38. Fleisch H. Bisphosponates: mechanisms of action // Endocr Rev. — 1998. -Vol. 19.-P. 80-100.

39. Forlino A, Cabral WA, Barnes AM, Marini JC. New perspectives on osteogenesis imperfecta. Nat Rev Endocrinol. -2011. -Vol. 7(9). P. 54057.

40. Fraser R.D.B., MacRae T.P. and Suzuki E., Chain conformation in the collagen molecule // J. Mol. Biol. 1979. - Vol. 129. - P. 463-481.

41. Fujino Т., Morii Т., Tajima Т., Honya K., Horita A., Mochizuki K., Fusioka K.S. Sporadic osteogenesis imperfecta type V in an 11-year-old Japanese girl. // J Orthop Sci. 2010. - Vol. 15. - P. 589-593.

42. Gajko-Galicka A. Mutations in type I collagen genes resulting in osteogenesis imperfecta in humans // Acta Biochimica Polonica.- 2002. -Vol. 49.-No. 2.-P. 433-441.

43. Garcia-Giralt N, Enjuanes A, Bustamante M et al. In vitro functional assay of alleles and haplotypes of two COL1A1- promoter SNPs // Bone. 2005. -Vol. 36. -№5. P. 902-908.

44. Gat-Yablonski Galia, Ries Liat, Lev Dorit, Goldman Boleslaw, Friedman

45. Eitan. A missense mutation in Collai in a Jewish Israeli patient with mild osteogenesis imperfecta, detected by DGGE // Hum Genet. -1997.-Vol. 101.-P. 22-25.

46. Glorieux F.H., Bishop N.J., Plotkin H., Chabot G., Lanoue G., Travers R. Cyclic administration of pamidronate in children with severe osteogenesis imperfecta // N Engl J Med. 1998. - Vol. 339. - P. 947-952.

47. Glorieux F.H., Rauch F., Plotkin H., Ward L., Travers R., Roughley P., et al. Type V osteogenesis imperfecta; a new form of brittle bone disease // J Bone Miner Res. 2000. - Vol. 15. - P. 1650-1658

48. Glorieux F.H., Ward L.M., Rauch F., Lalic L., Roughley P.J., Travers R. Osteogenesis imperfecta type VI: a form of brittle bone disease with a mineralization defect // J Bone Miner Res. 2002. - Vol. 17. - P. 30-38.

49. Glorieux Francis H. Caffey disease: an unlikely collagenopathy // The Journal of Clinical Investigation. 2005.- Vol. 115.

50. Goldfarb L.G., Vasconselos O., Platonov F.A. et al. Unstable triplet and phenotypic variability of spinocerebellar ataxia type 1 // Ann. Neurol. — 1996. Vol. 39. - P. 500-506.

51. Grant S.F., David M.Reid, Glen Blake et al. Reduced bone density and osteoporosis associated with a polymorphic Spl binding site in the collagen type I a 1 gene//Nature genetics. 1996. Vol.14. P.203-205

52. Huilin Jin, Rob J. van't Hof, Omar M.E. Albagha and Stuart H. Ralston. Promoter and intron 1 polymorphisms of COL1A1 interact to regulate transcription and susceptibility to osteoporosis // Human Molecular Genetics.-2009. — Vol. 15. P. 2729-2738.

53. Ishikawa, Y., Wirz, J., Vranka, J. A., Nagata, K. & Bachinger, H. P. Biochemical characterization of the prolyl 3-hydroxylase 1, cartilage-associated protein, cyclophilin B complex // J. Biol. Chem.- 2009.- Vol. 284.-P. 17641-17647.

54. Kataoka K., Ogura E., Hasegawa K., Inoue M., Seino Y., Morishima T., Tanaka H. Mutations in type I collagen genes in Japanese osteogenesis imperfecta patients // Pediatrics international . 2007. - Vol. 49. - P.564.569.

55. Koay M.A., Brown M.A. Genetic disorders of the LRP5-Wnt signalling pathway affecting the skeleton // Trends Mol Med. 2005. Vol. 11. - P. 129-37.

56. Kuurila, K., Grenman, R., Johansson, R. & Kaitila, I. Hearing loss in children with osteogenesis imperfecta // Eur. J. Pediatr. — 2000. Vol. 159.-P. 515-519.

57. Kuurila, K., Kaitila, I., Johansson, R. & Grenman, R. Hearing loss in Finnish adults with osteogenesis imperfecta: a nationwide survey I I Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 2002. - Vol. 111.- P. 939-946.

58. Labuda M., Morissette J., Ward L.M., Rauch F., Lalic L., Roughley P.J., Glorieux F.H. Osteogenesis imperfecta type VII maps to the short arm of chromosome 3 // Bone. 2002. - Vol. 31(1). - P. 19-25.

59. Landin LA. Fracture patterns in children. Analysis of 8,682 fractures with special reference to incidence, etiology, and secular changes in a Swedish urban population 1950-1979 // Acta Orthop Scand Suppl. 1983.-Vol. 202.-P. 1-109.

60. Lee K.H., Kuczera K., Holl M.M. Effect of osteogenesis imperfecta mutations on free energy of collagen model peptides:; a molecular dynamics simulation//Biophys Chem. 20IT. - Vol. 156(2-3). -P. 1.4652. ' ■■'" ; ' ■ . ; ' : . '

61. Lee K-S., Song H-R., Clio. T-J., et al. Mutational spectrum- of type 1• collagen genes in Korean patients with osteogenesis imperfecta// Human

62. Mutation.- 2006. Mutation in Brief.#894 Online:

63. Liu P, Lu Y, Long J, Xu F, Shen H, Recker R,.Deng H. Common variants at the PCOL2 and' SpL binding sites- of the COL1 Al gene and- their ; interactive effect influence bone mineral density in Caucasians // J Med Genet. -20041 -Vol: 41.-P. 752-757.

64. Liu W., Gu F., Ji J., Lu D., Li X., Ma X. A novel COL 1A1 nonsense mutation causing osteogenesis, imperfecta in a Chinese family // Molecular Vision: — 2007. VoL 13: — P. 360-65 .

65. Maksimova N., Hara K., Miyashita et al.Clinical, molecular and histopathological featurea of short stature syndrome with novel CUL7 Mutation in Yakuts: new population isolate in Asia // J. Med. Genet. -2007. Vol. 44. - P. 772-778.

66. Mann V, Hobson EE, Li B, Stewart TL et al A COL1A1 Spl binding site polymorphism predisposes to osteoporotic fracture by affecting bone density and quality // J Clin Invest.- 2001. Vol.107. -№ 7. - P. 899-907.

67. Marini, J. C., Cabral, W. A. & Barnes, A. M. Null mutations in LEPRE1 and CRTAP cause severe recessive osteogenesis imperfecta // Cell Tissue Res.- 2009. Vol. 339. - P. 59-70.

68. Martin E., Shapiro J.R. Osteogenesis Imperfecta: Epidemiology and Pathophysiology // Current Osteoporosis Reports. 2007. - Vol. 5. - P. 91-97.

69. Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA// methods in molecular biology / ED. Walker J.M. N.Y.: Haman press. -1984.-P. 31-34.

70. Munns C.F., Rauch F., Travers R., Glorieux FH. Effects of intravenous pamidronate treatment in infants with osteogenesis imperfecta: clinical and histomorphometric outcome // J Bone Miner Res. 2005. - Vol. 20. -P. 1235-43.

71. National Institutes of Health Osteoporosis and Related Bone Diseases ~ National Resource Center. Osteogenesis Imperfecta Overview. http://www.niams.nih.gov/HealthInfo/Bone/OsteogenesisImperfecta/de fault, asp

72. Orita M, Jmahana H. Kanazawa H. Et.al. Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single cell conformation polymorphism // Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. - Vol.86. - P. 2766-2770.

73. Paterson, C. R., Monk, E. A. & McAllion, S. J. How common is hearing impairment in osteogenesis imperfecta? // J. Laryngol. Otol. — 2001. -Vol. 115.-P. 280-282.

74. Plotkin H., Rauch F., Bishop N.J., Montpetit K., Ruck-Gibis J., Travers R., Glorieux F.H. Pamidronate treatment of severe osteogenesis imperfecta in children under 3 years of age // J Clin Endocrinol Metab. -2000.-Vol. 85.-P. 1846-1850.

75. PollittR., McMahonR., Nunn J., BamfordR., Afiff A., BishopN., Dalton

76. A. Mutation analysis of COL 1A1 and COL 1A2 in patients diagnosed with osteogenesis imperfecta type I-IV // Human Mutation Mütation.- 2006. -Vol. 27 (7). P. 716.

77. Prockop D.J. and Kivirikko K.I. Collagens: molecular biology diseases and.potentials for therapy // Annu. Rev. Biochem.- 1995. Vol. 64. - P. 403-434.

78. Prockop D.J., Chu M.L. Collagen: gene structure. In:.; Royce PM, Steinmann B, ed. Connective tissue and its heritable disorders; 1st ed. New York: Wiley-Liss. 1993. - P. 149 -167

79. Rauch F., Gloneux E.H: Osteogenesis imperfecta // Lancet. 2004'. - Vol. 363.-P. 1377-85. : ,

80. Rauch F., Plotkin H:, Zeitlin L., Glorieux F.H. Bone mass, size and density in children and: adolescents with;, osteogenesis imperfecta: Effect of intravenous Pamidronate therapy // J Bone Miner Res. 2003. — Vol. 18.-P. 610-614.

81. Rauch?F:, Traverse R:,, Norman M.E., Taylor A., Parfitt A.M:, Glorieux F.Hi Deficient bone formation, in idiopathic juvenile osteoporosis: a histomorphometric study of cancellous iliac bone // J Bone Miner Res. — 2000. Vol. 15. - P. 957-63.

82. Redford-Badwal D;A., Stover M.L., Valli M. et al. Nuclear retention, of COLI A1 messenger RNA identifies null alleles causing mildosteogenesis imperfect // J Clin Invest. 1996. - V.15. - 1035-1040.

83. Reis F.C., Alexandrino F., Steiner C.E., Norato D.Y J., Cavalcanti D. P., Sartorato E. L. Molecular findings in Brazilian patients with osteogenesis imperfecta// J. Appl. Genet. 2005. -V. 46 (1).- P.105-108.

84. Rich A. and Crick F.H.C. The molecular structure of collagen // J. Mol. Biol. 1961. Vol. 3. -P. 483-506.

85. Ries-Levavi L., Ish-Shalom T., Frydman M. et al. Genetic and biochemical analyses of Israeli osteogenesis imperfecta patients // Hum Mutat. 2004. - V. 23(4). - P. 399-400.

86. Roschger P., Fratzl-Zelman N., Misof B.M. et al. Evidence that abnormal high bone mineralization in growing children with osteogenesis imperfecta is not associated with specific collagen mutations // Calcif Tissue Int. 2008. - V. 82 (4). - P. 263-270.

87. Roughley P.J., Rauch F., Glorieux F.H. Osteogenesis imperfecta — clinical and molecular diversity // European Cells and Materials. 2003 - Vol. 5. — P. 41-47.

88. Scheer U., Hinssen H., Franke W.W., Jockusch B.M. Microinjection of actin-binding proteins and actin antibodies demonstrates involvement of nuclear actin in transcription of lampbrush chromosomes // Cell. — 1984. -Vol. 39.-P. 111-122.

89. Shaheen R, Al-Owain M, Sakati N, Alzayed ZS, Alkuraya FS. FKBP10 and Bruck syndrome: phenotypic heterogeneity or call for reclassification? // Am J Hum Genet.- 2010. Vol. 87(2). - P. 306-7.

90. Sillence D.O., Senn A., Danks D.M. Genetic heterogeneity in osteogenesis imperfecta // J Med Genet. 1979. - Vol. 16(2). - P. 101-16.

91. Slayton R.L., Deschenes S.P., Willing M.C., Nonsense mutations in the

92. Stewart TL, Röschger P, Misof BM, Mann V et al. Association of COLTA1 Spl, alleles with defective bone nodule formation'in vitro and abnormal bone mineralization in vivo // Calcif Tissue Int. 2005. -Vol.77. - P.113-118.

93. Swinnen K.R., De Leenheer M.R., Coucke P.J., Cremers W.R.J., Dhooge J.M. Audiometrie, surgical, and genetic finding in 15 ears of patients with osteogenesis imperfecta // The American Laryngological. 2009.

94. Thompson E.M: , Young I.D;, Hall C.M., Pembrey M.E. Recurrence risksand prognosis in severe sporadic osteogenesis imperfecta // Journal of Medical Genetics.- 1987. Vol. 24. - P. 390-405.

95. Van der Slot A J, Zuurmond AM, Bardoel AF, Wijmenga C, Pruijs HE, Sillence DO, Brinckmann J, Abraham DJ, Black CM, Verzijl N, DeGroot

96. J, Hanemaaijer R, TeKoppele JM, Huizinga TW, Bank RA. Identificationiof PLOD2 as telopeptide lysyl hydroxylase, an important enzyme in fibrosis // J Biol Chem. 2003. - Vol. 278(42). - P. 40967-72.

97. Van Dijk FS,, Cobben JM, Pals G. Osteogenesis imperfecta, normal collagen folding, and lack of cyclophilin B // N Engl J Med. 2010. - V. 362(20).-P. 1940-1941.

98. Venturi G., Tedeschi E., Mottes M. et al. Osteogenesis imperfecta: clinical, biochemical and molecular findings // Clin Genet. 2006. - V. 70(2).-P. 131-139.

99. Vranka, J. A., Sakai, L. Y. & Bächinger, H. P. Prolyl 3-hydroxylase 1, enzyme characterization and identification of a novel family of enzymes // J. Biol. Chem. 2004.- Vol. 279. - P. 23615-23621.

100. Ward L.M., Rauch F., Travers R., Chabot G., Azouz E.M., Lalic L. et al.

101. Osteogenesis imperfecta type VII: an autosomal recessive form of brittle bone disease//Bone. 2002. - Vol. 31. - P. 12-18.

102. Weis, M. A. et al. Location of 3-hydroxyproline residues in collagen types, I, II, III, and V/XI implies a role in fibril supramolecular assembly // J. Biol. Chem.- 2009. Vol. 285.- P. 2580-2590.

103. Willing M.C., Deschenes S.P., Scott D.A., Byers P.H., Slayton R.L., Pitts S.H., et al. Osteogenesis imperfecta type I: molecular heterogeneity for COL1A1 null alleles // Am J Hum Genet. 1994. - Vol. 55. - P. 638647.

104. Willing M.C., Deschenes S.P., Slayton R.L., Roberts E.J. Premature chain termination- is a unifying mechanism for COL1A1 null alleles in osteogenesis imperfecta type I cell strains // Am J Hum» Genet. — 1996. -V. 59(4). P. 799-809.

105. Witecka J., Auguoeciak-Duma A.M., Kruczek A., Szydlo A. Two novel COL1A1 mutations in patients with osteogenesis imperfecta (OI) affect the stability of the collagen type I triple-helix // J Appl Genet. 2008. -Vol. 49(3).-P. 283-295.

106. Yamada Y., Ando F.,Niino N., Shimokata H. Association of a -1997G—»T polymorphism of the collagen Ialphal gene with bone mineral density in postmenopausal Japanese women // Hum. Biol. 2005.-Vol. 77.-P. 27-36.

107. Yoneyama T., Kasuya H., Onda H., Akagawa H., Hashiguchi K., Nakajima T., Hori T. and Inoue I., Collagen type I alpha2 (COL1A2) is the susceptible gene for intracranial aneurysms // Stroke. 2004.- Vol. 35.- P. 443-448.

108. Z. Yang,' Z.F. Ke, C. Zeng, Z. Wang, H.J. Shi and L.T. Wang. Mutation characteristics in type I collagen gene in Chinese patients with osteogenesis imperfecta. Genetics and Molecular Research. 2011. — Vol. 10(1).-P. 177-185.

Информация о работе

Надыршина, Дина Даяновна
кандидата биологических наук
Уфа, 2011
ВАК 03.02.07

Диссертация

Эпидемиологическое и молекулярно-генетическое исследование несовершенного остеогенеза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы