Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Частота спонтанных и индуцированных hprt-мутаций в лимфоцитах, их модуляция антиоксидантами и молекулярный анализ

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Частота спонтанных и индуцированных hprt-мутаций в лимфоцитах, их модуляция антиоксидантами и молекулярный анализ"

2 3

На правах ру кописи

Поллуцкий Андрей Яковлевич

Частота спонтанных и индуцированных Ьрй-мутаций в лимфоцитах, их модуляция антиоксидантами и молекулярный анализ.

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-1948

Работа выполнена в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН и в Каролинском Институте Шведской Академии Наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Газиев А. И доктор медицинских наук, профессор Ламберт Б (Lambert В.)

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Шевченко В.А. доктор химических наук Брусков В.И.

Ведущая организация: Институт Биофизики Клетки РАН, г.Пущино.

Защита состоится ¿3- /Д. 1998 г. в / Ь час. на заседании диссертационного совет Д 200.22.01 в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН, по адресу: 142292, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3 ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 200.22.01 кандидат биологических наук

"7 f

/

/

Нелипович П.А

1. ОГ,ШЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

туальиость темы.

Многочисленные исследования показывают, что под действием различных эндогенных и огенных факторов в ДНК и других макромолекулах клетки возникают повреждения, шекулярные защитные системы клетки и репарации ДНК не достаточно обеспечивают юстность генетической информации (Beckman and Ames. 1998). Малые дозы физических и иических агентов, различные эндогенные факторы способны вызывать мутационные и щирогенные нарушения в геноме клеток. Исследования, направленные на выяснение ханизмов генетической стабильности, изучение последствий действия физических и «ических факторов на живые организмы и создание средств, методов биомониторинга 1яются важнейшими задачами экологической биофизики.

Большую опасность для генофонда всего живого и в том числе человека представляют тианионные и химические мутагены, вводимые вереду обитания (Фешбах, Фредли. Экоцид в 'CP, 1992). Повреждения ДНК. если они не будут подвергнуты безошибочной репарации, гут служить причиной мутагенеза, трансформации и гибели клеток, а также развития шичных патологии и увеличения генетического груза в популяциях человека. Формирование тационных изменений в геноме в результате повреждения ДНК, ошибок репарации и пликации и существенное превышение их частоты над фоновым (спонтанным) уровнем может ужить биомаркером для оценки поврежденности opi анизма генотоксинами, эффективности нкционирования системы репарации, риска развития канцерогенеза, старения и других генеративных процессов (Vos , 1995 ). Одним из таких наиболее хорошо изученных и именимых к человеку биомаркеров является мутация по гену гипоксантин-гуанин-юфорибозил трансферазы (ЕС 2.4.2.8., hprt). Этот ген. последовательность которого известна, едставлен в Х-хромосоме единичной копией (Xq26-q27, Paj et al..1980). Люди, страдающие ндромом Леч-Найхана, имеют дефект по этому гену, и hprt -мутации для клеток 1екопнтающих не детальны (Rossiter et al., 1995). В ряде лабораторий ведутся исследования по тагенезу с использованием данного маркера, и особенно на лимфоцитах человека при йствии различных физических и химических агентов. Значительный интерес представляют следования с использованием маркера hprt по изучению эндогенных и экзогенных факторов, щулирующих мутагенез. Как известно, частота спонтанных hprt-мутаций в клетках человека еличивается с возрастом (Albertini et al., 1990). Это увеличение коррелирует с накоплением онтанных повреждений в ДНК (Mullaart eta!.. 1990; Ames et al.. 1993). Вместе с тем не статочно ясно, зависит ли от возраста организма уровень индуцируемых внешними агентами нных мутаций в клетках и, происходит ли снижение эффективности систем защиты клетки с зрастом, недостаточно изучены на молекулярном уровне механизмы закрепления

мутационных изменений в ДНК. Свои исследования мы попытались направить на поиски ответов, на эти вопросы. Проведение таких исследований важно для понимания не только механизмов мутагенеза, канцерогенеза и развития, различных возраст - зависимых патолоп но и для совершенствования методов биомониторинга и ииодозиметрии факторов загрязнег среды.

Цель н основные задачи исследования.

Основной целыо настоящей работы является изучение частоты спонтанных и индуцирован! hprt мутаций в лимфоцитах in vivo в зависимости от возраста организма, сравнение молекулярной природы этих мутаций, а также возможности снижения их уровня диетичесю антиоксидантами.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

- Определить частоту hprt мутаций в лимфоцитах селезёнки мышей разного возраста, необлученмых и облученных гамма -радиацией.

- Изучить антимутагенное действие диетических антиоксидантов поснижению частоты hpn мутаций в лимфоцитах мышеи.

- Изучить возникновение hprt мутаций в лимфоцитах человека в результате действия окиси стирола, широко используемого на практике. '

- Определить изменение лролиферативной активности hprt" клеток вусловиях in vitro.

- Провести сравнительный молекулярный анализ индуцированных и спонтанных hprt мутаь лимфоцитах.

Научная новизна и практическое значение работы.

Проведенные исследования позволили впервые показать существенное увеличение часто!

генных мутаций, индуцированных внешним повреждающим агентом (гамма -радиация) в лимфоцитах (in vivo) млекопитающих в зависимости от их возраста. Показано, что скорость пролиферации Т-лимфоцитов с мутациями по гену hprt при культивировании in vitro ниже, i сравнению с таковой у нормальных клеток. Результаты исследований природы мутаций, возникающих в гене hprt спонтанно и под действием окиси стирола, преимущественно представлены заменами оснований (AT>GC. GOTA, АТ<ТА) и делециями (до 200 пар оснований - п.о.). Впервые Показано, что введением в диету мышей дополнительных антиоксидантов удается снизить образование радиационно-индуцированных генных мутаци (по локусу hprt) в лимфоцитах старых и молодых животных. Полученные в работе данные указывают на увеличение чувствительности клеток организма млекопитающих с их возраст мутагенному действию факторов внешней среды. Результаты анализа индуцируемых hprt -мутаций в лимфоцитах селезенки мышей in vivo и снижение их частоты при увеличении антиоксидантов в диете животных указывает на возможность использования этого метода к

ест-системы для скрининга ант мутагенов, антиканцерогенов, пригодных для профилактики енетических и канцерогенных последствий действия радиации других факторов среды. )сиоп11ые положения, выносимые на tawn гу.

С использованием генетического маркера hprt-мутаций в лимфрцитах мышей разного возраста становлено, что со старением организма увеличивается частота генных мутаций, формируемых ie только спонтанно, но и при действии гамма -радиации, что свидетельствует о возможности нижения эффективности молекулярных антимутагенных систем клетки с возрастом организма. Установлено, что длительное дополнительное введение природных антиоксидантов в диету лышам оказывает резко выраженный антимутагенный эффект, выявляемый по снижению lacTOTbi hprt мутаций в лимфоцитах гамма -облученных мышей разного возраста. Молекулярный анализ спонтанных и индуцированных окисью стирола hprt мутаций в жмфоцитах человека показал, что эти мутации формировались в основном в результате замены )снований (АТ>ГЦ, ГЦ>'ГА, АТ>ТА) и делений от 2 до 200 пар оснований. Количественное :оотношение hprt мутаций, возникающих спонтанно и под действием окиси стирола сравнимо с »отношением этих же мутаций, индуцируемых редко ионизирующей радиацией в лимфоцитах lejioHCKa.

■ Показано, что скорость пролиферации in vitro лимфоцитов человека с hprt мутацией снижена то сравнению с таковой нормальных клеток.

\ппобация работы. Материалы диссертации докладывались на семинарах лаборатории радиационной молекулярной биологии ИТЭБ РАН, на семинарах отдела питания и токсикологии Каролинского Института Шведской АН, на 2-Радиобиологическом Сьезде (Киев, 1993), на 10-Международном Конгрессе г,о Радиационным Исследованиям (ICRR) (Вюрцбург, 1995), на практических курсах ЕМВО по сиквенированию DNA (Хейдельберг, 1996), на международной конференции по мутагенезу (Генуя, 1997), на международной конференции ASINA ТО (1997 ).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 7 статей и ряд тезисов. Объем и структура работы. Диссертационная работа включает в себя введение, обзор

литературы, описание материалов и методов, изложение результатов и их обсуждение, а также

заключение, выводы и список цитируемой литературы, содержащий 181ссылки. Работа

изложена на 102стр. машинописного текста, иллюстрирована 9 рисунками и 13 таблицами.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

2.1. Материалы и методы.

В работе использовали самцы мышей линии С57В1/6, содержащихся на стандартной диете

или получавших дополнительную добавку антиоксидантиой смеси (АнтиОкс), содержащую бета-каротин, витамины С, Е. рутин, а также селен и цинк. Животных подвергали облучению

различными дозами у-радиации и исследовали образование мутаций по hprt-локусу с помои методов авторадиографии или клонирования мутантных клеток, соблюдая условий описанн pa6oTax(Gocke et al. 1983; Dempscy and Morley, 1986; Albertini et al. 1988; 1990). При анализ» авторадиограм число мутантных(6-тиогуанин-6ТГ устойчивых) клеток рассчитывали с учет разведений и эффективности их стимуляции к росту. Образование hprt мутации в лимфоцит человека определяли методом клонирования как описано в работах(Albertini et al. 1988; 1990 инкубацией клеток в разных режимах, как указано в разделе 2.2.1. При использовании мето^ клонирования, выделенные лимфоциты мышей и человека культивировали в СОг инкубатор 96-луночных планшетах в среде, содержащей или не содержащей 6ГГ. Частоту мутаций определяли как отношение эффективности клонирования в присутствии 6-ТГ к эффективно! клонирования без 6-TT(A(bertim etat.. 1990). Для определения молекулярной природы Myrai по hprt-локусу мутантные клоны собирали через 15-16 дней после начала культивирования в луночных планшетах. Лимфоциты промывали, замораживали в количестве 6x103 и ЗОх 103 д получения кДНК. По мере необходимости, клетки размораживали для выделения мРНК. С помощью обратной транскриптазы(М-М1Л0 на матрице этой мРНК синтезировали кДНК. Далее фрагменты кДНК подвергали амплификации с помощью полимеразной цепной реакщ (ПЦР). В ПЦР брали 3-5 мкл продукта (кДНК). синтезированного с помощью обратной транскриптазы,1ед. Taq ДНК-полимеразы(на реакцию), а также ПЦР-буфер и специфичные праймеры. Поскольку начальное количество hprt мРНК было незначительно, мы проводили вторую ПЦР реакцию, используя 1 -3 мкл продукта первой реакции и новую пару специфичес праймеров. После этого, 5 мкл продукта второй ПЦР наносили на полиакриломидный гель(3,75%) для оценки качества и колическва конечного продукта ПЦР. Эффективность бы; обычно70-80%, это значит, что для 70-80% мутантных клонов удавалось получить ПЦР прод пригодный для сиквенирования. Мы использовали стандартный метод для сиквенирования с помощью набора PRISM Sequenase и автоматического сиквенатора (Applied Biosistems, Koste City.USA). Если в результате сиквенирования кДНК, выяснялось, что какой-либо из 9 экзоно отсутствует или имеет делецию, ю амплифицировали необходимый экзон непосредственно у геномной ДНК, с использованием специфичных для данного экзона праймеров. Полученные результаты молекулярного анализа мутаций hprt сравнивали с данными представленными в б данных( hprt-database, MutaBase. Release #6), содержащей результаты исследований hprt мутаций, опубликованных различными авторами за последние 2-Згода. Результаты экспериментов обрабатывались статистически согласно (Beyer, 1966) или с использованием программы Sigma Stat 2.0.

.2. Результаты исследований и их обсуждение.

.2.1. Методы опенки ИрП мутации и пролифсративпой активности нормальных и [утантных лимфоцитов,

I процессе выполнения данного исследования нам пришлось решать несколько задач, сключительно связанных с использованием методов оценки мутации по гену ЬрП в имфоцитах мышей разного возраста и на лимфоцитах людей, профессионально занятых на редком производстве. Для определения количества мутантных по гену ЬрП клеток, в общей юпуляции лимфоцитов, используются два метода: авторадиографии и клонирования. В основе тих методов лежит способность мутантных клеток пролиферировать в присутствии 6-тиогу-;иина (аналога пуринов, токсичного для нормальных клеток). Метод авторадиографии-основан щ регистрации мутантных клеток по включению [3Н] тимидина в ДНК в селективной среде и толучеиием «автографа» на чувствительной фотоэмульсии. Метод клонирования-основан на ,'пособности мутантных клеток пролиферировать и образовывать клон в селективной среде. Оба летода, хотя имеют свои «недостатки и преимущества», эффективно используются во многих иабораториях. На клетках человека было показано, что при одновременном использо-вании цвух методов для оценки количества Ирй мутаций можно получить различные величины. Так, частота мутаций в лимфоцитах человека, определяемая методом авторадиографии была в два раза выше таковых, получаемых методом клонирования(0'№Ш е1 а]. 1990; виЛла И а1. 1992). Наши исследования по оценке частоты ЬрЛ мутаций в лимфоцитах из селезенки мышей, с использованием обоих методов также дают результаты, различающиеся более чем в два раза. При чем, это различие регистрируется независимо от возраста животных, и во всех случаях величина частоты мутаций, определяемых методом авторадиографии в 2,0-2,4 раза выше таковой, получаемой методом клонирования клеток. Причина разницы величин частоты генных мутации, определяемых двумя методами в клетках человека и грызунов пока не понятно. Однако можно полагать, скорее всего, не все мутантные клетки способны образовывать клон или размер клона настолько мал. что его трудно отличить от скопления мертвых клеток в ячейке. Поэтому в основных экспериментах с мышами мы использовали более быстрый метод авторадиографии, а с лимфоцитами человека метод получения мутантных клонов, поскольку с клетками человека была еще связана работа по изучению природы ИрП мутаций на молекулярном уровне. Результаты исследований показали, что уровень спонтанных ИрП мутаций в лимфоцитах селезенки мышей увеличивается с их возрастом. Увеличение спонтанных мутаций с возрастом у мышей составляет около 3% в месяц, относительно уровня мутации, регистрируемых у 2-2,5 месячных животных. Т. е происходит дополнительное появление в среднем со скоростью 0,16х 10"6 мутации на ЬрП ген за один месяц. Для сравнения отметим, что увеличение спонтанных ЬрЛ мутаций в лимфоцитах периферической крови человека составляет в среднем около 2% в год. Исходя из этих данных, можно полагать, что

различия в скорости накопления спонтанных мутаций с возрастом у мышей и у человека, возможно, обусловлены разными скоростями метаболических процессов и, соответственно повышенной скоростью индукции «метаболических» повреждений ДНК в клетках мышей, сравнению с таковой у человека.

Как было отмечено, метод клонирования лимфоцитов человека, несущих мутацию по hprt используется как для генетического мониторинга действия генотоксикантов среды, так для изучения и скрининга мутагенов in vitro. Литературые данные показывает, что регистри руемая разными авторами чатота hprt мутаций в лимфоцитах человека, возникающие под действием одинаковой дозы одного и того же агента в условиях in vitro, существенно различаеся. Анализ этих данных указывают, что различие явно обусловлено разным времен! инкубации клеток для вывода их на фазу экспрессии мутации. Это навело на мысль, что • возможно HPRT" лимфоциты и 1IPRT* лимфоциты имеют разную пролиферативную способность. В экспериментах с лимфоцитами человека мы получили данные, подтверждаю это предположение. Исследуя влияние стирола на организм рабочих, связанных с его производством и использованием мы обнаружили, что частота мутаций по hprt-локусу у них составляет 21,9 ±14,9 х10"6, что гораздо выше частоты мутации в контрольной группе: 7,6±5, хЮ"6. Полученные данные свидетельствуют, что стирол является мутагеном и способен in vi' вызывать образование hprt мутаций. Повышенный уровень стирола в крови рабочих (Bastlov al., 1995), возможно, индуцирует образование мутаций в лимфоцитах находящихся в фазе noi которые не проявлялись фенотипически при прямом клонировании, и которые возможно удастся обнаружить после 8 дней культивирования их в неселективной среде, т.е. введя в эксперимент фазу экспрессии. Но оказалось, что через 8 дней культивирования частота мута! не только не возросла, как мы предполагали, а наоборот снизилась в среднем в 2-3 раза по сравнению с исходной величиной (Таблица 1). Это свидетельствует о том, что число "новых" мутантных клеток, не проявляющихся фенотипически. в периферической крови незначителы Однако, даже в этом случае, трудно было объяснить снижение частоты мутаций через 8 дней культивирования. Из данных этого эксперимента, можно предполагать, что мутантные лимфоциты проявляют более низкую пролиферативную активность, чем нормальные клетки, последующем эксперименте мы использовали лимфоциты, полученные из крови здоровых доноро Частоту мутаций определяли непосредственно после выделения клеток и через несколько дне их культивирования в неселективной среде. Результаты эксперимента представлены на Рис. 1 Можно видеть, что общее число клеток прогрессивно увеличивается, и время удвоения популяции составляет 1.8 дней, тогда как число мутантных клеток растет очень медленно и время удвоения этой субпопуляции составляет 6.2 дней. Результаты экспе-риментов показывают, что мутантные по hprt гену клетки имеют более низкую пролифератив-ную активность, следовательно, это необходимо учитывать в экспериментах in vitro.

Три использовании фазы экспрессии в экспериментах in vitro необходимо вводить юправочный коэффициент для полученной величины частоты мутаций равный 2 или более.

"аб-лица 1. Частота hprt мутаций в Т-лимфоцитах человека, определенная до и после 8 дней ультивирования._

Номер День"0" День"8"

эксперимента. Номер образца Частота мутаций Частота мутаций

xl О"6 х10"6

Эксперимент 1 Е2 15,3 8,2

ЕЗ 23,6 8,6

Е4 55,2 26,2

Е5 13,9 10,7

Е6 7,6 2,6

Е7 18,8 5,5

Е8 9,6 4,3

Е9 6,5 0,3

CI3 11,2 8,8

С14 38,2 11,4

С15 6,2 4,5

редняя величина 18,7+153 8,3+6,9

)ксперимент 2 ЕЮ 31,2 2,7

Ell 41,6 10,1

Е12 18,5 5,1

CI6 15,5 3,3

CI7 12,6 16,0

CI8 16,8 1,8

CI9 5,6 0,8

С20 16,0 3,7

С21 17,2 6,7

С22 9.9 0,3

-редняя величина 18,5±10,5 5,1+4,8

'ис. 1. Poci числа клеток в процессе культивирования.

- общее число клеток х 106, 2- число мутантных клеток х I О6, ю оси X — дни культивирования, по оси У — число клеток.

Кроме того, поскольку результаты свидетельствуют о различной метаболической активное мутантных и нормальных клеток, то возможно in vivo существует негативная селекция пр< мутантных клеток основанная на специфике их пролиферации.

2.2.2. Исследование уровня спонтанных и гамма индуцированных hprt мутаций в лимфоцитах мышей разного возраста.

Тест-система hprt мутации широко используется для изучения спонтанного и

индуцированного мутагенеза в клетках млекопитающих in vitro. Вместе с тем, в ряде случг возникает необходимость использования этого метода в исследованиях по изучению генж мутации на уровне целого организма в условиях in vivo. Это, прежде всего, связано с тем,L возникновение соматических мутации рассматривается как первая ступень в индукции канцерогенеза. Необходимость изучения мутагенеза на организменном уровне возникает ri оценке риска действия различных физических и химических агентов, при исследовании модулирующих факторов, а также при различных физиологических состояниях и в процес старения организма. Достаточно удобным объектом для таких исследований являются линейные мыши, из селезенки которых можно получить необходимое количество ликфоц

На рисунке 2 представлены результаты анализа частоты hprt мутации в лимфоцитах селезёнки мышей 8-104-недельного возраста, облученных гамма-радиацией. Из представленных данных можно видеть, что частота мутаций в лимфоцитах селезенки облученных мышей возрастает как производное дозы гамма- облучения. В пределах доз 0.: Гр явно имеется линейная зависимость образования hprt мутаций от дозы облучения мышс Такую зависимость образования мутаций мы видим как на 8-недельных, так и на 104-недельных. Вместе с тем частота мутаций в лимфоцитах ! 04-недельных мышей при всех д облучения гораздо выше(увеличивается в 2,8-13,1 раза), чем таковая у 8-недельных мышей(увеличение в 1,9-10,7 раза).

Рис. 2. Образование hprt мутаций в лимфоцитах мышей разного возраста в зависимости от их у -облучения.

частота мутаций, xlO4

100

40

20

60

80

—18— 10 4-недельные мыши

8-недельные мыши

о 0,5 i : доза облучения, Гр

2

5

Из представленных на Рис. 2 данных видно, что это увеличение явно не связано только с вкладом разницы фонового (спонтанного) уровня мутаций в лимфоцитах старых и молодых мышей. Так, фоновый уровень мутаций в лимфоцитах старых мышей превышает фоновый уровень мутаций у молодых мышей только на 88%, а частота мутаций в клетках гамма-облученных 104-недельных мышей превышает эту величину у 8-недельных мышей на 127-300% в зависимости от дозы облучения. Эта тенденция повышения с возрастом радиационно-индуцированных мутации подтверждается в экспериментах с использованием групп мышей 8, 14, 42, 78, 104, 110 недельных возрастов. Из результатов этих экспериментов можно предположить, что в процессе старения организма возрастает чувствительность его клеток к действию радиации по критерию образования генных мутаций (по гену Ирп). Эти данные позволяют также предполагать, что клеточные системы генозащиты в лимфоцитах стареющих млекопитающих функционируют менее надежно, чем в лимфоцитах молодых.

2.2.3. Модуляция частоты мутаций диетическими аптиоксидантамй.

В клеточных макромолекулах постоянно возникают повреждения под действием активных

форм кислорода и других эндогенных и экзогенных факторов. Повреждения в генетических структурах возникают и накапливаются, хотя живые организмы эволюционно наделены системами первичной защиты и репарации ДНК. Количество спонтанных повреждений в ДНК . клеток стареющего организма существенно больше, и как показали представленные выше данные, индуцированные радиацией повреждения репарируются с меньшей эффективностью в клетках старых животных. К клеточным системам первичной защиты генома относятся ферментативные и низкомолекулярные антиоксиданты. Многие низкомолекулярные антиоксиданты-генопротекторы человек и млекопитающие получают с пищей. Ряд антиоксидантов-витаминов являются эффективными антимутагенами и средствами хемопривентации канцерогенеза. Поэтому, в настоящем исследований мы попытались, использовать тест-систему ИрП мутации на мышах, для выяснения возможности снижения частоты генных мутаций у млекопитающих дополнительными введениями диетических антиоксидантов. В качестве такой диетической добавки была использована антиоксидантная смесь, содержащая витамины С и ГС, бета-каротин, рутин, а так же селенит натрия и глюконат цинка (АнтиОкс). Все компоненты данной смеси являются прямыми или косвенными «перехватчиками» свободных радикалов, или же входят в активные центры ферментов, регулирующих системы защиты и репарации. В предварительных экпериментах было установлено, что только при длнтельном(30-45 дней) введении в диету мышей этой дополнительной добавки, в клетках тканей значительно повышались антирадикальная и антимутагенная активности. На рис.3 показаны результаты экспериментов по анализу частоты Ьрг! мутаций в лимфоцитах мышей, не получавших и получавших дополнительные добавки АнтиОкс в течение 42 дней до их гамма- облучения. Животные 14, 42, 78, 110 недельных

возрастов, получающие антиоксидантные диетические добавки или получающие плацебо, подвергались облучению в дозах 2 и 5 Гр. Как видно из представленных данных (Рис. 3), частота мутаций у животных, получавших антиоксидантную смесь значительно ниже, чем у мышей получавших плацебо: для животных 14-недельного возраста частота мутаций снижает в 5,4-5,3 раза, а для 110-недельного- в 4,4-3,7 раза, »зависимости от дозы облучения. В работа Ушаковой и др.(изЬакоуа а1.,1996; 1998) было показано, что введение в диету мышей добавь АнтиОкс в том же режиме, что и в наших экспериментах наблюдается активация экспрессии генов супероксид дисмутазы, каталазы, генов теплового шока и анти- апоптозного гена Ьс1-2. Можно полагать, что используемая нами диетическая добавка проявляет свое антимутагенное действие ие только как прямой "прехватчик" радикалов, но и через активацию экспрессии защитных генов. Можно также отметить, что в этих экспериментах наибольший генозащитны эффект проявляется у молодых животных 14-недельного возраста. Так, индекс снижения частоты мутации(ИСЧМ) у молодых мышей, получавших АнтиОкс при облучении в дозе 2 Гр составляет 5,4, тогда как это значение у 110-недельных равна 4,4. А при облучении в дозе 5 Гр ИСЧМ для молодых животных соответствует 5,3 у стареющий животных 3,7.

Рис.3 Влияние диетической добавки (АнтиОкс) на частоту мутаций,

индуцируемых у-радиацией в лимфоцитах мышей разного возраста.

Частота

Возраст мышей, недели

Это указывает, что антимутагенное дейсвие АнтиОкс более эффективно у молодых мышей, че! у стареющих. Таким образом, результаты экспериментов показывают, что применение антиоксидантной смеси в качестве диетической добавки вызывает значительное снижение частоты мутаций в лимфоцитах мышей разного возраста подвергшихся облучению, а также снижает частоту спонтанных мутаций у стареющих мышей. Полученные данные по анализу Ьр1 мутации показывают, что существующие клеточные системы генозащиты у млекопитающих недостаточно эффективны и нуждаются в постоянном усилении и особенно при действии экстремальных факторов и в процессе старения организма.

2.2.4. Сравнительны» молекулярный анализ спонтанных и индуцированных мутаций в составе гена HPRT.

Полный сиквенс ДНК hprt- локуса был выполнен Edwards с соавторами в 1990 году (Edwards et al., 1990), содержит 44000 пар нуклеотидов и состоит из 9 экзонов, которые после сплайсинга образуют кодирующую последовательность кДНК из 657 пар нуклеотидов. Продукт hprt гена представляет собой белок, состоящий из 217 аминокислот и образующий тетрамерный комплекс для функциональной активности. Кристаллическая структура hprt белка была определена в 1994году (Eads et al., 1994). Считается, что любая замена в аминокислотной последовательности белка приводит к потере его активности и. как следствие, к способности клетки расти и образовывать клон в присутствии 6-тиогуанина.

2.2.4.1 Исследование спектра hprt-мутацнй, возникающих in vivo в лимфоцитах человека.

В наших экспериментах мы исследовали спектр спонтанных мутаций, возникающих in vivo. Для этого мы использовали лимфоциты, полученные из периферической крови рабочих работающих в гараже, средняя величина частоты мутаций по hprt локусу равна 9,3±5,1 xl О"6 , что не превышает средне статистические значения. Было определено 117 мутаций на уровне кДНК, 74% из которых были замены пар оснований, 10% -сдвиг рамки считывания, 12% - делений 3-52 пар оснований. Дополнительно, были определены две тандемные замены пар оснований и одна комплексная мутация. Простые замены пар оснований были обнаружены в 56 (20%) из 281 известных мутабильных мест в кДНК. На рис.4 показано распределение мутаций в кодирующей части hprt гена.

Рис.4. Распределение точечных мутаций в кодирующей части Ьрп гена, количество мутаций ^^

146

208

_________508.

_J517

1 36 71 107 170 272 344 416 482 549 614

позиция основания в кДН К

По оси X — номера позиций оснований в кДНК от 1 до 654; по оси У - количество мутаций в данной позиции. На рисунке показаны номера позиций, где мутации встречались от 3 до 6 раз.

Можно видеть, что мутации распределились двумя кластерами: много мутаций в первой трет! гена (до позиции » 240) и последней части гена (после позиции « 450), и сравнительно немно мутаций в середине гена. Такое распределение мутаций предполагает наличие "горячих мест" для их возникновения. Мутации редко встречались в экзонах 1 и 4, и образовывали кластеры экзонах 3 и 9. Наиболее частыми в кДНК были мутации в позициях 197 и 146. В этих позицт были 6 и 5 независимых мутаций соответственно, что значительно отличается от случайного распределения (Р<0,004). По четыре мутации было обнаружено в позициях 143,208, 508 и 61' Транцизий (53%) было немного больше, чем трансверсий (47%), и мутации ГЦ (56%)было больше, чем AT (44%). Замена ГЦ>АТ наиболее распространённая мутация среди замен пар оснований. Более чем 50% не больших делеций (3-52 п.о.) приходится на 5' конец экзона 2. Большее число мутаций по ГЦ паре возможно связано с деаминированием 5-метилцитозина Е ЦГ участках. Результаты анализа замен пар оснований в кДНК представлены в Таблице 2 в сравнении сданными, имеющими в литературе и банка «MutaBase».

Табл.2 Типы мутаций в кодирующей части ЬрП гена в Т-лимфоцитах здоровых некурящих людей

Тип мутации* Настоящая работа число(%) литературные данные и MutaBase,число (%)

Всего мутаций 87(100) 87(100)

Транзиции (всего) 45 (52) 45 (52)

ГЦ>АТ 23 (26) 22 (25)

ЦГ>ТА 9(10) 13(15)

А1>ГЦ 4(5) 6(7)

ТА>ЦГ 9(10) 4(5)

Трансверсии (всего) 42 (48) 42 (48)

ЦГ>ТА 7(8) 6(7)

ЦП»АТ 0 2(2)

гц>цг 8(9) 10(11)

цг>гц 2(2) 5(6)

АТ>ТА 8(9) 3(4)

ТА>АТ 5(6) 8(9)

АТ>ЦГ 1 (1) 0

ТА>ГЦ П (13) 8(9)

Мутаций по АТ 38 (44) 29 (33)

Мутаций по ГЦ 49 (56) 58 (67)

•нуклеотидные основания перечислены в не транскрибируемой цепи, как принято в литерату

Для сравнения с данными, представленными в литературе и "МЩаВаве", мы брали мутации, полученные только на Т-лимфоцитах здоровых не курящих доноров. Полученные нами данн хорошо согласуются с данными банка «МшаВайС» и результатами других исследований, и взятые вместе два спектра представляют реальную картину спонтанных мутаций по гену ЬрП для здоровых некурящих людей.

2.2.4.2 Исследование молекулярного спектра hprt-мутаций в лимфоцитах, обработанных in vitro мутагеном.

В последующих экспериментах в качестве повреждающего агента был выбран оксид

стирола. Стирол является мономером для получения полистирола и других продуктов химической промышленности, а стирол-7,8-оксид (СО) его непосредственный метаболит(т vivo) был классифицирован как «возможный и вероятный» канцероген для человека (IARC, 1994). Ранее было показано увеличение уровня 6-О-гуаниновых аддуктов и частоты hprt мутаций в Т-лимфоцитах человека, обработанных оксидом стирола in vitro (Bastlova et al., 1995). Мы изучали на молекулярном уровне мутации, индуцированные СО в Т-лимфоцитах человека in vitro, обоснованно предполагая, что характерный спектр мутаций, вызванных СО, можно использовать в качестве биомаркера и для исследований in vivo.

При воздействии СО, а концентрации 0.2 мМ, на выделенные лимфоциты частота мутаций возросла в 3,6 -4,8 раза, по сравнению с уровнем частоты спонтанных мутаций. Было собрано около 200 клонов клеток после обработки СО, и около 140 клонов контрольных клеток. В ходе экспериментов было сиквенироваио на уровне кДНК 55 клонов после воздействия СО и 44 контрольных клопов, кроме этого геномная ДНК была исследована для 49 СО-обработанных клона и для 7 контрольных. На основании полученных результатов можно сделать вывод, что спектр мутаций, индуцированных оксидом стирола, отличается от спектра мутаций контрольных клонов. Результаты молекулярного анализа мутаций по hprt локусу после воздействия оксида стирола и контрольных клонов представлены в таблице 3.

Табл. 3 Общее число и типы мутаций, возникающих в результате инкубации лимфоцитов

человека в присутствии окисида стирола (ОС) и без него.

Тип мутации Инкубация клеток без ОС,(%) Инкубация клеток с ОС, (%)

Транцизии (всего) 16 (47,0) 16(37,2)

ГЦ>АТ 9 (26,5) 7(16,3)

АЪГЦ 7 (20,6) 9 (20,9)

Трансверсии (всего) 7(20,6) 19(44,2)

ГЦ.ТА 1 (2,9) 7(16,3)

ГЦ>ЦГ 3 (8.8) 3 (7,0)

ДТ>ЦГ 1 (2.9) 2(4,7)

А'Г>ТА 2 (5,9) 7(16,3)

Делеция/вставка(всего) 11(32,4) 8(18,6)

Делеция/вставка1 п.о 4(11.8) 1 (2,3)

Делеция 2-200 п.о. 7(20,6) 4 (9,3)

Делеция >200 п.о. - 3 (7,0)

Всего характеризовано 34 (100) 43 (100)

Сплайс мутации 10 12

Всего определено 44 55

Как видно из представленных данных существуют определенные отличия между спонтанны in vitro мутациями и мутациями, индуцированными оксидом стирола. Заметно увеличилось число ГЦ>ТА (с 2,9 до16,3%) и АТ>ТА (с 5.9 до 16.3%) трансверсий в мугантных клонах, полученных после обработки оксидом стирола, по сравнению с контрольными клонами. Одним из специфичных аддуктов образующихся при воздействии оксида стирола является С гуанин (Vodicka et al., 1995), в процессе репликации такое повреждение должно приводить к ГЦ>АТ транцизии, поэтому для нас был неожиданным результат, когда контрольные клоны имели более высокий процент таких мутаций (26,5 и 16,3%). Это указывает, что ОС иидуцир в ДНК и другие повреждения, кроме Ой-гуанина, или, возможно, такие повреждения хорошо репарируются или же аддукты типа 06-гуанин, вызванные оксидом стирола, не являются достаточно стабильными соединениями. Необходимо также заметить, что существуют некоторые отличия в распределении мутаций между контрольными клонами в наших экспериментах и данными из банка «MutaBase». Возможно, это связано с тем, что литературь данные, представленные в банке «MutaBase», были взяты из многих независимых источнико! собранные во едино они могу г несколько исказить картину спонтанного мутагенеза (разные условия культивирования, разные клеточные линии, разный возраст доноров и др.). Сравнен результатов анализа спектра спонтанных мутаций в гене hprt. возникающих in vivo при прям( клонировании клеток и спектра спонтанных мутаций при инкубации клеток in vitro в течение 12-14 дней, показывает их существенное различие. Это указывает на влияние условий инкубации клеток на формирование спонтанных мутаций в гене hprt.

ВЫВОДЫ:

1. Показано, что частота спонтанных hprt мутаций в лимфоцитах селезенки старых (102-114 недельных) мышей на 70-80% выше по сравнению с таковой у молодых (8-14 недельных). Спонтанные мутаций в гене hprt клеток мышей увеличиваются с их возрастом в среднем с скоростью 0,16х10'6 заодин месяц.

2. Установлено, что у людей занятых в производстве стирола повышена частота hprt мутацш лимфоцитах периферической крови. В условиях культивирования in vitro пролиферативна активность hprt~ лимфоцитов людей в 3 раза ниже, чем у hprt* лимфоцитов.

3. Показана линейная зависимость образования hprt мутации in vivo в лимфоцитах селезенки мышей от дозы их у - облучения. Частота индуцированных hprt мутаций в клетках молоды мышей возрастает в 1,9-10,7 раза, а у старых в 2.8-13,1 раза, относительно спонтанного уровня, при у - облучении этих животных в диапазоне доз 0,5-5,0 Гр, что указывает на снижение активности клеточных систем защиты генома со старением.

4. Показано, что введение в диегу мышей разного возраста антиоксидантной смеси, содержащей витамины С. Е, бета-каротин, рутин, селенит натрия и глкжонат цинка, оказывает антимутагенный эффект, выражающийся в 4-5 кратном снижении hprt мутации, индуцируемых у - радиацией в лимфоцитах этих мышей.

5. Получена полная характеристика молекулярного спектра спонтанных(/'и vivo) мутаций кодируемой части гена hpr' в лимфоцитах здоровых людей. Основной вклад в спонтанные мутации гена hprt вносят тран~иции и траисверсии -76%. мутации со сдвигом рамки считывания-10%, делеиии-10%.

6. Показано, что спектр hprl мутаций, возникающих спонтанно, при инкубации лимфоцитов человека in vitro в течение 12-14 суток, существенно отличается от спектра этих же мутаций, спонтанно возникающих in viro, а также и от спектра мутаций, индуцируемых оксидом стирола in vitro. В последнем случае значительно преобладают трансверсии ГЦ>ТА и АТ>ТА.

Список статей, опубликованных ito тсие диссертации:

1. А.И. Газиев. А.Я.Подлуцкий. Р.Бредбери. Увеличение с позрастом частоты спонтанных и индуцированных y-радиацией hprt-мугаций в лимфоцитах селезенки мышей. Доклады Российской Академии Hay к, {1 994). 339. 276-278.

2. АЛ. Gaziev, A.Ja. Podlutsky. В.М. Parifilov. R..J. Bradbury. Dietary supplements of antioxidants reduce hprt mutant frequency in splenocjtes of aging mice. Mutation Research, (1995), 33S, 7786.

3. T.Bastlova and A.Podlutsky. Molecular analysis of styrene oxide induced hprt mutation in human T-lymphocytes. Mutagenesis, (1996). 11.581-591.

4. A.Podlutsky, T.Bastlova. and B.Lambert. Reduced proliferation rate of hypoxanthine-phosphoribosyl transferase mutant human T-lymphocytes in vitro. Environmental and Molecular Mutagenesis, (1996), 28, 13-18.

5. A.-M.Osterholm, T.Bastlova. A.VIeijer. A.Podlutsky. N.Zanesi. and S.-M.Hou, Sequence analysis of deletion at the hprt locus of human T-lymphocytes: association of a palindromic structure with a breakpoint cluster in exon 2. Mutagenesis (1996). 11.511-517.

6. А.И.Газиев, Т.Е.Ушакова, А.Я.Подлуцкий, Л.В.Никонова, В.Г.Безлепкин, Н.П.Сирота, Диетические антиоксиданты увеличивают продолжительность жизни мышей, снижают частоту мутаций и увеличивают экспрессию защитных генов. Успехи геронтологии, (1997), 1, 80-84.

7. A.Podlutsky, A.-M.Osterholm. S.-M.Hou. A.Hofmaier, and В.Lambert, Spectrum of point

n jtations in the coding regioi.of the hypoxanthine-phosphoribosyl transferase (hprt)gene in human T-lymphocytes in vivo. Carcinogenesis, (1998), 19.557-556.

Научное издание

Автореферат Подлуцкого А.Я.

Налоговая льгота - общероссийский классификатор продукции СЖ-005-93, том 2; 953000 - книги и брошюры.

02.11.98 г. 3. 8161Р. Т. 100 экз. Усл.печ.л. 1,0.

Отпечатано с оригинала-макета в Отделе научно-технической информация Путинского научного центра РАН. 142292, г.Пущино Московской обл., проспект Науки, 3. ОНТИ ПНЦ РАН.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Подлуцкий, Андрей Яковлевич, Пущино

Институт Теоретической и Экспериментальной Биофизики Российская Академия Наук

на правах рукописи

Подлуцкий Андрей Яковлевич

Частота спонтанных и индуцированных Ьрг1-мутаций в лимфоцитах, их модуляция антиоксидантами и молекулярный анализ.

Биофизика 03.00.02

Диссертация на соискание ученой степей кандидата биологических наук

научные руководители: проф., д.б.н. Газиев А.И., проф., д.м.н. Ламберт Б.

Пущино - 1998

Содержание работы:

Раздел страница

Введение 3

1. Раздел: Обзор литературы 5

1.1 Спонтанные и индуцированные мутации и

методы мониторинга 5

1.2 Антимутагенные системы клетки.

Антиоксидантная защита и репарация ДНК. 12

1.3 HPRT-маркер. Анализ генных мутаций

по HPRT—локусу. 28

2. Раздел: Материалы и методы. 36

3. Раздел: Результаты и обсуждение 44

3.1 Методы оценки HPRT мутаций и пролиферативной активности нормальных и мутантных клеток 44

3.2 Исследования уровня спонтанных и гамма индуцированных HPRT мутаций в лимфоцитах

мышей разного возраста. 51

3.3 Модуляция частоты мутаций диетическими

антиоксидантами. 59

3.4 Сравнительный молекулярный анализ спонтанных и индуцированных мутаций в составе HPRT гена. 67

3.4.1 Исследования спектра HPRT мутаций,

возникающих in vivo в лимфоцитах человека 71

3.4.2 Исследования молекулярного спектра HPRT мутаций

в лимфоцитах, обработанных in vitro мутагеном 78

4. Выводы 84 Acknowledgements 85 Использованная литература 86

Введение

Исследование реакции живых организмов на дейст вие физических и химических факторов техногенного загрязнения среды представляет важнейшее направление экологической биофизики. Ключевое место в этих исследованиях занимает проблема генетических последствий действия физических и химических агентов. Радиационные и химические мутагены, вводимые в среду обитания, представляют значительную опасность для всего живого и для генофонда человечества (Экоцид в СССР) [1]. Молекулярные защитные системы организма, механизмы репарации ДНК несовершенны, и они не полностью обеспечивают целостность генетической программы человека от мутагенного и канцерогенного действия этих агентов. Имеющиеся данные указывают на то, что происходит существенный рост врожденных аномалий и раковых заболеваний в популяциях населения, проживающих на загрязненных территориях. Экономические, социальные и этические последствия этих процессов очень велики (Фогель и Мотульски, 1990; Дубинин, 1994) [2, 3]. Поэтому организация генетического мониторинга, особенно в экологически напряженных регионах, для оценки наследственного здоровья населения является актуальной задачей. Имеющиеся методы и подходы для генетического мониторинга далеки от совершенства, и поэтому требуется как создание новых, так и совершенствование уже существующих методик. Существующие методы, пригодные для использования в мониторинге популяции человека, весьма ограничены. Среди них основное место занимают методы определения хромосомных повреждений (анализ хромосомных аберраций, микроядерный анализ) и методы определения соматических генных мутаций (Шевченко, 1996; обзор Albertini et al., 1990) [4, 5]. В последнее времы развиваются разнообразные методы для количественного и качественного анализа мутаций у человека и животных, эти методы различаются по анализу вариабельности различных последовательностей ДНК и изменению свойства нуклеотидов в отдельных локусах, анализ мутаций в ДНК различных тканей с использованием трансгенных животных, по анализу разнообразных структурных нарушений и аддуктов в ДНК и другие (Garner et al, 1991)[6].

Однако не все методы являются одинаково доступными как по степени

дороговизны так и методическим трудностям для оценки частоты генных

3

мутаций у человека и экспериментальных животных. Наибольшее применение для оценки частоты генных мутаций в клетках человека in vitro и in vivo находит метод на анализе мутаций по гену гипоксантингуанинфосфорибозил трансферазе (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase - HPRT enzyme) (Albertini, 1982) [7]. В основе метода лежит различие между нормальными и мутантными по HPRT гену клетками в утилизации 6-тиогуанина (6-ТГ): нормальные клетки гибнут в присутствии 6-ТГ с вероятностью 100%, тогда как мутантные клетки (не способные вовлекать 6-ТГ в синтез ДНК) никак не реагируют на присутствие этого аналога пурина в среде (ссылка). С использованием метода оценки мутаций по HPRT гену выполнены многочисленные исследования на клетках человека и других млекопитающих, тем не менее, остается много неясного в решении различных задач применением данного метода. Недостаточно изучены вопросы зависимости частоты HPRT мутаций в клетках периферической крови от различных условий физиологического статуса человека и животных, от условий питания и возраста, не до конца понятен молекулярный механизм возникновения мутационных нарушений в исследованиях hprt локуса ДНК, при действии различных физических и химических факторов. А это чрезвычайно важно не только с позиций использования метода в биомониторинге и биодозиметрии, но и для понимания механизмов мутагенеза и канцерогенеза, развитии дегенеративных процессов, связанных со старением организма, и их модуляции. Целью настоящего исследования являлось изучение частоты спонтанных и индуцированных HPRT мутаций в лимфоцитах in vivo в зависимости от возраста организма, сравнение молекулярной природы HPRT мутаций и выяснения возможности снижения уровня этих мутаций in vivo диетическими антиоксид антами.

1. Обзор литературы.

1.1. Спонтанные и индуцированные мутации и методы мониторинга.

Важнейшим свойством живых организмов является их способность передавать стабильную генетическую информацию от поколения к поколению. Вместе с тем, генетический материал способен изменяться в определённой степени, и эта изменчивость играет первостепенную роль в эволюции живых организмов. Такие изменения, происходящие в наследственных структурах (ДНК, ген, хромосома, геном) принято называть мутациями. С возникновением мутаций в половых и соматических клетках связано развитие множества патологий человека. Убедительными примерами связи мутаций со здоровьем человека являются исследования в области онкологических и генетических заболеваний. В последние годы широкое развитие получили исследования, посвященные изучению связи мутационных нарушений в геноме с развитием дегенеративных процессов с возрастом человека. В основе спонтанных мутаций лежит возникновение структурных повреждений и ошибки репликативного и репарационного синтеза в молекуле ДНК (Umar and Kunkel, 1996) [8]. Как показывает множество исследований ДНК в нормально метаболизирующей клетке подвержена структурным нарушениям благодаря действию различных эндогенных факторов (Lindahl, 1993) [9]. Среди спонтанных повреждений ДНК следует отметить апуринизацию и апиримидинизацию, которые возможны благодаря мобильности N-гликозидной связи основания с сахаром. Высвобождение основания из ДНК (чаще пурины, чем пиримидины) происходит в результате расщепления N-гликозидной связи и зависит от pH среды, температуры, ионной силы среды и вторичной структуры ДНК. Расщепление N-гликозидной связи может происходить не только спонтанно, но катализируется ферментами семейства ДНК-гликозилаз при возникновении структурных нарушений в основаниях ДНК. Эти спонтанные структурные нарушения (повреждения) оснований

возникают в результате эндогенных факторов. К таким изменениям относится окисление (например, образование 8-окси-2-дезоксигуанина, тиминовые гликоли и др.) в результате действия эндогенных активных форм кислорода, дезаминирование цитозина и гуанина и неэнзиматическое метилирование пуринов и пиримидинов путём переноса метальной группы с S-аденозилметионина (Lindahl, 1993) [2]. Серьёзным источником генных мутаций являются ошибки во время репликации ДНК и не эффективность пострепликативной репарации (система репарации неправильных пар оснований) (Modrich and Lahue, 1996) [10].

Как показано в ряде исследований, в процессе старения происходит накопление различных спонтанных повреждений ДНК и увеличение частоты генных и хромосомных мутаций (обзор Mullaart et al., 1990) [11]. Чем больше делений и репликационных кругов проходит клетка, тем больше вероятность появления спонтанных генных или хромосомных мутаций (Barnett and King, 1995) [12]. Также хорошо известно, что вероятность появления генных или хромосомных мутаций увеличивается для потомства рожденного от пожилых родителей, что свидетельствует о накоплении повреждений в ДНК не только в соматических, но и в половых клетках (Vishwanath and Shannon, 1997; Gaulden, 1992) [13, 14]. В результате загрязнения среды обитания радиационными и химическими мутагенами происходит увеличение частоты мутаций в соматических и зародышевых клетках. Основные закономерности образования спонтанных и индуцированных мутаций - являются общими для всех живых организмов. Хотя количественные и качественные характеристики могут различаться в зависимости от условий эксперимента и самого объекта исследований. Особой эффективностью по индукции мутаций обладают -ионизирующая радиация (включая радионуклиды), УФ-свет, химические соединения способные взаимодействовать с ДНК. Они вызывают разнообразные повреждения в ДНК, которые могут быть успешно репарированы или могут быть реализованы в генные или хромосомные

мутации, что может привести к гибели клетки или злокачественному перерождению. Поэтому поврежденность генома в клетках животных и человека может быть оценена как по определению различных повреждений ДНК, так и по мутациям.

В настоящее время существуют разные методы, которые позволяют судить о степени генотоксичности того или иного воздействия на животных, человека или культуру клеток. Но все разнообразие таких методов и подходов можно объединить в две большие группы, первая, методы так или иначе связанные с возникновением и обнаружением повреждений ДНК (адцукты ДНК, разрывы цепей ДНК, сшивки ДНК) и, вторая группа, связанная с проявлением мутационных изменений в ДНК.

Схема 1. Механизмы возникновения и проявления мутаций, воздействие

На Схеме 1 показана взаимосвязь процесса появления мутаций и последующих изменений в жизни клетки или организма. Можно заметить, что образование повреждений в ДНК является одним из первичных этапов в

структурные нарушения и образование адцуктов

репарация

канцерогенезе. Многие химические канцерогены вызывают образование ковалентно связанного с ДНК продукта (аддукта), который может приводить к возникновению и закреплению мутаций или другой тип повреждений ДНК в генах контролирующих рост и деление клеток, что приводит к ненормальному росту и раку. Чем более сильным канцерогеном является какое либо химическое вещество, тем выше уровень вызываемых им повреждений ДНК. Существующие методы анализа адцуктов ДНК позволяют напрямую определять количество повреждённых оснований в геноме после воздействия кокого-либо агента (НеттЫа е1 а1., 1994) [15]. Например, используя метод 32Р-роз11аЬеШп§, было показано наличие полициклических ароматических адцуктов в лимфоцитах шахтовых рабочих в Силезии, южного региона Польши (СгсуЬо\узка е1 а1., 1993) [16]. Уровень адцуктов был в 8,7 раза выше для рабочих по сравнению с контрольной группой, а для курящих рабочих уровень аддуктов был выше в 12,8 раза. С помощью методов определяющих степень повреждённости ДНК (Ник-трансляция, Комета-метод в нейтральных или щелочных условиях, образование аддуктов ДНК и др.) - можно судить о влиянии того или иного генотоксичного агента на структурную целостность ДНК. Такие методы довольно чувствительны в определении повреждений ДНК вызванных однократным воздействием высокой дозы генотоксина. Такое воздействие в реальной жизни хотя и происходит в результате аварии на промышленном производстве или в случае природных катастроф все же довольно редки и не затрагивают большинства населения. С другой стороны, большинство людей урбанизированных регионов на протяжении всей жизни подвергаются хроническому воздействию низкого уровня радиации, ультрафиолету и факторов урбанизации (загрязнение воздуха и воды). В этом случае, при хроническом воздействии низких доз генотоксина, методы определяющие структурную целостность ДНК зачастую оказываются малоэффективными. На помощь приходят методы позволяющие анализировать хромосомные аберрации, микроядра, методы определения генных мутаций - т.е. методы, которые используют в биомониторинге и биодозиметрии (ссылки см. ниже).

С помощью этих методов удаётся определить мутационный груз для определённой популяции людей или животных заданного региона. Такие эпидемиологические данные позволяют судить о степени воздействия факторов окружающей среды на генетический материал человека или животных.

Остановимся вкратце на наиболее часто используемых методах, для мониторинга в человеческой популяции. В основном, из-за чувствительности, воспроизводимости результатов, доступности материала и оборудования, в биомониторинге человеческой популяции используются следующие методы: анализ хромосомных аберраций (а), анализ микроядер (Ь), анализ мутаций по НРЮГ локусу (с), анализ мутаций Гликофорина А (й), анализ мутаций в рецепторе Т-клеток (е), анализ мутаций по НЬА-А локусу (/). Как можно видеть, перечисленные методы делятся на две категории: первая, анализ хромосомных повреждений (методы а и А), и вторая, анализ генных мутаций (методы с-/). Каждый из названных методов имеет свои достоинства и ограничения, до сих пор не найдено идеального метода для мониторинга человеческой популяции. Первая категория методов анализирует появление повреждений генетического материала на уровне хромосом, в зависимости от степени воздействия внешних факторов, увеличивается количество клеток (обычно используются клетки периферической крови) в которых наблюдаются отклонения от нормы в кариотипе (появление необычных хромосом). Метод анализа хромосомных аберраций существует в нескольких модификациях, отличающихся между собой по изучаемым аберрациям (например, определение дицентриков, определение хромосомных транслокаций, появление слипшихся хромосом, укорачивание хромосом, появление микроядер). До конца не поняты молекулярные механизмы, приводящие к появлению хромосомных аберраций. Вместе с тем это один из наиболее чувствительных методов в биомониторинге, с помощью этих методов можно определять стабильные повреждения хромосом через несколько лет после вызвавшего их воздействия. Одной из особенностей раковых клеток является нестабильность генома, или появление большого количества нестабильных хромосомных повреждений. Недостатком этой группы методов является их

трудоемкость, хотя в последнее время появилась возможность автоматизации процесса выявления и подсчета аберрантных клеток. Методы анализа генных мутаций (методы c-f) построены на выявлении мутантных по какому-либо гену клеток среди нормальной популяции клеток. Метода анализа мутаций по HPRT локусу использует лимфоциты периферической крови, методика основана на способности пролиферации мутантных клеток в присутствии 6-Тиогуанина (Albertini et al., 1982, O'Neill et al., 1990) [17,18]. Для проведения исследований требуется 20-30 мл периферической крови. При анализе Т-лимфоцитов людей переживших атомную бомбардировку, показана дозовая зависимость в количестве мутантных клеток (Hakoda et al., 1988)[19]. Также показана возможность использовать этот метод в in vitro исследованиях (Sanderson et al., 1984)[20]. Ограничение - чувствительность данного метода падает со временем после воздействия повреждающего агента.

Метод анализа мутаций Гликофорина А основан на выявлении мутаций в одной из форм Гликофорина А в эритроцитах периферической крови (Langlois et al., 1986, Grant and Bigbee, 1993) [21, 22]. Нормальный эритроцит имеет на поверхности мембраны две аллельные формы Гликофорина А - М и N. Если же произошла мутация в одной из аллелей, то на мембране эритроцита присутствует только одна из оставшихся молекул гликопротеина и такой эритроцит (МО или N0) отмечается как мутантный при флуоресцентном анализе. Так как мутации происходят в эритробластах (клетках предшественниках эритроцитов) и не исчезают со временем, то данная методика является одной из самых чувствительных даже через значительное время после воздействия генотоксина. Для анализа достаточно 1 мл периферической крови, но не существует адекватной in vitro модели использования этой методики. Ограничения: без автоматизации - довольно трудоемкий метод, с автоматизацией (использование проточного флуориметра) - дорогой; только половина (50%) человеческой популяции имеют гетерозиготный Гликофорин А в форме MN - необходимый для анализа, остальная часть популяции - гомозиготная (ММ или NN) - для исследований не подходит.

Анализ мутаций в рецепторе Т-клеток основан на особенности строения рецепторов ар �