Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярная радиобиология сложного гена vestigial Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная радиобиология сложного гена vestigial Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

АФАНАСЬЕВА Кристина Петровна

МОЛЕКУЛЯРНАЯ РАДИОБИОЛОГИЯ СЛОЖНОГО ГЕНА VESTIGIAL DROSOPHILA MELANOGASTER

03.01.01 —Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г я ноя 2013

Москва-2013

005541492

Работа выполнена в Научно-хозрасчетном подразделении «Отдел фазотрона» Лаборатории ядерных проблем им. В.П. Джелепова Объединённого института ядерных исследований, г. Дубна.

Научный руководитель: доктор биологических наук, главный научный сотрудник НХПОФ ЛЯП ОИЯИ Александров Игорь Донатович

Официальные оппоненты:

Ким Александр Иннокентьевич, доктор биологических наук, профессор кафедры генетики биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова;

Михайлов Владимир Федорович,кандидат биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной биологии и генетики радиационных эффектов ФНБУ ГНУ Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна.

Ведущая организация: ФГБУН Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится «19» декабря 2013 года в 14:00 час. на заседании диссертационного совета Д 501.001.65 при МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, Биологический факультет МГУ, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: Ломоносовский проспект, 27, 8 этаж, ком. 812. Отзывы на автореферат просим отправлять по адресу: Веселовой Т.В. Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, Москва, 119991. Факс: +7(495)939-11-15 (2 экз. в бумажном варианте с печатью и подписью обязательно).

Автореферат разослан « 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Веселова Т.В.

Актуальность работы

Концептуальное для высших эукариот обобщение классической радиационной генетики и цитогенетики (Muller, 1954 а, б), о наличии в спектре наследуемых изменений гена 2 основных классов мутаций - «точковые» (внутригенные изменения) и аберрационные (делеционного и обменного типа) оставило нерешенным фундаментальный вопрос о их молекулярной природе.

Изучение этого вопроса стало возможным с появлением таких молекулярных методов, как блот-гибридизация по Саузерну, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенирование. В частности, на небольших выборках мутаций ряда генов Drosophila облученных в генеративных клетках у-квантами и нейтронами и изученных названными методами был описан гетерогенный спектр молекулярных изменений от внутригенных делеций до замен отдельных пар оснований, лежащих в основе «точковых» мутаций (Pastink et al., 1988; 1990). О делеционной природе рентген-индуцированных мутаций отдельных генов свидетельствуют и данные для генеративных клеток Mus Musculus (Rinchick Е.М. et al., 1986).

Близкие результаты были получены в последствии и на соматических клетках с использованием таких генов-репортеров, как HPRT (Anderson et al., 1993, Philips et al., 1997) и APRT (Fujimori et al., 1992).

В то же время работы по молекулярному анализу структуры гена у радиационно-индуцированных аберрационных мутантов обменного типа немногочисленны и свидетельствуют о возможности локализации разрыва внутри гена облученного в генеративных клетках Drosophila (Williams, et al., 1991, Александров, Александрова, 1994) и соматических клетках человека (Sugg S.L. et al, 1996).

Эти и другие имеющиеся в литературе данные по обсуждаемому вопросу получены на разных тест-системах, генах с разной экзон-интронной структурой и в сильно отличающихся по радиационным условиям экспериментах, что не дает общего представления о качественных и количественных закономерностях радиомутабильности гена на молекулярном уровне в случае его мутаций «точковой» и аберрационной природы. В этой связи важным и актуальным является системный подход, т.е. проведение исследований на одном гене-репортере, сравнительное изучение действия на него в одних и тех же условиях эксперимента различных по ЛПЭ видов излучений с целью выявления спектра всех возможных повреждений, их оценки и молекулярной характеристики.

Наиболее актуальным в настоящее время остается изучение радиомутабильности генов в генеративных клетках, поскольку радиационный мутагенез на молекулярном уровне в этих клетках является менее изученными, но при этом высоко значимым для оценки рисков действия радиации для последующих поколений. К тому же, возможность экстраполяции данных полученных на соматических клетках на генеративные остается не ясной в силу малочисленности соответствующих данных для генеративных клеток, принципиальных различий в организации хроматина, а так же различий в работе систем репарации, обуславливающих судьбу первичных радиационных повреждений у этих двух типов клеток.

Проведение такого рода масштабных исследований в относительно короткий период времени возможно лишь на немногих генетически хорошо изученных объектах, среди которых в первую очередь следует рассматривать Drosophila melanogaster. В качестве гена-репортера перспективным является использование гена vestigial (vg), как наиболее близкого по размерам и организации к генам млекопитающих, и в спектре радиационно-индуцированных изменений которого регулярно наблюдаются мутации обоих классов, частота индукции которых линейно зависит от дозы редко- и плотноионизирующего излучения (Александров и др., 2001).

Цели и задачи работы

Целью работы является сравнительное изучение природы молекулярных изменений крупного гена vestigial Drosophila melanogaster у мутантов «точковой» и аберрационной природы, индуцированных разными дозами у-квантов 60Со, моноэнергетических нейтронов (Еср=0,85МэВ) и их комбинированного воздействия, с оценкой спектра этих изменений и их

распределения по карте гена.

Для достижение вышеназванной целей в работе были поставлены

следующие задачи:

1. Систематизировать генетическую коллекцию спонтанных и радиационных мутантов по гену vg по таким параметрам, как «точковая» и аберрационная природа, вид излучения и доза.

2. Провести молекулярный анализ структуры гена vg методом ПЦР у спонтанных, у-, нейтрон- и нейтроны+у-индуцированных мутантов «точковой» и аберрационной природы.

3. Сравнить выявленные молекулярные изменения у «точковых» и аберрационных мутантов гена vg, оценить зависимость этих изменений от вида и дозы излучения и определить характер распределения молекулярных изменений на карте гена.

4. Изучить на молекулярном уровне генетические эффекты комбинированного действия нейтронов и у-излучения по сравнению с эффектами этих видов радиации в отдельности.

5. Провести гетеродуплексный анализ и секвенирование не выявляемых методом ПЦР изменений ДНК 3-го и 4-го экзонов гена у «точковых» и аберрационных мутантов vg спонтанного и радиационного происхождения.

Положения, выносимые на защиту

1. Качественная картина молекулярных изменений гена, выявляемая методом ПЦР, одинакова для двух изученных видов радиации, однако в индукции частичных делеций гена нейтроны более эффективны, чем у-излучение.

2. Наличие кластеров повреждений на разных уровнях организации генома после действия обоих изученных видов радиации свидетельствует о гораздо более высокой степени пораженности генома клетки чем это следует из анализа традиционных радиобиологических эффектов (генные мутации, аберрации хромосом).

3. Потери ДНК варьирующей величины, наблюдаемые в области аберрационного разрыва при обменных перестройках хромосом ожидаемы в рамках современной теории структуры трека и моделей организации хроматина зрелых генеративных клеток.

4. Систематические замены оснований ДНК в облученном гене ведущие к повышению уровня однонуклиотидного полиморфизма (8№) свидетельствуют о необходимости нового подхода к оценке риска радиации, основанного на анализе БЫР.

Научная новизна работы

Впервые в одинаковых условиях эксперимента на одном гене сложной организации в зародышевых клетках выявлен спектр молекулярных повреждений после действия ионизирующих излучений с разной ЛПЭ.

Впервые показана кластерность повреждающего действия радиации на генетический аппарат зародышевой клетки, проявляющаяся в наличии

нескольких независимых мутационных повреждений разной сложности как у «точковых» мутантов так и у мутантов аберрационной природы.

Впервые представлена схема механизма формирования аберраций обменного типа с делетированием последовательностей ДНК разной величины в области аберрационного разрыва.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были доложены в виде устных и стендовых докладов- на следующих конференциях: «V съезд вавиловского общества генетиков и селекционеров» (Москва, 2009); Third International Conference, Dedicated to N. W. Timofeeff-Ressovsky «Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution» (Alushta, 2010); «VI съезд no радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность)» (Москва, 2010); X Конференция молодых ученных, специалистов и студентов, посвященная 50-летию со дня первого полета человека в Космос» (Москва, 2011); Российская научная конференция с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (Санкт-Петербург, 2011).

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 92 страницах, включает введения, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Работа иллюстрирована 10 рисунками и 7 таблицами. Список литературы насчитывает 121 источник, из них 22 отечественных и 99 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Рецессивный ген vg (15107 п.н., 8 экзонов, 7 интронов) локализован в секции 49Е1 плеча политенной аутосомы 2R Drosophila melanogaster (рис. 1).

Случайные выборки из 8 мутантов vg спонтанного происхождения, полученных в контрольных скрещиваниях в период нестабильности дикой линии D32 (87-91гг) (Александров, Александрова, 1994), и 114' мутантов радиационно-индуцированной природы (среди них 60 у-, 27 нейтрон- и 27 нейтроны + у-индуцированных, среди которых 5 получены от источника 252Cf) были взяты для анализа из генетической коллекции радиационных мутантов Drosophila melanogaster в ОИЯИ (Дубна, Россия), которые были получены в ходе широкомасштабных радиационно-генетических экспериментов,

б

проводимых на протяжении 70-90гг. прошлого столетия. Физические параметры экспериментов по воздействию у-излучения 60Со (установка «Сатгпа-се11-220», N=5,7 Гр/мин, дозы 5-60 Гр) и моноэнергетических нейтронов деления (реактор БР-10, £ср=0.85 МэВ, N=2,6 Гр/мин, дозы 2.5-20 Гр) (А1ехапс1гоу, 1984) на зрелые спермии самцов дикой лабораторной линии Ш2 В. те1апо^а$1ег, а также опытов по комбинированному действию нейтронов и у-излучения (те же источники) при их равном вкладе в общую дозу 15-30 Гр (Александров, Александрова, 1989) и по воздействию смешанного у-нейтронного излучения (источник 252СС, N=0,35 Гр/мин, дозы 7-28 Гр) (Александров, 1987) детально описаны ранее. Условия получения новых спонтанных и радиационно-индуцированных мутаций гена

+Р32 с

vg в 5-локусном тесте, где интактные и облученные дикие самцы скрещивались с самками тестер-линии АХ генотипа у зс*1 М49 .чс8 ч? (М5); Ь1 сп1 vg1 так же описаны ранее (Александров и др., 2001).

интронной структуры гена vestigial (15112п.н.); (г): положение ампликонов изучаемых субрайонов гена.

На основании ранее проведенного цитогенетического анализа (Alexandrov, 2004) вся выборка мутантов была подразделена на 2 класса: «точковые», не имеющие цитологически выявляемых изменений в районе локализации гена на уровне хромосомы и мутанты, имеющие хромосомные перестройки различного рода с локализацией одного из разрывов в области гена vg. Класс с хромосомными перестройками был проанализирован и систематизирован по уже имеющимся данным генетического теста на комплементацию с проксимальным sea и дистальным 1(2)С генами-маркерами (рис. 1), с определением генетических границ делеций по тем же генам-маркерам (Александров и др., 2001). Как было показано ранее, индукция мутаций обоих классов линейно зависит от дозы у-

излучения, нейтронов и их комбинированного воздействия (Александров и др., 2001, Александров, Александрова, 1989). В этих же работах показано, что в индукции мутантов аберрационной природы нейтроны и комбинированное облучение нейтроны-Ну-кванты более эффективны, чем у-излучение, тогда как по тесту «точковые» мутации - картина обратная.

Выделение геномной ДНК

Геномную ДНК выделяли из 20-25 имаго близкородственных лабораторных линий D32, (дикая аллель vg+32), vg' из материнской линии KL и мутантов гомо-или гемизигот vgx/vg88c28 (yg88c2S является делецией Df(2R)49D4-F6 (Alexandrov, 2004), 80 т.п.н., захватывающей весь ген vg и дистальный ген-маркер 1(2)С), с использованием набора реагентов «Diatom® DNA Prep 100» («ISOGEN», Россия).

Полимеразная цепная реакция Учитывая значительный размер гена, для ПЦР-анализа вся его последовательность была подразделена на 16 перекрывающихся фрагментов варьирующей величины (381-1901 п.н.) (рис. 1), к которым были подобраны уникальные пары праймеров. Амплификацию фрагментов гена на приборе «Терцик» («ДНК-технология», Россия) проводили с помощью реагентов «GenPak® PCR Master» Mix Core» («ISOGEN», Россия) на геномной ДНК мутантов vg. Условия проведения ПНР, предварительно оптимизированные по температуре отжига праймеров для каждого фрагмента, следующие: предварительная денатурация - 95°С, 5мин, 1 цикл; денатурация - 95°С, 1мин, отжиг праймеров - 54-64°С, 30с, синтез - 72°С, 1 мин, 30 циклов; окончательная достройка - 72°С, 7мин. Продукты реакции анализировали в 1%-ном агарозном геле в присутствии этидиум бромида (0,5 мкг/мл). Визуализацию проводили на трансиллюминаторе «Флускоп» (Россия) с последующим фотографированием. При интерпретации полученных данных полагали, что отсутствие одного фрагмента отражает наличие мутационного повреждения (микроделеция) в районе посадки прямого или обратного праймеров отсутствующего фрагмента, а отсутствие двух и более смежных фрагментов - наличие протяженной частичной делеции гена. Результаты таких реакций проверялись не менее трех раз. В случае мутантов с нормальной картиной всех изучаемых фрагментов гена полагали, что они имеют мелкие мутационные повреждения, не выявляемые этим методом. Достоверность различий в относительной частоте возникновения отдельных типов повреждений, выявляемых методом ПЦР для разных видов излучений,

оценивали с помощью критерия t-Стьюдента. Неслучайный характер распределения ПЦР-детектируемых мутационных повреждений на карте гена vg по сравнению с теоретически ожидаемым случайным оценивали с помощью критерия х-квадрат.

Анализ гетеродуплексов

Для выявления возможных изменений ДНК гена, не определяемых методом ПЦР, был проведен гетеродуплексный анализ ДНК экзонов 3 и 4 (фрагмент 8 и 10, соответственно) у 50 радиационных мутантов vg из той же изучаемой выборки с использованием метода конформационно-чувствительного гель-электрофореза (CSGE) (Hill, 2005).

Формирование гетеродуплексов проводили в объеме 20 мкл с использованием продуктов ПЦР мутантного и контрольного генотипов в соотношении 2:1 в следующих условиях: денатурация - 98°С, 5мин., образование гетеродуплекса - 65°С, ЗОмин., с последующим охлаждением до комнатной температуры. Тонкий, 0,8 мм толщины гель, содержащий 10%-ный полиакриламид в соотношении 28:1 к бис-акриламиду, 10%-ный этиленгликоль, 15%-ный формамид с добавлением ПСА и ТЕМЕД для инициации полимеризации, готовили в 0,5><ТТЕ буфере (IxTTE: 89 ммоль/л Трис, 28,5 ммоль/л таурин, 0,2 ммоль/л ЭДТА, pH 9.0). Префорез проводили в 0,5><ТТЕ буфере в течение 30 мин при 500V, форез - при 500V в течение 20 ч. на аппарате для секвенирования («Macrophor»), Окрашивание геля проводили методом серебрения.

Секвенирование

Секвенирование прямой и обратной нитей ДНК экзонов 3 и 4 гена vg у мутантов с выявленными в процессе гетеродуплексного анализа изменениями проводили в ФГБУН НИИ Физико-химической медицины ФМБА (г. Москва, Россия). Секвенирование этих фрагментов для каждого мутанта повторяли как минимум 3 раза. Программу http://helixweb.nih.gov/emboss lite/compare.html использовали для сравнительного анализа секвенированных последовательностей диких и мутантных аллелей гена vg.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ПЦР-анализ спонтанных мутаций

Перед анализом структуры гена vg у спонтанных и радиационно-индуцированных мутантов был проведен ПЦР-анализ облучаемого аллеля vg+32

9

из лабораторной линии D32 и аллеля vg из материнской линии KL. Согласно полученным результатам, структура гена у обоих аллелей оказалась идентичной и ожидаемо нормальной, исключая фрагмент 9 (интрон 3), ПЦР-продукт которого отсутствовал у аллеля vg'. Это обусловлено стабильной инсерцией крупного мобильного элемента 412 (7,6 т.п.н.) именно в этот интрон (Lindsley and Zimm, 1990), вследствие чего, размер этого фрагмента возрастал с 812 до 8412 п.н. и не мог быть амплифицирован в наших стандартных условиях реакции.

Согласно результатам ПЦР-анализа 8 спонтанных мутантов, у 1 из них не было выявлено никаких изменений структуры гена, тогда как у трех отсутствовал интрон 3 (фрагмент 9), у двух - экзон 2 (фрагмент 3) у двух остальных - экзон 3 (фрагмент 8) или экзоны 6-8 (фрагмент 16) соответственно.

Таким образом, анализ спонтанных мутантов показал наличие 2 типов повреждений: не выявляемые методом ПЦР (т.н. ПЦР+-мутанты) и обуславливающие отсутствие одного из изученных фрагментов гена («односайтовые» мутанты).

ПЦР-анализ радиационно-индуцированных «точковых» мутантов гена vgD. melanogaster

Согласно суммарным данным ПЦР-анализа 62 «точковых» мутантов гена vg, индуцированных изученными в работе видами радиационного воздействия, мутационные изменения, лежащие в основе их повреждения можно подразделить на четыре разных типа (рис. 2а): 1) ПЦР+-мутанты, 2) «односайтовые» мутанты, 3) внутригенные делеции с отсутствием от двух до девяти смежных фрагментов гена («многосайтовые» делеционные мутанты) и 4) мутанты с кластерами из 2-3 независимых повреждений «односайтового» и/или «многосайтового» типа в их разных сочетаниях, разделенных между собой ПЦР-нормальными участками гена (кластерные мутанты).

. Важно отметить, что 3-ий и 4-ый типы мутантов не характерны для спонтанных, следовательно, их можно рассматривать как молекулярные маркеры действия радиации на ген.

Анализ относительной частоты мутантов каждого типа отдельно для 3 видов лучевого воздействия (рис. 2а) показывает, что доля ПЦР+-мутантов среди всех остальных типов наиболее высока для у-квантов (16 случаев из 35 или 45,7%) и комбинированного воздействия (8 из 13 или 61,5%), что почти в 3 раза выше, чем для нейтронов (2 из 14 мутантов или 14,3%). Мутанты «односайтового» типа

повреждения преобладают, напротив, после действия нейтронов (6 из 14 или 42,9%), их уровень несколько ниже после у-квантов (13 из 35 или 37,1%), и является наименьшим после комбинированного воздействия (2 из 13 или 15,4%). Частота мутантов с «многосайтовыми» делениями после всех изученных в работе видов лучевого воздействия близка и составляет в среднем 14,7%. При этом, различий в вариабельности размеров и положении на карте гена «многосайтовых» делеций для всех трех видов облучения не установлено. Доля кластерных мутантов минимальна для у-квантов (1 из 35 или 2,9%), в отличие от нейтронов, где их доля в 9 раз выше (4 из 14 или 28,5%). После комбинированного облучения частота таких мутантов является промежуточной (1 из 13 или 7,7%).

Важно отметить, что зависимость спектра от дозы наблюдается лишь в случае у-излучения, где мутанты с 3-м и 4-м типами повреждения наблюдаются лишь при дозе 40 Гр и они отсутствуют в изученном диапазоне 5-20 Гр.

ПЦР-анализ радиационных мутантов vg с хромосомными обменами

ПЦР-анализ гена vg у 37 мутантов с инверсий (1п), 14 с транслокациями (Т) и 1 с транспозицией (Тр) (всего 52 с обменами) показал, что 4 (2 1п и 2 Т) из них являются мутантами с полной потерей изучаемого гена. Более того, согласно данным генетического анализа, у 4-х из низ отсутствует дистальный маркер 1(2)С, а у трех -дополнительно и проксимальный маркер sea. Следовательно, эти мутанты являются мультилокусными делециями сочетающимися с аберрационным обменом.

Результаты ПЦР-анализа оставшихся 48 аберрационных мутантов показали наличие тех же 4 типов повреждений гена, что и у «точковых» (рис. 26).

При этом, частоты мутанов 1-го типа для всех трех видов облучений близко совпадают с таковыми у класса «точковых» мутантов, а именно: преобладают в выборках у- и нейтроны-Ну-индуцированных мутантов (50 и 61,5% соответственно), и являются наименьшим для нейтронов (27,3%). В индукции «односайтовых» мутантов нейтроны в 2 раза более эффективны, чем у-кванты и комбинированное облучение (45,5; 20,8 и 23,1% соответственно). Эффективность у-квантов в индукции мутантов 3-го типа («многосайтовые» делеции) близка к таковой для «точковых» мутантов и составляет 16,7%, и выше в 2 раза чем для нейтронов и комбинированного воздействия (9,1 и 7,7% соответственно). Как показывает анализ данных, размеры таких внутригенных делеций варьируют от двух до шести смежных фрагментов. Относительная

частота индукции кластерных мутантов (4-й тип) нейтронами и у-квантами у аберрационных мутантов ниже таковой для «точковых» после тех же видов облучения и составляет 18,2 и 12,5% соответственно, тогда как у кластерных мутантов аберрационной и «точковой» природы после комбинированного облучения эта частота совпадает и составляет 7,7%.

Важно отметить, что все 4 типа повреждений у аберрационных мутантов наблюдаются при всех дозах и видах облучения, что показывает отсутствие какой-либо дозовой зависимости в их индукции изученными в работе видами радиации. Этим отличается данный класс мутантов от «точковых», где наблюдалась зависимость спектра от дозы в случае у-излучения.

Факт обнаружения значительной части аберрационных мутантов с ПЦР -картиной (23 из 48 или 47,9% суммарно для трех видов облучения) свидетельствует о том, что во всех этих случаях аберрационный разрыв локализуются вне гена, поскольку в противном случае ген был бы разорван и разобщен обменом, и места внутригенного разрыва детектировались бы методом ПЦР как изменения 2-го или 3-го типов. Локализацию разрыва вне гена у 7 таких мутантов подтверждают и независимые результаты экспериментов по гибризизации in situ (Александров, Александрова, 1994).

Сопоставление результатов вышеназванной работы по локализации разрыва внутри гена у шести мутантов с полученными нами результатами ПЦР-анализа этих же мутантов о наличии у них «односайтовых» или «многосайтовых» повреждений может свидетельствовать о том, что процесс формирования аберрационного разрыва-соединения сопровождается потерями ДНК гена в области разрыва, которые могут варьировать от сотен п.н. (отсутствие одного фрагмента) до 5-6 т.п.н. («многосайтовая» делеция), независимо от характера обмена и вида радиации. У остальных мутантов с ПЦР-детектируемыми изменениями того или иного типа локализация аберрационных разрывов относительно гена vg остается пока неясной и требует проведения дополнительных исследований.

Сравнительный анализ действия трех видов облучения на

молекулярном уровне

Установленное сходство в спектре и частотах мутантов с разными мутационными ПЦР-выявляемыми повреждениями позволяет объединить выборки аберрационных и «точковых» мутантов для каждого вида облучения и

оценить эффективность изученных в работе видов облучения в их индукции (рис. 2в).

Как показывает анализ, у у- и нейтроны+у-индуцированных мутантов картина распределения 4 типов повреждений близка, и в ней доля ПЦР+-

мутантов в среднем (около 52%) индуцированных (20%) (р <0,01). 70

ю" £ 60

|50

5 40

го

0 30

и £ 20

10

0

£ 90 §* 80

1 70

<и >, 60

го 50 го

достоверно выше, чем у нейтрон-

5? 70

б)

1-ый

2-ой 3-ий 4-ый типы повреждений

1-ый 2-ой 3-ий 4-ый типы повреждений

у-кванты нейтроны

нейтроны+у-кванты

40 й 30 т 20 10 о

1-ый 2-ой 3-ий 4-ый типы повреждений

Рис. 2. Относительная частота мутантов vg с мутационными повреждениями 4

разных типов детектируемых методом ПЦР для изученных в работе видов

излучений: а) мутанты «точковой» природы; б) мутанты аберрационной

природы; в) сумма двух выборок.

В тоже время у нейтрон-индуцированных мутантов преобладающим типом являются «односайтовые», и частота их возникновения выше чем у у- и нейтроны+7-индуцированных. Остальные 3 типа мутационных повреждений у нейтрон-индуцированных мутантов встречаются с приблизительно одинаковой

частотой. Однако, доля кластерных мутантов после действия нейтронов более чем в 3 раза выше таковой для двух других видов облучения.

Таким образом, если распределение относительных частот мутантов по типу повреждения после комбинированного облучение близко к таковому после у-квантов, то отсутствие у них зависимости спектра от дозы облучения (наличие мутантов 3-го и 4-го типов при всех изученных дозах) аналогично таковому для нейтронов. Это позволяет предполагать вклад в молекулярно-генетические эффекты комбинированного облучения как у-излучения, так и нейтронов. Распределение на карте гена vg ПЦР-выявляемых повреждений Близкая ПЦР-картина распределения по 4 типам мутационных повреждений у мутантов «точковой» и аберрационной природы позволяет оценить частоту повреждаемости каждого изученного фрагмента гена (рис. 3).

Сравнительный анализ распределения среди 16 изученных фрагментов «односайтовых» повреждений и 5'- и З'-концов «многосайтовых» делеций (93 независимых случая в целом для хромосомных и «точковых» мутантов)

-40

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

фрагменты гена vд

Рис. 3. Распределение на карте гена vg выявляемых методом ПЦР «односайтовых» повреждений и концов «многосайтовых» делеций.

14

показывает их частое совпадение на карте гена для всех видов радиации, что позволяет оценить относительную частоту повреждаемости каждого фрагмента в отдельности для всех трех видов облучения. В таком случае распределение относительных частот мутационных изменений на карте гена vg оказывается далеко неравномерным и достоверно отличается от теоретически ожидаемого случайного (х2=133.22, PO.OOl). Эта неравномерность обусловлена, главным образом, наиболее частым повреждением З'-конца интрона 2 и района интрона 3 (фрагменты 7 и 9 соответственно), которые могут представлять собой "горячие" участки среди всех изученных для данного гена.

Высокая частота повреждаемости 9го фрагмента (интрон 3) наблюдается за счет большего вклада типа «односайтовых» делеций у у- и нейтрон-индуцированных мутантов «точковой» природы (10 случаев среди 19 мутантов или 52,6%). Близкая же картина наблюдается у 3 спонтанных мутантов из 7 имеющих «односайтовые» делеции (42,9%).

Поскольку, аналогичная ПЦР-картина характерна и для тестер-аллеля vg1, возникает вопрос: не являются ли названные спонтанные и радиационные мутанты фактически аллелью vg'? Результаты экспериментальной проверки этого предположения представлены в разделе секвенирования.

Сочетание хромосомного обмена с делецией в области аберрационного разрыва

Как было показано выше, аберрационный разрыв может быть локализованы внутри гена и сопровождаться, как нами устновлено методом III [Р односайтовыми или многосайтовыми делециями, размеры которых т.о. может варьировать от сотен п.н. до 5-6 т.п.н.

Наряду с небольшими внутригенными делециями, сопутствующими аберрационному разрыву-соединению, методом комплементационного анализа установлены более крупные потери генетического материала в области хромосомного разрыва у 4 мутантов, где наряду с делецией всего гена vg наблюдается и генетически определяемая потеря фланговых генов-маркеров (проксимального sea у первых трех и дистального 1(2)С у всех четырех мутантов), что позволяет определить размеры этих протяженных не только на молекулярной но и на генетической карте делеций в пределах не менее 200 т.п.н. ДНК.

Эти результаты свидетельствуют о том, что формирование хромосомных обменов сопровождается делециями разной величины в области одного из

36СО 49СЭ 49ЕР

49° Делеция

Рис. 4. Молекулярная модель образования комплексных обменно-делеционных аберраций на примере нейтрон-индуцированного инверсионного мутанта vg с разрывами в подсекциях 36СЮ, 49ЕБ и делеции с разрывами в подсекциях 49СЕ) и 49ЕР: а) схема политенной аутосомы 2 с локализацией в соответствующих подсекциях концов потенциальных аберрационных разрывов; б) схема топологического контакта («топологический узел») соответствующих подсекций с предаберрационными повреждениями ДНК, формирующих основания макро- и микропетель - предшественников инверсии и делеции; в) «топологический узел» (в увеличенном масштабе) с шестью концами от трех двунитевых разрывов и схема негомологичных соединений этих концов, ведущих к образованию инверсии и делеции; г) схема структурно перестроенной аутосомы 2 с наблюдаемыми в опыте перицентрической инверсией и интерстициальной делецией с генами эса^-1(2)С. Для простоты и наглядности двухцепочечная ДНК на б) и в) изображена в виде одной нити.

разрывов-соединений локализованных в районе гена vg. Существование подобного явления может быть обусловлено сложной структурой трека, наложенной на не менее сложную многоуровневую ЗД-укладку хроматина в спермии. Схема одного из возможных рекомбинационных механизмов образования в зиготе после сингамии хромосомных перестроек, сопровождаемых крупными делениями, нами предложена на рис. 4. В основу модели положены представления о тороидально-петлевом принципе организации хроматина и компактной укладки этих петель в ядре зрелых спермиев животных (Alexandrov et al., 2009; Ward 2010), позволяющих формировать «топологические узлы», а так же представления о сложной структуре трека, включающей его кор и «шубу» из 5-электронов (Goodhead, 2006). Прохождение коровой части трека через топологический узел с большим энерговыделением, с образованием кластеров двунитевых разрывов создает предпосылки для процессов репарации, основанных на межнитевой рекомбинации. В результате негомологичной рекомбинации возможен процесс образования аберрационного обмена и сопутствующей делеции мини-петли.

Анализ методом секвенирования 3-го и 4-го экзонов гена vg

Общая ПЦР-картина у спонтанных, радиационных мутантов и аллеля vg1 из KL не даёт еще оснований говорить о единой генетической природе всех этих аллелей. Для выявления дополнительных молекулярных маркеров в районах гена, смежных интрону 3 (экзоны 3 и 4), было проведено секвенирование этих экзонов у всех названных аллелей. Как показывают результаты секвенирования (табл.1) молекулярные маркеры выявленные у vg1 наблюдаются у всех изученных трех спонтанных и четырех радиационно-индуцированных мутантов, у которых методом ПЦР так же, как и у аллеля vg' было установлено отсутствие интрона 3.

Таким образом, учитывая наличие 5 молекулярных маркеров в этом районе гена (около 1600 п.н.) у vg', вслед за ПЦР было проведено секвенирование этих экзонов у 3 спонтанных и 4 радиационно-индуцированных мутантов (табл. 1).

Следовательно, изученные мутанты имеют район гена, включающий экзон 3, интрон 3 и экзон 4 (включающий около 1600п.н.) идентичны аллелю vg'.

Согласно полученным результатам, выявленные независимые дополнительные маркеры в этих 2 экзонах подтвердили, что все эти проанализированные мутанты имеют этот район из аллеля vg!.

Эти результаты свидетельствуют о факте переноса генетической информации аллеля на аллель vg+32 в основе механизма которого, можно полагать, лежит межаллельная рекомбинация по типу генной конверсии в зиготе после объединения удвоенных интактного материнского и облученного отцовского геномов.

Табл. 1. Результаты секвенирования экзонов 3 и 4 гена vg у аллеля V спонтанных и радиационно-индуцированных мутантов vg «точковой» природы с

отсутствием интрона 3.

мутант вид облучения, доза (Гр) секвенирование ехЗ ПЦР ¡11 3 секвенирование ех4

КЬ А20070*, Т2331С Отриц. А2514С, С2520Т

спонтанное А2007С, Т2331С Отриц. А2514С, С2520Т

спонтанное А2007С, Т2331С Отриц. А2514С, С2520Т

уивп спонтанное А20070, Т2331С Отриц. А2514С, С2520Т

у§87е140 У, 20 А20070, Т2331С Отриц. А2514С, С2520Т

у§79Ь1 у, 40 А2007С, Т2331С Отриц. А2514С, С2520Т

у§88с87Ь п, 2,5 А20070, Т2331С Отриц. А2514С, С2520Т

п, 2,5 А20070, Т2331С Отриц. А2514С, С2520Т

* - положение оснований по экзонной карте

Гетеродуплексный анализ и секвенирование экзонов 3 и 4 радиационных мутантов гена vg

Учитывая высокую частоту ПЦР+-мутантов среди «точковых» и аберрационных классов, представляет интерес выяснить, какие молекулярные изменения могут лежать в основе не детектируемые методом ПЦР повреждений.

Так же наличие кластерного типа повреждений у целого ряда мутантов обоих классов позволяет предполагать и наличие дополнительных молекулярных изменений на уровне отдельных оснований, сопутствующих повреждениям, выявляемым цитологически, генетически и методом ПЦР.

Для решения этих вопросов был проведен гетеродуплексный анализ 3 и 4 экзонов у случайной выборки из 26 «точковых» и 20 аберрационных мутантов с. разными типами повреждений, выявляемых методом ПЦР.

Согласно полученным результатам у 9 ПЦР+-мутантов из 26 всех изученных «точковых» было показано наличие гетеродуплексов, в основе которых лежат, как выявило секвенирование, однонуклеотидные замены, делеции 7-11 и инсерция 2 п.н. в разных положениях (табл. 2). При этом у 4 из них и одного с многосайтовой делецией, которые индуцированы разными изученными видами лучевого воздействия в экзонах обнаружено несколько независимых изменений, что позволяет их рассматривать как мутантов кластерного типа. Эти результаты расширяют наши представления о кластерном характере действия ионизирующих излучений разного вида на молекулярном уровне.

У 20 аберрационных мутантов методом гетеродуплекса не было выявлено никаких молекулярных изменений в 3 и 4 экзонах.

Табл. 2. Результаты секвенирования экзонов 3 и 4 гена vg у мутантов «точковой» природы

№ мутантная линия вид облучения, доза (Гр) картина ПЦР секвенирование ехЗ секвенирование ех4

1 у§87е80 у, 10 ПЦР 2616(1е111

2 у§67(12 у, 40 «многосайто-вая» делеция А2007в А2513С, А2582Т

3 у§77а4 у, 40 ПЦР 197Ые15

4 у§83Ь24 у, 40 ПЦР+ С2637А, А2638С, 639delll

5 у§83с24 у, 40 ПЦР 211Ые111

6 У£83с42 у, 40 ПЦР 2590del7

7 У§8311 п, 10 ПЦР+ А2009С А2513С, А2582Т

8 УЯ88£104 п+у, 15 ПЦР+ А2007в, Т2331С

9 vg88g40 п-+т, 15 ПЦР+ А2007С

10 У§88Г66 п+у, 20 ПЦР+ 2437ш8ТА, С2438Т, С2439Т, С2442Т, в2444С

Кластерный характер действия радиации на геном.

Если проанализировать всех аберрационных мутантов на предмет наличия кластеров на уровне гена, определяемого методом ПЦР, а так же на уровне района гена и хромосомы и целом (с привлечение литературных данных гибридизации in situ, генетического и цитологического анализов), то из 48 мутантов, 34 имею кластер повреждений на том или ином уровне организации генома, что составляет 70,8% общей выборки аберрационных мутантов (табл.3).

Табл. 3. Анализ выборки мутантов аберрационной природы на предмет выявления кластеров на разных уровнях организации генома.

Выборка, проанализированная на предмет кластеров Разрыв вне гена Разрыв внутри гена Локализация разрыва не ясна Сумма мутантов с кластерами

ПЦР" 1-4-ый тип ПЦР-повр. 1-4-ый тип ПЦР-повр и отсутствие sea или 1(2) С гена 4-ый тип ПЦР-повр. 4-ый тип ПЦР-повр.

34

48 23 4 2 2 3 (70,8%)

Сопоставление этих результатов с данными для мутантов «точковой» природы показывает, что 6 из 62 (9,7%) имеют кластеры, выявляемые методом ПЦР. А у 5 других из 27 (18.5%) с изученными методом секвенирования 3-м и 4-м экзонами имеются кластеры в виде замен, делеций и инсерций на уровне оснований ДНК. Т.о. секвенирование позволяет выявить дополнительные молекулярные кластеры, которые возникают по-видимому с большей частотой.

Установленные нами особенности природы кластеров для мутантов «точковой» и аберрационной природы могут быть объяснены в рамках современных представлений о структуре трека ионизирующей частицы. В частности, аберрационные мутанты с дополнительными повреждениям на молекулярном (ДНК гена) и генетическом (поведение смежных генов-маркеров) уровнях возникают, по-видимому, в результате прохождения в этом районе коровой части трека и сопутствующего действия вторичных частиц в виде дельта-электронов, определяющих дополнительные эффекты на разных уровнях

20

генома. В случае «точковых» мутантов, их изменения похожи на результат действия отдельно долетающих менее плотноионизирующих частиц шубы 5-электронов.

Таким образом, анализ структуры гена vg (включая все его экзоны и интроны) у радиационно-индуцированных мутантов «точковой» и аберрационной природы методом ПЦР выявил наличие 4 типов мутационных изменений (ПЦР+, «односайтовые», «многосайтовые», кластерные), соотношение которых определяется дозой и качеством радиации. Распределение «односайтовых» повреждений и концов «многосайтовых» делеций на карте гена является неравномерным с наиболее частым повреждением определенных районов двух интронов гена. Новым и важным является обнаружение методом ПЦР нескольких независимых повреждений (кластер) в пределах гена после действия как редко- так и плотно-ионизирующих видов излучений, изученных в работе. Методы гетеродуплексного анализа и секвенирования выявили в изученных экзонах дополнительно молекулярные изменения у мутантов «точковой» природы в виде замен оснований, делеций и инсерций в несколько пар оснований, что расширяет количество мутантов с кластером независимых повреждений в пределах гена. Привлечение литературных данных по генетическому и цитологическому анализам для некоторых изученных в работе мутантов аберрационной природы показало наличие кластеров на генетическом и хромосомном уровнях. Одновременно результаты секвенирования смежных отсуствующему интрону районов гена у «односайтовых» мутантов позволило установить в этом районе процесс генной конверсии, как механизм репарации радиационно-индуцированных повреждений ДНК гена, наблюдаемый и у спонтанных мутантов в условиях нестабильности генома. Так же было обнаружено, что аберрации обменного типа сопровождаются в области разрыва потерей части ДНК варьирующей величины (от нескольких сотен до 200 т.п.н.).

выводы

1. Генетическая коллекция из 121 спонтанных и радиационно-индуцированных мутантов vestigial Drosophila melanogaster систематизирована по цитогенетической природе (62 «точковой», 52 аберрационной), виду и дозе радиации.

2. ПЦР-анализ структуры гена vg у изученных в работе мутантов выявил 4 типа молекулярных повреждений (ПЦР+, «односайтовые», «многосайтовые», кластерные).

3. У радиационных мутантов «точковой» и аберрационной природы после трех испытанных видов облучения выявлены все типы повреждений, у спонтанных мутантов - два типа (ПЦР+ и «односайтовые»). Установлена зависимость спектра повреждений от дозы только для у-излучения у «точковых» мутантов, для всех остальных изученных в работе выборок мутантов дозовых зависимостей не установлено. Распределение односайтовых повреждений и концов многосайтовых делеций на карте гена является не случайным, с их локализацией преимущественно в 3'-конец интрона 2 и интроне 3.

4. Спектр ПЦР-детектируемых мутационных повреждений после комбинированного нейтроны+7-облучения качественно идентичен таковому для двух видов радиации в отдельности, а соотношение в нем разных типов повреждений близко к наблюдаемому для у-излучения.

5. Гетеродуплексный анализ ДНК и секвенирование ПЦР+-фрагментов гена vg выявили молекулярные изменения в виде замен оснований, небольших делеций и инсерций.

6. Комплексный молекулярный, генетический и цитологический анализ радиационных мутантов vg позволил установить кластерный характер действия изученных в работе видов радиации на молекулярном, генетическом и хромосомном уровнях организации генома.

7. Установлен факт межаллельная рекомбинация с переноса части материнского аллеля vg' в отцовский ген vg+32 у некоторых спонтанных и радиационно-индуцированных мутантов.

8. Комплексный молекулярно-генетический анализ радиационно-индуцированных мутантов vg аберрационной природы выявил потери ДНК сопутствующие аберрационному разрыву-соединению, варьирующей величины на молекулярном и генетическом уровнях.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1) Александров И.Д, Афанасьева К.П, Александрова М.В., Лапидус И.Л.

Радиационная биология структурно разных генов Drosophila melanogaster. Сообщение 1. ген vestigial: молекулярная характеристика «точковых» мутаций // Журнал «Радиационная биология. Радиоэкология», 2012, том 52, № 3, с. 234-246.

2) Афанасьева К.П, Александрова М.В, Александров И.Д, Кораблинова С.В.

Радиационная биология структурно разных генов Drosophila melanogaster. Сообщение 2. ген vestigial: молекулярная характеристика аберрационных мутантов //Журнал «Радиационная биология. Радиоэкология», 2012, том 52, № 4, с. 349-362. Материалы в сборниках трудов конференций:

3) Afanasyeva К, Alexandrova М, Alexandrov I. Molecular radiobiology of the

animals genes: from N.W. Timofeeff-Ressovsky to the present day // abstracts of Third International Conference, Dedicated to N. W. Timofeeff-Ressovsky «Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution» JINR, Dubna, 2010, p. 182-184.

4) Афанасьева К.П, Александрова М.В, Александров И.Д. Изменения ДНК,

выявляемые методом ПЦР, у спонтанных и у-индуцированных мутантов по гену vestigial у Drosophila melanogaster // тезисы докладов «VI съезда по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность)», Издат. «РУДН», Москва, 2010 г, том 2, с.53.

5) Афанасьева К.П, Намолован Л.Н, Александрова М.В. Сравнительная

эффективность у-квантов, нейтронов и ионов 12С в индукции наследуемых мутаций генов разной величины и экзон-интронной организации у D. melanogaster!I тезисы докладов «X Конференции молодых ученных, специалистов и студентов, посвященная 50-летию со дня первого полета человека в космос», Москва, 19 апреля 2011г., с.13.

6) Афанасьева К.П, Александрова М.В, Александров И.Д. Характеристика

молекулярного спектра наследуемых мутаций сложного гена vestigial Drosophila melanogaster вызываемых реакторными нейтронами и фотонами Со // тезисы докладов Российской 25 научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии», Санкт-Петербург, 19-20 мая 2011 г, с. 123-124.

23

Отпечатано методом прямого репродуцирования с оригинала, предоставленного автором.

Подписано в печать 11.11.2013. Формат 60 х 90/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,62. Уч.-изд. л. 1,68. Тираж 100 экз. Заказ № 58110.

Издательский отдел Объединенного института ядерных исследований 141980, г. Дубна, Московская обл., ул. Жолио-Кюри, 6. E-mail: publish@jinr.ru www.jinr.ru/publish/

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Афанасьева, Кристина Петровна, Дубна

ОБЪЕДИНЕННЫЙ ИНСТИТУТ ЯДЕРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Лаборатория ядерных проблем им. В. П. Джелепова

04201365495

Афанасьева Кристина Петровна

МОЛЕКУЛЯРНАЯ РАДИОБИОЛОГИЯ СЛОЖНОГО ГЕНА VESTIGIAL DROSOPHILA MELANOGASTER

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

03.01.01 - радиобиология

Научный руководитель: доктор биологических наук И.Д. Александров

Дубна-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................9

1.1. Радиационный мутагенез отдельных генов у животных и человека..........................................................................................................9

1.1.1.Радиационный мутагенез в генеративных клетках высших животных.......................................................................................................10

1.1.1.1.Молекулярная природа радиационно-индуцированных «точковых» мутаций гена............................................................................12

1.1.1.2.Молекулярная природа радиационно-индуцированных мутаций гена аберрационного класса........................................................14

1.1.2.Радиационный мутагенез отдельных генов в соматических клетках млекопитающих.............................................................................16

1.2. Структура трека ионизирующих излучений и первичные повреждения ДНК........................................................................................21

1.3. Механизмы ошибочной репарации первичных повреждений ДНК................................................................................................................22

1.4. Структурная организация хроматина зрелых генеративных клеток у высших животных........................................................................26

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................29

2.1. Выделение геномной ДНК...........................................................31

2.2. Полимеразная цепная реакция.....................................................31

2.3. Анализ гетеродуплексов...............................................................34

2.4. Секвенирование.............................................................................36

3. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.........................37

3.1. ПЦР-анализ спонтанных мутаций...............................................37

3.2. ПЦР-анализ радиационно-индуцированных «точковых» мутантов гена О. melanogaster...............................................................40

3.3. ПЦР-анализ радиационных мутантов vg с хромосомными обменами.......................................................................................................48

3.4. Сравнительный анализ действия трех видов облучения на молекулярном уровне..................................................................................55

3.5. Распределение на карте гена vg ПЦР-выявляемых повреждений..................................................................................................................57

3.6. Сочетание хромосомного обмена с делецией в области аберрационного разрыва..............................................................................60

3.7. Результаты секвенирования 3-го и 4-го экзонов у аллеля vg1 и радиационных мутантов без ампликона 9 (интрон 3)..............................64

3.8. Гетеродуплексный анализ и секвенирование экзонов 3 и 4 радиационных мутантов гена vg, изученных методом ПНР...................67

3.9. Кластерный характер действия радиации на геном..................71

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................74

ВЫВОДЫ..............................................................................................75

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................78

ВВЕДЕНИЕ

Одним из концептуальных заключений классический радиационной генетики и цитогенетики явилось утверждение (Muller, 1954 а, б), что обязательными компонентами спектра изменений любого гена в генеративных клетках, индуцируемых ионизирующим излучением, являются два главных класса мутаций - «точковые» (внутригенные изменения) и аберрационные (делеционного и обменного типа).

Однако, природа «точковых» мутаций оставалась неизвестной в этот, домолекулярный, период радиационной генетики. В отношении хромосомных перестроек с местами разрыва в области гена также оставался невыясненным вопрос, локализован ли разрыв внутри гена или рядом, за его пределами и какова в таком случае природа мутантного фенотипа. При цитологической локализации аберрационного разрыва вне гена мутантный фенотип связывали с «эффектом положения», а предположение о наличии сразу двух независимых повреждений в виде «точковой» мутации гена и независимой хромосомной перестройки не подтверждалось линейной зависимостью индукции такого рода мутаций наблюдаемой в экспериментах (Дубинин, 1934).

Разделение радиационно-индуцированных мутаций гена на два класса «точковой» и аберрационной природы является актуальным и в настоящее время, что подтверждается более поздними работами, выполненными как на генеративных (Александров, 1987; Rüssel, 1971), так и на соматических клетках (Howard et al., 1987).

Новые молекулярные методы позволили установить достаточно широкий спектр мутационных изменений гена после действия главным образом редкоионизирующего излучения, как в генеративных, так и в соматических клетках, варьирующие от изменений на уровне отдельных

оснований ДНК до полной потери гена. При этом большинство таких данных получено на соматических клетках in vitro, модельные системы которых позволяют более легко и быстро проводить такой анализ. В этой связи вопрос возможности экстраполяции получаемых на соматических клетках данных на генеративные, в отношении которых соответствующие данные пока крайне ограничены, а их получение весьма трудоемко и длительно по времени, пока остается открытым. Более того, многие данные в отношении соматических клетках получены для экзонов, а не всего гена в целом. Важно также отметить, что имеющиеся в литературе данные о действии плотноионизирующих излучений на молекулярном уровне индивидуальных генов в соматических, а тем более в генеративных клетках остаются крайне ограниченными.

В этой связи важным и актуальным является проведение сравнительных исследований по изучению молекулярной картины радиомутабильности гена в генеративных клетках после действия на него различных по ЛПЭ видов излучений в одних и тех же условиях генетического эксперимента с целью выяснения молекулярной основы его «точковых» и аберрационных мутаций.

Знание по возможности более широкого спектра этих молекулярных изменений на ряду с фундаментальным представляет и большой практический интерес, учитывая наличие в этом спектре такого класса изменений, как замены отдельных оснований ДНК, увеличивающие однонуклеотидный полиморфизм (SNP) с его большим вкладом в генетически детерминированные соматические болезни животных и человека.

Проведение такого рода масштабных исследований в относительно короткий период времени, возможно лишь на немногих генетически хорошо изученных объектах, среди которых в первую очередь следует

рассматривать Drosophila melanogaster. В качестве гена-репортера перспективным является использование гена vestigial (vg), как наиболее близкого по размерам и организации к генам млекопитающих, и в спектре радиационно-индуцированных изменений которого регулярно наблюдаются мутации обоих классов, частота индукции которых линейно зависит от дозы редко- и плотноионизирующего излучения (Александров и др., 2001).

Цели и задачи работы

Целью работы является сравнительное изучение природы молекулярных изменений крупного гена vestigial Drosophila melanogaster у мутантов «точковой» и аберрационной природы, индуцированных разными дозами у-квантов 60Со, моноэнергетических нейтронов (Еср=0,85МэВ) и их комбинированного воздействия, с оценкой спектра этих изменений и их распределения по карте гена.

Для достижение вышеназванной целей в работе были поставлены следующие задачи:

1. Систематизировать генетическую коллекцию спонтанных и радиационных мутантов по гену vg по таким параметрам, как «точковая» и аберрационная природа, вид излучения и доза.

2. Провести молекулярный анализ структуры гена vg методом ПЦР у спонтанных, у-, нейтрон- и нейтроны+у-индуцированных мутантов «точковой» и аберрационной природы.

3. Сравнить выявленные молекулярные изменения у «точковых» и аберрационных мутантов гена vg, оценить зависимость этих изменений от вида и дозы излучения и определить характер распределения молекулярных изменений на карте гена.

4. Изучить на молекулярном уровне генетические эффекты комбинированного действия нейтронов и у-излучения по сравнению с эффектами этих видов радиации в отдельности.

5. Провести гетеродуплексный анализ и секвенирование не выявляемых методом ПЦР изменений ДНК 3-го и 4-го экзонов гена у «точковых» и аберрационных мутантов vg спонтанного и радиационного происхождения.

Положения, выносимые на защиту

1. Качественная картина молекулярных изменений гена, выявляемая методом ПЦР, одинакова для двух изученных видов радиации, однако в индукции частичных делеций гена нейтроны более эффективны, чем у-излучение.

2. Наличие кластеров повреждений на разных уровнях организации генома после действия обоих изученных видов радиации свидетельствует о гораздо более высокой степени пораженности генома клетки, чем это следует из анализа традиционных радиобиологических эффектов (генные мутации, аберрации хромосом).

3. Потери ДНК варьирующей величины, наблюдаемые в области аберрационного разрыва при обменных перестройках хромосом, ожидаемы в рамках современной теории структуры трека и моделей организации хроматина зрелых генеративных клеток.

4. Систематические замены оснований ДНК в облученном гене ведущие к повышению уровня однонуклиотидного полиморфизма (БЫР) свидетельствуют о необходимости нового подхода к оценке риска радиации, основанного на анализе БИР.

Научная новизна работы

Впервые в одинаковых условиях эксперимента на одном гене сложной организации в зародышевых клетках выявлен спектр молекулярных повреждений после действия ионизирующих излучений с разной ЛПЭ.

Впервые показана кластерность повреждающего действия радиации на генетический аппарат зародышевой клетки, проявляющаяся в

наличии нескольких независимых мутационных повреждений разной сложности как у «точковых» мутантов так и у мутантов аберрационной природы.

Впервые представлена схема механизма формирования аберраций обменного типа с делегированием последовательностей ДНК разной величины в области аберрационного разрыва.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Радиационный мутагенез отдельных генов у животных и человека

Начало изучения радиационного мутагенеза связано с зародышевыми клетками и с Drosophila melanogaster, как классическим генетическим тест-объектом. Впоследствии изучение проводили и на других объектах, таких как Neurospora crassa и Mus Musculus. Одновременно появились исследования и на культурах соматических клеток in vitro, что делает возможным сравнение мутагенеза этих двух принципиально разных типов клеток.

Классический период в изучении радиационного мутагенеза отдельных генов эукариот всецело связан с анализом мутационного процесса в генеративных клетках сначала классического генетического тест-объекта Drosophila melanogaster, а позже и других лабораторных организмов, включая Bombix mori, Neurospora crassa и Mus musculis. Если хорошее знание генетики и цитогенетики (анализ политенных хромосом) позволял детально изучать на генетическом и хромосомном уровне каждую радиационно-индуцированную мутацию данного гена-репортера, то в отношении остальных тест-организмов использовались в основном, генетически и гибридологический анализ. В совокупности полученные результаты позволили сделать концептуальное для высших эукариот обобщение (Muller, 1954 а; б), о наличии в спектре наследуемых изменений гена 2 основных классов мутаций - «точковые» (внутригенные изменения, не выявляемые цитологически) и аберрационные (цитологически видимые делеции, инверсии и транслокации).

С развитием генетики соматических клеток in vitro были созданы новые модели для изучения радиационного мутагенеза в соматических

клетках на отдельных генах-репортерах (HPRT, APRT и др.). При этом следует отметить, что изучение радиационного мутагенеза на этих клеточных тест-системах совпало со становлением и развитием молекулярной биологии и ее методов, которые стали основным подходом для анализа природы генных мутаций в соматических клетках. В этой связи классическое подразделения генных мутаций на «точковые» и аберрационные для этих тест-систем оказалось не характерным, но остается в силе для генеративных клеток.

Учитывая сказанное, ниже будут рассмотрены литературные данные по радиационному мутагенезу для генеративных и соматических клеток в отдельности.

1.1.1. Радиационный мутагенез в генеративных клетках высших животных

Общие радиобиологические закономерности индукции генных мутаций в генеративных клетках главным образом у Drosophila, а в частности, линейная зависимость частоты индукции мутаций от дозы редкоионизирующего излучения была показана уже в ранний период радиационной генетики (Гептнер и Демидова, 1936; Глембоцкий, 1936; и др.). Эти результаты были подтверждены более поздними работами на этом же тест-объекте с разделением генных мутаций «точковой» и аберрационной природы (Ives, 1959; Alexandrov, 1984; Александров 1987) а так же на Neurospora (de Serres, 1989; 1991) и Mus musculus (Russell, 1971; Rinchik, 1987).

Работы по оценке эффективности плотноионизирующего излучения в индукции генных мутаций в генеративных клетках не многочисленны. Наиболее полный анализ индукции мутаций одновременно в нескольких генах Drosophila нейтронами разной энергии показал, что по тесту «точковые» мутации нейтроны с Еср=0,85 МэВ так же, как и у-излучение

б0Со более эффективны, чем нейтроны с Еср=0,35 МэВ. Однако, в индукции мутаций генов аберрационной природы наиболее эффективными оказались нейтроны с Еср=0,35 МэВ (Александров, 1984).

Дальнейший более детальный анализ зависимости частоты индукции мутаций «точковой» и аберрационной природы от дозы у-излучения и нейтронов (0,85 МэВ) для гена vestigial показал, что частота мутаций обоих классов линейно растет с дозой и в индукции мутантов «точковой» (без молекулярного анализа) и аберрационной природы нейтроны более эффективны, чем у-кванты б0Со (рис.1) (Александров и др., 2001).

Более высокая эффективность быстрых нейтронов в индукции генных мутаций изучаемых локусов была так же показана на Drosophila (Pastink et al., 1987) и на Bombix morí (Murakami, 1971).

Рис. 1. Зависимость доза-эффект для у- (о) и нейтрон-индуцированных (•) мутаций гена vg О. melanogaster хромосомной (а) и «точковой» (б) природы (Александров и др., 2001).

Таким образом, наличие данных об общих радиобиологических закономерностях индукции генных мутаций «точковой» и

аберрационной природы в генеративных клетках животных открывало перспективу изучения молекулярной природы мутаций этих классов и выяснения особенностей действия плотноионизирующих видов излучений по сравнению с редкоионизирующими.

1.1.1.1.Молекулярная природа радиационно-индуцированных «точковых» мутаций гена

Выяснение истинной природы «точковых» изменений гена стало возможным с развитием таких молекулярных методов, как блот-гибридизация по Саузерну, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенирование.

Ранние работы с использованием метода болт-гибридизации по Саузерну на Drosophila при анализе небольших выборок рентген- и нейтрон-индуцированных мутаций ряда не крупных генов показали, что значительная их часть обусловлена внутригенными делениями варьирующие величины, а остальные несли, по-видимому, мелкие не выявляемые этим методом изменения (Ashburner et al., 1982; Kelley et al., 1985; Coté et. al., 1986; Pastink et al., 1987, 1990; Mahmoud et al., 1991; Eeken et al., 1994). Дальнейший их анализ методом секвенирования позволил установить, что в основе таких мутантов могут лежать изменения ДНК в виде небольших делеций, инверсий и замен отдельных оснований (Pastink et al., 1988; Eeken et al., 1994). Одновременно были получены первые данные о неслучайной локализации этих повреждений в одном из районов гена (Pastink et al., 1988). Анализ большой выборки «точковых» и аберрационных мутантов по крупному гену vestigial D. melanogaster, индуцированных у-излучением и реакторными нейтронами с Еср=0,85 МэВ с использованием метода ПЦР также показал, что значительная их часть обусловлена внутригенными делециями изученного района гена (Александров и др. 2001). В другой работе, по

изучению у- и нейтрон-индуцированных «точковых» мутаций небольшого гена black полученных в этих же экспериментах, методом ПЦР было установлено, что лишь небольшая часть таких мутантов была обусловлена небольшими внутригенными делециями, тогда как большая их часть имела молекулярные изменения, не выявляемые этим методом. Анализ таких мутантов методом секвенирования выявил более сложную картину молекулярных изменений, в которой для у-индуцированных мутантов преобладали замены отдельных оснований ДНК или микроделеции из нескольких пар нуклеотид, тогда как для нейтрон-индуцированных преобладали молекулярные изменения, характерные для материнского тестер-аллеля black1, на фоне которого выделялись радиационно-индуцированные мутации black. Важно отметить, что наличие этих молекулярных маркеров аллеля Ыаск1 на месте облученного дикого аллеля Ыаск+п, свидетельствует