Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности процессов раннего остеогенеза трубчатых костей человека в различных геохимических условиях

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Особенности процессов раннего остеогенеза трубчатых костей человека в различных геохимических условиях"

На правах рукописи

Асадулаева Мадина Набиевна

ОСОБЕННОСТИ ПРОЦЕССОВ РАННЕГО ОСТЕОГЕНЕЗА ТРУБЧАТЫХ КОСТЕЙ ЧЕЛОВЕКА В РАЗЛИЧНЫХ ГЕОХИМИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з о СЕН 2015

Астрахань - 2015 00556'/^

005562693

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Астраханский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения РФ

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор,

Лазько Алексей Евгеньевич

Официальные оппоненты: Карякина Елена Викторовна,

доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ "Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии", отдел фундаментальных и клинико-экспериментальных исследований, главный научный сотрудник

Ерохин Александр Николаевич,

доктор медицинских наук, доцент, ФГБУ "Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. академика Г.А. Илизарова", научная клинико-экспериментальная лаборатория патологии осевого скелета и нейрохирургии, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова»

Защита состоится 23 октября 2015 г. в 14:00 часов на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.009.01 при ФГБОУ ВПО "Астраханский государственный университет" по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1, ауд. 101.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО "Астраханский государственный университет" по адресу: 414056, г. Астрахань, ул. Татищева, 20а и на сайте http://www.asu.edu.ru

Автореферат разослан " " 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.б.н.

Е.В.Курьянова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Глубокое понимание процессов тератогенеза и регенерации костной и хрящевой тканей человека невозможно без изучения динамики, стадий и механизмов нормального остеогенеза и его факторов на ранних стадиях пренатального развития (Привес М.Г., с соавт., 1956, 1967; Павлова В.Н., с соавт., 1974; Лазько А.Е., Росткова Е.Е., 1991; Докторов A.A. 1999; Щеплягина Л.А., Моисеева Т.А.., 2003; Денисов-Никольский Ю.И., Матвейчук И.В., 2005; Kelemen Е., et al„ 1984; Ducy Р. et al., 2000).

Для биологии и медицины значительный интерес представляет взаимосвязь между гистогенезом трубчатых костей человека и факторами остеогенеза и минерализации в них, в частности, гликозаминогликанами и липидами на тех стадиях развития, для которых наиболее вероятно начало развития процессов, приводящих к врожденной патологии трубчатых костей конечностей (Павлова М.Н., Поляков А.Н., 1971; Chan G., 1992: Slemenda С. W., 1996; Anderson Н.С., 2003).

Процессы остеогенеза и минерализации костной ткани являются весьма сложными и зависящими от многих факторов, как эндогенных, так и экзогенных. В числе последних, как весьма важных, нужно отметить минеральные компоненты окружающей среды, в частности, металлы (Авцын А.П. с соавт., 1983, 1987, 1991; Ермаков В.В., 1999; Сусликов В.Л., 1999, 2000).

На территории России имеется значительное количество районов, различающихся по содержанию металлов в воде, которую использует население в быту и на производстве. К таким районам можно отнести Поволжье и Дагестан. Не слишком отстоя друг от друга географически, они резко отличаются по содержанию металлов в воде рек. Так содержание хрома (Сг), кобальта (Со), меди (Си), селена (Se), кадмия (Cd) и сурьмы (Sb) в реках Дагестана весьма значительно и достоверно выше, чем в р.Волга (Бутаев A.M. с соавт., 2006).

Между тем, несмотря на довольно значительное число исследований, посвященных морфологии костей (Семенова Л.К., 1953, I960, 1962, 1971; Привес М.Г., 1955; Борисевич А.И., I960; Никитюк Б.А., 1968 а, б; Судзиловский Ф.В., с соавт., 1975; Подрушняк Е.П., Новохатский А.И., 1983; Криштофорова Б.В., 1984; Аврунин A.C. соавт., 2002, 2005; Шалина Т.Н., 2009; Koziebic Т., 1981; Mattei В., е.а. 1983; Kelemen Е., е.а., 1984; Archer С., 2003), работ, в которых бы учитывалось влияние различных геохимических условий на ранний остеогенез трубчатых костей человека крайне недостаточно.

Нам не встретились данные о раннем гистогенезе и минерализации, в том числе на ультраструктурном уровне, закладок трубчатых костей человека и об особенностях факторов, которые их определяют, в частности, липидов и гликозаминогликанов, в различных геохимических условиях.

Цель и задачи исследования. Учитывая вышеизложенное, целью исследования явилось выявление особенностей процессов гистогенеза и минерализации закладок трубчатых костей человека и существенно

различающихся геохимических условиях Нижнего Поволжья и Северного Кавказа.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи исследования:

1. На светооптическом и ультраструктурном уровнях провести сравнительную оценку гистогенеза закладок трубчатых костей на примере бедренной кости на ранних этапах пренатального развития человека в разных геохимических условиях проживания.

2. Изучить в сравнительном плане в различных геохимических условиях процессы минерализации в закладках бедренной кости человека при пери- и эндохондральном остеогенезе на ультраструктурном уровнях.

3. Выявить различия в локализации, содержании, спектре нейтральных липидов и фосфолипидов в закладках бедренных костей человека в процессе раннего остеогенеза в условиях г.Астрахани и г.Махачкалы.

4. Сравнить изменение содержания гликозаминогликанов и их спектр в закладках бедренных костей человека при пери- и эндохондральном остеогенезе в различных геохимических условиях.

Научная новизна исследования. Впервые было проведено комплексное сравнительное изучение развития трубчатых костей человека, процессов остеогенеза и минерализации в них на органном, тканевом, клеточном и молекулярном уровнях при существенно различающихся геохимических условиях Нижнего Поволжья и Северного Кавказа.

Выявлены факторы остеогенеза, преимущественно испытывающие на себе влияние особенностей геохимических условий сравниваемых территорий.

Теоретическая н практическая значимость. Результаты данного исследования демонстрируют процесс и механизмы адаптации трубчатой кости, как морфофункциональной системы, к возрасту и к воздействию внешней среды через изменение факторов, влияющих на остеогенез и минерализацию, что имеет значение для понимания сущности категорий гомеостаза, адаптации, развития и прогресса биологических систем.

Полученные данные о развитии трубчатых костей человека в различных геохимических условиях раскрывают тонкие процессы остеогенеза и минерализации, имеющие общебиологическое значение. Они могут быть полезны как основа для изучения аномалий опорно-двигательного аппарата, патогенеза его заболеваний и регенерации костной и хрящевой тканей. Отклонения в спектрах изученных факторов остеогенеза и минерализации можно использовать для ранней диагностики нарушений развития костносуставного аппарата. Результаты исследований основных этапов раннего остеогенеза позволят разработать рекомендации по использованию эмбриотрансплантатов при лечении ложных суставов и вяло заживающих переломов трубчатых костей.

Положения, выносимые на защиту.

1. Различия в гистогенезе закладок бедренной кости человека, обусловленные различной минерализацией окружающей среды, начинают проявляться с 9, 10 недели внутриутробного развития.

2. При наличии общей этапности процессов минерализации закладок бедренных костей человека в обеих изучаемых геохимических зонах -образование с помощью хрящевых клеток везикул матрикса, трансформация их в калькосфериты, осаждение на калькосферитах, как центрах кристаллизации, гидрооксиапатита - первый этап в зоне с повышенной минерализацией проходит интенсивнее.

3. При качественно аналогичных процессах снижения содержания нейтральных липидов и увеличения содержание фосфолипидов и расширения их спектра за счет активаторов минерализации при остеогенезе и минерализации закладок бедренных костей человека, их интенсивность выше в зоне с повышенной минерализацией.

4. Для процессов оссификации и минерализации закладок бедренных костей в норме в обеих геохимических зонах характерно снижение содержания в несульфатированных и малосульфатированных и, напротив, нарастание концентрации кислых высокосульфатированных гликозаминогликанов -хондроитинсульфатов и кератансульфата. Повышенная минерализация окружающей среды активизирует эти механизмы.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на объединеном XII Конгрессе международной ассоциации морфологов и VII Съезде Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов (Тюмень, 2014), X Международной научно-практической конференции «Prospects of world science» (Sheffield (England), 2014), Международной научной конфонференции «Современная наука: актуальные проблемы и пути их решения», (Липецк, 2014), заседаниях Махачкалинского и Астраханского отделений Всероссийских научных обществ анатомов, гистологов и эмбриологов, патологоанатомов.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 9 научных работ, в том числе 7 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для представления результатов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации. Материал диссертации изложен на 127 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и приложений. Работа иллюстрирована 31 рисунком и 3 таблицами. Библиографический список включает 280 источников, из них 152 - иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования служили бедренные кости и их закладки 47 зародышей и предплодов женского пола, полученные в результате искусственного прерывания беременности у практически здоровых женщин, и преждевременных родов, обусловленных экзогенным воздействием, из прозектур, акушерских и гинекологических клиник г. Астрахани и г.Махачкалы в осенне - зимний период. Женщины, от которых был получен материал исследования, имели сходный социальный и бытовой статус.

Возраст зародышей и предплодов и их периодизация определялись с учетом схем и данных, опубликованных в работах Г.А.Шмидта (1957; 1963; 1972), G.L.Streeter (1948, 1951), R.O'Rahilly (1979). В случае невозможности измерения зародышей и предплодов при их расчленении, определение возраста осуществлялось по записи о сроке беременности в учетной карте лечебного учреждения.

Для исследования гистогенеза закладок бедренных костей использовались окраска серий парафиновых срезов гематоксилином-эозином по Караци, полутонких эпоксидных срезов метиленовым синим в растворе тетраборнокислого натрия (Киселева А.Ф. с соавт., 1983).

Для применения метода трансмиссионной электронной микроскопии проводились: фиксация в растворе глутаральдегида по J.Karlsson, K.L.Schultz (1965), постфиксация в растворе четырехокиси осмия по G.Millonig (1961), обезвоживание в спиртах восходящей концентрации, заливка в аралдит, контрастирование ультратонких срезов на сетках насыщенным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца по E.S.Reynolds (1963), просмотр и фотографирование на трансмиссионных электронных микроскопах ЭМВ-100 ЛМ и "Tesla BS 242 Е".

Этапы минерализации в закладках бедренных костей человека на светооптическом уровне изучались с помощью реакции выявления кальция ализариновым красным по Мак-Ги - Расселу (Lillie R., 1969), а на электронномикроскопическом уровне с использованием метода, изложенного в авторском свидетельстве на изобретение № 1286931 "Способ выявления солей кальция в хряще при электронно-микроскопическом исследовании" авторов А.Е.Лазько и Р.И.Асфандиярова. Целью изобретения являлось выявление водорастворимых соединений кальция в минерализующемся хряще путем фиксации раствором четырехокиси осмия в смеси органических растворителей и последующей дегидратации в смеси данных растворителей с изменяющимся соотношением ингредиентов.

Гистохимически липиды в закладках бедренных костей изучали на криостатных срезах с использованием следующих реакций: 1. окраска нейтральных липидов Суданом III и IV по Кею и Уайтхеду, 2. окраска фосфолипидов жженым Суданом черным В по Беренбауму (Pearse Е., 1962).

Для контроля специфичности реакций и идентификации липидов и фосфолипидов применялись экстракционные методы по Кейлиг и Бекер (Pearse Е., 1962).

Для исключения возможного маскирующего эффекта окрашивания полисахаридов на выявление липидов, контрольные препараты подвергались обработке тестикулярной гиалуронидазой (0,3 мг/мл) в 0,1М растворе хлорида натрия в смеси с равным количеством 0,1 М ацетат-уксусного буфера (рН=4,9).

Материал для электронномикроскопического исследования липидов обрабатывали и заливали в эпон по ускоренному методу, обеспечивающему сохранность данных веществ (Stein О., Stein Y.,1967).

Спектр липидов и фосфолипидов закладок бедренных костей человека исследовался методом тонкослойной хроматографии, для чего и 5 исследуемого материала были получены липидные экстракты по методу Фольча, изложенному в руководстве А.А.Покровского (1969). Разделение общих липидов и фосфолипидов на фракции проводили на пластинках "Silufol" с слоем силикагеля фирмы "Kavalier" (Чехия). Для проявления общих липидов использовалась система растворителей гексан-эфир-ледяная уксусная кислота, а для выявления спектра фосфолипидов - хлороформ-метанол-вода (Stahl Е., 1965). Контроль и идентификация фракций производились по параллельным (выполненным на одной и той же пластинке) хроматограммам липидов сывороток крови женщин, имеющих такой же срок беременности, как и женщины, от которых был получен материал.

С целью выявления сульфатированных гликозаминогликанов, парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм обрабатывались 0,5% раствором коричневого основного по способу М.Г.Шубича (1961).

Для дифференцированного определения хондроитинсульфата и кератансульфата применяли окраску 0,1% раствором альцианового синего на ацетатном буфере (рН=5,8) с использованием метода критической концентрации электролита (Лопунова Ж.К., с соавт., 1969; Шубич М.Г. Лспунова Ж.К., 1973). В качестве неорганического электролита применяли магния хлорид - 0,9 М хлорид магния в 0,1% растворе альцианового синего для окраски на кератансульфат и раствор красителя с 0,4 М хлорида магния для суммарной гистохимической реакции на хондроитинсульфат и кератансульфат (Копьева Т.Н., с соавт., 1983).

Разделение исследуемых гликозаминогликанов по степени кислотности, в значительной степени зависящей от количества сульфогрупп, достигалось применением окраски 0,5% раствором толуидинового синего при различных кислых значениях pH мединал-ацетатного буфера, применяемого в качестве растворителя краски. При рН=2,62 выявлялись кислые высокосульфатированные гликозаминогликаны, а при рН=6,12 - менее кислые, низкосульфатированные вещества этой группы (Pearse Е., 1962).

Содержание гликозаминогликанов в закладках бедренных костей оценивали визуально под световым микроскопом в баллах (или по системе плюсов) (Шаповалов Ю.Н., 1962).

Для электронномикроскопического исследования локализации гликозаминогликанов ультратонкие срезы контрастировали на сетках 0,5% раствором нитрата висмута по A.Serafini-Fracassini, J.W.Smith (1966).

Количество хондроцитов в единице объема хрящевых закладок бедренных костей человека в процессе раннего остеогенеза вычислялось по формуле (1) (Автандилов Г.Г., 1973):

,, N,„

"= 7Г (мм-3) (1)

где: - количество хондроцитов, содержащихся в единице объема

N .

ткани; « - количество срезов хондроцитов, подсчитанное в единице площади

случайного гистологического среза; D* - средний диаметр хондроцитов в изучаемом срезе.

На ультраструктурном уровне определялось ядерно-плазматическое отношение по формуле (2) и вычислялась частота встречаемости конкретного его значения (h) в исследуемой возрастной группе:

NI Р = — (2)

где: S„ - площадь сечения ядра хондроцита, Sp - площадь сечения его цитоплазмы, измеренные на электронограмме.

В период раннего остеогенеза в различных отделах закладок бедренных костей была определена абсолютная удельная поверхность мембран эндоплазматической сети хондроцитов, т.е. количество квадратных микрометров поверхности мембран эндоплазматической сети, содержащихся в одном кубическом микрометре его цитоплазмы (Автандилов Г.Г., 1973; Автандилов.Г.Г., с соавт., 1981).

На электронограммах подсчитывалось количество отпочковывающихся от наружной поверхности хондроцитов везикул матрикса (Borg Т.К., et. а!., 1981) в разных зонах и стадиях развития хрящевой закладки.

Количественные данные, полученные в ходе выполнения исследования, проанализированы методами вариационной статистики и определения достоверности различий с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. При проведении статистической обработки использовалась утилита OpenOffice Cale из свободно распространяемого программного продукта OpenOffice (Ver. 3.0), работающая под управлением операционной системы Windows ХР Home Edition (сертификат OEM XI2-53766).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенное исследование позволило выявить, что на ранних стадиях хондрогенеза (6-8 недель внутриутробного развития) хондроциты закладок бедренных костей человека и в г.Астрахани и в г.Махачкале представляют собой гомогенную группу. Это подтверждается нормальным законом распределения цитометрических признаков, который хорошо соответствует опытным вариационным кривым. Данные признаки характеризуют хондроциты

ранних стадий остеогенеза как малодифференцированные клетки с большой генеративной способностью.

Количество клеточных элементов в единице объема метафизарных отделов закладок 6 - 8 недель внутриутробного развития довольно велико, они плотно прилегают друг к другу из-за малого количества межклеточного вещества.

В хрящевых закладках бедренных костей человека в изучаемых геохимических регионах, начиная с 9 недели внутриутробного развития, наблюдается неоднородность клеточного состава. Хондроциты I типа (рис.1) характеризуются крупным ядром, значительным развитием шероховатой эндоплазматической сети, наблюдается наличие в многочисленных вакуолях, образованных эргастоплазмой, электронноплотного, осмиофильного содержимого.

У хондроцитов II типа (рис.2) ядро более мелкое, что подтверждается постоянным преобладанием по величине ядерно-плазматического отношения у хондроцитов I типа. Эндоплазматическая сеть развита слабее. Показатель абсолютной удельной поверхности её мембран также свидетельствует об этом, постоянно уступая в хондроцитах II типа аналогичному показателю хрящевых клеток I типа. В цитоплазме хондроцитов II типа имеются крупные вакуоли с малоконтрастным веществом в виде тонких и коротких филамент и хлопьев.

Рис.1. Электронограмма Рис.2.Электронограмма хондроцитов

хондроцита I типа в проксимальном II типа в проксимальном эпифизе

эпифизе закладки бедренной кости закладки бедренной кости предплода

предплода человека 9 недель человека 9 недель внутриутробного

внутриутробного развития развития (г.Махачкала). Ув. х!8000.

(г.Астрахань). Ув.х1Н000.

Необходимо отметить, что моды цитологических параметров, а именно, ядерно-цитоплазматического отношения и абсолютной удельной поверхности мембран эндоплазматической сети для хондроцитов и I и II типов на изучаемых этапах пренатального онтогенеза в г.Махачкале статистически достоверно смещены в сторону больших значений по сравнению с г.Астраханью.

С развертыванием процессов остеогенеза в хондроцитах и I и II типов достоверно уменьшается ядерно-цитоплазматическое отношение, и достоверно повышается абсолютная удельная поверхность мембран эндоплазматической сети, отражающая усиление способности к синтезу составных частей межклеточного вещества хряща и остеоида.

Также в процессе остеогенеза в закладках бедренных костей в результате синтеза межклеточного вещества и гипертрофии хондроцитов плотность упаковки их, выражаемая числом клеток в единице объема, падает.

Хондроциты закладок бедренных костей человека на различных этапах развития несут на своей поверхности неодинаковое количество везикул матрикса, которые представляют собой осмиофильные электроноплотные глобулярные структуры диаметром 0,1 - 0,3 мкм, окруженные мембраной. Везикулы матрикса могут быть связаны с клеточной поверхностью хондроцитов и остеобластов на их теле или отростках, располагаться в межклеточном пространстве хряща и остеоида в соседстве с волокнами коллагена.

На всех изучаемых стадиях пренатального развития и в г.Астрахани и в г.Махачкале наименьшее число этих структур ассоциировано с хондроцитами зоны пролиферации, а наибольшее - с хрящевыми клетками зоны дегенерации. Выявлено резкое статистически высокодостоверное увеличение числа везикул матрикса в зоне гипертрофии по сравнению с зоной роста. Обращает на себя внимание более интенсивное, статистически достоверное (Р<0,05) увеличение числа везикул матрикса в зоне роста закладок бедренных костей в г.Махачкале по сравнению с г.Астраханью на всех изучаемых этапах пренатального онтогенеза. Этот факт сочетается с общим большим количеством везикул матрикса в первом геохимическом регионе, которое было отмечено в нашем исследовании, и наводит на мысль о более интенсивных процессах ранней минерализации в г.Махачкале.

Как показали электронногистохимические исследования, везикулы матрикса ассоциированные с хондроцитами и остеобластами, а так же свободно располагающиеся в межклеточном пространстве хряща и остеоида, имеют в своем составе кислые гликозаминогликаны, локализующиеся на наружных поверхностях везикул, что отчетливо видно в случае контрастирования азотнокислым висмутом (рис. 3).

Морфологическим выражением следующего этапа минерализации закладок бедренных костей человека в изучаемых геохимических регионах являются кристаллоидные образования или калькосфериты. По нашим данным это сфероидальные структуры диаметром 0,6 - 1,6 мкм, состоящие из высоколабильного в водной среде аморфного кальций-фосфата, что объясняет невозможность их визуализации в случае обычной подготовки препаратов для трансмиссионной электронной микроскопии.

Безводная методика обработки материала позволяет выявить тонкую структуру калькосферитов, представляющую собой игло- и лентообразные кристаллиты, радиально отходящие от одного или, чаще, нескольких (до 5) центров кристаллизации, которые размерами и повышенной электронной плотностью походят на везикулы матрикса (рис. 4).

Рис.3. Электронограмма хондроцита из метафизарного отдела закладки бедренной кости предплода человека 10 недель пренатального развития. Интенсивно контрастируются

везикулы матрикса. Электронно-гистохимическая реакция с азотнокислым висмутом (г.Махачкала).

Рис.4.Электронограмма кристалл-лоидной структуры (калькосферита) из метафизарного отдела закладки бедренной кости предплода человека 9 недель пренатального развития из г.Астрахани. Видна сложная структура калькосферита, имеющего 3 ядра кристаллизадии.

Ув.х22000.

Ув.х35000.

В ходе развертывания процессов минерализации хряща и остеоида в закладках бедренных костей человека происходит рост кристаллов калькосферитов, являющихся в данном случае центрами кристаллизации. Кристаллы приобретают форму коротких игл, что свидетельствует о переходе аморфного, лабильного кальций-фосфата в кристаллический гидрооксиапатит, и фиксируются на активных участках фибрилл коллагена-оссеина

Предпосылкой к эндохондральному остеогенезу в закладках бедренных костей человека является минерализация межклеточного вещества хряща диафизарного отдела их закладок. Новообразованные балки костной ткани минерализуются по вышеизложенному механизму и быстро накапливают соли кальция.

На ранних стадиях остеогенеза (6 — 8 недель внутриутробного развития) в закладках бедренных костей и в г.Астрахани и в г.Махачкале большинство хондроцитов эпифизарного отдела и гиалиновой зоны метаэпифизарного хряща содержат неравномерно распределенные в цитоплазме 3-5 небольших липидных капелек. Они варьируют по величине, имеют овальную или округлую форму и четкие очертания.

В зоне метаэпифизарного хряща число хондроцитов, содержащих липиды, уменьшается, а в диафизарном отделе закладок бедренных костей на данной стадии развития встречается еще меньше хрящевых клеток с липидными включениями.

На стадиях 9, 10 недель внутриутробного развития липиды выявлялись в хондроцитах метаэпифизарного хряща закладок бедренных костей человека в

обеих изучаемых геохимических зонах большей частью в виде 4-6 крупных округлых капель и изредка обнаруживались в межклеточном веществе. Наблюдалось отпочковывание осмиофильных тел, очень сходных с везикулами матрикса, от хондроцитов, особенно находящихся в зоне гипертрофии метаэпифизарного хряща, и выход данных тел в межклеточное пространство (рис. 5).

Фосфолипиды давали положительную реакцию в зонах гипертрофии, дегенерации и минерализации метаэпифизарного хряща закладок бедренных костей на этих этапах пренатального развития человека.

На хроматограммах общих липидов экстрактов закладок бедренных костей предплодов человека 9-10 недель пренатального развития (рис.6) неэстерифицированных жирных кислот (НЭЖК) у предплодов из г.Астрахани содержится несколько больше по сравнению с г.Махачкалой.

Напротив, можно отметить заметно большее количество свободного холестерина и фосфолипидов в закладках бедренных костей из г.Махачкалы, что может свидетельствовать в пользу предположения о более значительной активности процессов оссификации и минерализации в данном геохимическом регионе.

» * .,:/

шт

ШШ

т

В

Эфиры холестерина

Триглицериды

в в НЭЖК

Диглицериды

Моноглицериды

т т В Свободный холестерин

• ф в Фосфолипиды

А м

Рис.5.Электронограмма хондроцита зоны гипертрофии метаэпифизарного хряща закладки бедренной кости предплода человека 9 недель из г.Астрахани.

Видны отпочковывающиеся от хондроцита осмиофильные везикулы матрикса. Обработка препарата по Стайну - Стайну. Ув. х14000.

Рис. 6. Хроматограммы липидов закладок бедренных костей предплодов человека 9, 10 недель пренатального развития из г.Астрахани (А) и г.Махачкалы (М). С - хроматограмма сыворотки крови женщины аналогичного срока беременности в качестве контроля.

При сравнительном изучении хроматограмм фосфолипидов закладок бедренных костей предплодов человека 9, 10 недель пренатального развития как между различными геохимическими регионами, так и по отношению с предыдущими этапами онтогенеза (6-8 недель пренатального развития) обращает на себя внимание появление в закладках из г.Махачкалы заметных количеств фосфатидилсерина - мощного модулятора кальцификации.

В закладках бедренных костей из г.Махачкалы по отношению к г.Астрахани заметно больше и такого промоутера минерализации, как фосфатидилэтаноламин.

Хроматограммы липидов закладок бедренных костей человека в обеих геохимических зонах на 11, 12 неделях внутриутробного развития (рис.24) демонстрируют уменьшение содержания и обеднение спектра триглицеридов — выявляются только самые "быстрые" фракции, практически сливающиеся с НЭЖК. По прежнему отсутствуют моно- и диглицериды, а содержание эфиров холестерина, НЭЖК и свободного холестерина снижено и мало различается в закладках из г.Астрахани и г.Махачкапы.

На хроматограммах фосфолипидов закладок бедренных костей предплодов 11, 12 недель пренатального развития из г.Астрахани только теперь начинает выявляться незначительное количество фосфатидилсерина. Общая концентрация фосфолипидов, выражающаяся через интенсивность окраски хроматограмм, заметно выше в закладках бедренных костей из г.Махачкалы. Особенно это показательно для сфингомиелина и фосфатидилсерина -фосфолипидов интенсифицирующих остеогенез и минерализацию кости.

На всех рассматриваемых стадиях остеогенеза, а именно, на 6 - 8, 9, 10 и II, 12 неделях внутриутробного развития, наиболее интенсивный синтез гликозаминогликанов и протеогликанов происходит в хондроцитах зоны роста метаэпифизарного хряща закладок бедренных костей в их хорошо развитых эндоплазматической сети и комплексе Гольджи. В межклеточном веществе и на наружной поверхности цитолеммы хондроцитов этой зоны и зоны пролиферации обнаруживается лишь небольшое количество протеогликанов в виде гранул матрикса небольшого размера, в среднем 8,0 ± 1,1 нм (рис. 7).

Показательна окраска на кератансульфат в закладках из г.Махачкалы, так как при гистохимической реакции с красящим раствором, содержащем 0,9 М хлористого магния, она идет на 1 - 2 балла (окрашивание от бледно-голубого до голубого, +, ++) в межтерриториальном матриксе хряща зоны гипертрофии. Закладки бедренных костей аналогичного возраста при той же гистохимической реакции дают окрашивание практически всегда на 1 балл.

Локализация и выраженность гистохимических реакций позволяют заключить, что в зоне роста и гипертрофии костных закладок 9, 10 недель нарастает количество кислых гликозаминогликанов, представленных, в основном, хондроитинсульфатами со средней степенью сульфатированности. На данных стадиях онтогенеза количество кератансульфата увеличивается в межтерриториальном матриксе зоны гипертрофии хрящевых закладок, особенно в г.Махачкале.

С большой долей вероятности можно предположить, что в зоне дегенерации хондроцитов метаэпифизарного хряща закладок бедренных костей человека на стадиях 9, 10 недель внутриутробного развития присутствует уже заметное количество кислых сульфатированных гликозаминогликанов. Они представлены высокосульфатированными формами хондроитинсульфатов и кератансульфата, которые располагаются в территориальном и межтерриториальном матриксе хряща этой зоны, причем создается впечатление

о повышенном содержании этих веществ в закладках бедренных костей из г.Махачкалы.

Суммарная реакция с альциановым синим даёт ярко-голубую окраску эпифизарного хряща костных закладок на 3 балла (+++), а дифференциальная реакция на кератансульфат - голубую (2 балла, ++), особенно выраженную в центральной части эпифиза в межтерриториальном и частично в территориальном межклеточном матриксе хряща закладок из г.Махачкалы (рис. 8).

¿г ¿¿У-^у • ■.'л: •

Рис.7. Интенсивное контрастирование мембран эндоплазматической сети и комплекса Гольджи на электроно-грамме хондрог/ита зоны роста метаэпифизарного хряща закладки бедренной кости предплода человека 9 недель из г.Махачкалы. Обработка препарата по Смиту-Серафини-Фракассини. Ув.хЮООО.

Рис. 8. Дифференциальная реакция с альциановым синим на кератансульфат в эпифизарном отделе закладки бедренной кости предплода человека 11 недель пренатального развития из г.Махачкалы. Окраска по Шубичу -Лопуновой. Об. 10, ок. 10.

Таким образом, на стадиях 11, 12 недель внутриутробного развития в эпифизарных частях закладок бедренных костей человека и в гиалиновой зоне метаэпифизарного хряща этих закладок наряду с заметным содержанием полисахаридов с небольшим количеством сульфогрупп, представлены кислые сульфатированные соединения этого класса, в частности, хондроитинсульфаты. Кератансульфат, что особенно выражено в закладках из г.Махачкалы, локализуется в центральной части эпифиза, в большинстве своем в межтерриториальном матриксе и, незначительно, в территориальном.

Остеогенез является важнейшим формообразующим процессом для кости как органа. Естественно, что интенсивные процессы остеогенеза не могут быть вне сферы внимания при изучении процессов органогенеза кости на этапах пренатального развития. Как нам представляется, к главным звеньям остеогенеза относятся гистогенез, минерализация, углеводный, и липидный обмены веществ в костной ткани. Эти составные части остеогенеза, как показал анализ литературы, недостаточно изучены у человека вообще, а в случае экзогенного влияния на них, тем более.

Изменения в любом из этих звеньев, вызванные, например, особенностями микроэлементного окружения, может вести к трансформациям органогенеза кости, тонкие механизмы которых во всех чертах в настоящее время неизвестны.

В работе было выявлено, что, если на ранних стадиях хондрогенеза (6-8 недель пренатального развития) хондроциты закладок бедренных костей человека и в г.Астрахани и в г.Махачкале представляют собой гомогенную группу клеток, то на более поздних стадиях (9 - 10 и 11 - 12 недель внутриутробного развития) налицо неоднородность клеточного состава хрящевых закладок в обеих геохимических зонах.

Хондроциты можно разделить по признаку преимущественного синтеза ими или белкового (хондроциты I типа) или углеводного компонента матрикса хряща (хондроциты И типа) на две примерно равные по численности группы, что хорошо согласуется с данными исследований П.М.Мажуги и В.В.Черкасова (1974), которое было проведено ими, однако, на суставном хряще молодых крыс.

С развертыванием процессов остеогенеза цитоморфометрические показатели свидетельствуют о снижении репродукционной способности хондроцитов и об их дифференцировке и специализации. Об этом, в частности, говорит прогрессирующее уменьшение количества хондроцитов в единице объема метафизов закладок бедренных костей человека на всех рассматриваемых этапах пренатального онтогенеза.

Следует отметить статистически достоверное превышение количества хондроцитов в метафизарных отделах закладок бедренных костей в г.Махачкале по сравнению с г.Астраханью на всех рассматриваемых периодах раннего остеогенеза человека, что, возможно, свидетельствует о повышенной генерационной способности хондробластов в геохимической зоне с высокой минерализацией.

На стадиях 6-8 недель пренатального развития ядерно-цитоплазматическое отношение и абсолютная удельная поверхность мембран эндоплазматической сети, отражающая плотность их упаковки в клетке, в хондроцитах диафизарного отдела закладок в обоих изучаемых геохимических районах статистически не различаются.

Исследование цитометрических показателей - ядерно-цитоплазматического отношения и площади абсолютной удельной поверхности мембран эндоплазматической сети - также свидетельствует о неоднородности популяции хондроцитов закладок бедренных костей человека на стадиях пренатального развития 9 - 10и 11 - 12 недель.

Примечательно статистически достоверное превалирование моды ядерно-цитоплазматического отношения у хондроцитов II типа г.Махачкалы над таким же параметром аналогичных хрящевых клеток из г.Астрахани на стадии 9-10 недель пренатального развития. Это может свидетельствовать в пользу предположения о большей интенсивности процессов синтеза углеводного компонента матрикса хряща в клетках из геохимической зоны с большей минерализацией.

На стадии 9-10 недель намечается "сдвиг вправо" кривых варьирования ядерно-цитоплазматического отношения и абсолютной удельной поверхности мембран эндоплазматической сети хондроцитов эпифизарных отделов закладок бедренной кости из г.Махачкалы по отношению к г.Астрахани. Это может служить подтверждением предположения о начинающейся интенсификации синтеза и белкового и минерального компонентов хрящевого матрикса в зоне с большей минерализацией окружающей среды.

На следующих этапах внутриутробной оссификации закладок бедренных костей (11 - 12 недель) процесс интенсификации синтеза компонентов матрикса в геохимической зоне с высокой минерализацией продолжает развиваться, о чем свидетельствует увеличение вышеописанного "сдвига вправо".

Этапы минерализации, выявляемые с помощью морфологических методик, в минерализующемся хряще диафизарного отдела закладок бедренных костей и в остеоиде при пери- и эндохондральном остеогенезе в обеих изучаемых геохимических зонах принципиально сходны. Процессы, приводящие к насыщению минеральными солями, начинаются с образования везикул матрикса, проходят стадию калькосферитов, как конгломератов везикул матрикса, эпитаксиального роста кристаллов гидрооксиапатита из калькосферитов и фазовых превращений, приводящих к переходу аморфного, лабильного кальций-фосфата в стабильный кристаллический гидрооксиапатит.

Обращает на себя внимание тенденция превышения количества везикул матрикса в закладках бедренных костей из г.Махачкалы, что может служить косвенным признаком более интенсивных процессов минерализации в данном геохимическом регионе.

Различие в процессах отложения минерального компонента в минерализующемся хряще и остеоиде заключается, по нашему мнению, в том, что в минерализации хряща, происходящей в анаэробных условиях, наиболее деятельную роль играют калькосфериты, лежащие свободно в перицеллюлярной области, тогда как минерализацию остеоида, происходящую в аэробных условиях, в большей степени обеспечивают калькосфериты, ассоциированные с волокнами коллагена. Повышенное содержание кислорода, возможно, создает предпосылки к образованию на коллагене активных участков, к которым и прикрепляются калькосфериты.

Из проведенного исследования локализации, качественного и количественного состава липидов на ранних стадиях пренатального остеогенеза (от б до 12 недель внутриутробного развития) следует, во-первых, что вещества этой группы присутствуют во всех отделах закладок бедренных костей этого периода, и, во-вторых, количественное содержание липидов и их качественный состав определенным образом изменяются в зависимости от локализации в закладке и стадии остеогенеза.

С помощью гистохимических реакций на нейтральные липиды наблюдалось уменьшение содержания выявляемых веществ данной группы при последовательном рассмотрении зон метаэпифизарного хряща закладок бедренных костей от гиалиновой зоны до зоны гипертрофии (в закладках костей зародышей и предплодов человека 6-8 недель) или зоны минерализации (в

закладках бедренных костей предплодов 9, 10 и 11, 12 недель пренатального развития) в обеих изучаемых геохимических зонах.

Соответствие увеличения содержания фосфолипидов интенсификации процессов оссификации и минерализации видно из того, что степень выраженности гистохимических реакций значительно усиливается в зоне минерализации, особенно в закладках бедренных костей предплодов 11, 12 недель внутриутробного развития.

Данные полуколичественного метода тонкослойной хроматографии подтверждают и дополняют сведения гистохимии липидов закладок бедренных костей человека.

На хроматограммах общих липидов всех изученных стадий остеогенеза отсутствуют моно- и диглицериды, присутствующие в контрольных параллельных хроматограммах липидов сыворотки крови женщин, имеющих аналогичный срок беременности.

За исключением фосфолипидов, общее содержание липидов, выявляемых методом тонкослойной хроматографии, по мере созревания хряща и замещения его костной тканью, а также дальнейшей её минерализации, прогрессивно снижается в обеих геохимических регионах, что хорошо согласуется с данными гистохимических исследований.

Интересен тот факт, что развертывание процессов оссификации и минерализации в закладках бедренных костей человека сопровождается прогрессирующим снижением содержания фракций свободного холестерина и его эфиров в обеих геохимических зонах. Это свидетельствует в пользу того предположения, что данные нейтральные липиды играют важную роль лишь в начальных стадиях процессов минерализации, так как они являются необходимейшей составной частью биологических мембран везикул матрикса, образование которых нами зафиксировано на электронограммах

Содержание фосфолипидов в закладках бедренных костей человека на рассматриваемом этапе развития (от 6 до 12 недель) с возрастом увеличивается в обеих геохимических зонах. Однако возрастание концентрации отдельных представителей этой группы липидов происходит не одинаково.

С началом интенсивных процессов оссификации и минерализации (9-10 недель пренатального развития) в закладках бедренных костей из зоны с повышенной минерализацией впервые начинает определяться фракция фосфатидилсерина и значительно усиливается фракция фосфатидилэтаноламина - мощных индукторов минерализации. Подобный эффект мы связываем с присутствием в окружающей среде Кавказа повышенных по отношению к остальной территории России количеств микроэлементов, в частности, меди и селена.

Медь, как известно, обладает свойством усиливать синтез фосфолипидов, к которым относятся фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин (Кейне Р.Д., 1982), с одной стороны, а с другой, препятствует их разрушению, блокируя процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Новиков В.Е., Катунина Н.П., 2002; Fields M.L. et al., 1998). Подобным действием обладает и селен, ещё более

активный ингибитор ПОЛ (Минина Л.А. с соавт., 2008; Шахов А.Г. с соавт., 2005; Родионова Т.Н. с соавт., 2010).

С развертыванием процессов остеогенеза на 11, 12 неделях пренатального развития человека и переходом минерализации к более поздним стадиям образования калькосферитов и эпитаксиального роста кристаллов гидрооксиапатита содержание нейтральных липидов в закладках бедренных костей в обеих геохимичесих зонах снижается.

Иной характер имеет качественная и количественная динамика фосфолипидов, общее количество которых заметно больше в закладках из г.Махачкалы и это особенно характерно для сфингомиелина и фосфатидилсерина - промоутеров остеогенеза и минерализации.

И только лишь на этой стадии остеогенеза фосфатидилсерин начинает определяться в закладках из г.Астрахани.

Таким образом, можно с достаточной степенью вероятности предположить значительную роль веществ липидной природы в процессах оссификации и минерализации закладок бедренных костей человека. Совместно с другими факторами костеобразования, такими, например, как гликозаминогликаны, они присутствуют в связывающей кальций субстанции минерализующегося хряща и остеоида.

Особое место, по нашему мнению, занимают в процессе кальцификации свободный холестерин и его эфиры из группы нейтральных липидов и фосфатидилсерин - кислый фосфолипид.

Два первых вещества - необходимый компонент везикул матрикса, которым они помогают обеспечивать начальный этап минерализации, входя в состав мембран везикул, тем самым защищая и организуя их ферментные системы.

Фосфатидилсерин, имея высокую аффинность к кальцию и активно связывая его, делает возможным накопление кальций - фосфата и дальнейший эпитаксиальный рост кристаллов гидрооксиапатита на последующих стадиях минерализации.

Проведенное исследование показало, что процессы оссификации и минерализации в закладках бедренных костей человека на ранних стадиях пренатального онтогенеза (6-12 недель внутриутробного развития) связаны со значительными изменениями в синтезе, качественном составе и динамике накопления гликозаминогликанов и протеогликанов.

Было выявлено, что, если исследовать продукцию гликозаминогликанов хондроцитами хрящевых закладок бедренных костей начиная с зоны роста метаэпифизарного хряща и заканчивая зоной гипертрофии, то можно отметить значительные изменения в характере биосинтеза и накопления этих веществ.

Наиболее активный внутриклеточный синтез гликозаминогликанов наблюдается в хондроцитах зоны роста метаэпифизарного хряща. Секреторные вакуоли от комплекса Гольджи мигрируют к цитолемме, нагруженные молекулами протеогликанов, для экзоцитоза.

Если мы будем двигаться к зоне гипертрофии, то увидим, как синтез протеогликанов в хондроцитах постепенно затухает, но зато возрастает

количество этих веществ, аккумулированное хрящевыми клетками на наружной поверхности своей цитолеммы и локализующееся в межклеточном пространстве.

Гликозаминогликаны, зафиксированные на поверхности цитолеммы хондроцитов, возможно, предназначены для формирования полноценных везикул матрикса, так как нами четко определено наличие этих полисахаридов в составе данных образований.

Принимая во внимание высокую аффинность ионов кальция к молекулам гликозаминогликанов, заслуживает внимания предположение, что эти вещества в мембране везикул матрикса играют роль первичных аккумуляторов кальция, необходимых для образования ядер кристаллизации. Не подлежит сомнению, что эту функцию гликозаминогликаны могут полноценно выполнять только в содружестве с другими факторами минерализации, в частности, с липидами и фосфолипидами.

Как показало гистохимическое исследование с применением характерных топооптических реакций на протеогликаны и ферментного контроля, в процессе развития закладок бедренных костей человека на стадиях от 6 до 12 недель пренатального развития в гиалиновой зоне, зонах пролиферации, роста и гипертрофии метаэпифизарного хряща наблюдается отчетливое уменьшение более нейтральных низкосульфатированных гликозаминогликанов с одновременным увеличением содержания веществ этой группы, проявляющих кислотный характер - хондроитинсульфатов и кератансульфата, что хорошо согласуется с данными В.С.Песчанского (1970).

Данный процесс более активен в закладках из зоны с повышенной минерализацией окружающей среды.

Отмечается также тенденция к увеличению степени сульфатированности гликозаминогликанов закладок бедренных костей по мере развития зародыша и предплода человека. Интересен более быстрый росг содержания кератансульфата, что также в большей степени характерно для г.Махачкалы, -наиболее сульфатированного представителя данной группы полисахаридов, который, по мнению В.О.Песчанского (1973), играет значительную роль в созревании оссифицирующегося хряща и подготовке его к минерализации.

С началом замещения хряща костной тканью, количество гликозаминогликанов, особенно кислых, в зонах минерализации и резорбции хрящевых закладок, по данным гистохимического исследования, значительно уменьшается, что, возможно, объясняется вступлением их в химические связи, необходимые для дальнейшего хода процессов остеогенеза и минерализации.

Относительно биологической роли той динамики накопления и изменения качественного и количественного состава гликозаминогликанов в хрящевых закладках бедренных костей человека, которую мы выявили, можно сделать предположение, что гелеобразные структуры из макромолекул протеогликанов где преобладающим углеводным компонентом являются гиалуроновая кислота, как представитель несульфатированных гликозаминогликанов, или хондроитинсульфат и кератансульфат, относящихся к сульфатированным, значительно отличаются одна от другой по плотности и гидратированности.

Наименее плотен и наиболее гидратирован гель, имеющий в своем составе преимущественно гиалуроновую кислоту, а наиболее плотен и наименее гидратирован, соответственно, гель с преобладанием кератансульфата.

Таким образом, накопление в хрящевом матриксе хондроитинсульфатов и, особенно, кератансульфата не может не отразиться на функции матрикса, так как делает его все более плотным и, следовательно, затрудняет транспорт в нем. Это приводит с течением времени к ухудшению условий существования хондроцитов, обусловливает дегенерацию и разрушение их. В этом мы вполне согласны с данными работы K.Sames, R.Wobst (1980), проведенной на хряще ребра взрослого человека. Изменение качественного состава матрикса хряща закладок - замещение в нем гидрофильных гликозаминогликанов гидрофобными высокосульфатированными приводит к вытеснению из матрикса воды, гипергидратируя хондроциты.

Всё это приводит, в конце концов, к полной дегенерации хондроцитов и их разрыву. Освобождающиеся при этом силой гидростатического давления полость гипертрофированного хондроцита, и в этом мы полностью солидаризируемся с мнением П.М.Мажуги (1975, 1977), заполняется периваскулярными, эндотелиальными и клетками крови, что является жизненно важным для процесса остеогенеза.

Резюмируя вышеизложенное, с точки зрения влияния повышенного содержания микроэлементов, в частности, меди и селена, в окружающей среде на оссификацию и минерализацию закладок бедренных костей, необходимо признать активизирующее влияние этого внешнего фактора на данные процессы. Максимум этого влияния приходится на период от 9 до 10 недели пренатального развития человека. На более поздних стадиях онтогенеза воздействие повышенной минерализации на остеогенез прогрессивно уменьшается.

ВЫВОДЫ

1. На ранних стадиях пренатального онтогенеза человека (6-8 недель) гистогенез закладок бедренных костей в обеих изучаемых геохимических зонах сходен и базируется на практически неразличимых по морфологическим признакам клеточных элементах.

2. Начиная с 9 - 10 недель пренатального развития человека в закладках бедренных костей в изучаемых геохимических зонах по морфологическим и морфометрическим признакам уже можно выделить два типа хондроцитов.

3. С 9 - 10 недель внутриутробного развития хондроциты закладок бедренных костей и I и II типов в одной геохимической зоне начинают различаться по морфометрическим параметрам (ядерно-цитоплазматическое отношение и значение абсолютной удельной поверхности мембран эндоплазматической сети) от клеток аналогичных типов в другой изучаемой зоне.

4. По мере развертывания процессов остеогенеза на 9 — 12 неделе внутриутробного развития во всех типах хондроцитов в исследуемых

геохимических зонах статистически достоверно уменьшается ядерно-цитоплазматическое отношение и повышается абсолютная удельная поверхность мембран эндоплазматической сети, отражая усиление их способности к синтезу составных частей межклеточного вещества хряща. Данные процессы интенсивнее протекают в регионе с повышенной минерализацией внешней среды.

5. При минерализации хряща и остеоида в закладках бедренных костей человека в изучаемых геохимических зонах выявляется этапность процессов: образование с помощью хрящевых клеток везикул матрикса, трансформация их в калькосфериты, осаждение на калькосферитах, как центрах кристаллизации, гидрооксиапатита. Первый этап минерализации — образование везикул матрикса - статистически достоверно интенсивнее осуществляется в зоне с повышенной минерализацией окружающей среды.

6. При оссификации и минерализации закладок бедренных костей человека в них наблюдается снижение содержания нейтральных липидов. В то же время содержание фосфолипидов увеличивается, а их спектр расширяется за счет активаторов минерализации. Данные процессы опережающими темпами идут в высокоминерализованной геохимической зоне.

7. Процессу оссификации в закладках бедренных костей человека предшествует снижение содержания в них несульфатированных и малосульфатированных и, напротив, нарастание конценграции кислых высокосульфатированных гликозаминогликанов - хондроитинсульфатов и кератансульфата. Этот феномен более выражен в зоне с повышенной минерализацией окружающей среды.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты исследования могут быть использованы для разработки сбалансированных по макро- и микроэлементам рационов питания для детей и беременных женщин с учетом геохимической ситуации в регионе. Они могут быть полезны для определения рекомендаций по использованию эмбриотрансплантатов при лечении ложных суставов и вяло заживающих переломов трубчатых костей.

Данные, полученные в работе, могут быть использованы при чтении курса лекций и проведении практических занятий по морфологии, эмбриологии и биологии хряща и кости на соответствующих кафедрах вузов биологического и медицинского профиля.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. *Асадулаева М.Н. Особенности остеогенных клеток закладок трубчатых костей человека в различных геохимических условиях / М.Н.Асадулаева, А.Е.Лазько // Естественные науки. Журнал фундаментальных и прикладных исследований — Астрахань: Изд-во "Астраханский университет". - 2012. - № 2. -С.123-127.

2. *Асадулаева М.Н. Сравнительная характеристика гистогенеза закладок трубчатых костей человека в различных геохимических условиях / М.Н.Асадулаева, А.Е.Лазько // Астраханский медицинский журнал - Астрахань: Изд-во Астраханской медицинской академии. - 2012. - № 2. - С.28-30.

3. *Асадулаева М.Н. Минерализация закладок рубчатых костей человека в различных геохимических условиях / М.Н.Асадулаева, А.Е.Лазько, М.В.Лазько // Морфология (Архив анатомии, гистологии и эмбриологии) — Санкт-Петербург: Изд-во "Эскулап". - 2014. - № 3. - С. 112.

4. *Асадулаева М.Н. Спектры липидов и фосфолипидов закладок трубчатых костей в различных геохимических условиях / М.Н.Асадулаева, А.Е.Лазько, М.В.Лазько // Фундаментальные исследования - Москва: Изд-во РАЕ. - 2014. -№ 7 (часть 4). - С.658-661.

5. *Асадулаева М.Н. Хондроциты закладок бедренных костей человека в различных геохимических условиях / М.Н.Асадулаева, А.Е.Лазько // Современные проблемы науки и образования — Москва: Изд-во РАЕ. - 2014. - №

3. - URL: http://wvvw.science-education.rU/l 17-13654 (дата обращения: 24.06.2014).

6. Асадулаева М.Н. Влияние геохимических условий на качественный и количественный состав липидов и фосфолипидов в закладках трубчатых костей / М.Н.Асадулаева А.Е.Лазько, М.В.Лазько // Materials of the X International scientific and practical conférence «Prospects of world science» - Shefïield (England).

— 2014. - V.7. — P.53-55.

7. * Асадулаева М.Н. Минерализация закладок трубчатых костей человека в различных геохимических условиях / М.Н.Асадулаева, А.Е.Лазько // Фундаментальные исследования — Москва: Изд-во РАЕ. - 2014. - № 9 (часть 3).

- С. 567-570.

8. *Асадулаева М.Н. Липиды и фосфолипиды закладок трубчатых костей человека в различных геохимических условиях / М.Н.Асадулаева, А.Е.Лазько // Современные проблемы науки и образования - Москва: Изд-во РАЕ. - 2014. - №

4. - URL: http://www.science-education.ni/l 18-13898 (дата обращения: 11.07.2014).

9. Асадулаева М.Н. Пренатальный гистогенез бедренной кости человека в различных геохимических регионах /М.Н.Асадулаева, А.Е.Лазько // Труды Междунар. научн. конф. «Современная наука: актуальные проблемы и пути их решения» - Липецк: Изд-во ООО «Максимал информационные технологии». — 2014. - С.112-117.

* - статьи, опубликованные в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации

- статьи, опубликованные в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации

Подписано в печать 23.09.2015г. Бумага офсетная. Печать офсетная. Формат 60*84 1/16. Усл. печ.л - 1,5. Заказ № 117. Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии "Радуга-1"