Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эндо-1,4-бета-глюканаза термофильного штамма Sporotrichum Pulverulentum (Phanarochheta Chrisosporium) (отбор, очистка, физико-химические свойства)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Эндо-1,4-бета-глюканаза термофильного штамма Sporotrichum Pulverulentum (Phanarochheta Chrisosporium) (отбор, очистка, физико-химические свойства)"

АЯАДОИЯ Н4УК ГРУЗИНСКОЕ ССР . ИНСТИТУТ БИОХИМИИ РАСТЕНИИ

На правах рукописи

УРУШАДЗЕ Тапера Ревазовна

УДК 577.152.321

ЭНДО-1,4-р-ГЛШАНАЗА ТЕРМОФИЛЬНОГО ШТЛНМА БРОГОТМСНВИ ишшшьгмтии (РШДОАЮСНЛЕТА СШЕОБКЖИМ) : (отбор, очистка, физико-химические свойства)

03.00.04 - Скохишш

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ТБИЛИСИ 1990

Работа выполнена в Институте биохимии растений АН ГССР

Научные руководители -

академик АН ГССР Г.И. КВЕСИТАДЗЕ,, к.б.н., ст.н.с. Л.З. ГОГШШЕВИЛИ

Официальные оппоней^гы -

Ведущая оргбйизация -

доктор биологических наук В.Р.ШАТИЛОВ.

доктор биологических наук Г.Ш.ТКИШАДЗЕ Тбилисский государственный университет им. И.Двавахишвшш.

Защита диссертации состоится 14 декабря 1990г в 13 часов на заседании сйеЦйализйрованного. совета К 007.04.01 при Институте биохимии растений АН ГССР (380059, Тбилиси, Военно-ГрузинскЬя дорога, 10-ый км).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института биохимии рабШйШ АН ГССР

АМорбфврат разослан 13 ноября 1990Г

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологически йаук

Ы. БендианишвиЛИ

ОБЩАЯ ШПШ РАБОТЫ

.¿шальном* йрабмма фщшшеяуш закономер-

ностей ферМэЙМШНоГд ВДрОлШ ЦёЛЛИЛО&И» Ь*рУЙ*УрЦ Й свойств еодтвб^ёфвуищ бйоШёЛШ'Юрой. Й ЙЦ<№й. ЙХ ШбСШбёВ ШявШ вайЫ нйфШШеМ совреМэШЬЙ бйо^эхйоЛопйи

В йаЫоШеэ врейя стало oiвbшШ^ Ш ЦёММёзОДа ЯоМйлексн» привлекай ВШШанйе энзйМологоё й бйоШйвоЬ» как *Ш*ейд функцй-отаруициэ в&аиМорагулируеша йсШфэДОейШа системы, ещэ йе является ( по -зноеМу составу» ойтШШЬШй» ЙойтоМу йбжйой проблемой

тгэяттм. та тявт щюдмми тшзвш вшт цштом-

■йКеских комплексов, пУтеМ йЭМвйвВДй уеяобйй йульПВДроБений й 'состава среды, получение*» гешадшшвнерйнмя метода® траясформантов - продуцентов целлюдаз, выявлением целлюлэз с определенными свойствами, путем проведения "молекулярного скриципга" с последующим их использованием дня обогащения природных комплексов.

Основы проведения "молекулярного скрининга" разрабатываются и для микробных эндоглюканаа -первого фермента цоллюлазного комплекса. Однако, данные работы находятся в стадии разработки из-за сложности очистеи целлюлолитических ферментов и недостаточной та характеристики.

Цель и задачи исследования. Цель исследования состоялв в выявлении продуцента целлюлаз среди культур термофильных грибов, не обладающих целлобиазной активностью, но способных вести гидролиз нерастворимых субстратов.до низкомолекулярных продуктов гидролиза, в частности глюкозы, с последующим изучением физико-химических свойств энлоглюканвз.

В связи с ети предусматривалось решение следующих задач:

1. Отобрать из коллекции типовых культур термофильных микроорганизмов продуценты целлюлаг, не обладающие целлобиазной активностью и установить их способность образовывать глюкозу в повышенном количестве.

2. Разработать метод очистки эндо-1,4- р -глюканазы, изучить Зизико-химические свойства и специфичность действия по отношению к широкому спектру субстратов.

Научная новизна. Разработана • схема очистки эндоглюканаз. Установлено, ЧТО культура 5р.ри1теги1еп1;ш1 (Phanaгoahaeta о!1г1во-врог1ия-. ) продуцирует множественные формы эвдоглюканаз, различающиеся по адсорбционным свойствам, две из них (Э1 и Э2) получены в гомогенном виде. Определены молекулярные массы, изоэлектрические точки, аминокислотный состав. Для эндоглнжаназы Э1 определены Кш, константа Генри, константа ингибирования, субстратная специфичность. Установлено, что эндоглнжаназы Э1 и Э2 низкомолекулярные, кислые, слабоингибируемые ферменты, катализирующие в основном гидролиз полисахаридов с р-1,4- связями. Фермент Э1 гидролизует микрокристаллическую целлюлозу на 4в% В продуктах гидролиза от-сутствуюет целлобиоза, содержание глюкозы -3556.

Практическая значимость. Изучение молекулярных характеристик эндоглюканаз показало, что гомогенная эндоглюканаза Э1 , характе-ризирунцаяся высокой константой адсорбции на нерастворимом субстрате (МКЦ) ведет более глубокий гидролиз субстрата , чем большинство ее аналогов. Фермент может, быть использован при изучении структуры полисахаридов и строения клеточных стенок высших растений. Перспективным является применение эндоглюканаз Бр.риХ^еги-1епгшп для осахаривания целлвдозосодержащих субстратов с одновременным сбраживанием образующейся глюкозы для производства этилового спирта.

Апробация работы.- Результаты работы изложены на: Республиканской конференции по биотехнологии (Тбилиси, 1983),III симпозиуме социалистических стран по биотехнологии (Братислава, 1983), у Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии (Кобулети, 1985), Республиканской конференции молодых ученных по биохимии полимеров и биотехнологии (Тбилиси, 1985), I Всесоюзной конференции молодых ученных "Современные проблемы биохимии и физико-химической биологии" (Звенигород, 1985), III Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами"(Кобулетр,1986), Международном симпозиуме "ЗдгегМсуЬеаЬ 90" (Братислава, 19?о).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано ю работ.

Структура и объем работы . Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 рисунками, 12 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, результатов и

их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 190 наименований, из них иностранных авторов '130.'

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили культуры термофильных микро-мицетов Ch. thermophiie, A. wentii, A. versicolor, A. terreus AT-490, Sp. pulverulentunik. Sp.thermophiie, Ch. globosus полученные из коллекции типовых культур микроорганизмов Института биохимия растений АН ГССР и выделенные из них препараты целлюлаз.

Культуры микромицетов поддерживали в пробирках на сусло-агаре (7° Бялдинга), хранили при температуре 4°.

При селекции термостабильных целлюлаз термофильные микроми-цеты A. wentii, A. versicolor, A. terreus АТ-490, Ер. pulveruien-tum, Sp. thermophiie выращивали в жидкой питательной среде следующего состава (г/л): микрокристаллическая целлюлоза-10, кукурузный ЭКСТракт-1,5%, ПТМБ-4,5, NatfíyO, KH.¿?04~2, MgSü4 7НгО-С,5. Для Ch. thermophiie и ch.globosus питательная среда была следующего состава (г/л): микрокристаллическая целлюлоза-20, кукурузный экст-ракТ-1,5%, KHgPO^-6,8, (NH4)2S04-1,3, MgS04 7Н20-0,5, CaCL2-0.2. Микромицеты выращивали в колЗех Эрлекмейера емкостью- 750 мл, содержащих 150 мл питательной среды, на качалке (200 об/мин) при 40° в течение 96 ч. В качестве посевного материала использовали суспензию конидий 10-суточных культур.

С целью увеличения активности целлюлаз в глубинных условиях культивирования, проводили оптимизацию питательней среды штамма Sp. pülverulentuM на основе методов математического планирования эксперимента (Максимов, Федоров,19G9).

Для полуения технических препаратов целлюлаз культурзльну® жидкость обессоливала! и концентрировали методом тангенциальной фильтрации на полых волокнах (Киришский ОКВ-ШВ), а затем осаждали этиловым спиртом (1:4).

' Для определения восстанавливающих Сахаров был использован метод Комоди-Нельсона (somogyi, 1952). й качестве субстратов использовали: натриевую соль карбокеиметилцеллллозы (КМЦ^-степень замещения - О,Ь, степень полимеризации - '500-К20(serva, ФРГ),

фильтровальную бумагу ватман и 1 размером 1x6 см ("Whatman" Великобритания), микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ) для колоночной хроматографии ("Chemapol", Чехословакия), авицел, 1,3; 1,4~р-глюканлихенан, 1,5-а-ь-арабинан ("Koch-light laboratories", Великобритания), Д-галактан(из люпина белого Lupinue albus), соотношение галактозы, арабинозы, ксилозы, уроновых кислот-58:2:1:1; ламинарин, галактоманнан из семян люцерны Medicago sativa, аморфную целлюлозу, маннан (ВНШ1Э, г. Вильнюс).(Субстраты любезно предоставлены д.б.н. РодионовоЯ H.A. и д.б.н. Максимовым). Гидролиз полисахаридов проводили при 55° в ацетатном буфере 0,05М с pH 4,5. Время инкубации реакционной смеси с лихенином, галактаном, арабинаном, галактоманнаном, авицелом, ламинарином, маннаном 72ч, с аморфной целлюлозой -45 ч., фильтровальной бумагой - 1ч., КЩ -0,5 ч.

Эндоглгасаназную активность определяли по методу (Рабинович и др.,1977), основанному на регистрации начальной скорости уменьшения вязкости раствора КМЦ. Активность фермента выражали в микромолях гидролизируемых связей за 1 мин на 1 мг белка или 1 мл раствора фермента. Для контроля активности эвдоглшаназ, в процессе элюции был использован метод (Родионова и др., 1966), в основе которого лекит аналогичный принцип изменения вязкости субстрата КЩ.

Целлобиазную активность' -определяли по способности фермента образовывать глюкозу при действии на целлобиозу. Глюкозу определяли глюкозооксидазно-пероксидазным методом (Щербухин и др., 1971).

Термостабйльност'ь ферментов изучали, определяя по кинетической кривой термоинактивации время полуинактивации при 65° (температура пастеризации). Активность выражали в процентах от исходной а/ао 10056. Строили графа® зависимости остаточной активности от времени инкубации фермета.

За меру адсорбционной способности принимали коэффициент равновесного распределения Кр (л/г) равный отношения количества ферменте, адсорбированного единицей активности (или массы) адсорбента, к концентрации фермента в растворе в условиях линейности изотермы адсорбции Генри.

Изучение ингибирования 8ндо-1,4-р-глюкеяазы глюкозой при

гидролизе окрашенной целлюлозы ОЦ-31 (ВНИШ1Э г. Вильнюс) проводили по методу (Нуцубидзе и др., 1985).

Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда (Bradford, 1974), а также спектрофотометрически при 280 нм.

Для исследования гомогенности эндо-1,4-р-глюканаз и определения молекулярной массы проводили электрофорез белков в градиенте полиакриламидного геля (10-15%) в присутствии ДЦС-На(2,2Ж) и 2-меркаптоэтанола. при рН 8,3 по методу Лемли (baemmli, 1970). Электрофоре? проводили с использованием прибора "Phast-System" ("Pharmacia", Швеция) на "Phast"-гелях с размером 45x50x0,45 мм при силе тока 9,9 мА, 210 v, 60 auh. Гели окрашивали с помощью нитрата серебра (Hlulceshoven et. al., 1968).

.' Гомогенность фермента также определяли с помощью ультрацентрифугирования на ультрацентрифуге "Analytical Spinco model" (Beckman, США).

Молекулярную массу определяли с использованием набора низкомолекулярных метчиков ("Pharmacia", Швеция), а также методом гель-фильтрации через колонку с сефадексом G-100.

■ Аналитическое изоэлектрофокусирование проводили на приборе "Phast System" по методике фирмы. В качестве стандартов применяли "PI-standarts" этой фирмы;

Гидролиз белка и определение содержания аминокислот проводили по методу (Моога, Wtein, 1963) на аминокислотном анализаторе Био-троник LC-5001, содержание триптофана определяли спектрофото-метрически по методу (Хорлин, 1986) на жидкостном хроматографе "Du Pont Sp 8800".

Хроматографию конечных продуктов гидролиза МКЦ проводили посредством ВЭЗЮС на приборе "Corva" (Чехословакия).

Статистический анализ проводили по методу Рокицкого (Ро-кицкий, 1973).

В работе использовали носители ДЭАЭ-650 Тойеперл, СМ-650 Тойеперл, HW-55 Тойеперл-("Toyo Soda", Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.Отбор продуцента целлюлаз. Из коллекции типовых культур микроорганизмов лаборатории биотехнологии были отобраны термо-

Сильные микромидеты - продуцетнн целлвлаз: Авре^Шив 1еггбив АТ 490, А. тегв±оо1ог, А. яеп1;11, 8рого1;гз.о1шт риГтеги1ег^ит, Бр ишгторЬПе, СЬае^тЗддт «хегторЬИе, СЬ. globosuв. После культиш рования штаммов при температуре 40° на среде , содержащей целлю лозу, определялись внеклеточные активности, представленные в таС лице 1. •

Таблица 1

Внеклеточные активности целлвлаз термофильных микромицетов

штаммы : ' а к т. и в н о с т ь, ед/мл ~

" °_вндогликаназнаяпо кмд по ФЬ целлобиезна;

1.А. 1;еггеив АТ-490 4,1 18.5 0,5 0,50

2.А. тегз1оо1ог 23,5 19,7 0,8 0,59

Э.А. «епт 18,5 15,3 0,86 0.50

4.Бр. ри1уеги1еп'Ьит 10 8,7 0,4 -

5.Бр. йлгворЬПе 0,9 0,85 0,4 " 0,40

б-СК. в1оЪовив 4,2 1,0 0,3 0,20

7.сь. ОДгпорНИе 1,? 1,2.. 0,1 0.50

Как видно из таблицы, один из активных продуцентов целшалаз штам» Бр. ри1уеги1еп1шп не обладал целлобиазной активностью. Как Суде: показано несколько позже, несмотря на отсутствие целлобиазно! активности, эндоглюканаза из-этой культуры образовывала большое количество глюкозы, это и предопределило выбор культуры дл; дальнейших исследований.

Оптимизацию питательной среды проводили методом математического планирования эксперимента по плану полного (103) £ дробного факторного эксперимента, с варированиием четырех компонентов (Максимов, Федоров, 1969). Полученные результаты подтвердили оптимальность исходной среды для культуры Эр. ри1уепае^ш по способности гидрализовать как растворимый (КМЦ), так и нерастворимый субстрат («Б).

2.Изучение технических препаратов. В работе использованы технические препараты отобранных культур, полученные осаждением из культураяьной жидкости этиловым спиртом. Активности спиртоосавден-ных препаратов целлюлаз представлении в таблице 2.

Таблица

Активности пепаратов целлюлаз, полученных осавдением этиловым спиртом

ПРОДУЦЕНТ а к т и внос т ь ед/г

зндоглюканазкая по КМЦ по ФБ целлооиазная

А.'квпН! 4000 600 53 70

А. veгs^.coloг 7000 795 50 72

А. геггеив АТ-490 220 310 20,3 70

Бр. ри1уеги1еп1ит ею 1260 49,3 -

СЬ. идегторьие 53 115 7,0" 50

Для изучения термостабильных свойств внеклеточных целлюлаз отобранных культур ферментные растворы инкубировали при разных значениях температуры, в -основном 65° и выше, и по'убыли активное™ определяли наиболее термоустойчивую форму эндоглюканазы. Полученные нами экспериментальные данные показали, что культуры микромицетов способны образовывать целлюлазы, обладающие различной термостабильностью. Штамм Бр. ри1'/еги1еп1;ш1 характеризуется высокой термостабильностью при использовании субстрата КЩ, и как отмечалось выше отсутствием целлобиазной активности. Принимая во внимание, что способность гидролиза нерастворимого субстрата -микрокристаллической целлюлозы (МКЩ является критерием, определяющим возможность практического использования любого препарата целлюлаз, нами был изучен процесс накопления глюкозы при действии препарата Бр. ри1?еги1еп1;ит на МКЦ (рис.1).

ас •Ьо--¿о--2о

Рис.1 Гидролиз микрокристаллической целлюлозы препаратом 8р ри1уеги1еп'1ит

Условия опыта: гидролиз МКЦ проводили в течении б часов, концентрация субстрата в реакционной среде 5г/л в 0,05 м ацетат-, ном буфере рН 4.5

1 - ВС

2 - глюкоза

В результате было показано, что несмотря на отсутствие целлобизной активности процесс накопления глюкозы начинается после одного часа с начала гидролиза и достигает постоянного значения после 6 часов. Очевидно система ферментов Sp. pulveruientum в состоянии проводить гидролиз субстрата (по крайней мере ее доминирующей части) до глюкозы без наличия целлобиазы.

Исследование влияния рН инкубационной среды, на скорость ферментативной реакции выявило, что оптимальным для действия андо-1,4-р-глюканазы является интервал рН 4,3-4,5. Оптимальным для образования ВС из ФБ 4,7-5,0.

Расчет относительного содержания (а) и коэффициента распределения Кр слабо и прочноадсорбирупцихся • форм на МКЦ показал, что целлюлазный препарат штамма Sp.pulveruientum содержит 20% слвбоадсорбируемых форм эндоглюканаз с коэффициентом распределения 0,008 л/г и 80% прочноадсорбируемых форм с коэффициентом распределения 0,92 л/г(рис.2).

Рис. 2. Зависимость [Е] ¿[Е] р 1/£ от [МВД] при адсорбции

Бр. ри1уеги1еп1;ит на ЫКЦ. А-для слабо адсорбируемых форм. Б-для

прочноадсорбируемых форм, .

1 1Е] а -1 с

где -г = ( —Е--- )

6 [Е]0 1 +^[№01]

Условия опыта: 0,05. Ы ацетатный буфер рН 4,5, температура 25е

Влиание температуры инкубационной среды на активность цел-люлазного препарата Бр. ри1уеги1еп1;ит изучали используя как нерастворимый (ФБ), так и рьстворимый субстрат (КМЦ). Показано, что препарат проявлял максимальную активность по отношению к перечисленным субстратам в интервале температур 60-55°.

Ингибирование эндогликаназы глюкозой при концентрации 18 г/л (значительно превосходящей концентрацию 'фермента в реакционной среде ), показало, что ингибирование носит неконкурентный характер, константа ингибирования 96 г/л, константа Михаэлиса 3,3 г/л. т.е. фермент слабоингибируем продуктом реакции.

3,Очистка и физко-химические характеристики эндо-1,4-б-глю- . каназ 5р.ри1уера1е^гш1. . Для получения высокоочищенной эндо-1,4-р-глюканазы штамма Бр. ,ри1уеги1епЬит на первом этапе очистки наш была использована анионообменная' хроматография на ДЭАЭ-650 Тойеперл ( рис.з). фракции собирали по 5 мл и определяли в них содержание белка и эндоглюканазную активность вискозиметрически.

Рис. 3. Анионнообменная хроматография эндоглюканаз Sp. pui-verulentum на колонке с ДЭАЭ-650 Тойеперл. Условия опыта: на колонку размером 2,6x50 см, уравновешенную 0,02 М амонигй ацетатным буфером наносили 100 мл раствора фермента со скоростью 50 мл/ч. Десорбция в линейном градиенте ионной силы до 0,5 М того же буфера, а-белок, б-активность по эндоглюканазе (ед/мл).

Исходным буфером элкировалась значительная часть эндоглюканазной активности ( 81% ) и относительно малое количество белка ( 12% ) ( пик 1 ). В градиенте ионной силы с колонки десорбировалось до 65% нанесенного белка с незначительной (8,3%) эндоглюканазной активностью (пики 2,3). Эвдоглюканазная фракция,полученная элюцией стартовым буфером с удельной активностью 16,3 мг/мл была отделена от значительного количества белка и частично от пигмента.

Фракцию 1 эндоглюканазы обессоливали прибавлением 3-х объемов дистиллированной вода с последующим концентрированием на полых волокнах АП-0,2, переводили в 0,02 М натрий-цитратный буфер рН 4,0. После такой подготовки фракцию эндоглюканазы наносили на колонку с катиовообменником СМ-650 Тойеперл, размером 1,6x50 см фирмы "екв" уравновешенную тем же буфером. Скорость влюции 25 мл/ч. Десорбцию проводили в линейном градиенте того же буфера до 0,2 М

В исходном буфере элюировалось 77,6% и 16,7% белка. Степень очистки этой зндоглюканазной фракции - 30, удельная активность 75 ед/мг белка. При десорбции в линейном градиенте ионной силы элю-ируется три пика с незначительной активностью по эндоглюканазе. Для дальнейшей очистки мы выбрали фракцию -1, элшрованную в исходном буфере, поскольку степень очистки и удельная активность этой фракций имеет наибольшее значение.

Обессоленную и концентрированную фракцию (1) с зндоглюканазной активностью переводили в 0,01 М натрий-фосфатный буфер рН 7,0 и наносили на колонку размером 1,5x8 см с ДЭАЭ Тойеперл, уравновешенную тем же буфером. В исходном буфере элюировалось 47,8% активности и 3,2% белка с удельной активностью по эндоглюканазе 112 ед/мг (пик 1 - Э1). При десорбции элюировалось 4 белковых пика (2,3,4,5) из них лишь один пик 3 (Э2) содержал эндоглюканазную активность (35% эндоглюканэзной активности и 2,7% белка, Ауд 77,7 ед/мг белка). Профиль элюции белка и эндоглюканазной активности представлен на рис. 4.

Для дальнейшей очистки эндоглюканаз проводили гельфильтрацию фракций 1 (Э1) и 3 (Э2)

Профиль элгции фракции 1 (Э^) представлен на рис. 5. После гельфильтрацки Э} было получено четыре белковых пика ( 1,2,3,4) с удэльнымм &ндс_тлюкачазнами активностями соответственно 20,5; 66; 120; 228 ед/мг белка со степенями очистки 8,2; 26,9; 48; 91,4.

Рис. 4. Анионнобменная хроматография на ДЭАЭ-650 Тойеперл

эндоглюканазной фракций штамма Bp.pulverulent-um. Условия ошга: размер колонки 1,5x6см, уравновешивали 0,01М Na-фосфатным буфером рн 7,0. Наносили по 3-4мл раствора фермента, скорость элюциию мл/ч. Десорбция в линейном градиенте того же буфера до о,5 М. а-белок, б-активность по эндоглюканазе (ед/мл).

Последний пик (4) оказался гомогенным по электрофорезу как в на-тивных, так и в денатурирующих условиях, по изоэлектрофокусирова-нию и по данным ультрацентрифугирования.

При гельфильтрации фракции Э2 было получено четыре белковых пика (рис.б), два из которых (3 и 4) обозначенные наш Э2 3 и Э2 4 соответственно имели удельные эндоглзоканазные активности 80 ед/мг и 145 ед/мг. Электрофоретический анализ фракций Э2 3 и Э2 4 в присутствии ДЦС-Na показал, что фракция Э2 3 содержит лишь три белковых полосы. Для дальнейшей очистки фракцию 32 3 концентрировали и наносили на колонку с ДЭАЭ Тойеперл (рис 7). Эндоглюканаза элю-ировалась в исходном буфере (пик 1). Десорбцию проводили в линейном градиенте того жэ буфера до 0,5 М. В пике 2 эндоглзоканазная активность отсутствовала. Полученный описанным методом фермент был исследован на гомогенность методом гельфильтрации, электрофореза в полиакркламидном геле в нативных и денатурирующих условиях. По данным всех перечисленных тестов Э2 оказалась гомогенной.

Рис. 5,6, Гель-хроматография фракции Э1(рис.5) и фракции ^

(рис.6) через колонку Ш-ЬЬ Тойеперл Условия опыта: размер колонки 1,6x90 см.Ма-ацетатный буфер 0,05М, рН 4,5. Наносили 1-1,5мл раствора фермента. Скорость элюции 40 мл/ч, фракции собирали по 2,5 мл. а - белок

б - активность по эндоглжаназе -

Рис.7.Анионообменввя хроматография на ДЭАЭ-650 Тойеперл фракции

Условия опыта: на колонку размером 1,6x8см, уравновешенную Иа-фосфатным буфером 0,01 М рН 6,0 наносили 2 мл раствора фермента. Скорость элюции ю мл/ч, в линейном градиенте того же буфе->а до 0,5 м. Фракции собирали по _ мл. а - белок, о - активность чоУт1По эндоглюканазе (ед/мл).

В таблице 3 суммированы этапы очистки и ее результаты.

Таблица 3

Результаты очистки эндо-1,4-р-глюканаз Бр. рид.уеги1еп1;ит

Этапы очистки А общ?вдо глюканазы (виск. ед общий белок (мг) А удель (ед/мг белка) Степень очистки Выход по активности 56 Выход по белку %

Исходная 12000 . 4800 2,5 1.0 100 100

ДЕАЭ-650 Тойе перл.рН 5,0 9795 600 16,3 6,5 81,6

СМ-65 Тойе. перл, рН4,0 7500 100 75 30 62,5 2,8

ДЭАЭ-650 Э < 3584 32 112 44,8 29,9 0,66

рН 7,0 Э2 2100 27 77,7 31,1 17,5 0,56

960 4,2 . 228 91,4 11,8 0,08

э2 830 5,7 145 58 6,9 0,1

ДЭАЭ-650 Тойе перл.Шб.О 420 2,05 205 82 3,5 04

Определение молекулярной массы. 'Молекулярную массу эндоглю-каназ определяли методом гельфкльтрации через колонку с сефадексом ' с-юо (1,бхюо)и электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. По данным гель-фильтрации молекулярная масса эндоглюканазы равна 44 кДа, V -180 мл. Для эндоглюканазы - 40 кДа, V - 184 мл. € ©

Молекулярные массы Э^^ и Э2 рассчитанные метдом влектрофореза оказались равными 46 кДа и 43 кДа соответственно.'

Мзоэлекгрическая точка для Эг- 4,3, для Э2- 5,2.

Седкменташгонный анализ Э1 показал, что фермент осаждается как однородный белок и имеет коэффициент седиментации 4,2 Е.

Определение аминокислотного состава показало, что молекула эндоглюканазы' Э^ состоит из 378 остатков аминокислот, а Э2 - из 359 остатков.Молекулярная масса рассчитанная на основе аминокислотного анализа без учета содержания углеводов составляет для Э^ 43кДа, для Э2 - 41 кДа.

В состав молекул Э^ и Э2 входят гидрофобные аминокислоты (32,3% и 37,3%), аминокислоты с незаряженными полярными группами 38.62 и 36,7%), основные аминокислоты (6,9% и 6,4%) соответственно.

Общее содержание углеводов (маннозы, глюкозы) в молекуле эндоглюканазы Э1 составляло 7,6«.

Каталитическая константа, характеризующая молекулярную акти ность фермента, была установление по уменьшению вязкости КМЦ '(3-4г/л) - для 51- 11,4 ю 3 мин-* для ЭР- 10,2 ю Змин~1

Ингибированиб' Еысокоочищенной эндоглюканазы Э1 глюкозой при гидролизе окрашенной целлюлозы носит неконкурентный характер, константа ингибирования равна 72г/л, константа Михаэлиса Кт -2,5г/л.

Расчет коэффициента распределения высокоочищенной эндоглюканазы Э^ показал, что величина Кр равна 1,6л/г. Результаты эксперимента представленные на рис.8 в виде прямой линии, иллюстрируют однородность гомогенной эндоглюканазы по способности адсорбироваться на МКЦ. -

Исследованиз субстратной специфичности эндоглюканазы Э, по-

казало, что фермент гидролизувт р-1',4 связи в КМЦ, целлюлозе и авицеле, чередующиеся р-1,4, с р-1,3 связями в лихенине (р-1,4-более интенсивно) и р-1,4 связи в маннанах. Высокоочищенный фермент не расщеплял до восстанавливающих Сахаров арабинан, практически не действовал на целлобиозу. (таблица 4)

; Таблица 4

Субстратная специфичность высокоочшценной Э^ Бр. ри1уеги1еп<;да

СУБСТРАТ

Тип • связи

Концентра ция(г/л)

Время гидроли за(ч)'

Активность „мкмоль/мин мг белка .

КМЦ (вискозиметрически) Р-1,4 7 0,1 228

КЩ (по осахариванию) Р-1,4 15 0,5 75

Осажденная из раствора

в НдР04 целлюлоза р-1.4 2 45 3,5

Лихенин Р-1,4 Р-1,3 5 2 3,3

Арабинан - а-1,5 5 72 0

Галактоманнан Р-1,4 --

а-1,6 5 • 72 0,03

Авицел р-1,4 5 72 0,2

Ламинария Р-1,3 '5 72 0,04

Маннан Р-1,4 5 72 1,1

Маннан Р-1,4 5 72 0,04

Целлобиоза Р-1,4 1,4 0,16 0

п- Нитрофенил- а 1>5 0,16 .0

галактопиранозид

п-Нитрофенил- Р 1,5 0,16 . 0

галактопиранозид

п-Нитрофенил- Р. 1.5 0,16 0

гликопиранозид

В продуктах исчерпывающего гидролиза кристаллической целлюлозы высокоочищенным ферментом Э^ установлено наличие глюкозы

(35%), целлотриозы, целлототраозы (63%). сутствует целлобиоза.

В продуктах гидролаза от-

Таким образом очевидно, эндоглюканаза Бр.риЗ^егиХеп-Ьит, действуя непосредственно на исходную нерастворимую целлюлозу обладает способностью образовывать глюкозу без основного промежуточного продукта - целлобиозы. '

Степень конверсии микрокристаллической целлюлозы гомогенной

Рис.8 Иллюстрация однородности высокоочищенной эндо-глюканазы Э, по способности адсорбироваться на МКЦ.

Рис. 9 . Гидролиз микрокристаллической целлюлозы высокоочишенной эндоглю-каназой 3^ штамма Бр. ри1уеги1епинп. Условия опыта: гидролиз МКЦ проводили в течение 72ч, концентрация субстрата в реакционной среде -5г/л в 0.05М ацетатном буфере рН 4,5. 1тВС%, 2-глшоза».

Как было установлено степень конверсии кристаллического субстрата .максимальна в .-условиях наиболее эффективной адсорбции. Именно эф-

фективность адсорбции эндоглшаназы Э1, установленная нами, является фактором непосредственно определяющим способность фермента расщеплять упорядоченную цьллюлозу. ■

ВЫВОДЫ

1. Из коллекции культур термофильных микромицетов отобран штамм Зрпго1;г;1с1шт ри1?еги1еп1;ит - продуцент целлюлаз, не обладающий целлобиазной активностью, но вместе с тем способный частично гидролизовать нерастворимый субстрат до низкомолекулярных продуктов гидролиза, в частности - глюкозы.

2. С\ помощью метода математического планирования биологического эксперимента установлен оптимальный состав питательной среды.

3. Осаждением этиловым спиртом получен ферментный препарат целлюлаз с 80% -ым выходом по эндоглюканазе. Установлены оптимальные условия действия фермента (рН - 4,5; температура - 55° ). Показано наличие в препарате прочноадсорбируемых форм фермента (80%) и слабое ингибирование конечным продуктами реакции (глюкоза).

4. разработан метод очистки, позволяющий получать в гомогенном виде две формы эндоглюканазы (Э1 и Э2 ). Метод состоит из четырех этапов для Э1 и пяти этапов для Э2. Выход по активности 11,855 (Э.,), Э,Ъ% (Э2). Удельная активность 228 ед/мг О.,), 205 ед/мг (Э2). Степень очистки 91,4 (Э1), 82 (Э2).

5.Показана однородность высокоочищенного фермента по адсорбционным свойствам на микрокристаллической целлюлозе и слабое ингибирование глюкозой.

6.Установлена способность к глубокому гидролизу микрокристаллической целлюлозы гомогенной эндоглмканазой до глюкозы (35Й), целлотриозы, целлотетраозы (6 356). Высказано предположение о не-целлобиазном пути получения глюкозы в культурах некоторых термофильных микромицетов.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ-

1 Буачидзе Т.Ш., Урушадзе Т.Р., Мамаиашвили H.A., Куцу бвдзе Н.К. Характеристика целлюдазных препаратов мезофильных : термофильных грибов.// Тезисы докладов III симпозиума социалиста ческих стран по биотехнологии. -Братислава, 1983.

. 2.Буачидзе Т.Ш., Гогилашвили JI.3., Уруаадзе Т.Р. Нуцубвдзе H.H., Чиргадзе Л.Т Целлюлазы термофильных микроорганизмов.// Тезисы докладов конференции по биотехнологии, Тбилиси 1S33..

3. Урушадзе Т.Р., Хведелидзе P.M., Шаламберидзе М.Д., Хомасуридзе Т.е.. Характеристики эндоглшканаз термофильных микроми-цетов // Тезисы докладов I Всесоюзной конференции молодых ученных.- Звенигород, 1985. -с.18.

4. Гогилашвили Л.З., Шаламберидзе М.Д., Хведелидзе P.M., Урушадзе Т.Р. Эпдоглюканазы термофильных микромицетов. //Тезисы докладов V Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимологии. -КоЗулети, 1985. -с. 273.

5. Урушадзе Т.Р., Хомасуридзе Т.е., Гогилашвили Л.3. Подбор условий культивирования , выделение, очистка и характеристики эндоглюканазы из глубинной культуры термофильного микромицета Sporotriohum pulverulentuci. // Тезисы докладов III Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" -Кобулети, 1986, -с.63.

6. Урушадзе Т.Р., Хомасуридзе Т.С. Выделение, очистка и свойства эндоглвканаз термостабильной культурой Sporotriohum pul-yeruientum.// Тезисы докладов Всесоюзной конференции. "Методы получения и анализа биохимических реактивов". Юрмала, 1987.

V". Гогилашвили Л.З., Шаламберидзе М.Д., Урушадзе Т.Р., Хведелидзе P.M., Сванидзе P.C., Квеситадзе Г.И. Физико-химические свойства вядеглюканаз термофильных микромицетов //Биотехнология. 198Ö. -т.4. N4. -с.450-456.

8. Урушадзе Т.Р., Хомасуридзе Т.е., Гогилашвили Л.Ш. Экспериментальная проверка оптимальности состава питательной среды для биосинтеза целлюлаз грибом Eporotriohun pulvörulentum. Ссобц АН ГССР, тЛЗЗ, U 1, 1969-

S.Gogilaslivili Ii.H., Khveaeli.i7.fi E.K., Urushadse Т.К., Клогоа-Burid-c T.S. Seieotjon о* themiopiiyliu liicrottj'?6tes - producent.s

of thermostable oellulases for biooorivereion oX plant raw material. Simposium Interbiotech 90, Bratislava, Chechoslovakia, p.85.

10. Урушадзе Т.P., Гогилашвили Л.З. Физико-химические, молекулярные характеристики и субстратная специфшючть андо >1,4-0-глюканазы Sporotriohum pulverulentum. // Сообщ. АН ГССР т. 140, N1, с. 58". '