Электрооптический анализ микробных суспензий для определения метаболической активности клеток и их детекции

Гулий, Ольга Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Электрооптический анализ микробных суспензий для определения метаболической активности клеток и их детекции
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Электрооптический анализ микробных суспензий для определения метаболической активности клеток и их детекции"

На правах рукописи

Гулий Ольга Ивановна

ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МИКРОБНЫХ СУСПЕНЗИЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК

И ИХ ДЕТЕКЦИИ

03,00.07 - микробиология 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Саратов - 2006

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научные консультанты:

доктор биологических наук Игнатов Олег Владимирович доктор технических наук Бунин Виктор Дмитриевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Чиров Павел Абрамович доктор химических наук, профессор Решетилов Анатолий Николаевич доктор биологических наук, доцент Корженевич Вячеслав Исаевич

Ведущая организация - Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"

диссертационного совета Д 220.061.04 в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335. Тел./факс (8452) 69-25-32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335. Тел./факс (8452) 69-23-09.

Автореферат разослан 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Защита состоится

Л.В. Карпуннна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Проблема изучения метаболической активности микробных клеток и их индикации актуальна для различных областей прикладной микробиологии и биотехнологии. Вопросы детекции клеток и определения активности их ферментативных систем тесно взаимосвязаны. Это обусловлено тем, что при детекции микроорганизмов обычно решаются несколько основных вопросов: индикация микроорганизма, определение количества клеток и оценка активности ферментативных систем микроорганизма, что при определенных условиях может служить показателем жизнеспособности клеток (Ivnitski et а]., 1999). Вместе с тем, определение метаболической активности микробных клеток может являться и независимой задачей, которая находит свое приложение, как в микробиологических производствах, так и в медицинской микробиологии.

Одними из наиболее удобных подходов для экспрессной оценки морфологических и физиологических параметров клеток являются электрофизические (ЭФ) методы, к которым относится метод ориентации клеток в переменном электрическом поле (Мирошников с соавт., 1986; Бунин, 1996).

Изменения электрофизических свойств клеток при микробном метаболизме могут быть обусловлены несколькими различными процессами, протекающими в клетках как по отдельности, так и одйовременно. Такими процессами могут являться: транспорт субстрата в клетку, его ферментативная трансформация в клетке, действие изучаемого соединения на клеточный метаболизм и т.д. Важное значение при данных исследованиях имеют свойства изучаемого соединения, его способность участвовать в ферментативном катализе у клеток исследуемого микроорганизма, возможное токсическое действие на изучаемые клетки и пр.

Микробная деградация низкомолекулярных токсичных соединений представляет значительный интерес, поскольку лежит в основе биотехнологических способов очистки токсичных выбросов и может быть использована для создания биокаталитических технологий синтеза ряда токсичных веществ (Карасевич, 1982). При этом в большинстве случаев для изучения метаболической активности микробных клеток используют методы, основанные на количественном определении продукта или субстрата ферментативной реакции с использованием меченых соединений, фотометрии, хроматографии и т.д. Такие исследования обычно проводят в несколько этапов и характеризуются относительной сложностью анализа, требуют дорогостоящего оборудования и реагентов [Кулис, Разумас, 1986; West, Sparting, 1986; Knowng, Govind, 1994]. Применение электроолтического анализа микробных суспензий позволит не только регистрировать метаболическую активность микроорганизмов, проводить количественное определение соединений, являющихся субстратами

ферментативной реакции, но и при определенных условиях проводить сравнительное изучение путей метаболизма определенных субстратов у бактерий.

Другим аспектом исследований является изучение электрооптических свойств микробных суспензий при действии на клетки различных ингибиторов метаболической активности. Ингибиторами могут служить вещества, традиционно применяемые в биохимических исследованиях, а также различные антибиотики. Это направление имеет значительный потенциал и может привести к созданию нового подхода для экспрессного определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

Создание методологии для быстрого обнаружения микроорганизмов в окружающей среде является одной из важных проблем современной биотехнологии в связи с существующей опасностью террористических угроз, наличием в окружающей среде возбудителей опасных инфекций и т.д. (Walt, Franz, 2000; Deisingh, Thompson, 2002). Наиболее часто способность антител (Ат), меченных различными маркерами, образовывать комплекс с соответствующими антигенами используется для решения биосенсорных методов детекции клеток (Keith, 2000; Vaughan, 2001 и др.). При этом электрофизические методы могут значительно упростить и облегчить задачу детекции микроорганизмов с помощью моноклональных или поликлональных антител.

Наряду с применением антител для определения микроорганизмов могут быть использованы бактериофаги, которые обладают определенной селективностью взаимодействия с клеточной поверхностью и являются достаточно точными индикаторами, определяющими видовую и типовую принадлежность бактерий (Kristensen, Winter, 1998; Sieber, 1998).

Цель работы - развитие методологии электрооптического анализа микробных суспензий для определения метаболической активности клеток и их детекции.

Задачи исследования

1. Разработка методических приемов для определения метаболической активности при катаболизме низкомолекулярных соединений у микроорганизмов с помощью электрооптического анализа клеточных суспензий.

2. Сравнительное изучение путей метаболизма токсичных низкомолекулярных соединений у микроорганизмов, обладающих специализированной ферментативной системой подготовительного метаболизма, с помощью электрооптического анализа клеточных суспензий.

3. Создание нового метода определения токсичных низкомолекулярных соединений на основе измерения электрофизических свойств микробных клеток, обладающих специализированной ферментативной системой подготовительного метаболизма.

4. Исследование изменений электрооптических параметров клеточных суспензий при метаболизме нетоксичных низкомолекулярных соединений в микробных клетках Escherichia coli при ингибировании их ферментативных систем на примере метаболизма глюкозы.

5. Развитие методических подходов определения антибиотикочувствительности микробных клеток с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий на примере (З-лактамных, аминогликозидных антибиотиков, тетрациклина и хлорамфеникола. Изучение синергетического антимикробного эффекта антибиотиков на примере канамицина и тетрациклина с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий.

6. Разработка методических подходов индикации бактерий при взаимодействии со специфическими антителами с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий.

7. Изучение возможности определения бактерий при их инфицировании специфическими бактериофагами с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий. Изучение зависимости изменений электрооптических параметров клеточных суспензий Е. coli XL-1 при их инфицировании бактериофагом М13К07.

8. Исследование изменений электрооптических параметров клеточных суспензий при взаимодействии с биоселективными агентами (антителами и бактериофагами) в присутствии посторонней микрофлоры.

Научная новизна работы

Впервые показана возможность использования электрооптического анализа суспензий клеток для сравнительного изучения путей метаболизма низкомолекулярных соединений на примере метаболизма пара-нитрофенола (ПНФ). Нами установлено, что электрофизические свойства микробных клеток, способных утилизировать ПНФ, значительно изменяются в процессе метаболизма этого соединения. Установлена взаимосвязь активности ферментов подготовительного метаболизма низкомолекулярных соединений и изменений электрооптических параметров клеточных суспензий при их метаболизме. Установлено, что ингибирование метаболических процессов в микробных клетках Е. coli при метаболизме глюкозы приводит к изменениям электрооптических параметров клеточных суспензий и их респираторной активности, что подтверждает зависимость электрофизических свойств клеток от процессов метаболизма.

специализированной ферментативной системой подготовительного метаболизма этих соединений. Установлена зависимость изменений электрофизических свойств микроорганизмов от процессов метаболизма низкомолекулярных токсичных соединений и концентрации субстрата.

Впервые предложен способ определения чувствительности микробных клеток к действию ß-лактамных, аминогликозидных антибиотиков, тетрациклина и хлорамфеникола с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий. Нами установлено, что электрооптические свойства микробных суспензий при действии ß-лактамных антибиотиков у чувствительных и резистентных штаммов Е. coli коррелируют с наличием плазмид устойчивости к данным антибиотикам. Исследованы изменения электрооптических параметров клеточных суспензий при воздействии на них антибиотиков, являющихся ингибиторами белкового синтеза и обладающими как бактерицидным, так и бактериостатическим эффектом воздействия на микробные клетки. Изучены изменения электрооптических параметров клеточных суспензий при совместном действии канамицина и тетрациклина. Показана возможность изучения синергидного действия антибиотиков на микробные клетки с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий.

Впервые показана возможность создания нового типа биосенсорной системы для определения микробных клеток при специфическом взаимодействии как с моноклональными, так и с поликлональными антителами. Показана возможность индикации бактерий при взаимодействии со специфическими антителами в присутствии посторонней микрофлоры с помощью электрооптического анализа клеточных суспензий.

Впервые показана возможность определения бактерий, инфицированных специфическими бактериофагами, с помощью регистрации изменений электрофизических свойств микробных клеток. Изучена зависимость изменений электрооптических параметров клеточных суспензий Е. coli XL-1 при инфицировании бактериофагом М13К07 в зависимости от количества внесенного фага и от времени инкубации клеток с фагом. На основании изучения взаимодействия микробных клеток Е. coli XL-1 и колибактериофага М13К07 показана возможность использования электрооптического анализа клеточных суспензий для изучения процесса инфицирования бактериофагом микробных клеток. Показана возможность индикации бактерий при их инфицировании бактериофагом в присутствии посторонней микрофлоры с помощью электрооптического анализа клеточных суспензий.

Практическая значимость

Разработана методология определения метаболической активности микробных клеток в процессе катализа токсичных и нетоксичных соединений в

микробных клетках, основанная на измерении электрооптических параметров суспензий клеток.

Разработан новый способ индикации и количественного определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий штаммов-деструкторов, способных метаболизировать определяемые субстраты.

Предложен новый подход для определения чувствительности микробных клеток к действию антибиотиков на основе измерения электрофизических свойств микробных клеток. Показана возможность использования метода электрооптического метода анализа микробных клеток для регистрации синергетического антимикробного действия антибиотиков.

Предложен новый метод индикации микробных клеток в водных растворах при взаимодействии со специфическими моноклональными и поликлональными антителами с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий.

Разработан метод определения бактерий при их инфицировании специфическим бактериофагом с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий. Установлена зависимость изменений электрооптических параметров клеточных суспензий при их инфицировании бактериофагами от количества внесенного фага и от времени инкубации клеток с ним.

Разработан способ количественного определения метафоса и пара-нитрофенола в водных растворах, на который получен патент Российской Федерации (№2175352 заявл. 11.05.2000, опубл. 27.10.2001 бюлл. №30 / Гулий О.И., Игнатов О.В., Щербаков A.A., Игнатов В.В.).

Материалы, представленные в диссертации, используются при обучении студентов и аспирантов на кафедре биохимии и биофизики, кафедре микробиологии и физиологии растений биологического факультета, кафедре нелинейной физики Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского, кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы, кафедре биотехнологии, органической и биологической химии Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработан комплекс методических приемов для определения метаболической активности микробных клеток при катаболизме низкомолекулярных соединений с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий. Показана взаимосвязь изменений электрооптических параметров клеточных суспензий при метаболизме ряда соединений с активностью ферментов подготовительного метаболизма. Проведено сравнительное изучение электрооптических свойств клеточных суспензий ......—^finenTaiiMTiuv пягпичными (Ьеоментативными системами

подготовительного метаболизма пара-нирофенола (через гидрохинон или 4-нитропирокатехин).

2. Установлено, что ингибирование метаболических процессов в микробных клетках Escherichia coli при метаболизме глюкозы приводит к изменениям электрооптических параметров клеточных суспензий и их респ раторной активности.

3. Разработан принцип действия биосенсорной системы для определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и суми -иона с помощью электрооптического анализа клеточных суспензий, обладающих специализированными ферментативными системами подготовительного метаболизма определяемых соединений.

4. Разработан принцип использования метода электрооптического шализа клеточных суспензий для определения чувствительности микробных клеток к действию антибиотиков, обладающих бактерицидным и бактериостаг 1ческим эффектом воздействия на микробные клетки. Установлено, что электроопт ические свойства микробных суспензий при действии ß-лактамных антибиотиков на чувствительные и резистентные штаммы Е. coli коррелируют с наличием плазмид устойчивости к данным антибиотикам. Показана возможность использования метода электрооптического метода анализа микробных клеток для регистрации синергетического антимикробного эффекта антибиотиков.

5. Разработан метод использования электрооптического анализа клеточных суспензий для определения микробных клеток в водных растворах при их взаимодействии со специфическими моноклональными и поликлональными антителами.

6. Разработана схема использования метода электрооптического анализа микробных суспензий для определения бактерий при их инфицировании бактериофагом.

7. Установлена возможность использования электрооптического анализа для индикации бактерий при их взаимодействии с антителами и бактериофагами в присутствии посторонней микрофлоры.

Работа выполнена в лаборатории электрофизиологии клетки (ЛЭК) Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН) в рамках бюджетной темы: «Исследование электрофизических свойств микроорганизмов» 2001-2005 гг. Номер государственной регистрации 11.200.117783.

«Фундаментальные исследования и высшее образование», грант Y1-P-06-09 -2003-2006 гг.; программы «Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 годы», проект Д4169; Министерства образования и науки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы» подпрограммы "Развитие инфраструктуры научно-технической и инновационной деятельности высшей школы и ее кадрового потенциала, «индивидуальный код» 4198 - 2005г.; NATO ColJaborated Linkage Grant СВР.NR.NRCLG 981615 - 2005-2006 гг.; Европейской Академии наук -2005г.; Федерального агентства по науке и инновациям по приоритетному направлению "Развитие инфраструктуры" в рамках ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 20022006 годы по мероприятию 1.9 "Проведение молодыми учеными научных исследований по приоритетным направлениям науки, высоких технологий и образования" контракт № 02.442.11.7153, шифр работы: 2005-РИ-19.0/002/171 -2005 г.; Президента РФ для молодых кандидатов наук МК-8599.2006.4 - 2006 г.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на всероссийских и международных симпозиумах и конференциях: Euroconference "Bacterial-Material/Radionuclide Interaction", Rossendor/Dresden, Germany, 1998; научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов СГАУ им. Н.И. Вавилова по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы за 1999 год, Саратов, 1999; 9,h European Congress on Biotechnology, Belgium, 1999; всероссийской заочной конференции "Перспективы развития Волжского региона", Тверь, 2000; International Symposium on Environmental Biotechnology 2000, Kyoto Japan, 2000; семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов биотехнологии-2000, Пущино, 2000; международной научной конференции "Экологические и гидрометеорологические проблемы больших городов и промышленных зон", Санкт-Петербург, 2000; научной конференции, посвященной двадцатилетию создания ИБФРМ РАН, Саратов, 2000; международной научно-практической конференции "Проблеми I перспективи очищения та повторного використання води", Харьков, 2000; научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов СГАУ им. Н.И. Вавилова по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы за 2000 год, Саратов, 2001; 5-ой Пущинской конференции молодых ученых "Биология — наука 21-го века", Пущино, 2001; всероссийской конференции "Фундаментальные и прикладные аспекты функционирования водных экосистем: проблемы и перспективы гидробиологии и ихтиологии в XXI веке", Саратов, 2001; всероссийской заочной конференции "Перспективы развития Волжского региона", Тверь, 2001; семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов биотехнологии-2001, Пущино, 2001; всероссийской конференции «Экологизация

подготовки специалистов в вузах. Утилизация и переработка отходов», Саратов, 2001; первой региональной конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой", Саратов, 2002; 6-ой Путинской конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века", Пущино, 2002; всероссийской заочной конференции "Перспективы развития Волжского региона", Тверь, 2002; 2-ой международной конференции "Экологические и гидрометеорологические проблемы больших городов и промышленных зон", Санкт-Петербург, 2002; международной конференции "Biotechnology and food 2003", Zagreb, Croatia, 2003; 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века", Пущино, 2003; международной конференции "Enzymes in the environment: activity ecology and applications 2003", Prague, Czech Republic, 2003; отчетной конференции ло итогам НИР 2003 года Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, 2004; итоговой конференции молодых ученых, аспирантов и студентов НОЦ, Саратов, 2004; международной конференции «The б"1 Workshop on biosensors and bioanalytical ^-techniques in environmental and clinical anaîysis», Rome, Italy, 2004; конференция молодых ученых НОЦ, Саратов, 2005; 9-ой Пущинской школе-конферешвш молодых ученых ' 'Биология - наука 21 -го века", Пущино, 2005; всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты», Саратов, 2005; международной конференции «13th International biodeterioration and biodégradation symposium», Madrid, Spain, 2005; международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», Саратов, 2005; международной конференции «4th International Conference instrumental methods of analysis IMA », Greece, 2005.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 56 работ, в том числе получен 1 патент Российской Федерации, 21 статья и 34 тезисов докладов, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 5 глав с изложением результатов работы и их обсуждением, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 363 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 317 страницах компьютерного текста, включающего 67 рисунков и 4 таблицы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Микроорганизмы. В работе использовали бактерии Escherichia coli К-12, Е. coli К-12 pUC-18, К coli РММВ-33, Е coli pBR325, Е, coli XL-1 и Azospirillum brasilense Sp7, полученные из коллекции Института биохимии и физиологии растений и

микроорганизмов РАН (Саратов). В работе также использовали микроорганизмы, полученные из коллекции лаборатории Саратовского НИИ "Биокатализа": Pseudomonas putida БА-11 (ВКПМ В-6707), P. putida С-11 (ВКПМ В-6708) и Acinetobacter calcoaceticum А-122. Микроорганизмы хранили при 4 °С на чашках Петри с МПА и пересевали каждую неделю. В работе использовали лиофилизированные клетки Listeria monocytogenes вакцинного штамма "АУФ" (ФГУП "Ставропольская биофабрика"), полученные в Государственном научном центре (ГНЦ) прикладной микробиологии и биотехнологии г. Оболенск, Московская область.

В исследованиях использован метод электроориентации клеток под влиянием переменного электрического поля. Регистрируя изменение интенсивности рассеянного (или ослабление прямо прошедшего) пучка света, можно количественно охарактеризовать степень пространственной упорядоченности клеток. В экспериментах использованы электрооптические анализаторы ELUS и ELBIC, созданные группой исследователей под руководством д.т.н. В.Д.Бунина в ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, при длине волны света 670 нм (относительно вакуума). Общая схема электрооптической части анализаторов приведена на рис. 1.

световой поток 2

световой поток 1 л ы. линза

Ф Ф ф измерительная ячейка • вв -- / N

» Л Ф —^

сЬотогтиемннк

фотоприемннк

Рис, 1. Схема оптической части анализаторов ELUS и ELBIC

Ориентационные спектры (ОС) представлялись в виде частотной зависимости разности значений оптической плотности суспензий 50D, измеренных при распространении пучка неполяризованного света вдоль и поперек направления ориентирующего поля. Эта разность была нормирована на значение оптической плотности при хаотической ориентации клеток (Мирошников и др., 1986, Bunin, Voloshin, 1996).

На электрооптическом анализаторе ELBIC использовали дискретный набор частот ориентирующего электрического поля: 10; 52; 104; 502; 1000; 5020 и

10000 кГц; на электрооптическом анализаторе ELUS использовали набор частот: 10; 100; 250; 470; 500; 750; 1000; 1450; 2000 и 2800 кГц.

В ходе выполнения работы применяли традиционные методы культивирования микроорганизмов на питательных средах (Маниатис с соавт., 1984; Миллер, 1987). Исследование ЭО параметров клеток проводил! согласно (Ignatov et al., 2002). Респираторную активность микробных клеток из i фяли по методике (Методы общей бактериологии, 1984). Включение клеток в а-аровый гель проводили по методике (Корженевич, 1991). Инфицирование клеток бактериофагом проводили согласно (Bunin et al., 2004). Трансфекцию проводили по методу (Guliy et al., 2005). Определение жизнеспособности клеток преходили по методике (Методы общей бактериологии, 1984; Луста, Фихте, 1990). Определение чувствительности бактерий к антибиотикам проводили по методу (Лабинская, 1978). Коллоидное золото со средним диаметром частиц 20 нм получали по методу Frens (Frens, 1973). Процедуру получения коньюгатов коллоидного золота с антителами и коньюгатов коллоидного золота с протеином А проводили согласно (De Mey, Moeremans, 1986, Дыкман, Богатырев, 19<7).

Кривые на рисунках строились по средним значениям, полученным в результате не менее 5 экспериментов. Статистическую обработку результатов измерений проводили стандартным методом (Чарыков, 1984; Лакин, 1990). Для статистической обработки экспериментальных данных также использовали пакет прикладных программ Microsoft Excel 2000.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Экспериментальные исследования с использованием метода электрооптического (ЭО) анализа клеточных суспензий велись по трем основным взаимосвязанным направлениям.

Первое - исследование метаболической активности целых клеток и количественное определение ряда соединений в водных растворах.

Второе - изучение свойств микробных суспензий при действии на клетки различных ингибиторов метаболической активности.

Третье - определение клеток микроорганизмов в водных растворах при их специфическом взаимодействии с биоселективными агентами - антителами и бактериофагами.

Использование метода электрооптического анализа суспензий клеток для сравнительного изучения путей метаболизма низкомолекулярных соединений на примере метаболизма пара-нитрофенола

Процессы ферментативного катализа, протекающие в бактериальной клетке, сопровождаются перераспределением зарядов внутри клетки и, следовательно,

могут приводить к изменению ее электрофизических свойств. Возможность использования метода ЭО анализа клеточных суспензий для изучения подобных процессов проводилась на микробных клетках Р. pulida С-И, Р. pulida БА-11 и A. calcoaceticum А-122, способных к утилизации ПНФ в качестве единственного источника углерода и энергии (Сингирцев, 1996). Выбор ПНФ обусловлен тем, что среди нитрофенолов он наиболее подвержен метаболическому превращению микроорганизмами, а также хорошо изучены пути его метаболизма микробными клетками. Поэтому изучение ЭО параметров клеток при метаболизме ПНФ может служить удобной моделью для решения поставленных задач. Описаны два возможных пути микробного метаболизма ПНФ — через прямое гидролитическое отщепление нитрогруппы и образование гидрохинона (Spain, Gibson, 1991) или через предварительное восстановление нитрогруппы в аминогруппу, с последующим отщеплением ионов аммония и образованием нитро-пирокатехина (Rokesh et al., 1994; Jain et al., 1994) (рис. 2).

п-нитрофенол (Moraxella sp.) 4-юпрофенол-4-монооксигеназа и-бензохинон и-бензохинон-редуктаза гидрохинон гидрохинон-1,2-диоксигеназа

4-гидроксимуконовый полуальдегид

и-нитрофенол (Arthrobacter sp.) 4-яитрофенол-4-монооксигеназа 4-нит#опирокатехол

4-нитропирокатехол-4-монооксигеназа ,2.4-ёензотриол

4-гидроксимуконовый полуальдегид дегидрогеназа

1,2,4-бензотриол-диоксигеназа

малеилацетил-дегидрогеназа

малеилацетиловая кислота

З-окс^адилинат основной метаболизм клетки

Рис. 2. Схема подготовительного метаболизма пара-нитрофенола клетками штамма Moraxella sp. (A) (Spain, Gibson, 1991) и клетками штамма Arthrobacter sp. (Б) (McTavish, 2000)

Нами изучалось влияние ПНФ на ЭО параметры клеточных суспензий Р. pulida С-11, Р. putida БА-11 и A. calcoaceticum А-122. В результате было установлено, что при инкубации клеток с различными концентрациями ПНФ, происходят значительные изменения в ОС суспензий клеток всех изучаемых штаммов (рис. 3).

Частота, кГц Частоте, кГц Частота, кГц

Рис. 3. Изменение величины ЭО сигнала суспензии клеток Р. putida С-11 (А), Р. putida БА-11 (Б) и A. calcoaceticum А-122 (В) при инкубации с ПНФ (1 - клетки, инкубированные в дистиллированной воде без добавления субстрата (контроль); 2 - клетки, инкубированные в дистиллированной воде с добавлением 1,0 мМ ПНФ; 3-е добавлением 2,5 мМ ПНФ)

Полагаем, что изменение ЭО параметров клеток при воздействии определенных промежуточных продуктов метаболизма ПНФ может свидетельствовать о различии в путях метаболизма данного соединения в клетках штаммов-деструкторов. В связи с тем, что при гидролитической элиминации нитрогруппы ПНФ может образоваться гидрохинон, нами изучалось влияние гидрохинона на ЭО параметры клеточных суспензий трех изучаемых штаммов. В результате было установлено, что существенные изменения ОС суспензий клеток, инкубированных с различными концентрациями гидрохинона, происходили у клеток Р. pulida С-11. Однако гидрохинон не влиял на ЭО свойства микробных суспензий Р. putida БА-11 и A. calcoaceticum А-122 (рис. 4).

Значительные изменения ОС происходят при инкубации клеток Р. putida С-11 с гидрохиноном. Это, вероятно, связано с тем, что предполагаемый путь метаболизма ПНФ в микробных клетках данною штамма проходит через образование гидрохинона, как у клеток Moraxella sp. (Spain, Gibson, 1991). При инкубации клеток штамма Р, putida БА-11 и A. calcoaceticum А-122 с гидрохиноном существенных изменений ОС не происходило. Возможно, что процесс метаболизма ПНФ для клеток штамма P. putida БА-11 и A. calcoaceticum А-122 проходит через образование 4-нитропирокатехина с последующим разрывом ароматического кольца, как у штамма Arthrobacter sp.JS443 (Rokesh et al., 1994; Jain et a!, 1994).

"п—.........—

100 1000 Частота, кГц

■т, 0+10000 10

..........—

100 1000 Частота, кГц

т™, o-f-10000 10

100 1000 10000 Частота, кГц

Рис. 4. Изменение величины ЭО сигнала суспензий клеток Р. pulida С-11 (А), P. putida БА-11 (Б) и A. calcoaceticum А-122 (В) при инкубации с гидрохиноном (1 - клетки, инкубированные в дистиллированной воде без добавления субстрата (контроль); 2 - клетки, инкубированные в дистиллированной воде с добавлением 1,0 мМ гидрохинона; 3-е добавлением 2,5 мМ гидрохинона)

Полученные данные были подтверждены с помощью метода регистрации специфической респираторной активности (CPA) клеток по отношению к гидрохинону и ПНФ. В результате было показано, что клетки A. calcoaceticum А-122 и P. putida штамма БА-11 не обладают CPA в отношении гидрохинона, а клетки P. putida С-11- проявляют активность в отношении гидрохинона. Однако клетки всех изученных штаммов обладали CPA по отношению к ПНФ (рис. 5).

Рис. 5. CPA клеток P. putida С-11 (а), P. putida БА-11 (б) и A. calcoaceticum А-122 (в) по отношению к гидрохинону и ПНФ

Существуют неспецифические факторы (не связанные с метаболизмом изучаемых субстратов), которые могут приводить к изменению ЭО сигнала: сорбция высоко- или низкомолекулярных соединений на клеточной поверхности;

Ша □б Пв

ПНФ гкзрохююн

0 10 20 30 40 50 60 70 CPA, глсА/ ю«*мг сухого веса кпшж

осмотические явления, связанные с инкубацией клеток в дистиллированной воде. Для выявления возможных изменений ОС суспензий, связанных с возможной сорбцией молекул субстратов на поверхности клеток, были поставлены контрольные эксперименты с использованием клеток штаммов A-ospirillum brasileme Sp7 и Escherichia coli К-12, не обладающих фермент тивными системами подготовительного метаболизма ПНФ. Для этого микробн i ч клетки A. brasilertse Sp7 и Е. coli К-12 инкубировали с ПНФ (1,0 мМ) в течение 15 мин, подготавливали для ЭО анализа, и использовали для измерений ОС клеточной суспензии. В результате было установлено, что ПНФ не влиял на ЭО свойства микробных суспензий штаммов A. brasilertse Sp7 и Е. coli К-12.

Для определения влияния осмотических явлений на изменение ЭО параметров суспензий P. putida С-11, P. putida БА-11 и A. calcoaceticun А-122 клеточные суспензии изучаемых штаммов инкубировались в дистиллированной воде в течение 5, 15 и 30 минут. После инкубации клетки подготавливались для ЭО анализа и использовались для измерений ОС. В результате было установлено, что значительных изменений ОС бактериальных суспензий P. putida С-11, P. putida БА-11 и A. calcoaceticum А-122 при инкубации в дистиллированной воде не происходило.

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что ЭО параметры микробных суспензий, утилизировавших ПНФ, значительно изменялись в процессе метаболизма этого соединения. Полученные данные свидетельствуют о возможности использования метода ЭО анализа клеточных суспензий для изучения путей метаболизма низкомолекулярных соединений у микроорганизмов, обладающих соответствующей ферментативной системой подготовительного метаболизма исследуемого соединения.

Использование электрооптического анализа суспензий клеток для определения концентрации субстрата

В связи с загрязнением окружающей среды инсектицидами и продуктами их деградации активно развиваются направления по созданию новых методов определения этих соединений. Одним из наиболее перспективных методов экспресс-анализа токсичных соединений являются биосенсорные системы на основе ферментов или целых клеток. Известно, что активный центр фермента часто проявляет достаточно широкую специфичность по отношению к близким по структуре соединениям (Rechetilov et al., 1997; Yagodina, Nikolskaya, 1997). Мы предположили, что, вследствие сходства химических структур ПНФ и фосфорорганических нитроароматических инсектицидов (Мельников, 1987), инсектициды метафос и сумитион (рис. 6) мотут выступать в роли субстратов для

ферментативных систем подготовительного метаболизма ПНФ в микробных клетках.

Рис. 6. Структурные формулы сумитиона (1) и метафоса (2)

Нами исследованы изменения ЭО параметров клеточных суспензий Р. putida С-11, Р. pulida БА-11, и A. calcoaceticum А-122 в процессе метаболизма инсектицидов метафоса и сумитиона для их количественного определения с помощью ЭО анализатора. При проведении дополнительного контроля чистоты препаратов метафоса и сумитиона с помощью газожидкостной хроматографии было установлено, что используемые инсектициды представляют собой чистые препараты без содержания примесей.

После оптимизации условий культивирования и условий проведения ЭО анализа микробные клетки трех изучаемых штаммов инкубировали с инсектицидами, после чего регистрировали изменения ОС. Использовались зависимости изменений оптической плотности клеточной суспензий при электроориентации клеток от частоты ориентирующего поля в интервале 10 -10 ООО кГц. Поскольку максимальное изменение ОС суспензий клеток имело место на первых пяти частотах ориентирующего электрического поля в пределах от 10 до 1000 кГц, для удобства представления экспериментальных данных была использована величина 5ODK0HT[H)nb-5OD3KcnCp„MeHT при частоте ориентирующего поля 10 кГц. В результате было показано, что линейная зависимость величины ЭО эффекта от концентраций инсектицидов наблюдалась для клеток Р. putida С-11 в интервале концентрации метафоса 0,5 - 3,0 мМ (рис. 7) и сумитиона 0,5 - 3,5 мМ (рис. 8). Аналогичные данные получены для клеток Р. putida БА-11. Для клеток A. calcoaceticum А-122 линейный диапазон зависимости величины ЭО сигнала от концентрации метафоса и сумитиона находился в пределах 0,5 - 2,0 мМ и 0,5 - 2,5 мМ, соответственно.

Контрольные эксперименты определения возможных изменений ОС, связанных с неспецифическим действием субстрата на клетку позволяют утверждать, что изменения ОС клеточных суспензий Р. putida С-11, Р. putida БА-11 и Л. calcoaceticum А-122 при инкубации с инсектицидами связаны с процессами ферментативного катализа метафоса и сумитиона.

СНз

SOOO-i

4000-

s зооо

2000-

1000-

5 800-

a 400-

100 1000 Частота, кГц

—i—■—i—1—i—i—i— 1.0 1.5 2.0 2.S Концентрация, мМ

10000

3.0

Рис. 7. (А) Зависимость величины ЭО сигнала суспензии клеток Р. риИс!а С-11 от концентрации метафоса (+ контроль - клетки, инкубированные в дистиллированной воде без добавления субстрата; клетки, инкубированные с субстратом *0,5 мМ, 01,5 мМ, □ 2,0 мМ, • 2,5 мМ, ■ 3,0 мМ, О 3,5 мм, ▲ 5,0 мМ)

(Б) зависимость значений б0ВК0НТр0Ш>-50Ц}и:пер1МСНТ на частоте 30 кГц от концентрации метафоса

6000

"Т-' ''"""I ■

100 1000 Частота, кГц

1600

Е в = Ё. В

5 Ё Э 1200Т w

800-

400

10000

н—■—;—■—i—1—i—1—i—'—i 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Концентрация, мМ

Рис. 8. (А) Зависимость величины ЭО сигнала суспензии клеток Р. pulida С-11 от концентрации сумитиона (+ контроль - клетки, инкубированные в дистиллированной воде без добавления субстрата; клетки, инкубированные с субстратом 0 0,5 мМ, ♦ 1,5 мМ, □ 2,0 мМ, ■ 2,5 мМ, О 3,0 мм, Д 3,5 мМ, • 4,0 мМ, ▲ 5,0 мМ)

(Б) зависимость значений 50DKoHTpo.ib-SOD3kcnepKMCHT на частоте 10 кГц от концентрации сумитиона

В связи с тем, что микробные клетки изучаемых штаммов обладали способностью утилизировать фосфорорганические нитроароматические соединения в аэробных условиях, нами использован метод определения специфической респираторной активности (CPA) микробных клеток для регистрации фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона.

Культивируя микроорганизмы в специальных средах и анализируя их респираторную активность, нами была выявлена зависимость респираторного ответа клеток от концентрации метафоса и сумитиона. Зависимость CPA клеток P. putida С-11 и P. putida Б А-11 имела линейный характер в диапазоне концентраций метафоса 0,5-3,0 мМ и сумитиона в пределах 0,5-3,5 мМ для обоих штаммов. Концентрационная зависимость CPA для клеток A. calcoaceticum А-122 по отношению к метафосу имела линейный характер в интервале 0,5-2,0 мМ, для сумитиона - в интервале 0,5-2,5 мМ. Полученные концентрационные зависимости CPA клеток изучаемых штаммов могут быть использованы в качестве калибровочных кривых для определения изучаемых инсектицидов в водных средах.

Иммобилизация микробных клеток является необходимым этапом для создания биосенсорных систем (Сингирцев, 1996). Нами показано, что наиболее предпочтительным методом иммобилизации микробных клеток является метод включения клеток в гель природного полисахарида агар-агара (Игнатов и др., 2001). Поэтому далее была исследована CPA иммобилизованных в геле агар-агаре клеток трех изучаемых штаммов по отношению к метафосу и сумитиону. В результате показано, что линейный диапазон CPA иммобилизованных в геле агар-агаре клеток P. putida С-11 и P. putida БА-11 находился в отношении метафоса в интервале 0,53,0 мМ, а для клеток Л. calcoaceticum А-122 этот интервал составлял 0,5-2,0 мМ, как и для свободных клеток. Линейный диапазон концентрационной зависимости CPA по отношению к сумитиону иммобилизованных, в геле агар-агаре клеток P. putida С-11 и P. putida БА-11 находился в интервале концентраций 0,5-3,5 мМ, а для клеток Л. calcoaceticum А-122 - 0,5-2,5 мМ, т.е. как для свободных клеток.

Установлено, что линейные диапазоны концентрационной зависимости микробных P. putida С-11, P. putida БА-11 и Л. calcoaceticum А-122, полученные с помощью методов ЭО анализа клеточных суспензий и CPA свободных и иммобилизованных клеток трех изучаемых штаммов в отношении препаратов метафоса и сумитиона практически совпадают.

Таким образом, в результате проведенных исследований впервые показана возможность количественного определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона с помощью методов ЭО анализа и CPA микробных клеток, основанных на оценке активности

ферментативных систем . подготовительного метаболизма специально культивируемых микроорганизмов штаммов-деструкторов.

Сравнивая методы ЭО анализа и CPA микробных клеток с традиционными способами определения фосфорорганических инсектицидов (Лурье, 198"), следует указать, что предлагаемые способы характеризуются простотой, быстро! техникой проведения анализа, не требуют дорогостоящего оборудования и сп а иальной подготовки персонала для работы с ним. К тому же применяемые методы детекции исследуемых инсектицидов позволяют проводить определение ферментативной активности нативных клеток в течение короткого времени.

Изучение электрооптических свойств микробных суспензий при de icnteuu на клетки различных ингибиторов метаболической активности

Проведена серия экспериментов по изучению изменений ЭО параметров клеточтк суспензий при метаболизме нетоксичных соединений микробными клетками и ингибировании их ферментативных систем на примере метаболизма глюкозы. В качестве модельного объекта исследований использованы клетки Escherichia coli К-12, поскольку метаболизм глюкозы у этого микроорганизма хорошо изучен и описаны многие ферментные системы, катализирующие внутриклеточные реакции (Ленинджер, 1985, Готтшашс, 1985).

При изучении влияния глюкозы на ЭО свойства клеточной суспензии Е. coli было установлено, что ОС бактериальных клеток изменяются через 5 мин после внесения субстрата в суспензию, что, вероятно, связано с активностью ферментативных процессов, происходящих в микробных клетках под действием субстрата. Для подтверждения высказанного предположения использовали ингибиторы ферментов. Сущность данного подхода состояла в нарушении нормальной метаболической активности клеток Е. coli К-12 путем воздействия различных ингибиторов и проведении сравнительных измерений ЭО параметров клеточных суспензий после добавления субстрата. В экспериментах были использованы классические ингибиторы азид натрия и карбонилцианид-3-хлорфенилгидразон (КЦХФ), и разобщающий агент процессов окисления НАДН2 и фосфорилирования АДФ - 2,4-динитрофенол (2,4-ДНФ). Выбор данных соединений обусловлен тем, что хорошо описано их воздействие на микробные клетки Е. coli (Готтшалк, 1985; Уэбб, 1966).

Нами проводилась оценка влияния метаболизма глюкозы на изменения ЭО параметров суспензии клеток Е. coli К-12 при действии химических ингибиторов азида натрия и КЦХФ, и разобщителя - 2,4-ДНФ, а также при воздействии физико-химических факторов, таких как температура и pH.

В результате было показано, что после обработки клеток азидом натрия, КЦХФ и 2,4-ДНФ происходит уменьшение величины ЭО сигнала по сравнению с контролем (клетки, не обработанные ингибитором). После добавления глюкозы к суспензии

клеток, обработанной ингибиторами, ОС клеточных суспензии' практически не изменялись, в отличие от контрольных экспериментов с клетками, не обработанными ингибиторами. Поскольку азид натрия, КЦХФ и 2,4-ДНФ являются ингибиторами дыхания, в качестве независимого контроля полученных данных нами использована респираторная активность клеток Е. coli штамма К-12 по отношению к глюкозе после действия азида натрия, КЦХФ и 2,4-ДНФ. В результате установлено, что после воздействия ингибиторов респираторная активность клеток в отношении глюкозы значительно снижалась в отличие от контрольных экспериментов с клетками, не обработанными ингибиторами.

При изучении влияния pH и температуры на ЭО характеристики микробной суспензии К coli К-12 при метаболизме глюкозы в качестве независимого контроля ферментативной активности клеток был использован метод определения CPA клеток по отношению к глюкозе при различных значениях pH и температуры. В результате показано, что в фосфатном буфере при pH 7,0 клетки проявляли высокую респираторную активность по отношению к глюкозе. При изучении влияния температуры на ЭО параметры микробной суспензии клеток К coli штамма К-12 было показано, что оптимумом для проявления клетками максимальной ферментативной активности в отношении глюкозы является 30+1 °С.

Таким образом, использование ЭО анализа клеточных суспензий для оценки влияния ингибиторов химической природы, а так же физико-химических факторов (температура и pH) на микробный обмен является достаточно перспективным направлением в дальнейших исследованиях клеточного метаболизма.

Изучение электрооптических свойств микробных суспензий при действии антибиотиков на клетки

Исследование взаимодействия клеток с различными лекарственными веществами, в том числе с антибиотиками, имеет важное значение в познании особенностей микробного метаболизма. При воздействии антибиотиков на чувствительные микроорганизмы наблюдаются, как известно, изменения морфологии клеток, биохимических процессов и путей обмена (Ланчини, Паренти, 1985; Маршелл, 1981; Бриан, 1984). Это может приводить к изменению ЭО параметров микробных клеток. Полагаем, что оценка изменений клеточной стенки в результате воздействия на них антибиотиков с помощью ЭО анализа клеточных суспензий может служить показателем чувствительности микробных клеток к исследуемому антибиотику. В работе был использован ряд антибиотиков (ампициллин, хлорамфеникол, канамицин и тетрациклин) с различными механизмами воздействия на, микробные клетки. Поскольку выбранные антибиотики обладали широким спектром действия и активны в отношении ряда грамотрицательных бактерий, в качестве модельного объекта исследования

использовали микробные клетки Е. coli. Идея экспериментов заключалась в сравнительном исследовании ЭО свойств микробных клеток, различающихся по устойчивости к изучаемому объекту, при воздействии антибиотиков, а также при модификаций антибиотикочувствительного штамма в антибиотикорезистентный

Рис. 9. Схема проведения экспериментов при изучении влияния антибиотиков на ЭО параметры микробных клеток Е. coli

Нами проводились эксперименты по изучению влияния ампициллина на ЭО параметры микробных клеток. Ампициллин относится к группе ß-лактамных антибиотиков, механизм его действия связан с нарушением синтеза пептидогликана [Бриан, 1984; Сазыкин, Навашин, 1991]. Активность ß-лактамных антибиотиков в значительной степени определяется их способностью взаимодействовать с клеточной поверхностью и изменять барьерные свойства цитоплазматической мембраны [Бриан, 1984].

Изучалось изменение ЭО параметров микробных клеток Е. coli чувствительного штамма К-12 и резистентного штамма К-12 pUC-18 к ампициллину при воздействии разных концентраций антибиотика (25, 50, 75, 100, 150 и 250 мкг/мл). В результате было установлено, что изменения в ОС суспензий клеток Е. coli К-12 при воздействии различных концентраций ампициллина имели место на первых пяти частотах электрического поля (10-1000 кГц). На более высоких частотах существенных изменений не отмечено. Для удобства представления экспериментальных данных была использована величина ЭО сигнала при частоте ориентирующего поля 52 кГц. Как видно из представленных данных (рис. 10), максимальное изменение величины ЭО сигнала происходило при концентрации ампициллина 50 мкг/мл.

Для контроля чувствительности клеток Е. coli К-12 к ампициллину проводился их посев на питательную среду LB с ампициллином (50 мкг/мл), при этом роста клеток не наблюдалось.

150 250 Концентрация, мкг/мл

Рис. 10. Динамика изменения величины ЭО сигнала при частоте ориентирующего поля 52 кГц суспензий клеток Е. coli К-12 при действии разных концентраций ампициллина

При изучении изменений ЭО параметров суспензий клеток антибиотикустойчивого штамма Е. coli К-12 pUC-18 при воздействии разных концентраций ампициллина было показано, что существенных изменений ОС клеточной суспензии не происходило, что можно считать проявлением устойчивости данного штамма к действию ампициллина. Контроль устойчивости клеток Е. coli К-12 pUC-18 к ампициллину проводился при посеве на питательную среду LB с ампициллином (50 мкг/мл), при этом рост клеток наблюдался.

Следовательно, зависимость ЭО эффекта клеток при действии ампициллина значительно отличалась для чувствительных и резистентных штаммов Е. coli.

Нами проведены исследования ЭО параметров клеток чувствительного к ампициллину штамма Е. coli XL-1, при действии ампициллина, а также после его плазмидной модификации в антибиотикорезистентный штамм (рис. 9). Выбор клеток Е. coli штамма XL-1 обусловлен тем, что, он является близкородственным к клеткам Е. coli К-12.

При оценке влияния ампицилллина на ЭО параметры микробных клеток Е. coli XL-1 было показано, что происходит значительное изменение величины ЭО сигнала (рис. 11) после инкубации клеток с антибиотиком.

Согласно литературным данным, механизм устойчивости микробных клеток к ампициллину обусловлен наличием у антибиотикорезистентных микроорганизмов специализированных ферментативных систем с различной

§2500 -52000 -a'isoo -

с 1000 4

10 100 1000 10000 Частота, кГц

Рис.11. Динамика изменения величины ЭО сигнала суспензии клеток Е, coli XL-1 при действии ампициллина (50 мкг/мл): 1 - без добавления ампициллина (контроль). Клетки с добавлением антибиотика: 2 - экспозиция 5 мин; 3-15 мин; 4 - 30 мин; 5 - 60 мин; 6 - 150 мин

субстратной специфичностью, объединяемых под названием "беталактамазы" (Навашин, Фомина, 1982; Навашин, 1991; Сазыкин, Навашин, 1991). У грамотрицательных бактерий они сосредоточены в цитоплазматической мембране и периплазматическом пространстве. Генетическая информация о синтезе ß-лактамаз может содержаться в плазмидах или эписомах и может передаваться от клетки к клетке, что объясняет распространение устойчивости (Сазыкин, Навашин, 1991). Полагаем, что ЭО свойства микробных суспензий при действии ß-лактамных антибиотиков у чувствительных и резистентных штаммов могут коррелировать с наличием плазмид устойчивости к данным антибиотикам, кодирующих продукцию ß-лактамаз. В связи с этим нами проводилась трансфекция клеток ампициллинчувствительного штамма Е. coli XL-1 плазмидой pHENl, несущей на себе ген устойчивости к ампициллину. На следующем этапе проводились исследования изменений ЭО параметров клеточной суспензии Е. coli XL-1 pHENl при действии ампициллина. В результате исследований было показано (рис. 12), что значительных изменений ЭО параметров микробных клеток Е. coli XL-1 pHENl при воздействии на них ампициллина не происходило, что отражает приобретение штаммом резистентности к ампициллину.

Для контроля чувствительности и устойчивости клеток Е. coli XL-1 и Е. coli XL-1 pHENl к ампициллину проводился их посев на питательную среду LB с ампициллином (50 мкг/мл). Было показано отсутствие роста культуры клеток Е. coli XL-1, но наблюдался интенсивный рост культуры клеток Е. coli XL-1 pHEN 1.

Частота, кГц

Рис. 12. Динамика изменения ориентационных спектров суспензий клеток Е. coli XL-1 pHENl при действии ампициллина (50 мкг/мл): 1 - без добавления ампициллина (контроль). Клетки с добавлением антибиотика: 2 - экспозиция 5 мин; 3-15 мин; 4-30 мин; 5-60 мин; 6-150 мин

Сравнивая результаты экспериментов по исследованию изменений ЭО параметров клеток чувствительного к ампициллину штамма Е. coli XL-1 и изменение ЭО параметров клеточной суспензии при его плазмидной модификации в антибиотикорезистентный штамм Е. coli XL-1 pHENl выявлена четкая закономерность изменений величины ЭО сигнала для клеток чувствительного штамма. Полученные результаты позволяют полагать, что ЭО свойства микробных суспензий при действии ß-лактамных антибиотиков на чувствительные и резистентные штаммы коррелируют с наличием у них плазмид устойчивости к данным антибиотикам, кодирующих продукцию ß-лактамаз.

Особый интерес, с нашей точки зрения, представляет использование метода ЭО анализа клеточных суспензий при воздействии на них хлорамфеникола, являющегося ингибитором белкового синтеза и обладающего бактериостатическим эффектом воздействия на микробные клетки. Основной механизм действия хлорамфеникола связан с нарушением синтеза на стадии переноса аминокислот от аминоацил-тРНК на рибосомы. Считается, что хлорамфеникол, связываясь с SOS-субъединицей рибосом, инактивирует пептидилтрансферазную реакцию, катализирующую образование пептидной связи в рибосомной системе белкового синтеза (Навашин, Фомина, 1982; Ланчини, Паренти, 1985; Спирин, 1986). При изучении влияния хлорамфеникола на ЭО параметры клеточных суспензий проводились сравнительные исследования изменений ЭО параметров микробных клеток Е. coli: чувствительного К-12 и устойчивого pBR325 штаммов при воздействии хлорамфеникола. Поскольку максимальные изменения ОС суспензий клеток при действии хлорамфеникола

имели место на первых пяти частотах ориентирующего электрического поля в области от 10 до 1000 кГц, для удобства представления экспериментальных данных была использована величина S0DK0HTTlonb-5OD3Kcnep„MCHT при' частоте ориентирующего поля 52 кГц. При сравнении результатов изме~ ений ЭО параметров клеток чувствительного Е. coli К-12 и устойчивого Е. coli pBR.325 к хлорамфениколу штаммов (рис. 13) видно, что у клеток Е. coli К-12 при воздействии антибиотика происходит постепенное увеличение величины ЭО сигнала с увеличением концентрации антибиотика, которое достигало мак гимума при концентрации хлорамфеникола 35 мкг/мл.

4000 т

= 3500 ■

§ 3000 ■

3 2500 ■

4 2000 ■

g 1500-

р 1000 -

о .

Ч 500-

ю d « i i i i i i i i i т i С5 "Л fl -О И -т 1/3 о о о

« N Ift t

Концентрация, мкг/мл

Рис. 13. Изменения величины ЭО сигнала бООК0НТр0ль-5ООЭКСГМрИМснт при частоте ориентирующего поля 52 кГц суспензии клеток Е. coli К-12 (1) и суспензии клеток Е. coli pBR325 (2), в зависимости от концентрации хлорамфеникола

У микробных клеток Е. coli pBR-325 существенных изменений ЭО параметров суспензии после воздействия хлорамфеникола не наблюдалось. Это позволяет предположить, что изменения ЭО параметров клеточных суспензий при действии хлорамфеникола у клеток резистентных штаммов связаны с продукцией специфического фермента (ацетилтрансферазы), инактивирующего антибиотик (Навашин и Фомина, 1982; Ланчини и Паренти, 1986).

Количественной оценкой изменений величины ЭО сигнала может являться определение числа жизнеспособных клеток. Нами проводились контрольные эксперименты определения жизнеспособности микробных клеток стандартным методом подсчета колоний (Методы общей бактериологии, 1984; Луста, Фихте, 1990) клеток после их обработки используемыми концентрациями хлорамфеникола. В результате проведенных исследований было показано, что после обработки клеток чувствительного штамма Е. coli К-12 хлорамфениколом в концентрации 35 мкг/мл количество жизнеспособных колоний сократилось почти в 4 раза; при увеличении концентрации антибиотика до 50 мкг/мл количество

жизнеспособных колоний сократилось почти в 25 раз; при внесении 70 мкг/мл количество жизнеспособных колоний сократилось почти в 60 раз по сравнению с контролем, а при концентрации 140 мкг/мл вырастали единичные жизнеспособные колонии. При определении количества жизнеспособных клеток £. со// pBR-325 после их предварительной обработки хлорамфениколом в концентрациях 35 мкг/мл и 50 мкг/мл количество жизнеспособных колоний практически не изменилось. Однако, при использовании высоких концентраций хлорамфеникола (70 мкг/мл и 140 мкг/мл) количество жизнеспособных колоний уменьшалось в 1,5 и 3 раза по сравнению с контролем.

Одновременно были проведены эксперименты для определения вклада возможных осмотических явлений на изменение ЭО параметров суспензий клеток всех изучаемых штаммов Е. coli. В результате было показано, что значительных изменений в ОС бактериальных суспензий при инкубации в дистиллированной воде не выявлено.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно сделать вывод, что зависимость ЭО эффекта клеток при действии антибиотиков с разными механизмами воздействия на микробные клетки - ампициллина и хлорамфеникола -значительно отличается для клеток чувствительных и резистентных штаммов Е. coli. Считаем, что это направление исследований имеет значительный потенциал и может привести к созданию нового подхода для экспрессного определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. В отличие от стандартных методов определения чувствительности бактерий к действию антибиотиков, использование метода ЭО анализа имеет ряд преимуществ, к которым относятся быстрота получения результата, относительная простота анализа и возможность проведения анализа минимальных объемов.

Для предупреждения возникновения устойчивых форм микроорганизмов и повышения эффективности антибиотикотерапии могут быть применимы одновременно два и более антибиотика (Маршелл, 1981). При одновременном применении нескольких антибиотиков могут наблюдаться 4 формы действия используемых комбинаций в отношении микроорганизмов: индифферентная, аддитивная, синергидная и антагонистическая.

Особый интерес, с нашей точки зрения, представляет использование метода ЭО анализа клеточных суспензий при синергидном действии антибиотиков на микробные клетки, поскольку синергизм предполагает, что антимикробное действие комбинации препаратов сильнее суммы эффектов каждого компонента в отдельности (Маршелл, 1981).

Поскольку имеются данные об усилении антибактериального эффекта канамицина при сочетанном применении с тетерациклином (Егоров, 1986), в наших исследованиях изучалось изменение ЭО параметров клеточной суспензии

E. coli штамма К-12 при одновременном действии канамицина и тетерациклина. Схема экспериментов включала следующие этапы:

1;. Изучение ЭО параметров клеточной суспензии Е. coli при действии канамицина.

2. Изучение ЭО параметров клеточной суспензии Е. coli при действии тетерациклина.

3. Изучение ЭО параметров клеточной суспензии Е. coli при одновременном действии канамицина и тетерациклина

Канамицин и тетрациклин являются ингибиторами белкового синтеза (Егоров, 1986). Канамицин относится к аминогликозидным антибиотикам группы олигосахаридов. Основной механизм его действия связан с нарушением белкового синтеза на стадии переноса аминокислот от аминоацил-тРНК на рибосомы (Спирин, 1986).

Нами изучена динамика изменений ЭО параметров микробных клеток Е. coli К-12 при действии канамицина в концентрациях 5 и 10 мкг/мл. Выбор данных концентраций антибиотика обусловлен минимальной подавляющей концентрацией (МПК) канамицина в отношении клеток Е. coli [Навашин, Фомина, 1982; Егоров, 1986].

В результате было показано, что при использовании малых концентраций антибиотика (5 мкг/мл) значительных изменений ОС суспензии клеток Е. coli К-12 не наблюдалось (рис. 14).

4000 и

а 3500-

100

1000

10000

Частота, кГц

Рис. 14. Динамика изменений ОС суспензии клеток Е. coli К-12 при действии канамицина (5 мкг/мл): 1 - клетки без добавления канамицина (контроль); (2) — экспозиция 5 мин; (3) — 15 мин; (4) -30 мин; (5)-60 мин; (6) - 150 мин

Для дополнительного контроля чувствительности клеток Е. coli К-12 к канамицину проводился их посев на питательную среду LB с канамицином (5 и 10 мкг/мл). Культуру клеток инкубировали при постоянной температуре 30 СС в течение суток. На чашках со средой LB при добавлении канамицина до концентрации 5 мкг/мл наблюдался рост культуры, при концентрации канамицина 10 мкг/мл рост клеток не наблюдался.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что канамицин в концентрации 5 мкг/мл не действует на микробные клетки Е. coli К-12 и в последующих экспериментах по изучению синергитического действия антибиотиков использовался канамицина в концентрации 5 мкг/мл.

Проведены также эксперименты по изучению изменений ЭО параметров микробных клеток Е. coli К-12 при действии тетрациклина. Механизм действия тетрациклина обусловлен ингибированием связывания аминоацил-тРНК с А местом рибосомы на 30S рибосомной субъединице (Егоров, 1986, Сазыкин, Навашин, 1991). Минимальная подавляющая концентрация тетрациклина для большинства штаммов Е. coli колеблется в пределах 1-25 мкг/мл (Сазыкин, Навашин, 1991), поэтому в наших экспериментах изучалась динамика изменений ЭО параметров клеток Е. coli К-12 при действии тетрациклина в концентрациях 1,7 мкг/мл и 5,0 мкг/мл. В результате исследований было показано (рис. 15), что при действии используемых концентраций тетрациклина значительных изменений ЭО параметров клеточной суспензии Е. coli К-12 не происходило.

Частота, кГц

Рис. 15. Динамика изменения ОС суспензий клеток Е. coli К-12 при действии тетрациклина (1,7 мкг/мл): (1) — клетки без добавления тетрациклина (контроль); 2 - экспозиция 5 мин; 3 — 15 мин; 4 — 30 мин; 5-60 мин; 6 - 150 мин

Полученные результаты, вероятно, связаны с ограничением проникновения антибиотика внутрь клетки, поскольку внешняя мембрана грамотрицательных бактерий до известной степени может ограничивать проникновение тетрациклина в клетку (Сазыкин, Навашин, 1991). В последующих экспериментах по изучению

синергетического действия антибиотиков использовался тетрациклин в концентрации 1,7 мкг/мл.

Для контроля устойчивости клеток Е. coli К-12 к тетрациклину в используемых концентрациях проведен их посев на питательную q еду LB с тетрациклином (1,7 мкг/мл и 5,0 мкг/мл), при этом в обоих случаях нолюдался рост клеток.

В дальнейшем были проведены эксперименты по оценке изменений ЭО параметров клеток Е. coli К-12 при одновременном действии канамидина и тетрациклина. В этой серии экспериментов использовали канамиьин в концентрации 5 мкг/мл и тетрациклин в концентрации 1,7 мкг/мл, при которых антибиотики не действовали на микробные клетки. Как видно из предстаг ленных данных (рис. 16), при одновременном воздействии канамицина и тетрациклина на микробные клетки наблюдалось значительное изменение величины ЭО сигнала.

g 3500 1

I 3000

£ 2500

5 2000

е;

| 1500

| 1000

® 500

% 0

10 100 1000 10000 Частота, кГц

Рис. 16. Динамика изменения ОС .суспензии клеток Е. coli К-12, при одновременном действии канамицина (5 мкг/мл) и тетрациклина (1,7мкг/мл): (1) - клетки без добавления антибиотиков (контроль); 2 - экспозиция 5 мин; 3-15 мин; 4 - 30 мин; 5 - 60 мин; 6 - 150 мин

Для контроля полученных результатов проводился посев клеток Е. coli К-12 на питательную среду LB, содержащую канамицин (5 мкг/мл) и тетрациклин (1,7 мкг/мл). Рост микробных клеток на среде данного состава не наблюдался.

Полученные данные могут быть объяснены синергидным действием использованных антибиотиков, поскольку при совместном применении антибиотиков происходит усиление антимикробного эффекта по сравнению с биологическим действием отдельно взятых препаратов. Кроме того, синергидное действие антибиотиков может проявляться и в случае, если препараты способны одновременно поражать важные реакции метаболизма клетки (в наших экспериментах использовались антибиотики ингибиторы белкового синтеза).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности использования метода ЭО анализа для регистрации синергетического антимикробного действия антибиотиков.

Определение микробных клеток с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий при специфическом взаимодействии микроорганизмов с биоселективными агентами

Обнаружение и идентификация микроорганизмов в окружающей среде является одной из актуальных проблем современной биотехнологии (Walt, Franz, 2000; Deisingh, Thompson, 2002). Широкое распространение получили методы идентификации микроорганизмов при помощи биосенсорных систем с использованием антител (At) (Gascoyne et al., 1997; Vaughan et al., 2001).

Наряду с использованием At для определения микроорганизмов могут быть использованы бактериофаги, обладающие определенной селективностью взаимодействия с клеточной поверхностью (Kristensen, Winter, 1998; Sieber, 1998).

ЭО свойства клеток после их взаимодействия с биоселективными агентами -антителами и бактериофагами могут меняться, что позволит определять присутствие микробных клеток в исследуемом образце и применить ЭО анализ для определения бактерий.

Схема экспериментов включала в себя следующие этапы:

1. Исследование изменений ЭО параметров клеточной суспензии вакцинного штамма Listeria monocytogenes при взаимодействии с моноклональными антителами (мАт).

2. Исследование изменений ЭО параметров клеточной суспензии Azospiriilum brasilense Sp7 при взаимодействии с поликлональными антителами.

3. Исследование изменений ЭО параметров клеточной суспензии Escherichia coli XL-1 при их инфицировании умеренным бактериофагом М13К07.

Первоначально проводились эксперименты по изучению изменений ЭО параметров клеточной суспензии вакцинного штамма Listeria monocytogenes при взаимодействии с мАт. Исследования проводились в лаборатории физико-химических методов исследования клеток Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (г. Оболенск, Московская область). Для контроля специфичности мАт проводилась электронно-микроскопическая идентификация взаимодействия клеток L. monocytogenes со специфичными мАт, меченными коллоидным золотом (рис. 17).

После оптимизации условий анализа проводилась регистрация изменений ЭО параметров суспензии листерий при взаимодействии с различными концентрациями мАт.

Рис. 17. Электронная микроскопия взаимодействия клеток Listeria monocytogenes и специфичных мАт, меченных коллоидным золотом (увеличение 10 ООО)

В результате было показано, что в исследуемом диапазоне частот от 10 до 500 кГц происходило снижение величины ЭО сигнала после взаимодействия со специфическими мАт, причем максимальные изменения ЭО свойств клеточной суспензии происходили при частоте ориентирующего поля 10 и 100 кГц (рис. 18).

10 100 1000 Частота, кГц

Рис. 18. Зависимость величины ЭО сигнала суспензии клеток L. monocytogenes от концентрации мАт: 1 - клетки без внесения мАт (контроль). Клетки, инкубированные с мАт: 2 - 0,475мкг/мл; 3 — 1,425 мкг/мл; 4-1,9 мкг/мл; 5 - 2,3 мкг/мл; б - 4,75 мкг/мл; 7-7,1 мкг/мл; 8 - 9,5 мкг/мл

В качестве контроля использовалась суспензия клеток, инкубированная без добавления мАт. Таким образом, регистрируя соответствующие изменения ЭО параметров клеточной суспензии L. monocytogenes после взаимодействия с антителами можно судить о взаимодействии специфических мАт с клеточной поверхностью листерий.

Одним из важных моментов в разработке данного метода определения микробных клеток является получение аналитического сигнала в присутствии мешающих факторов и, прежде всего, в присутствии посторонней микрофлоры. Поэтому нами исследовались ЭО параметры клеточной суспензии листерий при взаимодействии с мАт, специфичными к клеткам листерий, в присутствии клеток Е. coli К-12 и A. brasilense Sp7. Выбор данных культур обусловлен сходством их формы с клетками листерии (палочки). Проведенными исследованиями установлено, что при внесении в суспензию клеток L. monocytogenes клеток других штаммов (Е. coli К-12 и A. brasilense Sp7) и инкубации со специфичными к листериям мАт, происходит снижение величины ЭО сигнала, но, главное, возможна индикация клеток L. monocytogenes (рис. 19).

Рис. 19. Зависимость величины ЭО сигнала смешанной суспензии клеток (L. monocytogenes, A. brasilense, Е. coli К-12) от концентрации мАт: 1 - клетки без внесения мАт (контроль); 2-е внесением мАт - 0,475 мкг/мл мАт; 3 - 1,425 мкг/мл мАт; 4-1,9 мкг/мл мАт; 5 - 2,3 мкг/мл мАт

Дополнительно проводились контрольные эксперименты по изучению возможности неспецифического взаимодействия мАт, специфичных к L. monocytogenes, с клетками Е. coli К-12 и A. brasilense Sp7. В результате было установлено, что в суспензиях клеток Е. coli К-12 и A. brasilense Sp7 не происходило изменений ЭО параметров при действии на них мАт, специфичных к клетками листерий.

Проведенными экспериментами установлено, что ЭО свойства клеток L. monocytogenes меняются при взаимодействии со специфичными мАт. Показано, что в присутствии посторонних культур клеток Е. coli К-12 и A. brasilense Sp7, возможна индикация клеток листерии в смешанной суспензии с использованием мАт, специфичных к листериям.

g 1000-sj 500"

100 Частота, кГц

1000

Полагаем, что аналогичные изменения ЭО параметров клеточных суспензий, связанные с изменением электрофизических свойств клеток, после их взаимодействия с моноклональными антителами, могут иметь место и при взаимодействии с поликлональными антителами в клетках других микробных штаммов. Поэтому нами в качестве объекта исследований испо; зовались бактериальные клетки A. brasilense Sp 7 и кроличьи поликлональные штитела (Ат). Схема эксперимента была аналогичной при использовании мАт и клеток листерий. В результате регистрации изменений ЭО параметров кле -очных суспензий A. brasilense Sp 7 при их взаимодействии с разли"ными концентрациями поликлональных антител было показано значительное изменение ЭО параметров клеточной суспензии после их взаимодействия с Ат. Максимальное снижение величины ЭО сигнала суспензии клеток A. brasilense Sp 7 при взаимодействии с поликлональными антителами наблюдались при концентрации Ат 2,2 мкг/мл при частоте ориентирующего поля 10-100 кГц

При изучении ЭО параметров клеточной суспензии A. brasilense Зр7 при взаимодействии с поликлональными Ат в присутствии посторонних культур клеток (Е. coli К-12 и L. monocytogenes) происходило изменение величины ЭО сигнала и достоверная индикация клеток A. brasilense Sp7 в исследуемой суспензии. Более того, были поставлены контрольные эксперименты по изучению возможности неспецифического взаимодействия поликлональных антител с клетками Е. coli К-12 и L. monocytogenes. Установлено, что у суспензий клеток Е. coli К-12 и L. monocytogenes изменений ЭО параметров при действии поликлональных Ат не происходило.

Таким образом, на примере клеток L. monocytogenes и A. brasilense Sp 7 представлен новый подход для определения бактерий в чистой культуре и в присутствии посторонней микрофлоры при взаимодействии клеток со специфическими моноклональными и поликлональными антителами с помощью метода ЭО анализа клеточных суспензий.

Наряду с использованием Ат для индикации микроорганизмов могут быть использованы бактериофаги. Специфические бактериофаги являются очень точными индикаторами, определяющими видовую и типовую принадлежность бактерий (Jung et al., 1999; Chatterjee et al., 2000; Summers, 2001). В результате адсорбции фага на поверхности клеток происходит перераспределение белков клеточной поверхности, что может привести к изменениям ЭО параметров микробных суспензий. В качестве модели были использованы микробные клетки Е. coli XL-1 при их взаимодействии с фагом М13К07. Хорошо изучен процесс инфицирования фагом М13 клеток Е. coli, содержащих F-пили (Click, Webster, 1997; 1998; Riechmann, Holiiger, 1997; Deng, 1999).

При исследовании изменений ОС суспензии клеток Е. coli XL-1 в зависимости от количества фагов, внесенных в суспензию, из расчета на 1 бактерию. В результате было показано, что максимальные изменения ОС происходят при инфицировании клеток из расчета 20 фагов на 1 бактерию (рис.

100 1000 10000 Частота, кГц

Рис. 20. Зависимость величины ЭО сигнала суспензии клеток Е. coli XL-1 от количества внесенного фага MI3K07 в расчете на 1 бактерию: 1 - клетки без добавления фагов (контроль); клетки с добавлением фагов: 2-1 фаг; 3-5 фагов; 4—10 фагов; 5 — 20 фагов

Для контроля процесса трансфекции фага в бактериальную клетку Е. coli XL-1 проводили посев клеток после их инфицирования фагом на питательную среду LB с канамицином (25 мкг/мл), поскольку фаг М13К07 несет устойчивость к канамицину (Hoogenboom, 1991). На среде, содержащей канамицин, наблюдался хороший рост клеток, что свидетельствует об устойчивости клеток к канамицину, а также об их инфицировании бактериофагом.

При изучении динамики изменений ОС клеточной суспензии Е. coli XL-1 при инфицировании фагом М13К07 было показано (рис. 21) значительное уменьшение величины ЭО сигнала уже через 10 мин от начала инкубации, что, вероятно, связано с адсорбцией фага на поверхности клетки. Максимальное снижение величины ЭО сигнала происходило через 30 мин от начала инкубации клеток с фагом, а после 60 мин инкубации клеток с фагом, величина ЭО сигнала клеточной суспензии значительно увеличивалась.

Для проверки селективности используемого фага М13К07 в отношении клеток Е. coli XL-1, был и использованы клетки Е. coli BL-Ril и А. brasilense Sp7.

я 12000 -я 100003 8000 -

100

1000 Частота, кГц

10000

Рис. 21. Динамика изменений ОС суспензии клеток Е. coli XL-1 при добавлении фага М13К07 в расчете 20 фагов на 1 бактерию: 1 — клетки без фагов (контроль); 2 - экспозиция 1 мин; 3-10 мин; 4-30 мин; 5-60 мин; 6-90 мин

Выбор клеток Е. coli штамма BL-Ril обусловлен тем, что клетки данного штамма не несут F-эписому и не образуют F- пили, поэтому они не могут быть заражены фагом (Sambrook et al., 1989). Выбор клеток А. brasilense Sp7 в качестве контрольной культуры обусловлен далеким систематическим положением, но обладающим близкими размерами Е. coli XL-1.

В результате проведенных исследований показано, что при взаимодействии клеток Е. coli XL-1 с фагом М13К07 в присутствии клеток Е. coli BL-Ril и А. brasilense Sp7 происходило значительное снижение величины ЭО сигнала. Установлено, что специфические изменения ЭО параметров клеточных суспензий под действием фага М13К07 происходили только у микробных клеток Е. coli штамма XL-1, тогда как у суспензий клеток Е. coli BL-Ri! и А. brasilense Sp7 изменений ЭО параметров под действием фагаМ13К07 не происходило.

Проведен также стандартный микробиологический контроль процесса инфицирования клеток А. brasilense Sp 7 и Е. coli BL-Ril бактериофагом М13К07 с помощью высева бактерий на плотную питательную среду с канамицином (25 мкг/мл). Роста клеток на среде, содержащий канамицин, не наблюдалось, т.е. бактериофаг не инфицировал клетки А. brasilense Sp 7 и Е. coli BL-Ril.

Следовательно, при внесении в суспензию Е. coli XL-1 клеток других штаммов (£. coli BL-Ril и А. brasilense Sp7) и инфицировании суспензии фагом М13К07, возможна индикация клеток Е. coli XL-1.

В результате впервые установлена возможность индикации бактерий при их инфицировании специфическими бактериофагами с помощью метода ЭО анализа клеточных суспензий на примере микробных клеток E.coli XL-1 и бактериофага

М13К07. Доказано использование метода ЭО анализа для определения бактерий при их взаимодействии со специфическими бактериофагами в присутствии посторонней микрофлоры. Данные результаты могут быть использованы для создания экспресс метода индикации микроорганизмов, а также, возможно, для изучения этапов инфицирования клетки бактериофагом.

Таким образом, в результате проведенных исследований показаны возможности использования метода ЭО анализа клеточных суспензий для решения ряда задач прикладной микробиологии и биотехнологии. Преимуществом предлагаемых подходов является возможность анализа нативных клеток без их повреждения и возможность полной автоматизации и стандартизации процесса анализа с ускорением проведения анализа. Данные подходы будут способствовать расширению возможностей применения метода электрооптического анализа клеточных суспензий и служить принципиально новыми направлениями, которые могут найти широкое применение в микробиологической, фармацевтической, биотехнологической промышленностях, медицине и охране окружающей среды.

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлено, что метод электрооптического анализа клеточных суспензий может быть использован для изучения путей метаболизма у клеток микроорганизмов. На примере штаммов микроорганизмов Pseudomonasputida C-l 1, Pseudomonas putida БА-11 и Acinetobacter calcoaceticum А-122, обладающих различными ферментативными системами подготовительного метаболизма пара-нитрофенола (через гидрохинон или 4-нитропирокатехин), показана возможность определения метаболического пути исследуемого соединения у клеток бактерий. Установлена взаимосвязь активности ферментов подготовительного метаболизма низкомолекулярных соединений и изменений электрооптических параметров клеточных суспензий при их метаболизме.

2. Впервые показана возможность определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона в водных растворах с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий, обладающих специализированными ферментативными системами подготовительного метаболизма определяемых соединений. На примере клеток Pseudomonas putida C-ll, Pseudomonas putida БА-11 и Acinetobacter calcoaceticum А-122 представлены данные определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона с помощью измерения ориентационйых спектров микробных суспензий. Установлены изменения электрооптических параметров клеточных суспензий в зависимости от концентрации низкомолекулярного токсичного соединения.

3. Установлено, что ингибирование метаболических процессов в микробных клетках Escherichia coli при катаболизме глюкозы приводит к изменениям электрооптических параметров клеточных суспензий и их респираторной активности, что подтверждает зависимость электрофизических свойств клеток от процессов обмена.

4. Предложен новый подход для определения антибиотикочувстви г-льности микробных клеток с помощью метода электрооптического анализа кл< точных суспензий. Установлено, что изменения электрооптических параметров суспензий клеток при действии антибиотиков, обладающих различным механизмом воздействия на клетку, значительно отличаются у чувствительных и резист гнтных штаммов Е. coli.

5. Установлено, что при действии ампициллина на клетки ампициллинчувствительного штамма Е. coli XL-1 наблюдаются изменения электрооптических параметров клеточных суспензий, однако, при тран :фекции клеток данного штамма ампициллинустойчивой фаговой плазмидой PHEN1 подобных изменений при действии антибиотика не происходит.

6. Впервые установлена возможность использования метода электрооптического анализа микробных клеток для регистрации синергетического антимикробного эффекта антибиотиков. На примере микробных клеток Е. coli изучены изменения электрооптических параметров клеточных суспензий при совместном действии антибиотиков канамицина и тетрациклина.

7. При использовании клеток Listeria monocytogenes и Azospirillum brasilense Sp 7 разработан способ индикации бактерий при взаимодействии клеток со специфическими моноклональными и поликлональными антителами с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий.

8. Впервые представлена возможность индикации бактерий при fix инфицировании специфическими бактериофагами с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий. На примере микробных клеток E.coli XL-1 и бактериофага М13К07 установлена зависимость изменений электрооптических параметров клеточных суспензий при инфицировании бактериофагами от количества внесенного фага и от времени инкубации клеток с фагом. •

9. Установлена возможность использования метода электрооптического анализа для определения бактерий при их взаимодействии со специфическими антителами и бактериофагами в присутствии посторонней микрофлоры.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Измерение электрооптических параметров суспензий клеток в процессе катализа токсичных и нетоксичных соединений может быть использовано в микробиологических производствах для определения метаболической активности микробных клеток.

2. Измерение ориентационных спектров микробных суспензий штаммов, обладающих специализированной ферментативной системой подготовительного метаболизма, предлагается к использованию при контроле загрязненности окружающей среды для определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов (метафоса и сумитиона).

3. По изменению электрооптических параметров клеточных суспензий при действии антибиотиков, обладающими как бактерицидным, так и бактериостатическим эффектом воздействия на микробные клетки, доказывает наличие или отсутствие чувствительности к данному антибиотику у исследуемых клеток. Эти данные могут послужить основой для разработки тест-систем определения чувствительности микробных клеток к антибиотикам для практического использования в медицине и ветеринарии.

4. Изучение электрооптических свойств микробных суспензий при специфическом взаимодействии с моноклональными и поликлональными антителами позволит создать новый тип биосенсорной системы для определения микробных клеток в присутствии посторонней микрофлоры для контроля качества питьевой воды.

5. Регистрация изменений электрофизических свойств микробных клеток при их инфицировании специфическими бактериофагами может быть использовано для разработки нового метода определения бактерий в присутствии посторонней микрофлоры для контроля качества питьевой воды.

6. Изучение динамики изменений электрооптических параметров клеточных суспензий при их инфицировании бактериофагами может быть использовано для изучения этапов фаговой инфекции в научных исследованиях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ignatov О.V., Khorkina N. A, Markina L.N, Tumaikina J.A., Guliy O.I., Bunin V.D., Ignatov V.V. Electro-optical study of the bacterial suspensions at bacterial-metal interactions //Euroconference Bacterial-Metal/Radionuclide Interaction: Basic Research and Bioremediation. Rossendorf/Dresden, Germany, 1998. - P. 11.

2. Ignatov O.V., Khorkina N.A.,Tumaikina J.A., Guliy O.I., Stherbakov A.A., Ignatov V.V. Determination of p-nitrophenol using Acinetobacler calcoaceticum strain

A-122 H 9lh European Congress on Bioîechnology. - Brussels, Belgium, 1999. -ECB9/2941 -B.

3. Ignatov O., Guliy O., Singirtsev L, Stherbakov A. Study of bacteria! strains for détermination of p-nitrophenol and some phosphoorganic pesticides by respiration activity of microbial cells // ISEB 2000. - Kyoto, Japan, 2000. - P. 40.

4. Игнатов O.B., Гулий О.И., Сингирцев И.Н., Щербаков А.А., Игнатов В.В. Определение продукта гидролиза некоторых инсектицидов п-нитрофенола с помощью респираторной активности иммобилизованных микробных клеток // Международная научная конференция "Экологические и гидрометеорологические проблемы больших городов и промышленных зон". -Санкт-Петербург, 2000. - С. 157.

5. Гулий О.И. Использование микробных клеток для определения п-нитрофенола // Материалы всероссийской заочной конференции "Перспективы развития Волжского региона". - Тверь, 2000. - С.80.

6. Гулий О.И., Игнатов О.В., Игнатов В.В., Щербаков А.А.. Определение фосфорорганического нитроароматического инсектицида метафоса с помощью микробных клеток // Материалы международной научно-практической конференции "Проблеми I перспективи очищения та повторного використання води". - Харьков, 2000. - С. 61-62.

7. Гулий О.И., Игнатов О.В., Сингирцев И.Н., Щербаков А.А., Игнатов В.В. Иммобилизация микробных клеток для определения п-нитрофенола и метафоса // Семинар-презентация инновационных научно-технических проектов биотехнологии-2000. - Пущино, 2000. - С. 62-63.

8. Гулий О.И., Игнатов О.В., Сингирцев И.Н., Щербаков АЛ.,Игнатов В.В. Определение инсектицида метафоса с помощью респираторной активности микробных клеток // Семинар-презентация инновационных научно-технических проектов биотехнологии-2000. - Пущино, 2000. - С. 62.

9. Гулий О.И., Игнатов О.В., Щербаков А.А., Игнатов В.В. Способ определения концентрации инсектицида метафоса и продукта гидролиза фосфорорганических нитроароматических инсектицидов пара-нитрофенола в водной среде // Патент РФ №2175352 заявл. 11.05.2000, опубл. 27.10.2001 бюлл. № 30.

10. Гулий О.И. Селективное определение паранитрофенола с помощью респираторной активности клеток Pseudomonas putida БА-11 II Молодые ученые СГАУ им. Н.И.Вавилова - агропромышленному комплексу Поволжского региона: Сборник научных работ СГАУ им. Н.И. Вавилова. - Саратов, 2001. - С. 361-365.

11. Игнатов О.В., Гулий О.И., Сингирцев И.Н., Щербаков А А., Макаров О.Е., Игнатов В.В. Респираторная активность бактерий Acinelobacter calcoaceticum A-122 по отношению к фосфорорганическим нитроароматическим инсектицидам

метафосу и сумитиону // Эколопя довкшля та безпека життед1яльности. - Киев, 2001. -tel.- С. 81-86.

12. Игнатов О.В., Гулий О.И., Сингирцев И.Н., Щербаков A.A., Игнатов В.В. Респираторная активность иммобилизованных клеток Acinetobacter calcoaceticum А-122 при метаболизме п-нитрофенола // Эколопя довюлля та безпека жиггеддяльности. - Киев, 2001. - № 1. - С. 87-92.

13. Гулий О.И., Игнатов О.В., Игнатов В.В., Сингирцев И.Н., Щербаков A.A. Применение микробных клеток для биодетекции фосфорорганических нитроароматичских инсектицидов // Эколопя довкшля та безпека житгед1ялыюсти. -Киев, 2001,-№2.-С. 8-11.

14. Гулий О.И., Игнатов О.В. Биодетекция фосфорорганического нитроароматического инсектицида фенитротиона с помощью микробных клеток Pseudomonas putida С-11 и Pseudomonas pulida БА-11 // Экологизация подготовки специалистов в вузах. Утилизация и переработка отходов: Сборник научных работ. -Саратов, 2001. - С. 65-67.

15. Гулий О.И., Игнатов О.В., Щербаков A.A., Игнатов В.В. Микробные клетки для биосенсорных систем анализа фосфорорганического нитроароматического инсектицида метафоса // 5-я Пущинская конференция молодых ученых "Биология - наука 21 -го века". - Пущино, 2001.-С.218.

16. Гулий О.И., Игнатов О.В., Щербаков A.A., Игнатов В.В. Изучение возможности создания биосенсорной системы на основе микробных клеток для определения инсектицидов Н Материалы всероссийской научной конференции "Фундаментальные и прикладные аспекты функционирования водных экосистем: проблемы и перспективы гидробиологии и ихтиологии в XXI веке". - Саратов, 2001.-С. 45.

17. Гулий О.И., Игнатов О.В., Щербаков A.A., Сингирцев И.Н., Игнатов В.В. Использование респираторной активности микробных клеток Acinetobacter calcoaceticum А-122 для определения инсектицида метафоса // Материалы всероссийской заочной конференции "Перспективы развития Волжского региона". -Тверь, 2001.-С. 85.

18. Гулий О .И., Игнатов О.В., Щербаков A.A., Сингирцев И.Н., Игнатов В.В. Использование бактериальных клеток для биодетекции фосфорорганических нитроароматических инсектицидов // Семинар-презентация инновационных научно-технических проектов биотехнологии-2001. - Пущино, 2001. - С. 112-113.

19. Игнатов О.В., Гулий О.И., Сингирцев И.Н., Щербаков A.A., Макаров O.E., Игнатов В.В. Респираторная активность свободных и иммобилизованных клеток Pseudomonas putida C-l 1 и Pseudomonas putida БА-11 по отношению к п-нитрофенолу и фосфорорганическим нитроароматическим инсектицидам // Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. - Т. 38, № 3. - С. 278-285.

20. Guliy O.I., Ignatov O.V., Shchyogoiev S.Yu., Bunin V.D., Ignatov V.V. Quantitative determination of organophosphorus aromatic nitro insecticides by using electric-field cell orientation in microbial suspensions // Anal. Chem. Acta. - 2002. -V.462, Is. 2.-P. 165-177.

21. Ignatov O.V., Guliy O.I., Shchyogoiev S.Yu., Bunin V.D., Ignatov ' .V. Effect of p-nitrophenol metabolites on microbial-cell electrophysical properties '/ FEMS Microbiol. Lett. - 2002. - V. 214, Is. 1. - P. 81-86.

22. Гулий О.И., Лихачева Е.И., Игнатов O.B. Применение культуры микробных биокатализаторов на основе включенных в агаровый гель клет ж для детекции фосфорорганических инсектицидов метафоса и сумитиона ./ б-я Путинская конференция молодых ученых "Биология — наука 21-го 1ека". -Пущино, 2002. - Том 3. - С. 100.

23. Гулий О.И., Игнатов О.В. Перспективы создания микробных биосенсорных систем для определения токсичных ксенобиотиков в водны < средах Ч Материалы первой региональной конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой".- Саратов, 2002. - С. 4344.

24. Гулий О.И., Лихачева Е.И. Использование электроориентацки клеток Acinetobacter calcoaceticum А-122 для определения инсектицида сумитиона // Материалы всероссийской заочной конференции "Перспективы развития Волжского региона". - Тверь, 2002. - С. 177-178.

25. Игнатов О.В., Гулий О.И., Игнатов В.В. Перспективы использования электроориентации клеток в микробных суспензиях для определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов мегафоса и сумитиона // 2-ая Международная конференция "Экологические и гидрометеорологические проблемы больших городов и промышленных зон". - Санкт-Петербург, 2002. -С.101.

26. Гулий О.И., Игнатов О.В. Определение фосфорорганических нитроароматических инсектицидов и п-нитрофенола с помощью респираторной активности микробных клеток // 2-ая Международная конференция "Экологические и гидрометеорологические проблемы больших городов и промышленных зон". - Санкт-Петербург, 2002. - С. 97.

27. Guliy O.I., Ignatov O.V., Makarov О.Е., Ignatov V.V. Determination of organophosphorus aromatic nitro insecticides and p-nitrophenol by microbial-cell respiratory activity // Biosensors & Bioelectronics. - 2003. - V. 18, Is. 8. - P. 1005-1013.

28. Игнатов O.B., Гулий О.И., Бунин В.Д., Щеголев С.Ю., Игнатов В.В. Микробные биосенсорные системы для определения фосфорорганических инсектицидов // Сборник научных трудов "Высокие технологии - путь к прогрессу". - Саратов, 2003. - С. 114-118.

29. Guliy O.I., Ignatov O.V., Lihacheva E.I., Shchyogolev S.Yu., Bunin V.D., Ignatov V.V. Effect of inhibitors on electro-optical characteristics Escherichia coli K-12 cells at glucose metabolism // Abstract Book of scientific conference "Biotechnology and food 2003",- Zagreb, Croatia. - 2003. - P. 63.

30. Guliy O.I., Ignatov O.V., Lihacheva E.I., Shchyogolev S.Yu., Bunin V.D., Ignatov V.V. New approach for biosensor analysis of low molecular weight compounds // Abstract Book of scientific conference "Biotechnology and food 2003". - Zagreb, Croatia.-2003.-P. 64.

31. Гулий О.И., Игнатов O.B. Действие ингибиторов на электрофизические свойства клеток Escherichia coli К-12 при метаболизме глюкозы // 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука 21-го века". - Пущино,

2003. - С. 97.

32. Guliy O.I., Ignatov O.V., Makarov O.E., Ignatov V.V. Determination of organophosphorus aromatic nitro insecticides and p-nitrophenol by microbial-cell respiratory activity // Abstract Book of scientific conference "Enzymes in the environment: activity ecology and applications 2003". - Prague, Czech Republic, 2003. -P. 147.

33. Ignatov O.V., Guliy O.I., Shchyogolev S.Yu., Bunin V.D., Ignatov V.V. New approach for determination of toxic compounds by electro-orientation in microbial suspensions // Abstract Book of scientific conference "Enzymes in the environment: activity ecology and applications 2003". - Prague, Czech Republic, 2003. - P. 149.

34. Гулий О.И., Маркина JI.H., Игнатов O.B. Влияние ампициллина на электрооптические свойства клеток Escherichia coli II Материалы всероссийской заочной конференции "Перспективы развития Волжского региона". - Тверь, 2003. -

C. 65.

35. Guliy O.I., Ignatov O.V., Shchyogolev S.Yu., Bunin V.D., Ignatov V.V. Effect of inhibitors on electro-optical characteristics of Esherichia coli K-12 cells during glucose metabolism // Current studies of biotechnology. Food. - 2004. - V. III. - P. 139145.

36. Bunin V.D., Ignatov O.V., Guliy O.I., Voloshin A.G., Dykman L.A., O'Neil

D., Ivnitski D. Studies of Listeria monocytogenes-antibody binding using electro-orientation //Biosensors &Bioelectronics. - 2004. -V. 19, Is. 2. - P. 1759-1761.

37. Bunin V.D., Ignatov O.V., Guliy O.I., Zaitseva I.S., O'Neil D., Ivnitski D. Electro-optical analysis of the Escherichia coli-phage interaction // Anal. Biochem. -

2004.-V. 328.-P. 181-186.

38. Ignatov O.V., Guliy O.I., Bunin V.D., Voloshin A.G., O'Neil D., Ivnitski D. Detection of microbial cells with electrooptical analysis // Defense against bioterror: detection technologies, implementation strategies and commercial opportunities / Eds.

D. Morrison, F. Milanovich, D. Ivnitski, T. Austin. - The Netherlands: Springer. 2004. -P. 147-163.

39. Ignatov O.V., Guliy O.I., Bunin V.D. Electro-optical analysis of microbial cells ¡1 Nato Advanced Research Workshop Defense Against Biotterror: detection Technologies, Implementation Strategies and Opportunities. - Madrid, Spain, 2004. -P. 9.

40. Guliy O.l, Ignatov O.V., Markina L.N., Bunin V.D., Ignatov V.V. Effect of arapicillin on the electrophysical characteristics of Escherichia coli П Abstract Book of scientific conference "The 6th Workshop on biosensors and biofnalytical ц-techniques in environmental and clinical analysis". - Rome, Italy, 2004. - MED 02.

41. Ignatov O.V., Guliy O.I, Bunin V.D., Ignatov V.V. Electrophysical analysis of microbial cells and biosensor technology // Abstract Book of scientific "The 6lh Workshop on biosensors and bioanalytical ^-techniques in environmental and clinical analysis". -Rome, Italy, 2004. - ENV 21.

42. Тулий О.И., Игнатов O.B., Бунин В.Д., Игнатов В.В. Изменение электрооптических свойств микробных суспензий при метаболизме токсичных соединений // Материалы 2-ой региональной конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой". - Саратов,

2004. - С. 40.

43. Тулий О.И., Игнатов О.В., Маркина Л.Н., Щеголев С.Ю., Бунин В.Д., Игнатов В.В. Изменение электрофизических свойств клеток Е. coli при действии канамицина и тетрациклина // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2005. - № ] .-С. 3-7.

44. Тулий О.И., Маркина Л.Н., Игнатов О.В., Щеголев С.Ю., Бунин В.Д., Игнатов В.В., Влияние ампициллина на электрофизические свойства клеток Escherichia coli // Микробиология. - 2005. - Т.74, №1. - С. 126-131.

45. Бунин В.Д., Игнатов О.В., Гулий О.И., Зайцева И.С., О'Нейл Д., Ивницкий Д. Исследование электрооптических параметров суспензии клеток Escherichia coli XL-1 при взаимодействии с фагом М13К07 // Микробиология. -

2005. - Т. 74, № 2.-С. 198-203.

46. Бунин В.Д., Игнатов О.В., Гулий О.И., Волошин А.Г., Дыкман Л.А., О'Нейл Д., Ивницкий Д. Исследование электрофизических свойств клеток Listeria monocytogenes при взаимодействии с моноклональными антителами // Биофизика -2005.-Т. 50, Вып. 2. - С. 316-321.

47. Ignatov О.V., Guliy O.I., Bunin V.D., Ignatov V.V. Electrophysical analysis of microbial cells and biosensor technology II Intern. J. Environ. Anal. Chem. - 2005. -V. 85, №9-11.-P. 727-740.

48. Guliy O.I., Ignatov O.V., Markina L.N., Bunin V.D., Ignatov V.V. Action of ampicillin and kanamicin on the electrophysical characteristics of Escherichia coU cells // Intern. J. Environ. Anal. Chem. - 2005. - V. 85, № 12-13. - P. 981-992.

49. Гулий О.И., Игнатов O.B., Бунин В.Д., Игнатов В.В. Изменение электрооптических свойств микробных суспензий при метаболизме токсичных соединений: Сб. статей молодых ученых. - Саратов, 2005. - С. 124-131.

50. Гулий О.И. Изучение электрофизических свойств микробных клеток Escherichia coli для определения эффективности комбинированного действия антибиотиков канамицина и тетрациклина // 9-я Путинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука 21-го века". - Пущино, 2005. - С. 344.

51. Игнатов О.В., Гулий О.И. Исследование электрофизических свойств микроорганизмов // Материалы всероссийской конференции "Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты". - Саратов, 2005. - С. 77.

52. Гулий О.И., Игнатов О.В., Маркина Л.Н. Использование электрооптического анализа клеточной суспензии Escherichia coli для определения антибактериальной активности хлорамфеникола // Материалы всероссийской конференции "Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты". - Саратов, 2005. - С. 84.

53. Guliy O.I., Ignatov O.V., Bunin V.D., Ignatov V.V. Electro-optical properties of microbial suspensions at biodégradation of organophosphorus aromatic nitro insecticides // Abstract book of "13th International biodeterioration and biodégradation symposium". - Madrid, Spain, 2005. - P. 84.

54. Гулий О.И., Игнатов O.B., Использование метода электроориентации клеток в переменном электрическом поле для определения токсичных соединений // Материалы международной конференции "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды". - Саратов, 2005. - С. 127-128.

55. Guliy O.I., Ignatov O.V., Makarov О. Е., Ignatov V. V. Comparision study of the two new approaches for determination of organophosphorus aromatic nitro insecticides in aqueous medium // 4th International Conference instrumental methods of analysis IMA. - Greece, 2005. - P. 499.

56. Ignatov O.V., Guliy O.I., Bunin V.D., Ignatov V. V Perspectives of electrophysical analysis for biosensor technology //4th International Conference instrumental methods of analysis IMA. -Greece, 2005. - P. 500.

Подписано в печать 24.08.2006 Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать RISO. Объем 2,88 печ. л. Тираж 110 экз. Заказ Кг 041.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю.Б. Свидетельство № 3117 410600, Саратов, ул. Московская, д. 152, офис 19, тел. 26-18-19, 51-16-28

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Гулий, Ольга Ивановна

ВВЕДЕНИЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Применение электрофизических методов анализа 19 клеточных суспензий для решения прикладных биологических задач

ГЛАВА 2. Методы определения ферментативной активности 42 целых клеток

ГЛАВА 3. Методы идентификации микроорганизмов в 53 экологическом мониторинге

ГЛАВА 5. Электрофизический анализ клеточных суспензий при 85 метаболизме пара-нитрофенола

ГЛАВА 6. Использование электрооптических свойств клеточных 99 суспензий для разработки микробных биосенсорных систем анализа низкомолекулярных соединений

6.1. Разработка сенсорных систем определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона с помощью электрооптического анализа 102 микробных клеток P. putida С-11, P. putida БА-11 и

A. calcoaceticum А

6.2. Сравнительное исследование электрооптических свойств 121 микробных суспензий и их респираторной активности для определения инсектицидов мегафоса и сумитиона

ГЛАВА 7. Электрофизические свойства микробных клеток Е. coli 134 при метаболизме глюкозы. Ингибирование ферментативной активности клеток при метаболизме глюкозы

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 4. Материалы и методы исследования

7.1. Электрофизические свойства клеток Escherichia coli К-12 при 135 метаболизме глюкозы. Влияние химических ингибиторов на метаболизм глюкозы

7.2. Влияние температуры и рН среды на электрооптические 149 характеристики клеточной суспензии Escherichia coli К-12 при метаболизме глюкозы

ГЛАВА 8. Влияние антибиотиков на электрооптические свойства 156 микробных суспензий Escherichia coli

8.1. Влияние Р-лактамных антибиотиков на электрооптические 159 свойства микробных суспензий E.coli

8.2. Влияние хлдорамфеникола на электрооптические свойства 178 микробных суспензий Е. coli

8.3. Изучение электрофизических свойств микробных клеток 195 Е. coli при комбинированном действии антибиотиков

ГЛАВА 9. Определение микробных клеток с помощью 207 электрооптического анализа клеточных суспензий при специфическом взаимодействии микроорганизмов с биоселективными агентами

9.1. Изучение электрооптических свойств микробных суспензий 208 Listeria monocytogenes при специфическом взаимодействии с моноклональными антителами

9.2. Изучение электрооптических свойств микробных суспензий 221 Azospirillum brasilense Sp7 при взаимодействии с поликлональными антителами

9.3. Изучение электрофизических свойств микробных клегок 234 Е. coli XL-1 при их инфицировании фагом М13К07 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 246 ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ источников

Введение Диссертация по биологии, на тему "Электрооптический анализ микробных суспензий для определения метаболической активности клеток и их детекции"

Актуальность проблемы

Проблема изучения метаболической активности микробных клеюк и их индикации актуальна для различных областей прикладной микробиологии и биотехнологии. Вопросы детекции клеток и определения активности их ферментативных систем тесно взаимосвязаны. Это обусловлено тем, что при детекции микроорганизмов обычно решаются несколько основных вопросов: индикация микроорганизма, определение количества клеток и оценка активности ферментативных систем микроорганизма, чго при определенных условиях може! служить показателем жизнеспособности клеток [Ivnitski et al., 1999]. Вместе с тем, определение метаболической активности микробных клеток может являться и независимой задачей, которая находит свое приложение, как в микробиологических производствах, так и в медицинской микробиологии.

Одними из наиболее удобных подходов для экспрессной оценки морфологических и физиологических параметров клеюк являкнся электрофизические (ЭФ) методы, к которым относится метод ориентации клеток в переменном электрическом поле [Мирошников с соавт., 1986; Бунин, 1996].

Изменения электрофизических свойств клеток при микробном метаболизме могут быть обусловлены несколькими различными процессами, протекающими в кле!ках как по отдельности, так и одновременно. Такими процессами могут являться: транспорт субсфага в клетку, его ферментативная трансформация в клетке, дейс1вие изучаемого соединения на клеточный метаболизм и т.д. Важное значение при данных исследованиях имеют свойства изучаемого соединения, его способность учаавовать в ферментативном катализе у клеток исследуемого микроорганизма, возможное токсическое действие на изучаемые клетки и пр.

Микробная деградация низкомолекулярных токсичных соединений представляет значительный интерес, поскольку лежи1 в основе биотехнологических способов очистки токсичных выбросов и может быib использована для создания биокаталитических технологий синтеза ряда токсичных веществ [Карасевич, 1982]. При этом в большинстве случаев для изучения метаболической активности микробных клеток используют методы, основанные на количественном определении продукта или субстрата ферментативной реакции с использованием меченых соединений, фотометрии, хроматсирафии и т.д. Такие исследования обычно проводят в несколько этапов и характеризуются относительной сложностью анализа, требуют дорогостоящего оборудования и реагентов [Кулис, Разумас, 1986; West, Sparting, 1986; Knowng, Govind, 1994]. Применение электрооптического анализа микробных суспензий позволит не только регистрировать метаболическую активность микроорганизмов, проводить количественное определение соединений, являющихся субстратами ферментативной реакции, но и при определенных условиях проводиib сравнительное изучение путей метаболизма определенных субстратов у бактерий.

Другим аспектом исследований являе1ся изучение электрооптических свойств микробных суспензий при действии на клетки различных ингибиторов метаболической активности. Ингибиторами могут служить вещества, традиционно применяемые в биохимических исследованиях, а также различные антибиотики. Это направление имеет значительный потенциал и может привес!и к созданию нового подхода для экспрессного определения чувс1вительности микроорганизмов к антибиотикам.

Создание методологии для быстрого обнаружения микроорганизмов в окружающей среде является одной из важных проблем современной биотехнологии в связи с существующей опасностью террористических угроз, наличием в окружающей среде возбудителей опасных инфекций и т.д. [Walt, Franz, 2000; Deisingh, Thompson, 2002]. Наиболее часто способность антител (Ат), меченных различными маркерами, образовывать комплекс с соответствующими антигенами используется для решения биосенсорных методов детекции клеток [Keith, 2000; Vaughan, 2001 и др.]. При этом электрофизические методы могут значительно упростшь и облегчить задачу детекции микроорганизмов с помощью моноклональных или поликлональных антител.

Цель работы - развише методологии электрооптического анализа микробных суспензий для определения метаболической акжвности клеток и их детекции.

Задачи исследования

2. Сравнительное изучение путей метаболизма гоксичных низкомолекулярных соединений у микроорганизмов, обладающих специализированной ферментативной системой подготовительною метаболизма, с помощью электрооптического анализа клеточных суспензий.

3 Создание нового метода определения токсичных низкомолекулярных соединений на основе измерения электрофизических свойств микробных клеток, обладающих специализированной ферментативной системой подготовительного метаболизма.

5. Развитие методических подходов определения антибиотикочувствительности микробных клеток с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий па примере (3-лактамных, аминогликозидных антибиотиков, тетрациклина и хлорамфеникола. Изучение синергетического антимикробного эффекта антибиотиков на примере канамицина и гетрациклина с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий.

7. Изучение возможности определения бактерий при их инфицировании специфическими бактериофагами с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий. Изучение зависимости изменений электрооптических параметров клеточных суспензий Е. coliXL-1 при их инфицировании бактериофагом М13К07.

Научная новизна работы

Впервые показана возможность использования электроопгического анализа суспензий клеток для сравнительного изучения пуiей метаболизма низкомолекулярных соединений на примере метаболизма пара-нитрофенола (ПНФ). Нами установлено, что электрофизические свойства микробных клеток, способных утилизировать ПНФ, значительно изменяются в процессе метаболизма этого соединения. Установлена взаимосвязь активности ферментов подготовительного метаболизма низкомолекулярных соединений и изменений элекфооптических параметров клеточных суспензий при их метаболизме. Установлено, что ингибирование метаболических процессов в микробных клетках Е coli при метаболизме глюкозы приводит к изменениям электрооптических параметров клеточных суспензий и их респираторной активности, что подтверждает зависимость электрофизических свойств клеток от процессов метаболизма.

Впервые проведено определение фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона в водных растворах с помощью измерения ориентационных спектров микробных суспензий клеток штаммов, обладающих специализированной ферментативной системой подготовительного метаболизма этих соединений. Установлена зависимость изменений электрофизических свойств микроорганизмов от процессов метаболизма низкомолекулярных токсичных соединений и концентрации субстрата.

Впервые предложен способ определения чувс1вительности микробных клеток к действию (З-лактамных, аминогликозидных антибиотиков, тетрациклина и хлорамфеникола с помощью меюда электрооптического анализа клеточных суспензий. Нами установлено, что электрооптические свойства микробных суспензий при действии (3-лактамных антибиотиков у чувствительных и резистентных штаммов

E coli коррелируют с наличием плазмид устойчивости к данным антибиотикам. Исследованы изменения электрооптических параметров клеточных суспензий при воздействии на них антибиотиков, являющихся ингибиторами белкового синтеза и обладающими как бактерицидным, так и бактериосташческим эффектом воздействия на микробные клетки. Изучены изменения электрооптических параметров клеточных суспензий при совместном действии канамицина и тетрациклина. Показана возможность изучения синергидного действия антибиотиков на микробные клетки с помощью метода электроонтического анализа клеточных суспензий.

Впервые показана возможность определения бактерий, инфицированных специфическими бактериофагами, с помощью регистрации изменений электрофизических свойств микробных клеток. Изучена зависимость изменений электроопгических параметров клеточных суспензий Е. coli XL-1 при инфицировании бактериофагом М13К07 в зависимости от количества внесенного фага и от времени инкубации клеток с фагом. На основании изучения взаимодействия микробных клеток Е. coli XL-1 и колибактериофага М13К07 показана возможность использования электрооптического анализа клеточных суспензий для изучения процесса инфицирования бактериофагом микробных клеток. Показана возможность индикации бактерий при их инфицировании бактериофагом в присутствии посторонней микрофлоры с помощью электрооптического анализа клеточных суспензий.

Практическая значимость

Разработана методология определения метаболической активности микробных клеток в процессе катализа токсичных и нетоксичных соединений в микробных клетках, основанная на измерении электрооптических параметров суспензий клеток.

Предложен новый подход для определения чувствительности микробных клеток к действию антибиотиков на основе измерения электрофизических свойств микробных клеток. Показана возможность использования метода электрооптическою метода анализа микробных клеток для регистрации синергетического антимикробного действия антибиотиков.

Материалы, представленные в диссертации, используются при обучении студентов и аспирантов на кафедре биохимии и биофизики, кафедре микробиологии и физиологии растений биологического факультета, кафедре нелинейной физики Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского, кафедре микробиологии и ветсанэкспергизы, кафедре биотехнологии, органической и биологической химии Саратовского государственного аграрного университет им. Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработан комплекс методических приемов для определения метаболической активности микробных клеток при катаболизме низкомолекулярных соединений с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий. Показана взаимосвязь изменений элекгрооптических параметров клеточных суспензий при метаболизме ряда соединений с активностью ферментов подготовительного метаболизма. Проведено сравнительное изучение электрооптических свойств клеточных суспензий микроорганизмов, обладающих различными ферментативными системами подготовительного метаболизма пара-нирофенола (через гидрохинон или 4-нитропирокатехин).

3. Разработан принцип действия биосепсорной системы для определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона с помощью электрооптического анализа клеточных суспензий, обладающих специализированными фермешативными системами подготовительного метаболизма определяемых соединений.

4. Разработан принцип использования метода электрооптического анализа клеточных суспензий для определения чувстви1ельности микробных клеток к действию антибиотиков, обладающих бак1ерицидным и бактериостатическим эффектом воздействия на микробные клетки. Установлено, что электрооптические свойства микробных суспензий при действии р-лактамных антибиотиков на чувствительные и резистентные штаммы Е coli коррелируют с наличием плазмид устойчивости к данным антибиотикам. Показана возможность использования метода электрооптического анализа микробных клеток для регистрации синергетического антимикробного эффекта антибиотиков.

5. Разработан метод использования электрооптического анализа клеточных суспензий для определения микробных клеюк в водных растворах при их взаимодействии со специфическими моноклональными и поликлональными антителами.

7. Установлена возможность использования электроопгического анализа для индикации бактерий при их взаимодействии с антителами и бактериофагами в присутствии посторонней микрофлоры.

Данная работа получила финансовую поддержку грантов: Президента РФ для молодых докторов наук № 01-04-99421, Международного научно-технического фонда (МНТЦ) проекты 615; 3170 PDG; «Фонда содействия отечественной науке» - 2004-2006 гг.; фонда CRDF грант REC-006 - 2003-2006 гг.; программы «Фундаментальные исследования и высшее образование», грант Y1-P-06-09 - 2003-2006 гг.; про1раммы «Интеграция пауки и высшего образования России на 2002-2006 годы», проект Д4169; Министерства образования и науки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы» подпрограммы "Развитие инфраструктуры научно-технической и инновационной деятельности высшей школы и ее кадрового потенциала, «индивидуальный код» 4198 -2005г.; NATO Collaborated Linkage Grant CBP.NR.NRCLG 981615 - 20052006 гг.; Европейской Академии наук - 2005г.; Федерального агентства по науке и инновациям по приоритетному направлению "Развише инфраструктуры" в рамках ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002-2006 годы по мероприятию 1.9 "Проведение молодыми учеными научных исследований по приоритетным направлениям науки, высоких технологий и образования" контракт № 02.442.11.7153, шифр работы: 2005-РИ-19.0/002/171 - 2005 г.; Президента РФ для молодых кандидатов наук МК-8599.2006.4 - 2006 г.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на всероссийских и международных симпозиумах и конференциях: Euroconference "Bacterial-Material/Radionuclide Interaction", Rossendor/Dresden, Germany, 1998; научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов СГАУ им. Н.И. Вавилова по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы за 1999 год, Саратов, 1999; 9lh European Congress on Biotechnology, Belgium, 1999; всероссийской заочной конференции "Перспективы развития Волжского региона", Тверь, 2000; International Symposium on Environmental Biotechnology 2000, Kyoto Japan, 2000; семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов биотехнологии-2000, Пущино, 2000; международной научной конференции "Экологические и гидрометеорологические проблемы больших городов и промышленных зон", Санкт-Петербург, 2000; научной конференции, посвященной двадцатилетию создания ИБФРМ РАН, Саратов, 2000; международной научно-практической конференции "Проблеми I перспективи очищения та повторного використання води", Харьков, 2000; научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов СГАУ им. Н.И. Вавилова по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы за 2000 год, Саратов, 2001; 5-ой Путинской конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века", Пущино, 2001; всероссийской конференции "Фундаментальные и прикладные аспекш функционирования водных экосисчем: проблемы и перспективы гидробиологии и ихтиологии в XXI веке", Саратов, 2001; всероссийской заочной конференции "Перспективы развижя Волжского региона", Тверь, 2001; семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов биотехнологии-2001, Пущино, 2001; всероссийской конференции «Экологизация подготовки специалистов в вузах. Утилизация и переработка отходов», Саратов, 2001; первой региональной конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой", Саратов, 2002; 6-ой Пущинской конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века", Пущино, 2002; всероссийской заочной конференции "Перспективы развития

Волжского региона", Тверь, 2002; 2-ой международной конференции "Экологические и гидрометеорологические проблемы больших городов и промышленных зон", Санкт-Петербург, 2002; международной конференции "Biotechnology and food 2003", Zagreb, Croatia, 2003; 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века", Пущино, 2003; международной конференции "Enzymes in the environment: activity ecology and applications 2003", Prague, Czech Republic, 2003; отчетной конференции по итогам НИР 2003 года Инстшут биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, 2004; итоговой конференции молодых ученых, аспирантов и студентов НОЦ, Саратов, 2004; международной конференции «The 6th Workshop on biosensors and bioanalytical ji-techniques in environmental and clinical analysis», Rome, Italy, 2004; конференция молодых ученых НОЦ, Саратов, 2005; 9-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века", Пущино, 2005; всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаметальные и прикладные аспекты», Саратов, 2005; международной конференции «13th International biodeterioration and biodegradation symposium», Madrid, Spain, 2005; международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», Саратов, 2005; международной конференции «4th International Conference instrumental methods of analysis IMA », Greece, 2005.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 56 pa6oi, в юм числе получен 1 патент Российской Федерации, 21 статья и 34 тезисов докладов, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 5 глав с изложением результатов работы и их обсуждением, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 363 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 317 страницах компьютерною гекста, включающего 67 рисунков и 4 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Гулий, Ольга Ивановна

275 ВЫВОДЫ

1. Впервые установлено, что метод электрооптического анализа клеточных суспензий может быть использован для изучения путей метаболизма у клеток микроорганизмов. На примере штаммов микроорганизмов Pseudomonas putida С-11, Pseudomonas putida БА-11 и Acinetobacter calcoaceticum А-122, обладающих различными ферментативными системами подготовительною метаболизма пара-нитрофенола (через гидрохинон или 4-нитропирокатехин), показана возможность определения метаболического пути исследуемого соединения у клеток бактерий. Установлена взаимосвязь активности ферментов подготовительного метаболизма низкомолекулярных соединений и изменений электрооптических параметров клеточных суспензий при их метаболизме.

2. Впервые показана возможность определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона в водных расiворах с помощью метода электрооп i ического анализа клеточных суспензий, обладающих специализированными ферментативными системами подготовительного метаболизма определяемых соединений. На примере клеток Pseudomonas putida С-11, Pseudomonas putida БА-11 и Acinetobacter calcoaceticum А-122 представлены данные определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона с помощью измерения ориентационных спектров микробных суспензий. Установлены изменения электрооптических параметров клеточных суспензий в зависимое i и от концен фации низкомолекулярного юксичного соединения.

4. Предложен новый подход для определения ангибиог нечувствительности микробных клеток с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий. Установлено, что изменения электрооптических параметров суспензий клеток при действии антибиотиков, обладающих различным механизмом воздействия на клетку, значительно отличаются у чувствительных и резистентных штаммов Е. coli.

5. Установлено, чю при дейс1вии ампициллина на клетки ампициллинчувствительного штамма Е. coli XL-1 наблюдаются изменения электрооптических параметров клеточных суспензий, однако, при трансфекции клеток данного штамма ампициллинустойчивой фаговой плазмидой PHEN1 подобных изменений при действии антибиотика не происходит.

6. Впервые установлена возможность использования метода электрооптического анализа микробных клеток для ре1истрации сипергетическою антимикробного эффекта антибиотиков. На примере микробных клеток Е. coli изучены изменения электрооптических параметров клеточных суспензий при совместном действии антибиотиков канамицина и тетрациклина.

8. Впервые представлена возможность индикации бактерий при их инфицировании специфическими бактериофагами с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий. На примере микробных клеток E.coli XL-1 и бактериофага М13К07 установлена зависимость изменений электрооптических параметров клеточных суспензий при инфицировании бактериофагами от количества внесенного фага йог времени инкубации клеток с фагом.

9. Установлена возможность использования метода электрооптического анализа для определения бактерий при их взаимодействии со специфическими an г и телами и бактериофагами в присутствии посторонней микрофлоры.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последнее время активно развиваются работы по изучению электрофизических свойств микробных клеток. Основными направлениями этих исследований являлись: создание новой техники для изучения электрофизических свойств клеток, изучение влияния тех или иных физико-химических и физиологических процессов на ЭФ свойства клеток, разработка теоретических моделей поведения клеток в электрическом поле. В последние годы был выполнен ряд работ по изучению влияния процессов метаболизма различных субстратов на электрофизические свойства клеток [Ignatov et al., 2002]. В наших исследованиях использовался электрооптический анализ клеточных суспензий, основанный на регистрации изменений оптических характеристик клеточных суспензий с использованием ориентации клеток в электрическом поле. Основные принципы электрооптического анализа заключаются в следующем. Воздействие внешнего электрического поля на клеточную суспензию вызывает появление на клетках индуцированного дипольного момента, связанного с перераспределением их объемных и поверхностных зарядов. Взаимодействие этого поля с индуцированным (и/или, возможно, с присущим клеткам постоянным) диполем приводит к некоторой упорядоченности в ориентации клеток и, как следствие этого, к изменению оптических свойств в клеточной суспензии (то есть к электрооптическому эффекту). Регистрируя изменение интенсивности рассеянного (или ослабление прямо прошедшего) пучка света, можно количественно охарактеризовать степень пространственной упорядоченности клеток и, в ряде случаев, оценить их электрофизические и морфометрические характеристики [Брезгунов с соавт., 1984].

Основная идея работы заключалась в экспериментальном подтверждении того, что с помощью одного методологического подхода, а именно, электрооптического анализа клеточных суспензий, можно решить как проблему определения метаболической активности клеток, так и их идентификации. Причем эти задачи могут быть решены как по отдельности, так и практически одновременно. Полученные нами экспериментальные данные могут быть использованы для решения различных задач прикладной микробиологии - определение метаболической активности микробных клеток и изучения путей метаболизма, определения низкомолекулярных соединений, изучения взаимодействия клеток с антибиотиками, определения клеток в водных средах.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Гулий, Ольга Ивановна, Саратов

1. Авторское свидетельство СССР № 1096280 C12Q 1/02; C12N 13/00, 1/00 А Способ определения повреждения микроорганизмов / Фомченков

2. B.М., Чугунов В.А., Ажермачев А.К., Бабаева П.Б. Бюл. № 21,1984.

3. Андреев B.C., Баштанов А.В., Воробейников В.М., Матыко Н.А. Экспресс-метод определения сахаролитической активности микроорганизмов // Лаб. дело. 1972. - № 9. - С.554 - 557.

4. Афанасьева О.В. Контроль производства пекарских дрожжей методом люминесцирующих сывороток // Прикладная биохимия и микробиология. 1968. - Т. 4, Вып. 5. - С. 583-586.

5. Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И. Твердофазный иммуноанализ с использованием коллоидного золота в серотипировании азоспирилл // Микробиология. 1991. - Т. 60, Выи. 3.1. C. 524-529.

6. Бакиров Т.С., Чупурнов А.А., Тюников Г.И., Генералов В.М. Исследование изменений электрических характеристик эритроцитов гуся при адсорбции вируса краснухи // Биотехнология. 1997. - № 4. -С. 47-54.

7. Бакиров Т.С., Генералов В.М., Топорко B.C. Измерение поляризации отдельной клетки в неоднородном переменном электрическом поле // Биотехнология. 1998. - № 2. - С. 73-82.

8. Брезгунов В.Н., Бунин В.Д., Попов В.Г. Анализ изменений электрофизических и морфометрических параметров в период роста и споруляции у Bacillus thuringiensis II Микробилолгия. 1984. - Т. 53, № 3. - С. 381 -386.

9. Брезгунов В.Н., Швец Н.В., Бунин В.Д., Волошин А.Г., Светогоров Д.Е., Щепкина А.Н. Определение электрооптическим методом числа неповрежденных бактериальных клеток после экстремальных воздействий // Микробиология. 1985. - Т. 54, Вып. 4. - С. 616-620.

10. Бриан Л.Е. Бактериальная резистентность и чувствительность к химиопрепаратам. М.: Медицина, 1984. - 272 с.

11. Быкова С.П. О применении экспресс-метода для контроля работы биологических очистных сооружений // Оптимизация обращения с отходами производства и потребления: Тез. докл. Всероссийской научно-практической конференции. Ярославль, 2003 - С. 54.

12. Бунин В.Д. Электрооптический анализ клеток и клеточных структур в гетерогенных клеточных суспензиях. Дисс. докт. техн. наук. Москва, 1996.-167 с.

13. Волошин А.Г., Лапыш М.Е., Игнатов С.Г., Бунин В.Д. Применение электрооптического метода для контроля биопрепаратов // Прикладная биохимия и микробиология. -1996. Т. 32, № 6. - С. 669-670.

14. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. М.: Мир, 1985. - С. 40.

15. Гулий О.И. Определение фосфорорганических нитроароматических инсектицидов с помощью респираторной активности микробных клеток. Дисс. канд. биол. наук. Саратов, 2001.-186 с.

16. Даниельсон Бенгт, Мосбах Клаус. Теория и практика колориметрических сенсоров // Биосенсоры: основы и приложения / Ред. Э. Тернер, И. Карубе, Дж. Уилсон.- М.: Мир, 1992. С. 457-487.

17. Дзантиев Б.Б., Егоров A.M. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа // Ж. ВХО им. Менделеева. -1982, Вып. 4. С.442-449.

18. Дыкман Л.А., Богатырев В.А. Коллоидное золото в твердофазных методах анализа// Биохимия. 1997. - Т. 62. - С. 411-418.

19. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М.: Высшая школа, 1986. -448 с.

20. Ефременко В.И., Столбин С.В., Греков Л.И. Биосенсоры и аспекты их использования (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология 1990. -Т. 26,№1.- С. 14-18.

21. Иванов А.Ю., Фомченков В.М. Зависимость повреждающего действия ПАВ на клетки E.coli от фазы роста культуры // Микробиология. 1989. - Т. 58, Вып.6. - С. 969 - 975.

22. Иванов А.Ю., Фомченков В.М Электрофизический анализ повреждения бактериальных клеток E.coli ионами серебра // Микробиология. 1992. -Т.61, № 3. - С. 464 - 471.

23. Иванов А.Ю., Дейнега Е.Ю., Мирошников А.И., Савлук О.С. Исследование изменений электроориентации клеток E.coli при действии дезинфектантов // Микробиология. 1985. - Т.54, № 5. - С. 826 - 829.

24. Иванов А.Ю., Фомченков В.М., Хасанова Л.А., Курамнина З.М., Садиков М.М. Влияние ионов тяжелых металлов на электрофизические свойства клеток E.coli и Anacystis nidulans II Микробиология. 1992. -Т.61, №3.-С. 455-463.

25. Карасевич Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М.: Наука, 1982. - 144 с.

26. Карулин А.Ю., Дзантиев Б.Б., Орлова Г.Г., Егоров A.M. Некоторые закономерности иммуноферментного анализа бактериальных клеток // ЖМЭИ. 1987. - № 9. - С. 12-18.

27. Клисенко М.А. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Агропромиздат, 2. -1992.-Т. 1.-567с.

28. Коренман Я.И. Ароматические соединения экоаналитические проблемы // Соросовский образовательный журнал. - 1999. - № 12. -С. 35-39.

29. Корженевич В.И., Игнатов О.В., Миронов А.Д., Кривопалов Ю.В., Барковский А.Л. Активность штаммов деструкторов ароматических соединений, иммобилизованных в гранулах агарового геля. // Прикладная биохимия и микробиология. 1991. - Т.27, № 3. - С. 365369.

30. Кулис Ю.Ю., Разумас В.Й. Биоамперометрия. Вильнюс.: Мокслас, 1986.-215 с.

31. Кулис Ю.Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов. Вильнюс: Мокслас, 1981. - 200 с.

32. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина, 1978. - 394 с.

33. Лакин Г.Ф. Биометрия. М: Высшая школа, 1990. - 351 с.

34. Ланчини Д., Паренти Ф. Антибиотики. М.: Мир, 1985. С. 22-36.

35. Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. - 1056 с.

36. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных вод. М.: Химия, 1984.-448 с.

37. Луста К.А., Фихте Б.А. Методы определения жизнеспособности микроорганизмов, Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1990. 186 с.

38. Манзенюк О.Ю., Воложанцев Н.В., Светоч Э.А. Идентификация бактерий Pseudomonas mallei с помощью бактериофагов Pseudomonas pseudomallei II Микробиология. 1994. - Т.63, Вып. 3. - С. 537-544.

39. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М: Мир, 1984.-479 с.

40. Маршелл Э. Биофизическая химия. М.: Мир, 1981. - Т. 1. - С. 347-358.

41. Мартыненко В.И., Промоненков В.К. Пестициды. Справочник. М.: Агропромиздат, 1992. 368 с.

42. Мельников Н.Н. Пестициды и регуляторы роста растений. Справочник. М.: Агропромиздат, 1995. 400 с.

43. Мельников Н.Н. Пестициды, химия и технология их применения. М.: Агропромиздат, 1987. 400 с.

44. Мееров Г.И. Радиометрические методы определения активности ферментов,- М.: Атомиздат, 1974. 61 с.

45. Методы общей бактериологии: Пер. с англ./ Под ред. Ф. Герхарда. М.: Мир, 1984.-Т. 1.-С. 458-464.

46. Методы общей бактериологии: Пер. с англ./ Под ред. Ф. Герхарда. М.: Мир, 1984. -Т.2.- С. 374-378.

47. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной биологии. М.: Мир, 1987. -440 с.

48. Мирошников А., Фомченков В.М., Иванов А.Ю. Электрофизический анализ и разделение клеток. М.: Наука, 1986. - 185 с.

49. Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. М.: Медицина, 1982.-186с.

50. Пат. 5051360 США, С 12 Q 1/04;С 12 М 1/34, 1/24. Способ детектирования активности микроорганизмов.

51. Пат. 268000 ГДР, МКИ 4 С12 Q 1/02. Способ определения активности популяций микроорганизмов, окисляющих углеводы.

52. Петухов В.Н., Фомченков В.М., Чугунов В.А., Холоденко В.П. Биотестирование почвы и воды, загрязненной нефтью и нефтепродуктами, с помощью растений // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - № 6. - С. 564 -567.

53. Пирузян J1.A., Паперная И.Б. Действие физиологически активных соединений на биологические мембраны. М.: Наука, 1974. - 370 с.

54. Сазыкин Ю.О. Антибиотики как ингибиторы биохимических процессов. -М.: Наука, 1968.-С. 106-161.

55. Сазыкин Ю.О., Навашин П.С. Антибиотики и оболочка бактериальной клегки // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Серия Биотехнология. М. -1991.-Т. 31.-С. 128-149.

56. Сингирцев И.Н. Микробная деструкция нитрофенолов. Автореф. дис. канд. биол. наук. Саратов. ВНИПЧИ "Микроб". 1996. - 24 с.

57. Сирота А.И. Электрооптический способ регистрации и исследования реакций взаимодействия антигенов с антителами. Автореф. дис. канд. биол. наук. Куйбышев. 1979. 17 с.

58. Сирота А.И., Стукова Т.А., Шаталаева М.Н. Электрооптический метод регистрации взаимодействия антиген-антитело для детекции антитромбоцитарных антител при геморрагических тромбоцитопатиях // Клин. лаб. диагн. 1993. - № 3. - С. 50-54.

59. Советский энциклопедический словарь / Под. ред. A.M. Прохорова, 4-е издание. М.: Сов. Энциклопедия, 1986. - 1600 с.

60. Спирин А.С. Молекулярная биология. Структура рибосомы и биосинтез белка. М.: Высшая школа, 1986. - 303 с.

61. Столяров, М.В. Саранча на юге России // Защита и карантин растений. -1998.-№3.-С. 16-17.

62. Тернер Э., Карубе И., Уилсон Дж., Даниельсон Бенгт, Мосбах Клаус. Теория и практика колориметрических сенсоров // Биосенсоры: основы и приложения. М.: Мир, 1992. - С. 457-487.

63. Толстой Н.А., Спартаков А.А., Трусов А.А., Щелкунова С.А. Постоянный электрический дипольный момент бактерий и бактериофагов // Биофизика. 1966. - Т. 11. - С. 453 -461.

64. Туманов А.А., Коростылева Е.А. Ферментативные методы определения фосфорорганических соединений в природных и сточных водах. // Химия и технология воды. 1989. - Т. 11, № 4. - С. 329-336.

65. Умнова Н.С., Шаханина К.Л., Павлова И.П., Мещерякова И.С. Разработка иммуноферментного метода для выявления Francisella tularensis IIЖМЭИ. 1986. - № 2. - С. 87-91.

66. Уэбб Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма. М.: Мир, 1966. - 862 с.

67. Фомченков В.М., Алексеев А.Н., Брезгунов В.Н., Иванов Н.В., Щевцов В.В. Электрофизические свойства спор Bacillus thuringiensis II Микробиология. 1983. - Т.52. - С. 213-218.

68. Фомченков В.М., Иванов А.Ю., Мирошников А.И., Чугунов В.А. Электрофизический анализ повреждения внешней мембраны клеток Е coli II Микробиология. 1990. - Т. 59, № 1. - С. 19-25.

69. Фомченков В.М., Ажермачев А.К., Чугунов В.А., Бабаева П.В. Влияние полиэлектролитов на электроповерхностные свойства микроорганизмов // Коллоидный журнал 1983. - Т. 45. - С. 273-280.

70. Фомченков В.М., Иванов А.Ю., Ажермачев А.К. Влияние ПАВ на электрические свойства бактериальных клеток // Микробиология. 1986. -Т. 55,№4.-С. 601 -606.

71. Фомченков В.М., Мазанов А.Л., Чугунов В.А. Изменение электрических характеристик бактериальных клеток при нарушении барьерной функции цитоплазматической мембраны // Микробиология. 1986. - Т. 55,№5.-С. 754-759.

72. Фомченков В.М., Эль-Регистан Г.И., Иванов А.Ю. Электрофизический анализ цистоподобных покоящихся форм бактериальных клеток // Микробиология. 1989. - Т. 58, Вып. 5.-С. 831-834.

73. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Сирота А.И., Мельников А.Г. О дипольном моменте бактериальных клеток // Биофизика. 1990. - Т. 35. -С.173.

74. Хитченс Г.Д., Ходко Д., Мурфи О. Дж., Роджерс Т.Д. Измерения бактериальной активности методом медиаторной амперометрии в проточно-инжекционной системе // Электрохимия. 1993. - Т. 29. -С. 1534-1540.

75. Чарыков А.К. Математическая обработка результатов химического анализа. JL: Химия, 1984. - 168 с.

76. Червякова К.И., Перманова И.П., Макарчук Ф.Т. Применение люминесцирующих антител для выявления термофильных бактерий при производстве консервов // Прикладная биохимия и микробиология. -1972.-Т. 8, Вып. 4. С. 495-497.

77. Швец Н.В., Волошин А.Г., Брезгунов В.Н. Электрооптический метод оценки жизнеспособности микроорганизмов Е. coli после сублимационной сушки // Биотехнология. 1987. - Т. 3, № 4. - С. 528 -532.

78. Шевченко М.А., Таран П.А., Гончарук В.В. Очистка природных и сточных вод от пестицидов. Л.: Химия, 1989. - 184 с.

79. Шилов В.П., Еремова Ю.Я. Диффузионные процессы при поляризации осесимметричных биологических клеток и низкочастотный электрооптический эффект в клеточных суспензиях // Коллоидный журнал. 1995. - Т. 57, № 2. - С. 255-260.

80. Эршлер И.А., Прибуш А.Г., Кузьмин П.И., Абидор И.Г., Яровая М.С. Исследование электрооптического пробоя клеточных мембран электрооптическим методом // Биологические мембраны. 1991. - Т. 8, № 12.-С. 1327-1336.

81. Abdel-Hamid I., Ivnitski D., Atanasov P., Wilkins E. Flow-through immunofiltration assay system for rapid detection of E. coli 0157:H7 //Biosensors andBioelectronics. 1999. - V. 14, Iss. 3. - P. 309-316.

82. Anderson G.P., King K.D., Gaffney K.L., Johnson L.H. Multi-analyte interrogation using the fiber optic biosensor // Biosensors and Bioelectronics. -2000. V. 14.-P. 771-777.

83. Arnold W.M., Zimmermann U., Pauli W. The comparative influence of substituted phenols (especially chlorophenols) on yeast cells assayed by electro-rotation and other methods // Biochim. Biophys. Acta. 1988. -V. 942. - P. 83-95.

84. Asanuma S., Thottappilly, Ayanaba A., Ranga Rao V. Use of the enzyme-linked assay (EL1SA) in the detection of Rhizobium both in culture and from root nodules of soybeans and cowpeas // Canadian Journal of Microbiology. -1985. V. 31, N.6.-P. 524-528.

85. Aubert D., Toubas D., Foudrinier F., Villena I., Gomez J.E., Marx C., Lepan H., Pinon J.M. Accelerated detection of DNA on Membranes by automated enzyme-linked immunofiltration assay // Anal. Biochem. 1997. - V. 247. -P. 25-29.

86. Avanissaghajani E., Jones K., Holtzman A., Aronson Т., Glover N., Boian M., Froman S., Brunk C.F. Molecular technique for rapid identification of mycobacteria//J. Clin. Microbiol. 1996. -V. 34, Iss. 1. - P. 98-102.

87. Basile F., Beverly M.B., Voorhees K.J. Pathogenic Bacteria: their detection and differentiation by rapid lipid profiling with pyrolysis mass-spectrometry // Trends Anal. Chem. 1998. - V. 17. - P. 95-109.

88. Bataillard P., Gardies F., Renault-Jaffrezic N., Martelet C., Colin В., Mandrand B. Direct detection of immunospecies by capacitance measurements //Anal. Chem. 1988. - V. 60. - P. 2374-2379.

89. Beeching N.J., Dance D.A.B., Miller A.R.O., Spencer R.C. Biological warfare and bioterrorism (review) // British Med. J. 2002. - V. - 324. -P. 336-339.

90. Bergan T. Rapid methods for detection of aerobic bacteria in blood and spinal fluid // Rapid methods and automation in microbiol / Ed. R.C. Tilton. -Washington D.C. Amer. Soc. Microbiol, 1981. P. 36-40.

91. Bhatia R., Dilleen J.W., Atkinson A.L., Rawson D.M. Combined physico-chemical and biological sensing in environmental monitoring // Biosensors and Bioelectronics. 2003. - V. 18. - P. 667- 674.

92. Blasco R., Murphy M.J., Sanders M.F., Squirrell D.J. Specific assays for bacteria using phage mediated release of adenylate kinase // J. Appl. Microbiol. 1998. - V. 84. - P. 661-666.

93. Blum L.J. Bio- and chemiluminescent sensors. World Scientific, Singapore, River Edge, NJ, 1997.- 198 pp.

94. Borrebaeck C., Mattiasson B. Recent development in geterogenous enzyme immunoassay // J. Solid-Phase Biochem. 1979.-V. 4, N. 1. - P. 57-67.

95. Bottcher C.F. Theory of electrical polarisability. New York: Acad Press, 1978.-248 pp.

96. Brainina K., Kozitsina A., Beikin J. Electrochemical immunosensor for Forest-Spring encephalitis based on protein A labeled with colloidal gold // Anal. Bioanal. Chem. 2003. - V. 376. - P. 481-485.

97. Brayton P.R., Tamplin M.L., Huq S.A., Colwell R.R. Enumeration of Vibrio-Cholerae 01 in Bangladesh waters by flourescent-antibody direct viable count // Appl. Environ. Microbiol. 1987. - V. 53. - P. 2862-2865.

98. Brecht A., Piehler J., Lang G., Gauglitz G. Direct optical immunosensor for atrazine detection // Anal. Chim. Acta. 1995. - V. 311, Iss. 3. - P. 289-299.

99. Brooks J.L., Mirhabibollahi В., Kroll R.G. Experimental enzyme-linked amperometric immunosensors for the detection of Salmonella in foods // J. Appl. Bacteriol. -1992. V. 73. - P. 189-196.

100. Brooks J.L., Mirhabibollahi В., Kroll R.G. Sensitive enzyme-amplified electrical immunoassay for protein A-bearing Staphylococcus aureus in foods // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - P. 3278-3284.

101. Bunin V.D., Voloshin A.G., Bunin, Z.F., Shmelev V.A. Electrophysical monitoring of culture process of recombinant Escherichia coli strains // Biotechnol. Bioenginer. 1996. - V. 51. - P. 720-724.

102. Bunin V.D., Voloshin A.G. Determination of cell structures, electrophysical parameters, and cell population heterogeneity // J. Colloid Interface Sci. -1996. V. 180.-P. 122-126.

103. Bunde R.L., Jarvi E.J., Rosentreter J.J. Piezoelectric quartzcrystal biosensors//Talanta. 1998. - V. 46, Iss.6. - P. 1223-1236.

104. Burt J.P., Chan K.L., Dawson D., Parton A., Pethig R. Assays for microbial contamination and DNA analysis based on electrorotation // Ann. Biol. Clin.(Paris.). 1996. - V. 54, Iss. 6. - P. 253-257.

105. Bush P.L., Stumm W. Chemical interaction in the aggregation of bacteria: Bioflocculation in waste treatment // Environ. Sci. and Technol. 1968. -V. 2. - P.49 - 53.

106. Byfield M.P., Abuknesha R.A. Biochemical aspects of biosensors // Biosensors and Bioelectronics. 1994. - V. 9, N 45. - P. 373-400.

107. Campanella L., Beone Т., Sammartino M.P., Tomassetti M. Determination of phenol in wastes and water using an enzyme sensor // Analyst. 1993. -№ 118.-P. 979-986.

108. Carstensen E.L., Marquis R.E., Child S.Z., Bender G.R. Dielectric properties of native and decoated spores of Bacillus megaterium H J. Bacteriol. -1979. V. 140. - P. 917 - 928.

109. Carstensen E.L., Marquis R.E., Gerhardt P. Dielectric study of the physical state of electrolytes and water within Bacillus cereus spores // J. Bacteriol. -1971.-V. 107. -P. 106-113.

110. Carter R.M., Mekalanos J.J., Jacobs M.B., Lubrano G.J., Guilbault G.G. Quartz crystal microbalance detection of Vibro cholerae 0139 serotype // J. Immunol. Methods. 1995. - V. 187. - P. 121-125.

111. Cavalieri S.J., Biehle J.R., Sanders W.E. Jr. Synergistic activities of clarithromycin and antituberculous drugs against multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis II Antimicrob. Agents Chemother. 1995. -V. 39, Iss. 7.-P. 1542-1545.

112. Chance B. Spectra and reaction kinetics of respiratory pigments of homogenized and intact cells //Nature. -1952. V. 169. - P. 215-221.

113. Chatterjee S., Mitra M., Das Gupta S.Kr. A high yielding mutant of mycobacteriophage LI and its application as a diagnostic tool // FEMS Microbiology Letters. 2000. - V. 188. - P. 47-53.

114. Chua H., Lu Y.J. Wong P.K. Changes in cell surface dielectric constant in biosorption of nickel ion (Ni ) by Enterobacter sp.4-2 // Enzyme Microb. Technol. 1998. - V. 23. - P. 403-407.

115. Click E.M., Webster R.E. Filamentous phage infection: required interactions with the TolA protein // J. Bacteriol. 1997. - V. 179, N. 20. - P. 6464-6471.

116. Click E.M., Webster R.E. The TolQRA proteins are required for membrane insertion of the major capsid protein of the filamentous phage fl during infection//J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 1723.

117. Concoran J.D., Sheehan О., O'Hare M.M.T., Halliday H.L. Tracheal surfactant protein A following treatment with Curosurf // Applied Cardiopulmonary Pathophysiology. 1995. - V. 5. - P. 245-248.

118. Coons A.H., Kaplan M.H. Localisation of antigen in tissues cells // J. Exp. Med. 1950,- V. 91. -P. 1-13.

119. Danielsson В., Mosbach K. Determination of enzyme activities with the enzyme thermistor unit // FEBS Lett. 1979. - V. 101. - P. 47-50.

120. Deng L.W., Malik P., Perham R.N. Interaction of the globular domains of pill protein of filamentous bacteriophage fd with the F-pilus of Escherichia coli II Virology. -1999. V. 253. - P. 271.

121. Deisingh A.K., Thompson M. Detection of infectious and toxigenic bacteria // Analyst. 2002. - V. 127. - P. 567-581.

122. Dennielson M.J., Hall J.M. and Turner A.P.F. Gas-phase microbiosensor for monitoring phenol vapor at Ppb levels // Anal. Chem. 1995. - № 67. -P. 3922-3927.

123. DeSilva M.S., Zhang Y., Hesketh P.J., Maclay G.J., Gendel S.M., Stetter J.R. Impedance based sensing of the specific binding reaction between

124. Staphylococcus enterotoxin В and its antibody on an ultra-thin platinum film // Biosensors and Bioelectronics. -1995. V. 10. - P. 675-682.

125. Deshpande S.S., Rocco R.M. Biosensors and their potential use in food quality-control // Food Technol. -1994. V. 48, Iss. 6. - P. 146-150.

126. Dezenclos Т., Asconcabrera M., Ascon D., Lebeault J.M., Pauss A. Optimization of the indirect impedancemetry technique a handy technique for microbial growth measurement // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1994. -V. 42.-P. 232-238.

127. Ding Т., Bilitewski U., Schmid R.D., Korz D.J., Sanders E.A. Control of microbial activity by flow injection analysis during high cell density cultivation of£. coli II J. Biotechnol. 1993. - V. 27. - P. 143-157.

128. Donnelly C.W., Baigent G.J. Method for flow-cytometric detction of Listeria-monocytogenes in milk // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 52. -P. 689-695.

129. Dzhene I., Petrova R., Stoylov S. A possible correlation of electro-optic changes with the deformability of erythrocytes // Cell Biophys. 1990. -V. 16, Iss. 3. - P. 161-167.

130. Dupont J., Menard D., Herve C., Chevalier F., Beliaeff В., Minier B. Rapid estimation of E. coli in live marine bivalve shellfish using automated conductance measurement//J. Appl. Bacteriol. -1996. V. 80. - P. 81-90.

131. Edelman P.G., Wang, J. Biosensors and Chemical Sensors: Optimizing Performance through Polymeric Materials. ACS, Washington, 1992 - 245 p.

132. Ehret R., Baumann W., Brischwein M., Schwinde A., Stegbauer K., Wolf B. Monitoring of cellular behaviour by impedance measurements in interdigitated electrode structures // Biosensors and Bioelectronics. 1997. -V. 12, Iss. l.-P. 29-41.

133. Eldefrawi M.E., Eldefrawi A.T., Anis N.A., Rogers K.R., Wong R.B., Valdes J.J. Fiberoptic immunosensors for detection of pesticides // ACS.SYMP.SER. 1995. - V. 586. - P. 197- 209.

134. Egger M., Donath E., Ziemer S., Glaser R. Electrorotation-a new method for investigating membrane events during thrombocyte activation. Influence of drugs and osmotic pressure // Biochim. Biophys. Acta. 1986. - V. 861, Iss.l. - P.122-130.

135. Egger M., Donath E. Electrorotation measurements of diamide-induced platelet activation changes // Biophys. J. 1995. - V. 68, Iss.l. - P. 364-372.

136. Endemann H, Model P. Location of filamentous phage minor coat proteins in phage and in infected cells // J. Mol Biol. 1995. - V. 250, N. 4. - P. 496506.

137. Engvall E., Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochemistry. 1971. - V. 8, Iss. 9.-P. 871-874.

138. Eynard N., Rodriguez F., Trotard J., Teissie J. Electrooptics studies of Escherichia coli electropulsation: orientation, permeabilization, and gene transfer//Biophys. J. 1998. - V. 75, Iss. 2. - P. 2587-2596.

139. Feng P. Commercial assay systems for detecting food borne Salmonella: a review // J. Food Protect. 1992. - V. 55. - P. 927-934.

140. Feng P. Emergence of rapid methods for identifying microbial pathogens in food // J. AOAC Intl. 1996. - V. 79, Iss. 3. - P. 809-812.

141. Fenselau C. Mass spectrometry for the characterization of microorganisms. -ACS, Washington, DC, 1994. 240 p.

142. Fleschin S., Bala C., Bunaciu A.A., Panait A., AboulEnein H.Y. Enalapril microbial biosensor // Preparative Biochemistry and Biotechnology. -1998. -V. 28, Iss 3. P. 261-269.

143. Folley-Thomas E.M., Whiplle D.L., Bermudez L.E., Barletta G.R. Phage infection, transfection and transformation of Mycobacteruim tuberculosis by means of luciferase reporter gene // Microbiology. 1995. -V. 141. - P. 11731181.

144. Frat Amico P.M., Strobaugh T.P., Medina M.B., Gehring A.G. Detection of E. coli 0157:H7 using a surface-plasmon resonance biosensor // Biotechnol. Techn. 1998. - V. 12, Iss. 7. - P.571-576.

145. Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions // Nature Phys. Sci. 1973. - V. 241. - P. 2022.

146. Galindo E., Bautista D., Garcia J.L., Quintero R. Microbial sensor for penicillins using a recombinant strain of Escherichia coli II Enzyme Microbial Technology. 1990. - V. 12, Iss. 9. - P.642-646.

147. Galindo E., Lagunas F., Osuna J., Soberon X., Garcia J.L. A microbial biosensor for 6-aminopenicillanic acid // Enzyme and Microbial Technology. 1998.-V. 23,Iss5.-P. 331-334.

148. Gascoyne P., Pethig R., Satayavivad J., Becker F.F., Ruchirawat M. Dielectrophoretic detection of changes in erythrocyte membranes following malarial infection // Biochim. Biophys. Acta. -1997. V. 1323. - P. 240-252.

149. Geier B.M., Wendt В., Arnold W.M., Zimmermann U. The effect of mercuric salts on the electro-rotation of yeast cells and comparison with a theoretical model // Biochim. Biophys. Acta. 1987. - V. 900. - P. 45-55.

150. Gehring A.G., Crawford C.G., Mazenko R.S., Van Houten L.J., Brewster J.D. Enzyme-linked immunomagnetic electrochemical detection of Salmonella typhimurium II J. Immunol. Methods. 1996. - V. 195. - P. 15-25.

151. Gehring A.G., Patterson D.I., Si T. Use of a light-addressable potentiometric sensor for the detection of Eschrichia Coli 0157:H7 // Anal. Biochem. -1998.- V. 258.-P. 293-298.

152. Gimsa J., Schnelle Т., Zechel G., Glaser R. Dielectric spectroscopy of human erythrocytes: investigations under the influence on nystatin // Biophys. J. 1994.-V. 66.-P. 1244-1253.

153. Gimsa J., Pruger В., Eppmann P., Donath E. Electrorotation of particles measured by dynamic light scattering-a new dielectric spectroscopy technique // Colloids and Surfaces A: Physocochemical and Engineering Aspects. -1995.-V. 98.-P. 243-249.

154. Gimsa U., Gimsa J. Determination of viral neuraminidase specifity for membrane-bound sialic acids by cell electrophoresis // Mol. Membr. Biol. -1997.-V. 14.-P. 87-90.

155. Gimsa J., Wachner D. A unified resistor-capacitor model for impedance, dielectrophoresis, electrorotation, and induced // Biophys. J. 1998. - V. 75, Iss. 2.-P. 1107-1116.

156. Ghindilis A.L., Atanasov P., Wilkins M., Wlikins E. Immunosensors: electrochemical sensing and other engineering approaches // Biosensors and Bioelectronics. -1998. V. 13. - P. 113-131.

157. Ghindilis A.L., Atanasov P., Wilkins M., Wlikins E. Immunosensors: electrochemical sensing and other engineering approaches // Biosensors and Bioelectronics. 1998. - V. 13. - P. 113-131.

158. Glazier S.A., Weetall H.H. Autofluorescence detection of E. coli on silver membrane filters //J. Microbiol. Methods. 1994. - V. 20. - P. 23-27.

159. Goater A.D., Dalton C., Pethig R., Smith H.V. Viability of Giardia intestinalis cysts and viability and sporulation state of Cyclosporacayetanensis oocysts determined by electrorotation // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67, Iss. 2. - P. 586-590.

160. Gray Darren S., John L. Tan, Joel Voldman, Chen C.S. Dielectrophoretic registration of living cells to a microelectrode array // Biosensors and Bioelectronics. 2004. - V. 19. - P. 771-780.

161. Greenfield R.A., Drevets D.A., Machado L.J., Voskuhl G.W. Bronze M.S. Bacterial pathogens as biological weapons and agents of bioterrorism // Am J. Med Sciences. 2002. - V. 323. - P. 299-315.

162. Gheorghiu E., Asami K. Monitoring cell cycle by impedance spectroscopy: experimental and theoretical aspects // Bioelectrochemistry and Bioenergetics. -1998.-V. 45, Iss. 2. P.139-143.

163. Griffiths D., Hall G. Biosensors what real progress is being made? //Trends Biotechnol. - 1993. - V. 11. - P. 122-130.

164. Hadley W.K., Yajko D.M. Detection of microorganisms and their metabolism by measurements of electrical impedance. // Instrumental methods for rapid microbiological analysis. / Ed. W.H. Nelson, VCH Publishers, 1985.-P. 193-211 (Chapter 7).

165. Hanning K. New aspects in preparative and analytical continuous free flow cell electrophoresis // Electrophoresis. -1982. V. 3. - P. 235-243.

166. Harteveld J.L.N., Nieuwenhuizen M.S., Wils E.R.J. Detection of Staphylococcal Enterotoxin-B employing a piezoelectric ciystal immunosensor// Biosensors and Bioelectronics. 1997. - V. 12. - P. 661-667.

167. Harris C.M., Kell D.B. The estimation of microbial biomass // Biosensors 1985.-V. l.-P. 17-24.

168. Hashem V.I., Rosche W.A., Sinden R.R. Genetic assays for measuring rates of (CAG).(CTG) repeat instability in Escherichia coli II Mutat. Res. 2002. -V. 502, Iss. 1-2.-P. 25-37.

169. He F.J., Geng Q., Zhu W., Nie L.H., Yao S.Z., Meifeng C. Rapid detection of E. coli using a separated electrode piezoelectric crystal sensor // Anal. Chim. Acta. 1994. - V. 289. - P. 313-319.

170. Helrich K. Official Methods of analysis of the association of official analytical chemists, microbiological methods, 2. AOAC, Arlington, VA, 1990.-P.425-497(Chapter 17).

171. Highfield P.E., Dougan G. DNA probes for microbial diagnosis // Br. J. Biomed. Sci.-1992.-V. 42. P.352-355.

172. Hill M.J., James A.M., Maxted W.R. Some physical investigation of the behavior of bacterial surface. 8. Studies on the capsular material of Streptococcus pyogenes // Biochim. Biophys. Acta. 1963. - V. 66. - P. 261274.

173. Hitchens G.D., Hodko D., Miller D.R., Murphy O.J., Rogers T.D. Bacterial activity measurements by mediated amperometry in a flow-injection system // Russian J. Electrochem. 1993. - V. 29, Iss. 12. - P. 1344-1349.

174. Hiskia A.E., Atmajidou M.E., Tsipi D.F. Determination of organophosphorus pesticide residues in Greek virgin olive oil by capillary gas chromatography // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1998. -V. 46, Iss. 2. - P. 570-574.

175. Hobson N.S., Tothill I., Turner A.P.F. Microbial Detection // Biosensors and Bioelectronics. 1996. - V. 11, Iss. 5. - P.455-477.

176. Holland R.L., Cooper B.H., Hegelson N.G.P., McCracken A.W. Automated detection of microbial growth in blood cultures by using stainless steel electrodes//J. Clin. Microbiol. 1980. - V. 12. - P. 180-184.

177. Holzel R., Lamprecht I. Dielectric properties of yeast cells as determined by electrorotation // Biochim. Biophys. Acta. 1992. - V. 1104, Iss. 1. - P. 195200.

178. Holzel R. Non-invasive determination of bacterial single cell properties by electrorotation //Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1450, Iss. 1. - P. 53-60.

179. Holzel R. Electrorotation of single yeast cells at frequencies between 100 Hz and 1.6 GHz. // Biophys. J. 1997. - V. 73, Iss. 2. - P. 1103-1109.

180. Holzel R. Nystatin-induced changes in yeast monitored by time-resolved automated single cell electrorotation // Biochim. Biophys. Acta. 1998. -V. 1425. - P. 311-318.

181. Hodgson C.E., Pethig R. Determination of the viability of Escherichia coli at the single organism level by electrorotation // Clin. Chem. 1998. - V. 44, Iss. 9.-P.2049-2051.

182. Ignatov O.V, Guliy O.I., Shchyogolev S.Yu., Bunin V.D., Ignatov V.V. Effect of p-nitrophenol metabolites on microbial-cell electro-optical characteristics //FEMS Microbiol. Lett. 2002. - V. 214. - P.81-86.

183. Ivnitski D., Rishpon J. A one-step, separation-free amperometric enzyme immunosensor // Biosensors and Bioelectronics. 1996. - V. 11. - P. 409-417.

184. Ivnitski D., Wolf Т., Solomon В., Fleminger G., and Rishpon J. An amperometric biosensor for real time analysis of molecular // Bioelectrochem. Bioenerg. 1998. - V. 45. - P. 27-32.

185. Ivnitski D., Abdel-Hamid I., Atanasov P., and Wilkins E. (Review). Biosensors for detection of pathogenic bacteria // Biosensors and Bioelectronics. 1999. - V. 14. - P. 599-624.

186. Ivnitski D., Wilkins E., Tien H.T., Ottova A. Electrochemical biosensor based on supported planar lipid bilayers for fast detection of pathogenic bacteria // Electrochemistry Communication. 2000. - V. 2, Iss. 7. - P. 457460.

187. Jacobs, M.B., Cater, R.M., Lubrano, G.J., Guilbault, G.G. A piezoelectric biosensor for Listeria-monocytogenes II Am. Lab. 1995. - V. 27, Iss. 11. - P. 26-28.

188. Jakes K.S., Davis N.G., Zinder N.D. A hybrid toxin from bacteriophage fl attachment protein and colicin E3 has altered cell receptor specificity // J. Bacterid. 1988. - V. 170. - P. 4231.

189. Jain R.K., Dreisbach J.H., Spain J.C. Biodegradation of p-nitrophenol via 1,2,4-benzentriol by an Arthrobacter sp. // Appl. Environ. Microbiol. 1994. -V. 60, №8.-P. 3030-3032.

190. Jouenne Т., Bertin L., Charriere G., Junter G.A. Electrochemical assessment of E. coli survival in natural water // Water Res. 1991. - V. 25, Iss. 7. - P. 829-833.

191. Jung S., Arndt K.M., Muller M., Pluckthun Selectively infective phage (SIP) technology: scope and limitations //Journal of Immunological Methods. 1999.-V. 231. -P.93-104.

192. Junter G.A., Lemeland J.F., Selegney E. Electrochemical detection and counting of E. coli in the oresence of a reducible coenzyme, lipoic acid // J. Appl. Environ. Microbiol. 1980. - V. 39. - P.307-316.

193. Kalab Т., Skladal P. Evaluation of mediators for development of amperometric microbial bioelectrodes // Electroanalysis. 1994, Iss. 6. - P. 1004-1008.

194. Kaspar C.W., Tartera C. Methods for detecting microbial pathogens in food and water // Methods Microbiol. 1990. - V. 22. - P. 497-530.

195. Kalab Т., Skladal P. Evaluation of mediators for development of amperometric microbial bioelectrodes // Electroanalysis. 1994. - V. 6. -P. 1004-1008.

196. Karube I., Matsunaga Т., Tsuru S., Suzuki S. Biotechnical fuel cell utilizing immobilized cells of Clostridium butyricum II Biotechn. Bioeng. 1977(b). -V. 19, N. 11.-P. 1727-1733.

197. Kaspar C.W., Tartera C. Methods for detecting microbial pathogens in food and water // Methods Microbiol. 1990. - V. 22. - P. 497-530.

198. Kim H.J., Bennetto H.P., Halablab M.A. A novel liposomebased electrochemical biosensor for the detection of haemolytic microorganisms // Biotechnol. Techn. 1995. - V. 9, Iss. 6. - P. 389-394.

199. Koch A.L. Energy expenditure is obligatory for the downhill transport of galactosides // J. Mol. Biol. -1971. V. 59. - P. 447-459

200. Khlebtsov N.G., Melnikov A.G., Bogatyrev V.A. The linear dichroism and birefringence of colloidal dispersions: approximate and exact approaches // J. Coll. Interf. Sci. -1991. V. 146. - P. 463-478.

201. Knowng S.G.W., Govind R. Metabolic monitoring by using the rate of change of NAD(P)H fluorescence // Biotechnol. Bioeng. 1994. - V. 44, Iss. 4. - P.453 - 459.

202. Koch Sabine, Wolf Hans, Danapel Christine, Klaus A. Feller Optical flow-cell multichannel immunosensor for the detection of biological warfare agents // Biosensors and Bioelectronics. 2000. - V. 14. - P. 779-784.

203. Kowalski M., Hannig K., Klock G., Gessner P, Zimmermann U., Neil G.A., Sammons D.W. Electrofiised mammalian cells analyzed by free-flow electrophoresis //Biotechniques. 1990. - V. 9. - P. 322-341.

204. Krebber C., Spada S., Desplancq D., Krebber A., Ge L., Pluckthun A. Selectively infective phage SIP: a "mechanistic dissection of a novel in vivoselection for pro-tein-ligand interactions // J. Mol. Biol. 1997. - V. 268. - P. 607.

205. Kriegmaier M., Zimmermann M., Wolf K., Zimmermann U., Sukhorukov V.L. Dielectric spectroscopy of Schizosaccharomyces pombe using electrorotation and electroorientation // Biochim. Biophys. Acta. 2001. -V. 1568, Iss. 2. - P.135-146.

206. Kristensen P., Winter G. Proteolytic selection for protein folding using filamentous bacteriophages // Fold Des. 1998. - V. 3, Iss. 5. - P. 321-328.

207. Lawrence A.J., Morres G.R. Conductometry in enzyme studies // Eur. J. Biochem. 1972. - V. 24. - P. 538-546.

208. Libby J.M., Wada H.G. Detection of Nesseria meningitides and Yersinia pestis with a novel silicon-based sensor // J. Clin. Microbiol. 1989. - V. 27. -P. 1456-1459.

209. Liu T.Z., Wang Y., Kounaves S.P., Berush E.J. Determination of organonitriles using enzyme-based selectivity mechanisms. 1. An ammonia gas sensing electrode-based sensor for benzonitrile // Anal. Chem. 1993. -V. 65,N. 21.-P. 3134-3136.

210. Ljungholm K., Wadso I. Microcalorimetric detection of growth of Mycoplasmatales//J. Gen. Microbiol. -1976. V. 96, N. 2. - P. 283-288.

211. Lloyd D. Flow Cytometry in Microbiology. Springer-Verlag London Limited, Germany, 1993. - 188 p.

212. Lukosz W., Clerc D., Nellen P.M., Stamm C., Weiss P. Output grating couplers on planar optical wave-guides as direct immunosensors // Biosensors and Bioelectronics. -1991. V. 6. - P. 227-232.

213. Maier H. Electrorotation of colloidal particles and cells depends on surface charge // Biophys. J. 1997. - V. 73, Iss. 3. - P. 1617-1623.

214. Marco M.P., Barcelo D. Environmental applications of analytical biosensors // Meas. Sci. Technol. -1996. V. 7. - P. 1547-1562.

215. Markx G.H., Kell D.B. The use of dielectric permittivity for the control of the biomass level during biotransformations of toxic substrates in continuous culture // Biotechnol. Prog. 1995. - V. 11. - P. 64-70.

216. Marston F.A.O. The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in E. coli II Biochem J. 1986. - V. 240. - P. 1-12.

217. Marshall N.J., Hewitt J.H., James A.M. Changes in the surface properties of three strains of Staphylococcus aureus on in vitro training to methicillin resistance // Microbios. -1971. V. 4. - P.241 -251.

218. Marty J-L, Sode K. and Karube I. Biosensor for detection of organophosphate and carbamate insecticides // Electroanalysis. 1992, N 4. -P. 249-252.

219. Matsunaga Т., Karube J., Nakahara Т., Suzuki S. Amperometric determination of viable cell numbers based on sensing microbial respiration // Europ. J. Appl. Microbial. Biotechnol. -1981. V. 12, N. 2. - P. 97-101.

220. Matsunaga Т., Karube I., Suzuki S. Electrode system for the determination of microbial population // Appl. Environ. Microbiol. -1979. V. 37, N. 1. - P. 117-121.

221. Melamed M.R., Lindmo Т., Mendelson M.L. Flow cytometry and sorting. -John Wiley, New York, 1990. P. 105-153.

222. Meng J.H., Zhao S.H., Doyle M.P., Kresovich S. Polymerase chain-reaction for detecting E. coli 0157:H7 // Int. J. Food Microbiol. 1996. - V. 32, Iss. 1-2.-P. 103-113.

223. Meulenberg R., Pepi M., de Bont J.A. Degradation of 3-nitrophenol by Pseudomonas putida B2 occurs via 1,2,4-benzenetriol // Biodegradation. -1996.-V. 7. P.303-311.

224. Medina M.B., Houten L.V., Cooke P.H., Tu S.I. Real-time analysis of antibody binding interactions with immobilized E. coli 0157:H7 cells using the BIAcore // Biotechnol. Techn. -1997. V. 11, Iss. 3. - P. 173-176.

225. Meister R. Т., Berg G. L., Sine C., Meister S., Poplyk J. Farm Chemicals Handbook, 70th ed. Meister Publishing Co, 1984 - 374 p.

226. Meister, R.T. Farm Chemicals Handbook '92. Meister Publishing Company, Willoughby, OH, 1992. - 425 p.

227. McClelland R.G., Pinder A.C. Detection of low levels of specific Salmonella species by fluorescent antibodies and flow cytometry // J. Appl. Bacteriol. 1994. - V. 77. - P. 440-447.

229. Mirhabibollahi В., Brooks J.L., Krool R.G. A semi-homogeneous amperometric immunosensor for protein A-bearing Staphylococcus aureus in foods // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1990. V. 34. - P. 242-247.

230. Mikkelsen S.R. Electrochemical biosensors for DNA sequence detection // Electroanalysis. 1996. - V. 8, Iss. 1. - P. 15-19.

231. Morris V.J., Jennings B.R. The effect of neomycin and streptomycin on the electrical polarisability of aqueous suspensions of Escherichia coli II Biochim. Biophys. Acta. 1975. - V.392, Iss.2. - P.328-334.

232. Morgan C.L., Newman D.J., Price C.P. Immunosensors: technology and opportunities in laboratory medicine // Clin. Chem. 1996. - V. 42, Iss. 2. -P. 193-209.

233. McGown L.B., Joseph M.J., Pitner J.B., Glenn P.V., Linn C.P. The nucleic acid ligand a new tool for molecular recognition // Anal. Chem. 1995. - V. 1. - P. 663A-668A.

234. McQuillen K. The bacterial surface. 3. Effect of penicillin on the electrophoretic mobility of St. aureus И Biochim. Biophys. Acta. 1951. -V. 6. - P. 537-547.

235. Mionetto N., Rouillon R., Marty J-L. Inhibition of acetylcholinesterase by organophosphorous and carbamates compounds. Studies on free and immobilized enzymes // Wasser-Abwasser-Forsch. 1992. - N.25. - P. 171174.

236. Muramatsu H., Kajiwara K., Tamiya E., Karube I. Piezoelectric immunosensor for the detection of Candida albicans microbes // Anal. Chim. Acta. 1986.-V. 188.-P. 257-261.

237. Nakamura N., Shigematsu A., Matsunaga T. Electrochemical detection of viable bacteria in urine and antibiotic selection // Biosensors and Bioelectronics. -1991. V. 6, Iss.7. - P. 575-580.

238. Nelson W.H. Instrumental methods for rapid microbiological analysis. -VCH Publishers, USA, 1985. 219 p.

239. Omkar Dr. Biosensors and their application // Everyman's Sci. 1993. - V. 28, N4.-P. 119-123.

240. Ortega F., Dominguez E., Jonssonpettersson G., Gorton L. Amperometric biosensor for the determination of phenolic-compounds using a tyrosinase graphite electrode in a flow-injection system // J. Biotechnol. -1993. -V. 31. -P. 289-300.

241. Overman S.A., Tsuboi M., Thomas G.J. Subunit orientation in the filamentous virus Ff (fd, fl, M13) // Journal of Molecular Biology. 1996. -V. 259, N.3.-P. 331 -336.

242. Owen V.M. Market requirements for advanced biosensors in healthcare // Biosensors and Bioelectronics. 1994. - V. 9. - P. XXIX-XXXV.

243. Owens J.D. Formulation of culture media for conductometric assays: theoretical considerations // J. Gen. Microbiol. 1985. - V. 131, N. 11. -P. 3055-3076.

244. Perez F.G., Mascini M., Tothill I.E., Turner A.P.F. Immunomagnetic separation with mediated flow-injection analysis amperometric detection of viable E. coli 0157 // Anal. Chem. 1998. - V. 70. - P. 2380-2386.

245. Pesce A.J., Ford D.J. Gaizutis M. Pollak V.E. Binding of protein to polystyrene in solid-phase immunoassays // Biochem. Biophys. Acta. 1977. - V. 492. - Iss.2. - P. 399-404.

246. Piehler J., Brecht A., Geckeler K.E., Gauglitz G. Surface modification for direct immunoprobes // Biosensors and Bioelectronics. 1996. - V. 11. -P. 579-590.

247. Pethig R., Markx G.H. Applications of dielectrophoresis in biotechnology // Trends Biotechnol. 1997. - V. 10. - P. 426-32.

248. Pinder A.C., Purdy P.W., Poulter S.A.G., Clark D.C. Validation of flow cytometry for rapid enumeration of bacterial concentrations in pure cultures // J. Appl. Bacteriol. 1990. - V. 69. - P. 92-100.

249. Plomer M., Guilbault G.G., Hock B. Development of a piezoelectric immunosensor for the detection of Enterobacteria // Enzyme Microb. Technol. -1992. V. 14. - P. 230-235.

250. Plummer D.T., James A.M. Some physical investigations of the behavior of bacterial surfaces. 3. The variation of electrophoretic mobility and casule size of A. aerogenes // Biochim. Biophys. Acta. -1961. V. 53. - P. 453-460.

251. Plummer D.T., James A.M, Gooder H., Maxted W.R. Some physical investigations of the behavior of bacterial surfaces. The variations of the surface structure of Streptococcus pyrogenes during growth // Biochim. Biophys. Acta. -1962. V. 60. - P. 595-603.

252. Pratt J.S., Woldring M.G. Recent developments in radioimmunoassay // J. Radioanalyt. Chem. 1977. - V.35, N 1. - P. 45-54.

253. Prosser J.I. Molecular marker systems for the detection of genetically modified microorganisms in the environment // Microbiology. 1994. -V. 140.-P. 5-17.

254. Prosser J.I., Killham K., Glover L.A., Rattray E.A.S. Luminescnece-based systems for detection of bacteria in the environment // Crit. Rev. Biotech. -1996.-V. 16.-P. 157-1833.

255. Prusak-Sochaczewski E., Luong J.H.T., Guilbault G.G. Development of a piezoelectric immunosensor for the detection of Salmonella typhimurium //Enzyme Microbiol. Technol. -1990. V. 12. - P. 173-177.

256. Pyle B.H., Broadway S.C., McFeters G.A. A rapid, direct method for enumerating respiring enterohemorrhagic E. coli 0157:H7 in water // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61, Iss. 7. - P. 2614-2619.

257. Raicu V., Gusbeth C., Anghel D.F., Turcu G. Effect of cetyltrimethylammonium bromide (СТАВ) surfactant upon the dielectric properties of yeast cells // Bba.Gen.Subjects. 1998. - V. 1379. - P.7-15.

258. Ramanathan S., Shi W.P., Rosen B.P., Daunert S. Bacteriabased chemiluminescence sensing system using beta-galactosidase under the control of the ARSR regulatory protein of the ARS Operon // Anal. Chim. Acta. -1998.-V. 369, Iss. 3. P. 189-195.

259. Ramsay G., Turner A.P.F. Development of a electrochemical method for the rapid determination of microbial concentration and evidence for the reaction mechanism // Anal. Chim. Acta. 1988. - V. 215. - P. 61-69.

260. Rechetilov A.N., Iliasov P.V., Filonov A.E., Gayazov R.R., Kosheleva I.A., Boronin A.M. Pseudomonas putida as a receptor element of microbial sensor for naphthalene detecion // Process Biochem. 1997. - V. 32, Iss. 6. - P. 487493.

261. Reichlea C., Schnelleb Т., Mullera Т., Leyaa Т., Fuhra G. A new microsystem for automated electrorotation measurements using laser tweezers //Biochim. Biophys. Acta. 2000. - V. 1459, Iss. 1. - P. 218.-229.

262. Riechmann L., Holliger P. The C-terminal domain of TolA is the coreceptor for filamentous phage infection of E. coli II Cell. 1997. - V. 90, Iss. 2.-P. 351-360.

263. Roberts J.K.M, Jardetzky O. Monitoring of cellular metabolism by NMR //BBA.- 1981.-V. 639.-P. 53-76.

264. Rodrigues U.M., Kroll R.G. Rapid detection of Salmonellas in raw meats using a fluorescent antibody-microcolony technique // J. Appl. Bacterid. -1990.-V. 68.-P. 213-223.

265. Roffey R., Lantorp K., Tegnell A., Elgh F. Biological weapons and bioterrorism preparedness: importance of public-health awareness and international cooperation // Clin. Microbiol. Infect 2002. - V. 8. - P. 522528.

266. Rogers K.R., Mulchandani A., Zhou W. Biosensor and chemical sensor technology: process monitoring and control. ACS, Washington, DC, 1995. -187 p.

267. Rokesh J.K., Dreisbach J.H., Spain J.C. Biodegradation of p-nitrophenol via 1,2,4-benzetriol by an Arthrobacter sp. // Appl. Environ. Microbiol. 1994. -V. 60, № 8. - P.3030-3032.

268. Rossi T.M., Warner M. Bacterial identification using fluorescence spectroscopy // Instrumental methods for rapid microbiological analysis / Ed. W.H. Nelson. VCH Publishers, 1985. - P. 1-50 (Chapter 1).

269. Rowe P.C., Orrbine E., Wells G.A. Epidemiology of hemolytic-uremic syndrome in Canadian children from 1986 to 1988 // J. Pediatr. 1991. -V. 119.-P. 218-224.

270. Rowe-Taitt Chris A., Golden J.P., Feldstein M.J., Cras J.J., Hoffman K.E., Ligler F.S. Array biosensor for detection of biohazards // Biosensors and Bioelectronics. 2000. - V. 14. - P. 785-794.

271. Ruissen A.L., Groenink J., Krijtenberg P., Walgreen-Weterings E., van't Hof W., Veerman E.C., Nieuw Amerongen A.V. Internalisation and degradation of histatin 5 by Candida albicans // Biol. Chem. 2003. - V. 384, Iss. 1. -P. 183-190.

272. Russel M., Whirlow H., Sun T.P., Webster R.E. Low-frequency infection of F-bacteria by transducing particles of Filamentous bacteriophages // J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - P.5312.

273. Ruterjans H., and Juretschke H.P. NMR in the study of cells and tissues // Rapid methods and automation in microbiol. and immunol. / Ed. K.O. Habermehl. Springeer-Verlag, 1985 - P. 177-183.

274. Sabine Jung, Arndt K.M., Muller K.M., Pluckthun A. Selectively infective phage SIP technology: scope and limitations // J. Immunological Methods. -1999.-V. 231. P.93-104.

275. Salzman G., Singham S.B., Johnston R.G., Bohren C.F. Light scattering and cytometiy // Flow cytometiy and sorting / Eds. Melamed M.R., Lindmo Т., Mendelsohn M.L. John Wiley, New York, 1990. - P.105-153.

276. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Second ed. N.Y.: Cold Spring. Mavbov Lab. Press, 1989.

277. Sarkis G.K., Jacobs W.R., Hatfull G.F. Luciferase reporter mycobacteriophages: a sensitive tool for the detection and assay of live mycobacteria//Mol. Microbiol. -1995. V. 15. - P. 1055-1067.

278. Schott H. The effect of buffers and organic and inorganic cations on the electrokinetic properties of bacteria // Bioelectrochem. Bioelectroenerg. -1977. v.4.-P. 117-136.

279. Schmitt N., Tessier L., Watier H., Patat F. A new method based on acoustic-impedance measurements for quartz immunosensors // Sensors Actuators B-Chem. -1997. V. 43, Iss. 1-3. - P. 217-223.

280. Schneider B.H., Edwards J.G., Hartman N.F. Hartman interferometer: versatile integrated optic sensor for label-free, real-time quantification of nucleic acids, proteins, and pathogens // Clin. Chem. 1997. - V. 43, Iss. 9. -P. 1757-1763.

281. Schuurs A.H.W.M., Van Weeman B.K. Enzyme immunoassay // Clin. Chim. Acta. 1977.-V. 81.-P. 1-40.

282. Sharpe A.N. Developments in rapid methods for detection of agents of foodborne disease // Food Res. Intl. 1994. - V. 27. - P.237-243.

283. Seo K.H., Brackett R.E., Hartman N.F., Campbell D.P. Development of a rapid response biosensor for detection of Salmonella typhimurium II J. Food Prot. 1999. - V.62, Iss. 5.-P.431-437.

284. Shreyasi Chatterjee, Mahasweta Mitra, Sujoy Kr. Das Gupta A high yielding mutant of mycobacteriophage LI and its application as a diagnostic tool // FEMS Microbiology Letters. 2000. - V. 188. - P. 47-53.

285. Sieber V., Pluckthun A., Schmid F.X. Selecting proteins with improved stability by a phage-based method //Nat.Biotechnol. 1998. - V. 16. - P. 955.

286. Sippy N., Luxton R., Lewis R.J., Cowell D.C. Rapid electrochemical detection and identification of catalase positive microorganisms // Biosensors and Bioelectronics. 2003. - V. 18, Iss. 5-6. - P. 741-749.

287. Silley P., Forsythe S. Impedance microbiology: a rapid change for microbiologists//J. Appl. Bacteriol. -1996. V. 80. - P.233-243.

288. Sloper A.N., Deacon J.K., Flannagan M.T. A planar indium phosphate monomode wave-guide evanescent field immunosensor // Sensors Actuators. -1990. В 1.-P. 285-297.

289. Slots J., Reynolds H.S. Long-wave UV-light flourescence for identification of black pigmented bacteriodes spp. // J. Clin. Microbiol. 1982. - V. 16. -P. 1148-1151.

290. Skuridin S.G., Yevdokimov Y.M., Efimov V.S., Jennifer M.H., Turner A.P.F. A new approach for creating doublestranded DNA biosensors //Biosensors and Bioelectronics. 1996. - V. 11, Iss. 9. - P. 903-911.

291. Spain J.C., Gibson D.T. Pathway for biodegradation of /?-nitrophenol in Moraxella sp. //Appl. and Environ. Microbiol. 1991. - V. 57, № 3. - P. 812819.

292. Spain C. Jim and Gibson T.David. Pathway for biodegradation of p-Nitrophenol in a Moraxella sp. // Applied and environmental microbiology. -1991.-Mar.-P. 812-819.

293. Soini E., Hemmila I. Fluoroimmunoassay: present status and key problems // Clin. Chem. 1979. - V. 25. - P.353-361.

294. Stengele I., Brass P., Garces X., Giray J., Rasched I. Dissection of functional domains in phage fd adsorption protein. Discrimination between attachment and penetration sites // J. Mol. Biol. 1990. - V. 212. - P. 143.

295. Stephen Cavalieri J., Biehle J.R., Sanders W. E. JR. Synergistic activities of clarithromycin and antituberculous drugs against multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis II Antimicrobial Agents Chemotherapy. 1995. -V. 39,N. 7.-P. 1542-1545.

296. Stewart G.N. The changes produced by the growth of bacteria in the molecular concentration and electrical conductivity of culture media // J. Exp. Med. 1899.-V. 4. - P. 235-243.

297. Stockall A.M., Edwards C. Changes in respiratory activity during encystment of Azotobacter vinelandii II J. Gen.Microbiology. 1985. - V. 131,N. 6.-P. 1403-1410.

298. Sudhakar-Barik, Siddaramappa S.-B.R., Sethunathan N. Metabolism of nitrophenols by bacteria isolated from paration-amended flooded soil //J. Microbiol. And Serol. -1976. V. 42, № 4. - P. 461-470.

299. Sukhorukov V.L., Benkert R., Obermeyer G., Bentrup F.W., Zimmermann U. Electrorotation of isolated generative and vegetative cells, and of intact pollen grains of Lilium longiflorum II J. Membrane. Biol. 1998. - V. 161, Iss. 1.-P. 21-32.

300. Sukhorukov V.L., Zimmermann U. Electrorotation of erythrocytes treated with dipicrylamine: mobile charges within the membrane show their "signature" in rotational spectra // J. Membr. Biol. 1996. - V. 153. - P. 161169.

301. Suleiman A.A., Guilbault G.G. Recent developments in piezoelectric immunosensors // Analyst. -1994. V. 119. - P. 2279-2282.

302. Summers W.C. Bacteriophage therapy // Annu. Rev. Microbiol. 2001. -V. 55. - P.437-451.

303. Swaminathan В., Feng P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 1994. - V. 48. - P. 401-426.

304. Szymczyk K., Malczewska M. Gas chromatography analysis of organophosphorous pesticides in plant samples // Chromatographia. 1998. -V.48, Iss. 1-2.-P. 156-157.

305. Takayama K., Kurosaki Т., Ikeda T. Mediated electrocatalysis at biocatalyst electrode based on a bacterium Gluconobacter industrius II J. Electroanalyt. Chem.- 1993.-V. 356.-P. 295-301.

306. Tietjen M., Fung D.Y.C. Salmonella and food safety // Crit. Rev. Microb. -1995.-V. 21.-P.53-83.

307. Thomson W. T. Agricultural chemicals // Book 1: Insecticides, acaricides, and ovicides. Revised ed. Thomson Publ., Indianapolis, 1976. - 284 p.

308. Turner A.P.F., Cardosi M.F., Ramsay G., Schneider B.H., Swain A. Biosensors for use in the food industry: a new rapid bioactivity monitor // Biotechnology in the food industry. Online Publications, Pinner UK, 1986. -P. 97-116.

309. Ulitzur S., Kuhn J., Introduction of lux genes into bacteria: a new approach for specific determination of bacteria and their antibiotic susceptibility // Bioluminescence and chemiluminescence: New Perspectives. Wiley, Bristol, 1987.-P.463-472.

310. Van Emon J.M., Gerlach C.L., Johnson J.C. Environmental Immunochemical Methods. ACS, Washington, DC, 1995. - 342 p.

311. Vaughan R.D., O'Sullivan C.K., Cuilbault G.G. Development of a quartz crystal microbalance (QCM) immunosensor for the detection of Listeriamonocytogenes II Enzyme and Microbial Technology. 2001. - V. 29. -P. 635-638.

312. Van Weemen B.K, Schuurs A.H.W.M. Immunoassay using antigen-enzyme conjugate//FEBS Lett. -1971. V. 15, Iss. 3. - P. 232-236.

313. Walt D., Franz D.R. Biological warfare detection // Anal Chem. 2000. -V. 12.-P. 738A-746A.

314. Wang J., Rivas G., Parrado C., Xiaohua C., Flair M. Electrochemical biosensor for detecting DNA sequences from the pathogenic protozoan Cryptosporidium parum II Talanta. 1997b. - V. 44. - P. 2003-2010.

315. Wang J., Rivas G., Cai X.H. Screen-printed electrochemical hybridization biosensor for the detection of DNA-sequences from the Escherichia coli pathogen // Electroanalysis. 1997c. - V. 9, Iss. 5. - P. 395-398.

316. Watts H.J., Lowe C.R., Pollard-Knight D.V. Optical biosensor for monitoring microbial cells //Anal. Chem. 1994. - V. 66. - P. 2465-2470.

317. West A.W., Sparting G.P. Modification to the substratein-induced respiration method to permit measurement of microbial biomass in soil of differing water contents // J. Microbial. Methods. 1986. - V. 5, N. 3/4. -P. 177-190.

318. Wilkins J.R. Use of platinum electrodes for electrochemical detection of bacteria // J. Appl. Environ. Microbiol. 1978. - V. 36, Iss. 5. - P. 683-687.

319. Wilkins J.R., Young R., Boykin E. Multichannel electrochemical microbial detection unit//J. Appl. Environ. Microbiol. 1978. - V. 35. - P. 214-215.

320. Wilkins J.R. Use of platinum electrodes for electrochemical detection of bacteria//J. Appl. Environ. Microbiol. 1978. - V. 36, Iss. 5. - P.683-687.

321. Willoughby O.H., Morgan D.P. Recognition and management of pesticide poisonings, 3rd ed. U.S. Environmental Protection Agency, Washington, DC, 1982.-245 p.

322. Wilson D.M., Alderte T.F., Maloney P.C, Wilson Т.Н. Protonmotive force as the source of energy for adenosine 5-triphosphate synthesis in Escherichia coli// J. Bacteriol. 1976. - V. 126. - P. 327-337.

323. Woodward A.M., Kell D.B. Confirmation by using mutant strains that the membrane-bound H(+)-ATPase is the major source of non-linear dielectricity in Saccharomyces cerevisiae // FEMS Microbiol. Lett. 1991. -V. 68. - P. 9195.

324. Yagodina O.V., Nikolskaya E.B. The main factors of monoamine biosensor selectivity increasing// Sensor Actuator. B. Chem. 1997. - V. 44, Iss. 1-3. -P. 566-570.

325. Zimmermann U., Vienken J., Pilwat G. Rotation of cells in an alternating electric fields: The occurrence of a resonance frequency // Z. Naturforsch. C.. 1981, Bd. 36, S. - P. 173-177.

326. Zhai J.H., Cui H., Yang R.F. DNA-based biosensors // Biotechnol. Adv. -1997.-V. 15, Iss. l.-P. 43-58.

327. Zhai J.H., Cui H., Yang R.F. DNA-based biosensors // Biotechnol. Adv. -1997.-V. 15, Iss.l. P. 43-58.

328. Zhu В., Wang G.O. Current status and prospects for the nucleic-acid biosensors // Progr. Biochem. Biophys. 1997. - V. 24, Iss. 6. - P. 510-513.

329. Zhou С., Pivarnik P., Rand A.G., Letcher S.V. Acoustic standing-wave enhancement of a fiber-optic Salmonella biosensor // Biosensors and Bioelectronics. 1998. - V. 13, N 5. - P. 495-500.

330. Zhou X.F., Burt J.P.H., Pethig R. Automatic cell electrorotation measurements: studies of the biological effects of low-frequency magnetic field and of heat shock // Physics in Medicine and Biology. 1998. - V. 43, Iss. 5.-P. 1075-1090.

331. Zhou X.F., Marks G.H., Pethig R. Effect of biocide concentration on electrorotation spectra of yeast cells // Biochim. Biophys. Acta. 1996. -V. 1281.-P. 60-64.

332. Zhou X.F., Markx G.H., Pethig R. Eastwood I.M. Differenciation of viable and non-viable bacterial biofilms using electrorotation // Biochim. Biophys. Acta. 1995.-V. 1245.-P. 85-93.

333. Zhu В., Wang G.O. Current status and prospects for the nucleic-acid biosensors // Progr. Biochem. Biophys. 1997. - V. 24, Iss. 6. - P. 510-513.

Информация о работе

Гулий, Ольга Ивановна
доктора биологических наук
Саратов, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Электрооптический анализ микробных суспензий для определения метаболической активности клеток и их детекции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы