Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электрооптический анализ клеток и клеточных структур в гетерогенных клеточных суспензиях

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Электрооптический анализ клеток и клеточных структур в гетерогенных клеточных суспензиях"

На правах рукописи

РГ6 ОД

2 0 т 1335

БУНИН Виктор Дмитриевич

ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КЛЕТОК

И КЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР В ГЕТЕРОГЕННЫХ КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЯХ

03.00.23—биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

Оболенск—199«

Работа выполнена в Государственном научном цен.ре прикладной микробиологии Министерства здравоохранения и медицинской промышленности РФ.

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор Вилсн Михайлович Кянторо доктор биологических наук Влздиспае Владимирович Смоляниноа

доктор технических наук, профессор Михаил Александрович Ханин

Ведущая организация: Институт биологического приборостроения РАН

Защита состоится Н си-асЗ 1995 г. в «О часов на заседании диссертационного совета Д 053 34 13 при Российском химике- технологическом университете им. Д.И.Менделеева ( 125047: Москва. Миусская пл. дом 9).

С диссертацией можно ознакомиться в научно-информационном центре РХП/ им. Д.И.Менделеева

Автореферат разослан

1996г.

Д

Ученый секретарь диссертационного совета- к. б. н. у И.И.Гусева

Общая характеристика работы Актуальность темы исследования :

Современный этап развития науки характеризуется значительным ускорением исследований в области биотехнологии к медицины ' Эти исследования направлены на создание препаратов на основе клеток, клеточных структур и продуктов внутриклеточного синтеза, т также на совершенствование технологии их получения.

Оптимизация биотехнологических процессов и контроль качества препаратов в первую очередь опираются на результаты оперативного анализа происходящих в клетках процессов и оценки влияния на них различных физико-химических факторов при постоянно существующей гетерогенности клеточной популяции по физиологическим, морфометрическим и иным параметрам'. Однако используемые для этих измерений методы далеки от совершенства и не обеспечивают в полной мере решения поставленных задач.

Целью диссертационной работы является развитие нового направления анализа - электрофизического метода определения параметров клеток и гетерогенности клеточной популяции. Развитие метода основано ^а решении совокупности вопросов, "включающей в себя:

• разработку теоретических аспеклов метода:

• создание методических основ его применения;

• получение алгоритмов расчета электрофизических параметров клеточных структур и показателей гетерогенности клеточной популяции:

• обоснование принципов проектирования и разработки аппаратуры:

• создание программного обеспечения для обработки данных и управления процессом измерений.

• использование полученных параметров для научно-практических целей.

Основные задачи исследования:

1.Разработка теории решения прямой и обратной электрооптической и электрофической задач;

2.Разработка алгоритмов расчета следующих параметров: •средневзвешенного размера клеток, •электрофизических параметров клеточных структур, •кинетики накопления целевых продуктов в клеточных структурах, •электрофизической и морфометрической гетерогенности суспензии клеток.

•абсолютной концентрации клеток в суспензии.

•кинетики электрофизической и физиологической модификации клеточны* с. грухтур;

Л. Разработка методологии проектирования, создание аппаратурйых и программ ных средств для электрооптического анализа клеток;

4. Применение метода для решения ряда прикладных задач микробиологии, биотехнологии и медицины.

Новизна результатов

Развитие теоретических основ и методологии применения электрооптического метода для анализа электрофизических параметров клеточных структур оценки гетерогенннссти популяции, определения физиологических, морфометси-ческих и концентрационных параметров клеток носит пионерский характер. Оно опирается на новые подходы а интерпретации результатов измерения поляризационных параметров клеток и оптического проявления эффекта их поляризуемости.

В процессе выполнения исследований разработзны новые разделы теории электрооптических явлений в гетерогенной клеточной суспензии. Рассмотрены особенности решения обратных задач электраоптического, электрофизического и морфометримвекого анализа клеток. Впервые получены алгоритмы расчета абсолютной концентрации клеток, определения морфометрических и электрофизических параметров клеточных структур, в том числе для случая гетерогенности клеточной популяции. Развит метод определения гетерогенности клеточной популяции по электрофизическим.признакам. Разработана методология построения аппаратурных и программных средств электрофизического анализа клеток. Рассмотрено использование электрофизического метода для решения на принципиально новом уровне задачи определения качества вакцинных препаратов и пробиотиков. Предложены алгоритмы оптимизации Биотахнологических процес-соз с использованием результатез электрофизического анализа.

НПУЧКО-ПС^ГП'Ч^СУ^Н зипч^мссть пзоотм

Испсгьгсаз^'З о-г.'оаСот»нчь]х алгоритмов, программного обеспечения и аппаратуры легло.--?-:- г г =(- и с зысокой точностью решить принципиально

важные задз'-!< «.-••г'": л-зтек в процессах их культивирования,

сушки И ХрЭЧсН!и

Измерение оптических и электрооптических параметров клеточной суспензии дает возможность определить абсолютную концентрацию клеток.

Определение гетерогенности клеточной популяции по электрофизическим признакам обеспечивает оперативное решение актуальной задачи оценки физиологической гетерогенности культуры.

Анализ кинетики - изменения электрофизических параметров клеточных структур позволяет создать неразрушзющий метод измерения количества накапливаемого белка, локализованного известным образом в определенной структуре, что имеет большое практическое значение при производстве лекарственных препаратов и недоступно другим неразрушающим методам измерений.

Электрооптический'анализ поверхностных параметров клеточных биотест тстеы дает возможность выполнять измерения концентрации токсичных и иных Бсществ и определять механизм их действия на клетку.

По материалам диссертации опубликовано 34 работы.

Агсообецияработы

1. По материалам работы сделаны доклады на Всесоюзной конференции "5яслрк5ор-8Г, (КкшеноБ, 1981г.), 1 Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1S32r.), Yíi Съезде Всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата, 1985г.), Всесоюзном научно-техническом совещании "Автоматизация и компьютеризация научных исследований технологических процессов и проектных работ( Москва, 1988 г.), VII International Conference EUROOPTO (Bulgaria, 1991), 7 Российской конференции по цитологии Пущина, 1994 г.), 1 Eur. Nitrogen Fixation Cent (Hungary,19Э4), Eur. Symposium "EUROOPTO 94" ( Hungary 1934), 7 Europian Congress on Biotecnology, (France, '935), Международном симпозиуме "Конверсионные разработки медицинской техники", (Москва, 1996),' Российском научно-практическом . совещании "Дисбактериозы и эубиотики" (Москеа, 1996 г.).

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, семи глав, выводов, заключения и списка литературы, включающего 225 наименований. Общий объ?'.- диссертации 167 стр. машинописного текста, включая Л p»>c>.isoe м 'Стау :*.ц.

Содержания работы

Во введение рассмотрена актуальности проблемы, анализируются цель и задачи исследования, изложены научная новизна и значимость результатов работы. выделены основные положения, выносимые на защиту.

Во второй главе в обзоре литературы изложены сведения о морфологии и физиологии клеток, о эффектах пассивного действия электрического поля на вещество и клеточные структуры. Рассмотрены особенности злектроолтического анализа клеток, приведены результаты измерения электрофизических пара-м«1роа клеточных структур рззличсиз» «етсдз?."и. сд-яэ" опюр результатов практического использования метода. Систематизированы сведения о методах и аппаратуре измерения электрофизических, морфометрических л концентрационных параметров клеток и клеточных структур.

Во третьей главе рассмотрены результаты решения прямой и обратной электрооптических задач, устанавливающих связь оптических параметров гетерогенной суспензии с поляризационными и морфс'.'етрически^и параметрами клеток. Разработана процедура расщепления экспериментальных данных на компоненты от различных механизмов поляризуемости. Исследовано решение прямой и обратной электрофизических задач.

В четвертей глаза показаны результаты решения прямой я обратной спектротурбид'/глетри.ческих задач. Приведены теоретические соотношения для обработки данных эяектроептаческих и спеетрстурбид^гетрмчесих измерений, которые позволяют определить размеры, форму и коэффициент преломления клеток, найти абсолютную концентрацию клеток в суспензии.

В пятой глазе систематизированы результаты разработки электрооптической аппаратуры и лролэа?лмного обеспечения , приведены технические данные и рассмотрено построение основных измерительных систем приборов

В шестой главе рассмотрены направления использования метода и приведены результаты применения разработанных алгоритмов обработки данных, аппаратуры и проггаггенало обеспечения для решения практических задач: контроля биотэхногогпчесгих пссцгсссз, анализа качества препаратов на основе целых клеток, !.<сни-ос:--'3 накопления в клетках продуктов биосинтеза, использования клеток /ак сУстгст систем для измерения концентрации в растворе раз-ПКЧНГ.Х - "Тг'

.„^^илт^ г.'егада и аызоды завершают работу.

Основные результаты работы

Развитие электрофизического метода анализа параметров суслендированнь к клеток и гетерогенности клеточной популяции основано на выполнении исследов; -ний в трех направлениях: создании теоретической базы и алгоритмов расчета парс-метров. создании аппаратурного и программного обеспечения для вылолне-ния измерений и проведения методических работ по использованию метода и определи ■ нию перспективных направлений его применения. На рис 1. показана взаимосвязь измеряемых параметров суспензии и расчетных параметров клеток, которая опре деляет совокупность прямых и обратных задач, необходимых для создания расчет нь:х алгоритмов.

Определение размера эксцвнтрисистета и коэффициента преломления клеток

Л. 1

Ä.2

>-„

?. j длина волны сзыта

f, частота элек~ри- Определанйо

чоского поля электрофиаи-чаеках

параметроз даюточ-ных структур

Рис.1 Прямые и обратные задачи оптического и электрофизического анализа кле точной суспензии и клеток.

В основе решения электросптической задачи' лежит обработка результатов измерения электрооптического сигнала в клеточной суспензии. Элекгросптический сигнал представляет собой изменение оптических параметров суспензии и, в частности, изменение оптической плотности при воздействии на нее гармонического электрического г.оля. Причиной изменения оптической плотности является вариация параметров светорассеяния суспендированных клеток. Эта вариация проявляется в изменении усредненного сечения рассеяния клеток.

Для суспензии гетерогенных Пи - размерам клеток усредненное сечение рассеяния в, при любой степени их ориентации определяется выражением:

б* =1 у(х .а,Ь) * УУ(х )* Р(а,Ь)* Бт* йц с^ 51П0 ¿0 с!а ЙЬ (1)

где -/(х.,а,Ь)- индикатрисса рассеяния света, Щх) - распределение Больцмана по углам ориентации, нормированное к равновероятному распределению; Р(а,Ь) -распределение клеток по размерам, нормированное к их интегральной сумме; 0,ч/ - углы направления светорассеяния, показанные на рис.2; хА - углы ориентации клетки в полярной системе координат с осью, направленной по биссектрисе угла между падающим и рассеянным светом; а,Ь - соответственно малая и большая полуоси анизометрической клетки

Направление падения светового пучка,

индикатрисса рассеяния света В

Направление светорассеяния

Рис. 2 Углы ориентации частицы

В результате решения прямой электрооптической задачи получены соотношения, связывающие изменения оптических свойстз суспензии с мосфометрическими и поляризационными параметрами клеток:

п=п-

- взо = к] I Вп Оп ехр(-п(п+1)0(а,Ь№ п=2

(2) (3)

где Оп = /01с1г; /-,1Н(т)|2(1+С2/*Рп (т) *Рп(^«1+^)/2)е1т .

т=Созх ; М= 1/2КТ; С, = Соэв;

Вп = Г.ГЕ2 *Рп(Созх(/ ) ; (4)

Выражение для множителя Оп учитывает все оптические параметры, необходимые для расщеп измзнзчия сечения рассеяния клетки при ее ориентации, а еы-оа>г-гг^1е '<-: - : гс'. ;и уз-^-^роаания в объеме суспензии электрического

поля

Решение обратной задачи состоит е восстановлении подинтегральной функции R(b) в интегральном уравнении Фредгольма 1 рода:

S(t) = Hj*K(b,t)db (5)

где S(t) = G, (t) - G.o, Н - константа. К(ЬД) - ядро интегрального преобразования Исследованные и используемые при решении электроптических задач комбинации подинтегральной функции и ядра интегрального преобразования приведены в табл. 1: Таблица 1 Варианты решения обратной элекрооптической задачи.

Восстанавливаемый параметр Подинтвграль-яая функция Ядро интегрального преобразования Степень ориентации

Распределение размеров клеток Fib) n=n* K«=ZB„Q,,exp[-n(n+1)D{b)t] сильная

Распределение размеров клеток F(b) Kwf=B2Q2e)Ep[-n{n+1)D{b)i] слабая

Дихрсичный вес da{b)*Q*F(b) exp[-n(n+1)t] слабая

Анизотропия поляризуемости da(b) К..ц= Q2F(b)cxp[-n(n+1)t] слабая

Взвешенная анизотропия поляризуемости da{b)*f={ b) i<v,ar = Q2esp[-n(n+1)tJ слабая

Из-за усповно корректного характера обратных электрооптических задач для каждой комбинации подинтегральной функции и ядра интегрального преобразования нэобходкл/ю осуществлять проверку точности решения. Для этой цели был ис-

пользован -алгоритм решения ладач "синтез-анализ", который приведен на рис 3:

Рис. 3 Алгоритм решения задач синтез-анализ.

Решение обратной задами по восстановлению 'лодинтегральной функции - распределения размеров клеток было основано на использовании алгоритма статис-тистической регуляризации. Регупяризованное решение R(b) представлялось а виде суммы среднестатического ожидаемого решения R°(b) и решения матричного уравнения Rc(b):

Ie I* IeI+ зМс11* |RC 1= Ie I* lal - ( IeI'IeI+s2* le11) Ir° I (6)

m s s где s ={f7sj )1wn, щ - ошибка измерения S(t,).E,,= — Кч, g, =-----S(ti).

i=1 s i

Ie! - транспонированная матрица. Ici '- матрица, обратная корреляционной матрице ici-

Элементы корреляционной матрицы Ici содержат априорную информацию о решении и задаются следующим соотношением:

lCtll = <Ri*R|> (7)

Функция распределения размеров бактериальных клеток имеет ассиметрич-ную форму. Одним из близких к среднеожидаемому распределению размеров является распределение Релея, которое имеет вид : f О

R\ И {-¿12} (8)

I

Vf 2- rd2 )

где Xi = г- ( b| -0.75*b -0.2 *Ъ0!< (41:г -1)) (9)

0.2 *Ь0

Ь0- средний размер клеток, Ь, - дискретные значения продольного размера

Сравнение востансаленного по релаксационной кривой распределения размеров с распределением, полученным при обработке микрофотометрических измерений, выявило необходимость коррекции расчетных соотношений связи размеров и коэффициента вращательной диффузии: кТ

D=------* ( |5+ 3*(3(1п(2р)-.5)-р) )) (10)

xr|b3fo

Р = 3(ln р-O.S62+0.917/p-0.005/p2 ' (11)

где 5 - введенный коэффициент учета формы клеток," лежащий в предела), 0 - 2. Тс - коэффициент учета пористости, ворсинчатости и других особенностей конкретного вида микроорганизмов, который лежит в пределах от 0.2 до 2.

Восстановление по экспериментальным данным зависимости анизотропии поляризуемости от размеров РОРА(Ь) выявило существование в низкочастотной области частотной дисперсии анизотропии поляризуемости отклонения от результатов. предсказываемых теорией объемной поляризуемости, что свидетельствует о наличии аддитивной компоненты поверхностной поляризуемости. Разработанный алгоритм расщеплений данных позволяет выделить сигнал одного механизма поляризуемости и за счет этого корректно подойти к решению задачи восстановления параметров клеточных структур.

Решение спектротурбидиметрической задачи позволяет параллельно определить размер Ь. фактор формы (р) и относительный показатель преломления клеток (т). Оно основано на экспериментальных данных по волновым экспонентам и мутности соответственно хаотической ориентации (п), (т) и клеток, ориентированных длинной осью вдоль (пь), (т6) и поперек (п,), (т,) светового потока, а также данных злектрогттических измерений.

Для протяженных сфероидов получены соотношения связи эксцентриситета и коэффициента преломления с волновым экспонентом:

Р = Ра/рь = [(2-па)/(2-пй)] 1,2 (12)

гг. =р кс /(4хг) + 1 (13)

где р = 3 р1/3[(Пь-Па) / (р2-1)]1Л (14)

- фазовый набег на сфере эквивалентного радиуса г, причем : р= (гл-1), (15)

Хс - средневзвешенная в пределах диапазона измерений длина волны/ _ коэффициент преломления поддерживающей среды /„ - длина волны света в вакууме

Для расчета величины г можно использовать как результаты измерения коэффициента вращательной диффузии (10),(11), так и соотношения (15) и (14).

Совместное определение этих параметров, позволяет корректно рассчитать численную (Ы), массозо-объемную (С) концентрацию и площадь Б клеток.

N = та,ь u(p) / [ к аЬК(ра,ь)]

с = Та.ь ра.ь dXc/[ 3 л Mo m К((ь.ь)] (17)

S = 4та.ьи(р)/К(р,.ь) (18)

где, К(р,р) / (0.25- (р)1'3 - фактор эффективности, инвариантный П (р,р) u(p) = р для та; и(р) = 1 для Tfc.

При априорном задании величины коэффициента преломления клеток для определения их численной концентрации можно использовать результаты только оптических и электрооптических измерений.

N|= х I К(р) * L (19)

где К(р) = К2 * Ь4 * F2 (р) (20)

L- оптическая толща образца суспензии.

F2(p) - функция эксцентриситета р и коэффициента преломления клеток, К2 - константа.

Для клеток а виде протяженного эллипсоида вращения:

F(2) 1/р2 /(1+ (рр-1)* (sinv)2) (21)

где v - угол между направление?.! светового потока и продольной осью клетки. Неизвестный параметр р при этом может быть определен из соотношения и=(т. -т) / (т-та). При линейной аппроксимации функциональной зависимости и(р) с относительной погрешностью не более 10% было получено:

р Я 0.43 * и - 0.54 (22)

Использование значения коэффициента вращательной диффузии D (Ь,а), рассчитанного по экспериментальным данным, позволило найти средний размер большей оси клетки: 1/3

b = V K1*F1 (р) / D (23)

где F1 (р) определено сотношением (10).

Объединение соотношений (20)- (23) дает возможность рассчитать приближенную величину cdïktop? ^оегтазнссти:

К{р) , К * Ол • (Р )Л ¡4/.3) * F2 (р) (24)

где р определяется соотношением (22). К включает в себя константы К1, К2, зависит от длины волны света и относительного коэффициента преломления клетки. Подстановка соотношений (24) е (19) позволяет найти Окончательный вид формуль? для определения концентрации клеток по результатам электрооптических измерений.

При решении прямой и обратной электрофизической задач основное внимание было уделено прикладным аспектам восстановления электрофизических параметров клеточных структур слоистой модели клетки. Выбор варьируемых параметров и диапазонов их изменения был основан на морфологических предпосылках и чувствительности модели к их изменению. Лодгоика параметров проводилась по

критерию минимизации невязки . экспериментальной РОРА*(и) и модельной

/

РОРАт(ш) функций:

<0|=% • Г? = X ( РОРАе(оО-РОРАт(^ )2 ) (25

> СО ,- — <01 •

Где ем , ш» - соответственно начальная и конечная частоты ЯйРА (о). Для большинства практических применений электрооптического метода представляет интерес определение весовых коэффициентов А! вклада злектрофизнче ■ ски гетерогенных фракции в общую численную концентрацию клеток при 2! А, =1. Электрооптическкй сигнал ПЗРАе(га) является суммой сигналов от электрофизически и/или морфометрически гомогенных фракций РйРА| (ш):

РОРАе(ю) = IАI * РВРА, (со) . (26)

Для определения функций РОРА, (ю) гомогенных фракций предложено использовать ряд приемов:

в специальная обработка клеточной суспензии для создания гомогенной фракции, например нагрев или другое повреждающее воздействие приведет к появлению гомогенной фракции поврежденных клеток, а выполнение злек-трооптических измерений обеспечит определение функции РОРА поврежденных клеток.

« теоретическое определение функции РОРА по электрофизическим па-

ч

■ раметрам клеточных структур при решении прямой электрофизической задачи,

• выделение гомогенной фракции из смеси другими-физическими методами и измерение ее РОРА . например, разделение лимфоцитарной фракции крови на субпопуляции с помощью препаративного электрофореза.

• измерение суммарной функции РОРА и всех составляющих функций ЯОРА за исключением неизвестной

При решении задачи определения абсолютной концентрации жизнеспособных клеток в смеси с поврежденными для определения неизвестной функции РОРА*(М) абсолютно жизнеспособных клеток используется июрстнда фум«:м«а РПРАа(о) поврежденных клеток, экспериментальная функция РОРА« (ш) и параметр А) полученный по результатам высевов:

РОАВ, («) = [РОАРе ). (1-А¥ ) * РОАРа (и) ] / Ау (27)"

где А» -- N. / N , N. - абсолютная концентрация жизнеспособных клеток

Решение обратной задачи расчета весовых множителей имеет численное решение и основано на использовании алгоритмов'теорий оптимизации. Целевой функцией при этом является невязка-между экспериментальной функцией ГОРА и взвешенными фунциями РОРА от входящих в смесь, составляющих.

¡=р]=к

Л » 2 -2 ({РОРД. (©¡) - Ау * ГОРД; (щ) - А, * РОРА. <М)> )2 (28)

¡=11=1

Минимизация -целевой функции методом случайного поиска локальных минимумов и спуском по линии максимального градиента восстанавливаемого параметра позволяет определять относительную концентрацию жизнеспособных клеток с погрешностью в 5-10%.

Для выполнения электрооптического анализа смеси клеток с существенной морфометрической гетерогенностью был разработан способ, основанный на программируемой манипуляции направления вектора поля. При манипуляции направления вектора электрического поля на 90° происходит изменение направления преобладающей ориентации клеток. Зто приводит к повторяющейся последовательности циклов просветления и замутнения суспензии относительно уровня оптической платности чзгшчвски ориентированных клеток. Этот процесс изображен на рис 4

Е

Аг-л

Рис.4 Принцип селективного электрооптического анализа суспензии клеток с существеной морфометрической гетерогенностью

Как следует из рис.4 увеличение частоты изменения направления вектора электрического поля приводит к снижению амплитуды электрооптического сигнала и • изменению его формы. Причиной этих изменений является различная степень инерционности клеток разных размеров при ориентации, определяемая величиной коэффициента вращательной диффузии. При изменении направления вектора с частотой Р (для случая изменения частоты Р в сторону ее уменьшения) мелкие клетки перед изменением направления вектора электрического поля на 90е находятся в стационарном, а более крупные клетки - в релаксационном состоянии. Изменение напряженности Е электрического поля одновременно с изменением частоты Р изменений направления вектора на 80° позволяет увеличить и выделить оптический вклад мелких клеток, находящихся в стационарном состоянии при слабой степени и>; ориентации, от вклада крупных клеток, находящихся в релаксационном состоянии при средней или сильной степени ориентации.

Выделение электрооптических откликов от фракций с существенным отличием размеров осуществляется путем использования итерационной процедуры последовательного исключения из сигнала сигналов от клеток достигающих стационарной фазы ориентации.

Е

Разработка аппаратно-программных средств дпп эпохтрооптичяского анализа клеточной суспензии

Развитие технического оснащения электрооптических измерений присело к созданию концепции проектирования аппаратуры класса "электрооптические ана-/изаторы клеток" , практической реализации электрооптического анализатора клеток и создании программного обеспечения для управления процессом измерений, обработки экспериментальных измерений и интерпретации полученных результатов.

4/ТруКТурпаЯ схема ЗЛбКТрООПТимёСкОГО сзмаЛиЗаТОра г^лсТОК приведена МсЗ

рпС 5:

Рис.5 Структурная схема электрооптического анализатора клзтск и его сопряжения с «геромс/'ьиьл» "с/п ьютером.

Первый прибор для электрооптческого анализа клеток был изготовлен ав тором в 1981 г. За 14 лет эволюционного совершенствования и улучшения техни ческих параметров было разработано 4 модификации приборов. Их основный технические особенности и области применения приведены на рис 6:

ЗЛБИК 1994 г.

'Двухлучевая фотометрия со скрещенными световыми потоками и манипуляцией поля 'Парафазные генераторы поля 'Автоматическая пробоподготовка и пробоотбор 'Работа под управлением ПК

Контроль качества препаратов на основе целых клеток

Электрофизический анализ биотест систем Использование электрофизических параметров для определения концентрации рекомб. белков

•Двухлучевая фотометрия со скрещенными световыми лучками "Парафазные генераторы поля 'Автоматизированная пробоподготовка Контроль прсшззодстеа ветеринарных вакцин «а основ« жквьгх клеток

•Двухлучевая фотометрия с механическим обтюратором

■"Стерилизуемая конструкция прибора с блоком хранения и транспорта суспензии Контроль сушки сшщиккых препаратов

Однолучзвая фотометрия Одноканальный выход генератора поля Отработаа методик измерения

Рис.6 Эволюция разработки злектрооптическ'/х приборов

Оснозные технические параметры прибора "ЭЛБИК", приведены в таблица2 Таблица 2 Основные технические параметры прибора "ЭЛБИК" Табл.2

1 Оптическая плотность исходной суспензии, ед. оп. пп 0.1-5

2 Объем исходной пробы, мл, не более п

3 Диапазон измеряемых концентраций кл/мл 10s- 10:г

4 Диапазон измеряемых размеров мкм 1 - 5

5 Диапазон изменения оптической плотности сус- ПСпогiи При ЗЛСгчТрССмТгГЧСС^СПХ r"ZT,'CpC!îi'fTX, ед.on пл 0.01- 0.5

6 Абсолютная погрешность измерения приращений фотометрического сигнала при частоте дискретизации эяектрооптических данных 10 Гц . %. не более 5*10 3

!7 Диапазон частот электрического ориентирующего поля. Гц 10"- 2.5*10'

7 Диапазон изменения напряженности электрического поля з электрооптической яч-эйке, 8/М 7*10^-7*103

Э Относительная погрешность измерения напря-. женности поля а изм. ячейке,%, на более 2

9 Коэффициент нелинейных искажений напряжения, приложенного к ячейка. %, не более 4

10 Максимальная частота дискретизации злехтрсоп-тическ«- данных , Гц - 10

11 Мгхсимальное время выполнения электрооптических измерений, мин, не более. 5

12 Режимы проболодготовки ручной, автоматический

13 Время проболодготовки, мин, не болев' 2

14 Габариты прибора мм х мм х мм 150 х 400 х 400

Рассмотрим особенности построения некоторых систем электроолтическога анализатора. На рис 7 представлена оптическая схема фотометрической си*

Рис. 7 Отеческая схема фатометрйчеакзй системы Под управлением персонального компьютера с помощью цифро-аналоговы? юеобразователэй источники тока 1 и 2 формируют два тока, которые попеременно в течение заданного времени подаются на излучатели 1 и 2. Световые потоки от излучателей после конденсоров проходят через суспензию в двух ортогональных направлениях. Один из световых потоков совпадает по направлению с вектором ориентирующего электрического поля, а другой ортогонален" ему. После прохождения системы плоских зеркал и диафрагм потоки сводятся на сегменте сферического зеркала и фокусируются на входной апертуре фотоприемника.Использование ортогональных световых потоков, поочередно проходящих через суспензию, идеального интегрирования и синхронного детектирования фотометрического сигнала повысило точность измерений нормированной разности интенсивности световых потоков до уровня 5*10"5 за счет устранения ряда возмущающих факторов: локальных флуктуации оптической плотности образца, осаждения клеток» шумов приемника и т.д..

Для реализации алгоритмов селективного анализа суспензии с существенной гетерогенностью размероз клеток разработана система манипуляции направления вектора поля на 90°, которая показана на рис 8. Манипуляция направлением вектора поля осуществляется путем коммутации пар электродов. Использование данного режима управления полем позволяет осуществить синхронную фильтрацию фотометрических данных и проводить электрооптичеазче измерения при наличии в образце 104-105 клеток.

Рис. 3 Схема управления направлением вектора Е а) -90° относительно светового потока; б) -0° относительно светового -потока.

На рис. 9 показана структурная схема разработанной системы пробоподготозки:

Рис 9. Структурная схема блока пробоподготовки

Система пробоотбора и пробоподготовки- выполняет следующие функции: «Отбор пробь( из рециркуляционного коьтура

«Измерение оптической плотности суспензии (О) и при необходимости ее разбавление в 2м раз Для достоверных измерений на уровне й<1 ед.опт. пл..

•Фильтрацию суспензии и ресуслендирование. осадка в поддерживающую жидкость. Такой средой в зависимости от вида клеток может быть дистилят. буфер или изотонический раствор. - • -

Стадия фильтации и ресуспендироеания осуществляется следующим образом. После окончания процесса разбавления, суспензия за счет вакуумирования емкости сбора отходов через открытый клапан 6 поступает в фильтрационный модуль. Клетки остаются на предварительно установленном кружке из ацетатной мембраны, а фильтрат поступает в емкость отходов через открытый'клапан 12. В момент окончания фильтрации клапан 12 закрывается и обратныйтюток буфера из емкости буферного раствора через открытый клапан 11 производит ресуспендирование клеточного осадка. Перемещение буфера происходит за счет азкуумирозания объема рабочей ячейки при открытых клапанах 5,10 и закрытом клапане 4. После завершения процесса ресуспендироеания подготовленная суспензия клэтск с замещенной поддерживающей средой через открытый клапан'13 соступает в злектрооптическую измерительную ячейку.

' Разработанный для злектрофизичэасого анализа клетск программный пакет обеспечивает реализацию следующих управляющих, вычислительных и системных процедур:

•предустановку условий измерений и управление процессом их выполнения, •обработку полученных результатов для восстановления электрофизических и мсрфометрических ;оти»в от гомогенных фракций или синтез таг,их откликов по результатам предварительных измерений,

•расчет показателей гетерогенности исследуемого образца (весовых множителей и абсолютных концентраций фракций),

•расчет электрофизических и морфометрических параметров клэток. •расчет физиологических параметров клеток и иных параметров кпзток и клеточных структур.

создание, хранение и просмотр ca.iL' .»_•.• гъз/! вГегтам измерений и расчетным параметрам.

Использование рпзультптоя аптггроопп^чоского анализа кпсток ,япя решения прнкяядных затч

Практическому использованию результатов электрооптических измерений предшедствует многостадийная вычислительная процедура, релизсвзнная в программном обеспечении и схематично представленная на рис. 10:

Рис. 10 Процедура обработки данных электрооптических измерений

' Результаты элаетрооптических измерений поу^мо указанных областей прямота применения могут служить основой для решения ряда дополнительных прикладных задач:

в Определения абсолютных концентрация фракций с различающимися электрофизическими параметрами, например жизнеспособность» . в Мониторинга процесса культивирования клеток и его оптимизации • Контроля качества препаратов на основе живых клатох

• Измерения кинетики накопления в генетачес;<и модифицированных клетках про- . дуктов биосинтеза: рекомбинантных белков, клеточных включений.

• Селективного определения концентрации токсичных веществ, БАВ и ксенобиотиков;

. Определения индуцированных и естественных изменений в морфологии клеток крови

Ниже приведены результаты применения .метода для решения практических задач.

Разработанные алгоритмы определения абсолютной концентрации клеток и фракционного состава клеточной популяции электрооптическим методом были использованы для контроля и оптимизации промышленного процесса периодического культивирования бактерий, используемых в качестве вакцины для лечения листе-риоза крупного рогатого скота. На рис.11 показаны функции FDPА(м) образцов поврежденных, абсолютно жизнеспособных клеток и эспериментального образца, использованного для синтеза функции FDPA,(m) абсолютно жизнеспособных клеток. На рис.12 показаны результаты измерения оптической плотности и концентрации клеток как функции времени их культивирования .

Рис. 11 Функции FDPA(w) образцов клеток Listeria в -поврежденные клетки В - абсолютно жизнеспосо5н-.ч--зетгеркментальный обг:в-;

Рис 12 Изменения оптической плотности

л •;.е'-ц^грац'.-и (С) жизнеспособных »-!(3тс\ ь !i,-Oc=cce к/льтиаиро-

МШ'я

Функции FDPAo поврежденных клеток была получена при электрооптическом анализе клеток Listeria после теплового воздействия при 90° С'в течение 20 мин).

Из данных на рис 12 следует, что использование результатов измерения оптической плотности для оценки концентрации клеток невелирует протекающие в ферментере процессы. В частности, остается незамеченным шоковое воздействие щелочи при подтйтровке культуральной среды на шестом часе роста.

Уменьшение числа жизнеспособных клеток на завершающей стадии культивирования при увелечении оптической плотности культуральной среды свидетельствует с погашении общей концентрации ¡снеток. Одняк-о пйовопоичиной этого hdo-цесса является значительный рост числа погибших клеток, который не восполняется увеличением количества жизнеспособных клеток. В данном случае, как следует из графика,-прекращение культивирования в момент, соответствующий максимальному количеству жизнеспособных клеток, обеспечивает увеличение выхода клеток на 10-15% в сравнении с регламентным временем завершения процесса.

Электрофизический метод измерения концентрации жизнеспособных леток особенно удобно использовать для контроля показателей качества долго растущих культур, например, противотуберкулезной вакцины БЦЖ . Относительная погрешность определения абсолютной концентрации в сравнении с результатами высевов составляла 10-20% при времени одного измерения не более 7-10 мин.

Анализ временных изменений электрофизических параметров клеточных структур был использован в процессе культивирования клеток Е coli. В модифицированных клетках штамма Е. coli SG20050 исследовалась кинетика накопления гибридных белков, состоящих из цитокинез человека и обладающих противоопухолевым и иммуностимулирующим действием. Плазмидз pThy315 кодировала синтез гибридного белка он -фактор некроза опухолей - тимозин - ai (ФНО-Т), pThy230 -ai тимозин- фаюгор некроза опухолей- ai (Т-ФНО), pThy325 - синтез белка он тимо-зин-cti -фактор некроза опухолей-тимсзин-а1(Т-ФНО-Т).

Для определения кинетики накопления белков использовали данные по динамике изменения диэлектрической проницаемости цитоплазмы и цитоплазмати-ческой мембраны, восстановленных по форме экспериментальных функций FDPA(o). Графики изменения, диэлектрической проницаемости мембраны, диэлектрической проницаемости, цитоплазмы и электропроводности цитоплазмы как

функции времени культивирования для безплазмидного и плазмидных штаммов представлены соответственно на рис. 13,14 и 15.

Рис.13 Изменение диэлектрической про- - Рис.14 Изменение электропроводности ницаемости мембраны в процессе куль- цитоплазмы в процессе культивирования тивирования ® - клеток без плазм. » - клеток без плазмиды • - с плазыидой рТЪу315 а - клеток с.плазмидой рТЬу315

Рис.15 Изменение диэлектрической проницаемости цитоплазмы э процессе куль^ тивирозания в - клеток Оезплэ^м * - с плазмидой рТЬу 230

Рис. 16 Сравнение результатов измерения концентрации гибридных 'белков... е - ¿?лектрлзп^чеслим методом © -Д4иси7см?т* * исгим метода .!

Изменения в процессе культивирования электропроводности цитоплазмы клеток согласно рис. 14 для всех штаммов носит одинаковый характер и отражают интенсивность процессов метаболизма.

Накопление белка, синтезируемого плазмидой рТЬу 315 приводит к увеличению эквивалентной толщины мембраны, ее более рыхлой структуре и вытеснению части связанной гидратной воды. Указанный процесс сопровождается снижением величины ет этой структуры, что видно из рис. 1.3.

Изменение диэлектрической проницаемости цитоплазмы с^для штамма с плазмидой рТЬу 230 достаточно существенны. Явное уменьшение величины ес от 40 до 28 сопряжено с увеличением в объеме цитоплазмы количества белка с низкой диэлектрической проницаемостью и уменьшением количества связанной воды с высокой диэлектрической проницаемостью

Синтез белка и его накопление в определенной клеточной структуре сопровождается изменением ее электрофизических параметров. Выбор определенной модели, описывающей данный процесс позволяет установить взаимосвязь между изменением параметра и концентрацией локализованного соединения. В частности, при электрофизическом моделировании мембрана была представлена в виде однородного монослоя с постоянной толщиной. Однгко фактически она содержит ли-пидный слой и примыкающий к ней слой гидратной воды с гранулами накапливаемого белка. При росте клеток наблюдается увеличениз числа белковых образований в объеме гидратного слоя и в предположении неизменной толщины слоя происходит вытеснение соответствующего количества гидратной"воды. Изменение диэлектрической проницаемости мебраны отражает этот процесс перераспределения фаз.

При данных условиях относительное весовое содержание. \Л/ белковой фракции с диэлектрической проницаемостью ер в смеси с гидратной водой можно определить из соотношения:

(£;*£») {Ср-Е№)

17 =-*----(29)

где - диэлектрическая проницаемость смеси

е* - диэлектрическая проницаемость связанной соды.

При расчете абсолютного содержания белка, прикрепленного к цитоплазмати-ческой мембране суспендированных клеток, необходимо дополнительно учитывать концентрационный фактор и объем области локализации белка:

Р = \Л/*К*Б*с1*с1А (30)

где Р - абсолютное содержание белка (мг/мл) К - концентрация клеток в единичном объеме Э - площадь цитоплазматической мембраны (тпкт 2) - удельный вес белка (мг/мк 3) ¿А - толщина слоя гидратной воды (мк) Входящая а выражение (30) абсолютная концентрация клеток К определяется по результатам электрооптических измерений размеров клеток. Толщина слоя гид-ратной воды с!А в первом приближении соответствует толщине цитоплазматической мембраны. Если клетка имеет форму эллипсоида вращения, то площадь ее мембраны Б - а*ЬЬ.

Сопоставление результатов олектрооптического и денситометрического методов определения концентрации белка приведенное на рис 16 гсказывает. что относительная погрешность определения количества белка в различных точках кривой роста с помощью электрооптического метода в сравнении с результатами денси-тосметрии не превышает 15%. Поэтому данный метод определения концентрации эндогенных препаратов с известной локализацией может быть успешно использован .для оперативного контроля их биосинтеза.

Электрооптический метод анализа был использован для исследования изменений внутреннего строения культуры В. Миппдшпз^ уаг. даПепае штамм 26 в процессе роста и дифференциации. Клетки выращивались на ферментере АК-10 а режиме лериодичесукого культивирования при температуре 30сС в питательной среде содержащей (в г/л) ферментативный гидролизат дрожжей (20), глюкозу (10), МдЭОд *7Н20 (0.35), гпБСи *7Н20 (0.02), СаС12*Н20. Для посева использовали вегетативную культуру 5-6 часов роста, выращенную на аналогичной среде. Комплексные измерения проводили на различных фазах развития культуры: 4 часа- активный вегетативный рост, 8 часов- образование гранул полигидроксимасляюй кислоты б цитоплазме, 12 часов - формирование спор. 15 часов- о-ззоерание сгор. 20 чассв-заЕершенкэ выхода эндоспор из спорзнгийг,

На рис 17 показаны изменения параметров, характеризующих динамику роста и дифференциации клеток и схематическое представление наблюдаемых в клетках

морфологических изменений.: N рН

Кг/л

Рис 17 Изменение основных показателей процесса культкгироБзнья и морфологии

клеток

2

л п

-рН среды. - оптическая плотность среды, -¡о

»нцентрация вегета-

□

тивных клеток, о - концентрация спор, •-* - концентрация глюкозы. ® - гранулы полигидроксимасляной кислоты, ^-спсры, '—'-кристаллы. Как следует из графиков оптической плотности и концентрации, линейная связь между величиной оптической плотности я концентрацией вегетативных клеток нарушалась к 12 часам культивкрсганкя .Последующее увеличение концентрации спор и умэньшение концентрации сегстатионых клеток в интервале 16-20 часов развития культуры сопровождались уменьшением величины оптической плотности . Это свидетельствует о меньшем чем у клеток сечении рассеяния спор, причем их больший коэффициент преломления нэ компенсирует уменьшение их размера. В соответствии с трафиком изменения концентрации глюкозы, основные метаболические

процессы завершаются к 12 часам культивировании и далее идет процессы дифференциации клеток.

На рис 18 показаны результаты обработки функций РРРА в приближении гомогенности суспензии при использовании применявшейся на момент исследований модели однородного эллипсоида:

Рис 18 Зависимость усредненных параметров клеток Вас.№илпд(еп51& от времени культивирования ; ' - размер клеток, © - электропроводность клетки, Щ - диэлектрическая проницаемость клетки.

Характер изменения электропроводности клетки от времени культивирования носит куполообразный характер с характерным максимумом а период наивысшей активности метаболических процессов. Резкий спад электропроводности к моменту завершения спорообразования характеризует перераспределение электрооптического отклика между вегетатикой, доминирующей в начальной стадии культивирования и спорами, дающими основной отклик 8 конце периода спорообраования.

Аналогичную интерпретацию имеет характер изменения диэлектрической проницаемости усредненной композиции из вегетативных клеток и спор. Значитель-' ное увеличение числа спор с меньшей чем у клеток диэлектрической проницаемостью приводит к снижению в конце процесса спсруя-^ли величины этого пара-

метра. Уменьшение среднего размера клеток я меньший размер спор лотверждает выводы о причине снижения оптической плотности в конце.лроцесса споруляции.

Электрофизический анализ взаимодействия клеточных биотест систем с различными веществами и механизмом взаимодействия проводился в трех направлениях: определение изменения функции FDPA (ca=Const, t) при неспецифическом взаимодействии с нетоксичными высокомолекулярными веществами, определение изменения функции FDPA (ш, t= Const) при специфическом взаимодействии с нетоксичными высокомолекулярными веществами, определение изменения функции FDPA (ш, t= Const) при неспецифическом взаимодействии с токсическими веществами.

В качестве биотест системы были использованы клетки Е. coli. На их поверхность адсорбирозался белок гемоглобин. В результате серии измерений был получен набор кривых зависимости функции FDPA ( i, с;= Const) при различных концентрациях ВМС , который показан на рис. 19:

210

—^—Рлд1 20 нМ ВМС —I— Ряд? 50 нМ ВМС —ь~ РядЗ 100 нМ ВМС —й—Ряд4 200 нМ ЕМС tf DM С

Ссг/лды

Рис. 19 Поседение функций РОРАД о=Сапй.) при различных ¡юнцентрациях В"*С

При исслодоззнии реакций специфического сзязъсеккя типа антяггн-пититепо з качестве корпускулярных к«атуносзр5эн?сз г.слсльосззли «ятки В. ро1ут!за с иммобилизованными на их посерхносги гпутгргг^м гг^дсгида'Л

,тителаш1 - овечьими иммуноглобулинами против !дМ чалозсгз .'

Результаты измерения функций РОРА до и после взакмедзйсгг^я г^кгэдсны на рис 20:

Частота Гц

—0— иммуносорбент —I—то же + АГ

Рис. 20 Функции РОРА(со) биотест системы В. ро!угшха до и после специфического взаимодействия

На рис.21 показаны результаты неспецифического воздействия сулемы (НдСЬ) при ее концентрации ниже и выше ГЩК на фибропласты эмбриона крысы :

Рис. 21 Функции РОРА(о>) биотест системы -фибропластов эмбрионов крысы при действии на них сулемы вга - контроль, сэ - конц. 0.03 мкг/мл, • - 3 мкг/мл

Полученные данные свидетельствуют о принципиальной возможности использования элеетрооптического метода для концентрационных измерений различных веществ по изменению электрофизических параметров клеток биотест системы.

Выгоды

1.Развиты теоретические, технические и юетодологачестдае основы электрооптического анализа сусттэндетрозаниых кгаггох

2.Ра»рзботакз т&срия и алгоритмы решения прямых и обратных задач анализа параметров клеток и клеточкой суепенгки:

• рассмотрено решение прямой и обратной электрооптических задач для слабой и сильной степени ориентации клеток в условиях морфометрической гетерогенности образца. Получены простые расчетные соотношения, реализованные в программном обеспечении,

• впервые получены расчетные соотношения и алгоритм восстановления зависимости анизотропии поляризуемости от размера клеток. На основе результатов анализа этой зг.зисикости предложен метод экспертиз нтаяьного определения действующего кйхакугзма поляризуемости, псгвояяжац'лй разделить экспериментальный сигнал нз супгргтсзищзд сигналов, обусловленных рззными механизмами полгризуэ«ости;

» вьерсые разработан алгоритм и преграмг/ное обеспечение для восстановления распределения размеров' баэте-ризльных клеток по форме релаксационной часта элгктроептичеаазго сигнала при стльнсй степени зшктроолтаческого сигнала;

• разрсЗотен алгоритм и прсгремг.^ноэ обеспечение для восстановления распределения размероз бактериальных клеток по ферма релаксационной части элестрооптического сигнала с учетом отклонения реальных аналитических соотношений взаимосвязи КВД с размержи и формой клеток от. теоретических;

» рассмотрены особенности решения обратной электрофизической задачи, разработан алгоритм и программное обеспечение для ее. решения. Исследована точность и функциональная чувствительность решения . по отношению к различным электрофизическим параметром клетки;

» выполнено совместное решение спектротурбид11метрической и электрооптической задач, позволившее на основе экспериментально измеряемых параметроз впервые получить аналитические соотношения для расчета усредненного сечения рассеяния клеток. На основе полученных соотношений реализован способ определения абсолютной концентрации клеток в суспензии;

• развит электрооптический метод определения, электрофизической гетерогенности состава клеточной суспензии, реализованный в разработанном алгоритме и программном обеспечении.

3. Разработаны принципы проектирования приборов электрофизического

анализа клеток и оптимизации их отдельных узлов.

1

• разработан. ряд приборов для электрофизического анализа клеток и вспомогательных устройств для подготовки клеточной суспензии к измерениям.

• разработана новая конструкция построения дифференциальной фотометрической системы, которая обеспечивает регистрацию относительных приращений фотометрического сигнала на уровне 2*10"5%;

• разработан новый способ и устройство для селективного электрооптического анализа суспензии клеток с их существенной морфометрической гетенностью;

• разработаны алгоритмы оптимизации конструкции электрооптической ячейки для выполнения элегпрооптических измерений в широкой полосе частот :

• разработан программный пакет "Е1_В1С", охватывающий управление электрооптическим анализатором, решение задач эпехтросптики. электрофизического анализа клеток, концентрационных измерений и

I

спектротурбидиметрии гетерогенных по морфометрическим и электрофизическим свойствам суспензии клеток.

4. На основе разработанных алгоритмов и аппаратуры создана методология

решения прикладных задач биотехнологии а медицины, б частности:

• определения концентрационных параметров и гетерогенности клеточной популяции;

• мониторинга биотехнологических процессов и контроля качества препаратов на основе целых клзток;

• кинетики модификации клеточных структур;

• электрофизического анализа изменения параметров клеточных Биотест систем.

Список опубликованных по теме диссертации работ

1. Фомченков В.М., Брезгунов В.Н., Бунин В.Д., Методические и аппаратурные вопросы регистрации электроориентации и диэлектрофореза клеток Тезусы докладов Всесоюзной конференции "Биоприбор-81", Кишенэа. 1981. с 6-7.

2. Брезгунов В.Н., Бунин В.Д., Фомченков 8.М.. Устройство для микробиологических исследований, Пат. 784865, 1980г. БИ N¿5

3. Брезгунов В.Н.. Бунин В.Д., Каменсков Б.П., Сигаев Ю.Ф. Прибор для регистрации ориентационных и диполофоретических спектров,- Препринт Описание научных принципов, устройства новых приборов и методики пользования ими Пущино 1982 с 32-39.

4. Брезгунов В.Н., Бунин В.Д. Оптимизация электродных систем широкополосных электрооптических измерительных ячеек - Депонент ОНТИТЭИ микробиопром М., 1982,7/05-2027.

5. Брезгунов В.Н., Бунин В.Д., Каменсков Б.П., Сигаев Ю.Ф. Приборы для регистрации ориентационных и диполофоретических спектров клеточных суспензий Материалы 1 Всесоюзного б&тофпзического съездат 1Y, Новые физические методьТ и приборы в биологических исследованиях 2170, М.-, 1932, с 201.

6. Бунин В .Д., Разработка метода и аппаратуры электроолтического анализа гетерогенных бактериальных суспензий, Автореф. Дисс. на соиск. уч. степ. канд. тех. наук., 1983.

7. Брезгунов S.H., Бунин В.Д., Попов В.Г. и др. Анализ изменений электрофизических и морфометрических параметров в период роста и споруляцииу Вас. thuringiensis. Микробиология, 1934, 3, с. 331-386.

8. Брезгунов В.Н., Бунин З.Д., Швец Н.В., Волошин А.Г., Ссетогоров Д.Е., Щепкина А.Н. Определенна элеетрооптичееккм методом числа неповрежденных бактериальных клеток после экстремальных еогдзйстекй М., Кчкробкапетя, 1985, т.54, вып. 4, с. 616-620.

9. Брезгунов В.Н., Бунин В.Д.. Волошин А.Г., Швец Н.В. Электрооптечоекий метод контсроля биотехнологических процессов Тезисы Yü Съезда Всесоюзного микробиологического общества "Достижения микробиологии- практике". Алма-Ата, 1985, 4, с. 19.

Ю.Сзетогороз Д.Е. Бункн В.Д., Брезгунов В.Н., Элекгрооптачеокий метод определения зависимости анизотропии поляризуемости от рззиероз WI., . Коллоидный ж., 1S37, Т49, N4, с. 802-805.

11.Разработка опытного образца электрооптичэского анализатора клеток, Заключительный отчет по теме ИГШ-1685 К, научи, .рук. В.Н.Брззгуноз, В .Д.Бунин, Архив ВНИКПМ, Инв. N 279, АН 1937г.

12.Андреев С.Н., Брезгунов В.Н., Бунин В.Д., Каменсксз Б.П., Сигаез Ю.Ф. Электрооптический анализатор клеток ГЛ., Биотехнология, 1938, N 5, с. 33. ?

13.Бунин В.Д., Брезгунов В.Н., Устройство для электрооптического анализа суспензии клеток, Пат. N 1635557 от 5.09.88

14.Брезгунов В.Н., Швец Н.В., Волошин А.Г., Бунин 8.Д., Симакова Р.А., Ященко Н.Г., Определение размеров бактериальных клеток электрооптическим методом М. Коллоидный ж., 1989, т.51, N5, с. 842-847.

1 б.Лапыш М.Е., Игнатов С.Г. Бунин В.Д. и др. Использование электрооптического метода для оперативного определения жизнеспособности бактериальных клеток, Микробиология 1989, Т. 58, вып. 3, с. 515-517.

16.Бунин В.Д. Волошин А.Г. Способ определения концентрации суспендированных клеток эллипсоидальных и простых форм, Пат. N 1669807 от 9.06.89

17.Бунин, А.Г.Волошин Измерение концентрации микроорганизмов с использованием электрооптических данных тез.докл. 1 Всесоюзной конференции "Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем" Велегож 1990. с 13

18.М.Е.Лалыш, Д-Е.Светогоров, С.Г.Игнатов, В.Д.Бунин Анализ возможностей использования нелинейной области электрооптического эффекта для определения концентрации и анизотропии поляризуемости бактериальных клеток тез .докл. 1 Всесоюзной конференции "Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем", Велегож 1990. с15

19.Оперативная диагностика состояния бактериальных клеток в процессе производства препаратов по результатам элекгрооптических исследований Д.Е.Светогороз В.Д.Бунин, А.Г.Волошин, М.ЕЛапыш, С.Г.Игнатов, В.Н.Брезгунов тез.докл. 1 Всесоюзной конференции "Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем", Велегож 1990. с 19

20.5резгунов В.Н., Бунин В.Д." Новейщие разработки приборов, математического

• обеспечения и,методик для электрооптического анализа клеточных суспензий, Препринт, Серпухов, ,1990, с. t-34.

21 .Bunin V.D., Voloshin A.G., EiectSrooptical technique dor measuring microorganism conpentraíion, Abstracta of VI Int. Symp. "Colloid and molecular Electrooptics", ELECTROPTO' 91, Sept.1991, Varna, Bulgaria, p.65.

22Ananchev V.N., Brezgunov V.N., Bunin V.O., Esin A.V., Electrooptical analizaterof ■ coils Ahstracts of VI Int. Symp." Colloid and molecular Electrooptics". ELECTROPTO' 91, Sspt.1991, Varna, Bulgaria, p.59.

23.Bunin, V.N.Brezgunov, A.G Voloshin, D.E.Svetogorov. Application of the electrooptical methods of the analysis of bictechnological processes. 1992, Colloid and Molecular Electrooptics. 207-211. IOP Publishing, Bristol.

24.Shchyogolev S., Khlebtsov N.. Bogatyrev V., Sirota A., Bunin V., Recombination of the spectroturbidimetric and electrooptical methods for multipurpose analysis of cells, Book of Abstracts of the First Eur. Nitrogen Fixation Conf.-Szeged, Hungary. Aug. 1994,-p.143.

25.Shchyogolev S.Yu.. Khlebtsov N.G., Bunin V.D.. Sirota A.I.. and Bogatyrev V.A

Inverse problems of spectroturbidimetry of biological disperse systems with random and ordered particle orientation, Proc SPIE , 1^94, V. 2082, p.167-176.

26.V.D Bunm. A.G. Voloshin The electrooptical method for the determination of parameters of cellular structures and its application in biotechnology, 7 Europian Congress on Biotecnology, Nica, France, 19-23.2.95 Abstracts, v 2, p 186.

27.Bunin. A.G. Voloshin. Determination of the cell structure electrophysical parameters and cell population heterogenity, J. of coll. & int. science (in print).

28.V.D.Bunin. A.G.VoIoshin.Z.F.Bunina, V.A.Shmelev. Electrophysical monitoring on cultivation process of recombinant E.Coli strain, Biotech & Bioeng. (in press).

29.Волошин A.i ., Лапыш ГЛ.И.. Игнатов С.Г., Бунин В.Д. Использование электрооптического метода для контроля бактериальной популяции, Прикладная биохимия и микробиология, 1996, в печати.

30.Бунин В.Д. Электрооптический анализ клеток: 'определение параметров клеточных структур и гетерогенности клеточной популяции, Сборник трудов Международного симпозиума "Конверсионные разработки медицинской техники", Москва. 1996, (в печати).

31.Бунин В.Д., Волошин А.Г. Метод и устройство измерения абсолютной концентрации клеток и фракционного состава популяций, сборник трудов Российской научно-практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики", Москва, с.8.