Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Электрохимическое восстановление цитохрома Р450 2В4 с использованием нанокомпозитных электродных материалов: стехиометрия и термодинамика
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Электрохимическое восстановление цитохрома Р450 2В4 с использованием нанокомпозитных электродных материалов: стехиометрия и термодинамика"

На правах рукописи

РУДАКОВ Юрий Олегович

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ ЦИТОХРОМА Р450 2В4 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАНОКОМИОЗИТНЫХ ЭЛЕКТРОДНЫХ МАТЕРИАЛОВ: СТЕХИОМЕТРИЯ И ТЕРМОДИНАМИКА

03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

^ п >

Москва 2009

003468214

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Виктория Васильевна Шумянцева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ольга Михайловна Ипатова

доктор химических наук, профессор Аркадий Аркадьевич Карякин

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится 14 мая в 1430 часов на заседании диссертационного совета Д.001.010.01 при ИБМХ РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, 10. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБМХ РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, 10.

Автореферат разослан «_» апреля 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Ь кандидат химических наук /

Карпова Елена Анатольевна

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Цитохромы Р450 - гемопротеины, характерные почти для всех живых существ. В организме человека они содержатся в различных органах и тканях (Lewis D. F. V., 2001). Цитохромы Р450 обладают свойством гидроксилировать неактивные атомы углерода органических молекул, повышая полярность гидрофобных ксенобиотиков, и способствуют их выведению из организма (Archakov A.I. et al., 1990; Ortiz de Montellano P. R., 1995). Цитохромы P450 катализируют около 60 типов химических реакций и метаболизируют примерно 1 миллион различных соединений, участвуют в синтезе стероидных гормонов (Lewis D.F.V., 2001; Archakov A.I. et al., 1990; Zangar R.C. et al., 2004). В последнее время пристальное внимание уделяется персонифицированной медицине и роли цитохромов Р450 в метаболизме отдельного организма (Nicholson J.K., 2006; Карузина И.И., 2008). Все это делает цитохромы Р450 перспективными объектами в создании биосенсоров для анализа потенциальных лекарственных препаратов (Wang J. et al., 1999) и оценке индивидуальной переносимости пациентами химиотерапии, правильном выборе методов лечения.

Ранее была показана возможность замены доноров электронов NAD(P)H и дополнительных белков редокс-партнеров электрохимическим восстановлением цитохромов Р450 (Faulkner К. et al., 1995; Kazlauskaite J. et al., 1996; Rusling J.F., 1998; Lei С. et al., 2000; Joseph S. et al., 2003; Shumyantseva V.V. et al, 2004). Биоэлектрохимические цитохром Р450-системы эффективны для анализа фермент-субстратных взаимодействий. Изучение стехиометрии таких систем, моделирующих природный каталитический цикл, особенно важно для последующего конструирования сенсорных устройств, направленных на анализ новых лекарственных форм.

Целью данной работы было изучение стехиометрических соотношений компонентов электрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4 (субстратов -бензфетамина и кислорода, образующегося пероксида водорода и формальдегида как продукта N-деметилирования субстрата) и определение термодинамических параметров электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1) Иммобилизовать цитохром Р450 2В4 на печатный электрод, сохранив каталитическую активность фермента.

2) Разработать метод детекции продуктов электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4, иммобилизованного на печатный электрод, позволяющий регистрировать образование пероксида и поглощение кислорода в кинетическом режиме.

3) На основании полученных количественных данных об образовании пероксида водорода, Ы-деметилировании субстрата и поглощении кислорода, определить стехиометрические параметры электрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4, иммобилизованного на печатный электрод.

4) Определить зависимость окислительно-восстановительного потенциала цитохрома Р450 2В4 от температуры в анаэробных условиях, рассчитать термодинамические параметры электрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4.

Научная новизна работы

Впервые был предложен биэлектродный метод детекции пероксида водорода, образующегося в результате электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4, иммобилизованного на печатном электроде. В работе впервые определены стехиометрические параметры электрокаталитического цикла цитохрома В450 2В4 в присутствии и отсутствии субстрата (бензфетамина), что позволяет сравнить модельную систему иммобилизованного цитохрома Р450 2В4 С природной монооксигеназной системой. Определены термодинамические параметры электрокаталитического цикла цитохрома РЧ50 2В4, сделаны выводы о вкладе термодинамических параметров в электрохимический потенциал.

Научно-практическая ценность работы

В результате проведенного исследования разработаны методы получения биосенсоров с полимерным покрытием, стабилизирующим фермент, которые могут быть использованы в качестве системы, моделирующей природный цикл цитохрома Р450 2В4.

Разработана биэлектродная схема, позволяющая при соответствующем выборе измерительного электрода анализировать продукты электрохимических реакций в кинетическом режиме. При использовании в качестве измерительного электрода сенсора с наноразмерным покрытием берлинской лазури или сенсора с иммобилизованным цитохромом с были проведены количественные измерения пероксида водорода. Микроэлектрод Кларка использовали для измерения поглощения кислорода в электрокаталитическом цикле цитохрома Р450 2В4.

Показана адектватность замены редокс-партнеров и дорогостоящих восстановительных агентов NADH и NADPH цитохрома Р450 2В4 электрохимическим восстановлением.

Экспериментально определена зависимость окислительно-восстановительного потенциала от температуры и рассчитаны термодинамические параметры электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4 при иммобилизации на структурированный наночастицами золота графитовый электрод.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006), VII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2008» (Уфа, 2008), V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008), Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2008), Первом международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 5 публикаций в сборниках докладов научных конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, посвященного материалам и методам наноструктурирования поверхности электродов, используемых в биоэлектрохимии, глав «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», выводов и списка цитируемой литературы, включающего 307 источников. Работа изложена на 138 страницах текста, содержит 33 рисунка и 4 таблицы.

Материалы и методы

Реактивы: цитохром с сердца лошади (Merck), цитохром Р450 2В4 (17-18 нмоль/мг, А41&/А278 = 1.5), выделенный из печени кроликов, индуцированных фенобарбиталом, и очищенный, как было описано ранее (Karuzina 1.1. et al., 1999), дидодецилдиметаламмоний бромид (ДЦАБ) (Sigma-AIdrich), золотохлористоводородная кислота HAuCLr3H2C) (Sigma-AIdrich), 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая

кислота), АБТС (Sgma-Aldrich), боргидрид натрия (Actos organies), каталаза (2800 ед/мг, Sgma), ацетилацетон (Aldrich), ацетат аммония (РЕАХИМ), уксусная кислота (РЕАХИМ), 5% раствор нафиона в низкомолекулярных спиртах (Fluka). Все другие использованные в работе вещества были по степени очистки не ниже уровня о. с. ч. Для приготовления растворов использовали бидистиллированную воду.

В работе использовались трехконтактные печатные электроды, рабочий (диаметр 2 мм) и вспомогательный электроды - графитовые, электрод сравнения — хлорсеребряный (ООО НПП «ЭЛКОМ», Россия, www.elcxim-moscow.ru).

Золотые напочастицы, стабилизированные ДДАБ получали восстановлением водного раствора золотохлористоводородной кислоты боргидридом натрия по методике, описанной ранее (Shumyantseva V.V. et al., 2004).

Приготовление ферментных электродов

На рабочую поверхность электрода наносили 2 мкл раствора золотых наночастиц, стабилизированных дидодецилдимешламмоний бромидом (Аи/ДДАБ-элеютрод) в хлороформе и инкубировали в течение 30 минут для испарения хлороформа.

Иммобилизация цитохрома Р450 2В4. На модифицированный Аи/ДДАБ-электрод наносили 0,2 нмоль (2 мкл 100 мкМ раствора) цитохрома Р450 2В4, через 30 минут наносили 1 мкл 5% нафиона. Перед проведением эксперимента электрод выдерживали при +5°С в течение 12 часов.

Иммобилизация цитохрома с На электроды ••■>. наносили 2 нмоль (2 мкл 1мМ раствора) цитохрома с в 0,1 M калий-фосфатном буфере (pH 7,4), через 30 минут наносили 1 мкл 5% раствора нафиона.

Приготовление биферментных электродов

Перед иммобилизацией фермента на рабочую поверхность электрода наносили 2 мкл раствора золотых наночастиц, стабилизированных дидодецилдиметиламмоний бромидом (ДЦАБ) в хлороформе и инкубировали в течение 30 минут.

На электроды наносили 2 нмоль цитохрома с (2 мкл 1 мМ раствора в 0,1 M калий-фосфатном буфере), 0,2 нмоль цитохрома Р450 2В4 (2 мкл 100 мкМ раствора в 0,1 M калий-фосфатном буфере), через 30 минут наносили 1 мкл 5% раствора нафиона.

Электрохимические измерения проводились с использованием потенциостата Autolab PGSTAT 10 (Eco Chemie, Нидерланды) с программным обеспечением GPES. Электрохимический сигнал электродов с иммобилизованным цитохромом Р450 2В4 регистрировали методом циклической вольтамперометрии. Измерения проводились в 0.1 M фосфатном буфере (pH 7,4), содержащем 50 мМ NaCI (электролитный буфер), скорости

сканирования от 5 до 200 мВ/с, в интервале потенциалов +200 + -700 мВ. Значения потенциалов приведены относительно хлорсеребряного электрода (Ag/AgCl) сравнения.

Для регистрации в кинетическом режиме образования пероксида водорода и поглощения кислорода был использован бипотенциостат IPC-Tween (Институт физической химии и электрохимии им. Фрумкина РАН, Россия) с программным обеспечением IPC_Tween. Данный прибор позволяет поддерживать заданное напряжение независимо на каждом из двух рабочих электродов (измерительном и операционном с иммобилизованным цитохромов Р450 2В4).

Электрохимическое восстановление цитохрома Р450 2В4 проводилось в 0,5 мМ растворе бензфетамина (или без субстрата) в электролитном фосфатном буфере при потенциале на рабочем электроде Е = - 450 мВ.

В качестве датчиков пероксида водорода использовались печатные электроды, модифицированные берлинской лазурью (Puganova Е.А. et al., 2005), а также печатные графитовые электроды, модифицированные цитохромом с (Krylov A.V. et al, 2004). Потенциал, подаваемый на измерительные электроды, был равен 0 мВ и. -50 мВ, соответственно. Определение концентрации пероксида водорода проводили по градуировочному графику. Концентрацию пероксида водорода в исходном растворе определяли спектрофотометрически (е 240=43.6 М"'см"') (Krylov A.V. et al., 2004).

Измерение количества кислорода, поглощаемого в ходе ферментативной реакции цитохрома Р450 2В4, производили амперометрически с помощью микроэлектрода Кларка (Instech, США) при потенциале -700 мВ (Clark L.C., 1953). Над раствором создавалась атмосфера аргона для предотвращения дополнительного доступа кислорода воздуха в ячейку. Калибровка микроэлектрода Кларка проводилась амперометрически, измерением тока при атмосферном давлении (100% содержания кислорода, 240 мкМ) (Clark L.C., 1953; http://antoine.frostburg.edu/chem/senese/101/solutions/faq/predicting-DO.shtml) с последующим добавлением дитионита натрия и регистрацией максимального изменения тока, принимаемого за нулевое значение кислорода в буфере. Разность значений этих токов принималась за величину, соответствующую концентрации растворенного в буфере кислорода.

Для определения термодинамических параметров каталитического цикла на электроде с иммобилизованным цитохромом Р450 2В4 регистрировались цикловольтамперограммы в анаэробных условиях в диапазоне температур 5+40°С с шагом 5°С. Из цикловольтамперограмм определяли величины окислительно-восстановительного потенциала для каждой температуры как среднее значение соответствующих потенциалов

Ер а н Ер.с. Термодинамические параметры рассчитывались из зависимостей от Т и Е^/Т от 1/Т. В работе использовался термостат ThermoStatRus (Eppendorf, США).

Спектрофотометр ические измерения проводили на спектрофотометре Сггу 100 (Varian Inc, Нидерланды). Скорость N-деметилирования бензфетамина в каталитической реакции цитохрома Р450 2В4 определяли по количеству выделившегося формальдегида, дающего окрашенный продукт с реактивом Нэша, используя коэффициент экстинкции £412 = 4000М"1см'1 (Nash Т., 1953; Kaiawal.P. et al., 1999).

Измерение пероксида водорода, образовавшегося в результате электрокаталитической реакции цитохрома Р450 2В4, проводили спектрофотометрически с использованием пероксидазы хрена и субстрата АБТС.

Для проведения экспериментов в присутствии каталазы в 1 мл рабочего буфера добавляли каталазу (2800 ед/мг) и проводили электролиз с использованием электродов F450 2В4/нафион в течение 1 часа при контролируемом напряжении -450 мВ (относительно Ад/АдО). Концентрацию образовавшегося пероксида водорода определяли спектрофотометрически, используя пероксидазу хрена и АБТС, ё4О5=36800 М"1см'1.

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Изображения СЭМ для электродов, модифицированных ДЦАБ и Аи/ДДАБ получены с помощью S-3400N Hithachi Scanning Electron Microscopa Образцы для СЭМ готовили нанесением на поверхность электрода 2 мкл 0,1М ДЦАБ или раствора Аи/ДДАБ, полученного по описанной выше методике.

Результаты и обсуждение

I. Исследование стехиометрии электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4

1. Электрохимические характеристики ферментных электродов

Между печатным графитовым электродом, модифицированным золотыми наночастицами, стабилизированными синтетическим поверхностно-активным веществом дидодецилдиметкламмоний бромидом (ДЦАБ) и гемом цитохрома Р450 2В4, включенного в эту матрицу, наблюдается прямой безмедиаторный перенос электронов (Shumyantseva V.V. et al., 2007).

Золотые наночасгицы, иммобилизованные на поверхности электрода, играют роль ансамбля наноэлектродов, облегчающей электронный транспорт от электрода на гем цитохрома Р450 2В4. Это приводит к усилению электрохимического отклика системы, что известно из литературных данных на примере различных белков и нуклеиновых кислот

(Riley D.J., 2002; Ribrioux S. et al, 1996; Perm S.G. et al., 2003; Cheng W. et al, Wang J., 2005; Broun K.R. et al, 1996) и подтверждено в наших исследованиях. Сравнительные цикловольтамперограммы для электродов Аи/ДДАБ/Р450 2В4/нафион и ДДАБ/Р450 2В4/нафион приведены на рис. 1.

-аа -о, в «а -аг о.о о.г о.* Е, В отн. Дд.'АдС!

Рис. 1. Влияние золотых наночастиц на величину каталитического тока цитохрома Р450 2В4, иммобилизованного на печатном электроде. Циклические вольтамперограммы электродов: А) Аи/ДЦАБ/Р450 2В4/нафион, Б) ДДАБ/Р450 2В4/нафион. Скорость сканирования у=50 мВ/с. Аэробные условия. 0,1 М калий-фосфатный буфер (рН 7.4), содержащий 0,05 мМ №С1, объем электролита 1 мл.

Золотые наночастицы были охарактеризованы спектрофотометрически (Хтах = 520 нм) и с помощью сканирующей электронной микроскопии: размер частиц составляет 4070 нм (рис. 2).

Рис. 2. Данные сканирующей электронной микроскопии для печатных электродов, модифицированных ДДАБ (А), Аи/ДДАБ в хлороформе (Б).

При скоростях сканирования от 5 мВ/с до 250 мВ/с зависимости величин катодного и анодного тока от скорости сканирования в анаэробных условиях линейны, что говорит о том, что электрохимические процессы протекают на поверхности электрода (Murray R.W.

et al., 1984; Bard A. J. et al., 1980): регистрируются электрохимические процессы, происходящие на иммобилизованном гемопротеине, а не в растворе.

В аэробных условиях восстановительный катодный пик на цикловольтамперограммах увеличивается, а окислительный пик полностью исчезает. Это говорит об электрокаталитической активности цитохрома R450 2В4 по отношению к кислороду, поскольку восстановленная форма цитохрома (феррицитохром Fe2*) связывает кислород с большей скоростью (к > 106 М~1с"1) (Archakov A.l. et al., 1990; Le/vis D. F. V., 2001). Отношение каталитического (в присутствии кислорода) и диффузионного тока (в атмосфере аргона) 1{Ог)/1(Аг) равно 1,8. В присутствии органического субстрата (бензфетамина) и кислорода, каталитический ток возрастает. Отношение каталитического (в присутствии 50 мМ бензфетамина) и диффузионного тока (в атмосфере аргона) l(BF)/l(Ar) равно 2,2.

Цитохром с является классическим объектом исследования электрохимии гемопротеинов. Были приготовлены биферментные электроды Аи/ДДАБ/Р450 2В4/цитохром с с иммобилизованным цитохромом с в качестве внутреннего электрохимического стандарта.

-О.е -О.в -0.2 0.0 0.2 0.4

Е, В отн. Ад/АдС1

Рис. 3. Цикловольтамперограммы для биферментного электрода Аи/ДДАБ/Р450 2В4/су1 с/нафион в А) анаэробных и Б) аэробных условиях. Скорость сканирования у=50 мВ/с. 0,1 М калий-фосфатный буфер (рН 7,4), содержащий 0,05 мМ 1МаС1, объем электролита 1 мл.

Редокс-потенциал цитохрома с Ео равен -51 мВ, ДЕ0^ равно 90 мВ как в буфере, содержащем кислород, так и в анаэробных условиях. Также как и в случае электродов с иммобилизованным цитохромом Р450 2В4, в присутствии кислорода окислительный пик цитохрома Р450 2В4 на цикловольтамперограммах биферментных электродов исчезал, а

восстановительный увеличивался. Это говорит о том, что цитохром с является только переносчиком электронов, а в случае цитохрома Р450 2В4 происходи г восстановление железа гема Fe+3+le"—► Fe+2, а также связывание кислорода его восстановленной формой с последующим восстановлением кислорода.

Поверхностная концентрация электроактивного фермента для электродов Ли/ДДАБ/Р450 2В4/нафион в тонких пленках рассчитана с помощью закона Фарадея и составила 5-15% (10-30 пмоль/элекгрод).

2. Методы количественной оценки генерации Н2О2 в электрохимических

реакциях

Одной из задач исследования было разработать кинетический метод измерения пероксида водорода в режиме реального ьремени. Для этого была предложена схема с использованием бипотенциостата, позволяющего одновременно подавать различные потенциалы на два рабочих электрода, находящихся в одной измерительной ячейке. Один из электродов является операционным, второй - измерительным.

В качестве операционного электрода использовался графитовый печатный электрод с иммобилизованным цитохромом Р450 2В4 (при потенциале Е = - 450 мВ), в качестве измерительного электрода для регистрации пероксида водорода использовались электроды, модифицированные берлинской лазурью (Е=0) (Ricci F. et al., 2003) или модифицированные цитохромом с (Е = - 50 мВ) (Krylov A.V. et al., 2004).

Выбор метода биэлектродной детекции был обусловлен возможностью регистрации в кинетическом режиме поглощения кислорода и образования пероксида водорода. Сенсоры на основе печатных электродов, модифицированных берлинской лазурью или цитохромом с, характеризуются достаточной чувствительностью измерений, легкостью калибровки, возможностью неоднократного использования для определения пероксида водорода. Такой подход позволил вести измерения в режиме реального времени, получая истинную картину изменения концентраций продуктов цитохром Р450-зависимой электрокаталитической реакции при контролируемом напряжении (Е = -450 мВ) в течение эксперимента.

Необходимо отметить, что ни один из компонентов, используемых для модификации электрода (исключая фермент), не элеюроактивен в исследуемой области потенциалов, что подтверждают контрольные эксперименты: цикловольтамперограммы электродов, модифицированных ДДАБ, нафионом, нано-Au в различных комбинациях, и литературные данные.

Для определения стехиометрических параметров каталитического цикла цитохрома Р450 2В4 были проведены эксперименты по измерению количества образующегося

пероксида водорода в присутствии субстрата цитохрома Р450 2В4 -бензфетамина и в его отсутствии. В экспериментах с каталазой (Аи/ДДАБ/Р450 2В4-электрод, Е= -450 мВ, 1 час) пероксид водорода не регистрируется как в присутствии, так и в отсутствии органического субстрата.

Электроды с иммобилизованным цитохромом с показали чувствительность к пероксиду водорода в диапазоне 1-1000 мкМ. Электроды были откалиброваны пероксидом водорода в диапазоне концентраций 1-100 мкМ.

Как видно из рисунков 4,5, без субстрата - бензфетамина, - количество образующегося пероксида водорода в ходе электрокаталитической реакции растет и достигает максимума примерно к 20-25 минуте (кривая а на рис. 4, кривая а на рис. 5). В присутствии бензфетамина скорость образования и количество образующегося пероксида водорода существенно меньше (кривая б на рис. 4, кривая б на рис. 5). Субстрат направляет реакцию по «продуктивному» пути, в сторону большего сопряжения и в направлении монооксигеназной реакции. Нельзя исключить и пероксидазную активность цитохрома Р450 2В4, приводящую к изменению стехиометрических соотношений в процессе электрокатализа (Х/йзвКР. й а!., 2005).

Время, с

Рис. 4. Кинетические кривые образования пероксида водорода в ходе ферментативной реакции цитохрома Р450 2В4, регистрируемые с помощью электрода, модифицированного берлинской лазурью а) без субстрата, б) в присутствии 0,5 мМ раствора бензфетамина. График получен из экспериментальных кривых зависимости тока от времени. Концентрацию пероксида водорода рассчитывали по калибровочной кривой. Врезка - калибровочный график для электрода, модифицированного берлинской лазурью.

В таблице 1 приведены результаты расчета скоростей образования пероксида водорода по данным, полученным с помощью различных методов детекции.

Концентрации Н2О2, полученные спекгрофотометрическим и амперометрическим (электрод, модифицированный берлинской лазурью) методами практически совпадают.

Время, с

Рис. 5. Кинетические кривые образования пероксида водорода в ходе ферментативной реакции цитохрома Р450 2В4, полученные с помощью электрода, модифицированного цитохромом с а) без субстрата, б) в присутствии 0,5 мМ раствора бензфетамина. График получен из экспериментальных кривых зависимости тока от времени. Концентрацию пероксида водорода рассчитывали по калибровочной кривой. Врезка - калибровочный график для электрода, модифицированного цитохромом с.

Скорости электрокаталитического 1М-деметилирования бензфетамина цитохромом Р450 2В4 измеряли спектрофотометрически по накоплению в рабочем растворе продукта ферментативной реакции—формальдегида.

Во время проведения электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4 в присутствии 0,5 мМ раствора бензфетамина в течение 60 мин, скорость Ы-деметилирования составила 2,5 ± 0.4 нмоль'(нмоль фермента)'1'(мин)'1. По сравнению с природной микросомальной системой это более низкие скорости. Однако если учесть, что электроактивны только 15 % от общего количества иммобилизованного фермента, то скорости М-деметилирования бензфетамина становятся сопоставимыми со скоростями микросомальной системы (14,4 ± 0.5 нмоль'(нмоль фермента)"1'(мин)~!для микросомальной системы и 17 ± 3 нмоль"(нмоль электроакпшного фермента)'1'(мин)"1для электролиза при контролируемом напряжении (Табл. 1).

Таблица 1.

Скорости образования Н2О2, формальдегида и поглощения кислорода в электрокаталитическом цикле цитохрома Р450 2В4 и в условиях микросомального

окисления.

Н2Ог (нмоль'(нмоль фермента)'(мин)') Поглощение О: (НМШ1Ь'(НМОЛЬ фермента)"' (мин)"1) Продукт реакции (формальдегид) (нмоль'(нмоль фермента ("'(мин)"1)

спектрофотометрия амперомерия амперометрия спектрофотометрия

пероксидаза хреиа/АБТС Электрод сБЛ Электрод с цитохромом с Электрод Кларка Реактив Нэша

В отсутствии субстрата (Е=-450 мВ) 4,3±0,7 4,4±0,7 5,б±0,8 4,8±0,4 -

В присутствии субстрата (Е=-450 мВ) 2,б±0,5 3,0±0,5 4,3 ±0,7 19,4±0,б 17±3

Микросомы* свободное окислснис, \ADPH 3,14 - - 3,6±0,2 -

Микросомы* бензфетамин ¡ЧАИРН 2,8 - - 21,6±0,6 14,4±0,5

Электролиз цитохрома Р450 2В4 проводился при потенциале Е= -450 мВ в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 0,05 мМ №С1, объем электролита 1 мл, в течение 1 часа, в качестве субстрата использовали 0,5 мМ раствор бензфетамина. * Данные (гЬикоу А.А. е1 а1., 1985). Авторы проводили измерение пероксида водорода тиоцианатным методом. Содержание цитохрома Р450 2В4 в микросомальной фракции принято равным 5 нмоль/мг белка.

3. Определение количества кислорода, участвующего в электрокатализе

Для исследования стехиометрии электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4 были проведены эксперименты по определению количества поглощаемого в

ходе электрокаталитического цикла кислорода, поскольку последний является косубстратом цитохрома Р450.

Для этого использовали биэлектродную схему с операционным электродом Аи/ДДАБ/Р450 2В4 и электродом Кларка для измерения поглощения кислорода (С1агк 1..С., 1953).

В присутствии субстрата (кривая б на рис.6) иммобилизованный фермент потребляет значительно больше кислорода, что согласуется с данными, полученными для природной микросомальной системы (2Ьикоу А.А. й а!., 1985).

Времи,с

Рис. 6. Кинетические кривые поглощения кислорода в электрокаталитическом цикле цитохрома Р450 2В4 а) в отсутствии субстрата и б) в присутствии 0,5 мМ раствора бензфетамина. Кривые получены отнесением экспериментальной зависимости тока от времени к калибровке.

Также был произведен расчет количества кислорода, участвующего в электрокаталитическом цикле, исходя из анализа цикловольтамперограмм. Вольтамперометрия позволяет получить «моментальный снимок» электрокаталитического процесса. Расчет производился исходя из соотношения площадей пиков в анаэробных и аэробных условиях при насыщающих концентрациях кислорода. В анаэробных условиях восстанавливается 3,7 ± 0,5 пмоль Р450/электрод, а в аэробных - 7,0 ± 0,5 пмоль/электрод, из чего следует, что количество восстановленного кислорода составляет 3,3 пмоль/электрод, т.е. соотношение восстановленный фермент (Ре+2): кислород близко к стехиометрическому 3,3:3,7 = 1:1,12 в соответствии с механизмом катализа цитохрома Р450.

Обобщенные результаты измерения стехиометрических параметров электрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4 в сопоставлении с данными других авторов представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Стехиометрические соотношения компонентов ферментативного превращения веществ в каталитическом цикле цитохрома Р450.

система субстрат Окисление NADPH потребление о2 образование н2о2 образование продукта ссылка

P450 2В4/электрод нет - 1 0,92 -

бензфетамин - 1 0,15 0,8

микросомы печени кроликов, индуцированных фенобарбиталом нет (37°С, рН=7,8) 1,39 1 0,61 -

бензфетамин (37°С,рН=7,6) 1,14 1 0,09 0,67 A.A. et al„ 1985

Р450 2В1 + NADPH Р450-редуктаза (реконструированная система) 7-этокснкумарин (25°С,10мин, рН=7,4) 1,25 1 0,55 0,15 Fang X., et al„ 1997

В реакциях NADPH-зависимого восстановления цитохромов Р450 2В4 (Zhukov A.A. et al„ 1985) и Р450 2В1 (Fang X., et al„ 1997) регистрируется образование пероксида водорода. В случае цитохрома Р450 2В4 субстрат бензфетамин направляет реакцию по монооксигеназному пути.

Полученные нами результаты подтверждают возможность образования пероксида водорода (см. таблицу 2) и воды (8% и 5% в отсутствии и в присутствии субстрата, соответственно) в электрокаталитическом цикле цитохрома Р450. Стехиометрические соотношения электрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4: Д02:ДН202=1:0,92 (без субстрата), Д02:ДН202:продукт=1:0,15:0,8.

Стехиометрию оксидазных реакций, катализируемых цитохромом Р450 2В4, можно представить следующей схемой: P-Fe3++02 —> P-Fe2+-02

P-Fe3+-02- > [P-Fe3+-OOH]" ) P-Fe3++H202

[P-Fe3+-0-0 ]--* 02'~ + P- Fe3+

02' + 2H+ * H202, где P - порфирин

В отсутствии субстрата в ходе каталитического цикла цитохрома Р450 2В4 единственным продуктом восстановления кислорода кроме воды является пероксид водорода.

В работе предложен метод регистрации в кинетическом режиме образования пероксида водорода как продукта оксидазных электрохимических реакций цитохрома Р450 по биэлектродной схеме с помощью различных измерительных электродов. Исхода из полученных скоростей реакций и стехиометрических коэффициентов, можно сделать вывод, что иммобилизованный на электроде цитохром Р450 2В4 при электрохимическом восстановлении ведет себя подобно микросомальной системе в растворе.

Полученные стехиометрические соотношения компонентов ферментативной реакции позволяют сделать вывод об адекватности замены природного восстанавливающего агента NADH или NADPH и белков редокс-партнеров электрохимическим восстановлением гемопротеина. Аналогично природной системе (Zhukov A.A. et al., 1985) (микросомальная фракция цитохрома Р450 2В4 в растворе), наблюдалось отклонение стехиометрических коэффициентов, полученных экспериментально, от коэффициентов, следующих из уравнения монооксигеназной реакции. Определенная доля кислорода, участвующего в ферментативном цикле, не участвует в превращении субстрата, а расходуется на образование пероксида водорода и воды.

11. Определение термодинамических параметров электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4

Термодинамика электрохимического восстановления гемопротеинов позволяет ответить на вопросы стабильности белка, иммобилизованного на наноструктурированный электрод и судить о вероятности электронного транспорта.

На окислительно-восстановительный потенциал гемопротеинов оказывают влияние различные факторы: лигацд-связывающие эффекта (Moore G. R. et al., 1977), контакт гема с растворителем (Stellwagen Е. et al., 1978) и природа растворителя (Battistuzzi G. et al., 1998; O'Donoghue D. et al., 2003), взаимодействие гема с белковым окружением (Moore G. et al., 1986). Определение E"как функции температуры позволяет вычислить величину изменения энтальпии АН" и энтропии AS^no уравнению:

-дн^ т^

nF nF v '

Где Е"-окислительно-восстановительный потенциал белка (В),

АН0 - изменение энтальпии реакции (Дж моль"1), AS0-изменение энтропии реакции (Джмоль 'К"1) п - число электронов, участвующих в реакции F - число Фарадея (F = 96490,0 Кл/моль) Т - температура (в градусах Кельвина)

Величина изменения энтальпии ДН° окислительно-восстановительного процесса характеризует взаимодействие между ионом железа гемопротеина и лигандами, а также электростатическое взаимодействие на границе иона металла с растворителем и белковым окружением (Gavioly G. et al., 2004).

Изменение энтропии AS0' характеризует изменения в конформационных степенях свободы фермента, связанные с окислительно-восстановительными процессами и реорганизацией молекул растворителя и ионов (Gavioly G. et al., 2004), а также переход гема в более компактную структуру (Scott R.A. et al., 2006),

Для вычисления термодинамических параметров электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4 были проведены измерения редокс-потенциала иммобилизованного цитохрома Р450 2В4 в интервале температур 5-30°С с шагом в 5°С.

Были получены зависимости величины редокс-потенциала Е° =(Ера+Ерс)/2 от температуры для электродов Аи/ДДАБ/Р450 2В4/нафион в анаэробных условиях. Для расчетов термодинамических параметров использовались температурные зависимости потенциалов относительно стандартного водородного электрода (СВЭ). В нашей системе мы использовали хлорсеребряный электрод сравнения, величины потенциалов были приведены к потенциалу стандартного водородного электрода по формуле: Есвэ = E°AS\Aga + 0-204 (при 20°С)

Окислительно-восстановительный потенциал связан со своими термодинамическими составляющими согласно уравнению 1. Из зависимостей Е° от Т и Е°/Т от 1/Т были вычислены AS0 и ДН° соответственно:

AS°' = nF— (2)

dT К '

ро' 0(—)

АН" = —nF—(3)

эф

С увеличением температуры наблюдается катодное смещение редокс-потенциала (рис. 7).

'1--—I—■—I—■—I—'—I—'-1—■—I

-0.8 -0.6 -0.4 -0,2 0.0 0.2 0.4

Е, В отн. АдУАдС!

Рис. 7. Циклические вольтамперограммы электродов Аи/ДДАБ/Р450 2В4/нафион в анаэробных условиях. Скорость сканирования у=50 мВ/с. Объем электролита 1мл, 100 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,4), 50 мМ ЫаС1.

Цикловольтамперограммы цитохрома Р450 2В4 для различных температур приведены на рис. 7, зависимость редокс-потенциала от температуры показана на рис. 8.

а <

т,к

Рис. 8. Зависимость редокс-потенциала цитохрома Р450 2В4, иммобилизованного на печатный электрод, от температуры. Данные получены при скоростях сканирования 50 мВ/с.

Выше 40°С линейная зависимость нарушается, что, по-видимому, следует отнести на счет частичной денатурации иммобилизованного белка.

Термодинамические параметры иммобилизованного на наноструктурированный Аи/ДЦАБ-электрод цитохрома Р450 2В4 определяли из зависимостей (2) и (3), их величины приведены в табл. 3.

-2.4x10 Н-1-1-1-I-1-I-1---|-'-(---1--1-1

1,3x10° 3.3x10° 3.4x10' 3,4x10' 3,5x10° 3.5x10° 3,6x10'* 3,6x10"'

1/Т, К"'

Рис. 9. Зависимость соотношения Е°/Т цитохрома Р450 2В4, иммобилизованного на печатный электрод от обратной температуры. Данные получены при скоростях сканирования 50 мВ/с.

Таблица 3.

Термодинамические параметры электрохимического восстановления различных белков

Параметр Белок ■—. AS0' (Цжмоль 'К-') АН0' (кДж моль1) ссылка

Гемоглобин -349,28 -97,18 (НеХ. et al., 2006)

Цитохром с -44^-75' -34-^13,1 (Gavioli G. et al., 2004)

Флаводоксин -80 -1,5 (Heering H.A. et ai, 1996)

Миоглобин -51,1 -1,3 (Liu X. et ai, 2005)

Голубой медьсодержащий белок -46 -36 (Battistuzzi G.eta/., 1999)

Цитохром Р450 2В4 -115,69 -29,1 настоящая работа

Восстановление цитохрома Р450 2В4 сопровождается отрицательным изменением как энтальпии, так и энтропии. Уменьшение энтропии можно отнести на счет конформационных изменений цитохрома Р450 2В4 в процессе восстановления, ограниченной гибкости белка в восстановленном состоянии и повышения жесткости структуры вследствие возможного образования дополнительных водородных связей. Уменьшение энтальпии проистекает из стабилизации восстановленной формы гемопротеина по сравнению с окисленной, а также ограниченной доступности гема молекулам растворителя. Необходимо также отметить возможность вклада в изменение термодинамических параметров перестройку структуры водородных связей или реорганизации молекул растворителя. Энтропийный вклад в изменение величины редокс-потенциала электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4 преобладает над

энтальпийным, что говорит о большем участии конформационных изменений, происходящих при восстановлении иммобилизованного гемопротеина, в изменение редокс-потенциала, по сравнению с доступностью гема или стабилизацией восстановленной формы.

Выводы

1. Разработаны методы иммобилизации цитохрома Р450 2В4 на графитовых электродах, модифицированных нанокомпозитными материалами на основе золотых наночастиц, стабилизированных жидкокристаллической матрицей ДЦАБ.

2. Разработана биэлектродная схема, состоящая из операционного (цитохром Р450 2В4 электрод) и измерительного электрода (БЛ или цитохром с электрод) для кинетического анализа образования пероксида водорода в ходе электрокаталитической реакции

3. Определены стехиометрические соотношения электрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4: Д02:ДН2С>2=1:0,92 (без субстрата), ДО2:ДН2О2:продукт=1:0,15:0,8. Показано соответствие стехиометрических параметров электрокаталитического цикла цитохром Р450 2В4-содержащей электрохимической системы и ЫАОРН-зависимой монооксигеназной системы.

4. Рассчитаны термодинамические параметры электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4: Д^ = -115,69 Дж-моль"1«'1, ДН" = -29,1 кДж-моль"1. Преобладание энтропийного вклада в изменение величины редокс-потенциала свидетельствует о конформационных изменениях, происходящих при восстановлении иммобилизованного гемопротеина. Энтропийный вклад оказывает существенное влияние на процесс переноса электронов в цитохроме Р450 2В4.

Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального Агентства по науке и инновациям Министерства образования и науки РФ (государственный контракт ФЦП № 02.512.11.2105) и Межведомственной Программы «Протеомика в медицине и биотехнологии».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Рудаков, Ю. О. Стехиометрия элекгрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4 / Ю. О. Рудаков, В. В. Шумянцева // Московская международная конференция «Биотехнология и медицина»—Москва, 2006-с. 258-259.

2. Шумянцева, В. В. Наноэлекгрохимия цитохромов Р450: прямой перенос электронов и электрокаталш / В. В. Шумянцева, Т. В. Булко, Ю. О. Рудаков, Г. П. Кузнецова, Н. Ф. Саменкова, А. В. Лисица, И. И. Карузина, А. И. Арчаков. // Биомедицинская химия. - 2006 - Т. 52, №5. - с. 458-468.

2а. Shumyantseva, V. V. Nanoelectrochemistry of Cytochrome P450s: Direct electron transfer and electro catalysis / V. V. Shumyantseva, Т. V. Bulko, Yu. O. Rudakov, G. P. Kuznetsova, N. F. Samenkova, A. V. Lisitsa, I. I. Karuzina, A. I. Archakov. // Biochemistry (Moscow) Supplemented series B: Biomedical Chemistry. - 2007. - V. 1, №4. - p. 327-333.

3. Shumyantseva, V. V. Electrochemical properties of cytochroms P450 using nanostructured electrodes: Direct electron transfer and electro catalysis / V. V. Shumyantseva, Т. V. Bulko, Yu. O. Rudakov, G. P. Kuznetsova, N. F. Samenkova, A. V. Lisitsa, 1.1. Karuzina, A. I. Archakov. // J. Inorg. Biochem.-2007.- V. 101.-p. 859-865.

4. Рудаков, Ю. О. Электрохимическое восстановление цитохрома Р450 2В4: стехиометрия и электрокатализ / Ю. О. Рудаков, В. В. Шумянцева, Т. В. Булко, Е. В. Супрун, Г. П. Кузнецова, Н. Ф. Саменкова, А. И. Арчаков // VII Всероссийская конференция по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2008» -Уфа, 2008-с. 98.

5. Рудаков, Ю. О. Исследование стехиометрии электрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4 / Ю. О. Рудаков, В. В. Шумянцева, Т. В. Булко, Е. В. Супрун, Г. П. Кузнецова,

Н. Ф. Саменкова, А. И. Арчаков // V Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» - Москва, 2008 - с. 372.

6. Rudakov, Yu. О. Stoichiometry of electrocatalytic cycle of cytochrome P450 2B4 / Yu. O. Rudakov, V. V. Shumyantseva, Т. V. Bulko, E. V. Suprun, G. P. Kuznetsova, N. F. Samenkova, A. I. Archakov //J. Inorg.Biochem.-2008.-V. 102,№11.-P.2020-2025.

7. Шумянцева, В. В. Микрокантилеверные и электрохимические биосенсоры для исследования белок-белковых взаимодействий / В. В. Шумянцева, Ю. О. Рудаков, П. А. Французов // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы» - Москва, 2008 - с. 161.

8. Рудаков, Ю. О. Нанобиоэлектрохимия цитохрома Р450 2В4: стехиометрия и термодинамика / Ю. О. Рудаков, В. В. Шумянцева, Т. В. Булко, Е. В. Супрун, Г. П. Кузнецова, Н. Ф. Саменкова, А. И. Арчаков // Первый международный форум по нанотехнологиям, (http://rusnanotech08.rusnanofomm.rU/sadm_files/disk/Docs/3/8/008.pdf),-Москва, 2008.

Список сокращений

АБТС -2,1 '-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота)

ДДАБ - дцдодецилдиметиламмоний бромид

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

EJI - берлинская лазурь

СВЭ - стандартный водородный электрод

Бумага для множительных аппаратов. Печать офсетная. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ №792 Типография ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рудаков, Юрий Олегович

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Введение

1.2. Классификация биосенсоров

1.3. Методы наноструктурирования электродов

1.4. Наноматериалы., используемые для наноструктурирования электродов

1.4.1. Глины

1.4.2. Фосфолипиды

1.4.3. Многослойные пленки

1.4.4. Наночастицы металлов

1.4.5. Углеродные нанотрубки

1.4.6. Фуллерены

1.4.7. Неорганические наночастицы

1.4.8. Фиброин шелка

1.5. Наноматериалы в качестве меток в электрохимических иммуносенсорах и иммунополях

1.5.1. Золотые и серебряные наночастицы

1.5.2. Полупроводниковые наночастицы

1.5.3. Апоферритиновые нано-носители

Введение Диссертация по биологии, на тему "Электрохимическое восстановление цитохрома Р450 2В4 с использованием нанокомпозитных электродных материалов: стехиометрия и термодинамика"

Цитохромы Р450 - гемопротеины, характерные почти для всех живых существ. В организме человека они содержатся в различных органах и тканях [1]. Цитохромы Р450 обладают свойством гидроксилировать неактивные атомы углерода органических молекул, повышая полярность гидрофобных ксенобиотиков, и способствуют их выведению из организма [2,3]. Цитохромы Р450 катализируют около 60 типов химических реакций и метаболизируют примерно 1 миллион различных соединений, участвуют в синтезе стероидных гормонов [1,2,4]. В последнее время пристальное внимание уделяется персональной медицине и роли цитохромов Р450 в метаболизме отдельного организма [5]. Все это делает цитохромы Р450 перспективными объектами в создании биосенсоров для анализа потенциальных лекарственных препаратов [6] и оценке индивидуальной переносимости пациентами химиотерапии, правильном выборе методов. лечения.

В каталитическом цикле цитохрома Р450 один из атомов кислорода расходуется на окисление органической молекулы, а второй восстанавливается до воды за счет редокс-эквивалентов NADPH или NADH: NAD(P)H + Н+ + 02 + ХН ^ NAD(P)+ + ХОН + Н20, (1) где ХН - субстрат

Однако в ряде случаев реакция не соответствует стехиометрическим соотношениям, приведенным в данном уравнении. Определенная доля электронов расходуется на восстановление кислорода, не сопровождающееся конверсией субстрата. Это явление получило название разобщения (рис. 1).

Известно, что ферменты микросом печени не окисляют ни один из известных субстратов с полным сопряжением. Часть редокс-эквивалентов NADPH расходуется в побочных оксидазных реакциях. При этом происходит образование активных форм кислорода: пероксида водорода и супероксид анион-радикала, а также воды [7-9].

Ь) NN е- {с) N-. ,.

Р м а) Н Н

Й'

N^-j-'n N-TN

Cys'

ROH

Г о N.-П—-N N-j-N 2Н+ Л J ~ / ~ N°м N-rN

S Cys' 1 /> Cys

7 (е)

Рис. 1. Каталитический цикл цитохромов Р450. Синими стрелками показаны пути разобщения цикла.

Ранее была показана возможность замены доноров электронов NAD(P)H и дополнительных белков редокс-партнеров электрохимическим восстановлением цитохромов Р450 [10-15]. Изучение стехиометрии системы, моделирующей природный каталитический цикл, особенно важно для последующего конструирования сенсорных устройств, направленных на анализ новых лекарственных форм.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы было изучение стехиометрических соотношений компонентов электрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4 (субстратов - бензфетамина и кислорода, образующегося пероксида водорода и формальдегида как продукта N-деметилирования субстрата) и определение термодинамических параметров электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) Иммобилизовать цитохром Р450 2В4 на печатный электрод, сохранив каталитическую активность фермента.

2) Разработать метод детекции продуктов электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4, иммобилизованного на печатный электрод, позволяющий регистрировать образование пероксида и поглощение кислорода в кинетическом режиме.

3) На основании полученных количественных данных об образовании пероксида водорода, N-деметилировании субстрата и поглощении кислорода, определить стехиометрические параметры электрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4, иммобилизованного на печатный электрод.

4) Определить зависимость окислительно-восстановительного потенциала цитохрома Р450 2В4 от температуры в анаэробных условиях, рассчитать термодинамические параметры электрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4.

Научная новизна работы.

Впервые был предложен биэлектродный метод детекции пероксида водорода, образующегося в результате электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4, иммобилизованного на печатном электроде. В работе впервые определены стехиометрические параметры электрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4 в присутствии и отсутствии субстрата (бензфетамина), что позволяет сравнить модельную систему иммобилизованного цитохрома Р450 2В4 с природной монооксигеназной системой. Определены термодинамические параметры электрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4, сделаны выводы о вкладе термодинамических параметров в электрохимический потенциал.

Практическая значимость исследования.

В результате проведенного исследования разработаны методы получения биосенсоров с полимерным покрытием, стабилизирующим фермент, которые могут быть использованы в качестве системы, моделирующей природный цикл цитохрома Р450 2В4.

Разработана биэлектродная схема, позволяющая при соответствующем выборе измерительного электрода анализировать продукты электрохимических реакций в кинетическом режиме. При использовании в качестве измерительного электрода сенсора с наноразмерным покрытием берлинской лазури или сенсора с иммобилизованным цитохромом с были проведены количественные измерения пероксида водорода. Микроэлектрод Кларка использовали для измерения поглощения кислорода в электрокаталитическом цикле цитохрома Р450 2В4.

Показана адектватность замены редокс-партнеров и дорогостоящих восстановительных агентов NADH и NADPH цитохрома Р450 2В4 электрохимическим восстановлением.

Экспериментально определена зависимость окислительно-восстановительного потенциала от температуры и рассчитаны термодинамические параметры электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4 при иммобилизации на структутрированный наночастицами золота графитовый электрод.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были доложены на международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006), VII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2008» (Уфа, 2008), V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008), Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы» (Москва, 2008), Первом международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 5 публикаций в сборниках докладов научных конференций.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, посвященного материалам и методам наноструктурирования поверхности электродов, используемых в биоэлектрохимии, глав «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», выводов и списка цитируемой литературы, включающего 307 источников. Работа изложена на 141 страницах текста,, содержит 32 рисунка и 4 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Рудаков, Юрий Олегович

4. Выводы.

1. Разработаны методы иммобилизации цитохрома Р450 2В4 на графитовых электродах, модифицированных нанокомпозитными материалами на основе золотых наночастиц, стабилизированных жидкокристаллической матрицей ДДАБ.

2. Разработана биэлектродная схема, состоящая из операционного (цитохром Р450 2В4 электрод) и измерительного электрода (БЛ или цитохром с электрод) для кинетического анализа образования пероксида водорода в ходе электрокаталитической реакции

3. Определены стехиометрические соотношения электрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4: А02:АН202=1:0,92 (без субстрата), А02:АН202:продукт=1:0,15:0,8. Показано соответствие стехиометрических параметров электрокаталитического цикла цитохром Р450 2В4-содержащей электрохимической системы и NADPH-зависимой монооксигеназной системы.

4. Рассчитаны термодинамические параметры электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4: AS0 = -115,69 Джмоль^К"1, АН0 =

-29,1 кДж моль'1. Преобладание энтропийного вклада в изменение величины редокс-потенциала свидетельствует о конформационных изменениях, происходящих при восстановлении иммобилизованного гемопротеина. Энтропийный вклад оказывает существенное влияние на процесс переноса электронов в цитохроме Р450 2В4.

1.6. Заключение.

Модифицированные ферментом электроды - основа амперометрических биосенсоров. Выбор подходящей комбинации материалов (фермента, медиатора — переносчика электронов, связывающих материалов, проводящей матрицы и пр.) определяет кинетику и эффективность электронного транспорта, стабильность, воспроизводимость и прочие характеристики сенсора. В настоящее время для модификации электродов используют множество различных материалов: углеродные нанотрубки, фуллерены, наночастицы глин и металлов и пр. Каждый из материалов имеет свои преимущества и недостатки, свою область применения, зависящую от типа электрода, используемого биоматериала.

В нашей работе мы использовали для модификации электродов мембраноподобный ПАВ дидодецилдиметиламмоний бромид, демонстрирующий свойства жидкокристаллической матрицы, хорошо подходящей для включения в нее биомолекулы цитохрома [12]. Мембрана ДДАБ содержит достаточно воды для сохранения структуры и функциональности белка и способствует прямому переносу электрона с электрода на белок, в то же время не проявляя электроактивности в интересующих нас диапазонах потенциала.

Легкость синтеза наночастиц золота, их электронные, физические и электрохимические свойства позволили нам использовать их в качестве наноструктурирующего материала для модифицирования печатного графитового электрода. Золотые наночастицы на поверхности электрода образуют ансамбль наноэлектродов и усиливают электрохимический сигнал биомолекулы, облегчая электронный транспорт с электрода на белок [252], что как нельзя лучше соответствовало целям и задачам нашего исследования.

2. Материалы и методы. 2.1. Экспериментальная часть.

2.1.1. Реагенты.

Реактивы: цитохром с сердца лошади (Merck), цитохром Р450 2В4 (1718 нмоль/мг, A4i8/A278 = 1,5), выделенный из печени кроликов, индуцированных фенобарбиталом, и очищенный, как было описано ранее [251], дидодецилдиметиламмоний бромид (ДДАБ) (Sigma- Aldrich), золотохлористоводородная кислота НАиСЦ-ЗНгО (Sigma-Aldrich), 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-б-сульфоновая кислота), АБТС (Sigma-Aldrich), боргидрид натрия (Acros organics), каталаза (2800 ед/мг, Sigma), ацетилацетон (Aldrich), ацетат аммония (РЕАХИМ), уксусная кислота (РЕАХИМ), 5% раствор нафиона в низкомолекулярных спиртах (Fluka). Все другие использованные в работе вещества были по степени очистки не ниже уровня о. с. ч. Для приготовления растворов использовали бидистиллированную воду.

В работе использовались трехконтактные печатные электроды, рабочий (диаметр 2 мм) и вспомогательный электроды - графитовые, электрод сравнения - хлор серебряный (ООО Hi ill «ЭЛКОМ», Россия, www.elcom-moscow.ru).

Золотые наночастицы, стабилизированные ДДАБ получали восстановлением водного раствора золотохлористоводородной кислоты боргидридом натрия по методике, описанной ранее [15, 252]. Наночастицы золота были охарактеризованы спектрофотометрически (Awax=520 нм) и с помощью сканирующей электронной микроскопии (средний размер частиц 40-70 нм).

Приготовление ферментных электродов

На рабочую поверхность электрода наносили 2 мкл раствора золотых наночастиц, стабилизированных дидодецилдиметиламмоний бромидом (Аи/ДДАБ-электрод) в хлороформе и инкубировали в течение 30 минут для испарения хлороформа.

Иммобилизация цитохрома Р450 2В4. На модифицированный Аи/ДДАБ-электрод наносили 0,2 нмоль (2 мкл 100 мкМ раствора) цитохрома Р450 2В4, через 30 минут наносили 1 мкл 5% нафиона. Перед проведением эксперимента электрод выдерживали при +5°С в течение 12 часов.

Иммобилизация цитохрома с. На Аи/ДДАБ-электроды наносили 2 нмоль (2 мкл 1мМ раствора) цитохрома с в 0,1М калий-фосфатном буфере (рН 7,4), через 30 минут наносили 1 мкл 5% раствора нафиона.

Приготовление биферментных электродов

Перед иммобилизацией фермента на рабочую поверхность электрода наносили 2 мкл раствора золотых наночастиц, стабилизированных дидодецилдиметиламмоний бромидом (ДДАБ) в хлороформе и инкубировали в течение 30 минут.

На электроды Аи/ДДАБ наносили 2 нмоль цитохрома с (2 мкл 1 мМ раствора в 0,1М калий-фосфатном буфере), 0,2 нмоль цитохрома Р450 2В4 (2 мкл 100 мкМ раствора в 0,1М калий-фосфатном буфере), через 30 минут наносили 1 мкл 5% раствора нафиона.

Электрохимические измерения проводились с использованием потенциостата Autolab PGSTAT 10 (Eco Chemie, Нидерланды) с программным обеспечением GPES. Электрохимический сигнал электродов с иммобилизованным цитохромом Р450 2В4 регистрировали методом циклической вольтамперометрии. Измерения проводились в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 50 мМ NaCl (электролитный буфер), скорости сканирования от 5 до 200 мВ/с, в интервале потенциалов +200 -700 мВ. Значения потенциалов приведены относительно хлорсеребряного электрода (Ag/AgCl) сравнения.

Для регистрации в кинетическом режиме образования пероксида водорода и поглощения кислорода был использован бипотенциостат IPC-Tween (Институт физической химии и электрохимии им. Фрумкина РАН, Россия) с программным обеспечением IPCTween. Данный прибор позволяет поддерживать заданное напряжение независимо на каждом из двух рабочих электродов (измерительном и операционном с иммобилизованным цитохромом Р450 2В4).

Электрохимическое восстановление цитохрома Р450 2В4 проводилось в 0,5 мМ растворе бензфетамина (или без субстрата) в электролитном фосфатном буфере при потенциале на рабочем электроде Е = — 450 мВ.

В качестве датчиков пероксида водорода использовались печатные электроды, модифицированные берлинской лазурью [253] а также печатные графитовые электроды, модифицированные цитохромом с [254]. Потенциал, подаваемый на измерительные электроды, был равен 0 мВ и -50 мВ соответственно. Определение концентрации пероксида водорода проводили по методу градуировочного графика. Концентрацию пероксида водорода в исходном растворе определяли спектрофотометрически (б24о~43.6 М^см"1) [254].

Измерение количества кислорода, поглощаемого в ходе ферментативной реакции цитохрома Р450 2В4, производили амперометрически с помощью микроэлектрода Кларка (Instech, США) при потенциале -700 мВ [255]. Над раствором создавалась атмосфера аргона для предотвращения дополнительного доступа кислорода воздуха в ячейку. Калибровка микроэлектрода Кларка проводилась амперометрически, измерением тока при атмосферном давлении (100% содержания кислорода, 240 мкМ) с последующим добавлением дитионита натрия и регистрацией максимального изменения тока, принимаемого за нулевое значение кислорода в буфере. Разность значений этих токов принималась за величину, соответствующую концентрации растворенного в буфере кислорода [255,257].

Для определения термодинамических параметров каталитического цикла на электроде с иммобилизованным цитохромом Р450 2В4 регистрировались цикловольтамперограммы в анаэробных условиях в диапазоне температур 5^40°С с шагом 5°С. Из цикловольтамперограмм определяли величины окислительно-восстановительного потенциала для каждой температуры как среднее значение соответствующих потенциалов Ер.а. и Ер.с,. Термодинамические параметры рассчитывались из зависимостей Е° от Т и Е°/Т от 1/Т. В работе использовался термостат ThermoStatPlus (Eppendorf, США).

Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометре Сагу 100 (Varian Inc, Нидерланды). Скорость N-деметилирования бензфетамина в каталитической реакции цитохрома Р450 2В4 определяли по количеству выделившегося формальдегида, дающего окрашенный продукт с реактивом Нэша, используя коэффициент экстинкции 84,2= 4000 M'W [257,258].

Измерение пероксида водорода, образовавшегося в результате электрокаталитической реакции цитохрома Р450 2В4, проводили спектрофотометрически с использованием пероксидазы хрена и субстрата АБТС [259].

Для проведения экспериментов в присутствии каталазы в 1 мл рабочего буфера добавляли каталазу (2800 ед/мг) и проводили электролиз с использованием электродов Аи/ДДАБ/Р450 2В4/нафион в течение 1 часа при контролируемом напряжении -450 мВ (относительно Ag/AgCl). Концентрацию образовавшегося пероксида водорода определяли спектрофотометрически, используя пероксидазу хрена и АБТС, £405=36800 М"

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Изображения СЭМ для электродов, модифицированных ДДАБ и Аи/ДДАБ получены с помощью S-3400N Hithachi Scanning Electron Microscope. Образцы для СЭМ готовили нанесением на поверхность электрода 2 мкл 0,1М ДДАБ или раствора Аи/ДДАБ, полученного по описанной выше методике.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Исследование стехиометрии электрохимического восстановления цитохрома

Р450 2В4.

3.1.1.Электрохимические характеристики ферментных электродов.

За основу для получения электродов с иммобилизованным цитохромом Р450 2В4 были взяты ранее полученные электроды [252].

В работе были использованы печатные электроды с графитовым рабочим и вспомогательным электродом и хлор-серебряным электродом сравнения (рис. 9).

Рис. 9. Схематическое изображение печатного электрода

1 - рабочий электрод

2 - вспомогательный электрод 3- электрод сравнения AgJAgCl 4 - серебряные контакты

Модифицированные электроды на основе наночастиц золота, дидодецилдиметиламмоний бромида, покрытые пленкой нафион, используемые в исследовании, были охарактеризованы методом цикловольтамперометии, квадратно-волновой вольтамперометрии.

Сущность метода амперометрии состоит в измерении тока окисления или восстановления электроактивных частиц. В большинстве случаев в ходе эксперимента на рабочий электрод подается постоянный потенциал относительно электрода сравнения. Наблюдаемый ток оказывается пропорционален либо объемной концентрации электроактивных частиц, либо скорости их расхода или образования в биокаталитическом слое.

Цикловольтамперометрия представляет собой вольтамперометрию с относительно быстрой треугольной разверткой потенциала, позволяющей регистрировать одновременно вольтамперограммы с анодной и катодной разверткой потенциала, отражающие, в частности, и электрохимические реакции продуктов электролиза.

Время

Рис. 10. Развертка потенциала при циклической вольтамперометрии.

Квадратно-волновая вольтамперометрия — способ снижения границы определяемых концентраций вещества при проведении вольтамперометрии, при котором на постоянную составляющую напряжения налагают переменную составляющую небольшой амплитуды прямоугольной формы с частотой 20-225 Гц.

Время

Рис. 11. Развертка потенциала при квадратно-волновой вольтамперометрии.

Цикловольтамперограммы позволяют определить окислительный (Ера) и восстановительный (Ера) пики, количество электроактивного вещества на электроде, величину полу потенциала (Е°ш) и другие параметры.

Е, мВ

Рис. 12. Основные параметры цикловольтамперограммы.

Был разработан метод иммобилизации ферментов на наноструктурированные электроды.

Между печатным графитовым электродом, модифицированным золотыми наночастицами, стабилизированными синтетическим поверхностно-активным веществом дидодецилдиметиламмоний бромидом (ДДАБ) и гемом цитохрома Р450 2В4, включенного в эту матрицу, наблюдается прямой безмедиаторный перенос электронов [252].

Печатный Печатный электрод электрод

Рис. 13. Схема действия наночастиц золота при переносе электрона с электрода на белок.

По-видимому, золотые наночастицы выполняют роль системы близко расположенных, но изолированных наноэлектродов, облегчающих электронный транспорт от электрода на гем цитохрома Р450 2В4, за счет сравнимого размера с молекулой цитохрома. Это приводит к усилению электрохимического отклика системы, что известно из литературных данных на примере различных белков и нуклеиновых кислот [260-265] и подтверждено в наших исследованиях. Сравнительные цикловольтамперограммы для электродов Аи/ДДАБ/Р450 2В4/нафион и ДДАБ/Р450 2В4/нафион приведены на рис. 14.

Золотые наночастицы были синтезированы по методике [266,268] и охарактеризовать! спектрофотометр ически (Кг,ах = 520 нм). Золотые наночастицы, стабилизированные дидодецилдиметиламмоний бромидом, имеют размеры 40-70 нм по данным сканирующей электронной микроскопии (рис. 16).

-0,8 -0,6 -0.4 -0,2 0.0 0.2 0,4

Е, В от Ag/AgCI

Рис. 14. Влияние золотых наночастиц на величину каталитического тока цитохрома Р450 2В4, иммобилизованного на печатном электроде. Циклические вольтамперограммы электродов: А) Аи/ДДАБ/Р450 2В4/нафион, Б) ДЦАБ/Р450 2В4/нафион. Скорость сканирования v=50 мВ/с. Аэробные условия. ОД М калий-фосфатный буфер (рН 7,4), содержащий 0,05 мМ NaCl, объем электролита 1 мл.

Длина волны, нм

Рис. 15. Спектр поглощения золотых наночастиц в хлороформе.

Рис. 16. Данные сканирующей электронной микроскопии для печатных электродов, модифицированных ДДАБ (А), Аи/ДДАБ в хлороформе (Б).

Дидодецилдиметиламмоний бромид — синтетический мембраноподобный материал широко используемый в качестве матрицы для включения белка и иммобилизации на поверхность электродов. ДДАБ является подходящей матрицей для включения наночастиц золота и их стабилизации.

-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4

Е, В

Рис. 17. Цикловольтамперограммы для электрода Аи/ДДАБ/Р450 2В4/нафион при скоростях сканирования от 10 до 100 мВ/с. Аэробные условия. 0,1 М калий-фосфатный буфер (рН 7,4), содержащий 0,05 мМ NaCl, объем электролита 1 мл.

При скоростях сканирования от 5 мВ/с до 250 мВ/с зависимости величин катодного и анодного тока от скорости сканирования в анаэробных условиях линейны, что говорит о том, что электрохимические процессы протекают на поверхности электрода: регистрируются электрохимические процессы, происходящие на иммобилизованном гемопротеине, а не в растворе [267].

Зависимость тока восстановления от скорости сканирования в аэробных условиях показана на рисунке 18. и, мВ/с

Рис. 18. Зависимость величины каталитического тока восстановления от скорости сканирования. Электроды Аи/ДДАБ/Р450 2В4/нафион, аэробные условия. 0,1 М калий-фосфатный буфер (рН 7,4), содержащий 0,05 мМ NaCl, объем электролита 1 мл.

-0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4

Е,В

Рис. 19. Электроды Аи/ДДАБ/Р450 2В4/нафион, анаэробные условия. 0,1 М калий-фосфатный буфер (рН 7,4), содержащий 0,05 мМ NaCl, объем электролита 1 мл.

В аэробных условиях восстановительный пик на цикловольтамперограммах увеличивается, а окислительный пик полностью исчезает. Это говорит об электрокаталитической активности цитохрома Р450 2В4 по отношению к кислороду, поскольку восстановленная форма цитохрома (феррицитохром Fe ) связывает кислород с большей скоростью (к > 106 IVT'c-1) [1,2]. Отношение каталитического (в присутствии кислорода) и диффузионного тока (в атмосфере аргона) I(02)/I(Ar)=l,8. Отношение каталитического (в присутствии 50 мМ бензфетамина) и диффузионного тока (в атмосфере аргона) I(BF)/I(Ar)=2,2.

Цитохром с является классическим объектом исследования электрохимии гемопротеинов. Были приготовлены биферментные электроды Аи/ДДАБ/Р450 2В4/цитохром с с иммобилизованным цитохромом с в качестве внутреннего электрохимического стандарта.

0,5 -0,0 -^ -0,5 --1,0

-1,5

-0,8

Рис. 20. Цикловольтамперограммы для биферментного электрода Аи/ДДАБ/Р450 2B4/cyt с/нафион в А) анаэробных и Б) аэробных условиях. Скорость сканирования V=50 мВ/с. ОД М калий-фосфатный буфер, содержащий 0.05 MMNaCl, рН 7.4, объем электролита 1 мл.

Редокс-потенциал цитохрома с Е0 равен -51 мВ, АЕ° равно 90 мВ как в буфере, содержащем кислород, так и в анаэробных условиях. Также как и в случае электродов с иммобилизованным цитохромом Р450 2В4, в присутствии кислорода окислительный пик цитохрома Р450 2В4 на цикловольтамперограммах биферментных электродов исчезал, а восстановительный увеличивался. Это говорит о том, что цитохром с является только переносчиком электронов, а в случае цитохрома Р450 2В4 происходит восстановление железа гема Fe+3+le" —► Fe+2, а также связывание кислорода его восстановленной формой с последующим восстановлением кислорода.

Поверхностная концентрация электроактивного фермента в тонких пленках рассчитана с помощью закона Фарадея

Q=nAFT где

Q - величина заряда, полученная интегрированием восстановительного пика цикловольтамперограмм

I-1-1-1-1-1-1-1-1-■-1

-0.6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0.4

Е, В отн. Ag/AgCI n - количество перенесенных электронов А — площадь поверхности электрода F — число Фарадея [267] Для электродов Аи/ДДАБ/Р450 2В4/нафион эта величина составила 515% (10-30 пмоль/электрод).

Некоторые электрохимические параметры для полученных электродов приведены в таблице 1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рудаков, Юрий Олегович, Москва

1. Lewis, D. F. V. Guide to cytochromes P450. Structure and function. / Lewis D. F. V. // London and New York: Taylor and Francis. - 2001. - P. 4-5.

2. Archakov, A.I. Cytochrome P450 and active oxygen / Archakov A.I., Bachmanova G. I. // London: Taylor and Francis Eds. 1990 - P. 105.

3. Ortiz de Montellano, P. R. Cytochrome P450: structure, mechanism and biochemistry. / Ortiz de Montellano, P. R. // New York: plenum press. 1995.

4. Zangar, R. C. Mechanisms that regulate production of reactive oxygen species by cytochrome P450 / Zangar, R. C. Davydov, D. R. Verma, S. // Toxicology and Applied Pharmacology. 2004. - V. 199, №3.-P. 316-331.

5. Nicholson, J. K. Global systems biology, personalized medicine and molecular epidemiology // Molecular Systems Biology. 2006. - V. 2, Article number: 52, http://www.nature.com/msb/journal/v2/nl/full/msb4100095.html

6. Wang, J. Amperometric biosensors for clinical and therapeutic drug monitoring: a review / Wang, J. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.- 1999.-V. 19-P. 47-53.

7. Zhang, Z. Direct electron injection from electrodes to cytochrome P450 cam in biomembrane-like films / Zhang, Z. Nassar, A.-E.F. Lu, Z. Schenkman, J. Rusling, J. // J. Chem. Soc., Faraday Trans. Г997. - V. 93. - P. 1769-1774.

8. Yasui, Н. Possible Involvement of Singlet Oxygen Species as Multiple Oxidants in P450 Catalytic Reactions / Yasui, H. Hayashi, S. Sakurai, H. // Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 2005. - V. 20, №1. - P. 1-13.

9. Faulkner, K. Electrocatalytically driven omega-hydroxylation of fatty acids using cytochrome P450 4A1 / Faulkner, K. Shet, M. Fisher, C. Estabrook, R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - V. 92. - P. 7705-7709.

10. Kazlauskaite, J. Direct electrochemistry of cytochrome P450cam / Kazlauskaite, J. Westlake, A. C. G. Wong, L.-L. Hill, H. A. O. // Chem. Commun. 1996. - V. 18. - P. 2189 - 2190.

11. Rusling, J. F. Enzyme bioelectrochemistry in cast biomembrane-like films / Rusling, J. F. // Acc. Chem. Res. 1998. - V. 31. - P. 363-369.

12. Lei, C. Clay-Bridged Electron Transfer between Cytochrome P450cam and Electrode / Lei, C. Wollenberger, U. Jung, C. Scheller, F.W. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2000. - V. 268, №3. - P. 740-744(5).

13. Joseph, S. An amperometric biosensor with human CYP3A4 as a novel drug screening tool / J., S. Rusling, J. F. Lvov, Y. M. Friedberg, T. Fuhr, U. // Biochem. Pharmacol. 2003. - Vol. 65.-P. 1817-1826.

14. Wang, J. Carbon Nanotube/Teflon Composite Electrochemical Sensors and Biosensors / Wang, J. Musameh, M. // M. Anal. Chem. 2003. - Vol. 75. - P. 2075-2079.

15. Banks, С. E. Electrocatalysis at graphite and carbon nanotube modified electrodes: edge-plane sites and tube ends are the reactive sites / Banks, С. E. Davies, T. J. Wildgoose, G.G. Compton, R.G. // Chem. Commun. 2005. - P. 829-841.

16. Banks, С. E. New electrodes for old: from carbon nanotubes to edge plane pyrolytic graphite / Banks, С. E. Compton, R.G. // Analyst. 2006. - Vol. 131 -P. 15-21.

17. Rubianes, M. D. Carbon nanotubes paste electrode / Rubianes, M. D. Rivas, G. A. // Electrochemistry Communications. 2003. - Vol. 5, №8. - P. 689-694.

18. Rubianes, M. D. Enzymatic biosensors based on carbon nanotubes paste electrodes / Rubianes, M. D. Rivas, G. A. // Electroanalysis. 2005. - Vol. 17. -P. 73-78.

19. Luque, G. L. Glucose biosensor based on the use of a carbon nanotube paste electrode modified with metallic particles / Luque, G. L. Ferreyra, N.F. Rivas, G.A. // Microchim. Acta. 2006. - Vol. 152.-P. 277-283.

20. Perez, B. Glucose biosensor based on carbon nanotube epoxy composites / Perez, B. Pumera, M. Valle, M. Merkoci, A. Alegret, S. // J. Nanosci. Nanotechnol. 2005. - Vol. 5. - P. 1694-1698.

21. Pumera, M. Carbon nanotube-epoxy composites for electrochemical sensing / Pumera, M. Merkoci, A. Alegret, S. // Sens. Actuators B. 2006. - Vol. 113. -P. 617-622.

22. Wang, J. Carbon nanotube screen-printed electrochemical sensors / Wang, J. Musameh, M. // Analyst. 2004. - Vol. 129. - P. 1-2.

23. Wang, B. Amperometric enzyme electrode for the determination of hydrogen peroxide based on sol-gel/hydrogel composite film / Wang, B. Zhang, J. Cheng, G. Dong, S. // Anal. Chim. Acta. 2000. - Vol. 407. - P. 111-118.

24. Liu, G. Amperometric glucose biosensor based on self-assembling glucose oxidase on carbon nanotubes / Liu, G. Lin, Y. // Electrochem. Commun. 2006. -Vol. 8.-P. 251-256.

25. Liu, G. Carbon nanotube-templated assembly of protein / Liu, G. Lin, Y. // J. Nanosci. Nanotechnol. 2006. - Vol. 6. - P. 948-953.

26. Liu, G. Biosensor based on self-assembling acetylcholinesterase on carbon nanotubes for flow injection/amperometric detection of organophosphate pesticides and nerve agents protein / Liu, G. Lin, Y. // Anal. Chem. 2006. - Vol. 78.-P. 835-843.

27. Wang, J. Amperometric choline biosensor fabricated through electrostatic assembly of bioenzyme/polyelectrolyte hybrid layers on carbon nanotubes / Wang, J. Liu, G. Lin, Y. // Analyst. 2006. - Vol. 131. - P. 477-483.

28. Qu, F. L. Amperometric biosensor for choline based on layer-by-layer assembled functionalized carbon nanotube and polyaniline multilayer film / Qu, F. L. Yang, M. H. Jiang, J. H. Shen, G. L. Yu, R. Q. // Anal. Biochem. 2005. -Vol. 344.-P. 108-114.

29. Zhao, H. T. Multilayer membranes for glucose biosensing via layer-by-layer assembly of multiwall carbon nanotubes and glucose oxidase / Zhao, H. T. Ju, H. X. // Anal. Biochem. 2006. - Vol. 350. - P. 138-144.

30. Yu, X. Peroxidase activity of enzymes bound to the ends of single-wall carbon nanotube forest electrodes / Yu, X. Chattopadhyay, D. Galeska, I. Papadimitrakopoulos, F. Rusling, J. F. // Electrochem. Commun. 2003. - Vol. 5. -P. 408-411.

31. Patolsky, F. Long-range electrical contacting of redox enzymes by SWCNTconnectors / Patolsky, F. Weizmann, Y. Willner, I. // Angew. Chem. Int. Ed. 2004. Vol. 43. - P. 2113-2117.

32. Wang, J. Carbon-nanotube-modified glassy carbon electrodes for amplified label-free electrochemical detection ofDNAhybridization/ Wang, J. Kawde, AN. Musameh, M.//Analyst.-2003.-Vol. 128.-P. 912-916.

33. Erdem, A. Direct DNA hybridization at disposable graphite electrodes modified with carbon nanotubes / Erdem, A. Papakonstantinou, P. Murphy, H. // Anal. Chem. 2006. - Vol. 78. - P. 6656-6659.

34. Wu, К. Direct electrochemistry of DNA, guanine and adenine at a nanostructured film-modified electrode / Wu, K. Fei, J. Bai, W. Hu, S. // Anal. Bioanal. Chem. 2003. - Vol. 376. - P. 205-209.

35. Zhu, N. Electrochemical DNA biosensors based on platinum nanoparticles combined carbon nanotubes / Zhu, N. Chang, Z. He, P. Fang, Y. // Anal. Chim. Acta. 2005. - Vol. 545. - P. 21-26.

36. Cai, H. Colloid Au-enhanced DNA immobilization for the electrochemical detection of sequence-specific DNA / Cai, H. Xu, C. He, P.G. Fang, Y.Z. // J. Electroanal. Chem. 2001. - Vol. 510.-P. 78-85.

37. Sanchez, S. Carbon nanotube/polysulfone screenprinted electrochemical immunosensor / Sanchez, S. Pumera, M. Fabregas, E. // Biosens. Bioelectron. -2007. Vol. 23. №3. - P. 332-340.

38. O'Connor, M. Mediated amperometric immunosensing using single walled carbon nanotube forests / O'Connor, M. Kim, S. N. Killard, A. J. Forster, R.J. Smyth, M. R. Papadimitrakopoulos, F. Rusling, J. F. // Analyst. 2004. - Vol. 129. - P. 1176-1180.

39. Yu, X. Protein immunosensor using single-wall carbon nanotube forests with electrochemical detection of enzyme labels / Yu, X. Kim, S.N. Papadimitrakopoulos, F. Rusling, J. F. // Mol. Biosyst. 2005. - Vol. 1. - P. 7078.

40. Ultrasensitive electrical biosensing of proteins and DNA: carbon-nanotube derived amplification of the recognition and transduction events / Wang, J. Liu, G. Jan, M. R. // Am. Chem. Soc. 2004.-Vol. 126.-P. 3010-3011.

41. Augelli, M. A. Flow-through Cell Based on an Array of Gold Microelectodes Obtained From Modified Integrated Circuit Chips / Augelli, M. A. Nascimento, V. B. Pedrotti, J. J. Gutz, I. G. R. Angnes, L. // Analyst. 1997. -Vol. 122.-P. 843-847.

42. Schindler, W. Nanoscale electrodeposition: A new route to magnetic nanostructures? / Schindler, W. Hofmann, D. Kirschner, J. // Journal of Applied Physics. 2000. - Vol. 87. - P. 7007-7009.

43. Kolb, D. M. Nanoscale decoration of electrode surfaces with an STM / Kolb, D. M. Engelmann, G. E. Ziegler, J. C. // Solid State Ionics. 2000. - V. 131. P. 69-78.

44. Xiao, X. Y. Local and global electrochemical nanostructuring of Pt and Au single crystal electrodes / Xiao, X. Y. Nielinger, M. Baltruschat, H. // Electrochimica Acta. 2003. - Vol. 48. - P. 3093-3105.

45. Kolb, D. M. Electrochemical nanostructuring. / Kolb, D. M. Ullmann, R. Ziegler, J. C. // Electrochimica Acta. 1998. - Vol. 43. - P. 2751-2760.

46. Potzschke, R. T. Electrochemical nanostructuring of n-Si(l 11) single-crystal faces / Potzschke, R. T. Staikov, G. Lorenz, W. J. Wiesbeck, W. // Journal of the Electrochemical Society. 1999.-Vol. 146. - P. 141-149.

47. McCord, M. A. SPIE Handbook of Microlithography, Micromachining and Microfabrication Volume 1: Microlithography / McCord, M. A. Rooks, M. J. // Bellingham: SPIE Press. 2000.

48. Bullen, D. Electrostatically actuated dip pen nanolithography probe arrays / Bullen, D. Liu, C. // Sensors and Actuators A: Physical. 2006. - Vol. 125. № 2. -P. 504-511.

49. Sugimur, H. Scanning probe lithography for electrode surface modification / Sugimur, H. Takai, O. Nakagiri, N. // Journal of Electroanalytical Chemistry. -1999. Vol. 473. №1-2. - P. 230-234.

50. Riepl, M. Electrical control of alkanethiols self-assembly on a gold surface as an approach for preparation of microelectrode arrays / Riepl, M. Mirsky, V. M. Wolfbeis, O. S. // Mikrochimica Acta. 1999. - Vol. 131. - P. 29-34.

51. Burmeister, F. Colloid monolayer lithography-A flexible approach for nanostructuring of surfaces / Burmeister, F. Badowsky, W. Braun, T. Wieprich, S. Boneberg, J. Leiderer, P. // Applied Surface Science. 1999. - Vol. 144-145. - P. 461-466.

52. Bethell, D. From monolayers to nanostructured materials: an organic chemist's view of self-assembly / Bethell, D. Brust, M. Schiffrin, D. J. Kiely, C. // Journal of Electroanalytical Chemistry 1996. - Vol. 409. № 1-2. - P. 137143.

53. Microscopie electronique-etude de l'attaque du verre par bombardement ionique / Navez, M. Sella, C. Chaperot, D. // CR Acad. Sci. 1962. - Vol. 254. -P. 240.

54. Valbusa, U. Nanostructuring Surfaces by Ion Sputtering / Valbusa, U. Boragno, C. Buatier de Mongeot, F. // J. Phys.: Condens. Matter. 2002. -Vol.14.-P. 8153.

55. Ritter, M. Nanostructuring of the Cu(001) surface by ion bombardment: a STM study / Ritter, M. Stindtmann, M. Farle, M. Baberschke, K. // Surface Science. 1996. - Vol. 348. - P. 243-252.

56. Nanostructuring of tetrahedral carbon films by carbon ion implantation. / Kutsay, O. Bello, I. Lifshitz, Y. Lam, C. Luk, W. Y. Lee, S. T. Meng, X. Kremnican, V. // Diamond and Related Materials. 2003. - Vol. 12. - P. 20512056.

57. Facsko, S. Formation of Ordered Nanoscale Semiconductor Dots by Ion Sputtering / Facsko, S. Dekorsy, T. Koerdt, С. Trappe, C. Kurz, H. Vogt, A. Hartnagel, H. // Science. 1999. - Vol. 285. - P. 1551.

58. Kirchner, V. Electrochemical nanostructuring with ultrashort voltage pulses / Kirchner, V. Xia, X. H. Schuster, R. // Accounts of Chemical Research. 2001. -Vol. 34.-P. 371-377.

59. Tabei, H. Fabrication and Electrochemical Features of New Carbon Based Interdigitated Array Microelectrodes / Tabei, H. Morita, M. Niwa, O. Horiuchi, T. // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1992. - Vol. 334. - P. 25-33.

60. Nagale M. P. Individually addressable, submicrometer band electrode arrays. 1. Fabrication from multilayered materials / Nagale M. P. Fritsch, I. // Analytical Chemistry. 1998. - Vol. 70. - P. 2902-2907.

61. Wang, J. Preparation and Characterization of Band Nanoelectrodes Made of Carbonized Polyacrylonitrile Films / Wang, J. Brennsteiner, A. Sylwester, A. P. Renschler, C. L. // Electroanalysis. 1991. - Vol. 3. - P. 505-509.

62. Seddon, B. J. Thin-Film Electrode a New Method for the Fabrication of Submicrometer Band Electrodes / Seddon, B. J. Eddowes, M. J. Firth, A. Owen, A. E. Girault, H. H. J. //Electrochimica Acta. - 1991. - Vol. 36. - P. 763-771.].

63. Merritt, C. D. Fabrication of microelectrode arrays having high-aspect-ratio microwires / Merritt, C. D. Justus, B. L. // Chemistry of Materials. 2003. - Vol. 15.-P. 2520-2526.

64. Bao, J. C. Template synthesis of ordered nano-system and their applications / Bao, J. C. Xu, Z. // Chinese Journal of Inorganic Chemistry. 2002. - Vol. 18. -P. 965-975.

65. Forrer, P. Electrochemical preparation and surface properties of gold nanowire arrays formed by the template technique / Forrer, P. Schlottig, F. Siegenthaler, H. Textor, M. // Journal of Applied Electrochemistry. 2000. - Vol. 30.-P. 533-541.

66. Жданов, С. И. // Жидкие кристаллы. 1979. - Т. 9-10. - С. 249-253.

67. Attard, G. S. Liquid-crystalline phase as template for synthesis of mesoporous silica / Attard, G. S. Glyde, J. C. Goltner, C. G. // Nature. 1995. -Vol. 378.-P. 366-368.

68. Attard, G. S. Liquid-Crystal Template for Nanostructured Metals / Attard, G. S. Goltner, C. G. Corcer, J. M. Henke, S. Templer, R. H. // Angewandte Chemie International Edition. 1997.-Vol. 36.-P. 1315-1317.

69. Attard, G. S. Mesoporous Platinum films from Lyotrotic Liquid Crystalline Phases. / Attard, G. S. Bartlett, P. N. Coleman, N. R. B. Elliott, J. M. Ouen, J. R. Wang, J. H. // Sciece. 1997. - Vol. 278. - P. 838-840.

70. Jiang, J. Nanostuctured platinum as an electrolcatalyst for the electrooxidation of formic acid / Jiang, J. Kucernak, A. // Journal of Electroanalytical Chemistry. 2002. - Vol. 520. - P. 64-70.

71. Whitehead, A. H. Nanostructured tin for use as a negative electrode material in Li-ion batteries / Whitehead, A. H. Elliott, J. M. Owen, J. R. // Journal of Power Sources. 1999.-Vol. 81-82.-P. 33-38.

72. Whitehead, A. H. Electrodeposition of mesoporous tin films / Whitehead, A. H. Elliot, J. M. Owen, J. R. Attard, G. S. // Chemical Communications. 1999. -P. 331-332.

73. Attard, G. S. Liquid crystal phase templated mesoporous platinum alloy / Attard, G. S. Leclerc, S. A. A. Maniguet, S. Russell, A. E. Nadhakumar, I. Gollas, B. R. Bartlett, P. N. // Microporous and Mesoporous Materials. 2001. -Vol. 44-45.-P. 159-163.

74. Luckham, P.F. The colloidal and rheological propertiesof bentonite suspensions / Luckham, P.F. Rossi, S. // Adv. Colloid Interface. — 1999.-Vol. 82.-P. 43-92.

75. Teng, Y.W. Direct Evidence of clay-mediated charge-transfer / Teng, Y.W. Chang, I.-J. Wang, C.M. // J. Phys. Chem. B. 1997. - Vol. 101. - P. 1038610396

76. Sallez, Y. Electrochemical behavior of c-type cytochromes at clay-modified carbon electrodes: a model for the interaction between proteins and soils / Sallez, Y. Banco, P. Lojou, E. // J. Electroanal. Chem. 2000. - Vol. 493. - P. 37-49.

77. Bistolas, N. Cytochrome P450 biosensors — a review / Bistolas, N. Wollenberger, U. Jung, C. Scheller, F. W. // Biosensors and Bioelectronics. -2005. Vol. 20. №12. - P. 2408-2423.

78. Bard, A. J. Bioelectrochemistry in Encyclopedia of Electrochemistry, vol. 9 / Bard, A. J. Stratmann, M. Wilson, G. // Weinheim : Wiley-VCH. 2002. - P. 341.

79. Poulos, T. L. Crystal structure of substrate-free Pseudomonas putida cytochrome P-450 / Poulos, T. L. Finzel, В. C. Howard, A. J. // Biochemistry. -1986.-Vol. 25.-P. 5314-5322.

80. Jung, C. Compressibility and uncoupling of cytochrome P450cam: high pressure FTIR and activity studies / Jung, C. Kozin, S. A. Canny, B. Chervin, J. C. Hui Bon Hoa, G. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. - Vol. 312. - P. 197-203.

81. Ege, D. Clay-modified electrodes 3. Electrochemical and electron spin resonance study of montmorillonite layers / Ege, D. Ghosh, P. K. White, J. R. Equey, J. F. Bard, A. J. // J. Am. Chem. Soc. 1985. - Vol. 107. - P. 5644-5652.

82. Kazlauskaite, J. Direct electrochemistry of cytochrome CYP101 / Kazlauskaite, J. Westlake, A. C. G. Wong, L.-L. Hill, H. A. O. // Chem. Commun. 1996.-P. 2189-2190.

83. Reipa, V. A direct electrode-driven CYP cycle for biocatalysis / Reipa, V. Mayhew, M. P. Vilker, V. L. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997. - Vol. 94. -P. 13554-13558.

84. Witz, M. Ferredoxin-mediated electrocatalytic dehalogenation of haloalkanes by cytochrome P450cam / Witz, M. Klucik, J. Rivera, M. J. // J Am. Chem. Soc. 2000. - Vol. 122. - P. 1047.

85. Reipa, V. Redox control of the P450cam catalytic cycle: effects of Y96F active site mutations and binding of a non-natural substrate / Reipa, V. Mayhew, M. P. Holden, M. J. Vilker, V. L. // Chem. Commun. 2002. - Vol. 318. - P. 319.

86. Mayhew, M. P. Improving the cytochrome CYP enzyme for electrode-driven biocatalysis of styrene epoxidation / Mayhew, M. P. Reipa, V. Holden, M. J. Vilker, V. L. // Biotech. Prog. 2000. - Vol. 16. № 4. - P. 610-616.

87. Walsh, M. E. Catalytic reductive dehalogenation of hexachloroethane by molecular variants of cytochrome P450(cam) (CYP101) / Walsh, M. E. Kyritsis, P. Eady, N. A. J. Hill, H. A. O. Wong, L. L. // Eur. J. Biochem. 2000. - Vol. 267. № 18.-P. 5815-5820.

88. Shumyantseva, V. V. Construction and characterization of bioelectrocatalytic sensors based on cytochromes P450 / Shumyantseva, V. V. Bulko, Т. V. Usanov, S. A. Schmid, R. D. Nicolini, C. Archakov, A. I. // J. Inorg. Biochem.-2001.-Vol. 87.-P. 185-190.

89. Zhang, Z. Direct electron injection from electrodes to cytochrome P450cam in biomembrane-like films / Zhang, Z. Nassar, A.-E.F. Lu, Z. Schenkman, J. B. Rusling, J.F. // J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1997. - Vol. 93.1. P. 1769-1774.

90. Bard, A. J. Electrochemical Methods / Bard, A. J. Faulkner, L. R. // New York: Wiley. 1980.

91. Lvov, Y. M. Direct electrochemistry of myoglobin and cytochrome P450cam in alternate layer-by-layer films with DNA and other polyions / Lvov, Y. M. Lu, Z. Schenkman, J. B. Zu, X. Rusling, J. F. // J. Am. Chem. Soc. 1998. -Vol. 120.-P. 4073-4080.

92. Zu, X. Electroenzyme-catalyzed oxidation of styrene and cis~p~ methylstyrene using thin films of cytochrome P450cam and myoglobin / Zu, X. Lu, Z. Zhang, Z. Schenkman, J. B. Rusling, J. F. // Langmuir. 1999. - Vol. 15. -P. 7372-7377.

93. Zhang, Y. Smad 3 and Smad 4 cooperate with c-Jun/c-Fos to mediate TGF-P-induced transcription / Zhang, Y. Feng, X.-H. Derynck, R. // Nature. -1998.-Vol. 394.-P. 909-912.

94. Joseph, S. An amperometric biosensor with human CYP3A4 as a novel drug screening tool / Joseph, S. Rusling, J. F. Lvov, Y. M. Fredberg, T. Fuhr, U. // Biochem. Pharmacol.-2003.-Vol. 65.-P. 1817-1826.

95. Iwuoha, E. Cytochrome P450 2D6 (CYP2D6) bioelectrode for fluoxetine / Iwuoha, E. I. Wilson, A. Howel, M. Mathebe, N. G. R. Montane-Jaime, K. Narinesingh, D. Gueseppi-Elie, A. // Anal. Lett. 2004. - Vol. 37. - P. 929-941.

96. Brust, M. Self-Assembled Gold Nanoparticle Thin Films with Nonmetallic Optical and Electronic Properties / Brust, M. Bethell, D. Kiely, C. J. Schiffrin, D. J. // Langmuir. 1998. - Vol. 14. - P. 5425-5429.

97. Cliffel, D. E. Mercaptoammonium-Monolayer-Protected, Water-Soluble Gold, Silver, and Palladium Clusters / Cliffel, D. E. Zamborini, F. P. Gross S. M., Murray, R. W. // Langmuir. 2000. - Vol. 16. № 25. - P. 9699 -9702.

98. Wuelfing, W. P. Monolayer-Protected Clusters: Molecular Precursors to Metal Films / Wuelfing, W. P. Zamborini, F. P. Templeton, A. C. Wen, X. Yoon, H. Murray, R. W. // Chem. Mater. 2001. - Vol. 13. - P. 87-95.

99. Han, X. Direct electron transfer between hemoglobin and a glassy carbon electrode facilitated by lipid-protected gold nanoparticles / Han, X. Cheng, W. Zhang, Z. Dong, S. Wang, E. // Biochem. Biophys. Acta. 2002. - Vol. 1556. -P. 73-277.

100. Marcos, M. A. Optical absorption spectra of nanocrystal gold molecules / Marcos, M. A. Khoury, J. T. Schaaff, T. G. Shafigullin, M. N. Vezmar, I. Whetten, R. L. // J. Phys. Chem. B. 1997. - Vol. 101. - P. 3706-3712.

101. Mirkin, C. A. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials / Mirkin, C.A. Letsinger, R.L. Mucic, R.C. Storhoff, J.J. //Nature. 1996. - Vol. 382. - P. 607 - 609.

102. Taton, T. A. Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes / Taton, T. A. Mirkin, C. A. Letsinger, R. L. // Science. 2000: - Vol. 289. № 5485, P. 1757- 1760.

103. Nam, J. M. Bio-Bar-Code-Based DNA Detection with PCR-like Sensitivity / Nam, J. M. Stoeva, S. I. Mirkin, C. A. // J. Am. Chem. Soc. 2004. -Vol. 126. № 19. - P. 5932 -5933.

104. Yguerabide, J. Light-Scattering Submicroscopic Particles as Highly Fluorescent Analogs and Their Use as Tracer Labels in Clinical and Biological Applications: I. Theory / Yguerabide, J. Yguerabide, E. E. // Anal. Biochem. -1998.-Vol. 262.-P. 137.

105. Martin, H. Gold nanoparticle probe-based gene expression analysis with unamplified total human RNA / Martin, H. Tai-Fen, W. Muller, U. R. Lefebvre, P. A. Maria, S. S. Paul, Y. P. // Nucleic Acids Res. 2004. - Vol. 32. - P. 137.

106. Shultz, S. Single-target molecule detection with nonbleaching multicolor optical immunolabels / Schultz, S. Smith, D.R. Mock, J.J. Schultz, D.A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - P. 996.

107. Cao, Y. W. C. Nanoparticles with Raman Spectroscopic Fingerprints for DNA and RNA Detection / Cao, Y.W.C. Jin, R. Mirkin, C.A. // Science. 2002. -Vol. 297.-P. 1536-1540.

108. Vo-Dinh, T. Surface-enhanced Raman scattering for medical diagnostics and biological imaging / Vo-Dinh, T. Yan, F. Wabuyele M. B. //J. Raman Spectrosc. 2005. - Vol. 36. - P. 640-647.

109. Mulvaney, S. P. Glass-Coated, Analyte-Tagged Nanoparticles: A New Tagging System Based on Detection with Surface-Enhanced Raman Scattering / Mulvaney, S. P. Musick, M. D. Keating, C. D. Natan, M. J. // Langmuir. 2003. -Vol. 19. № 11. - P. 4784-4790.

110. Kubitschko, S. Sensitivity Enhancement of Optical Immunosensors with Nanoparticles / Kubitschko, S. Spinke, J. Bruckner, T. Pohl, S. Oranth, N. // Anal. Biochem. 1997. - Vol. 253. - P. 112-122.

111. Lyon, L. A. Colloidal Au-Enhanced Surface Plasmon Resonance Immunosensing /Lyon, L.A. Musick, M.D. Natan, M.J. //Anal. Chem. 1998. -Vol. 70.-P. 5177.

112. Hsu, H. Y. RCA combined nanoparticle-based optical detection technique for protein microarray: a novel approach / Hsu, H. Y. Huang, Y. Y. // Biosens. Bioelectron. 2004. - Vol. 20. - P. 123.

113. Englebienne, P. High-throughput screening using the surface plasmon resonance effect of colloidal gold nanoparticles / Englebienne, P. Verhas, M. Hoonacker. A.V.// Analyst.-2001. -Vol. 126.-P. 1645.

114. Asian, K. Angular-Ratiometric Plasmon-Resonance Based Light Scattering for Bioaffmity Sensing / Asian, K. Holley, P. Davies, L. Lakowicz, J. R. Geddes,

115. C.D.//J. Am. Chem. Soc.-2005.-Vol. 127.-P. 12115.

116. Maxwell, D. J. Self-Assembled Nanoparticle Probes for Recognition and Detection of Biomolecules / Maxwell, D. J. Taylor, J. R. Nie, S. // J. Am. Chem. Soc. 2002. - Vol. 124. - P. 9606-9612.

117. Park, S. J. Array-Based Electrical Detection of DNA with Nanoparticle Probes / Park, S. J. Taton, T.A. Mirkin, C.A. // Science. 2002. - Vol. 295. - P. 1503.

118. Diessel, E. Online resistance monitoring during autometallographic enhancement of colloidal Au labels for DNA analysis / Diessel, E. Grothe, K. Siebert, H. M. Warner, B. D. Burmeister, J. // Biosens. Bioelectron. 2004. -Vol. 19.-P. 1229.

119. Haguet, V. Combined nanogap nanoparticles nanosensor for electrical detection of biomolecular interactions between polypeptides / Haguet, V. Martin,

120. D. Marcon, L. Heim, T. Stievenard, D. Olivier, C. El-Mahdi, O. Melnyk, O. // Appl. Phys. Lett. -2004. Vol. 84. - P. 1213.

121. Ozsoz, M. Electrochemical Genosensor Based on Colloidal Gold Nanoparticles for the Detection of Factor V Leiden Mutation Using Disposable

122. Pencil Graphite Electrodes / Ozsoz, M. Arzum, E. Kerman, K. Ozkan, D. Tugrul, B. Topcuoglu, N. Ekren, H. Taylan, M. // Anal. Chem. 2003. - Vol. 75. - P. 2181.

123. Cai, H. Electrochemical detection of DNA hybridization based on silver-enhanced gold nanoparticle label / Cai, H. Wang, Y. He, P. Fang, Y.//Anal. Chim. Acta 2002. - Vol. 469. - P. 165.

124. Odom, T. W. Atomic structure and electronic properties of single-walled carbon nanotubes / Odom, T. W. Huang, J. L. Kim, P. Lieber, С. M. // Nature. -1998. -Vol. 391, № 6662. P. 62-64.

125. Britto P.J. Carbon nanotube electrode for oxidation of dopamine / Britto P.J. Santhanam K.S.V. Ajayan P.M. // Bioelectrochem. Bioenerg. 1996. - Vol. 41. -P. 121.

126. Davis, J. J. Protein electrochemistry at carbon nanotube electrodes / Davis, J. J. Coles, R. J. O'Hill, H. A. // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1997. -Vol. 440.-P. 279.

127. Luo, H. Investigation of the Electrochemical and Electrocatalytic Behavior of Single-Wall Carbon Nanotube Film on a Glassy Carbon Electrode / Luo, H. Shi, Z. J. Li, N. Q. Gu, Z. N. Zhuang, Q. K. // Anal. Chem. 2001. - Vol. 73. - P. 915.

128. McCreery, R. L. Electroanalytical Chemistry, vol. 17 / McCreery, R. L. // New York :Dekker 1991.

129. Li, J. Novel Three-Dimensional Electrodes: Electrochemical Properties of Carbon Nanotube Ensembles/ Li, J. Cassell, A. Delzeit, L. Han, J. Meyyappan, M. // J. Phys. Chem. B. 2002. - Vol. 106. - P. 9299.

130. Nugent, J. M. Fast electron transfer kinetics on multiwalled carbon nanotube microbundle electrodes / Nugent, J. M. Santhanam, K. S. V. Rubio, A. Ajayan, P. M // Nano Lett. 2001. - Vol. 1. - P. 87.

131. Li, J. Novel Three-Dimensional Electrodes: Electrochemical Properties of Carbon Nanotube Ensembles / Li, J. Cassell, A. Delzeit, L. Han, J. Meyyappan, M. // J. Phys. Chem. B. 2002. - Vol. 106. - P. 9299.

132. Gooding, J. J. Nanostructuring electrodes with carbon nanotubes: A review on electrochemistiy and applications for sensing / Gooding, J. J. // Electrochimica Acta. 2005. - Vol. 50. - P. 3049-3060.

133. Chen, P.H. Control of Electron Transfer Kinetics at Glassy Carbon Electrodes by Specific Surface Modification / Chen, P.H. Fryling, M.A. McCreery, R.L.//Anal. Chem. 1994. - Vol. 67. -P. 3115.

134. Liu, J. Q. Achieving Direct Electrical Connection to Glucose Oxidase Using Aligned Single Walled Carbon Nanotube Arrays / Liu, J. Q. Chou, A. Rahmat, W. Paddon-Row, M. N. Gooding, J. J. // Electroanalysis. 2005. - Vol. 17. - P. 38.

135. Cline, К. K. Anomalously Slow Electron Transfer at Ordered Graphite Electrodes: Influence of Electronic Factors and Reactive Sites / Cline, К. K. McDermott, M. T. McCreery, R. L. //J. Phys. Chem. 1994. - Vol. 98. - P. 5314.

136. Chou, A. Demonstration of the importance of oxygenated species at the ends of carbon nanotubes for their favourable electrochemical properties / Chou, A. Bocking, T. Singh, N. K. Gooding, J. J. // Chem. Comm. 2005. - Vol.7. - P. 842-844.

137. Gooding, J. J. Protein Electrochemistry Using Aligned Carbon Nanotube Arrays / Gooding, J. J. Wibowo, R. Liu, J. Q. Yang, W. R. Losic, D. Orbons, S. Mearns, F J. Shapter, J.G. Hibbert, D.B.// J. Am. Chem. Soc. 2003. - Vol. 125. -P. 9006.

138. Lee, R. S. Conductivity Enhancement in Single-Walled Carbon Nanotube Bundles Doped with К and Br / Lee, R. S. Kim, H. J. Fischer, J. E. Thess, A. Smalley, R. E. // Nature. 1997. - Vol. 388. - P. 255.

139. Koehne, J. Ultrasensitive label-free DNA analysis using an electronic chip based on carbon nanotube nanoelectrode arrays / Koehne, J. Chen, H. Li, J. Cassell, A.M. Ye, Q. Ng, H.T. Han, J. Meyyappan, M. // Nanotechnology. -2003. -Vol. 14.-P. 1239.

140. Koehne, J. The fabrication and electrochemical characterization of carbon nanotube nanoelectrode arrays / Koehne, J. Li, J. Cassell, A. M. Chen, H. Ye, Q. Ng, H. T. Han, J. Meyyappan, M. // J. Mater. Chem. 2004. - Vol. 14. - P. 676.

141. Britto, P. J. Carbon Nanotube Electrode for Oxidation of Dopamine / Britto, P. J. Santhanam, K. S. Vajayan, P. M. // J. Bioelectrochemistry. 1996. - Vol. 41. -P. 121.

142. Wu, K. Direct electrochemistry of DNA, guanine and adenine at a nanostructured film-modified electrode / Wu, K. Fei, J. Bai, W. Hu, S. // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2003. - Vol. 376. - № 2. - P. 205209.

143. Wang, J. Solubilization of Carbon Nanotubes by Nafion toward the Preparation of Amperometric Biosensors / Wang, J. Musameh, M. Lin Y. // J. Am. Chem. Soc. 2003. - Vol. 125. - P. 2408-2409.

144. Wang, J. Carbon nanotube screen-printed electrochemical sensors / Wang, J. Mousameh, M. // Analyst. 2004. - Vol. 129. - P. 1.

145. Wang, J. Carbon Nanotube/Teflon Composite Electrochemical Sensors and Biosensors / Wang, J. Musameh M. //Anal. Chem. 2003. - Vol. 75. - P. 2075.

146. Guiseppi-Elie, A. Direct electron transfer of glucose oxidase on carbon nanotubes / Guiseppi-Elie, A. Lei, С. H. Baughman, R. H. // Nanotechnology. -2002.-Vol. 13.-P. 559.

147. Wang, Z. H. A selective voltammetric method for uric acid detection at cyclodextrin modified electrode incorporating carbon nanotubes / Wang, Z. H. Liu, J. Liang, Q. L. Wang, Y. M. Luo, G. //Analyst. 2002. - Vol. 127. - 653.

148. Wang, J. X. Electrocatalytic Oxidation of Norepinephrine at a Glassy Carbon Electrode Modified with Single Wall Carbon Nanotubes / Wang, J. X. Li, M. X. Shi, Z. J. Li, N. Q. Gu, Z. N. // Electroanalysis. 2002. - Vol. 14. - P. 225.

149. Wang, J. X. Electrochemistry of DNA at Single-Wall Carbon Nanotubes / Wang, J. X. Li, M.X. Shi, Z. J. Li, N. Q. Gu, Z. N. // Microchem. J. 2002. -Vol. 73.-P. 325.

150. Azamian, B. R. Bioelectrochemical Single-Walled Carbon Nanotubes / Azamian, B. R. Davis, J. J. Coleman, K. S. Bagshaw, С. B. Green, M. L. H. // J. Am. Chem. Soc. 2002. - Vol. 124. - P. 12664.

151. Wang, J. X. Electrochemistry of DNA at Single-Wall Carbon Nanotubes / Wang, J. X. Li, M. X. Shi, Z. J. Li, N. Q. Gu, Z. N. // Electroanalysis. 2004. -Vol. 16.- P. 140.

152. Barisci, J. N. Electrochemical quartz crystal microbalance studies of single-wall carbon nanotubes in aqueous and non-aqueous solutions / Barisci, J. N. Wallace, G. G. Baughman, R. H. //Electrochim. Acta. 2000. - Vol. 46. № 4. -P. 509.

153. Barisci, J. N. Electrochemical studies of single-wall carbon nanotubes in aqueous solutions / Barisci, J. N. Wallace, G. G. Baughman, R. H. // J. Electroanal. Chem. 2000. - Vol. 488. - P. 92.

154. Barisci, J. N. Electrochemical Characterization of Single-Walled Carbon Nanotube Electrodes / Barisci, J. N. Wallace, G.G. Baughman, R.H. // J. Electrochem. Soc. 2000. - Vol. 147. - P. 4580.

155. Moore, R. R. Basal Plane Pyrolytic Graphite Modified Electrodes: Comparison of Carbon Nanotubes and Graphite Powder as Electrocatalysts / Moore, R. R. Banks, С. E. Compton. R. G. // Anal. Chem. 2004. - Vol. 76. - P. 2677.

156. Nakashima, N. Formation of Single-Walled Carbon Nanotube Thin Films on Electrodes Monitored by an Electrochemical Quartz Crystal Microbalance / Nakashima, N. Kobae, H. Sagara, T. Murakami, K. // Chem. Phys. Chem. 2002. -Vol. 5.-P. 456.

157. Nugent, J. M. Fast electron transfer kinetics on multiwalled carbon nanotube microbundle electrodes / Nugent, J. M. Santhanam, K. S. V. Rubio, A. Ajayan, P. M. // Nano Lett. 2001. - Vol. 1. - P. 87.

158. Yu, X. F. The study of the attachment of a single-walled carbon nanotube to a self-assembled monolayer using X-ray photoelectron spectroscopy / Yu, X. F. Mu, T. Huang, H. Z. Liu, Z. F. Wu, N. Z. // Surf. Sci. 2000. - Vol. 461. - P. 199.

159. Hibbert, D. B. Kinetics of Irreversible Adsorption with Diffusion: Application to Biomolecule Immobilization / Hibbert, D. B. Gooding, J. J. Erokhin, P. // Langmuir. 2002. - Vol. 18. - P. 1770.

160. Chattopadhyay, D. Metal-assisted organization of shortened carbon nanotubes in monolayer and multilayer forest assemblies / Chattopadhyay, D. Galeska, I. Papadimitrakopoulos, F. // J. Am. Chem. Soc. 2001. - Vol. 123 - P. 9451.

161. Yu, X. Peroxidase activity of enzymes bound to the ends of single-wall carbon nanotube forest electrodes / Yu, X. Chattopadhyay, D. Galeska, I. Papadimitrakopoulos, F. Rusling, J. F. // Electrochem. Commun. 2003. - Vol. 5.-P. 408.

162. Kim, В. Self-alignment of shortened multiwall carbon nanotubes on polyelectrolyte layers / Kim, B. Sigmund, W. M. // Langmuir. 2003. - Vol. 19-P. 4848.

163. Patolsky, F. Long-Range Electrical Contacting of Redox Enzymes by SWCNT Connectors / Patolsky, F. Weizmann, Y. Willner, I. // Angew. Chem. -2004. Vol. 43. № 16. - P. 2113.

164. Nan, X. L. Immobilizing Shortened Single-Walled Carbon Nanotubes (SWNTs) on Gold Using a Surface Condensation Method / Nan, X. L. Gu, Z .N. Liu, Z. F. // Colloid Interface Sci. 2002. - Vol. 245. - P. 311.

165. Yang, Y.Y. Patterned Growth of Well-Aligned Carbon Nanotubes: A Photolithographic Approach/ Yang, Y.Y. Huang, S.M. He, H. Mau, A.W.H. Dai, L.M. // J. Am. Chem. Soc. 1999. - Vol. 121. - P. 10832.

166. He, P. G. Aligned carbon nanotube-DNA electrochemical sensors / He, P. G. Dai, L. M. // Chem. Commun. 2004. - Vol. 348.

167. Gao, M. Aligned Coaxial Nanowires of Carbon Nanotubes Sheathed with Conducting Polymers / Gao, M. Huang, S.M. Dai, L.M. Wallace, G. Gao, R.P. Wang, Z.L. // Angew. Chem. Int. Ed. 2000. - Vol. 39. № 20. - P. 3664

168. Gao, M. Biosensors Based on Aligned Carbon Nanotubes Coated with Inherently Conducting Polymers / Gao, M. Dai, L. M. Wallace, G. G.// Electroanalysis. 2003. -Vol. 15.-P. 1089.

169. Sotiropoulou, S. Carbon nanotube array-based biosensor / Sotiropoulou, S. Chaniotakis, N.A. // Anal. Bioanal. Chem. 2003. - Vol. 375. - P. 103.

170. Li, J. Carbon nanotube nanoelectrode array for ultrasensitive DNA detection / Li, J. Ng, H.T. Cassell, A. Fan, W. Chen, H. Ye, Q. Koehne, J. Han, J. Meyyappan, M. // Nano Lett. 2003. - Vol. 3. - P. 597.

171. Nguyen, С. V. Preparation of nucleic acid functionalized carbon nanotube arrays / Nguyen, C.V. Delzeit, L. Cassell, A.M. Li, J. Han, J. Meyyappan, M. // Nano Lett.-2002.-Vol. 2.-P. 1079.

172. Li, J. Novel Three-Dimensional Electrodes: Electrochemical Properties of Carbon Nanotube Ensembles / Li, J. Cassell, A. Delzeit, L. Han, J. Meyyappan, M. // J. Phys. Chem. B. 2002. - Vol. 106. - P. 9299.

173. Bekyarova, E. Applications of Carbon Nanotubes in Biotechnology and Biomedicine / / Bekyarova, E. Ni, Y. Malarkey, E. B. Montana, V. McWilliams, J. L. Haddon, R. C. Parpura, V. // Journal of Biomedical Nanotechnology. -2005. Vol. 1. № 1. -P. 3-17(15).

174. Boussaad, S. Detection of Protein Adsorption with Single Wall Carbon Nanotube Device / Boussaad, S. Tao, N. J. Nagahara, L. Zhang, R. Tsui, R. R. // Chem. Communications. 2003. - P. 1502 - 1503.

175. Wang, J. Ultrasensitive Electrical Biosensing of Proteins and DNA: Carbon-Nanotube Derived Amplification of the Recognition and Transduction Events / Wang, J. Liu, G. Jan, M. // J. Am. Chem. Soc. 2004. - Vol. 126. - P. 3010.

176. Azamian, B. R. Bioelectrochemical Single-Walled Carbon Nanotubes / Azamian, B. R. Davis, J. J. Coleman, K. S. Bagshaw, С. B. Green, M. L. H. // Journal of the American Chemical Society. 2002. - Vol. 124. - P. 12664.

177. Pantarotto, D. Translocation of Bioactive Peptides Across Cell Membranes by Carbon Nanotubes / Pantarotto, D. Briand, J.-P. Prato, M. Bianco, A. // Chem. Commun.-2004.-Vol. 7. №1.-P. 16-17.

178. Kam, N. W. S. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells / Kam, N.W.S. Jessop, T.C. Wender, P. Dai, H. //J.Am. Chem. Soc.-2004.-Vol. 126.-P. 6850-6851.

179. Zorbas, V. Preparation and Characterization of Individual Peptide-Wrapped Single-Walled Carbon Nanotubes / Zorbas, V. Ortiz-Acevedo, A. Dalton, A.B. Yoshida, M. M. Dieckmann, G. R. Draper, R. K. Baughman, R. H. Jose

180. Yacaman, M. Musselman, I. H. // J. Am. Chem. Soc. 2004. - Vol. 126. - P. 7222-7227.

181. Tatsuma, T. Electrochemical microgravimetry of fullerene (C60) films / Tatsuma, T. Kikuyama, S. Oyama, N. // J. Phys. Chem. 1993. - Vol. 97. - P. 12067.

182. Wang, Y. M. Aggregates of Cm and Co Formed at the Gas-Water Interface and in DMSO/Water Mixed Solvents. A Spectral Study / Wang, Y. M. Kamat, P. V. Patterson L. K. // J. Phys. Chem. 1993. - Vol. 97. - P. 8793.

183. Sherigara, B. S. Electrocatalytic Properties and Sensor Applications of Fullerenes and Carbon Nanotubes / Sherigara, B. S. Kutner, W. D'Souza, F. // Electroanalysis. 2003. - Vol. 15. - P. 753-772.

184. Xie, Q. Electrochemical detection of C606-and C706-: Enhanced stability of fullerides in solution / Xie, Q. Perez-Cordero, E. Echegoyen, L.// J. Am. Chem. Soc. 1992. - Vol. 114. - P. 3978.

185. Ohsava, Y. Electrochemical detection of Сбо6- at low temperature / Ohsava, Y. Saji, T. // J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1992. - Vol. 781.

186. Meerholz, K. Voltammetry of fullerenes C60 and C70 in dimethylamine and methylene chloride / Meerholz, K. Tschuncky, P. Heinze, J. // J. Electroanal. Chem. 1993. - Vol. 347. - P. 425.

187. D'Souza, F. Immobilization and Electrochemical Redox Behavior of Cytochrome с on the Fullerene Film Modified Electrodes / D'Souza, F. Rogers, L. M. O'Dell, E. S. Kochman, A. Kutner, W. // Bioelectrochem. 2005. - Vol. 66. -P. 35-40.

188. Li, M.-X. Electrocatalysis of cytochrome с at a C60-y-cyclodextrin and Nafion chemically modified electrode /Li, M.-X. Li, N.-Q. Gu, Z.-N. Zhou, X-H. Sun, Y.-L. Wu, Y.-Q. // Talanta. 1988. - Vol. 46. - P. 993.

189. Patolsky, F. C60-mediated bioelectrocatalyzed oxidation of glucose with glucose oxidase / Patolsky, F. Tao, G. Katz, E. Willner, I. // J. Electroanal. Chem. 1998.-Vol. 454.-P. 9-13.

190. Karyakin, A. A. A High-Sensitive Glucose Amperometric Biosensor Based on Prussian Blue Modified Electrodes / Karyakin, A. A. Gitelmacher, O.V. Karyakina, E. E. // Analytical Letters. 1994. - Vol. 27. - P. 2861-2869.

191. Chi, Q. J. Amperometric biosensors based on the immobilization of oxidases in a Prussian blue film by electrochemical codeposition / Chi, Q.J. Dong, S .J. // Analytica Chimica Acta. 1995.-Vol. 310.-P. 429-436.

192. Karyakin, A. A. Prussian Blue-based 'artificial peroxidase' as a transducer for hydrogen peroxide detection. Application to biosensors. / Karyakin, A.A. Karyakina, E.E. // Sensors and Actuators, B. 1999. - Vol. 57. - P. 268-273.

193. Karyakin, A. A. Prussian Blue-Based First-Generation Biosensor. A Sensitive Amperometric Electrode for Glucose. / Karyakin A.A., Gitelmacher O.V., Karyakina E. E. // Analytical Chemistry. 1995. - V. 67. - P. 2419-2423.

194. Lin, M.S. Chromium hexacyanoferrate based glucose biosensor / Lin, M.S. Shih, W.C. // Analytica Chimica Acta. 1999. - Vol. 381. - P. 183-189.

195. Zhang, J. Z. Cobalt(II)hexacyanoferrate film modified glassy carbon electrode for construction of a glucose biosensor / Zhang, J.Z. Dong, S.J. // Analytical Letters. 1999. - Vol. 32. - P. 2925-2936.

196. Wang, J. Glucose microsensors based on carbon paste enzyme electrodes modified with cupric hexacyanoferrate / Wang, J. Zhang, X. J. Prakash, M. // Analytica Chimica Acta. 1999. - Vol. 395. - P. 11-16.

197. Karyakin, A.A. Prussian Blue based amperometric biosensors in flow-injection analysis / Karyakin, A.A., Karyakina, E.E., Gorton, L. // Talanta. -1996.-Vol. 43. P. 1597-1606.

198. Shan, D. Direct electrochemistry and electrocatalysis of hemoglobin entrapped in composite matrix based on chitosan and СаСОз nanoparticles / Shan, D. Wang, S. Xue, H. Cosnier, S. // Electrochemistry Communications. 2007. -Vol. 9.-P. 529-534.

199. Grasset, L. Woven silk as a carrier for the immobilization of enzymes / Grasset, L. Cordier, D. Ville, A. // Biotechnol. Bioeng. -1977. Vol. 19. - P. 611.

200. Yoshimizu H. Preparation and characterization of silk fibroin powder and its application to enzyme immobilization / Yoshimizu H. Asakura, T. // J. Appl. Polym. Sci. 1990. - Vol. 40. P. 127.

201. Yunhua, W. U. Direct electrochemistry and electrocatalysis of heme-proteins in regenerated silk fibroin film / Yunhua, W. U. Shen, Q. Hu, S. // Analytica chimica acta. 2006. - Vol. 558. - P. 179-186.

202. Hayatt, M. A. Colloidal Gold-Principles, Methods and Applications / Hayatt, M. A. // San Diego: Academic Press. 1989.

203. Gonzalez-Garcia, M. B. Colloidal gold as an electrochemical label of streptavidin-biotin interaction / Gonzalez-Garcia, M.B. Fernandez-Sanchez, C. Costa-Garcia, A. //Biosens. Bioelectron. 2000. - Vol. 15. - P. 315.

204. Dequaire, M. An Electrochemical Metalloimmunoassay Based on a Colloidal Gold Label / Dequaire, M. Degrand, C. Limoges, B. //Anal. Chem. -2000.-Vol. 72.-P. 5521.

205. Chu, X. An electrochemical stripping metalloimmunoassay based on silver-enhanced gold nanoparticle label / Chu, X. Fu, X. Chen, K. Shen, G. Yu, R. // Biosens. Bioelectron. 2005. - Vol. 20. - P. 1805.

206. Liu, G. Nanomaterial labels in electrochemical immunosensors and immunoassays / Liu, G. Lin, Y. // Talanta. 2007. - Vol. 74. № 3. - P. 308 - 317.

207. Ambrosi, A. Doublecodified gold nanolabels for enhanced immunoanalysis / Ambrosi, A. Castaneda, M.T. Killard, A.J. Smyth, M.R. Alegret, S. Merkoci, A. // Anal. Chem. 2007. - Vol. 79. - P. 5232.

208. Velev, O. D. In Situ Assembly of Colloidal Particles into Miniaturized Biosensors / Velev, O. D. Kaler, E. W. // Langmuir. 1999. - Vol. 15. - P. 3693.

209. Cai, H. Cu@Au alloy nanoparticle as oligonucleotides labels for electrochemical stripping detection of DNA hybridization / Cai, H. Zhu, N. Jiang,

210. Y. He, P. Fang, Y. // Biosensors and Bioelectronics. 2003. - Vol. 18. - P. 13111319.

211. Chu, X. Quartz crystal microbalance immunoassay with dendritic amplification using colloidal gold immunocomplex / Chu, X. Zhao, Z. Shen, G. Yu, R. // Sens. Actuator B. 2006. - Vol. 114. - P. 696.

212. Chan, W. C. W. Quantum Dot Bioconjugates for Ultrasensitive Nonisotopic Detection / Chan, W. C. W. Nie, S. // Science. 1998. - Vol. 281. - P. 2016.

213. Bruchez, M. Jr. Semiconductor Nanocrystals as Fluorescent Biological Labels / Bruchez, M. Jr. Moronne, M. Gin, P. Weiss, S. Alivisatos, P. A. // Science. 1998.-Vol. 281.-P. 5385.

214. Han, M. Quantum-dot-tagged microbeads for multiplexed optical coding of biomolecules / Han, M. Gao, X. Su, J. Nie, S. // Nat. Biotechnol. 2001. - Vol. 19.-P. 631.

215. Liu, G. Electrochemical Coding for Multiplexed Immunoassays of Proteins / Liu, G. Wang, J. Kim, J. Jan, M.R. Collins, G.E. // Anal. Chem. 2004. - Vol. 76.-P. 7126.

216. Hansen, J. A. Quantum-dot/aptamer-based ultrasensitive multi-analyte electrochemical biosensor / Hansen, J. A. Wang, J. Kawde, A. Xiang, Y. Gothelf, K.V. Collins, G. // J. Am. Chem. Soc. 2006. - Vol. 126. - P. 2228.

217. Liu, G. Nanomaterial labels in electrochemical immunosensors and immunoassays / Liu, G. Lin, Y. // Talanta. 2007. - Vol. 74. - P. 308-317.

218. Liu, G. Versatile Apoferritin Nanoparticle Labels for Assay of Protein / Liu, G. Wang, J. Wu, H. Lin, Y. // Anal. Chem. 2006. - Vol. 78. - P. 7417.

219. Shumyantseva, V. V. Electrochemical properties of cytochrome P450 using nanostructured electrodes: Direct electron transfer and electro catalysis / Shumyantseva, V. V. Bulko, Т. V. Rudakov, Yu. O. Kuznetsova, G. P.

220. Samenkova, N. F. Lisitsa, A. V. Karuzina, I. I. Archakov, A. I. // Journal of Inorganic Biochemistry. 2007. - Vol. 101. № 5. - P. 859-865.

221. Puganova, E. A. New materials based on nanostructured Prussian blue for development of hydrogen peroxide sensors / Puganova, E. A. Karyakin, A. A. // Sensors and Actuators B: Chemical. 2005. - Vol. 109. № 1. - P. 167-170.

222. Nash, T. The colorimetric estimation of formaldehyde by means of the Hantzsch reaction /Nash, T. //Biochem. J. 1953. - Vol. 55. № 3. -P. 416-421.

223. Riley, D. J. Electrochemistry in nanoparticle science / Riley, D. J. // Curr. Opin. Colloi. Interf. Sci. 2002. - Vol. 7. - P. 186-192.

224. Ribrioux, S. Use of nanogold- and fluorescent-labeled antibody Fv fragments in immunochemistry / Ribrioux, S. Kleymann, G. Haase, W. Heitmann, K. Ostermeier, C. Michel, H. // J. Histochem Cytochem. 1996. - Vol. 44. - P. 207-213.

225. Perm, S. Nanoparticles for Bioanalysis / Penn, S. G. He L. Natan, M. J. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2003. - Vol. 7. - P. 1-7.

226. Cheng, W. Gold Nanoparticles as Fine Tuners of Electrochemical Properties of the Electrode/Solution Interface / Cheng, W. Dong, S. Wang, E. // Langmuir. 2002. -Vol. 18. - P. 9947-9952.

227. Wang, J. Nanomaterial-based electrochemical biosensors / Wang, J. // Analyst. 2005. - Vol. 130. - P. 421-426.

228. Broun, K. R. Morphology-dependent electrochemistry of Cytochrome с at Au colloid-modified Sn02 electrodes / Broun, K. R. Fox, A. P. Natan, M. J. // J. Am. Chem. Soc. 1996.-Vol. 118.-P. 1154-1157.

229. Han, X. Direct electron transfer between hemoglobin and a glassy carbon electrode facilitated by lipid-protected gold nanoparticles / Han, X. Cheng, W. Zhang, Z. Dong, S. Wang, E. Biochem. Biophys. Acta. 2002. - Vol. 1556. - P. 273-277.

230. Murray, R. W. Electroanalytical Chemistry, vol. 13 / Murray, R. W. Bard, A. J. //New-York: Marcel Dekker. 1984. P. 191.

231. Guto, P. M. Myoglobin retains iron heme and near-native conformation in DDAB films prepared from pH 5 to 7 dispersions / Guto, P. M. Rusling, J. F. // Electrochemistry Communications. 2006. - Vol. 8. № 3. - P. 455-459.

232. Fang, X. Stoichiometry of 7-ethoxycoumarin metabolism by cytochrome P450 2B1 wild-type and five active-site mutants / Fang, X. Kobayashi, Y. Halpert, J. R. // FEBS Letters. 1997. - Vol. 416. № 1. - P. 77-80.

233. Shumyantseva, V. V. Semisynthetic Flavocytochromes Based on Cytochrome P450 2B4: Reductase and Oxygenase Activities / Shumyantseva, V. V. Bulko, Т. V. Alexandrova, S. Sokolov, N. N. Schmid, R. D. Bachmann, T.

234. Archakov, A. I. // Biochemical and Biophysical Research Communications. -1999. Vol. 263. № 3. - P. 678-680.

235. Thurman, R. G. Hydrogen Peroxide Formation and the Role of Catalase / Thurman, R. G. Ley, G. Scholz, R. // Eur. J. Biochem. 1972. - Vol. 25. - P. 420-430.

236. Moore, G. R. Structural basis for the variation in redox potential of cytochromes / Moore, G. R. Williams, R. P. J. // FEBS Lett. 1977. - Vol. 79. -P. 229-232.

237. Stellwagen, E. Haem exposure as the determinate of oxidation-reduction potential of haem proteins / Stellwagen, E. // Nature. 1978. - Vol. 275. - P. 7374.

238. O'Donoghue, D. The electrochemical response of microperoxidase in nonaqueous solvents / O'Donoghue, D. Magner, E. // Chem. Commun. 2003. - P. 438-439.

239. Moore, G., R. Factors Influencing Redox Potentials of Electron Transfer Proteins / Moore, G., R. Pettigrew, G. W. Rogers, N. K. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1986. - Vol. 83. - P. 4998-4999.

240. Tezcan, F. A. Effects of Ligation and Folding on Reduction Potentials of Heme Proteins / Tezcan, F. A. Winkler, J. R. Gray, H. B. // J. Am. Chem. Soc. -1998. Vol. 120.-P. 13383-13388.

241. Gavioly, G. Redox thermodynamics of cytochrome с adsorbed on mercaptoundecanol monolayer electrodes / Gavioly, G. Borsari, M. Cannio, M. Ranieri, A. Volponi, G. // J. Electroanal. Chem. 2004. - Vol. 564. - P. 45-52.

242. Scott, R. A. Cytochrome c: A Multidisciplinary Approach / Scott, R. A. Mauk, A. G. // Eds. University Science Books: Sausalito. CA. 1996. - P. 10.

243. Beissenhirtz, M. Immobilized Cytochrome с Sensor in Organic/Aqueous Media for the Characterization of Hydrophilic and Hydrophobic Antioxidants / Beissenhirtz, M. Scheller, F. Lisdat, F. //Electroanalysis 2003, 15, 1425-1435.

244. Sivakolundu, S. G. Cytochrome с Structure and Redox Function in Mixed Solvents Are Determined by the Dielectric Constant / Sivakolundu, S. G. Mabrouk, P. A.//J. Am. Chem. Soc.-2000.- Vol. 122.-P. 1513-1521.

245. Borsari, M. Redox thermodynamics of cytochrome с in mixed water-organic solvent solutions / Borsari, M. Bellei, M. Tavagnacco, C. Peressini, S. Millo, D. Costa, G.//Inorg. Chim. Acta. 2003. - Vol. 349.-P. 182-188.

246. Dean, J.A. Lange's Handbook of Chemistry, 14th ed. / Dean, J.A. // New York: McGraw-Hill. 1992.

247. O'Reilly, N. J. Electrochemistry of Cytochrome с in Aqueous and Mixed Solvent Solutions: Thermodynamics, Kinetics, and the Effect of Solvent Dielectric Constant / O'Reilly, N. J. Magner, E. // Langmuir. 2005. - Vol. 21. -P. 1009-10014.

248. Liu, X. Electrochemical Investigation of Redox Thermodynamics of Immobilized Myoglobin: Ionic and Ligation Effects / Liu, X. Huang, Y. Zhang, W. Fan, G. Fan, C. Li, G. // Langmuir. 2005. - Vol. 21. - P. 375-378.

249. Battistuzzi, G. Redox Thermodynamics of Blue Copper Proteins / Battistuzzi, G. Borsari, M. Loschi, L. Righi, F. Sola, M. // J. Am. Chem. Soc. -1999.-Vol. 121.-P. 501-506.

250. Faulkner, К. M. A Spectroelectrochemical Method for Differentiation of Steric and Electronic Effects in Hemoglobins and Myoglobins / Faulkner, К. M. Bonaventura, C. Crumbliss, A. L. // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270. - P. 13604.

251. Не, X. Direct electrochemistry of hemoglobin in cetylpyridinium bromide film: Redox thermodynamics and electrocatalysis to nitric oxide / He, X. Zhu, L. // Electrochemistry Communications. 2006. - Vol. 8. № 4. - P. 615-620.

252. Battistuzzi, G. Control of Cytochrome с Redox Potential: Axial Ligation and Protein Environment Effects / Battistuzzi, G. Borsari, M. Cowan, J. Ranieri, A. Sola, M. // J.Am. Chem. Soc. 2002. - Vol. 124.-P. 5315.

253. Honeychurch, M. J. The thermodynamics and kinetics of electron transfer in the cytochrome P450cam enzyme system / Honeychurch, M. J. Allen, H. Hill, O. Wong, L-L. //FEBS lett. 1999. - Vol. 451. № 3. - P. 351-353.

254. Santucci, R. Ferrari Effect of dimethyl sulfoxide on the structure and the functional properties of horseradish peroxidase as observed by spectroscopy and cyclic voltammetry / Santucci, R. Laurenti, E. Sinibaldia F. Pia R.

255. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Protein Structure and Molecular Enzymology. - 2002. - Vol. 1596. №. 2. - P. 225-233.

256. Battistuzzi, G. Medium and Temperature Effects on the Redox Chemistry of Cytochrome с / Battistuzzi, G. Borsari, M. Sola, M. // Eur. J. Inorg. Chem. -2001 Vol. 2001. № 12. - P. 2989 - 3004.

257. Fan, C. Spectroscopy and Electrochemistry of the Covalent Pyridine-Cytochrome с Complex and a Pyridine-Induced, "Alkaline-like" Conformation / Fan, C. Gillespie, B. Wang, G. Heeger, A. J. Plaxco, K. W. // J. Phys. Chem. B. -2002.-Vol. 106.-P. 11375.

258. Zhang, W. An electrochemical investigation of ligand-binding abilities of film-entrapped myoglobin / Zhang, W. Fan, C. Sun, Y. Li, G. // Biochim. Biophys. Acta, General Sub. 2003. - Vol. 1623. - P. 29.

259. Battistuzzi, G. Enthalpy/entropy compensation phenomena in the reduction thermodynamics of electron transport metalloproteins / Battistuzzi, G. Borsari, M. Rocco, G. D. Ranieri, A. Sola, M. // J. Biol. Inorg. Chem. 2004. - Vol. 9. -P. 23.

260. Battistuzzi, G. Redox Thermodynamics of the Fe3+/Fe2+ Couple in Horseradish Peroxidase and Its Cyanide Complex / Battistuzzi, G. Borsari, M. Ranieri, A. Sola, M. // J. Am. Chem. Soc. 2002. - Vol. 124. - P. 26.