Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электрогенез и ионный обмен у аэробных бактерий

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Электрогенез и ионный обмен у аэробных бактерий"

ряз »д ¡Ш

ЕРЕВАНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ВАРДАНЯН АРШ ГЕРВЛСЯЕЮЧ

УДК 577.352.315 + 23

ЭШСГРОГЕВЕЗ И КОШЗЫЙ ОШШ У АЭРОНШХ БАКТЕШй шетхРАС'гшхия Г-ЪАГиН

(Ш.00.02. - Биофизика)

АВТОРЕФЕРАТ

дассертапда на сопскаьаа ученой степсшх кандидата биологических наук

ЕРЕВАН - 1988

Работ выполнена иа яафадрэ бяофюягв биологического фа-куль^ота Ереванского ордена Трудового Красного Знакеня госу-_ дарственного угаверслтга и в лаборатории йиэислсгки и бтш-мии кгкроорганизков га"Ша\жноклсхкот.

Научный руководитель - доктор блологичосвях паук,

профессор С.МЛШгТЛРООПВ

О&гцяаяьине оппоненты: доктор биологкчэсяис на//.,

профессор Л.С.ЯУШСЖЙ

доктор биологических наук С.А.ЕАДЗИКШ

Ведущее учраадоняе - Институт ^кробаологви пм.А .Еярхон-штойна АН Лагв.СС?

Защита дооврздкк состоится 1988 г.

в ^У^^аюов на заседала: сиовдалязкров&нного Совега К.Ш5.01.С6 да щясуждеина ученой сгеиэнк кандадага биояого-ческих наук при Ереванском ордена Трудового Красного Знамени государственном университете (375С4Э, Ереван, ул. Мравяяа I, Ереванский гсоунивзржтег, биологический факультет, кафедра баохзшец),

С дассэргадарй :йшю озяакоьшгьсЕ в бй'блкожвке уииверси-

тога.

Автореферат разослан

Ученый секретарь споараяизирэванЕого Совета, кандидат бишюгичеодах «иу!

Л'.Г.АНАНЯН

/ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРА СТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Клетка надеано заведена мембраной ¡благоприятных воздействий окрукаидей среди. В то же время

глотка является термодинамически открытой системой, нувдаздей-ся в постоянном потоке энергии, веществ и информации. Связь югетяя с округаицой средой такие осуществляется через мембрану, благодаря строго согласованной работе различных механизмов -репзптороз, фер:гентпкх комплексов, транепортннх и рогуляторных ст.'стсм, располсженЕЦЕ на ме«5ране. Изучение этих систем является ож»м вз ваакейшх задач бпсфгаавд, э удобиял во йногях отношениях объектом ксателсгаккй явюзлся бактераа, обладштшо гагата разнообразимая мещЗраиннки систекзш.

Процесс жизнедеятельности любого оргашзма нежсдкм без потребления и быделения энергии. Б превращениях осмотической и электрической энергии ванную роль играют биологические мембрана. Центральной проблемой биоэнергетики на протянешги полувека было выяснение кехакззма, с помощью которого энергия, высвобождаемая при окислении субстратов шш при поглощении свота используется для катализа энергозависимых процессов, таких как синтез АТР, перенос ионов к других зггзненно важных веществ через мембрану против градиентов их концентраций, подвижность и т.д. (Кагала, 1985; Николе, 1985; iiaaanoto, Kagawa, 1985; на-гоы, Kaicinyna, IS86; Hoefner, 1882). Четверть века назад Митчеллом (iiitchaii, 1961; 1966) была сформулирована а получвяа экспериментальное обоснование хемиосмотическая теорля, довольно успеино ошсквакцая процессы трансформация экергнн з сопря-гаэдях мембранах. Согласно этой теории исходным электрохимическим процессом является перенос протонов через мекбрану п создание разности электрохимических потенциалов по ионам if1".

В кизнедеятельности бактерий большую роль играют попы К+, которые накапливается клетками против градиента, в концентрациях на несколько порядков цреЕышазздях содерзание этого лона з окружающей среде (christian, waitho, 1962; schuits, soicmon, 1961; v/aiderhaug ot ai., 1987). K+ служит клеткам для поддержания тургоряого давления, актпвацзд внутриклеточных ферментов, для поддержания клеточного ¡51, стимуляции транспорта, роста бактерий, а такяе для хранения резервных форл энергии и других

фунКЩЙ (Epstein, Schultz, 1965, 1968; Skulachev, I978;Helraer, 1982; Drachev ot ai., 1985; waidorhaug et ai., 1987). С развитием биотехнологии важное значение приобретают сообщения о значительной роли и довольно узких пределах оптимальных концентраций ионов К+ в ферментационных средах для увеличения продуктивности птаимов-продуцентов аминокислот (Хачатрян и др., 1986). В настоящий момэнт генетически идентифицированы две системы, осуществляющие противоградаентоное поглощение К+ у е. coli (zarien-go, .Schultz, 1966; Rhoads, Ebstein, 1977) и у ряда других бактерий (Kakinuiia, Harold, 1985).

Уже свыше десяти лет рядом авторов у нас в стране и за рубежом на митохондриях (Красинская и др., 1984: Марианский и др. I9S4; йгужинский, Красинская, 1987; Krasinskaya et ai., 1984; Plotrobon ot al., 1983; Slater et al., 1985; Herweijer ot al., 1986) И бактериях (Vonturolli, Holandri, 1982; Sourd, Наг tiro-30V, 1983; Kitchcns, Koll, 1983; Elferink at al., 1984) показа-HO, что многие экспериментальные факты удобнее объяснить с помощью идея прямого взаимодействия мзжду злектроктранспорткой целью и другими траксгюрти&а: скстамаш. ЯгухннекиЁ с соавторами! (Краонвская и др., 1984; firy/лиский, Красинская, 1337; Krasinskaya. et ai., 1964) щшкн к выводу о возюеностя как црямо-го, sait я косвзхшого вза:-.:,:одействия ыезду дыхательной допьо и АТР-сиатетазой у штохойдр!гй в зависк-гостн от у слоек", окррзаэ-средн.-

С яругой cvopoUapxspocojs?.: а Трчуняаэм (Мартаросоэ, Х9В5; Hartirosov, rrchounian, IS8S) было показано, что з аэроб-изх условиях й^'-АТРаза к К+-иоксфор Trk у s.ccii взаимодействуют косвенно, тогда как црп анаэробном выращивании единственным объяснением н&бдвдаемых явлений кохет служить только прямое взаимодействие этих систем и объединение их н супэркомхибксы Шартиросов, 1985; Bourd, îfcrtiro3ov, 1983; Martirosov, Trchou-niari, 1983, 1986). Было выдвинуто предположение о том, что в мембранах дагащих бактерий, способных синтезировать АТР с помогло окислитального фо сформирования, такого рода суперкомплексы не формируются. Однако, экспериментов на аэробах, демонстрирующих правильность этого предположечкя, не было проведено.

Кроме того, накопилось много данных о роли мембранного по-тешдааяа в передаче информации ц регуляция хемотаксиса у под-

ВИШШХ МИКрооргаНИЗМСВ (вгтоХспап, ЛШог, 1976; ¿ХкопЬасЬ, 1982, 19БЬ). . -

Поэтому, представляется актуальным изучение аэробных и ке-пэдвияных бактерий, таксономкчески далеко отстоящих от ранее кссяедованннх микроорганизмов. Таким объектом были выбраны грампололательные бактераи Врв»«ьаоьогЬач Патов , имеющие широкое применение з биотехиологш, но плохо изученные с точки зрения бясфхзияи.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работа явилось изучение характера взаимодействия дцхаталъпой езтп, Н+-АТРазкого комплекса и система, транспортирующей ионы К* у Вт.гхауии. Основные задачи зазлвчалясь в слэдущем:

1. Определить потоки иовов, отззтетвонпых за изменения мембранного потенциала и тип электрического ответа при апплика-щи сахароз.

2. Установить роль изивиенай мембранного потенщала во взаимодействии систем, продуцярущах и потребляюсь энергию.

3. Установить тзп системы, транспортирующей иони 1Г\

4. Раскрыть щшщап взаимодействия систем переноса ионов у агроЗов.

Научная Еозизяа работы. В результате проведанных иссле-доаанай впергыо показано наличие резких, краткозреглеянкх изме-нбегй кайраняого потенддши у Вг.латоа пси аппликации утилизируемых Сахаров и определены иоен, ответственна за возникновение этих изменений ¿л^. ВпорЕыо показано, что начало функционирования дахательной дета несколько оперегает работу К+-АТР-азн, а резкая гяперполярязащя мембраны вследсизе начального быстрого выброса Н+через дыхатадьнуэ день, возможно, олухи? сигналом для перестройка фактора ^ АТРазного нокплекса в АТР-спнтотазнуа конформаврю. Описена ^-транспортирующая система а мембране вг.Латся , характеристики которой близка к таковкм, известны?? для тгк системы Е.ооН .

Практическое значение работа. Полученные данные о регуляции работы Н+-ЛТР~синтотазы V с помощью кратковременных изменений лгр- углубляют существуете продегазяеягя о природо взаимодействия мембранных злоктроЕтранспортных систем и АТР-синтвзирушцгх комплексов. Проведение исследования представляют дополнительный кагоргал для боле о шрокого пониматгя а об-

суждения возможных вариантов взаимодействуя одних и тех же мембранных систем в зависимости от аэробных ели анаэробных условий жизнедеятельности микроорганизмов.

Результаты исследований о быстром зачислении среды щи аппликации незначительных концентраций утилизируемых Сахаров (А. с. № 1341190) важны дяя ускорения и удешевления выбора оптимальных питательных сред культивирования микроорганизмов и могут быть применены в биотехнологии.

Апробация работы. Основной материал диссертационной работы обсуждался на научных семинарах лаборатории физиологии и биохимии макроорганизмов НИШ аминокислот (Ереван) и кафедры биофизики биологического факультета Ереванского госуккверситега.

Результаты работы доложены на Ш Советско-Шведском симпозиуме то физико-химической биологии (Тбилиси, 1981), на Ш Республиканской научной сессот по вопросам биоЗдзшш (Ереван,1982), на II Республиканской конференции, посвященной проблемам фгзкко-хшлческой бкологаи (Ереван, 1986), на П Всзсоюзной кок$еракгеш молодух ученых "Современные проблем! биотехнологии микроорганизмов" (Рига. 1987), на научной конференции молодах ученых, посвященной 70-летию Великой Октябрьской социалистической революции (Ереван, 1987).

Публикаций. По результатам исследований опубликованы 16 работ.

Объем работы. Диссертационная работа изложена на 142 страницах машинописного текста и содержит 7 таблиц и 29 рисунков. Библиография включает 204 наименования литературных источников, в том числе 159 на иностранном языке.

Содержание работы. Работа состоит из введения, четырех глав: 1 - обзор литературы, П - материалы и методы исследований, Ш - результаты исследований, ТУ - обсуждений результатов, выводов а списка использованной литературы.

МАТГОШЫ К ЖТОДУ ИССЩД0БА1МЙ

Бактерии. Исследования проводили на грамполокительяых, неподвижных аэробних бактериях вгоуШюигХша Патеа. штамм АТСС ИиС7 и Согупвьаоъег1ии siufco.Tu.oun АТСС 13032, грамположитслъ-ннх облигатно анаэробных вегеръоеосеиа £»ооа11а ШИ В-602, а токло гра'лотркцательных факультативно анаэробных взсиегХсМа

coli K-I2 (*).

Культивирование бактерий я подготовка их д эксперименту. Бактерии вырадавали в заранее автонлавироЕанном шгсо-поптонном бульоне, содержащем: I % пептона, 0,5 % шсх, I % (сухой остаток) мясную воду, pH 7,3-7,5. Br.flavura И C.glutamicun внраща-вада при хорошей аэрации на качалка в.егоип (ФРГ) до ранней стационарной фазы (18-20 ч) щзя 30°С, a s.raecaii3 и в.coli des аэрадал при температура 37°С.

Бактерии отмывали центрифугированием и переносили в экспериментальный раствор, содержащий ксх от 0 до 50,0 Ш, HaCi 1,0 ti/l, Hgso^ 1,0 .'AI, трас qt 5,0 ьИ до 50,0 tili, н^ро^ от 5,0 до 20,0 мМ. Сахара и другие реактива добавляет в раствор в тачание эксперимента. Изменения pH среда от 5,0 до 9,0 производили так, чтобы сохранить буферную емкость раствора неизменной.

Количество бактерий в единице объема (титр)' определяла высевом бактерий на твердае питательные среды с последующим подсчетом колоний.

Размера бактерий измеряли с помощью фаз обо-кострастного ки!фоскопа с окуляр-мшфометром. За внутриклеточный свобрдный объем вода брали 70 % полученногб объема, что было получало пря определении разности сухого и мокрого весов бактерий.

Изучение транспорта ионов с присед иовселективных электродов. Транспорт ионов через бактериальную мембрану изучали потенцисметрическим методом, определяя изменение их активности в среде с помощью стеклянных яатионселективнкх электродов, чувствительных к К+ и И"1" (Никольский, Матероза, I960; Arnold, ?о-dersen, 1984).

Для всего диапозона измерений pH среда, калибровкой в экспериментальном растворе титрованием соляной кислотой по 0,2 гМ определяли количество транспортируемых ионов Н+. Изменения активности ионов К+ в среде оценивали по стандартной калибровочной кривой и по уравнению Никольского.

Кинетические параметры транспорта ионов (К^ и опре-

деляет по методу Нейнуаввра-Бзрка.

Внутриклеточную концеятрацяэ ионов К* оценивал! по количеству К1", вытекавдего из клеток, обработанных толуолом (Eisea-stadt, 1972).

Величины и ДЩ рассчитывали по распределении TS®+ и

салнщловой кислоты мевду клеткой и средой, определяемому по-тенциометрически с помощью мембранных селективных электродов, изготовлвНЕКх вод руководством проф. Л.Л.Гринюса (Вильнюсский госунзверситет). Т®+ и салициловую кислоту вводили в экспериментальный раствор в концентрациях 1,0 мкМ и 60,0 ьсйМ соответственно (Гранюс, 1986; Ооашга а1., 1985).

Интенсивность дыхания бактерий измеряли на полярографе РА-2 (ЧССР) с помощьа закрытого тефлоновой пленкой платинового электрода «Зранк и др., 1973).

Влияний различных ингибиторов на транспорт глюкозы в бактериальные клетка исследовали внесением 14С-глт}ЗЦ~в~необхода-ж'цх добавок в суеггаязиа. Через Ю-секундние интервалы отбирата пробы объемом 0,2 мл, наносили на фильтра из стекловолокна (тдциасал ор/в) и яемздяенно промывали 10 мл фосфатного буфера. Радиоактивность высушенных фильтров измеряли в стандартном то-луольном сдактилдяторе, используя гшдкостко-сщитилляцаонпый спектрометр кагк-з (ОШ/О.

ИШШШ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСГДДЗИЕ.

Потока коков и измензяия ^"Ф" у Вг.гаауцт при аппликации са^аров. Исследования последнего десятилетия показали, что га-перполяризаг^опкие изменения мембранного потенциала бактерий Е.соИ при - появлений в среде галактозы служат сигналом д ля хемотаксиса ж начала движения в направлении аттрактанта (дааег еъ а1., 1979; Е1зепЬаоЬ, 1382,1983).

Однако, нажн эксперименты показали, что характер изменений

у неподншшых бактерий Вг.пауии при добавлении глвхозы (рзс.1; ягчс:л не отличаются от таковых, полученных другими авторам для подаааЕЦк бактерий. Бнло также показано, что-с увеличением концентрации добавляемой глюкозы меняются величина и характер лшердойяризацноишх ответов. Величина гяперпогщраза-ЕЗй при добавлении возрастащих концентраций глюкозы сначала стабилизируется, а щгл превышении концентрации глвкозы 0,5 появляется новая .фаза гапэрподяргвацйи. длящаяся тем дольше, чэм больше кояценгращш добавляемой глюкозы (рис.2, Ш фаза).

Увеличение гнпорполяразащошшх ответов щи повышении концентрации гдвйозы, вероятно, можно объяснить тем, что при низках концевтращях сахара вкяотгдатся не все электрогенераторы и.

145

140

1- Н

15

18 21 24 Бремя (мин)

Д\|'

«К*-'

50 шИ Н+ и К'

Рис.1. Изменения мембранного клеток Вр.гхатшд при аппли-кацпи глюкозы (Г; ОД Ш). Клетки з начальной стационарной фазе росга (18-20 ч) отмыты в дистиллированной воде и перенесены в экспериментальный раствор при 30°С и рН 7,3. Добавка гдэ-козы проведена после установления стационарного значения д-^ на 15 ия эксперимента.

Рас.2. Изменения штоков конов Н* и К* и гикерпо-лярпзация мембраны Ег. Патют при апшшкацан глюкозы (Г; 5,0 Исходный уровень Д^ составлял -145 кВ. Условия эксперимента те же, что на рис.1.

I П Ш фазы

_I

по маре.увеличения концентрации глюкозы, число "работающих" генераторов растет и наблюдается суммарный эффект.

Эксперименты показали, что в период быстрой гиперполяризации мембраны наблюдается резкий выброс ионов Н+ из клеток и поглощение ионов К+ (рпс.2). Кинетика потоков этих ионов такие меняется с увеличением концентрации глюкозы. Появление длительной гиперполярлзацки сопровождается изменениями скорости секреций Н+ и медленным накоплением К+ (рис.2).

Пр^ изучении влияния различных Сахаров на изменения л^ было получено, что глюкоза, фруктоза и сахароза вызывают гкпэр-поляризацни мембрана а такяе выброс Н+ и поглощение К1", а ман-нит, фукоза, сорбит, даже при стократном увеличении концентрации по сравнении с предыдущими сахараш, не приводят к изменениям л4> и потопов И+ и К+. При проверке оказалось, что первые сахара являются утилизируемыми для вг.пауия и с.£1^а:."Лсии, а остальные - нет. Это означает, что гиперподяризацая и резкие потока ионов Н+ и К+ возникают только в присутствии утилизируемых Сахаров, что подтвердилось при добавлении в среду неути-лиэируемого аналога глюкозы с^-метилгликолиранозида, не приведшего к изменениям Д'ф.

Для выяснения роля исходного значения дф на появление гаперпаляризадаонннх огзотов и их амплитуду, различными способа1® изменяла валичияу мембранного потенциала: ¡А"ф"| увеличивался'либо при увеличении рй среды, либо при уменьшении концентрации ионов К+ в среде. При одинаковых добавках глюкозы з этих условиях а-яхгштуда гиперпояяризагвз увеличивалась с уманьшакиегл |д\|'| (рпс.З), но при этом секреция Н+ оставалась неизменной.

Стехиометрия Н+Д+ обмена при возвикновэшш гиперполяриза-цая (в течение I фазы) близка к 1:1. Более того, это соотношение оказалось почти независимом от рй среда и концентрации вводимой в суспеязиш бактерий глюкозы. Такое соотношение говорит об электронейтральном обмене конов. Но эксперименты в отсутствие ионов К+ в среда показали, что независимо от этого апплякавдя глюкозы приводит к резкому выбросу Н+ к быстрой гап&ряоляриза1ещ мембраны. Следовательно, в ответ на аппликацию глюкозы из клеток (возможно, через дыхательную цепь) выбрасывается порция протонов, приводящая к гиперподярззацаи меибраны и только после этого ионы поступают в клетки в результате генеращш допелк?.-

SO-1 Г

Рпс.З. Изменения величины у Вг.Пашп при (1;0) изменении концентрации К1" в среда и постоянном ]й=7,3 и (2; А) изменении рН среда и постоянной концентрации [к+]0=1,0 Ш. Для некоторой точек показаны амплитуда гиперполяризации при добавлении 0,4 Ш глюкозы.

8 10 [к+]0,иМ

9 рй0

I

fh

ri

lb

Рис.4. Изменение величины [д^ при добавлении ШКД у бактерий: I - Er.fl3.vun

2 - Br.flavun в при-

сутствии ксн

3 - Escherichia coli

4 - S.faecalis Эксперимента на Br.fiavua и в. coil проведены без экзогенного источника энергии, а на s.faecaiia в присутствии глюкозы.

□ - величина Д^ в отсутствие ЯДКД. Щ - величина Д']г при добавлении дцкд.

о

тельного Лт|г, обеспечивая электронейтральность процесса.

Б отличие от Br.flavum, бактерии s.faecaii3 не способны к устойчивой генерации Д"^ без экзогенного источника энергии. Только после добавления в среду глюкозы достигает своего максимального уровня (140 МВ) и держится до полного истощения глюкозы в среде. Измерения мембранного потенциала при изменении температуры почти на 20°С показали, что величина |д*И в присутствии глюкозы практически остается неизменной. •

Измерения дрН у fc.fiavum при добавлении Сахаров показали, что в период гиперполяризации внутриклеточный рй и, следовательно, ДрН не претерпевают резких изменений. Измерения ДрН цра различных |й среда позволили установить, что внутриклеточный рй у этих бактерий, так жэ как.и Др, неустойчив, др меняется от -188 I® до -155 мВ в зависимости от рН среда в измеренных пределах от jS 5,2 до J0 7,8 соответственно.

Все эффекты> наблюдаемые у Br.navua, были обнаружены к у бактерий C.glutamicum.

Механизм генерации пшешолярязакионянх изкеневий мембранного потенпяала у Br.fiavum при аппликации утилизируемых Сахаров, Айзенбах (Eisenbaoh, 1983; Eisenbaoh ot ai., 1983) предполагает, что работающие дахательная цепь и Н^-АТРаза создаст высокий тем самым "маскируют" гииерполяразащт мембраны у E.coii щи добавлении аттракгантов.

Б наших экспериментах, как yse было сказано, высокий (Д-^! такге затрудняет регистрирование гилерподярязащи'(рис.3), однако резкий выброс Н+ при добавлении глюкозы остается неизменные, что могет свидетельствовать о том, что механизм генерации дополнительного Д^ не изменяется. Увеличения мембранного потенциала дышащих бактерий можно достигнуть и добавлением ингибитора Н^-АТРазного комплекса ДЦКД (дащклогексшгкарбодашмид). Этот эффект хорошо~объясняется в рамках хемиосмотической теории: в сопрягающих мембранах при аэробиозе АТРаза работает в режиме синтеза АТР, создавая ток протонов из среды в клетку, тем самым электрически шунтируя дыхательную цепь. Подавляя работу АТРазн с помощью ДЦКД, снимаем электрический шунт, что приводит к увеличению Ia^I , генерируемого дыхательной цепью (рис.4, кр.1). У анаэробных S.faecalis , так же как у E.coii в анаэробных условиях, ДПКЛ сникает , так как Н^-АТРаза, ра-

ботаащая в реяима гидролиза АТР в этих условиях является основном генератором лл|г (рис.4, кр. 3 и 4). Снижения |ai|í| у аэробов щи добавлении ДШЩ можно достигнуть при совместном действии этого ингибитора .и kcíí, блокирующего дыхание (рис.4, кр.2). Но надо отметить, что двке при ингибированяи этих двух генераторов др, полного подавления Лх|г не наблюдается, что совпадает с наблюдениями Айзенбаха fesonbach, 1383).

Добавление гликозы в присутствии ДОКД не приводит к заметным гзперполяризационным изменениям л\[г у Er.fiavun, в то же время не меняется скорость начального быстрого выброса Н+, однако, исчезают П и Ш-фазн (ркс.2) на кинетической кривой секре-цзи этого иона. Это означает, что электрогенератор, гиперполя-ризующий мембрану, работает с презней активностью, но на фоне очень высокого | (л175 г/В) изменения мембранного потенциала незаметны. Наличие перегибов на кривой секреции Н+ при добавлении глюкозы можно объяснить тем, что часть выбрасываемого из клеток протонов возвращается через fqp1 внутрь бактерий, а блокирование этой системы, естественно, приводят к сглаяиванию пэ-р5Х*збоз. Но наличие перегкбоз означает и некоторую задержку качала функционирования К^-АТРазы, т.к. если бы изначально потока Н* из клеток и обратно з клетки была уравновешена, то гакакях перегзбоз нэ наблюдалось бы.

Добавление глюкозы в присутствии кск танко не приводит к появзензэ гяцерсолярязацаи мембраны Er.iiavm, хотя |дг|х( уке невысок (105 мЗ). Не наблюдается такзг.э резкого начального выброса Н+. Это уяе может говорить о том, что именно дыхательная цепь ответственна за резкую гипарполяркзас&э мембраны.

Измерения поглощения кислорода этими бактериями выявили быстрое усиление потребления О2 в момент добавления глккозы к суспензии, а затем возвращение на праш® скорость по мере истощения глюкозы из среды. Эти данные подтверждав? мысль о том, что кмепно через дыхательную цепь происходят резкий выброс Н+ при добавлении глюкозы, что приводит к быстрой гиперполяризадаи пембраны.

Гиперполяриз ация мембраны ко наблюдалась такке в присут-стези !< -отилм&юимида (hhí) и Кар. Но если в присутствии ней глзкоза просто не транспортировалась в клетки, то в црисутствии КаР она почти беспрепятственно переносилась в клетки. Как из-

вестно Кар иягибирует гликолиз. Можно цредполоаить, что гяпер-поляризавдя возникает не в момент переноса глюкозы через мембрану, а какие-то метатяити, образованные в цроцессе ее катаболизма способствуют этому.

Транспорт ионов К* у Вг.пауцд. Было показано, что кинетика поглощения ионов К+ бактериями Вг.па-та при добавлении глюкозы хорошо согласуется с изменениями (рис.2): увеличение приводит к поглощению К+, уменьшение - к вытеканию. . Можно предположить, что движущей силой переноса К+ в эти клетки служит мембранный потенциал. И действительно, было показано, что калиевый равновесный потенциал и величина измеренного Д^ совпадают (табл.). Эти данные говорят о том, что ионы К* у аз-

Таблица

Распределение ионов К* между клеткой и средой, калиевый равновесный потенциал (%+) и д^ у вг.Патляа в средах с различным содержанием К* в отсутствие глюкозы.

Ск+]о и [к4"]^ - нарукняя и внутриклеточная концентрации К4", определяли по уравнению Нернста.

[к+]0, т [K+]in, ш Mla/^O 1® дг|/", кВ

0,46 ± 0,00 0,81 ± 0,01 1,91 * 0,01 9.67 ± 0,03' 208 ± 23 229 ± 28 255 ± 32 592 ± 48 452 ± 36 283 ± 20 133 ± 22 ' 61 ± 12 160 ± 4 147 ±6 128 ± 6 107 ± 5 155 ± 8 145 ± 8 133 ± 4 117 ± 6

робннх Bf. na wen распределяются пассивно то градиенту электрического поля между клеткой и средой. Это предположение подтверждается и в эксперименте с добавлением карбокилцианид-п-хлор-фенилгаготзока (КХФГ), приводящего к уменьшению |д\|/|и соответствующему вытеканию ионов К1" из клеток.

Коэффициент Вант-Гофа q10, определенный нами для первой фазы поглощения К* (рис.2), оказался равным 1,3, что почти совпадает с таким коэффициентом для физической диффузии, а это говорит о ионофоретическсм накоплении ионов К+ этиш бактериям:;. Значения \ = 2,3 Ш и = 0,2 иМ/г.шн оказались близкими к характеристикам тгк-системы е. coli, представляющей собой К*-

ионофор (Heiner et al., 1982; Rhoads, ijpatöin, 1977).

Предполагается, что для тгк системы движущей силой является а\|/ , но необходимо также присутствие АТР, возможно в роли регулятора (Bakker, Harold, 1980; Stewart et al., 1985; Walderhaus ot ai., 1987). Надо предположить, что у Br.fiavum имеет место такая же зависимость систегш переноса ионов К4" от дЦ'" и АТР. Каким бы способом мы не исключали способность клеток регенерировать АТР (будь то КХФГ, ДЦКД или арсенат), наблюдали ин-гибирование поглощения К+. Нельзя предположить, что потеря активности К+ транспортирующей систеш отражает побочные эффекты ингибиторов АТР, т.к. они различны по структуре и механизмам действия.

В работе такие предложена электрическая схема, эквивалентная электрогенным системам мембраны Br.fiavura, на основании которого детально обсуздэдтся наблюдаемые эффекты и возможные варианты взаимодействия транспортных систем в мембране.

ВЫВОДЫ

Исследовались электрохимические характеристики мембраны и особенности функционирования электрогвнннх систем у аэробных Brevibactorlum flavurn с целью установления механизма прямого или косвенного взаимодействия систем в сопрягающих мембранах.

1. Величина мембранного потенциала (Д"^) у Br.riavun в отсутствие экзогенного источника энергии увеличивается от |-9б| мВ до |-172| мВ при изменении pH среда от 5,2 до 9,0 и уменьшается от (-1681 мВ до {—1001 '«В при увеличении концентрации ионов К+ в среде от 0 до 50,0 гМ. В то яэ время величина Д\|>" у этих бактерий остается практически неизменным (как и у анаэробных streptococcus faecaüa ) при понижении температуры среда. Про-тондвижущая сила Др у Br:fiavun зависит от pH среда и в измеренных пределах изменяется от -188 г,© при pH 5,2 до -155 мВ при pH 7,8.

2. Несмотря на высокое значение исходного Д*^ j—Х50{ глВ, поступление утилизируемого сахара внутрь клеток ш-.fiavun приводит к заметной гиперполяразациа мембраны, связанной с выбросом Н+ через дыхательную цепь. Амплитуда гнперполяризацет растет с увеличением концентрации глюкозы от 0,01 до 0,5 М. При более высоки концентрациях глюкозы амплитуда начальной гипер-

поляризации уже не изменяется, но вслед за ней появляется длительная и меньшая по сравнению с начальной гиперполяризащя мембраны, поддерживаемая до исчерпания глюкозы в среде.

3. Выдвигаемый рядом авторов вывод о том, что гиперполяри-запия мембраны, возникавшая в присутствии аттрактантов способствует хемотаксису подзияных бактерий, следует принимать с осторожностью, т.к. абсолютно идентичные временные характеристика мембранного потенциала наблюдаются на неподвижных бактериях, вг.

fiavu®.

4. В присутствии ы, м,~дациклэгексилкарбодашшда ЩВД) исходный ¡A-yj у Bi-.fiavm заметно возрастает. При последующем введении утилизируемого сахара выброс Н+ через дцхательяую цеш, сохраняется, однако резкая гиперполяризация и изменения скорости секреции Н4" отсутствуют. Сопоставление характера выброса Н+ И уменьшение гяперпаяяризацип в присутствии утилизируемых Сахаров показывают, что вкяззченно АТР-синтетазы происходит, по-видалому, с опозданием в несколько секунд по сравнению с дыхательной цепью.

5. Определены следующие кинетические характеристики К+-транснорхирувдей системы у вг.iiavuri: Кщ = 2,3 î.î,l, чрлх =0,2 Ш/г.шн, коэффлцзент Вант-Гофа Q10 = 1,3. Калиевый равновесный потенщал (-160 мЗ) соответствует измеренной величине мембранного потендаала (-155 мЗ). В присутствии карбокилцканид-п-хлорфзнилглдразоиа (КХФГ) ионы 1С*" покидают клетку. Эти данные указывают на пассивное распределённе К+ по градиенту электрического поля между клеткой и средой. Поглощение К+ подавлязтся при добавлении ДЦКД, увеличивающего (a^I • А в присутствии ар-сената натрия блокируется вход К+ в клетки на 80-30$, хотя величина А^ не изменяется, а амплитуда гиперпозгяразацял при добавлении глюкозы дана увеличивается. Предполагается, что Вт. flavua поглощает К* через тгкгподобную систему, где ДЕзаущей силой сяукит л4^ , а>АТР, возможно, нужен в качестве модулятора транспорта.

6. Полученные результаты и теоретический анализ показывают, что в аэробных бактериях, в отличие от анаэробных клеток, электрогенные транспортные системы мембраны взаимодействуют мевду собой, по-вщдаому, косвенно через Ар.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

X. iiarfcirosov S.M., Petrosian L.S., Trchounian A.A., Vardanian

A.G. An. alootroohemical study of energy-dependent potassium accumulation in E.coli: VIII. Membrana potential (In comparison Kith that of Streptococcus faecalis) // Bioelectrochem. Bioenerg, - 19Ö1.- Vol. 8. - p. 613-620.

2. Martirosov S.H., Trchounian A.A., Durgarian S.S., Petrosian L.S., Vardanian A.G. Transport of H+ and K+ in bacteria and intramembrane interaction of transport systems for joint ом-ploynent of converted energy. // Abstracts of USSH-Swedon III Symposium on physico-chemical biology, Tbilisi.- 198l.-p.102-103.

3. Варданян А.Г. Измерение мембранного потенциала у некоторых микроорганизмов.// Тезисы докладов Ш Республиканской научной сессии по вопросам биофизики, Ереван, 1982.- С. 41.

4. Мартиросов С.ГЛ., Варданян А.Г., Петросян Л.С. Ионообменное отношение и мембранный потенциал у бактерий s.faecaHa//Биофизика. - 1982. - Т. 27. - С. 467-463.

5. !,5артиросов С.М., Дургарял С.С., Варданян А.Г., Оганесян М.л. Способ определения утклязируемости Сахаров микроорганизма«:! //A.c. "з 13Ш90.

6. .Варданян А .Г. Физиологическая фузкдая гнперполярпзапдя бранн азроб!Гг;:- бактяр-й при елгкпкагот сахароз //Тезг.он до. -ладов П Республиканской ;-:с:фзронскз, посвяпвшюЯ проблеял фгзидо-ЗпютесксЙ блологпз, Бравая, 1986. - С. 117. .

7. Варданян А.Г., Оганесян М.И., Дургарьян С.С. Особенности переноса ионов катя у азробнкх бактерий //Гез^сл докладов П Республиканской конференции, посвященной проблемам пизико-химической биологии, Ереван, IS86. - С. 32.

8. Варданян А.Г., Мартиросов С.М. Ионный обмен и гиперполяризация мембраны Brevibacterium fiüvum при аппликации метаболи-^iipyej.sx Сахаров. // Биофизика. - 1986. - Т.31. - С.833-837.

9. Варданян А.Г., Гончегулян А.Е., Петросян П.К., Мартиросов С. М. Механизм быстрой гаперполяризации У Brevibacteriura flavuoi // Биофизика. - 1986. - Т. 31. - С. 993-996.

10. Трчунян A.A.; Дургарьян С.С.., Огандаанян Е.С. Тер-Никогосяя

B.А., Варданян А.Г. и др. Исследование способности анаэробно

выращенных бактерий обменивать 2Е+ кяатки па К+ среды и поддерживать высокое распределение К+ мекду клеткой к средой. //Биологические науки. - 1986. - Г* 12 (276).- С. 82-88.

П. Варданян А.Г., Дургарьян С.С., Оганесян М.И. дх^-зависикцй перенос ионов калия у Brevibactorium x'iavum // Биолог,к,Армении. - 1337. - Т. 40. -С. 209-213.

12. Варданян А.Г. Кратковременные пз*швная меао'рааного потен-Фшс. и перекос конов кайся у аэрсбяах оактордк в прлсутст-нш Сахаров // Тззься докладов U Республиканской шкдаж-кэЗ конфэрешгш по фшиш-хаической биахотт, Еоогязеикац ТСКютя» Великого Октября» Ереван, IS87. - С. 12.

13. Варданян АЛ1,, Трчупян Л.А. Мембранный потенциал и транспорт ионов у бактерий /У Тезисы докладов П Всесоюзной конференции молода учешпс "Соврой&ккыо проблша биотехнология микроорганизмов", Рига, ISB7. - С. 103.

14. Vardanian A.G. A raodol for regulation of II+-AT?ase functioning in aerobical bacteria by membrane hyperpolarization caused by redox chain activation when utiliaablo sugars applied // Abstracta of IX International symposium on BiooleStroche-nistry and bioonergetics, Szeged, Hungary, 1987. - P. 64.

15. Варданян А.Г. Знеркгзация иегабраги Brovibaeteriurc flavua // Труды У Всесоюзной межуниверситетской конференции "Езо-логкя клетка", Тбилиси, 1387, ~ С. 28-29.

16. Vardanian A.G. A model for regulation of E+-A2Pasa function J.n asrobical bacteria by noisbrane hyporpolar-ization caused by rodox chain activation when utilisablo sugars applied // Bioeloctrochom.Bicencrg. - 1936. - V, 19. -