Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансформация оксианионов теллура фосфатаккумулирующей бактерией Acinetobacter calcoaceticus

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Трансформация оксианионов теллура фосфатаккумулирующей бактерией Acinetobacter calcoaceticus"

На правах рукописи

СОЛОМЕННЫЙ Александр Петрович

ТРАНСФОРМАЦИЯ ОКСИАНИОНОВ ТЕЛЛУРА ФОСФАТАККУМУЛИРУЮЩЕЙ БАКТЕРИЕЙ АсиШоЬаМег са1соасеИст

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 1998

Работа выполнена в Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, г. Пермь

Научный руководитель:

доктор биологических наук, А.И.Саралов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук О.Н.Октябрьский, доктор биологических наук В.Г.Ремеппиков

Ведущая организация - НИИ микробиологии Министерства Обороны РФ, г. Киров

Защита состоится «30 " октября 1998 г., в -/о часов на заседании диссертационного совета К 200.46.01 Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г.Пермь, ул. Голева, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан -¿Г« сентября 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, У / Л старший научный сотрудник СА^у——

И.Б.Ившина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время значительно повысился интерес к исследованиям экологического, эпидемиологического и биотехнологического значения бактерий рода Acinetobacter. Некоторые представители Acinetobacter являются инфекционными агентами человека и животных, причем большинство изученных штаммов очень быстро приобретают устойчивость к действию известных антибиотиков (Perez-Ramos et al., 1994), Показано, что данные бактерии способны населять чрезвычайно загрязненные местообитания, например, участвовать в формировании активного ила биологических очистных сооружений (Васильев, Вавилин, 1992, Harold, 1966; Deinema et al., 1980; Amann et al., 1995). Ацинетобакте-рии уже используются в биотехнологических схемах удаления из сточных вод соединений фосфора и тяжелых металлов (Levin et al., 1972; Comeau, 1990). На основе лиофилизированных культур штаммов-деструкторов созданы коммерческие препараты, в частности «Экойл», для очистки нефте-загрязненных вод и пота. В перспективе предлагается применить некоторые штаммы Acinetobacter spp. для промышленного синтеза полисахаридов (Navonvenezia et al., 1995). За период с 1994 года уже проведены три международных симпозиума по биологии ацинетобактерий. Констатировано, что на сегодняшний день имеется ограниченное число данных относительно физиологических и биохимических особенностей этих бактерий, которые позволяют им осваивать разнообразные экологические ниши. Практически отсутствуют сведения о воздействии на ацинетобактерии высокотоксичных неорганических ионов, интенсивно выделяющихся в окружающую среду в результате производственной деятельности и геохимических процессов.

Целью настоящего исследования было изучение явлений, происходящих при трансформации оксианионов теллура фосфатаккумулирующей бактерией Acinetobacter calcoaceticus.

Основные задачи работы состояли в следующем:

1. Оценить активность накопительных культур, выделенных из различных образцов природных и сточных вод Пермского промышленного узла, по отношению к оксианионам теллура.

2. Изучить особенности поглощения, восстановления и аккумуляции теллурит-анионов бактериями штамма дикого типа Acinetobacter calcoaceticus IEGM 549 в аэробных условиях при различных режимах культивирования.

3. Исследовать биохимический механизм восстановления теллурит-анионов клетками А. calcoaceticus LEGM 549.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые показано, что грам-отрицательные б актер mi A. calcoaceticus (штаммы IEGM 549 и IEGM ВТ 548) обладают способностью осуществлять восстановление оксианионов теллура в аэробных условиях. Определены основные

параметры поглощения теллурита бактериальной культурой А.са1соасеНси$ ПЮМ 549 и выявлены условия, при которых происходит наиболее активное удаление клетками бактерии токсичных ионов из среды. Выявлен вероятный биохимический механизм внутриклеточного восстановления теллурита клетками А. са1соасеИсш ПЮМ 549.

Данный штамм может служить основой для последующего генетического конструирования штаммов с улучшенными характеристиками. Штамм А.са1соасеИсиз ПЮМ 549 перспективен для прогрессивной биотехнологической схемы совместного удаления из городских и промышленных сточных вод теллурит- и фосфат-ионов.

Основные положения, вьшосымые на защиту.

1. Природные штаммы А.сакоасеИсш, населяющие водные экосистемы с высоким содержанием органических веществ, фосфора и металлов, обладают способностью эффективно поглощать и восстанавливать токсичные теллурит- и теллурат-ашюны с накоплением преимущественно внутриклеточного элементного теллура (Те0) при гетеротрофном типе обмена в аэробных условиях.

2. Оксианионы теллура проникают в клетки А.сакоасеНсиз ПЮМ 549, конкурируя с ортофосфат-анионами. Наиболее высокая скорость поглощения теллурит-оксианионов отмечается у культуры А.са1соасеНсик ПЮМ 549 во второй половине логарифмической фазы ускоренного роста; стационарная культура, накапливающая внутриклеточные полифосфаты, утрачивает способность поглощать теллурит-ионы из среды.

3. У А.сакоасеПсш ПЮМ 549 в детоксикации оксианионов теллура важная роль принадлежит внутриклеточному глутатиону и другим низкомолекулярным тиолам, которые восстанавливают их в основном до элементного теллура (Те0).

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на конференциях молодых ученых Института экологии растений и животных УрО РАН (Екатеринбург, 1996; Екатеринбург, 1998), Международной конференции «Перспективы развития естественных наук на Западном Урале» (Пермь, 1996), Международной конференции «Микробное биоразнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы» (Пермь, 1996), IV Международном симпозиуме по биологии бактерий рода Аапе1оЬас1ег (Израиль, Эйлат, 1996), Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды-98» (Москва, 1998). По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы в двух главах, описания объектов и методов исследований, четырех глав экспериментальной части с обсуждением результатов, заключения и выводов. Работа иллюстрирована при помощи 10 таблиц и 13 рисунков. Список использованных литературных источников включает 163 наименования.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории водной микробиологии и промышленной экологии ИЭГМ УрО РАН и является частью исследований, проводимых по биологии фосфатаккумулирующих бактерий рода Acmetobacter. Представленный экспериментальный материал был получен в рамках работ по бюджетной теме "Изучение гидрохимических и микробиологических процессов биогеохимических циклов биогенных элементов в водйых экосистемах" (№ Государственной регистрации 01. 9. 70 005278) и в 'рамках проекта РФФИ "Микробиологическое и гидрохимическое исследование процессов вторичного загрязнения природных и сточных вод Пермского промузла" (грант № 96-04-51043) на 1996-1998 гг.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом выполненной работы является штамм A.calcoaceticus IEGM 549, который был выделен из аэротенка биологических очистных сооружений (БОС) г.Перми, идентифицирован с помощью набора тестов системы API 20 и депонирован в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН. В работе был также использован штамм A.calcoaceticus IEGM ВТ 548, выделенный к.б.н. М.В.Бердичевской из аэротенка коммунальных очистных сооружений пос.Висагинас, Литва. Бактериальную культуру выращивали на минеральной среде с ацетатом (1%) или другими источниками углерода при 28-30°С в термостатируемом шейкере (170 об/мин). Накопительные культуры аэробных ацетатокисляющих бактерий получали из проб воды ряда природных и техногенных экосистем разного типа.

Общую численность бактерий в пробах и количество клеток с вошо-тиновыми гранулами определяли методом прямого счета под оптическим микроскопом на мембранных фильтрах, прокрашенных толуидиновым синим; наиболее вероятное число сапрофитных и ацетатокисляющих бактерий определяли методом десятикратных предельных разведений с использованием таблиц МакКреди (Практикум по микробиологии, 1976). Определение минимальной ингибирующей концентрации для теллурита калия и селенита натрия проводили на плотной среде на чашках Петри (Turner et al., 1995). При изучении транспорта теллур ита клетками в определенной фазе роста культуру отмывали от среды и ресусиендировали в 0.05М калий-фосфатный буфер с последующим внесением необходимых эффекторов.

Для анализа проб воды на химическое потребление кислорода (ХПК), содержание общего фосфора, железа и сульфатов использовали стандартные гидрохимические методики (Лурье, 1984). Концентрацию тел-лурита калия в среде кулкпшгрования определяли диэтилдитиокарбамат-ным методом (Turner et al., 1992). Величину поглощения теллур ита бактериальными клетками рассчитывали по его элиминации из среды. О содер-

жании теллура в сухой биомассе судили по интенсивности линий спектра вторичного рентгеновского излучения теллура с применением растрового электронного микроскопа РЭМ-100У с дисперсионным анализатором. Концентрацию клеточного белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951), содержание внутриклеточного глутатиона - по методу Титца (Tietze, 1969).

При определении наиболее вероятного числа бактерий в пробах использовали уровни статистической достоверности, заложенные в таблицах МакКреди. При подсчете колоний бактерий на плотных средах следовали требованиям статистической достоверности, согласно которым оптимальное число колоний на чашку должно находиться в пределах от 30 до 300. Биохимические результаты в большинстве таблиц приведены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±ш). В случае, если на графиках представлены средние значения без указания величин отклонения, последние, как правило, не превышали 10%. Достоверность различий между средними величинами оценивали согласно t-критерию Стыодента. Различия в соответствии с правилами считались значимыми при р<0.05. Результаты анализировали с помощью пакета программ Microsoft Excell (версия 7.0 для Windows).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Отношение аэробных ацетатокисляющих накопительных культур к теллурит-оксианионам

Ацетатокисляющие накопительные культуры, полученные из различных образцов природных и сточных вод Пермского промузла, проявляют неоднозначную способность поглощать и восстанавливать теллурит (Те032") - оксианионы (табл. 1).

Ряд испытанных культур не показывает выраженной активности к поглощению иона Те032" из среды культивирования и к его восстановлению; в присутствии 50 мкг-мл"1 теллурита калия (К2Те03) рост культур не отмечался, но не наблюдался и заметный лизис бактериальных клеток. В подобных сообществах микроорганизмов представляется маловероятным массовое распространение теллурит-резистентных или, напротив, теллурит-чувствительных клеток. Для местообитаний, откуда были выделены неактивные накопительные культуры, характерно невысокое содержание фосфора (0.1-10 мг-л"1) и ХПК (17-37 мг02 ■ л'1), пониженное количество ацетатокнеляющих бактерий (1-100 тыс.кл-мл"1) и клеток с полифосфатами (37% от общего числа). При этом активность накопительных культур трансформировать теллурит-анионы не связана с отношением количества ацетатокнеляющих бактерий к количеству сапрофитных или к общей численности микроорганизмов но прямому счету. Так, в биопленке аэрофильтра очистных сооружений г.Пытва при доминировании сульфатвосстанавли-вающих бактерий - продуцентов сероводорода и при достижении его кон-

Сравнительная характеристика природных и сточных вод Пермского промузла и распространение в них ацетатокисляющих микроорганизмов, обладающих способностью восстанавливать в накопительных культурах теллурит-окснанионы в токсичных концентрациях (50 мкг/мл) до элементного Тс (май-сентябрь, 1996; май-июль, 1997)

Мс-сто отбора проб Содержание веществ, мг/л Бактерии, Снижение [КаТеОз] за 24 ч,

рН Фосфор общий Железо Сульфаты ХПК общее число, млн кл/мл С БОЛЮТИНОМ, % от общего числа сапрофитные, тыс кл/мл ацетатокисляющие, тыс кл/мл % (эффективность восстановления)

Дренаж с иловых карт, БОС. Пермь 7.4 19.8 29.0 495 2220 404 7 27000 45000 >50 (+++)

Первичный аэротенк, БОС, Пермь 7.3 26.5 1.7 120 123 248 40 70000 2500 30 (+++)

Вторичным аэротенк, БОС, Пермь 7.2 26.8 1.3 118 107 111 42 3000 250 30(+++)

Первичны» отстойник, БОС, Нытва 7.2 3.9 2.4 58 103 60 19 600 250 25(+++)

Нытненскпе водохр, припло-тинный участок 8.1 0.1 07 30 25 4 33 6 1 30 (+++)

Первичный отстойник, БОС, Пермь 7.2 1.9 1.8 227 67 48 15 600 2500 15-20 (++)

Вторичным отстойник, БОС, Пермь 7.2 1.7 1.1 220 78 17 8 30 450 15-20 (++)

р Нытва, ниже плотины, поверхностный слой 7.6 0.2 0.7 38 28 6 23 250 6 10-15 (т)

Аэрофиль гр, БОС, Нытва 6.8 5.8 - - - 144 6 25000 2500 10-15 (+)

Буферный пруд 1, БОС, Пермь 6.9 31.8 1.5 230 95 127 19 5000 250 5(±)

Нытвенскме водохр., верховье 7.8 0 1 0.4 15 32 6 25 60 1 5(±)

Третичным отстойник, БОС, Пермь 7.1 1.7 0.7 218 37 15 7 3 10 0-1 (-)

Буферный пруд 2, БОС, Пермь 7.0 9.9 0.9 134 37 4 4 300 95 0-1 (-)

Буферный пруд 3, БОС, Пермь 7.1 5.7 0.8 134 17 3 3 12 10 0-1 (-)

Примечании-, эффективность восстановления "+++" - интенсивное черное окрашивание бактериальной суспензии; "++" - серое или коричневое окрашивание, " Г' - потемнение бактериальной суспензии; "±" - очень слабое потемнение;"-" - отсутствие окрашивания бактериальной суспензии.

центрации 6-12 мг H2S-Ji'' детоксикация оксианионов возможна химическим путем, что было подтверждено нами в лабораторном эксперименте.

Накопительная культура, полученная из пробы воды, взятой в верховье Нытвенского водохранилища, практически не поглощает и не восстанавливает теллурит. Однако, накопительная культура, полученная из пробы воды, взятой в наиболее загрязненном приплотинном участке Нытвенского водохранилища, показывает значимый проценг элиминации теллурита из среды и высокую восстанавливающую активность.

Самые высокие показатели поглощения теллурита и его восстановления выявлены для накопительных культур, полученных из наиболее загрязненных местообитаний, представляющих собой объекты биологических очистных сооружений (БОС). Они характеризуются повышенным содержанием органического вещества (ХПК более 100 мг02- л"1), фосфора, железа и сульфатов. Именно здесь выявлено повышенное количество ацетатокис-ляющих бактерий (250-75000 тыс.кл/мл), а также высокая общая численность бактерий по прямому счету по сравнению с объектами, находящимися на завершающей стадии биологической очистки сточных вод. Вероятно, на активность накопительных культур по отношению к теллурит-анионам в большей степени влияет состав микробного сообщества и наличие в нем фосфатаккумулирующих бактерий. Представленные гидрохимические и микробиологические характеристики накопительных культур согласуются с высказанным ранее мнением о том, что эффективные по удалению теллурита штаммы следует искать в биотопах, подобных начальным стадиям биологической очистки сточных вод (Taylor, Summeis, 1979). Поэтому для дальнейшего исследования нами был отобран штамм A.cälcoaceticus IEGM 549, выделенный из первичного аэротенка БОС г.Перми, где повышено содержание различных загрязняющих веществ и общая численность микроорганизмов, среди которых до 40% клеток имеют включения из полифосфатов, многочисленны ацетатокисляющие ацинетобактерии, обладающие высокой эффективностью восстановления теллурита.

2. Характеристика штамма A.calcoaceticus IEGM 549 и его способности трансформировать н аккумулировать теллурит-оксианионы

Новый штамм A.calcoaceticus IEGM 549 (табл.2) относится к .типичным представителям аэробных, грам-отрицательных, неподвижных, окси-дазотрицательных, фосфатаккумулирующих бактерий рода Acinetobacter (Baumann et al., 1968).

Он является пресноводным, мезофильным организмом, предпочитающим слабощелочную среду. Хорошо растет на МПА и МПБ, а также на этаноле, ацетате и н-гексадекане, но не использует глюкозу или другие моносахариды в качестве единственного источника углерода и энергии. Штамм не способен к анаэробному дыханию за счет нитрата.

Основные характеристики нового штамма Асте1оЬааег са1соасеИси% 1ЕОМ 549

Наименование характеристики Полученные данные

Вид колоний (на плотной среде) округлые с ровными краями, прозрач-

ные, гладкие, слабо выпуклые, вязкой

консистенции, непигменгированные

Морфология клеток (н конце логарифми- короткие утолщенные палочки,

ческой фазы роста) 2.6±0.6 х 1.4±0.2 мм

Окраска по Граму отр1щательная

Подвижность отсутствует

Оптимальная температура, °С 30-32

Диапазон значений рН среды 6.7-8.6

Оптимум рН 7.2-7.4

Рост при №С1:

0.2% + (оптимум)

1.0% ч-

2.5% ±

3.0% -

Каталаза +

Гранулы полифосфатов (внутриклеточные) +

Рост на:

МПБ +

ацетате +

сукцинате +

цитрате +

этаноле +

н-гексадекане +

малате -

глюкозе -

и-оксибензойной к-те -

Оксидаза -

Нитратредуктаза (диссмшшяциошгая) -

Гидролиз желатина -

Гемолиз -

Минимальная ингибирующая

концентрация, мкг-мл"

К2Те03 8

Ка28е03 1000

В процессе роста бактериальной культуры клетки A.calcoaceticus IEGM 549 претерпевают морфологические превращения. Во второй половине логарифмической фазы роста в культуре преобладают клетки в виде утолщенных палочек размером 2.6±0.6 х 1.4±0.2 мкм. Переход в стационарную фазу сопровождается появлением укороченных палочек. Затем в стационарной культуре они представлены исключительно кокковидными клетками размером 1.2±0.3 х 1.0±0.2 мкм.

Эти морфологические превращения сопровождаются изменениями свойств клеточной поверхности: в стационарной фазе клетки A.calcoaceticus IEGM 549 повышают гидрофобность и способность к слипанию с образованием биопленки. Данный штамм может продуцировать поверхностно-активные вещества полисахаридной природы, особенно, при дефиците фосфора в среде, что было учтено при изучении детоксикации теллурита.

Минимальная ингибирующая рост концентрация (MIC) теллурита калия (К2ТеОз) для изученных штаммов Л. calcoaceticus не зависела от состава среды, на которой культивировались бактерии (МПА или агаризован-ная среда с ацетатом) и составила 8 мкгмл"1. MIC очень близкого по химическим свойствам соединения - селенита натрия (Ha2Se03) была определена в 1000 мкг-мл"1 и также не зависела от среды определения (богатая или минимальная). Таким образом, по этому показателю теллурит оказался более чем в 100 раз токсичнее селенита, что для других грам-отрицательных бактерий ранее не отмечалось. Величина MIC по К2ТеОз для данных штаммов в 5-10 раз превышала таковую для штаммов дикого типа E.coli (Moore, Kaplan, 1994).

Следует отметить, однако, что при контакте с теллуритом, внесенном в среду в широком интервале концентраций, вплоть до 20 х MIC, культура A.calcoaceticus IEGM 549 практически полностью сохраняла жизнеспособность и могла возобновить рост после некоторой временной задержки. Продолжительность такой задержки зависела от концентрации теллурита и количества инокулированных в среде клеток (табл.3). В испытанных условиях культивирования (различные источники углерода, вариации значений pH среды) бактериальная биомасса в присутствии теллурита заметно снижала его содержать в среде. При этом скорость поглощения находились на уровне 35-40 мкг Те032" -мг"1 белка за 24 часа, который ранее был достигнут лишь для теллурит-резистентных генетически сконструированных штаммов E.coli (Turner et al, 1994). Следовательно, исследуемый штамм способен осуществлять эффективную детоксикацию поглощенного теллурита.

Культура A.calcoaceticus при контакте с теллуритом приобретает интенсивное черное окрашивание, при этом отмечается увеличение оптической плотности бактериальной суспензии при 600 нм. Оптическая плотность возрастает по мере поглощения и восстановления теллурита, что нами использовано при проведении количественных определений. Известно, что восстановление теллурит-оксианионов (Те032 ) биохимическим путем

происходит преимущественно до элементного теллура (Те0) с образованием его аморфной аллотропной модификащш. В ряде микробиологических публикаций она получила название «металлический» теллур, хотя, строго говоря, под этим термином обычно подразумевают кристаллическую аллотропную модификацию теллура.

Таблица 3

Продолжительность задержки роста культуры А. са1соасеист 1ЕСМ 549 в зависимости от концентрации К2Те03 при различной величине инокулята

Добавлено в среду К;ТеОз, мкг-мл'1

Задержка роста (ч) при различных объемах инокулята,

105 КЛ'МЛ"1

106 кл-мл"1

10 кл-мл"'

15 25 50 100 150

60 72-80 96-100 -140 -240

48-52 68-72 96-100

4 8-10 20 36-40 48-52

Процесс восстановления теллурита клетками изученного штамма A.calcoaceticus IEGM 549 имеет следующие особенности:

- восстановление теллурита при концентрациях около MIC регистрируется уже через 20-30 минут после его внесения в культуральную среду;

- восстановление теллурита также осуществляется и при низких его концентрациях (« MIC );

- культуры не утрачивают восстанавливающую способность после большого числа пересевов на МПА без теллурита в течение трех лет хранения.

Известно, что отдельные представители фототрофных бактерий и дрожжей обладают способностью к восстановлению теллурита в аэробных и анаэробных условиях в цитоплазме или в связанных с цитоплазматиче-ской мембраной вакуолях с аккумулированием элементного теллура внутри своих клеток (Moore, Kaplan, 1992; Yurkov et al, 1996; Gharieb, Gadd, 1998). Также и A.calcoaceticus IEGM 549 при гетеротрофном росте поглощает и восстанавливает теллурит в аэробных условиях с накоплением внутриклеточного теллура в виде электронно-плотных включений. На плотных средах восстановление оксианионов в центре колоний осуществляется шггенсив-нее, чем по краям. Колонии A.calcoaceticus, выросшие в присутствии теллурита, кроме приобретения черной окраски, других морфологических характеристик не изменяют.

Клетки изученных штаммов, наряду с теллурит-оксианионами обладают способностью восстанавливать теллурат-ионы (Те()42~), а также ок-сианионы селена - селенит (Se032") и селепат (Se042'). Последши восстанавливаются с образованием красной аморфной аллотропной модификации элементного селена (Se°).

Поглощение теллурита клетками A. calcoaceíicus IEGM 549 (через 24 ч) при вцесепии К2Те03 в перастущую культуру

ГКгТеОз] в среде, мкг-мл"1 Поглощение Содержание Те" в с.б. (по спектру рентгеновского излучения), имп-с"1 на 1 мм2 препарата Выживаемость, %

начальная конечная мкг-мл'1 в суг %

15.0 0.2±0.2 14.8 98.7 не опр. 100

25.0 6.4±1.0 18.6 74.4 7±1 100

50.0 29.6±0.6 21.4 42.8 20±2 100

100.0 57.4±2.5 42.6 42.6 48±8 95

150.0 87.0±6.0 63.0 42.0 32±2 80

Примечание: даны средние значения из трех независимых экспериментов; "не опр." - не определяли.

При исходной концентрации К2Те03 в жидкой среде в 15 мкг-мл"1 (2хШС) биомасса А.ссйсоасеИсж ШвМ 549 в течение суток успевает поглотить почти весь оксианион (98.7%), но уже при 25 мкг-мл"1 в среде остается примерно 1/4 его часть (табл.4). В то же время в интервале начальных концентраций К2ТеОз 50-100 мкг-мл"1 остаточное количество теллурита в процентном выражении практически одинаково и в среднем составляет 57.5%. Здесь зависимость суточной скорости поглощения теллурита от его начальной концентрации в культуралыюй среде носит линейный характер и, начиная с 50 мкг-мл"1, превышает 21 мкг-мл"1. Судя по изменениям концентрации теллурита в среде и рентгеноспектральным показателям содержания теллура в биомассе, лишь в диапазоне концентраций 50-100 мкг-мл"1 отмечается повышенная аккумуляция клетками преимущественно элемеот-ного теллура (Те0). При 100 мкг К2ТеОэ -мл"1 исходной среды показатель аккумуляции теллура в биомассе достигает максимального значения. Падение данного показателя при 150 мкг КзТеОз-мл"1 совпадает с гибелью примерно 20% популяции клеток ацинетобактерий. Биохимический процесс восстановления теллурита, по-видимому, не ограничивается образованием Те0, наиболее четко регистрируемого рентгеноспектральным анализом, а идет дальше с выходом более восстановленных летучих соединений теллура. Косвенным подтверждением такого процесса служит появление у культуры своеобразного «меркаптанового» запаха через 10-12 ч после внесения теллурита в среду даже в небольших количествах. По литературным данным и собственным наблюдениям, аналогичный «меркаптановый» запах отмечается и в случае биохимического восстановления оксианионов селена.

3. Особенности транспорта теллурита клетками A.calcoaceticus IEGM 549

Ранее было показано, что теллур ит-ионы прошпсают в клетки E.coli при участии фосфат-транспортирующей системы (Tomas, Kay, 1986, Taylor, 1994). По современным представлениям, основной системой транспорта неорганического фосфата у Acinetobacter является т.н. Pit-система, источником энергии для которой служит протондвижущая сила (van Veen et al., 1994). Поскольку ацинетобактерии обладают способностью активно поглощать фосфат-ионы из среды с последующим их аккумулированием в виде внутриклеточных полифосфатов они могут служить удобным объектом доя изучения транспорта оксианионов теллура.

С этой целью было прослежено влияние ряда эффекторов на скорость поглощения ионов Те032" клетками культуры A.calcoaceticus IEGM 549, взятыми в опыт в середине логарифмической фазы роста, в 0.05 М калий-фосфатном буфере или в случае о-арсенита в Трис-HCl буфере (табл.5). Варианты опыта с внесением лишь одного теллурита калия (25 мкг-мл'1 или 0.1 мМ) при четырех значениях температуры показывают, что, во-первых, поглощение ионов Те032" происходит практически с постоянной скоростью и носит линейный характер, который сохраняется по меньшей мере в течение 30 ч, во-вторых, скорость поглощения Те032" в пересчете на единицу клеточного белка не зависит от температуры (в диапазоне 10-37°С). Обратный выброс iß клетки ^трансформированных теллурит-ионов ни в одном варианте опыта не наблюдался. В дополнительных экспериментах добавление антибиотика хлорамфеникола - ингибитора синтеза белка - в концентрации 75 мкг-мл'1 к растущей культуре позволило установить, что время полужизни теллурит-транспортиругащей системы составляет около 8 часов. Таким образом, исследуемая транспортная система в клетках A. calcoaceticus IEGM 549 функционирует достаточно эффективно в течение значительного времени даже в отсутствии синтеза ее составляющих de novo.

Установлено, что при конкуренции со стороны близкородственных по химической природе оксианионов поглощение теллурита достоверно не ингибируется селенит-ионами (Se03~~) при их 50-кратном молярном избытке и теллурат-ионами (Те042") при 20-кратном молярном избытке. Ион Те042" ингибировал поглощение теллурита только при молярном соотношении 50:1, что видно из табл.5. Вероятно, оба оксианиона теллура - теллурит и теллурат - проникают в клетку благодаря одной и той же транспортной системе, которая тем не менее проявляет существенно более высокую степень сродства к теллуриту. Орто-арсенит-анионы при 20-кратном молярном избытке не ингибируют поглощение теллурит-анионов.

Отсутствовало влияние на скорость поглощения ионов Те032" клетками А. calcoaceticus IEGM 549 со стороны фторида натрия (NaF) - ингибитора субстратного фосфорилирования - при концентрации 10 мМ. Это мо-

жет свидетельствовать о том, что генерируемый в данных реакциях АТФ не принимает прямого участия в транспорте теллурита и согласуется с полученными ранее данными об основной роли трансмембранного потенциала в работе системы, транспортирующей двухвалентные анионы орто-фосфата (НР042) и теллурита (Те032~) (van Veen et al., 1994).

Таблица 5

Влияние изменений температуры и различных химических факторов при 32°С на скорость поглощения теллурита клетками A.calcoaceticus EEGM 549 в 0.05М калий-фосфатном буфере (ОЛмМ К2Те03 за 24 ч, pH 7.4)

Скорость поглощения теллурита

Фактор мкг-мг"1 белкач"' от контроля, %

Температура,°С:

10 1.04±0.10 99.0

(р>0-1)

25 1.04±0.15 99.0

(р>0.1)

32 (контроль) 1.05±0.11 100.0

37 1.09±0.09 103.8

(р>0.1)

о*-Арсениг натрия, 2 мМ(,) 1.10±0.17 104.8

(р>0.1)

Фторид натрия, 10 мМ 1.22±0.16 116.2

(р>0.1)

Селенит натрия:

2 мМ 1.02±0.10 97.1

(Р>0.1)

5 мМ 0.97±0.15 92.4

(р>0.1)

Теллурат калия:

2 мМ 0.96±0.16 91.4

(р>0.1)

5 мМ 0.59±0.19 56.2

(р<0.05)

Ы-этилмалеимид, 0.1 мМ 0,72±0.05 68.6

(р<0.05)

Примечание. Приведены средние данные трех независимых определений. В скобках указана достоверность различий между контрольным и опытным вариантами при уровнях значимости р<0.1 ир<0.05. (*) Использовался 0.05Мтрис(гидроксиметил)аминометан-НС1 буфер (рН 7.25).

Сулъфгидрильный реагент Жэтилмалсимид (0.1 мМ) оказывает достоверное ингибирующее влиянне на транспорт теллурита, по-видимому, за счет связывания доступных БН-групп белков, участвующих в этом процессе.

Представляется важным тот факт, что уровень интенсивности поглощения теллурит-ионов и накопления внутриклеточного теллура зависит от стадии роста и возраста культуры (рнс.1). В этой серии опытов использовалась такая концентрация К2Те03 (15 мкг-мл'1, 2хМ1С), которая не вызывала ощутимой гибели клеток, но ингибировала рост культуры в ходе эксперимента (пока не достигала уровня ниже М1С). Имешго в логарифмическую фазу ускоренного роста, включая ее завершающую стадию и начало стационарной фазы, А. са1соасейсш 1ЕСМ 549 продолжает поглощать тел-лурит с довольно высокой постоянной скоростью в течение всего времени эксперимента (90-120 мин). При этом наиболее высокая суммарная скорость поглощения теллурита (67 мкгт1 белка-мин"') отмечена при его внесении в культуру в последшою треть логарифмической фазы роста при значении СШ540 = 0.65-0.85. Стационарная культура с ОИ^о =1.30, напротив, лишь в течение 15 мин после добавки К2Те03 сохраняет аналогично высокую скорость поглощения теллурита, но затем в течение последующих 100 мин эту способность практически полностью утрачивает.

Последующая серия опытов с клетками А. сакоасеИсия ПЮМ 549 показывает, что между процессами поглощения фосфат- и теллурит-ионов действительно существует конкурентное ингибирование (рис.2, 3). В середине логарифмической фазы роста культуры при максимально высокой скорости поглощения теллурита (при крутом угле наклона кривой на графике) потребление ортофосфатов минимально (угол наклона соответствующей кривой крайне мал). Заметное снижение скорости поглощения теллурита, происходящее через 30 мин после его внесения в среду компенсируется увеличением скорости поступления фосфатов в клетку. При высоких скоростях поглощения Те032", когда поступление в клетки ортофосфатов минимально, их необходимый внутриклеточный пул частично восполняется за счет расходования накопленного ранее резерва в форме полифосфатов (рис.3, 4). Биосинтез последних возобновляется и усиливается лишь по мере снижения концентрации теллурита в среде.

Как известно, внесение в питательную среду неростового субстрата -О-глюкозы (в концентрации 10 мкг углерода-мл"1), которую А.саЬоасеИсш превращает в глюконовую кислоту, но не использует в качестве единственного источника углерода и энергии, усиливает потребление ортофосфатов клетками и, соответствешю, перевод их избытка в высокомолекулярные полифосфаты (Саралов и др., 1995). В наших экспериментах последующее добавление теллурита (при концентрации 15 мкг КгТеОз-мл'1) через 30 мин после внесения глюкозы не оказывает заметного влияния на потребление фосфат-ионов, но при этом усиливается биосинтез внутриклеточных полифосфатов (по сравненшо с вариантом без добавки глюкозы) (рис.3, 4). На-

против, при этом резко ингибируется поглощение теллурита (рис. 2), вплоть

Прододдигелькссть »кепозкции, мян

Рис. 1. Динамика поглощения теллурита калия (начальная концентрация 2хМ1С, 15 мкг-мл"1) клетками культуры А.сакоасеНсиь ПЮМ 549, находящейся в логарифмической или стационарной фазах роста

Добавление В-глюкозы к культуре А. сакоасеИсш 1ЕОМ 549 через 30 мин после внесения теллурита (при тех же концешрациях) быстро и полностью ингибирует поглощение теллурит-ионов (рис.2). При этом поступление в клетки фосфат-ионов первоначально снижается, но к концу эксперимента их содержание в биомассе практически соответствует варианту без внесения глюкозы (рис.3). Содержание внутриклеточных полифосфатов в данном случае увеличивается, но незначительно (рис.4).

Исходя из полученных данных представляется возможным утверждать, что дополнительная метаболическая энергия, которую ацинетобак-терии способны получать при окислении глюкозы не используется для транспорта теллурита.

Продолжительность экспозиции, мин

Рис. 2. Влияние добавки глюкозы (10 мкгС мл'1) на поглощение теллурита калия (15 мкгмл"') клетками культуры А. сЫсоасеИсих 1ЕОМ 549 в логарифмической фазе роста (А - добавлен только К2Те03, В - глюкоза добавлена за 30 мин до К2Те03 и С - глюкоза добавлена через 30 мин после К2Те03)

Продолжительность экспозиции, тч

Рис. 3. Влияние добавок глюкозы (10 мкгС-мл"')и теллурита калия (15 мкгмл"1) на содержание общего фосфора в биомассе Л. са\соасе1кин ШСМ 549 (А, В, С - соответствуют рис. 2)

Рис. 4. Влияние добавок глюкозы (10 мкгС-мл"1) и теллурига калия (15 мкг-мл'1) на содержание фосфора полифосфатов в биомассе А.сакоасеИсш ТЕБМ 549 (А, В, С - соответствуют рис. 2)

Продамшедыюсг* »кслозяции. кли

Рис. 5. Влияние добавок К2Те03 (15 мкг-мл"1) и М-этилмалеимида (КЕМ, 0,1 мМ) на содержание глутатиона в клетках культуры А.са1соасеИсш ШвМ 549 (А -контроль, необработанная проба; В - К2Те03 добавлен в начальный момент; С -КЕМ добавлен в начальный момент; В - МВМ добавлен в начале, а К2Те03 через 15 мин)

Таким образом, культуры A.calcociceticus в стационарной фазе замедленного роста характеризуются активным накоплением в них волютпновых гранул из высокомолекулярных полифосфатов (Саралов и др., 1995), но очень слабо поглощают теллурит-ионы из среды. В логарифмическую фазу ускоренного роста ацинетобактерии, напротив, расходуют полифосфаты и с высокой скоростью элиминируют ионы Те032" из среды.

4. Участие глутатиона в процессе детоксикации/ восстановления теллурита

В свете современных представлений, высокую токсичность оксиа-1шонов теллура (Те032 и Те042") для микроорганизмов связывают с их сильной окисляющей способностью (Turner et al., 1995). Устойчивость к теллу-рит-ионам резко снижается при обработке резистентных штаммов Е. coli ингибитором свободных внутриклеточных тиоловых групп (Turner et al., 1995). Глутатион является главным небелковым тиолом в клетках грам-отрицательных бактерий, включая A.calcoaceticus (Fahey et al, 1978). Была показана возможность прямой неферментативной реакции между теллури-том и низкомолекулярными тиолами (цистеином и глутатионом). Поэтому возникла необходимость изучить изменения, происходящие in vitro при взаимодействии восстановленной формы глутатиона (GSH) и раствора теллурита калия. Первоначально мы наблюдали реакцию между 10 мМ К2Те03 и GSH при различном молярном соотношении в минеральной среде с фосфатами, которая нами использовалась для культивирования ацинетобактерии. Выяснилось, что образование элементного теллура (Те0) в ходе взаимодействия восстановленного глутатиона с теллуритом действительно имеет место, но более активно происходит при 5-кратном молярном избытке глутатиона и в слабощелочной среде (рН 7.6-7.8). Дальнейшее увеличение концентрации глутатиона в указанных условиях ведет к генерации в реакционной смеси сероводорода, что было определено титрованием, закисле-нию среды (до значения рН 4.0) и, по всей видимости, к восстановлению теллурита в основном до сульфида теллура. При молярном "недостатке" GSH образование Те0 замедляется во времени и к концу эксперимента не удается получить черный осадок элементного теллура.

In vitro при взаимодействии 1 мМ восстановленного глутатиона (GSH) и 0.2 мМ (50 мкг мл"') теллурита калия наблюдалось быстрое (за 5-10 мин) исчезновение из среды GSH (на 70%) и теллурита (на 50%). Оставшийся глутатион на 90% представлял собой его окисленную форму (GSSG). При дальнейшем инкубировании пробы (120 мин) содержание глутатиона и теллурита не изменялось. Одновременно происходило постепенное восстановление теллурита. Этот процесс, в отличие от фазы связывания, ускорялся при повышении температуры или при внесении в инкубируемую смесь гомогената клеток A.calcoaceticus IEGM 549.

В клеточных гомогенатах A.calcoaceticus IEGM 549 показатель восстановления теллурита также зависит от температуры. Этот показатель, оцениваемый по повышению оптической плотности проб при 600 нм, обратно пропорционален действующей дозе NEM (0.001 - 1мМ).

Возникла необходимость изучить изменения содержания общего внутриклеточного глутатиона, происходящие при обработке культуры A.calcoaceticus IEGM 549 (в середине логарифмической фазы роста) теллу-ритом. В этой серии опытов в течение 90 мин К2Те03 в концентрации 15 мкг-мл'1 (2хМ1С) ингибировал рост культуры, при этом клетки поглощали теллурит из среды со скоростью, в среднем равной 65 мкгт"1 белка в мин. Процесс поглощения теллурита сопровождался его восстановлением до элементного теллура и окрашиванием бактериальной суспензии в черный цвет. Содержание общего глутатиона в клетках, взятых в опыт в середине логарифмической фазы роста культуры составляло 25.4±1.6 мкМт"1 белка, но продолжало повышаться в клетках растущей культуры контрольного варианта без добавки К2Те03. Тогда как в процессе поглощения теллурита уровень внутриклеточного глутатиона снижался и через 45 мин составил 10.7±3.1 мкМт'1 белка или примерно 33% относительно контроля (32.6±1.3 мкМт"1 белка). В дальнейшем уровень глутатиона, несмотря на продолжающееся поглощение теллурита, сохранял постоянную величину (рис.5).

Сульфгидрильный реагент N-этилмалеимида (NEM) в концентрации 0.1 мМ вызывал быстрое снижение уровня глутатиона и через 15 мин его осталось только 15% от контроля. Это действие было обратимым; содержание глутатиона постепенно достигло исходного уровня и после 45 мин задержки культура возобновила рост. Клетки, обработанные NEM и вслед за этим К2ТеОз, поглощали теллурит только по истечении 15 мин после его внесения в среду. Далее поглощение теллурита проходило с меньшей скоростью и в результате клетки смогли поглотить за время опыта 2.4±0.4 мкг Те032" -мг"1 белка (вместо 5.9±0.3 мкг Те032' -иг"1 в варианте опыта с К2Те03 без NEM). В присутствии NEM добавка К2Те03 не вызывала дальнейшего снижения уровня глутатиона. К концу опыта его содержание составило 12.3±4.5 мкМт1 клеточного белка. Эта величина была на 50% меньше, чем у клеток, обработанных только NEM (рис.5).

Полученные данные позволяют полагать, что убыль количества внутриклеточного глутатиона прямо пропорциональна количеству поглощенного клетками теллурита.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Фундаментальные работы ио трансформации теллурит-ионов были выполнены на грам-отрицательных несерных пурпурных бактериях сем. Rhodospirillaceae, относящихся к а и ß филогенетическим подгруппам Proteobacteria (Moore, Kaplan, 1992; 1994). Показано, что некоторые представители фотосинтезирующих родоспирилл демонстрируют высокий уро-

вень резистентности к теллуриту (MIC К2ТеОз вплоть до 1000 мкг-мл"1). Значение MIC К2Те03 для фотогетеротрофно растущих Rhodobacter sphaeroides повышается примерно в 50 раз при замене менее восстановленного субстрата (ацетат) на более восстановленные (бутират, капроат). При анаэробном фотогетеротрофном росте MIC К2ТеОз увеличивается в 2-5 раз, если снижается интенсивность освещения и, как следствие, падает метаболическая активность клеток. Детоксикация поглощенных ионов Те032" бактериями R. sphaeroides происходит посредством их восстановления до элементного "металлического" теллура, который аккумулируется в виде внутриклеточных включений, локализовашшх либо в цитоплазме, либо на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны. Благодаря этому обеспечивается удаление избыточного количества восстановительных эквивалентов, которое особенно обильно образуется при фотогетеротрофном типе обмена.

Основные задачи данного исследования - изучение процессов поглощения, восстановления и аккумулирования теллурит-ионов грам-отрицательными бактериями Acinetobacter calcoaceticus в ходе гетеротрофного роста в аэробных условиях. В отличие от пурпурных несерных бактерий ацинетобактерии относятся к у-подгруппе Proteobacteria. При проведении экспериментальных работ учитывались и известные из научной литературы данные о том, что ряд неорганических оксианионов (например, арсе-наты) могут являться фосфатными аналогами, а их токсичность связана с воздействием на сульфгидрильные группы ферментов, важнейших клеточных белков и глутатиона (Илялетдшюв, 1984).

В экологическом плане представители рода Acinetobacter характеризуются крайне широким диапазоном сред обитания - от организма животных и человека до олиготрофных грунтовых вод (Bergogne-Berezin et al., 1994). Оказалось, что из большинства природных и сточных вод Пермского промузла их удобно выделять в накопительные культуры с использованием ацетатсодержащих питательных сред, имеющих слабощелочную реакцию. Предложенный нами метод с внесением К2Те03 в накопительные культуры позволил установить, что способные к детоксикации теллурита ацинетобактерии широко распространены, в частности, на рашшх стадиях биологической очистки сточных вод. Поэтому для подробного изучения трансформации ионов Те032" был отобран штамм A. calcoaceticus IEGM 549, выделенный нами из аэротенка БОС г.Перми и депонированный в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН. Хотя дашшй штамм не показывает высокой резистентности к К2Те03 (MIC равна 8 мкг-мл"1), но величина MIC не зависит от того, выращивались ацинетобактерии на богатой питательной среде (МПА) гаи на минимальной среде с ацетатом, что принципиально отличает их от R. sphaeroides. В силу этого большинство лабораторных опытов с A. calcoaceticus IEGM 549 было проведено при его культивировании на минеральной среде с ацетатом.

Анализ экспериментального материала показал, что в присутствии теллурит-ионов бактериальные клетки A.calcoaceticus IEGM 549 поглощают их с неожиданно высокой скоростью, характерной лишь для мутантных Те-резистентных штаммов других бактерий. При этом культура не утрачивает своей жизнеспособности и детоксикация поглощаемого теллурита осущест-вляляется, как и у родоспирилл, в основном посредством восстановления до элементного теллура (Те0), аккумулируемого внутри клеток; при контакте с теллуритом биомасса окрашивается в черный цвет.

Восстановление теллурита клетками A.calcoaceticus IEGM 549 наблюдается также и при низких его концентрациях (« MIC), при концентрациях около MIC этот процесс регистрируется уже через 20-30 мин после внесения Те032" в среду и культура не утрачивает способность к детоксика-ции оксианиона после многократных пересевов на МПА без теллурита в течение трех лет хранения. Эти данные позволяют полагать, что процесс восстановления Те032~ данным штаммом является конститутивным признаком.

Аэробные хемоорганогетеротрофные культуры A.calcoaceticus с одной стороны, увеличивают эффективность поглощения теллурита только при повышении метаболической активности в период усиления роста. С другой стороны, неростовые субстраты типа глюкозы, окисляемые до органических кислот, препятствуют поглощению клетками теллурит-оксианионов, хотя стимулируют потребление фосфат-анионов и биосинтез внутриклеточных полифосфатов. Этим ацинетобактерии принципиально отличаются от фотогетеротрофов, для которых характерно рекордно высокое значение MIC по теллуриту и очень сильная ее зависимость от степени окисленности/восстановленности источника углерода: максимальные значения MIC (до 1000 мкг К2Те03 -мл'1) достигаются у них при падении метаболической активности.

Уровень активности поглощения теллурит-ионов и накопления внутриклеточного теллура, кроме существенного влияния концентрации Те032", сильно зависит от стадии роста и возраста культуры, но не зависит от температурных условий в интервале 10-37°С.

Максимальная скорость поглощения теллурита A. calcoaceticus IEGM 549 зарегистрирована при его внесении в культуру в конце логарифмической фазы роста до момента увеличения в популяции доли кокковидных клеток и накопления в них полифосфатов. Переход культуры A.calcoaceticus в стационарную фазу сопровождается замедлением роста в истощаемой среде, при этом начинают интенсивно запасаться внутриклеточные полифосфаты металлов в форме волютиновых гранул (Саралов и др., 1995). При этом снижается способность культуры к поглощению ок-сианионов теллура, хотя анионы Те032" конкурируют за проникновение в клетку с анионами НРО42', даже при значительном избытке последних в среде. При внесении теллурита в стационарную фазу культура через 1,5-2 ч вообще утрачивает способность к его поглощению при концентрации >М1С.

Зафиксировано конкурентное ингибироваиие транспорта теллурита близкородственными по химической природе теллурат-ионами (Те042"), но начиная лишь с 50-кратного молярного их избытка. Не выявлено значимого подавления процесса поглощения Те032" клетками со стороны ингибитора субстратного фосфорилирования.

Достоверный ингибирующий эффект на транспорт теллурита проявляет испытанный нами сульфгидрильный реагент N-этилмалеимид (NEM), причем в сравнительно низких концентрациях (0.1 мМ). Серия проведенных опытов с бактериальной суспензией и гомогенатами клеток A.calcoaceticus IEGM 549, подвергнутых обработке NEM, позволила обратить внимание на важную роль внутриклеточного глутатиона и других низкомолекулярных тиолов в восстановлении теллурита.

В логарифмической фазе культуры A.calcoaceticus значительно повышается уровень внутриклеточного глутатиона и его наибольшее содержание, включая восстановленную форму (GSH), достигается в последнюю треть фазы ускоренного роста и совпадает с максимальной скоростью поглощения и детоксикации оксианионов теллура. Полученные нами данные в экспериментах in vivo и in vitro свидетельствуют в пользу того, что GSH и другие низкомолекулярные тиолы могут принимать непосредственное участие в детоксикации/восстановлении ионов Те03"".

Этот и аналогичные процессы детоксикации оксианионов Те032", Те04 , Se03 и Se04по-видимому, позволяют ацинетобактериям поддерживать жизнеспособность в условиях, токсичных для многих других гетеротрофных прокариот, когда сообщество микроорганизмов в целом подвергается стрессовому воздействию. В итоге, как растущие, так и переживающие культуры A.calcoaceticus способны существовать в геохимических аномалиях или в содержащих теллурит сточных водах промышленных производств, что позволяет считать ж перспективными для создания прогрессивных биотехнологических схем совместного удаления органических и минеральных загрязняющих веществ на БОС.

ВЫВОДЫ

1. В загрязненных водш»к экосистемах Пермского промузла с повышенным содержанием органических и минеральных веществ, где в сообществе микроорганизмов 7-40% клеток имеют внутриклеточные гранулы полифосфатов, обнаружены ацинетобактерии, обладающие способностью к детоксикации оксиашюнов теллура.

2. Два изученных штамма грам-отрицательной бактерии Acinetobac-ter calcoaceticus в аэробных условиях восстанавливают теллурит (Те032-)- и теллурат (Те042")-оксиашюны в основном до элементного теллура (Те0) и аккумулируют его в виде внутриклеточных включений с окрашива!шем биомассы в черный цвет.

3. Способность восстанавливать теллурит является конститутивным признаком штамма A.calcoaceticus IEGM 549. Для данного штамма минимальная ингибирующая концентрация (MIC) по теллуриту калия составляет 8 мкг К2ТеОз-мл"'. Максимальная же аккумуляция внутриклеточного элементного теллура (Те0) достигается при повышении концентрации оксиа-ниона в среде (~ 100 мкг КгТеОз-мл"1 или 12.5хМ1С) . Посредством восстановления теллурита штамм A.calcoaceticus IEGM 549 проводит его эффективную детоксикацию, что дает возможность бактериальной культуре поддерживать жизнеспособность (на 80%) в присутствии очень высоких концентраций К2Те03 (до 20хМ1С).

4. Максимальная скорость поглощения ионов Те032" регистрируется при их внесении в культуру A.calcoaceticus IEGM 549 в последнюю треть логарифмической фазы роста (до 35-40 мкг Те032" -иг"1 белка за 24 часа). Переход культуры в фазу замедленного роста сопровождается падением скорости поглощения теллурита. Культура в стационарной фазе, когда она представлена в основном кокковидными клетками с гранулами полифосфатов почти полностью утрачивает способность к его поглощению.

5. Двухвалентные ионы Те032" проникают в клетки A.calcoaceticus IEGM 549, конкурируя с анионами ортофосфата (даже при высоких концентрациях последних). Интенсивное поглощение фосфат-ионов, сопровождаемое активным биосинтезом полифосфатов (в частности, при внесении в кулыуральную среду неростового субстрата - 10 мкг С- глюкозы • мл"1), практически полностью препятствует транспорту анионов теллурита клетками. Ацинетобактерии в логарифмической фазе роста способны расходовать накопленные ранее внутриклеточные полифосфаты даже при высокой скорости поглощения теллурита.

6. В детоксикации/восстановлении теллурита представляется важной роль внутриклеточного глутатиона и других низкомолекулярных тиолов, которые взаимодействуют с ионами Те032"; восстановление теллурита в аэробных условиях ингибируется лишь высокими концентрациями сульфгидрильного реагента N-этилмалеимида. При поглощении теллурита клетками A.calcoaceticus IEGM 549 происходит достоверное пропорциональное снижение содержания глутатиона. In vitro реакция восстановления оксианионов Те032~ глутатионом (GSH) состоит из двух стадий: быстрого взаимодействия с образованием окисленной формы глутатиона (GSSG) и последующего постепенного образования Те0.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Соломенный А.П., Сойфер Ю.Г., Чуракова Г.А., Козлова Г.А. Биоаккумуляция теллура бактериальными клетками // Химические проблемы защиты окружающей среды. Пермь, 1996.С. 73-77.

2. Соломенный А.П. Биоаккумуляция теллура клетками бактерий // Труды конф. молодых ученых ИЭРиЖ УрО РАН. Екатеринбург, 1996. С. 237240.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соломенный, Александ Петрович, Пермь

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

СОЛОМЕННЫЙ Александр Петрович

ТРАНСФОРМАЦИЯ ОКСИАНИОНОВ ТЕЛЛУРА ФОСФАТАККУМУЛИРУЮЩЕЙ БАКТЕРИЕЙ Аст&оЬасЛег ссйсоасейсю

03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук | А.И.Саралов

Г

1

| Пермь-1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Список принятых сокращений........................................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Биология бактерий рода Асте1оЬас(ег: краткий обзор............10

Глава 2. Детоксикация оксианионов теллура, осуществляемая

микроорганизмами...................................................................................................................20

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Материалы и методы исследования..........................................................................36

3.1. Бактериальные штаммы и условия их выращивания..........................36

3.2. Определение микробиологических и гидрохимических характеристик образцов природных и сточных вод............................37

3.3. Определение концентрации теллурита калия (К2Те03)

в среде культивирования..................................................................................................................38

3.4. Определение наличия теллура в биомассе бактерий......................40

3.5 .Определение минимальной ингибирующей концентрации.... 40 3.6.Определение показателей транспорта теллурит-анионов

клетками ацинетобактерий...............................................................................................41

3.7,Определение содержания общего внутриклеточного

глутатиона......................................................................................................................................................42

3.8.Определение концентрации клеточного бежа............................................43

3.9.Определение внутриклеточного содержания соединений

фосфора...................................................................................................................43

3.10 .Статистическая обработка результатов исследования .... 43

3.11. Химические реактивы..................................................................................................................44

Глава 4. Отношение аэробных ацетатокисляющих накопительных

культур к теллурит-оксианионам

4.1. Получение накопительных культур аэробных ацетатокисляющих ацинетобактерий.................................................. 45

4.2. Способность накопительных культур к детоксикации теллурит-оксианионов............................................................... 46

Глава 5. Характеристика штамма Acinetobacter calcoaceticus IEGM 549 и его способности трансформировать и аккумулировать теллурит-оксианионы

5.1. Морфологические и физиологические свойства штамма

A. calcoaceticus IEGM 549........................................................... 54

5.2. Способность A. calcoaceticus IEGM 549 к детоксикации теллурит-ионов........................................................................ 57

Глава 6. Особенности транспорта теллурита клетками

A calcoaceticus IEGM 549 ............................................................. 70

Глава 7. Участие глутатиона в процессе детоксикации / восстановления теллурита

7.1. Взаимодействие глутатиона и теллурита in vitro................... 80

7.2. Роль глутатиона в восстановлении теллурит-оксианионов бактериями A. calcoaceticus IEGM 549................................... 84

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................ 91

ВЫВОДЫ..................................................................................................... 96

Благодарности.............................................................................................. 98

ЛИТЕРАТУРА.............................................................................................. 99

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АДФ..........................аденозин-5 -дифосфат

АТФ..........................аденозин-5 -трифосфат

БОС...........................биологические очистные сооружения

КОЕ...........................колониеобразующие единицы на плотной

питательной среде

МПА..........................мясопептонный агар

МПБ..........................мясопептонный бульон

ПФШ ПФП_1................полифосфаты с числом мономерных единиц п, п-1

с.б............................сухая биомасса бактериальных клеток

ХПК..........................химическое потребление кислорода

ЭДТА........................этилендиаминтетрауксусная кислота

FADH2.......................флавинадениндинуклеотид восстановленный

GSH...........................глутатион, восстановленная форма

GSSG.........................глутатион, окисленная форма

MIC...........................минимальная ингибирующая концентрация

NADH........................никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

NADPH......................никотинамидадениндинуклеотид фосфат

восстановленный NEM......................... N-этилмалеимид

ODx............................оптическая плотность при длине волны х нанометров

Тег..............................детерминанта устойчивости к теллуриту

Те032".........................теллурит-оксианион

Те042".........................теллурат-оксианион

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время значительно повысился интерес к исследованиям экологического, эпидемиологического и биотехнологического значения бактерий рода Acinetobacter (Bergogne-Berezin et al., 1996). Некоторые представители Acinetobacter являются инфекционными агентами человека и животных, причем большинство изученных штаммов очень быстро приобретают устойчивость к действию известных антибиотиков (Perez-Ramos et al., 1994). В этой связи исследователи выражают опасение, что патогенные штаммы, которые сейчас являются, в основном, возбудителями внутрибольничных инфекций (в отделениях интенсивной терапии и реанимации, трансплантации, ожоговых и других) значительно расширят «сферу деятельности». Показано, что данные бактерии способны населять чрезвычайно загрязненные местообитания, например, участвовать в формировании активного ила биологических очистных сооружений (Васильев, Вавилин, 1992, Harold, 1966; Deinema et al., 1980; Amann et al., 1995). Ацинетобактерии уже используются в биотехнологических схемах удаления из сточных вод соединений фосфора и тяжелых металлов (Levin et al., 1972; Comeau, 1990). На основе лиофилизированных культур штаммов-деструкторов созданы коммерческие препараты, в частности «Экойл», для очистки нефтезагрязненных вод и почв. Применение таких препаратов особенно актуально в местностях с низкими температурами среды, где ацинетобактерии, тем не менее, способны успешно развиваться, используя углеводородные субстраты. На современном уровне развития прикладных исследований не представляет особой сложности ни в материальном, ни в технологическом плане наработка больших количеств биомассы ацинетобактерий. В перспективе предлагается применить некоторые штаммы Acinetobacter spp. для промышленного синтеза полисахаридов (Navonvenezia et al, 1995).

В связи с вышеизложенным все большее значение приобретают фундаментальные исследования в области биологии ацинетобактерий. За период с 1994 года уже проведены три международных симпозиума по указанной проблеме. Констатировано, что на сегодняшний день имеется ограниченное число данных относительно физиологических и биохимических особенностей бактерий рода Асте(оЬас(ег, которые позволяют им осваивать разнообразные экологические ниши. Интенсивные исследования в этой области в течение ряда лет ведутся в группе водной микробиологии Института экологии и генетики микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН (Саралов и др., 1995). Тем не менее, практически отсутствуют сведения о воздействии на ацинетобактерии высокотоксичных неорганических ионов, интенсивно выделяющихся в окружающую среду в результате производственной деятельности и геохимических процессов.

Целью настоящего исследования было изучение явлений, происходящих при трансформации оксианионов теллура фосфатаккумулирующей бактерией Асте(оЬас1ег са1соасеНси$.

Основные задачи работы состояли в следующем:

1. Оценить активность накопительных культур, выделенных из различных образцов природных и сточных вод Пермского промышленного узла, по отношению к оксианионам теллура.

2. Изучить особенности поглощения, восстановления и аккумуляции теллурит-анионов бактериями штамма дикого типа Асте^Ьас1ег са1соасейсиз 1ЕОМ 549 в аэробных условиях при различных режимах культивирования.

3. Исследовать биохимический механизм восстановления теллурит-анионов клетками А. сакоасеИсия ПЮМ 549.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые показано, что грам-отрицательные бактерии А. сакоасеИаля (штаммы 1ЕОМ 549 и 1ЕвМ ВТ 548) обладают способностью осуществлять восстановление

оксианионов теллура в аэробных условиях. Определены основные параметры поглощения теллурита бактериальной культурой АсакоасеНсия 1ЕОМ 549 и выявлены условия, при которых происходит наиболее активное удаление клетками бактерии токсичных ионов из среды. Выявлен вероятный биохимический механизм внутриклеточного восстановления теллурита клетками А.сакоасеИсия 1ЕвМ 549.

Данный штамм может служить основой для последующего генетического конструирования штаммов с улучшенными характеристиками. Штамм А. сакоасеНсия 1ЕОМ 549 перспективен для прогрессивной биотехнологической схемы удаления теллурит-ионов из реальных промышленных сточных вод. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Природные штаммы А.сакоасейси$, населяющие водные экосистемы с высоким содержанием органических веществ, фосфора и металлов, при гетеротрофном типе обмена в аэробных условиях обладают способностью эффективно поглощать и восстанавливать токсичные теллурит- и теллурат-анионы с накоплением внутриклеточного теллура и окрашиванием биомассы в черный цвет.

2. Оксианионы теллура проникают в клетки А.сакоасеНст 1ЕОМ 549, конкурируя с ортофосфат-анионами. Наиболее высокая скорость поглощения теллурит-оксианионов отмечается у культуры А. сакоасейст 1ЕОМ 549 во второй половине логарифмической фазы ускоренного роста; стационарная культура, накапливающая внутриклеточные полифосфаты, утрачивает способность поглощать теллурит-ионы из среды.

3. У А.сакоасеИсш 1ЕСМ 549 в детоксикации оксианионов теллура важная роль принадлежит внутриклеточному глутатиону и другим низкомолекулярным тиолам, которые способны к их восстановлению до элементного теллура.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на конференциях молодых ученых Института экологии растений и животных УрО РАН (Екатеринбург, 1996; Екатеринбург, 1998), Международной конференции «Перспективы развития естественных наук на Западном Урале» (Пермь, 1996), Международной конференции «Микробное биоразнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы» (Пермь, 1996), IV Международном симпозиуме по биологии бактерий рода Асте^ЬаЫег (Израиль, Эй лат, 1996), Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды-98» (Москва, 1998). По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 115 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы в двух главах, описания объектов и методов исследований, четырех глав экспериментальной части с обсуждением результатов, заключения и выводов. Работа иллюстрирована при помощи 10 таблиц и 13 рисунков. Список использованных литературных источников включает 163 наименования.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории промышленной экологии и водной микробиологии ИЭГМ УрО РАН и является частью исследований, проводимых по биологии фосфатаккумулирующих бактерий рода Асте1оЪас1ег. Представленный экспериментальный материал был получен в рамках работ по бюджетной теме "Изучение гидрохимических и биологических процессов биогеохимических циклов биогенных элементов в водных экосистемах7' ( № Государственной регистрации 01. 9. 70 005278) и в рамках проекта РФФИ "Микробиологическое и гидрохимическое исследование процессов вторичного загрязнения природных и сточных вод Пермского промузла" ( грант № 96-04-51043) на 1996-1998 гг.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. БИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ РОДА ACINETOBACTER. КРАТКИЙ ОБЗОР

Со времени переописания рода аэробных, грам-отрицательных, неподвижных, неферментирующих коккобацилл Acinetobacter Brisou and Prevot (Baumann et al, 1968) прошло 30 лет. Род Acinetobacter, в соответствии с современной систематикой, представлен шестью видами (Bouvet, Grimont, 1986): Acinetobacter baumannii, A.haemoiyticus, A.johnsonii, A.junnii, A.lwoffti и A.calcoaceticus. Согласно "Одобренным спискам названий бактерий" (Тер-Казарьян, 1989) был добавлен еще один вид -A.radioresistens. Тем не менее, число установленных на сегодняшний день геномных видов составляет уже 17, из которых 11 предлагается дифференцировать на фенотипическом уровне (Baginski et al, 1994).

Целенаправленные и разносторонние исследования биологии ацинетобактерий позволили выделить три основных особенности, присущие данному роду бактерий (Bergogne-Berezin et al., 1996), а именно:

- способность обитать в чрезвычайно разнообразных экологических нишах, от организмов высших животных до грунтовых вод;

- способность использовать для питания большое число субстратов, среди бактерий сравнимое только с псевдомонадами;

- способность быть толерантными к различным химическим токсикантам и антибиотикам.

Ацинетобактерии повсеместно распространены в водных и почвенных экосистемах (Baginski et al, 1994). Исследования 44 водных объектов (пруды, озера, реки) и 47 различных образцов почв показали, что представители p. Acinetobacter присутствуют в 43% водных и 40% почвенных объектах. Большинство из изолятов относится к комплексу A.calcoaceticus- A.baumannii, вторым по частоте встречаемости видом оказался A.haemoiyticus.

В отличие от А. Ьаитаппп, который наиболее часто выделяется из клинического материала (Seifert et al, 1996, Humphreys et al, 1996) A.calcoaceticus является типичным представителем естественной микрофлоры пресноводных экосистем, особенно загрязненных по фосфору (Mueller et al, 1994). Тем не менее, первоначальные представления о необычайно высокой численности ацинетобактерий несколько корректируются. В связи с этим была исследована структура бактериального сообщества активного ила аэробных и анаэробных реакторов биологических очистных сооружений (Kampfer et al, 1994а). Образцы анализировались при помощи олигонуклеотидных проб, комплементарных к консервативным участкам рибосомальной РНК бактерий a-, ß- и у-подклассов Proteobacteria, грам(+) бактерий с высоким содержанием G+C и группе флавобактерий/цитофагов. Во всех пробах доминировали представители ß-подкласса и грам(+) бактерии. Ацинетобактерии составляли лишь менее 2% от численности всех бактерий и в видовом отношении были определены как A.johnsonii, A.junnii и A.lwqffii. Гибридизация in situ выявила, однако, высокие ростовые характеристики большинства клеток ацинетобактерий в активном иле (Amann et al., 1995). В силу этого регистрируется и повышенный показатель (более 15%) отношения числа колониеобразующих единиц к общему числу бактерий в пробах рециркулируемого ила. Среди таких колоний, изолированных на богатой среде, 30-60% относится к Acinetobacter spp. Сходные данные были получены в лабораторной установке по удалению фосфора с помощью активного ила в течение 12-суточнош периода времени (Christensson et al, 1998). В посевах на плотную среду доминировал Acinetobacter, хотя анализ проб с помощью 16S РНК-гибридизации выявил, что только 9,8% бактерий относятся к грам(-) представителям у-подкласса Proteobacteria, а преобладают (31%) грам(+) бактерии с высоким содержанием G+C%. Напротив, из 149 бактериальных

изолятов, выделенных из активного ила и сточных вод на минеральной среде с ацетатом, 87 (или 58%) были идентифицированы с использованием системы тестов API 20NE как Acinetobacter (Jorgensen, Pauli, 1995).

Экология бактерий рода Acinetobacter тесно связана с особенностями прохождения жизненного цикла, продолжительность стадий которого, в свою очередь, зависит от физико-химических условий и состава среды обитания (James et al, 1995). Голодающие клетки ацинетобактерий и клетки стационарной культуры представляют собой небольшие по размерам кокки. Они характеризуются повышенной способностью прикрепляться к различным поверхностям, гидрофобным субстратам и аггрегироваться друг с другом с образованием биопленки, состоящей из плотных микроколоний (Nelson et al, 1985). Если среда обогащается органическим веществом, соединениями фосфора, серы и азота происходит быстрый переход к бациллярной морфологии клеток. При этом ацинетобактерии открепляются от субстрата или формируют диспергированную слабосвязанную биопленку. Наблюдаемый эффект отличается от выявленной ранее у ряда представителей Pseudomonas способности аггрегироваться, напротив, только при благоприятных для роста условиях среды и открепляться от субстрата в случае исчерпания питательных веществ (Lawrence, Korber, 1993). Такое поведение позволяет подвижным клеткам псевдомонад перемещаться по направлению к более предпочтительным условиям. В отличие от них не обладающие подвижностью ацинетобактерии свою стратегию выживания в неблагоприятной среде направляют на максимальное снижение активности.

Ацинетобактерии играют важную роль в биологическом удалении фосфатов из природных и сточных вод вследствие способности синтезировать повышенное количество внутриклеточных полифосфатов (Кулаев, 1975, Несбитг, 1977, Kulaev, Vagabov, 1983, Kulaev, 1990). Так, штаммы Acinetobacter sp., выделенные из аэробных систем очистки сточных вод могли аккумулировать до 25 мг фосфора �