Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия ядерного фактора транскрипции Oct-2 при дифференцировке клеток in vivo и in vitro

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия ядерного фактора транскрипции Oct-2 при дифференцировке клеток in vivo и in vitro"

РГБ ОД

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ии. В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи Панкратова Елизавета Владимировна УЖ 577-2Í8

"СИЯ ЯДЕРНОГО ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ Oct-2 ПРИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ КЛЕТОК in vivo И in vitro.

•5.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1994 год

Институт Молекулярной Биологии им. В. А- Энгельгардта, Российской Академии Наук

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ; доктор Оиологических наук, профессор ПОЛЯНОВСКИИ О.Л. кандидат Оиологических наук СТЕПЧЕНКО А.Г.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ;'доктор Оиологических наук, профессор ТИМОФЕЕВА М.Я. доктор Оиологических наук, профессор РАЗИН C.B.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт Биологии Развития им. Н.К.

Кольцова, Российской Академии Наук

л/ ///^

Защита состоится / 1994 г. в / " час. на

заседании диссертационного совета Д.002.79.01 при Институте

молекулярной Оиологии им. В.А. Энгельгардта по адресу : 117964,

Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в ОиОлиотеке Института

Молекулярной Биологии им. В.А. Згельгардта.

Автореферат разослан 1994 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Дифферепцировка клеток и морфогенез являются в вастояазе врэия активно развивающейся областью молекулярной и ¡щеточной •мологии. В ои.-озе регуляции процессов дкфференцировки клеток лежит сложный каскад иерархически соподчиненных механизмов. На самых ранних стадиях эмбриогенеза синтез эмбриональных иьдукторов регулирует экспрессию генов ядерных факторов транскрипции, которые в свою очередь регулируют экспрессию других белков.

Одними из самых "ранних" регуляторных белков являются эс1:-связываюшие белк:1 (Осй-белки/. Их экспрессия регистрируется на очень ранних стадия/ эмбриогенеза. Например, Осг-3 обнаружен в оплодотворенных ячцеклетках мыши. Анализ экспрессии Осг-факторов в онтогенезе млекопитающих показывает, что Осг-белхи экспрессируются з разных органах и тканях на всех этапах эмбриогенеза ч в постнатальныя период. Сс1-белки экспрессируются в 11НС мыиея с момента формирования нервной трубки, причем их экспрессия часто ограничена определенными отделами мозга или ядрами.

Несмотря на наличие обширного экспериментального материала об экспрессии генов ядерных факторов транскрипции в процессе дкфференцировки, в этой области остается еше много невыясненных вопросов. Для многих регулхторных генов до сих пор не определено их ¿эсто в иерархии регуляторных факторов. Леяствие эмбриональных индукторов дифференцировкм вызывает

V. I

целый комплекс изменении в клетке, регулируя экспресс«» определенных генов и, таким образом, определяет дифферешшровочную. судьбу клетки. Важно выяснить есть ли промежуточные звенья в системе диффер&;«шровочк;.>« сигнал -включение (выключение) гена. Наличие промежуточных звеньев в этой системе позволит выявить более тонкус регуляцию дифферендировки. Диффэренцировка клеток In vitro под действием индукторов является одним из немногих, если не единственным, . подходом ' для детального изучения механизмов действия индукторов на клетку.

ЦЕЛЬ -РАБОТЫ

Цеяьо данной работы являлось изучение экспрессии Oct-генов в процессе дисрфергнцировки клеток in vivo и in vitro, характеристика Oct-2 мРНК в клетках и тканях мышей, а такжз изучение влияния индукторов дифференцировки на экспрессия активного Oct-белка и Oct-2 мРНК.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы были представлены на коллоквиуме лаборатории молекулярно-генетической иммунологии Института молекулярной биологии РАН и на Конгрессе Международного Общества Биологии Развития (Австрия) 1993 г.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ По материалам диссертации опубликованы три научные работы.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация состоит из разделов: 'введение11, "обзор литературы* "Материалы и методы", 'Результаты и обсуждение', *Выводы* и 'список литературы*. Диссертация содержит 11 рисунков и 2 таблицы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Изучали экспрессии октамер-связываюдего фактора транскрипции Oct-2 в процессе аифферекцирозки клеток In vivo к in vitro, а также его экспрессию- в тканях взрослых шяаеп метолом Нозерн-гибридизашш. гибридизации на п'.стоблоте с меченным ?3' РНК- зондом. Зкспрессио активного белка Oct-2 в процесе диффзренцировки in vitro в клетках эмСриокалъноп карцинома РСИ и двух неяробластом NB41A3 и lteuro2A определяли методом задэржи подвижности а геле комплекса ЛНК-белок. Был» использованы два индуктора дифференцировки

DMSO и ретнноевая кислота. Показано., что, во-первых, РНК Oct-.---

2 присутствует зо - многих клетках, однако это не всегда приводит •к появления в клетке активного Озлка -Oct-2, способного взаимодействовать с oct-поеледовательностьо IHK (ATTTGCAT1. Во-вторых, uIKK. Oct-2 имеет сложный ■ паттерн и в разных клетках присутствует от одного до пяти разных транскриг.тоз. Cct-2 ¡¿РНК. В-третьих, в процессе дифферендироЕки in vitro актлвпыи белок Oct-2 моязт либо появляться в клетке 1РСС.4, Netirc2A), либо исчезать (ÍÍ341A3). s то время как аРНК Oct-2 присутствует в клетках кепробластоы постоянно, и пол jencTBiicu индукторов появляется или исчезав? только отдельные Oct-2 РНК транскрипты. В-четвертых, мРНК Oct-2 существует в клетке как в poly(A)+-, так и в polyl А)—-Фракции. Мы выдвинули предположение, что регуляция з:<спреесиии oct-2 в процессе дифференцировкк происходит как на уровне синтеза и процесскнга ыРНК, так и на урозне трансляции и регуляции активности уже синтезированного белка.

В эмбриогенезе Oct-2 зкспрессируется тотально' - в

V 4

центральной нервноп системе (ШСI. после рождения Oct-2

прогрессивно исчезает начиная со спинного мозга в направлен хвост-голова. Во второй половине эмбриогенеза Oct-2 та? экспрзссируется в печени и в плаценте.

В нашзсх экспериментах в процессе дифференцировки клето In vitro набор Oct-белков изменялся, причем DMS0 и ретиноев кислота по-разному "влияли не "только на морфолог дифференцирующихся клеток, но также вызывали разные изменен , з наборе oct-связывающих белков. Таким образом, в зависимое от природы индуцирующего агента в родительской клет; происходят разные изменения в наборе экспрессирукзш Oct-белков.

Во всех случаях дифференцировке клеток сопутствую избиения в наборе экспрессируюшихся Oct-белков, причем э-изменения индивидуальны для каждой клеточной линии и д: каждого индуктора.

i

; - МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЛИНИИ КЛЕТОК. Клетки эмбриональной карциномы РСС' неяробластом NB41A3 и Neuro2A, миеломы NS/0 получены t института Цитологии РАН. Клетки росли на среде DMEt. содержащей 10Z фетальной сыворотки теленка, в присутстви глвтамина и гентамицина. Клетки пассировались ' в 25* сь пластиковых флаконах INunK) в отношении (1:5) каждые 3-4 дн«

ИНЛУКШШ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ In vitro. Индукцию дифференцировк проводили, как ретиноевоя кислотой так и is DMS0. Клетки РСС

i

индуцировали тремя разными способами. 1. Культивирование

j течение 6 дней в среде, содержащей 250 нМ ретиноевоп кислоты

2.Культивирование в среде, содержащей is DMS0, в течение

б

дней. 3. Культивирование в плотно»« ¡¿снослое без пересева в течение 14 дней. Клетки неяробла^том дифференцировались под действие« is-ного DHS0 кли з присутствии 250 нМ ретиноезой кислота.

ДНК-ЗОНД. В качестве зонда для связывания о бел:« он

использовал:: дзухцепочечный двадпатишестичлекныя фрагмент.

содержащий ось-последовательность.

CCGGAAGCTGATTTGCATGTGCTGCC

ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТОВ. Клеточные экстрак.и получали кз дифференцированных и недифференцированных клеток РСС4. NB41A3, Neuro2A и NS/О. Для получения DO мхл лиэата брали -' около 10* клеток. Лизаты получали по схеме, описгинся panes. Клетки осаглали при 100 g 15 мин и промывали двагзы солевым раствором, забуференнны фосфатным буфером. Ресусяэндирэвали клетки в 4-кратном по сравнению с клеточным осадкой растворе 10 мМ трис-HCl, рН 7.9. 1 ыМ ЭДТА и 5 мМ Ш". Через 20 мин лизкровали клетки в гомогенизаторе Даукса. Добэ.зляли 4-краткый по сравнению с клеточный осадкок обНем 50 мМ трис-HCl, рН7,Э, 10 MM.WsClg , 2 мМ ДТТ, 255-ной 1вес/об5ем) сахароза и 50% гли:\ерина и осторожно перемешивали суспензи»-. Добавляли по каплям насыщенный (кейтрализованшл) раствор сульфата аммония в оСЪеме, равном оотзеыу осадка клеток. Посла ?того eme 30 мин осторожно перемешивали- агот лизат, обладающий высокой вязкостью. Так как использовал* неболыгмэ количества клеток, ДНК удаляли не скоростным центрифугированием, а обработкой ДНКазой X (40 мкг/мл) в течение 40 мин во льду. Затем добгзляли сухой, сульфат- аммония :•.

.. ? ' ' ' '

¡0,35 г/мл супернатанта). После того как сульфат аммония растворялся, добавляли 1 мкл 1 М ИаОН на 1 г сульфата аммония и размегавали суспензию еще ЗС мин. Осадок собирали центрифугированием при 15 ООО е 20 мин. Полностью сливали супернатант и ресуспендировали осадок в растворе содержащем 40 мМ трис-НС1, рК 7.9. 0.1 М КС1, 1ймМ МзС12. 0\2 МЫ ЭДТА, 2 мМ ДТТ. 15Х-НОГО глицерина в оскеме равном 1/20 до осаждения сухим сульфатом аммония. Дважды диализовали против буфера для ресуспендирования в течение 8-12 часов. Центрифугировали 10 мин 10 ООО г для удаления нерастворимого материала, разливали на маленькие порции и замораживали в жидком азоте.

ИССЛЕДОВАНИЕ ДНК-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ. Связывание ядерных белков с зондом проводили в буфере, содержащем 20 мМ Трис-НС1, рН 7.5 , 50 мМ.КСЬ, 1 мМ ЕЭТА. 52 глицерина, 0,5 мМ диэтилотреитол, 0,1-0,5 нг меченного Р^2-эонЬа (Ю** - 5-101' имп/мин) и 0,1 мкг ро 1у(сЮ1С), как описано ранее в работе Степченко и соавт. 0б£ем реакционной смеси 20 мкл, время инкубации 30 мин при комнатной температуре. Комплексы ДНК-белок регистрировали методом торможения электрофоретическои подвижности ДНК-зонда. Электрофоретическое разделение ДНК-белковых комплексов проводили в 52-ном полиакриламидном геле (30:1), приготовлеаном в 6,7 мМ буфере Трис-НС1, рН 7,5, содержащем 1 мМ ЕВТА, 3 мМ ацетат Ыа. Перед нанесением образца проводили преварительныи электрофорез!., в течение 1 часа. После этого наносили образец и проводили электрофорез в течение 2 часов при напряжении' К)'* В см с постоянной циркуляцией буфера. Гель сушили и радиоавтографировали при -7(Р С.

ПОЛУЧЕНИЕ ТОТАЛЬНОЙ И poíy(A)+ PHÜ проводили с использованием 5 М гуанидиатиоционата, кап описано ранее. ро1у(АГ-ГНК • получали на колонках с poly(dT).

ПОЛУНИНЕ КРИОГИСТОБЛОТОВ С ЗКБРКОНОЗ С ÍATKFOBAíirlHK СРОКОМ. Кулеънм дне»: беременности считался день появления вагинальной пробей у сэлки. Криогистоблоты получали, как описано ранее. Для получения криогистоблотов эмбрионов не отделяли от стенки маткн, а залип'зли вместе - эмбриональными оболочками и тканью натки, что уменьшало вероятность повреждения эмбриона при препарировании. Образцы заливали в блоки 7* желатина, приготовленном i:a растворе IX SSC. Готовые блоки хранили при -70° С. Срезн делали толкмной 22-40 «см при температуре -i о0 С и - аплицировали их на - китроцеллюлозные фильтры, предварительно вымоченные в 2Х SSC буфере и высуизнные. Затем фильтры запекали з вакуумном пкзфу при температуре 30е С в течение 2-х часов и использовали для гибридизации с Р33-меченным зондом.

НОЗЕРН-БЛОТ ГИБРИДИЗАЦИЯ И . ГИБРИДИЗАЦИЯ' НА КРИОГИСТОБЛОТАХ.Тотальную (20 икг) или+ро1у(М+ Í4-5 мкг 1 РНК ленатур,;розал1; при5 65° С в течение 10 мин и разделяли в 1 ;2%;;з.ом агарозном геле, содержащем 20* формальдегида, затем переносил:: на фильтри Hyboná С б 10Х SSC. Предгибридизациа проводили в растроре, содержащем 502 форкамида, 5XSSC, 2.5Х раствор? Ленхардта, 0,1% SÍS и 100 мкг/ил ДНК из селезенки в течечя-. 2-3 "асов прй 65° С. Гибридизацию проводили прй 52° С в to¡¿ ж растворе з течзниз ночи в присутствии меченного

Р32-РНК-зонда. Фильтры отшвали дзахды в 2XSSC, 0,12 SDS при комнатной температуре, затем з 0,1X SSC, 0.17. sfe при 62 " С и радиоазтографировали.

ЗОНДЫ ДЛЯ ГИБРИДИЗАЦИИ НА КРИОГИСТОБЛОТАХ И Н03НРН-БЛ0Т ГИБРИДИЗАЦИИ. Ранее нами была получена кДНК Oct-2 /39/, которую использовали для получения зондоб в Нозерк-блот гибридизации. Фрагмент Pst-Sma кДНК Oct-2 клонировал;; в векторе PGHH4 для получения меченой РНК Oct-2. Плазммду PGHM4 расщеплял* по сайту Saa и синтезировали Р^или Р33-меченнус in vitro антисмысловую РНК, используя Т7 РНК-полиыеразу. Меченную РНК использовали для гибридизации.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Н03ЕРН-БЛ0Т ГИБРИДИЗАЦИЯ РНК ИЗ ТКАНЕЙ ВЗРОСЛЫХ НЫИЕИ Balb/c И «¡ЕЛОМЫ HS/0.

Нозерн-блот- гибридизация на РНК из миеломных клеток NS/0 с меченный зондом выявила Oct-2-мРНК размером 13 т.н., 8 т.н., 3,6 т.н. и 2,3 т.н. (рис.1). После обработки РНКазоя А в течение 15 мин при комнатной температуре эти полосы сохраняются, но значительно ослабляются, кроме полоса 3 т.н. мРНК Oct-2 в клетках. NS/О присутствует как в тотальной, так и в polylA)-- фракции, причем гибридизация, с тотальной РНК отличается от poly<A)~ только^ наличием высокомолекулярных полос 13 ив т.н.. Полосы 6; 2,3; 1,7 т.н. присутствуют как в тотальной, так и в polyl А) - РНК

32

iрис.2). Гибридизация с меченным Р Oct-2-РНК-зондом с РНК из тканея мышеи EalVc с последующей обработкой РНКазоя А показала наличие ыРНК oct-2 в мозге (транскрипты б, 2,3 т.н.

_^ *-ч *_ч

t t ^

Рис. 1. Нозерн-блот гибридизация на РНК из клеток и тканей мышей. Гибридизация с РНК-зондом (зонд Д). 20 мкг тотальной РНК или 3 мкг poly(А4) -РНК наносили на гель. Слева указано положение маркеров. 1 - тотаявкоя' РККГ поч«(г, 2> - po-lyf;?)* -РШ почекг, 3'- тотальная1 HBf мозга, 4 - polyi А>""-РНК мозга, 5 - тотальная РНК печени, 6 -poly(АГ-РНК из NS/0.

в poly(A) -РНК и еще дополнительные полоса 1,7 и 1,3 т.н. в тотальной РНК мозга). В печени высокомолекулярная oct-2-PHK не выявляется, но присутствует мРНК размером 1,5 т.н.. В почках выявляются транскрилты размером 2,3 ; 1,7 , 1,3 т.н. В polyiAl ?НК почек присутствует в основном мРНК размером 1,3 т.н.'(рис.1).

Анализ Oct-2 РНК выявил очень сложную картину экспрессии в разных клетках к наличие большого количества гибридиэационных полос. Следует отметить, что высокая степень гомологии в семействе POU-белксв характерна только для участка, кодирующего P0U-домен. 5' и 3'-фланкирующие области слабо гомологичны и, выбранная нами зонд для гибридизации не имее^ высокой гомологии с другими POU-генами.

3 разних клетках было выявлено от одноа до пяти полос мРНК Oct-2. Такое разнообразие может быть как следствием альтернативного сплаясинга, так и следствием избирательной деградации РНК б клетке. Существование механизма альтернативного сплайсинга Oct-2-мРНК было описано ранее. Было показано наличие нескольких форм Oct-2-мРНК, с которых могут считываться зрелые Oct-2-белки, отличающиеся по размеру.

Из наших результатов видно, что существует еще один механизм образования Oct-2-мРНК с разной молекулярной массой. Нами было показано, что Oct-2-мРНК присутствует как в poly(A)^-Фракции, так и в ро1у(дГ-фракции. Это говорит о том, что в клетке существует как ро1у(А)+, так и ро1у(А)~ РНК oct-2, последняя может образовываться в результате специфического отщепления polylA) конца.

Для всех клеток характерна полоса 4,5 т.н. Мы

iZ

предполагаем, что это перекрестная гибридизация с рибосомной 28S РНК, так как Oct-2- РНК и рибосоиная 23S РНК содержат протяженные GC-богатые участки, в которых выявляется значительная гомология.

2. ЭКСПРЕССИЯ oct-2 РНК В ПРОЦЕССЕ ДИФФЕРЕН1ШР0ВКИ КЛЕТОК in vitro.

Гибридизация с тем ав РНК-зондом на РНК из дифференцированных in vitro и недифференцированных линиях клеток эмбриокарцинош РСС4, неяробластоы NB41A3 и Heuro2A, миобластомы 1.6, выявила наличие oct-2-мРНК в этих линиях клеток (рис.2).

В клетках линии NB41A3 выявляется oct-2-мРНК размером 6; 1,9; 1,7; 1,3 т.н. После дафференцировки под действием 15-го DMS0 все эти полосы сохраняются. Ретиноезая кислота стимулирует экспрессию Oct-2-мРНК в клетках NB41A3. Под действием ретиноевой кислоты появляется допслнительннй транскрипт размером 13 т.н.

В клетках линии Neuro 2А присутствует Oct-2-мРНК размером 13; 6; 2,3; .1,9; 1,7; 1,3 т.н. Ретиноевая кислота вызывает значительное уменьшение транскрипта 13 т.н.

В клетках эмбриональной карциномы РСС4 Oct-2-мРНК \ отсутствует. Дифференцировка под действием ретиноевой кислоты

приводит к появлению гибридизашганного сигнала с >

транскриптами 8; 6; 2,3; 1,9; 1,7; 1,3 т.н. Дифференцировка в 12-ном DMS0 дает тот л® эффект, вызывая очень сильную экспрессию Oct-2-мРНК.

В клетках недифференцированной миобластомы L-6 • присутствует Oct-2-ыРНК размером 2.5 т.н. Дифференцировка

Рис. 2 A.B. Нозерн-блот гибридизация РЕК из недифференцированных и дифференцированных in vitro линия клеток. На гель наносил;; по 20 мкг тотальной РНК. Гибридизация с Р -меченный oct-2 PiiK-зондом. . —— ■—Ю- - недифференцированные клетки. DM30- дифференцированные под действием DMSO. RA-дифференцированные рэтиноевой кислотой. С. Для проверки качества очистки poly!А) -РНК провели гибридизаций тоге же фильтра с посторонним ДНК-зондом, полученным на кДНК из клеток N5/0 (дорожки NS/O polylA) и total рис.2.В).

миобластомы 1-6 з плотном монослое приводит к ослабление транскрипта 2,5 т.н.

3. ЭКСПРЕССИЯ Oct-2' БЕЛКА В ПРОЦЕССЕ ДИФФЕРЕКШ1РОВКЙ КЛЕТОК In vitro.

Перед нами стояла задача определить, является ди экспрессия активного белка Oct-2 эаЕиеимоя от стадии дифференцировки клеток. В качестве модельных систем мн выбрали дифференцирозку in vitro двух линий неяробластом NB41A3 (представлена . властными клетками» и Nsuro2A (представлена более дифференцированными клетками, имеошймт». хорошо выраженные аксон и дендриты) и линию эмбриональной карциномы РСС4. В качестве индукторов диффереяцировки были выбраны ретиноевая кислота и BMSO. Показано, что ретиноевая кислота является эндогенным индуктором дифференцировки и воздействует на геном через ядерные рецепторы, а ыиыень для DMSO пока не известна, но предполагается, что DMSO нарушает стабильность клеточной мембраны и таким образом сдвигает внутриклеточный гомеостаз.

Из литературных данных известно, что в неиробластомах дифференцировка в более зрелые предшественники нейронов индуцируется культивированием в 12-ном DMSO, в эмбриональной карциноме FCC4 1й-ныя DMSO индуцирует Дифферениировку в производные всех трех зародышевых листков, тогда как под действием ретиноевоя кислоты клетки РСС4 дифференцируются преимущественно в клетки-предшественники нервной ткани.

Было показано, что Oct-2 белок экспрессируется не во всех клеточных линиях и его экспрессия зависит от стадии дифферениировки (рис.3). Белок Oct-2 экспрессируется в

iS

РИС.3. Задержка подвижности в геле комплекса ДШ'.-белок при разной концентрации неспецифической ЛКК polyidGdC). 1, 2, 3 - polytöGüO в пробе 0,5; 1; Зинг. соответственно. Анализировали клеточные экстракты. Линии клеток обозначены над фотографией. Oct-белки обозначены также как в работе Г. Шелера.

миелоаноя линии N3/0 и в недифференцированной неяробластоме N841 АЗ, а после дифференцировки клеток N341АЗ под действием ВМБО Осг-2 белок не выявляется данным методом. Неяробластома Неиго2А морфологически более диффернцирована. чем ЬШ41АЗ и в нея белок Ос1-2 присутствует в небольших количествах. Дифференцировка под действием ИМБО не приводит к изменению экспрессии Ос1-2 белка в клетках №ига2А (рис.3). .Под действием ретиноевоя кислоты в клетках №иго2А начинается сильная экспрессия Осг-1 и Ос1:-2 белков и, в данных экспериментальных условиях, вероятнс, начинается дедифференцировка клеток Неиго2А, так как под действием ретиноевоя кислоты изменяется морфология этих клеток: отростки укорачиваются и клетки становятся похожи на неиробласты.

В недифференцированных эыбриокарциномных клетках РСС4 активный Ос1;-2 отсутствует, однако дифференцировка под действием ШЗО или ретиноевоя кислоты вызывает появление активного 0сг-2 (рис.3).

Нал не удалось установить связь между экспрессией 0с1-2-мРНК и наличием активного Ос1-2-Селка в клетке. В клетках РСС4 появление 0с1-2-белка сопровождается появлением высокомолекулярных и низкомолекулярных транскриптов ос%-2 мРНК.

В клетках Иеиго2А активный белок 0с%-2 присутствует в незначительных количества^. а после дифференцировки под действием ретиноевоя кислоты Экспрессия Ос1:-2 белка значительно увеличивается, одновременно со значительным ослаблением транскрипта 13 т.н.

Исчезновение активного Ос1:-2-белка в клетках ИВ41АЗ

после дифференцировки под действием DISO не связано с. изменением Oct-2 мРНК.

Таким образом, активный Oct-2 присутствует далеко не во всех клетках, в которых есть Oct-2 мРНК.

4. ЭКСПРЕССИЯ Oct-2 Б ЭйБРИОГЕНЕЗЕ

Естественно задать вопрос, насколько экспрессия oct-2 в данных системах дифференцироЕки in vitro совпадает с тем, что имеет место при дифференцировке In vivo. Для ответа на этот вопрос нами была проведена серия гибридизация на гистобллтах эмбрионов миши начиная с шестого дня эмбрионального развития до третьего дня после рождения С рис.4 ) (6-; 6-; 10-; 14-; 17-декь эмбриогенеза; первый и третей дни после рождения). Нулевым днем считали день появления вагинальной пробки у самки. На стадии иестого дня (соответствует недифференцированным клеткам РСС4) экспрессия oct-2 мРКК на гистоблотах не выявляется. Зкспрессия oct-2 мРНК выявляется начиная с восьмого дня, на десятый день видна отчетливая гибридизация в нервней трубке. На четырнадцатый, семнадцатый день очень сильная экспрессия выявляется тотально в ЦНС, г также б печени и плаценте. На первый день после рождения экспрессия oct-2 начинает уменьшаться в ЦНС и печени, а на третий день после рождения экспрессия oct-2 мРНК исчезает з спинном мозге в направлении хвост-голсва- (рис.4). В зтот период в ЦНС начинается активная миелинизация и заканчивается дифференцировка нейронов.

Кроме эмбриональных тканей oct-2 мРНК присутствует во взрослых тканях - е иозге, печени, почках.' "Размер мРНК отличается в этих тканях, а уровень экспрессии очень невысок

Рис. 4. Экспрессия Ось-2 РНК в эмбриональных и взрослых тканях мышеи. Гибридизация на криогистоблотах эмбрионов и новорожденных мыиат Ва1Ь/с на стадия: 1 - е17, 2 - первые сутки после рождения, 3 - третьи сутки после рождения. " т.- .■:•-;■-.. плацента, ::.- печень, ■ . спинной мозг.

^л.л

Рис.5. Экспрессия осг-2 РНК в почках мышея Ва1Ь/с. к - кора почек, л - почечные лоханки.

- эияьяоттся' у схпюиюа- э- ройул фратаи». Гййридиэакиг па гистоблотах выявила экспрессию Oct-2 мРНК в основной в почечных лоханках и только точечкуо экспрессии в корхозом веществе почек (Гис.5). У нозорождекных мышат экспрессия Oct-2 «РНК выявляется таклэ в ияа* кек (сис.4).

Характер изменения экспрессии Oct-2 Оелка и oct-2 РКК в процессе индуцироваккоя лиффеицнровк;; in vitro позволяет предположить. что существует особый механизм регуляции активности Oct-2 C-zлка е клетке , хотория позволяет быстро переводить активный Oct-2 в неактивную форму. Мы предполагаем, что, кроме регуляции на уровне транскрипции . существует еще несколько механизмов регуляции экспрессии Oct-j-оелка: во-персых, на уровне процессинга мРЬК и, во-вторых, на уровне трансляции и регуляции активности синтезированного Оелка. Вероятно. ' дифферексировка ы>г:гт сопровождаться не только полным "выключением" гена, а так&о просто временной инактивацией белка. Такой мехпяизм обеспечивает более тонкую регуляцию процесса дифференцировки и не делает дифференцироЕку необратимой на кается стадии.

В нашх экспериментах в поцессе диффэренш;розки клеток in vitro набор Oct-белков изменл;;ся, причем условия дифференцировки (DMSO; ретиноевая кислота; дифференцировка в плотном монослое) по-разному влияли не только на морфологию дифференцируюшхся клеток, ко также вызывали pa3hje изменения в наборе oct-связываюших белков (рис.3). Таким обрезом, г зависимости от природы индуцирующего- агента, в родительской клетке происходят разные изменения б наборе Oct-белков. Во всех случаях дифференцировке клеток сопутствуют изменения в наборе экспрсссируэшихся Oct-беков.

выводы

1. В разных клетках выявляется от одной до пяти . гибридизационных полос Oct-2 мРНК, которая может

присутствовать одновременно, как в poly<A»+ так и в- polytAJ" форме.

2. В недифференцированной эмбриокарииноме РСС4 отсутствует oct-2 мРНК и Oct-2 белок. Дифф=ренцировка in vitro этих клеток сопровождается появлением Oct-2 белка и мРНК.

3. В низкодифферешшрованноя нейробластоме NB41A3 обнаружена oct-2 мРНК и активный Oct-2 белок. Дифферениировка этих клеток in vitro сопровождается исчезновением Oct-2 белка, при этом экспрессия oct-2 мРНК не изменяется.

4. В нейробластоме Neuro2A Oct-2 белок присутствует в миноре. Дифферениировка под действием is DMS0 не оказывает влияния на экспрессию Oct-2, а обработка поя действием ретиноевои кислоты приводит к усилению экспрессии Oct-2 белка и ослаблению oct-2 РНК транскрипта размером 13 т.н. •

5. Мы предполагаем, что регуляция экспрессии Oct-2 в процессе дифференцировки осуществляется как на уровне синтеза и процессинга РНК, так и на уровне трансляции и регуляции активности уже синтезированного белка.

е. В эмбриогенезе Oct-2 РНК экспрессируется начиная с. 8-го дня эмбрионального развития. С десятого дня начинается сильная экспрессия в нервной трубке. На 14-17 дни наблюдается тотальная экспрессия в ЦНС, а также в печени и плаценте. На первып-третий дни после рождения экспрессия Oct-2 в UHC исчезает в направлении от хвоста к голове.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю доктору, биол. наук О.Л. Поляновскому за обшее научное руководство и труд по чтению и редактированию диссертации.

Особую благодарность автор выражает своему научному руководителю кандидату биол. наук Степче::ко А.Г. за обучение навыкам работы в области молекулярной биологии, за научное руководство и большую помощь в работе.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕЛЕ- ДИССЕРТАЦИИ.

1. Панкратова Е.В., Сытина Е.В., Степченко А.Г./ Экспрессия Oct-2 белка в процессе дифференцировки клеток in vivo и in . vitro./ Молекулярная Биология, 1993, Т. 27, С. 617-625.

У

2. Pai&rato»ä Е.'*., Sytina E.V., Stepchenko A.C./ Cell differentiation in vitro and the expression of Oct-2 protein and oct-2 ENA./ FEB5 Letters, 1994, 338, 81-B4.

3. Pankratova E.V., Sytina E.V., Stepchenko A.G./ Nuclear transcription factor Oct-2 and cell differentiation./ 12th International Congress of the International Society of Development Biologists, Vienna, Austria, August, 1993.