Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение адаптивных реакций клеток эпителия кишечника при культивировании в условиях микробиореактора

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение адаптивных реакций клеток эпителия кишечника при культивировании в условиях микробиореактора"

ТРУШКИН Евгений Владиславович

ИЗУЧЕНИЕ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ КЛЕТОК ЭПИТЕЛИЯ КИШЕЧНИКА ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В УСЛОВИЯХ МИКРОБИОРЕАКТОРА

03.03.01 - Физиология 03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2013

~ 4 ИЮЛ 2013

005531160

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной физиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук и ООО Научно-технический центр «БиоКлиникум».

Научный руководитель: Доктор биологический наук, профессор,

член-корреспондент РАН Александр Григорьевич Тоневицкий

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории стволовых клеток человека Института экспериментальной кардиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Габбасов Зуфар Ахнафовнч

Доктор медицинских наук, профессор, зав. лабораторией протеомики отдела Молекулярно-клеточной биомедицины Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации -Института медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ -ИМБПРАН)

Ларина Ирина Михайловна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение «Научно-исследовательский

институт нормальпой физиологии им. П. К. Анохина» Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится » 'Сг^ОїіЛ. 2013 года в/Р "часов на заседании Диссертационного совета Д 002.111.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации - Института медико-биологических проблем Российской академии наук, по адресу: 123007, г. Москва, ш. Хорошевское, 76-а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - ИМБП РАН. Автореферат разослан «

Рі » >Л-<ХиХ-_2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

М.А. Левинских

Актуальность исследования

Основная функция эпителия тонкого кишечника заключается в формировании гисто-гематического барьера, отделяющего соединительную ткань кишечника от потенциально вредных соединений, присутствующих в просвете кишки, а также препятствующего попаданию этих веществ в кровоток [Уголев, 1991]. Плотные контакты, образующиеся в апикальной области эпителия между соседними клетками, формируют структурный и функциональный барьер, который препятствует парацеллюлярному транспорту веществ. Нарушение плотных контактов наблюдается при ряде воспалительных заболеваний заболеваний кишечника.

Помимо барьерной функции, эпителиальные клетки кишечника выполняют транспортную. В тонком кишечнике осуществляется всасывание большинства жизненно-важных для организма веществ и перорально принимаемых лекарственных средств. Транспорт осуществляется пассивно, активно и путем пиноцитоза.

Клетки эпителия кишечника используются в качестве объекта исследований, направленных на изучение процессов всасывания биологически активных молекул и ксенобиотиков в тонком кишечнике человека, а также влияния различных физиологических факторов на барьерную функцию кишечного эпителия [Mathieu, 2005; Sambuy, 2005].

При этом наиболее распространенным подходом является культивирование клеток кишечника в виде монокультуры. Недостатком такого подхода является значительное упрощение модели по сравнению с нормальной стенкой кишечника, так как практически не удается воссоздать физиологичный ток питательной среды под базальной мембраной, что в значительной мере влияет на процессы активного или пассивного транспорта тех или иных веществ через эпителий тонкого кишечника. Распространенным подходом к решению данной проблемы является использование микробиореакторов (МБР), позволяющих моделировать и поддерживать ток питательной среды.

В настоящее время существует два основных типа МБР: статические и динамические [Biffï, 2012; Young, 2010]. В МБР статического типа отсутствует циркуляция среды, а питание клеток осуществляется по механизму диффузии через мембрану, на которой культивируются клетки [Zhang, 2009]. В МБР динамического типа микронасосы обеспечивают циркуляцию питательной среды в проточном и (или)

замкнутом режимах [Уоггь 2009]. Недостатком существующих МБР динамического типа является высокая скорость потока культуральной среды по микроканалам, соединяющим ячейки, в которых культивируются клетки, что приводит к постоянному гидродинамическому сгрессированию клеток, в результате чего их жизнеспособность необратимо снижается [1шига, 2010].

Остаётся не выясненным вопрос, как культивирование в микробиореакторах влияет на функциональную активность клеток эпителия кишечника: остается ли она а пределах нормы, имеет ли место стрессирование клеток, в какой мере клетки, культивируемые в таких условиях могут быть использованы как модель нормального эпителия кишечника.

В этой связи целью исследования было изучение молекулярно-генетических особенностей функционального статуса клеток эпителия кишечника человека при их культивировании в условиях микробиореактора. Для решения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1) Разработка микробиореактора динамического типа для культивирования клеточной модели ткани эпителия кишечника;

2) Изучение процесса диффузии маркерных молекул при микроциркуляции среды в условиях микробиореактора;

3) Получение стабильного монослоя дифференцированных клеток линии Сасо-2;

4) Экспериментальное обоснование выбора референсных генов для оценки изменения экспрессии генов в процессе дифференцировки клеток линии Сасо-2;

5) Исследование экспрессии генов белков-транспортеров в дифференцированных клетках линии Сасо-2;

6) Сравнение уровня экспрессии генов белков теплового шока при культивировании клеток Сасо-2 в условиях микробиореактора и в планшете;

7) Характеристика апикально-базальной поляризации клеток линии Сасо-2 при культивировании в условиях микробиореактора.

Научная новизна. Научная новизна исследования заключается в том, что разработан прибор, позволяющий проводить культивирование клеточного эквивалента эпителия тонкого кишечника в условиях непрерывной циркуляции питательной среды.

Впервые показано, что при дифференцировке клеток Сасо-2 гены SF3A1, SDHA и ТВР, относящиеся к группе референсных генов, характеризуются наиболее стабильным уровнем экспрессии.

Культивирование клеток линии Сасо-2 в условиях микробиореактора не приводит к изменению экспрессии белков семейства теплового шока. Клетки линии Сасо-2, культивируемые в микробиореакгоре динамического типа, имеют апикально-базальную поляризацию характерную для клеток эпителия тонкого кишечника in vivo в норме.

Практическая значимость исследования. Создан и апробирован (Патентная заявка от 21 ноября 2012 г. №2012149565) микробиореактор, позволяющий культивировать клеточные эквиваленты тканей млекопитающих. Выбраны референсные гены, которые позволяют более точно оценивать экспрессию целевых генов при дифференцировке клеток Сасо-2. Показана возможность культивирования клеток линии Сасо-2 в условиях микробиореактора и потенциальная применимость клеток Сасо-2, культивируемых в микробиореакгоре, в качестве эффективной модели для исследования in vitro процессов активного и пассивного транспорта биологически активных веществ и ксенобиотиков через стенку тонкого кишечника.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Микробиореактор позволяет поддерживать непрерывный ток среды под базальной поверхностью клеток, обеспечивая наличие градиента концентраций веществ между апикальной и базолатеральной сторонами эпителия кишечника;

2) Гены SF3A1, SDHA и ТВР характеризуются более стабильным уровнем экспрессии при дифференцировке клеток Сасо-2, чем обычно упоминаемые в литературе;

3) Культивирование клеточной линии Сасо-2 в микробиореакгоре не приводит к стрессированию клеток;

4) Клетки линии Сасо-2, культивируемые в микробиореакгоре, имеют апикально-базальную поляризацию характерную для клеток эпителия тонкого кишечника in vivo в норме.

Структура и объем диссертации. Диссертация написана по традиционному типу, содержит 137 страниц машинописного текста. Состоит из введения, обзора

литературы, материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает в себя 204 источника. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 16 рисунками.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, в т.ч. 6 в журналах, рекомендованных ВАК.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на международных конференциях 3D Cell Culture Conference (Цюрих, Швейцария, 2012), SPEC 2012 - Shedding New Light on Disease (Чинг Май, Таиланд, 2012), AXLR8-3 workshop report (Берлин, ФРГ, 2012), совместном заседании лабораторий Молекулярной физиологии, Нейроиммунопатологии и Регуляции экспрессии генов ФГБУ «НИИОПП» РАМН (16 апреля 2013 г.) и секции ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН (07 мая 2013 г.).

Материалы и методы исследования

Подготовка микробиореактора к работе

Микробиореактор (МБР) представляет собой комплекс, который позволяет обеспечить культивирование клеточного эквивалента эпителия тонкого кишечника, дает возможность работы с поляризованными клетками и моделирования микроциркуляции посредством поддержания заданной скорости потока среды культивирования, что также способствует установлению градиента концентраций между апикальной и базальной поверхностями на определённом уровне.

Нами был разработан микробиореактор позволяющий проводить культивирование клеточных эквивалентов тканей в мембранных вставках. Клетки находятся на внутренней поверхности вставки, внешняя поверхность омывается кулиуральной средой. Перфузия проводится в замкнутом контуре и обеспечивается микронасосом. Все перечисленные компоненты интегрированы в биочип, основой которого служит стандартное предметное стекло (Рисунок 1). Параметры культивирования задает блок управления (БУ) МБР, подключаемый к биочипу.

Перед использованием подключали БУ МБР к магистрали сжатого воздуха и вакуума. Значения положительного и отрицательного давления устанавливали на уровне +50 и - 50 кПа соответственно.

В исследовании использовали биочип с возможностью культивирования клеток в ячейке с замкнутой циркуляцией культуральной среды. Биочип заполняли культуральной средой, помещали мембранную вставку с клетками в биочип, включали режим циркуляции среды. Скорость циркуляции среды устанавливалась на уровне 5 мкл/мин.

Культивирование клеточной линии Сасо-2

Клетки Сасо-2 были любезно предоставлены Уве Марксом, Технический Университет г. Берлин (Германия). Для культивирования использовалась среда МЕМ с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 0,1 M заменимых аминокислот и 0,1% пенициллин/стрепомицина в С02-инкубаторе при температуре 37°С. Для приготовления среды использовались реагенты производства фирмы Gibco (США). Дифференцированные клетки линии Сасо-2 получали путем культивирования монослоя в течение трёх недель. При этом замену среды производили один раз в два дня.

Создание монослоя дифференцированных клеток Сасо-2 на мембранной вставке

При создании модели для исследования транспорта веществ через эпителий кишечника клетки Сасо-2 высевали с плотностью 50 тыс. клеток на мембранную вставку площадью 0,143 см2 и диаметром пор 0,4 мкм. Культивировали в течение 21 дня после чего оценивали проницаемость флуоресцирующего белка EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) через монослой дифференцированных клеток Сасо-2. Для этого в апикальный отсек мембранной вставки вносили 100 мкл полной питательной среды, в которой растворяли EGFP до концентрации 1 мкМ. Культивировали 2 часа в С02-инкубаторе при температуре 37°С, после чего вычисляли массу белка в базолатеральном отсеке.

Структура белка EGFP представляет из себя ^-бочонок размером 2 на 4 нм и обеспечивает повышенную устойчивость к действию различных факторов (рН, температура, протеазы). Молекулярная масса EGFP равна 27 кДа, максимум возбуждения Хвозб = 490 нм, максимум эмиссии = 509 нм. Белок был любезно предоставлен К.А. Лукьяновым, Институт биоорганической химии им. М.М. Овчинникова и Ю.А. Шемякина РАН. Транспорт молекулы такого размера через эпителий тонкого кишечника возможен только по парацеллюлярному механизму транспорта, поэтому через монослой дифференцированных клеток Сасо-2 со

сформировавшимися плотными межклеточными контактами EGFP практически не проникает.

Целостность монослоя оценивали методом измерения трансэпителиального сопротивления с помощью прибора EVOM (World Précision Instruments, Inc., США). Для дальнейших экспериментов использовали трансвеллы с клетками, трансэпителиальное сопротивление которых превышало 300 П-см2, что соответствует значению для монослоя дифференцированных клеток Сасо-2 со сформировавшимися плотными межклеточными контактами.

Выделение РНК

Клетки (в количестве от 200 тыс. до 6 млн. штук) в мембранных вставках или флаконах промывали стерильным буфером PBS и добавляли 700 мкл лизис буфера RLT (Qiagen). Выделение РНК проводили с помощью коммерческого набора RNeasy Mini Kit (Qiagen). Все препараты РНК в процессе выделения обрабатывались раствором DNase I (Qiagen).

Концентрацию выделенных образцов РНК определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop 1000 (Thermo Scientific). Качество образцов РНК контролировали с помощью капиллярного электрофореза на приборе BioRad Experion (BioRad, США). В дальнейшем использовали образцы для которых значение параметра RQI (RNA Quality Indicator) было выше 9.

ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени

В работе использовался ПЦР-Микс «2,5х реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ» производства ООО «Синтол» (Россия). Все праймеры были синтезированы фирмой «Синтол» (Россия) и очищены в ПААГ.

В качестве матрицы для ПЦР использовали комплементарные цепи ДНК (кДНК), полученные из выделенных образцов РНК в результате проведения обратной транскрипции набором реактивов QIAGEN QuantiTect Reverse Transcription Kit. Программа постановки ПЦР реакции в режиме реального времени включала 10 минут денатурации при 94°С в течение 10 минут, 50 циклов денатурация (94°С, 20 сек) -отжиг (62°С, 10 сек) - элонгация (72°С, 30 сек). Для каждой пары праймеров реакцию проводили одновременно в трех лунках на одном планшете.

Для каждого из шестнадцати потенциальных референсных генов АСТВ, GAPDH, GUS, RPLPO, ТВР, PSMC4, PUM1, MRPL19, SF3A1, HPRTI, RPS18, UBC, В2М, HSPC3,

БОНА, У\УНА2 были подобраны пары праймеров. Для генерации праймеров были использованы программы РптегЗ (у. 0.4.0) и Рптег-ВЬЛ8Т. Энергию образования вторичных структур оценивали анализом последовательностей олигонуклеотидов в программе 0^оАпа1у2ег 3.1.

В процессе дифференцировки клеток Сасо-2 наибольшей стабильностью экспрессии обладают гены £Р.Ш б'-ААССОТССАСТСТССАТСАААОТ-З', Я: 5'-СССАТОТГСТАОТААСССАОТОАО-З'), ЗОНА (Б: б'-ТССТОСТСОТТСТСТСАТТА-3', Я: 5'-АССТТТССССТТСАСТСТТ-3') и ТВР (Р: 5'-

ТТСООАОАСТТСТССОАТГСТА-З', Я: 5'-ТСаАСТСТТСТТСАСТСТТООС-3'). где Б

- обозначение прямого праймера; Я - обозначение обратного праймера.

Последовательности праймеров для генов белков стрессового ответа и белков, специфически экспрессирующихся в клетках эпителия тонкого кишечника подбирали аналогичным образом.

Для расчета нормированного уровня экспрессии генов использовали формулу [НеИетапв I, 2007]:

где Е - эффективность ПЦР, a Ct - значение порогового цикла для соответствующего гена.

Методы оценки стабильности экспрессии генов

Для выбора наиболее стабильных референсных генов оценивали экспрессию 16 генов-кандидатов в недифференцированных и дифференцированных клетках линии Сасо-2 двумя методами: ACt [Silver N., 2006] и geNorm [Vandesompele J., 2002]. Гены с наиболее стабильной экспрессией использовали в качестве референсных.

Полногеномный транскриптомный анализ

Способ проведения полногеномного транскриптомного анализа и интерпретации полученных результатов был подробно описан нами ранее [Кашкин, 2010]. На один анализ необходимо не менее 100 и не более 500 нг тотальной РНК образца. На первой стадии проводили обратную транскрипцию с использованием случайных праймеров, содержащих Т7-промотор (WT Expression kit, Ambion). Затем проводили обработку RNase Н (WT Expression kit, Ambion, США), синтезировали вторую цепь кДНК (WT

Expression kit, Ambion, США) и проводили in vitro транскрипцию на протяжении 16 часов. Полученную кРНК очищали, проверяли её качество и количество на соответствие требованиям протокола. 10 мкг очищенной кРНК использовали во втором раунде обратной транскрипции со случайными праймерами и смесью dNTPs, содержащей dUTP (WT Expression kit, Ambion, США). Смесь обрабатывали RNase Н. После этого проводили очистку вторичной кДНК (WT Expression kit, Ambion, США), оценивали ее качество и количество. 5,5 мкг вторичной кДНК использовали для фрагментации. Полученные фрагменты одноцепочечной вторичной кДНК метили с помощью фермента TdT и DNA tabling reagent (WT Terminal labeling kit, Affymetrix, США). Для гибридизации на микрочип (GeneChip Human Gene 1.0 ST Arrays, Aflymetrix, США) использовали 27 мкл полученной смеси меченных одноцепочечных фрагментов ДНК. Гибридизацию проводили в течении 18 часов в печи для гибридизации GeneChip Hybridization Oven 640 (Affymetrix, США) при 45°С и скорости вращения 60 rpm. После гибридизации микрочипы промывали, прокрашивали с помощью GeneChipFluidics Station 450 (Affymetrix, США), сканировали в сканнере GeneChipScanner 3000 7G (Aflymetrix, США).

Анализ содержания пуриновых метаболитов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ

Образцы культуральной среды анализировали на предмет содержания веществ методом ОФ-ВЭЖХ-УФ с использованием хроматографической системы Agilent 1260 Series (Agilent Technologies, США). Разделение осуществляли на обращено-фазовой хроматографической колонке Zorbax ODS Eclipse Plus (250 x 4,6 мм, размер частиц сорбента 5 мкм) (Agilent Technologies, США). Регистрацию сигналов и определение метаболитов осуществляли с помощью высокочувствительного диод-матричного детектора G1315D (Agilent Technologies, США) на длине волны 260 нм. Данные анализировали с использованием программного обеспечения, предоставленного производителем к данной хроматографической системе.

Для построения калибровочных кривых в физиологическом диапазоне концентраций гипоксантина стандартную навеску метаболита массой 1 мг растворяли в 1 мл буфера PBS, перемешивали до получения гомогенного стандартного раствора известной концентрации.

В результате десяти последовательных двукратных разбавлений полученного стандартного раствора получали калибровочные образцы с известными концентрациями метаболитов в диапазоне 1 мкг/мл — 1000 мкг/мл.

Полученные растворы фильтровали на стерильном целлюлозном фильтре с размером пор 0,22 мкм (Costar, Corning Inc., США). Калибровочные образцы помещали в хроматографическую кювету (Agilent Technologies, США) и анализировали с помощью описанной выше методики.

Интегральную площадь пика определяли с помощью поставляемого в комплекте с хроматографической системой программного обеспечения. Калибровочные кривые строили в виде зависимости интегральной площади пика от известной концентрации калибровочного раствора и аппроксимировали линейной функцией с условием пересечения оси абсцисс в точке 0.

Статистическая обработка результатов исследования

Для установления статистически значимых различий проводили анализ с использованием критерия Манна-Уитни. Для выявления достоверности различий сравниваемых средних величин, изменяющихся между группами образцов, использовали 95%-й доверительный интервал и значение достигаемого уровня значимости р < 0,05.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» (Государственный контракт № 16.522.11.2015) и с использованием оборудования ЦКП "Современные оптические системы" НЦКЭМ СО РАМН и ЦКП «Постгеномные и метаболомные методы исследования в молекулярной биологии» ООО НТЦ «БиоКлиникум» в рамках ГК 16.522.11.7057.

Результаты исследования и их обсуждение

Микробиореактор для культивирования моделей тканей млекопитающих

Разработана рабочая конструкторская документация и создан микробиореактор, позволяющий обеспечить длительное культивирование клеточных эквивалентов тканей (порядка 100 тысяч клеток) в биочипах (Патентная заявка от 21 ноября 2012 г. № 2012149565).

Биочип представляет собой предметное стекло, на котором находится слой эластичного полимера, полидиметилсилоксана (ПДМС), содержащий микрофлюидную структуру. ПДМС обладает высокой газопроницаемостью, что позволяет поддерживать газообмен на достаточном уровне. Слой ПДМС приклеен к пластине из поликарбоната, обеспечивающей механическую прочность биочипа. Микронасос имеет цикл работы, состоящий из пяти тактов, в течение которого среда поступает в рабочую камеру через один клапан и изгоняется через другой (Рисунок 1).

Ячейки представляют собой мембранные вставки, на внутреннюю сторону мембраны которых нанесены клетки. Внешние поверхности мембран ячеек связаны между собой микрофлюидными каналами высотой 100 мкм и шириной до 1 мм. В структуру каналов интегрирован микронасос и микроклапаны, обеспечивающие перфузию и управление током среды. Каждый микронасос состоит из двух микроклапанов и рабочей камеры. Микронасос имеет цикл работы, состоящий из пяти тактов, в течение которого среда поступает в рабочую камеру через один клапан и изгоняется через другой.

Управление микроклапанами и рабочей камерой микронасоса производится пневматически, что исключает влияние электромагнитных полей на культивируемые модели. Подачу воздуха для пневматического управления с заданным повышенным или пониженным относительно атмосферного давлением обеспечивает блок управления, к которому может быть подключено до четырех биочипов одновременно.

На основе экспериментальных данных и численного моделирования деформации микроклапанов были подобраны рабочие положительное и отрицательное давления, обеспечивающие герметичное закрытие микроклапанов и перфузию с расходом в диапазоне от 0,2 до 20 мкл/мин. Пневматическая схема прибора обеспечивает отсутствие флуктуаций среды, не связанных с работой микронасоса, что было подтверждено экспериментом с движением флуоресцентных частиц в микроканалах.

Апикальный отсек

Базолатеральный отсек

Мембранная вставка

Монослой дифференцированных клеток

Поток жидкости

¿шЛ

+

EZL-JZ

Т2Ш:

3-е

3QC-

JZ3

п

Т5

3-е

+

—_+_+

—ЗСН Ц Ц"Т*—

Рисунок 1 - Схематичное изображение Т1-Т5 - фазы работы насоса.

клеточной

биочипа.

При динамическом культивировании (то есть при постоянном перемешивании среды) возможно поддержание необходимой скорости потока жидкости, что приближает такую модель к условиям in vivo. Кроме того, в таком режиме культивирования метаболиты, продуцируемые клетками отводятся быстрее, чем в случае культивирования в статических условиях, где этот процесс осуществляется за счёт диффузии.

Для доказательства этого утверждения в апикальный отсек трансвелла вносили раствор флуоресцирующего белка EGFP. Масса белка EGFP, диффундировавшего

через мембрану вставки в динамических условиях культивирования (чип) составила 67% от изначально внесённого в апикальный отсек, что превышает количество белка мигрировавшего через мембрану при культивировании в плашке (21%) более чем в 3 раза. По-видимому, это связано с тем, что в динамических условиях культивирования происходит более быстрое перемешивание среды, что позволяет поддерживать высокий уровень градиента концетраций между внутренним и внешним объёмом трансвелла, чего не происходит в условиях более медленного диффузионного перемешивания при культивировании в плашке.

Таким образом, в нашей стране впервые разработан микробиореактор динамического типа, который позволяет моделировать микроциркуляцию посредством поддержания градиента концентраций между апикальной и базальной поверхностями мембраны на заданном уровне. Особенностью данного устройства является уникальная конструкция перистальтического микронасоса, обеспечивающая движение культуральной среды со скоростью от 0,2 до 20 мкл/мин, а также снижение силы гидродинамических ударных воздействий на клетки.

Получение монослоя дифференцированных клеток Сасо-2

Нами было показано, что 21 день инкубации клеток Сасо-2 приводит к формированию дифференцированного слоя клеток (Рисунок 2), которые экспрессируют присущие энтероцитам тонкого кишечника белки.

При создании модели для исследования транспорта веществ через эпителий кишечника клетки Сасо-2 культивировали на поликарбонатных мембранных фильтрах с диаметром пор 0,4 мкм в течение 21 дня.

Рисунок 2 - Клеточная линия Сасо-2. А - недифференцированная культура; Б - через 21 день дифференцировки. Увеличение 20х.

Культивирование клеток на проницаемых подложках с микропористой мембраной стало стандартным методом для изучения поляризованных, в частности, эпителиальных клеток, так как в этих условиях клетки могу поглощать и секретировать молекулы как на базальной, так и на апикальной поверхностях. В этом случае метаболическая деятельность осуществляется более естественным образом и клетки существуют в условиях приближенных к естественным.

Был проведен анализ конфлуентности полученного монослоя дифференцированных клеток Сасо-2 на проницаемой мембране вставки. Для оценки проницаемости монослоя в апикальный отсек мембранной вставки вносили раствор флуоресцирующего белка ЕвРР, с молекулярной массой 27 кДа. Диффузия белка в базолатеральный отсек мембранной вставки моделирует процесс пассивного транспорта через эпителий тонкого кишечника. За два часа культивирования масса белка, диффундировавшего в базолатеральный отсек мембранной вставки без клеток составила 21% от изначально внесенного количества, в то время как диффузия через монослой дифференцированных клеток Сасо-2 существенно ниже (3%), что косвенно свидетельствует о наличии плотных контактов между клетками.

Далее проводили оценку степени конфлуэтности и целостности монослоя методом измерения трансэпителиального сопротивления с помощью прибора ЕУОМ. Данный метод основан на измерении проницаемости клеточных моделей тканей для ионов и электронов.

Выявлено, что внесение в мембранную вставку различного количества клеток (от 5 до 40 тыс.) практически не влияет на величину трансэпителиального сопротивления и составляет около 130 П-см^. При дифференцировке монослоя значение сопротивления существенно увеличивается, что согласуется с литературными данными [АЛигввоп, 1990]. Для дальнейших экспериментов использовали мембранные вставки с клетками трансэпителиальное сопротивление которых превышало 300 П-см^.

Таким образом, нами было показано, что полученный монослой дифференцированных клеток Сасо-2 является целостным.

Известно, что многие вещества вызывают разрушение плотных контактов между энтероцитами, что приводит к увеличению проницаемости различных веществ через стенку кишечника и снижению значения трансэпотелиального сопротивления. Было

15

доказано, что воздействие ЭДТА приводит к снижению трасэпителиального сопротивления (с 460 до 140 il-см2) дифференцированных клеток Сасо-2, что может быть свидетельством разрушения плотных контактов.

Таким образом, полученная модель на основе дифференцированных клеток Сасо-2 адекватно воспроизводит свойства эпителия тонкого кишечника, характерные для физиологической нормы.

Выбор референсных генов для проиесса дифференцировки клеток Сасо-2

В процессе дифференцировки клеток Сасо-2 изменяется экспрессия генов. Чтобы ее оценить, необходимо было выявить т.н. референс-гены, т.е. те, экспрессия которых остается на постоянном уровне. Из литературы известны гены-кандидаты на роль референсных: АСТВ, GAPDH, GUS, RPLPO, ТВР, PSMC4, PUMl, MRPL19, SF3A1, HPRT1, RPS18, UBC, В2М, HSPC3, SDHA, YWHAZ. Оценка стабильности референс-генов методами методы ACt и geNorm дала приблизительно одинаковые результаты. В отличие от описанного в литературе, в качестве референсных нами были выбраны гены SF3A1 (кодирует субъединицу 1 сплайсинг фактора ЗА), SDHA (субъединица А сукцинатдегидрогеназного комплекса) и ТВР (ТАТА-блок связывающий белок), значения стабильности экспрессии которых равны 1,7, 1,8 и 1,8 относительных единиц соответственно при использовании для расчёта метода ACt, и 1,6, 1,7 и 1,7 относительных единиц соответственно при использовании для обсчёта метода geNorm. Они характеризуются более стабильным уровнем экспрессии, чем обычно упоминаемые в литературе в качестве референсных АСТВ (ß-актин) и GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа), стабильность экспрессии для которых равняется 1,9 и 2,0 (метод ACt) или 1,8 и 1,8 (метод geNorm) относительных единиц соответственно.

Было решено сравнить результаты оценки изменения экспрессии генов белков специфически экспрессирующихся в эпителии тонкого кишечника, а именно генов: SI, кодирующего фермент сукраза-изомальтаза; SLC11A2 (второй член из семейства транспортёров ионов двухвалентных металлов), ANPEP (аланиламинопептидаза), MYOIA (миозин) и PPARG (гамма-рецептор активатора пролиферации пероксисом) при нормировании на гены АСТВ и GAPDH, либо — SF3A1, SDHA и ТВР.

Величину изменения уровня экспрессии генов определяли из отношения NRQ, рассчитанного для дифференцированных клеток, к NRQ, рассчитанному для

недифференцированных клеток Сасо-2. Использование в качестве референсных генов АСТВ и йАРЬН сопровождается существенным снижением точности определения по сравнению с нормировкой на гены 57\?Л /, ЯйНА и ТВР (различие в экспрессии до 1,8 раз) и может привести к искажению результатов, поэтому в дальнейшем в качестве референсных использовались гены 8РЗА1, ЗОНА и ТВР.

Было продемонстрировано, что при нормировании гены БРЗА1, БОНА и ТВР наибольшее увеличение экспрессии (66 раз) наблюдается для гена 5/. Экспрессия генов 8ЬС11А2 и АЫРЕР увеличивается в 17 и 24 раза, соответственно. Для генов МУ01А и РРАЯв экспрессия изменяется в 5,5 и в 4 раза. Увеличение экспрессии данных генов также подтверждает дифференцировку клеток Сасо-2.

Полногеномный транскриптомный анализ дифференцированных клеток Сасо-2

Так как клетки Сасо-2 при определенных условиях проявляют морфологические и функциональные свойства, аналогичные таковым у энтероцитов, то нами были изучены транскриптомы недифференцированных и дифференцированных в течение трёх недель клеток линии Сасо-2.

Полногеномный анализ транскриптома показал, что в процессе дифференцировки достоверно изменяется экспрессия 835 генов. Увеличение экспрессии наблюдается для 606 генов, из них: для 389 генов рост составил 1,5-4 раза, для 201 гена в 4 - 16 раз, а экспрессия 15 генов увеличилась в 16-60 раз.

Снижение уровня экспрессии было зафиксировано для 209 генов: для 107 генов наблюдалось снижение экспрессии в 1,5-4 раза, для 95 генов - в 4-16 раза, для 27 генов в 16-250 раз.

В том числе были обнаружены достоверные изменения уровня экспрессии 42 генов (повышение экспрессии 32 генов и снижение экспрессии 10 генов), кодирующих транспортерные молекулы, из которых 37 относятся к семейству 8ЬС (Семейство транспортёров растворённых веществ) (Таблица 1).

Таблица 1 - Изменение экспрессии белков-транспортеров в клетках Сасо-2 в процессе дифференцировки.

Ген Относительное значение экспрессии (log2) P Кратность изменения

Недифференцированные клетки Дифференцированные клетки

SLC5A12 5,55±0,2 9,6±0,1 0,000 4,05

SLC5A9 7,7±0,5 9,9±0,1 0,008 2,2

SLC7A5 10,3±0,2 8,2±0,1 0,001 -2,1

АВССЗ 8±0,8 10±0,1 0,042 2

SLC38A6 6,3±0,2 8±0,2 0,004 1,7

SLC23A1 10±0,4 11,7±0 0,014 1,7

SLC38A4 4,5±0,3 6,1±0,7 0,032 1,6

SLC22A9 5±0,1 6,6±0,4 0,006 1,6

SLC22A9 5±0,1 6,6±0,4 0,006 1,6

SLC7A1 9,5±0,1 8,1±0,1 0,001 -1,4

SLC44A5 6,7±0,1 8,1 ±0,1 0,001 1,4

SLC2A3 12,3±0,1 11±0,7 0,038 -1,3

SLC2A9 5,6±0,2 6,8±0,1 0,003 1,2

ABCG2 7,5±0,2 6,2±0,4 0,014 -1,3

SLC6A12 6,4±0,1 7,5±0,3 0,009 1,1

SLC30A1 7,5±0,4 8,6±0,3 0,042 1,1

SLC27A2 9,6±0,4 10,6±0,2 0,044 1

SLC10A2 4,8±0,1 5,9±0,5 0,029 1,1

SLC2A1 12,7±0,1 11,6±0,3 0,009 -1,1

SLC27A3 7,6±0,1 8,6±0,3 0,015 1

SLC7A9 8±0,1 8,9±0,2 0,008 0,9

SLC22A18 8,5±0,2 9,4±0,1 0,008 0,9

FCGRT 9,1 ±0,2 10±0,3 0,038 0,9

АТР8В1 8,7±0,3 9,5±0,2 0,032 0,8

SLC39A1 9,9±0,1 9,1±0 0,003 -0,8

SLC37A4 9,7±0,1 10,5±0,4 0,025 0,8

PDZK1 8,9±0,2 9,7±0 0,011 0,8

SLC39A5 10,6±0,2 11,4±0,2 0,029 0,8

SLC44A3 9,8±0,1 10,6±0,1 0,006 0,8

SLC2A14 8,4±0,2 7,7±0,3 0,048 -0,7

SLC29A4 9,3±0,2 10±0 0,020 0,7

SLC22A18AS 5,6±0,1 6,3±0,3 0,039 0,7

SLC16A1 8,5±0,1 7,8±0,1 0,006 -0,7

SLC1A5 10,8±0,1 10,2±0 0,001 -0,6

SLC30A2 5,4±0,1 6±0,1 0,003 0,6

SLC35D1 6,6±0,2 7,3±0 0,032 0,7

SLC30A4 5,2±0 5,8±0 0,000 0,6

Окончание таблицы 1

Ген Относительное значение экспрессии (log2)- P Кратность изменения

Недифференцированные клетки Дифференцированные клетки

SLC39A11 7,2±0,1 7,8±0,1 0,006 0,6

SLC13A2 6,4±0,1 7±0,3 0,042 0,6

SLC29A1 10±0,2 9,5±0 0,019 -0,5

SLC5A2 5,9±0,1 6,4±0,2 0,039 0,5

SLC14A2 4,8±0,1 5,2±0,1 0,022 0,4

Полученные результаты показывают уменьшение уровня стимуляции транспорта глюкозы (SLC2A1, SLC2A3) и уменьшения транспорта катионных и нейтральных аминокислот (SLC7A1, SLC7A5) (аргинин, лизин, орнитин, фенилаланин, тирозин, лейцин, и триптофан).

Также следует отметить высокие значения и достоверное изменение экспрессии белков, связанных с энергетическим гомеостазом клетки: транспортом пуриновых нуклеозидов (SLC29A1, SLC29A4) и их производных (SLC5A12, SLC2A9, PDZK1, SLC23A1).

Известно два семейства пуриновых транспортеров: равновесные транспортеры нуклеозидов (ENT), облегчающие диффузию нуклеозидов по градиенту концентрации (SLC29) и концентрирующие транспортеры нуклеозидов (CN7), осуществляющие активный транспорт нуклеозидов в клетку сопряженно с ионами Na+ (SLC28). При этом транспорт гипоксантина и ксантина осуществляют только два равновесных транспортера SLC29A1, SLC29A2, в то время как транспортеры мочевой кислоты представлены в различных семействах группы SLC.

В данной работе дифференцировка клеток Сасо-2 была сопряжена с достоверным снижением экспрессии транспортера пуриновых нуклеозидов и оснований SLC29A1 в 1,5 раза и повышением экспрессии SLC29A4 (транспортера аденозина и пиримидиновых нуклеозидов) в 1,6 раз (р<0,02). Для экспрессии генов, связанных с транспортом мочевой кислоты, были получены следующие результаты: SLC5A12 - повышение в 16,5 раз, SLC22A9 - повышение в 2,9 раз, ABCG2 - снижение в 2,4 раза, PDZK1 — повышение в 1,7 раз (все р<0,03).

Среди отмеченных белков есть транспортеры, которые экспрессируются как на базальной поверхности клетки (81С29А1) [Магщгауке, 2003], так и на апикальной мембране (РШК1) [Ма1тЬег& 2004].

Таким образом, нами исследованы особенности экспрессии генов активных транспортеров и показано, что в процессе дифференцировки клеток Сасо-2 достоверно изменяется экспрессия 42 генов, 37 из которых относится к семейству вЬС.

Особенности функионального статуса апикальной и базальной поверхности дифферениированных клеток Сасо-2

Для оценки влияния культивирования в условиях микробиореактора на функциональное состояние клеток Сасо-2 было оценено изменение уровня экспрессии белков стрессового ответа (белки теплового шока Нзр27, №р70 и №р90) и специфических белков тонкого кишечника (Е-кадгерин и аланиламинопептидаза) после трёх дней культивирования в микробиореакторе, по сравнению с клетками, культивируемыми в статических условиях (трансвелл с клетками в планшете).

Культивирование клеток проводилась в биочипах, содержащих по два симметричных контура. Каждый контур содержал микронасос, резервуар со средой (-200 мкл) и ячейку (~100 мкл) с клеточной моделью, объединенные микроканалами.

Чтобы оценить изменение экспрессии выбранных генов в клетках линии Сасо-2 в ответ на культивирование на разработанной среде, с помощью метода ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени был определено содержание транскриптов этих генов в образцах клеток после трёх дней культивирования в микробиореакторе и в планшете.

В процессе культивирования в микробиореакторе в течение трёх суток экспрессия стрессовых белков, также как и экспрессия специфичных для эпителия тонкого кишечника белков остаётся на уровне сравнимым с таковым для клеток, культивируемых в статических условиях. Культивирование клеток Сасо-2 в микробиореакторе не приводит к стрессированию клеток, которые функционируют в пределах физиологической нормы (Таблица 2).

Таблица 2 - Экспрессия белков теплового шока при культивировании клеток линии Сасо-2 в течение трёх дней в условиях микробиореактора._

Ген (кодируемый белок) Экспрессия (в %, по сравнению с культивированием в плашке)

ШРАМ (Нвр70) 88±21

ШРАІВ №р70) 85±21

НБР90АА1 (НэрЭО) 107±13

НБРВ1 (Нэр27) 82±26

СИНІ (Е-кадгерин) 105±7

АЫРЕР (аланиламинопептидаза) 88±23

Для исследования особенностей функционального статуса апикальной и базальной поверхности дифференцированных клеток Сасо-2 при культивировании в микробиореакторе изучили динамику изменения концентрации пуриновых метаболитов в культуральной среде в процессе культивирования методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с введением ион-парного реагента в состав подвижной фазы, адаптированным из [Тауаггг, 2005].

Дифференцированные клетки были получены в мембранных вставках при культивировании в течение 21 суток после достижения монослоя, что позволило отбирать образцы культуральной среды из апикального и базолатерального отсеков вставки. Концентрации метаболитов определяли по предварительно построенным с использованием метода внутреннего стандарта калибровочным кривым.

Динамика изменения концентрации ксантина и гипоксантина в образцах культуральной среды характеризуется снижением концентрации обоих метаболитов в базолатеральном отсеке, ярко выраженным для гипоксантина (-7,0 мкМ за 7 часов культивирования) и менее заметным для ксантина (-2,0 мкМ). При этом уровень гипоксантина с апикальной стороны эпителиоцитов также снижается (-0,9 мкМ), а ксантина повышается (+4,4 мкМ) на протяжении первых 7 часов после добавления свежей аликвоты культуральной среды. Изменение уровня гипоксантина в культуральной среде на протяжении эксперимента свидетельствует об интенсивном транспорте метаболита через клеточную мембрану.

С другой стороны, для ксантина, который, предположительно, переносится через мембрану с помощью тех же транспортеров, что и гипоксантин, динамика изменения концентрации имеет другой характер. Согласно полученным данным, снижение уровня ксантина с базолатеральной стороны клеток сопровождается выделением его с апикальной стороны. При нормировке полученных численных

21

значений с учетом числа клеток и различных объемов среды в базолатеральном и апикальном отсеках мембранной вставки, можно заключить, что ксантин практически не задерживается в клетке, в отличие от гипоксантина, который интенсивно поглощается.

Наблюдаемые различия в транспорте двух близких по структуре метаболитов, переносимых через мембрану с помощью одних и тех же белком-транспортеров, по-видимому, связаны с тем, что гипоксантин интенсивно используется клетками для ресинтеза макроэргических пуринов, т.к. биосинтез пуринов в клетках Сасо-2 недостаточно активен.

Рисунок 3 - Схема транспорта ксантина и гипоксантина через монослой клеток Сасо-2. Показано предполагаемое перераспределение пуриновых транспортеров (ЫВТ) при дифференцировке клеток. А - недифференцированная клетка; Б -дифференцированная клетка.

Таким образом, несмотря на достоверность изменения экспрессии транспортера пуринов 8ЬС29А1 и значительное изменение экспрессии 8ЬС29А2, вовлеченных в равновесный транспорт гипоксантина и ксантина, при дифференцировке клеток линии Сасо-2, снижение экспрессии данных генов не приводит к нарушению транспорта указанных метаболитов. Напротив, полученные результаты позволяют предположить, что изменение экспрессии исследуемых транспортеров может быть связано с их специфической локализацией в дифференцированных клетках (Рисунок 3), которые характеризуются активным поглощением гипоксантина из внешней среды и сквозным транспортом ксантина. При этом культивирование в микробиореакторе позволило

сделать вывод о полярных свойствах исследуемых клеток, а также динамическом характере регуляции транспорта гипоксантина в зависимости от концентрации метаболита в окружающей среде с апикальной и базолатеральной сторон.

Полученные результаты свидетельствуют о полярности дифференцированных клеток на мембранной вставке, которая отражается в различиях между концентрациями метаболитов в апикальном и базолатеральном отсеках. Отмеченный характер транспорта гипоксантина свидетельствует о том, что в условиях одинакового уровня концентрации гипоксантина с апикальной и базолатеральной стороны предпочтительным является поглощение с базолатеральной стороны. На основании полученных данных можно также выдвинуть предположение о том, что локализация транспортеров азотистых оснований в полярных клетках кишечника не ограничивается базолатеральной стороной.

Таким образом, культивирование дифференцированных клеток Сасо-2 в микробиореакгоре позволило сделать вывод о полярных свойствах исследуемых клеток в отношении транспорта ксантина и гипоксантина.

Выводы

1) Разработан микробиореактор динамического типа, позволяющий моделировать поляризованный монослой эпителия тонкого кишечника в условиях непрерывной циркуляции питательной среды.

2) Микробиореактор позволяет поддерживать заданную скорость циркуляции среды в пределах от 0,2 до 20 мкп/мин, в результате чего возможно воссоздание непрерывного тока среды под базальной мембраной клеток, характерного для условия in vivo..

3) В процессе дифференцировки клеток линии Сасо-2 экспрессия генов АСТВ и GAPDH характеризуется значением стабильности на уровне 1,9 и 2,0 относительных единиц соответственно. Экспрессия генов SF3A1, SDHA и ТВР обладает более высокой стабильностью на уровне 1,7, 1,8 и 1,8 относительных единиц соответственно.

4) Полногеномный анализ экспрессии показал, что при дифференцировке клеток Сасо-2 достоверно изменяется экспрессия белков, связанных с энергетическим гомеостазом клетки: транспортом пуриновых нуклеозидов (SLC29A1, SLC29A4) и

их производных (SLC5A12, SLC2A9, PDZK1, SLC23A1). Экспрессия гена транспортера пуриновых нуклеозидов и оснований SLC29A1 снижается в 1,5 раза, в то время как экспрессия SLC29A4 (транспортера аденозина и пиримидиновых нуклеозидов) повышается в 1,6 раза. Для экспрессии генов, связанных с транспортом мочевой кислоты, были получены следующие результаты: SLC5A12 — повышение в 16,5 раз", SLC22A9 - повышение в 2,9 раз, ABCG2 - снижение в 2,4 раза, PD2K1 — повышение в 1,7 раз.

5) Дифференцированные клетки Сасо-2, культивируемые в условиях микробиореактора, функционируют в пределах физиологической нормы на протяжении трех суток:

— культивирование дифференцированных клеток Сасо-2 в микробиореакторе не приводит к изменению уровня экспрессии генов белков теплового шока и белков характерных для эпителия тонкого кишечника;

- клетки линии Сасо-2, культивируемые в микробиореакторе, имеют апикально-базальную поляризацию, характерную для клеток эпителия тонкого кишечника in vivo в норме.

6) Клетки Сасо-2, культивируемые в условиях микробиореактора, могут быть использованы в качестве эффективной модели для исследования in vitro процессов активного и пассивного транспорта биологически активных веществ и ксенобиотиков через стенку тонкого кишечника.

Практические рекомендации

1) Микробиореактор может быть использован в медико-биологических исследованиях для моделирования микроциркуляции крови при культивирования клеточных моделей тканей.

2) Для изучения процессов транспорта в эпителии тонкого кишечника в норме и под воздействием различных патологических факторов целесообразно использовать монослой дифференцированных клеток Сасо-2, демонстрирующих основные функции энтероцитов человека.

3) В качестве референсных генов для изучения клеток Сасо-2 рекомендуется использовать гены SF3A1, SDHA и ТВР.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Кашкин К.Н. Экспрессионное профилирование и предполагаемые механизмы устойчивости к доксорубицину клеток рака легких человека / К.Н. Кашкин, Е.А. Мусаткина, А.В. Комельков, И.А. Фаворская, Е.В. Трушкин, В.А. Шлепцова, Д.А. Сахаров, Т.В. Виноградова, Е.П. Копанцев, М.В. Зиновьева, О.В. Ковалёва, И.Б. Зборовская, А.Г. Тоневицкий, Е.Д. Свердлов // Доклады академии наук. — 2010. — Т. 430, №3, —С. 412-415.

2 Трушкин Е.В. Референсные гены для изучения процесса дифференцировки клеток линии Сасо-2 методом ПЦР-РВ / Е.В. Трушкин, Д.Г. Максименко, Н.А. Хаустова, И.Н. Нечаев, Н.Г. Лузгина, Д.В. Мальцева, АЛ. Русанов //Биотехнология. —2013. — № 1. — С. 33-41.

3 Трушкин Е.В. Метод флуоресцентного мониторинга жизнеспособности клеточных моделей кожи в условиях биореактора / Е.В. Трушкин, И.А. Сергачев, Н.П. Петрова, В.А. Петров, А.Ю. Шкурников, У. Маркс // Биотехнология. — 2013. — № 1. — С. 91-96.

4 Сенявина Н.В. Современные технологии in vitro тестирования лекарств in vitro: использование микробиореакторов / Н.В. Сенявина, Е.В. Трушкин, A.JI. Русанов, В.А. Петров, А.Ю. Шкурников, У. Маркс, Д.А. Сахаров // Биотехнология. — 2013.—№ 1. —С. 51-58.

5 Wagner I. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture / I. Wagner, E.M. Materne, S. Brincker, U. SiiBbier, C. Fradrich, M. Busek, F. Sonntag, D.A. Sakharov, E.V. Trushkin, A.G. Tonevitsky, R. Lauster, U. Marx // Lab on a chip. — 2013. — DOI: 10.1039/C3LC50234A.

6 Sergachev I. Fluorescent optical fiber sensors for cell viability monitoring [Текст] / I. Sergachev, A. Rusanov, E. Trushkin, D. Sakharov, U. Marx, A. Tonevitsky// Analyst. - 2013. -DOI: 10.1039/C3AN00248A.

Подписано в печать:

23.05.2013

Заказ № 8537 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Трушкин, Евгений Владиславович, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОФИЗИОЛОГИИ» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи

04201359350

ТРУШКИН Евгений Владиславович

ИЗУЧЕНИЕ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ КЛЕТОК ЭПИТЕЛИЯ КИШЕЧНИКА ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В УСЛОВИЯХ

МИКРОБИОРЕАКТОРА

03.03.01 - Физиология 03.01.03 - Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН ТОНЕВИЦКИЙ Александр Григорьевич

Москва, 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ОСНОВНЫХ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ...................4

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................5

Актуальность темы исследования............................................................................5

Научная новизна.........................................................................................................7

Теоретическая и практическая значимость работы................................................7

Положения, выносимые на защиту..........................................................................8

Структура и объем диссертации...............................................................................8

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР...................................................................10

1.1 Клеточная линия Сасо-2 как модель эпителия тонкого кишечника.............10

1.2 Анализ данных микрочипов..............................................................................12

1.3 Механизмы транспорта веществ через эпителий кишечника.......................16

1.4 Культивирование клеток на проницаемых мембранных фильтрах..............25

1.5 Референсные гены в изучении процесса дифференцировки клеток линии Сасо-2........................................................................................................................30

1.6 Воздействие на клетки кишечника...................................................................32

1.7 Микробиореакторы............................................................................................40

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.............................45

2.1 Реактивы..............................................................................................................45

2.2 Культивирование клеточной линии Сасо-2.....................................................45

2.2.1 Получение дифференцированной культуры клеток Сасо-2................45

2.3 ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени...........................50

2.4 Методы оценки стабильности экспрессии генов............................................55

2.5 Полногеномный транскриптомный анализ.....................................................56

2.5.2 Приготовление Second-strand Master Mix..............................................58

2.5.3 In vitro транскрипция кРНК....................................................................59

2.5.4 Очистка кРНК...........................................................................................60

2.5.5 Синтез 2nd-cycle кДНК............................................................................61

2.5.6 Гидролиз с RNAse Н................................................................................62

2.5.7 Очистка 2nd-Cycle кДНК........................................................................63

2.6 Изучение транспорта веществ через монослой клеток Сасо-2.....................65

2.7 Обращенно-фазовая ВЭЖХ..............................................................................66

2.8 Статистическая обработка результатов исследования...................................69

ГЛАВА 3. ФОРМИРОВАНИЕ МОНОСЛОЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК ЛИНИИ САСО-2......................................................................................71

3.1 Изучение генетических особенностей клеток Сасо-2 до и после дифференцировки.....................................................................................................74

3.1.1 Оценка стабильности экспрессии потенциальных референсных генов .............................................................................................................................74

3.2 Оценка изменения экспрессии специфических генов клеток Сасо-2...........80

3.3 Оценка степени конфлюэнтности монослоя...................................................82

3.4 Влияние дифференцировки клеток линии Сасо-2 на белки активного транспорта (по данным полногеномного анализа экспрессии)...........................89

ГЛАВА 4. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ В МИКРОБИОРЕАКТОРЕ.......................94

4.1 Преимущества культивирования в микрофлюидных системах....................94

4.2. Влияние условий культивирования в микробиореакторе на функциональный статус клеток Сасо-2.................................................................96

4.3. Полярность монослоя дифференцированных клеток Сасо-2.......................98

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................................................107

ВЫВОДЫ...................................................................................................................112

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ...............................................................114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................115

СПИСОК ОСНОВНЫХ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

БУ - блок управления

МБР - микробиореактор

ПЦР - полимеразная цепная реакция

АСТВ -ß-актин

В2М -бета-2-микроглобулин

GAPDH - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа

GUS -глюкуронидаза

HPRT1 - гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансфераза, гипоксантин

фосфорибозил-трансфераза I

HSPC3 - белок теплового шока HSP90-ß

MRPL19 -митохондриальный рибосомальный белок L19

PSMC4 - АТФаза 4 26S протеасомы

PUM1 - РНК-связывающий белок семейства PUF

RPLPO - фосфопротеин РО

RPS18 - рибосомальный белок S18

SDHA - субъединица А сукцинатдегидрогеназного комплекса SF3A1 -субъединица 1 сплайсинг фактора ЗА ТВР - ТАТА-блок связывающий белок UBC - убиквитин

YWHAZ - дзета полипептид тирозин 3-моноксигеназа/триптофан 5-монооксигеназа активирующего белка

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Основная функция эпителия тонкого кишечника заключается в формировании гистогематического барьера, отделяющего соединительную ткань кишечника от потенциально вредных соединений, присутствующих в просвете кишки, а также препятствующего попаданию этих веществ в кровоток. Плотные контакты, образующиеся в апикальной области эпителия между соседними клетками, формируют структурный и функциональный барьер, который препятствует парацеллюлярному транспорту веществ из кишечника. Нарушение плотных контактов с одной стороны, наблюдается при ряде воспалительных заболеваний, а с другой - является причиной различных воспалительных заболеваний кишечника и некротического энтероколита.

Помимо барьерной функции, эпителиальные клетки кишечника выполняют транспортную. В тонком кишечнике осуществляется всасывание большинства жизненно-важных для организма веществ и перорально принимаемых лекарственных средств. Транспорт осуществляется пассивно, активно и путем пиноцитоза.

Клетки эпителия кишечника используются в качестве объекта исследований, направленных на изучение процессов всасывания биологически активных молекул и ксенобиотиков в тонком кишечнике человека, а также влияния различных физиологических факторов на барьерную функцию кишечного эпителия.

При этом наиболее распространенным подходом является культивирование клеток кишечника в виде монокультуры. Недостатком такого подхода является значительное упрощение модели по сравнению с нормальной стенкой кишечника, так как практически не удается воссоздать физиологичный ток питательной среды под базальной мембраной, что в значительной мере

влияет на процессы активного или пассивного транспорта тех или иных веществ через эпителий тонкого кишечника. Распространенным подходом к решению данной проблемы является использование микробиореакторов, позволяющих моделировать и поддерживать ток питательной среды.

В настоящее время существуют варианты микробиореакторов, позволяющие культивировать различные модели органов [Biffi, 2012; Young, 2010]. Однако до сих пор остаётся невыясненным, как культивирование клеток эпителия кишечника в микробиореакторе влияет на их функцию: остается ли она в пределах нормы, имеет ли место стрессирование клеток, в какой мере клетки, культивируемые в таких условиях, могут быть использованы как модель нормальной стенки кишечника.

В этой связи целью исследования было изучение молекулярно-генетических особенностей функционального статуса клеток эпителия кишечника человека при их культивировании в условиях микробиореактора.

Для решения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка микробиореактора для культивирования клеточной модели ткани эпителия кишечника;

2. Изучение процесса диффузии маркерных молекул при микроциркуляции среды в условиях микробиореактора;

3. Получение стабильного монослоя дифференцированных клеток линии Сасо-2;

4. Экспериментальное обоснование выбора референсных генов для оценки изменения экспрессии генов в процессе дифференцировки клеток линии Сасо-2;

5. Исследование экспрессии генов белков-транспортеров в дифференцированных клетках линии Сасо-2;

6. Сравнение уровня экспрессии генов белков теплового шока. Оценка при культивировании клеток Сасо-2 в условиях микробиореактора и в планшете;

7. Характеристика апикально-базальной поляризации клеток линии Сасо-2 при культивировании в условиях микробиореактора.

Научная новизна

Научная новизна исследования заключается в том, что разработан новый прибор, позволяющий проводить культивирование клеточной модели эпителия тонкого кишечника в условиях непрерывной циркуляции питательной среды. В отличие от литературных данных, показано, что при дифференцировке клеток Сасо-2 гены SF3A1, SDHA и ТВР характеризуются наиболее стабильным уровнем экспрессии.

Культивирование клеток линии Сасо-2 в условиях микробиореактора не приводит к изменению экспрессии белков теплового шока. Клетки линии Сасо-2, культивируемые в микробиореакторе, имеют апикально-базальную поляризацию характерную для клеток эпителия тонкого кишечника in vivo в норме.

Теоретическая и практическая значимость работы

Практическая значимость исследования заключается в том, что разработан микробиореактор, позволяющий культивировать клеточные модели тканей млекопитающих. Выбраны референсные гены, которые позволяют более точно оценивать экспрессию целевых генов при дифференцировке клеток Сасо-2, по сравнению с описанными в литературе. Показана возможность культивирования клеток линии Сасо-2 в условиях микробиореактора и потенциальная применимость клеток Сасо-2, культивируемых в микробиореакторе в качестве эффективной модели для исследования in vitro процессов активного и пассивного транспорта биологически активных веществ и ксенобиотиков через стенку тонкого кишечника.

Положения, выносимые на защиту

1) Микробиореактор позволяет поддерживать непрерывный ток среды под базальной поверхностью клеток, обеспечивая наличие градиента концентраций веществ между апикальной и базолатеральной сторонами эпителия кишечника.

2) Гены SF3A1, SDHA и ТВР характеризуются более стабильным уровнем экспрессии при дифференцировке клеток Сасо-2, чем обычно упоминаемые в литературе

3) Культивирование клеточной линии Сасо-2 в микробиореакторе не приводит к стрессированию клеток.

4) Клетки линии Сасо-2, культивируемые в микробиореакторе, имеют апикально-базальную поляризацию характерную для клеток эпителия тонкого кишечника in vivo в норме.

Структура и объем диссертации

Диссертация написана по традиционному типу, содержит 137 страниц машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает в себя 204 источника. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 16 рисунками.

Степень достоверности и апробация результатов

По теме диссертации опубликовано 6 работ, в т.ч. 6 в журналах, рекомендованных ВАК.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на международных конференциях 3D Cell Culture Conference (Цюрих, Швейцария, 2012), SPEC 2012 - Shedding New Light on Disease (Чинг Май, Тайланд, 2012), AXLR8-3 workshop report (Берлин, ФРГ, 2012), совместном заседании лабораторий Молекулярной физиологии, Нейроиммунопатологии и Регуляции экспрессии генов ФГБУ «НИИОПП» РАМН (16 апреля 2013 г.) и секции ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН (07 мая 2013 г.).

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Клеточная линия Сасо-2 как модель эпителия тонкого кишечника

Пероральное введение является наиболее популярным и приемлемым способом доставки лекарственных препаратов к органам мишеням. Создание клеточных моделей, которые позволят имитировать слизистую оболочку кишечника с целью исследования механизмов и скорости всасывания препаратов, представляет большой интерес для фармацевтической промышленности, поскольку это позволяет уменьшить число животных и количество тестового вещества, необходимых для проведения экспериментов. Кроме того, результаты исследований на моделях животных не всегда могут быть перенесены на человека [Bailey С.А., Bryla P., Malick A.W., 1996]. С точки зрения абсорбции лекарственных препаратов, наиболее важны эпителиальные клетки кишечника, которые отвечают за всасывание и метаболизм веществ. Клеточная культура in vitro, которая представляла бы собой монослой поляризованных, жизнеспособных и полностью дифференцированных клеток, подобных клеткам эпителия тонкого кишечника, может быть ценным инструментом для изучения абсорбции и метаболизма лекарственных препаратов [Meunier и др., 1995].

В 1977 году была создана коллекция клеточных линий из опухолей желудочно-кишечного тракта с целью проведения исследований механизмов рака и терапий на основе цитостатиков [Fogh, Wright, Loveless, 1977]. Некоторых из этих линий демонстрируют свойства, характерные для энтероцитов тонкого кишечника. В большинстве случаев частичная дифференцировка клеток происходит под воздействием синтетических или биологических факторов добавляемых в среду [Chantret и др., 1988; Meunier и др., 1995; Pinto и др., 1983]. Исследования клеточной линии Сасо-2 показали,

что в процессе дифференцировки эти клетки проявляют некоторые морфологические, биохимические и функциональные свойства, аналогичные таковым для энтероцитов тонкого кишечника. Первоначально полученная из карциномы толстой кишки, клеточная линия Сасо-2 демонстрирует различные характеристики дифференцированных клеток кишечного эпителия, в том числе поляризованную столбчатую морфологию с апикальной щеточной каёмкой, электрические и морфологические плотные контакты, и транспортные свойства схожие с таковыми у слизистой оболочкой кишечника in vivo [Sambuy и др., 2005; Метельский, 2009]].

При дифференцировке клетки Сасо-2 растут в виде монослоя, имеют цилиндрическую поляризованную морфологию с микровиллиями на апикальной поверхности и производят ферменты класса гидролаз и другие белки, присущие энтероцитам in vivo (сукраза-изомальтаза, лактаза, аминопептидаза N, дипептидилпептидаза IV, муцин-подобный высокомолекулярный ядерный гликопротеин, виллин, миозин, щелочную фосфатазу и др.) на апикальной мембране, а также системы транспорта аминокислот, дипептидов, витаминов и цитостатиков [Jumarie, Malo, 1991; Pignata и др., 1994; Sambuy и др., 2005; Каралова и др., 2006]. Уровень экспрессии генов данных белков увеличивается в процессе дифференцировки и в полностью дифференцированном монослое клеток Сасо-2 сравним наблюдаемым in vivo для дифференцированных клеток кишечника (энтероцитов) [Delie, Rubas, 1997]. Эти данные позволяют считать культуру клеток Сасо-2 удобной моделью для изучения механизмов регуляции в процессах пролиферации и дифференцировки in vitro [Sambuy и др., 2005].

Клетки линии Сасо-2 продуцируют ферменты как первой (в том числе различные изоформы цитохрома Р450 - CYPA1A, CYP3A5 и др.), так и второй фазы (UDP-глюкуронозилтрансферазы, N-ацетилтрансферазы,

сульфотрансферазы и глутатион-Б-трансферазы) метаболизма, однако в целом уровень экспрессии или активности этих ферментов ниже, чем для

человеческих энтероцитов, что ограничивает их применение в качестве модели для изучения окислительного метаболизма кишечника [Ferrec Le и др., 2001; Raeissi и др., 1999; Sambuy и др., 2005]. В частности, клетки Сасо-2 практически не экспрессируют цитохром CYP3A4, который присутствует в клетках эпителия кишечника in vivo и может принимать участие в метаболизме некоторых веществ (например, циклоспорина и мидазолама). Увеличить уровень экспрессии CYP3A4 можно либо трансфицировав клетки Сасо-2 плазмидой, кодирующей ген этого белка [Fisher и др., 1999; Ни и др., 1999], либо воздействовав на них индуктором (для этого может быть использован 1а,25-дигидроксивитамин D3) [Schmiedlin-Ren и др., 1997]. Экспрессия CYP3A4 в трансфицированных плазмидой клетках Сасо-2 может быть увеличена за счёт инкубации в течение 24 часов с 12-0-тетрадеканиолфорбол-13-ацетатом и бутиратом натрия. В этих условиях ферментативная активность увеличивается приблизительно в 40 раз, по сравнению с контрольными образцами [Cummins, Mangravite, Benet, 2001; Sambuy и др., 2005].

Таким образом, модель эпителия тонкого кишечника на основе дифференцированных клеток Сасо-2 позволяет оценить проницаемость и токсичность исследуемых лекарств, а также выяснить механизм их транспорта через слизистую кишечника [Kim и др., 2006; Meunier и др., 1995].

1.2 Анализ данных микрочипов

Процесс дифференцировки клеток эпителия тонкого кишечника регулируется на транскриптомном уровне. Полногеномный транскриптомный анализ с использование микрочипов демонстрирует значительное изменение экспрессии многочисленных генов как в процессе дифференцировки клеток линии Сасо-2, так и при воздействии на эти клетки различных вещ