Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия, локализация и фосфорилирование изоформ киназы легких цепей миозина в клетках животных и человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия, локализация и фосфорилирование изоформ киназы легких цепей миозина в клетках животных и человека"

г; 5 о»

2 5 № да

На правах рукописи

ЧИБАЛИНА Маргарита Валериевна

ЭКСПРЕССИЯ, ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ИЗОФОРМ КИНАЗЫ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНА В КЛЕТКАХ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2000

Работа выполнена в лаборатории Клеточной подвижности НИИ Экспериментальной Кардиологии Российского Кардиологического научно-производственною комплекса МЗ РФ

Научный руководитель:

доктор биологических наук В.П. Шмринский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Э.М. Тарарак

кандидат биологических наук Н.В. Богамева

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А,Н. Баха

Защита состоится 27 апреля 2000 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 074.22.02 в РКНПК МЗ РФ по адресу: 121552, Москва,, 3-я Черепковская ул., д. 15а.

С диссертацией молено ознакомиться в библиотеке Российского Кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Автореферат разослан 24 марта 2000 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

вб^. /// о

Т.И. Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Кшгаза легких цепей миозина (КЛЦМ) является ключевым регулятором клеточной подвижности, опосредуемой миозином Н-го типа (Stull et al., 1986). КЛЦМ активируется комплексом Ca2' -кальмодулин и фосфорилирует регуляторные легкие цепи (РЛЦ) миозина. Фосфорклирование РЛЦ на несколько порядков увеличивает активность актин-активируемой Mg2*-зависимой АТФазы гладкомышечного и немышечного миозинов (Adelstein and Conti, 1975; Seilers, 1985) и запускает сокращение гладкомышечных клеток. В немышечных клетках фосфорилирование РЛЦ миозина киназой легких цепей миозина определяет множество форм клеточной активности. Показано, что КЛЦМ регулирует ретракцию эндотелиальных клеток и сокращение фибробластов (Wysolmerski and Lagunoff, 1990, 1991; Kolodney and Wysolmerski, 1992), агрегацию и ретракцию тромбоцитов (Lokeshwar and Bourguignon, 1992; Hashimoto et al., 1994), быстрое амебоидного движение эукариотических клеток, таких как макрофаги и эозинофилы (Wilson et al., 1991; Walker et al., 1998). Известно, что КЛЦМ также вовлечена в регуляцию цитокинеза (Fishkind et al., 1991; Yamakita et al., 1994; Matsumura et al., 1998), подвижности конуса роста нервных клеток (Jian et al., 1994, 1996), секреции (Choi et al., 1994; Park et al., 1996; Rao et al., 1997; Kim et al., 1998), "кэпирования" рецепторов на поверхности клеток (Kerrick and Bourguignon, 1984; Majercik and Bourguignon, 1988), образования пузырчатых вздутий на мембранах апоптотических клеток (Mills et al.. 1998).

Генетический локус гладкомышечной/немьппечной КЛЦМ позвоночных имеет сложную организацию. Он кодирует три продукта: классическую КЛЦМ, молекулярная масса которой составляет 108 кДа, высокомолекулярную изоформу КЛЦМ с молекулярной массой 210 кДа и белок KRP (Kinase Related Protein) (Olson et al., 1990; Collinge et al., 1992; Watterson et al.. 1995). КЛЦМ-210 включает в себя всю последовательность и все функциональные домены КЛЦМ-108 и дополнительно содержит еше протяженную N-концевую последовательность, которая отсутствует у КЛЦМ-108 (Watterson et al., 1995). KRP представляет собой белок, идентичный по аминокислотной последовательности С-концевому домену КЛЦМ. Он экспрессируется с собственного промотора, который находится внутри интрона КЛЦМ (Gallagher and Herring, 1991; Collinge et al., 1992). Устройство по типу ген в гене, показанное для генетического локуса КЛЦМ, явилось первым примером подобной организации в геноме эукариот. Несмотря на то, что установлена полная экзон-интронная структура гена КЛЦМ в геноме птиц, молекулярно-генетические отношения двух изоформ КЛЦМ на сегодняшний день остаются невыясненными. Не понятно, являются ли они продуктами альтернативного сплайсинга или их экспрессия инициируется с независимых промоторов.

Свойства высокомолекулярной изоформы КЛЦМ изучены очень мало. Известно лишь, что КЛЦМ-210 тоже является протеинкиназой и фосфорилирует тот же субстрат, что и КЛЦМ-108 - РЛЦ миозина 11-го типа (Gallagher et al., 1995). К началу данного исследования высокомолекулярная изоформа КЛЦМ считалась эмбриональной изоформой КЛЦМ (Gallagher et al., 1995; Fisher and Ikebe, 1995). Однако недавно было показано, что высокомолекулярная изоформа экспрессируется в эндотелиальных клетках взрослого организма (Garcia et al., 1997). В то же время внутриклеточное и тканевое распределение этого белка остается неизученным. Не ясно, в чем заключаются функциональные различия двух изоформ КЛЦМ. Несмотря

на то, что структура гена КЛЦМ известна, никакие регуляторные единицы пока не найдены и не понятно, как регулируется экспрессия этих белков в тканях и в процессе онтогенеза.

Целыо настоящей работы являлось изучение локализации, экспрессии и носттрансляционных модификаций продуктов генетического локуса киназы легких цепей миозина в клетках позвоночных. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить локализацию изоформ КЛЦМ в тканях и их экспрессию в культивируемых гладкомьплечных клетках.

2. Установить внутриклеточное распределение КЛЦМ-210 и роль ее уникальной последовательности во взаимодействии с цитоскелетом.

3. Исследовать фосфорилирование КЛЦМ в культивируемых гладкомышечных клетках.

Научная новизна работы. Показано, что высокомолекулярная изоформа КЛЦМ экспрессируется преимущественно в немышечных тканях, а также в гладких мышцах аорты. Впервые исследована локализация высокомолекулярной изоформы КЛЦМ в тканях. КЛЦМ-210 обнаружена в некоторых типах эпителия (эпителии трахеи и яйцевода, эндотелии сосудов). Высказано предположение, что КЛЦМ-210 может участвовать в регуляции специфических форм клеточной подвижности, таких как секреция и эндоцитоз. Впервые продемонстрировано, что КЛЦМ-210 колокализуется с мнкрофиламентами в гладкомышечных клетках аорты и в немышечных клетках. С помощью двух альтернативных методов (окрашивания цитоскелетов клеток флуоресцентно-меченными белками и трансфекции клеток молекудярно-генешческнми конструкциями) показано, что уникальный фрагмент КЛЦМ-210 связывается с мнкрофиламентами в клетках. Полученные результаты по дифференциальной экстракции и ннгибированию КЛЦМ в культивируемых клетках позволяют предположить, что КЛЦМ-210 вовлечена в стабилизацию актинового цитоскелега клеток. Впервые показано, что экспрессия высокомолекулярной изоформы КЛЦМ в гладкомышечных клетках регулируется механическими и гуморальными воздействиями. Установлено, что обе изоформы КЛЦМ в культивируемых ГМК являются фосфобелками. Показано, что р42 МАР-киназа является основной протеинкиназой, фосфоршшрукнцей КЛЦМ при стимуляции ГМК форболовым эфиром.

Практическая значимость работы. Результаты работы создают предпосылки для дальнейших исследований организации генетического локуса КЛЦМ животных и человека и установлению функциональных особенностей его множественных продуктов. Полученные антитела, молекулярно-генетические конструкции и разработанные методические подходы могут быть использованы в широком спектре исследований механизмов клеточной подвижности.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийской конференции "Прикладные аспекты исследования скелетных, сердечных и гладких мышц", (Пущине, Россия, 1996), на 8-ом Европейском симпозиуме по изучению гипертонии (Милан, Италия, 1997), на 2-ом и 4-ом совещаниях стипендиатов Медицинского Института Говарда Хьюза (Варшава, Польша, 1997; Москва, Россия, 1999), на международном симпозиуме "Биологическая подвижность: современные методы исследования" (Пущине, Россия, 1998), на съезде

з

Американского Биофизического общества (Канзас-Сити, США, 1998), на 27-ой и 28-ой Европейских мышечных конференциях (Лунд, Швеция, 1998; Йорк, Великобритания, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована I таблицей и 37 рисунками. Список литературы включает 205 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Определение концентрации белков. Концентрацию антител определяли спектрофотометрически. Концентрацию других белков определяли по цветной реакции с Кумасси G-250 при помощи реактива фирмы Bio-Rad (США) согласно протоколу производителя. Общий белок в гомогенатах тканей и клеток определяли по цветной реакции с амиловым черным по методу, описанному Schaffner and Wetasman (1973).

Электрофорез и иммуноблоттинг. Препараты белков и экстракты тканей и клеток подвергали электрофорезу в пластинах полиакриламидного геля в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) и ß-меркаптоэтанола по методу Lacmmli (1970). Иммуноблоттинг проводили по методу Towbin et al. (1970) с модификациями. Для анализа изоформ использовали 5-7.5 % полиакриламидные гели с обычной и пониженной сшивкой. Электропсренос белков проводили на нитроцеллюлозную мембрану в стандартном трис-глицин/этанольном буфере, содержащем 0.02 % ДСП, в течение 1 часа при напряжении 100В в камере Miniprotean фирмы Bio-Rad. После переноса мембрану блокировали 5% раствором обезжиренного молока в ФСБ в течение 1 часа при комнатной температуре. Инкубации с антителами проводили в ФСБ. содержащем 0.1 % Твин-20 и 1-2 % обезжиренного молока, в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембраны отмывали сначала ФСБ с 0.1 % Твин-20, затем ФСБ. Для выявления белковых полос использовали 3,3'-диаминобешшшн или хемилюминесцентную детекцию с помощью набора реактивов фирмы Amersham (Великобритания).

Характеристика использованных в работе антител к продуктам генетического локуса КЛЦМ. В работе были использованы следующие антитела: поликлональные антитела a KRP. выявляющие обе изоформы КЛЦМ и KRP; моноклональные антитела (клон КЗб, Sigma) и поликлональные антитела //859 к КЛЦМ-108, выявляющие обе изоформы КЛЦМ. Антитела, специфические к высокомолекулярной изоформе КЛЦМ (поликлональные антитела N875 к рекомбинантному полипептиду, соответствующему 1-875 аминокислотным остаткам КЛЦМ-210, поликлональные антитела #3528 к синтетическому пептиду, соответствующему остаткам 306-321 КЛЦМ-210 и моноклональные антитела 2F4 к тому же пептиду) выявляли исключительно высокомолекулярную изоформу протеинкииазы и не обладали иммунореактивностью к низкомолекулярной изоформе КЛЦМ и KRP. Антитела //3007, //3528, #859 были любезно предоставлены д-ром Д.М. Ваттерсоном (Северозападный университет г. Чикаго, США). Антитела 2F4 и N875 были получены и охарактеризованы в ходе данной работы.

Иммунофлуоресценция. Серийные криостатные срезы тканей толщиной 5 мкм фиксировали в ацетоне 6 мин при комнатной температуре. Культивируемые клетки, выращенные на покровных стеклах, фиксировали 3.7% формальдегидом в ФСБ 5-10 мин при комнатной температуре. Клетки лермеабилизовали 1 % Тритоном Х-100 в ФСБ 2-10 мил при комнатной температуре и отмывали ФСБ. Стекла инкубировали с неразведенной ЭТС 30 мин и затем наносили на них первые антитела в ФСБ, содержащем 1 мг/мл БСА, инкубировали 1 час во влажной камере при комнатной температуре. С текла промывали 3x2 мин ФСБ и наносили вторые антитела, меченные ФИТЦ, ТРИТЦ или Техасским Красным. Инкубировали 1 час при комнатной температуре, затем промывали стекла 3x2 мин ФСБ. Клетки и срезы заключали между предметным и покровным стеклами в заливочную среду Aquapolymount (США). Препараты фотографировали с помощью Фотомикроскопа 111 (Zeiss, Германия) на пленку Kodak Tri-X Pro или T-inax.

Создание и характеристика молекулярно-генетических конструкций. pFLAG-N934. Уникальная последовательность КЛЦМ-210, кодирующая аминокислоты 1-934, была субклонирована из вектора pVL1392-N934 в вектор pFLAG CMV2 (Kodak, США) по Hgl II и ВатН I рестриктным сайтам. Клоны, содержащие вставку в нужной ориентации, были отобраны с помощью рестрикционного анализа. Конечная конструкция кодировала полипепдид, соответствующий аминокислотам I-934 последовательности КЛЦМ-210, с дополнительной FLAG-последовательностыо (N-Асп-Тир-Лиз-Асп-Асп-Асп-Асп-Лиз-С) и 9 дополнительными аминокислотами (N-Лей-Ала-Ала-Ала-Асн-Сер-Сер-Иле-Асп-С) перед первой аминокислотой последовательности КЛЦМ.

Молекулярно-генетическая конструкция pEG Fl'-MLC К-210 в векторе pEGFP-N1 (Clontech) была любезно предоставлена д-рами А. Гавриловой и А. Брезник (Медицинский колледж Альберта Эйнштейна, Бронкс, США). Конструкция кодировала гибридный белок, включающий полную аминокислотную последовательность КЛЦМ-210 (аминокислоты 1-1906) и GFP-домен на С-конце.

Выделение и культивирование клеток. Гладкомышечные клегки из медии аорты курицы выделяли энзиматичсски по методике, описанной Chamley-Campbell et al. (1979), с модификациями. Полоски медии измельчали и инкубировали при 37°С и мягком перемешивании в растворе, содержащем 0.75 мг/мл эластазы и 1 мг/мл коллагеназы в среде Ml99. Изолированные клетки подсчитывали в камере Горяева и высаживали на чашки Петри в среде роста (М199, 2 мМ L-глутамина. 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10% ЭТС) с плотностью посадки 2-4 х 10^ клеток/см^. ГМК культивировали в атмосфере 95% воздуха, 5% СО2 при 37°С. Для пассирования использовали 0.25% трипсин в растворе Версена. В экспериментах использовали клетки первичной культуры и 1 -4 пассажей.

Клетки из аорты 19-дневных куриных эмбрионов получали энзиматически при обработке ткани 0.25% раствором трипсина в ФСБ.

Клетки HeLa (АТСС# CCL-2), А10 (АТСС# CRL-1476), HISM (АТСС# CRL-1692) культивировали в DMEM с 10% ЭТС. Для пассирования всех типов клеток использовали 0.25% трипсин.

Транзиторная трансфекция культивируемых клеток молекулярно-генетическими конструкциями. Транзиторную трансфекцию проводили с помощью набора Maxifectin-21 (Pepline, Россия) по протоколу производителя. При трансфекции

pEGFP-MLCK-210 в качестве контрольного вектора использовали pEGFP-Cl (Clontech, США), не содержащий вставки. Клетки фиксировали через 18-24 часа после трансфекции и исследовали собственную флуоресценцию гибридного белка. При трансфекции pFLAG-N934 в качестве контрольного вектора использовали конструкцию pFLAG-BAP (Kodak, США). Клетки фиксировали через 8-16 часов после трансфекции. "Грансфицированные клетки выявляли методом непрямой иммунофлуоресценции, используя антитела М2 к FLAG-пептиду и антитела #3528 к КЛЦМ-210.

Определение активации МАР-киназ. Для определения активации р42/р44 или р38 МАРК блоты лизатов клеток окрашивали антителами, специфическими к фосфорилированной по остаткам Тре202/Тир204 p42/p44cdu, или антителами, "специфическими к фосфорилированной по остаткам Тре180/Тир182 р38 МАРК (New England Biolabs, США). Параллельно идентичную мембрану окрашивали антителами к p42/p44crk' 2 или р38 МАРК для определения общего количества соответствующих протеинкиназ. Блоты проявляли с помощью хемилюминесцентного субстрата. Активность JNK (c-Jun N-terminal kinase) определяли с помощью метода твердофазного катализа ("pull-down assay"), как описано Bogoyevitch ct al. (1996).

Метаболическое мечение клеток '2Р и т vivo фосфорилирование КЛЦМ. ГМК курицы 2-4 пассажей культивировали в среде М199 с 10% ЭТС до состояния конфлуента, за сутки до начала эксперимента меняли среду на Ml99 с 0.1% БСА, Перед экспериментом ГМК помещали в среду MEM, не содержащую фосфата на 2-2.5 часа. 'Затем среду заменяли на бесфосфатную MEM, содержащую 0.1 мМ Na^PO^ и 60-120 мкЮо/мл 1у-,2Р]-Н,Р04. Метаболическое мечение проводили в течение 2.5-3 часов, В некоторых экспериментах за 90-110 минут до начала стимуляции в среду добавляли ингибиторы протеинкиназ (I'D 98059. SB 202190, GF 109203Х (бисиндолилмалеимид-I)). Далее клетки стимулировали различными фармакологическими агентами (PDBu, форсколнном, окадаевой кислотой). В качестве контроля использовали ГМК, обработанные DMSO. ГМК промывали ФСБ, лизировали буфером экстракции, содержащим 20 мМ MOPS, рН 7.0, 350 мМ NaCl, 1 % Тритон Х-100, 25 мМ MgCl2, 2 мМ ЭГТА, 1 мМ ДТТ, 1 мМ орто-ванадат натрия, 0.5 мМ PMSF, 0.2 мМ ТРСК, 0.2 мМ TLCK, 100 мкМ лейпегттин, 1мкМ пепстатин. Клетки механически счищали с чашки и осветляли лизат центрифугированием в настольной микроцентрифуге при 4°С.

К лизатам добавляли антитела, предварительно сорбированные на протеин-G-Сефарозу и инкубировали 1.5 часа во льду при постоянном перемешивании, затем Сефарозу осаждали и надосадочную жидкость удаляли. Осадок промывали 3 раза буфером экстракции и 3 раза 20 мМ Три-HCl рН 7.2 буфером, содержащим 600 мМ KCI. Иммунопрещшигаты подвергали ДСН-электрофорезу, переносили на нитроцеллюлозную мембрану, с которой получали авторадиограмму, затем мембрану окрашивали антителами и проявляли с помощью ДАБ. Мембрану и авторадиограмму денситометрировали. Уровень фосфорилирования белков выражали в условных единицах как отношение значений плотностей зон на авторадиограмме к плотностям соответствующих белковых зон на иммуноблоте. Уровень фосфорилирования исследуемых белков в контрольных образцах принимали за 100%. При анализе фосфорилирования КЛЦМ для иммунопреципитации использовали козьи антитела к KRP, для окрашивания блотов соответствующих иммунопреципитатов использовали кроличьи антитела к KRP (#3007) или мышиные антитела К36 к КЛЦМ.

Органная культура аорты в режиме механической стимуляции. Сегменты аоргы курицы, лишенные эндотелия, брали на лигатуру и закрепляли в приборе для механической деформации (Shirinsky et al., 1989). Сегменты аорты культивировали в среде MI99 с 10% ЭТС при периодическом растяжении с частотой 60 циклов в минуту и относительным удшшнением 15% в течение 3-6 дней. В качестве контроля использовали сегменты, культивируемые в отсутствие растяжения. Но окончании эксперимента из сегментов аорты готовили образцы для ДС.Н-электрофореза и анализировали содержание КЛЦМ с помощью иммуноблоттинга.

Обработка данных. Гели, иммуноблоты и авторадиографические пленки сканировали с помощью сканера Hewlett-Packard HP-licx и проводили денснтометрический анализ с помощью программы NUI Image. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программ KaleidaGraph 3.08 и Microsoft Excel 7.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Экспрессия изоформ КЛЦМ в органах и тканях. Сравнительный анализ содержания продуктов генетического локуса КЛЦМ в органах и тканях курицы с помощью иммуноблоттинга показал, что KRP выявляется в органах с высоким содержанием гладкомышечной ткани (пищеводе, тонкой кишке и мускульном желудке, а также сосудах и яйцеводе). KRP практически отсутствует в немышечных тканях и сердце взрослого животного (рис. I). КЛЦМ-108 обнаружена во всех исследованных тканях, причем ее содержание наиболее высоко в гладкомьпнечных тканях. КЛЦМ-210 имеет более ограниченное распределение. С помощью антител к KRP эта изоформа была выявлена в аорте и в печени курицы (рис. 1, сверху). С помощью антител, специфических к высокомолекулярной изоформе, КЛЦМ-210 была выявлена также в вене, яйцеводе, почке и брюшине курицы (рис. 1, снизу). Кроме этого, высокомолекулярная изоформа КЛЦМ была обнаружена в аорте, гипофизе, надпочечнике и предстательной железе человека.

На следующем этапе были исследованы особенности локализации изоформ КЛЦМ в тканях курицы с помощью иммуногистохимических методов. Иммунофлуоресцентное окрашивание тканевых срезов аорты показало, что КЛЦМ-210 локализуется совместно с гладкомышечньтм а-актином в слоях гладкомышечных клеток сосудистой стенки. Однако, КЛЦМ-210 удавалось обнаружить в стенках не всех сосудов. Медиальный слой vasa vasorum, а также мелких сосудов, пронизывающих стенки трахеи, пищевода и яйцевода, не окрашивался антителами, специфическими к КЛЦМ-210. Не окрашивался этими антителами и медиальный слой артерии в триадах печени. Более детальное исследование локализации КЛЦМ-210 в стенке артерий показало, что хотя КЛЦМ-210 не выявляется в слоях гладких мышц, она обнаруживается в эндотелиальной выстилке и адвентиции артерий.

Иммунофлуоресцентное окрашивание позволило выявить

высокомолекулярную изоформу КЛЦМ в определенных типах эпителия, например, в эпителии трахеи и яйцевода. И в трахее, и в яйцеводе КЛЦМ-210 локализуется в апикальной части слоя эпителиальных клеток, выстилающих стенку органа. В печени КЛЦМ-210 была выявлена в ветвях портальной вены и синусоидах.

КЛЦМ-210 КЛЦМ-108

KRP

¿Ж */ш///

•л

га*

/

■—КЛЦМ-210

Рисунок 1. Анализ содержания изоформ КЛЦМ в органах курицы.

Вверху - иммуноблот экстрактов различных тканей курицы,

окрашенный антителами к КЯР. На каждую дорожку нанесено 10 мкг белка.

Внизу - иммуноблот экстрактов различных тканей курицы,

окрашенный антителами к уникальному фрагменту КЛЦМ-210. На каждую дорожку, кроме первой, нанесено 35 мкг белка. На первую дорожку (гомогенат аорты)

нанесено 10 мкг белка

Таким образом, наблюдается дифференциальная тканевая экспрессия изоформ КЛЦМ. КЛЦМ-108 обнаружена практически во всех тканях, но она преобладает в гладкомышечных тканях. КЛЦМ-210 преимущественно локализована в немышечных тканях, а именно, в некоторых типах эпителия, и, кроме того, в гладких мышцах аорты.

Другими исследователями высокомолекулярная изоформа КЛЦМ была обнаружена в некоторых эмбриональных тканях мыши и курицы и лабораторных клеточных линиях. Fisher and Ikebe обнаружили мРНК высокомолекулярной изоформы КЛЦМ и соответствующий белок в кишке, мускульном желудке, сердце, аорте и печени 10-17-ти дневных эмбрионов курицы (Fisher and Ikebc, 1995). Gallagher et al. (1995) показали, что высокомолекулярная изоформа КЛЦМ экспрессируется в сердце и печени 15-дневного эмбриона мыши. Обе группы исследователей не смогли обнаружить значимые количества высокомолекулярной изоформы КЛЦМ в тканях взрослых животных, за исключением печени, где в определенных условиях удавалось детектировать небольшие количества продукта. На основании этого авторы сделали заключение, что высокий уровень ее экспрессии характерен для эмбриональных тканей, а в процессе иостнатального развития экспрессия снижается. В связи с этим было высказано предположение, что высокомолекулярная изоформа КЛЦМ является эмбриональной КЛЦМ. Наши данные, напротив, демонстрируют, что высокомолекулярная изоформа КЛЦМ не является только эмбриональной изоформой, поскольку она обнаруживается в тканях взрослых организмов.

На основании данных об экспрессии высокомолекулярной изоформы КЛЦМ в эмбриональных тканях, недифференцированных эмбриональных стволовых клетках и различных клеточных линиях, таких, как COS, REF, ЗТЗ, Gallagher et al. (1995) было высказано предположение о том, что эта изоформа КЛЦМ важна для регуляции акта-

миозиновой подвижности в пролиферирующих и мигрирующих клетках. Мы обнаружили КЛЦМ-210 в дифференцированных эпителиальных клетках трахеи и яйцевода, а также в гладко.мышечных клетках аорты, которые в нормальных условиях в организме не нролиферируют. Таким образом, наши данные указывают на го, что роль КЛЦМ-210 не oi-раничивается функцией, которую этот белок может выполнять в пролиферирующих клетках.

До настоящего времени в литературе имелись данные об экспрессии изоформ КЛЦМ в тканях и клетках, полученные с использованием молекулярно-биологических и биохимических подходов, позволяющих оценить лишь присутствие/отсутствие белка и его сравнительное содержание. Мы же применили иммуногистохимический метод, что позволило нам исследовать локализацию и распределение этих белков в органах и тканях. Как уже упоминалось выше, Gallagher el al. (1995) и Fisher and Ikebe (1995) была отмечена экспрессия высокомолекулярной изоформы КЛЦМ в печени, однако, нами впервые показано, что этот белок локализован в венах и синусоидах, то не в паренхиме, образуемой гепатоцитами. Нами также было продемонстрировано, что высокомолекулярная изоформа КЛЦМ присутствует в эпителиальных тканях. Все типы эпителия, в которых была обнаружена КЛЦМ-210, - псевдомногослойный эпителий, выстилающий просвет трахеи и яйцевода, и эндотелий сосудов - являются активно экзоцитиругощими/эндоцитирующими типами клеток. Более того, показанная нами локализация КЛЦМ-210 именно в апикальной части эпителиального слоя в трахее и яйцеводе позволяет предположить участие высокомолекулярной изоформы КЛЦМ в процессе секреции. Эта изоформа, гак же как и "классическая" низкомолекулярная изоформа КЛЦМ, может осуществлять фосфориларование миозина II (Gallagher et al., 1995; Kudryashov et al., 1999). Кроме того, КЛЦМ-210, по-видимому, обладает какими-то специфическими свойствами, необходимыми для обеспечения подвижности нсмышечных. клеток. Некоторые функциональные свойства КЛЦМ-210 были установлены в ходе дальнейшего исследования.

2. Внутриклеточная локализация КЛЦМ-210. На следующем этапе работы мы поставили задачу изучить внутриклеточную локализацию высокомолекулярной изоформы КЛЦМ. 13 качестве объекта исследования была выбрана первичная культура клеток, выделенных из аорты эмбриона курицы. Для выяснения локализации КЛЦМ-210 в культивируемых клетках использовали метод непрямой иммунофлуоресценции. Как видно из рисунка 2, антитела, специфические к уникальному фрагменту КЛЦМ-210 окрашивают пучки микрофиламентов в культивируемых ГМК. Высокомолекулярная изоформа КЛЦМ имеет аналогичное распределение в гладкомышечных клетках человека. Антитела N875, специфические к КЛЦМ-210, выявляют микрофиламенты в клетках H1SM (гладкомышечных клетках из кишки человека). Следовательно, КЛЦМ-210 локализуется на микрофиламентах в гладкомышечных клетках.

Нами был применен также альтернативный метод исследования внутриклеточной локализации белков - локализация после трансфекции клеток соответствующей молекулярно-генетической конструкцией. Была произведена трансфекция клеток HeLa конструкцией, кодирующей КЛЦМ-210 с дополнительным GFP-доменом. GFP обладает собственной флуоресценцией, поэтому гибридный белок, экспрессирующийся в трансфицированных клетках, тоже обладает способностью к флуоресценции, что делает возможным наблюдение за его

накоплением и перераспределением в живой клетке. При микроскопическом исследовании нефиксированных препаратов было обнаружено, что флуоресцентный продукт накапливается на микрофиламентах. Для визуализации Ф-актина клетки были фиксированы и окрашены ТРИТЦ-фаллоидином. Оказалось, что КЛЦМ-210-СБР действительно локализуется совместно с микрофиламентами в трансфицированных клетках. 13 контрольных клетках, трансфинированных плазмидой, кодирующей только ОРР, флуоресцентный продукт был распределен равномерно в цитоплазме.

Рисунок 2. Локализация КЛЦМ-210 в культивируемых гладкомышечных клетках. Двойное иммунофлуоресцентнос окрашивание первичной культуры клеток, выделенных из аорт эмбрионов курицы, антителами #3528 к КЛЦМ-210 (А) и антителами к гладкомышечному а-актину (Б).

Известно, что низкомолекулярная изоформа КЛЦМ локализуется совместно с микрофиламентами в культивируемых клетках (De Lanerolle et al., 1981; Guemeio et al., 1981). Изучение высокомолекулскулярной изоформы началось сравнительно недавно, и на сегодняшний день опубликовано только две работы, затрагивающие внутриклеточную локализацию этого белка (Verin et al., 1998; Garcia et al., 1999). Авторы исследовали распределение высокомолекулярной изоформы КЛЦМ в культивируемых эндотелиальных клетках и показали, что в этих клетках в отсутствие стимуляции не наблюдается колокализации актина и КЛЦМ. Обработка клеток тромбином или дипероксованадатом приводила к частичному совпадению окрашивания КЛЦМ с сетью филаментарного актина (Verin et al., 1998; Garcia et al., 1999), Возможно, в эндотелиальных клетках высокомолекулярная изоформа КЛЦМ взаимодействует с какими-то другими внутриклеточными структурами, природа которых пока не известна. В то же время в нашей работе четко показано, что КЛЦМ-210 распределена вдоль актииовых филаментов в гладкомышечных клетках.

Таким образом, полученные данные указывают на то, что мишенью КЛЦМ-210 как в гладкомышечиой, так и в немышечной клетке являются микрофиламенты. Тем не менее, наличие у КЛЦМ-210 дополнительной протяженной N-концевой последовательности дает основания предполагать, что этот белок может взаимодействовать с белками и/или какими-то внутриклеточными структурами, с которыми не может взаимодействовать КЛЦМ-108. Поиск клеточных партнеров КЛЦМ-210 - предмет дальнейшего изучения.

3. Некоторые функциональные свойства высокомолекулярной изоформы КЛЦМ.

3.1. Анализ взаимодействия уникального фрагмента КЛЦМ-210 с элементами питоскелета т \ч\>о. КЛЦМ-210 была выявлена на микрофиламентах культивируемых клеток. Поэтому можно было предполагать, что уникальный фрагмент КЛЦМ-210 вовлечен во взаимодействие с микрофиламентами. Для проверки этой гипотезы мы использовали два различных метода. В первом случае была исследована способность рекомбинантного фрагмента N875 (содержащего остатки 1-875 КЛЦМ-210), меченного флуоресцентным красителем, окрашивать фиксированные и пермеабилизованные клетки. Оказалось, что СуЗ-\>875 декорирует микрофиламенты. Во втором случае была осуществлена транзигорная трансфекция клеток НеЬа плазмидой, кодирующей уникальный фрагмент КЛЦМ-210 с дополнительной П,АО-носледователыюстью на М-концс (ГГАО-К934). Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание этих клеток антителами к АО-последовательности и ТРИТЦ-фаллоидином выявило, что уникальный фрагмент обнаруживается на микрофиламентах трансфицированных клеток (см. рис. 3). Полученные результаты означают, что уникальная часть КЛЦМ-210 способна взаимодействовать с микрофиламентами в клетке.

Рисунок 3. Уникальный фрагмент КЛЦМ-210 колокализуегся с микрофиламентами в культивируемых клетках.

Клетки НеЬа транзнторно трансфицировали конструкцией рРЬАО-Ш34, фиксировали через 14 часов после трансфекции и проводили двойное иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к РЬАО-гюследовательности (А) и ТРИТЦ-фаллоидином (Б).

3.2. Экстракция изоформ КЛЦМ из клеток. Обнаружив, что уникальный фрагмент КЛЦМ-210 связывается с микрофиламентами in vivo, мы предположили, что в клетке КЛЦМ-210 может взаимодействовать с цигоскелетом более эффективно, чем КЛЦМ-108. Для проверки этого предположения была исследована способность изоформ КЛЦМ экстрагироваться культивируемых клеток линии А10 - гладкомышечных клеткок из аорты крысы, которые содержат обе изоформы КЛЦМ. Фракционирование проводили стандартным образом буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl, pH 7.4, 125 мМ сахарозу, 2 мМ ЭГТА, 0.05% Тритон Х-100, ингибиторы протеиназ и 0-500 мМ KCl. Полученные экстракты анализировали с помощью иммуноблотгинга. Как видно из рисунка 4, КЛЦМ-108 переходила в растворимую фракцию уже при концентрации KCl от 0 до 100 мМ, а при концентрации KCl 200 мМ КЛЦМ-108 обнаруживалась только в растворимой фракции. КЛЦМ-210 при

концентрации КС1 0-100 мМ оставалась в детергент-нерастворимом осадке, а при концентрации КС1 200 мМ обнаруживалась и в надосадочной фракции, и в осадке. Только при концентрациях КС1 выше 300 мМ КЛЦМ-210 обнаруживалась преимущественно в растворимой фракции.

Рисунок 4.

Дифференциальная экстракции КЛЦМ-210 и КЛИМ-108 из культивируемых клеток.

Экстракцию КЛЦМ проводили буфером, содержащим

увеличивающиеся концентрации КСЛ (указаны сверху на каждой панели). Тритон-растворимые надосадочные фракции (н) и Тритон-нерастворимые осадки (о) анализировали с помощью иммуноблоттинга, используя антитела # 859.

Таким образом, КЛЦМ-210 и КЛЦМ-108 различаются по своей способности экстрагироваться из клеток., причем высокомолекулярная изоформа оказывается более сильно связанной с цитоскелетной фракцией, а именно - с микрофиламентами. Следовательно, уникальный фрагмент КЛЦМ-210 усиливает взаимодействие протеинкиназы с микрофиламентами в клетке.

3.3. Действие ингибиторов активности КЛЦМ на клетки, экспрессирующие преимущественно одну изоформу КЛЦМ. Известно, что уникальный фрагмент КЛЦМ-210 способен собирать в пучки фибриллярный актин in vitro (Kudryashov et al., 1999). На основании этих данных было высказано предположение о том, что КЛЦМ-210 может стабилизировать микрофиламенты in vivo. Для проверки этого предположения необходимо было нейтрализовать стабилизирующее действие фосфорилированного миозина на актиновые филаменты. Известно, что дефосфорилирование миозина как следствие ингибирования активности КЛЦМ приводит к дестабилизации актинового цитоскелета в немышечных клетках (Lamb et al., 1988; Jian et al., 1994). Мы исследовали действие ингибиторов активности КЛЦМ ML-7 и ML-9 на морфологию и состояние актинового цитоскелета клеток, экспрессирующих преимущественно одну из двух изоформ КЛЦМ. Для сравнения были взяты клетки HISM, экспрессирующие только КЛЦМ-210, и клетки А10, экспрессирующие преимущественно КЛЦМ-108.

Контрольные клетки обоих типов были распластанными, вытянутыми, с четко видимыми при нммунофлуоресцентном окрашивании пучками актиновых филаментов, расположенными вдоль продольной оси клетки. При обработке клеток ML-7 или ML-9 в концентрации 20 мкМ в течение 50 мин наблюдалось сжатие клеток и перераспределение в них актина из вытянутых микрофиламентов в

0 100 200 300 400 MM KCI

I н оЦн о | Г н о|| н о|| н ~о

КЛЦМ-210 КЛЦМ-108

коллапсированные пучки в цитоплазме и в леринуклеарном пространстве клеток. Наблюдаемые изменения морфологии клеток и актинового цитоскелета были обратимыми. После отмывания ингибиторов клетки полностью восстанавливали морфологию и картину микрофиламентов, свойственную необработанным клеткам. Кроме того, обработка клеток бнсиндолилмалеимидом-IX (ингибитором РКС, не влияющим на активность КЛЦМ) не приводила к каким-либо видимым изменениям в структуре актинового цитоскелета, выявляемым при иммунофлуоресцентном окрашивании. Сравнение клеток HISM и А10, обработанных ингибиторами КЛЦМ, выявило, что H1SM клетки более устойчивы к действию ингибиторов. В присутствии 20 мкМ ML-7 значительное количество HISM клеток оставались распластанными и сохраняли стресс-фибриллы, в то время как клетки А10 ошаривались и начинали открепляться. ML-9 вызывал более слабые эффекты, чем ML-7 на обоих типах клеток, что согласуется с меньшей эффективностью этого ингибитора, отмеченной другими исследователями (Saitoh et al., 1987; Ishikawa et al., 1988; Heyworth et al., 1995). Клетки, экспрессирующие преимущественно высокомолекулярную изоформу КЛЦМ, более устойчивы к дестабилизирующему влиянию ингибиторов КЛЦМ на цитоскелет. По-видимому, КЛЦМ-210 использует два механизма для связывания с актином несколько участков - участки, общие с КЛЦМ-108, а также свои собственные. Вероятно, за счет этого КЛЦМ-210 может стабилизировать актиновый цитоскелет не только благодаря своей ферментативной активности, но и за счет физической стабилизации пучков актиновых филаментов, подобно другим актин-связывающим белкам, таким как тропомиозин, кальдесмон и филамин.

Полученные данные позволяют предположить, что в немышечных клетках КЛЦМ-210 может выполнять функцию интегратора цитоскелета. В отличие от гладких мышц, в нсмышечпых клетках отсутсгнуют постоянно собранные сократительные элементы, и все двигательные реакции этих клеток определяются локальной сборкой актомиозина. Возможно, в немышечных клетках КЛЦМ-210 может выполнять несколько функций: 1) связываясь с актином, способствовать сборке пучков актиновых филаментов, 2) находясь на актиновом филаменте, фосфорилировать миозин и тем самым организовывать сборку и работу сократительного аппарата и 3) сопрягать актомиозиновые волокла с другими компонентами цитоскелета.

4. Изучение экспрессии изоформ КЛЦМ в культивируемых сегментах аорты и гладкомышечных клетках аорты курицы, В гладкомышечных клетках аорты экспрессируются обе изоформы КЛЦМ. Известно, что ГМК сосудов являются клетками, которые способны претерпевать фенотипическую модуляцию (Chamley-Campbell et al. 1979; Owens, 1995). Культура ГМК аорты представляет собой охарактеризованную модель для изучения этого процесса. Мы исследовали, как изменяется экспрессия КЛЦМ при фенотипической модуляции ГМК.

4.1. Экспрессия изоформ КЛЦМ в органной культуре гладкомышечной ткани аорты при механической стимуляции. Ранее проведенные в нашей лаборатории исследования показали, что механическая стимуляция влияет на фенотип гладкомышечных клеток сосудов (Birukoy et al., 1995). Периодическое растяжение увеличивает экспрессию некоторых структурных и регуляторных белков, в частности, h-кальдесмона и филамина (Birukov et al., 1995) и гладкомышечного миозина (Reusch et al., 1996) в ГМК сосудов. Мы исследовали, влияет ли периодическая механическая стимуляция на экспрессию КЛЦМ.

Сегменты аорты курицы, лишенные эндотелия, культивировали в стационарных условиях (в отсутствие растяжения) и в режиме периодической механической стимуляции. Культивирование сегментов сосудов в стационарных условиях приводит к снижению содержания обеих изоформ по сравнению с контролем - свежевыделенным сосудом (рис. 5). При этом экспрессия КЛЦМ-210 снижается сильнее, чем экспрессия КЛЦМ-108, что приводит к изменению соотношения КЛЦМ-210/КЛЦМ-108. Культивирование сегментов аорты в режиме периодического растяжения замедляет снижение содержания обеих изоформ и поддерживает соотношение изоформ КЛЦМ (рис. 5). Влияние механической стимуляции имеет обратимый характер. Прекращение механической стимуляции сосуда на 3 дня приводит к значительному уменьшению содержания КЛЦМ-108 и КЛЦМ-210, а возобновление стимуляции увеличивает содержание обеих изоформ.

Рисунок 5. Влияние

механической стимуляции на экспрессию изоформ КЛЦМ в органной культуре сегментов аорты курицы.

Сегменты аорты культивировали, как описано в материалах и методах. Анализ экспрессии изоформ КЛЦМ проводили методом иммуноблоттинга.

Содержание КЛЦМ в

свежевыделенной аорте принимали за 100%. На диаграмме приведены средние значения ± стандартная ошибка из 4 независимых экспериментов. Темные столбцы -КЛЦМ-210, светлые столбцы-КЛЦМ-108.

Исследования других групп ученых показали, что механическая стимуляция приводит к увеличению уровня экспрессии низкомолекулярной изоформы КЛЦМ в культивируемых ГМК из трахеи собаки (Smith et al., 1997; Smith et al., 1999). Однако, такой эффект действия механической стимуляции исследователи наблюдали только в условиях, когда амплитуда растяжения составляла от 16 до 30%. При периодическом растяжении с амплитудой до 15% не было отмечено увеличения содержания КЛЦМ (Smith et al., 1997). Наши результаты демонстрируют, что периодическое растяжение с амплитудой 15%, не превышающей физиологических значений амплитуды растяжения сосудистой стенки, влияет на экспрессию КЛЦМ в гладкомышечных клетках. Возможно, причина таких различий заключается в специфике объектов исследования (ГМК трахеи и сосудов) и в особенностях экспериментальных моделей. Использованная нами модель органной культуры позволяет сохранить естественное окружение ГМК, в частности, компоненты межклеточного матрикса, которые могут потенциировать эффекты механической стимуляции на экспрессию белков в гладкомышечных клетках (Birukov et al., 1995).

Предотвращение снижения экспрессии КЛЦМ предполагает, что сосуды, подвергавшиеся растяжению, лучше сохраняют способность к сокращению, поскольку КЛЦМ является скорость-лимитирующим ферментом, необходимым для инициации сокращения гладкомышечной клетки (Murphy et al., 1989). Действительно, было показано, что культивирование ГМК из мышцы трахеи в режиме периодического растяжения приводит к увеличению скорости и амплитуды укорочения отдельных клеток. При этом увеличение максимальной скорости сокращения коррелирует с увеличением содержания КЛЦМ в клетке и уровнем фосфорилирования РЛЦ миозина (Smith et al., 1999).

Таким образом, полученные дашше указывают на то, что содержание сосудистой ткани в органотипической культуре для исследовательских и медицинских целей следует дополнять механической стимуляцией.

4.2. Влияние гепарина на экспрессию изоформ КЛЦМ. Известно, что гепарин является веществом, замедляющим фенотипическую модуляцию и специфически ингибирующим пролиферацию ГМК в культуре и in vivo (Hoover et al., 1980; Reilly et al., 1989; Guyton et al., 1980; Clowes ei al., 1988). Нами было исследовано действие гепарина на экспрессию изоформ КЛЦМ в первичных и пассированных ГМК аорты. Гепарин в используемых концентрациях практически не оказывал ингибирующего влияния на пролиферацию куриных ГМК в первичной и пассированной культуре. В первичной культуре ГМК гепарин в концентрации 0.25 мг/мл предотвращал снижение экспрессии КЛЦМ-108 и значительно стимулировал экспрессию КЛЦМ-210. В пассированных ГМК гепарин стимулировал экспрессию обеих изоформ КЛЦМ (рис. б). Гепарин в концентрациях от 5 до 100 мкг/мл вызывал дозозависимое увеличение экспрессии обеих изоформ КЛЦМ. При этом даже в концешрации 100 мкг/мл он не влияет на содержание в пассированных ГМК кальдесмона, сс-актишша и кальпонина, что свидетельствует об избирательном действии этого вещества на экспрессию белков в ГМК. Удаление гепарина из среды культивирования приводит к снижению содержания обеих изоформ КЛЦМ до контрольного уровня. Следует отметить тот факт, что гепарин оказывает однонаправленный эффект на экспрессию обеих изоформ КЛЦМ, но экспрессия высокомолекулярной изоформы оказывается

Рисунок 6. Влияние гепарина на экспрессию изоформ КЛЦМ в культивируемых ГМК аорты курицы.

ГМК аорты 2 пассажа, достигшие конфлуента, культивировали в течение 3 дней в среде, содержащей 2.5% ЭТС, в отсутствие или в присутствии 100 мкг/мл гепарина. Содержание КЛЦМ оценивали с помощью иммуноблоттинга. Приведены средние значения ± стандартная ошибка из 3 независимых экспериментов. Темные столбцы - КЛЦМ-210, светлые столбцы-КЛЦМ-108.

более чувствительной к гепарину.

S? 250 §• 200 о «О

5 1оо £ о.

о 50 о

" 0

-t

Т

j ;

контроль

гепарин

4.3. Экспрессия изоформ КЛИМ в первичной культуре ГМК. Нами была изучена экспрессия обеих изоформ КЛЦМ в первичной культуре ГМК, выделенных из медии аорты курицы. На рисунке 7 приведена типичная диаграмма содержания изоформ КЛЦМ в различных временных точках, соответствующих различной степени конфлуэнтности культуры ГМК. В первичном изоляте ГМК содержание КЛЦМ-108 и КЛЦМ-210 максимально. В первые дни культивирования экспрессия обеих изоформ КЛЦМ уменьшалась. С началом стадии пролиферации содержание обеих изоформ КЛЦМ начинало вновь возрастать, однако, в различной степени. Содержание КЛЦМ-108 увеличивалось незначительно, а содержание КЛЦМ-210 практически восстанавливалось до исходного уровня. Как следствие, при культивировании ГМК изменялось соотношение изоформ КЛЦМ. Если в аорте и в первичном изоляте аортальных клеток содержание КЛЦМ-210 составляло примерно четверть от содержания КЛЦМ-108, то в процессе культивирования ГМК содержание КЛЦМ-210 становилось сравнимым с содержанием КЛЦМ-108 (см. рис. 7). По-видимому, на экспрессию этих белков могут оказывать влияние развитость клеточных контактов, компоненты межклеточного матрикса, а также матрикс-ассоциироваипые факторы роста, количество которых возрастает со временем культивирования клеток.

л а1

§1 с;

О!

к 5г

= X о £ о Ц о. а>

с £ о

£ о о о

X ь о

0 3 8

дни в культуре

Рисунок 7, Экспрессия КЛЦМ в первичной культуре ГМК аорты курицы.

На верхней панели представлена динамика культуры ГМК. На нижней панели приведена диаграмма содержания изоформ КЛЦМ в различные периоды культивирования. Показаны результаты типичного эксперимента. Темные столбцы КЛЦМ-210, светлые столбцы- КЛЦМ-108.

Итак, фенотипическая модуляция ГМК аорты сопровождается снижением содержания обеих изоформ КЛЦМ, также как и других структурных и регуляторных белков, характерных для дифференцированного фенотипа ГМК. Факторы, замедляющие фенотипическую модуляцию, стимулируют экспрессию обеих изоформ

КЛЦМ. В тоже время, в ГМК дифференцированного фенотипа преимущественно экспрессируется КЛЦМ-108, а в модулированных ГМК на пинает значительно экспрессироваться КЛЦМ-210. Можно предположить, что КЛЦМ-108 является изоформой, регулирующей сократительную активность клеток, а КЛЦМ-210 может регулировать как сокращение, так и иные клеточные процессы, которые не нарушаются, а, напротив, активируются при переходе ГМК в секреторный фенотип. К таким процессам, на наш взгляд, относятся секреторная активность и миграция ГМК.

5. Фосфорилирование КЛЦМ в культуре ГМК аорты. Как упоминалось выше, КЛЦМ является ключевым регулятором миозина И-го типа. Очевидно, что активность КЛЦМ также должна регулироваться. Одним из способов изменения активности ферментов является фосфорилирование. Мы исследовали, какие сигнал-проводящие каскады опосредуют фосфорилирование обеих изоформ КЛЦМ в культивируемых ГМК аорты курицы.

Известно, что цАМФ-зависимая протеиикиназа (РКА) фосфорилирует КЛЦМ in vitro и такое фосфорилирование приводит к снижению активности КЛЦМ (Conti and Adelstein, 1981). Мы попытались оценить возможную роль РКА в регуляции свойств КЛЦМ-210 in vivo. Обработка ГМК форсколином (активатором аденилат-циклазы) не приводила к увеличению уровня фосфорилирования обеих изоформ КЛЦМ (рис. 8). Наблюдаемое отсутствие увеличения уровня фосфорилирования можно объяснить несколькими причинами: с одной стороны, протеиикиназа А может не участвовать в фосфорилировапии КЛЦМ в ГМК, претерпевших феиотипическую модуляцию, с другой стороны, существует вероятность того, что КЛЦМ в культивируемых ГМК курицы еше в отсутствие стимуляции полностью фосфорилирована РКА по ее сайтам или другой протеинкиназой по тем же сайгам. Таким образом, полученные результаты пока не позволяют нам сделать вывод о роли РКА в регуляции активности КЛЦМ-210 в аортальных ГМК. Однако, такая регуляция может иметь место в других типах клеток, например, в эндотелии, как это было показано Garcia et al. (1997).

На следующем этапе работы мы использовали форбол-12,13-днбутират (PDBu) для стимуляции ГМК. Форболовые эфиры являются функциональными аналогами диацилглицерина и прямыми активаторами протеинкиназы С (РКС). Обработка форболовым эфиром приводила к значительному увеличению уровня фосфорилирования обеих изоформ КЛЦМ, сравнимому с уровнем фосфорилирования, достигаемым при обработке ГМК окадаевой кислотой -ингибитором серин/треониновых фосфатаз. Обработка ГМК ингибитором РКС -бисиндолилмалеимидом I (B1M-I) предотвращала увеличение стимулированного форболовым эфиром фосфорилирования КЛЦМ (рис. 8). Таким образом, полученные результаты показывают, что активация протеинкиназы С необходима для индуцированного форболом фосфорилирования КЛЦМ, однако, остается неясным, вовлечена ли РКС в прямое фосфорилирование КЛЦМ в исследуемых клетках. Для ответа на этот вопрос было проведено картирование фосфопептидов КЛЦМ-108 до и после стимуляции ГМК форболовым эфиром. С помощью этого экспериментального подхода было показано, что РКС не фосфорилирует КЛЦМ в исследуемых клетках. Было показано, что PDBu стимулирует фосфорилирование КЛЦМ-108 по двум основным участкам, оба из которых представляют собой сайты МАР-киназ.

Авторадиограмма

Иммуноблот

Рисунок 8. Фосфорилировапие КЛЦМ в ГМК аорты курицы при стимуляции форсколином п форболовым -эфиром.

Культивируемые ГМК, метаболически меченные '2Р, обрабатывали 20мкМ форсколина или 2 мкМ PDBu (в отсутствие или в присутствии 3 мкМ BIM-1), затем лнзнровали и из лизатов иммунопреципитировали КЛЦМ. Приведены авторадиограмма иммунопреципитатов (верхние панели), блот иммунопреципитатов (средние панели) и относительное фосфорилировапие КЛЦМ-108 (нижние панели).

Известно, что активация протеинкиназы С приводит к инициации МАР-киназных сигнальных каскадов (Robinson and Cobb, 1997; Sugden and Clerk, 1998). Мы исследовали активацию различных подтипов МАР-киназ форбол-12,13-дибутиратом. Было показано, что обработка форболовым эфиром приводит к активации р42г,и и р38 МАР-киназ, но не приводит к активации JNK/SAPK. Для оценки вклада двух подтипов МАР-киназ, активируемых PDBu, в фосфорилировапие КЛЦМ в культивируемых ГМК были использованы два ингибитора: PD 98059 -ингибитор МЕК1/2 - протеинкиназ, активирующих р42/р44 МАРК (Alessi et al., 1995) и SB 202190 - прямой ингибитор р38 МАРК (Lee et al., 1994),. Обработка ГМК PD 98059 приводила к снижению форбол-стимулированного фосфорилирования КЛЦМ, тогда как обработка ГМК ингибитором р38 МАРК SB 202190 не влияла на уровень фосфорилирования КЛЦМ (см. рис.9). На основании этих данных можно заключить, что рА2"а МАРК, но не р38 МАРК вовлечена в форбол-стимулированное фосфорилировапие КЛЦМ в культивируемых ГМК аорты курицы.

Авторадиограмма

Иммуноблот

—КЛЦМ-210

—КЛЦМ-108—

О) s £ <0

о «

ц

о 5 ■9-

о о

е

ф

з

Ü I i

s s

U 4

О о X

—КЛЦМ-210—

-КЛЦМ-108—

ж

/// J*

Рисунок 9. Влияние ингибиторов МАР-киназ на форбол-стнмулированное фосфорилирование КЛЦМ в культивируемых ГМК аорты курицы.

ГМК, метаболически меченные ,2Р, инкубировали в отсутствие пли е присутствии ингибитора (50 мкМ РО 98059 и 10 мкМ БВ 202190, правая и левая панели, соответственно) затем лизировали и из лтатов пммунопреципитировали КЛЦМ Приведены авторадиограмма иммунопреципнтатов (верхние панели), блот иммунопрецинитатов (средние панели) и относительное фосфорилирование КЛЦМ-108 (нижние панели)

Недавние исследования показали, что р42/р44 МАРК вовлечена в фосфорилирование КЛЦМ m vivo (Klemke et al., 1997). Однако до настоящего времени оставалось неясным, участвуют ли другие типы МАР-киназ в фосфоршшровашш этого белка и каков вклад МАРК в общее фосфорилирование КЛЦМ в клетке. Полученные в настоящем исследовании результаты позволяют предположить, что р42е|И МАР-киназа непосредственно фосфоршшрует КЛЦМ, и, более того, является протеинкиназой, обеспечивающей мажорное фосфорилирование КЛЦМ в ГМК аорты курицы.

Интересно, что фосфорилирование КЛЦМ МАР-киназой in vitro приводит к активации КЛЦМ (Momson et al., 1996; Klemke et al., 1997), в то время как фосфорилирование другими протешташазами (РКА, РКС, СаМК II) приводит к снижению ее активности in vitro (Conti and Adelstein, 1981; Nishikawa et al., 1985; Hashimoto and Soderling, 1990). Таким образом, прямое фосфорилирование КЛЦМ МАР-киназой в клетке может приводить к усилению способности КЛЦМ фосфорилировать РЛЦ миозина, а это, в свою очередь, способствует активации

АТФазы актомиозина, необходимой для осуществления клеточной подвижности (Klemke et al., 1997). Механизмы такой регуляции активности КЛЦМ и возможность их осуществления in vivo должны явиться предметом дальнейнпгх исследований.

В ближайшем будущем ожидается установление полной структуры генетического локуса КЛЦМ, будет проведен промоторный анализ и найдены регуляторные единицы. Станут понятны молекулярно-генетические отношения двух изоформ КЛЦМ. Возможно, выяснится, что ген КЛЦМ-108 находится внутри гена КЛЦМ-210, подобно тому, как ген KRP располагается внутри гена КЛЦМ. Не исключено, что изучаемый нами генетический локус окажется еще более сложным, например, будут обнаружены дополнительные его продукты. В целом, молекулярные механизмы функционирования и регуляции продуктов генетического локуса киназы легких цепей миозина представляют исключительный интерес и, несомненно, будут изучаться в дальнейшем. Работы по идентификации клеточных партнеров КЛЦМ-210 позволят понять роль этого белка в гладкомышечных клетках секреторного фенотипа и в немышечных клетках.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что КЛЦМ-210 экспрессируется в основном в немышечных тканях и клетках (некоторых типах эпителия, эндотелии, фибробластах), а также в гладких мышцах аорты человека и животных, что предполагает участие КЛЦМ-210 в регуляции многообразных форм клеточной подвижности.

2. Впервые продемонстрировано, что КЛЦМ-210 локализуется совместно с микрофиламентами в культивируемых клетках. Во взаимодействии КЛЦМ-210 с микрофиламентами in viro участвует ее уникальный N-концевой фрагмент. Он опосредует более прочное связывание КЛЦМ-210, по сравнению с КЛЦМ-108, с актиновым цитоскелетом и тем самым способствует его стабилизации.

3. Показано, что экспрессия обеих изоформ КЛЦМ в гладкомышечных клетках аорты регулируется периодическим растяжением и гепарином, а также зависит от состояния клеточных контактов.

4. Изучено фосфорилирование изоформ КЛЦМ в культивируемых гладкомышечных клетках аорты курицы при стимуляции форболовым эфиром и форсколином. Установлено, что фосфорилирование КЛЦМ опосредуется p42erk: МАРК, но не р38 МАРК, РКА и РКС.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Birukov K.G., Schavocky J.P., Shirinsky V.P., Chibalina M.V., Van Eldik L.J., Watterson D.M. (1998) Organization of the genetic locus for chicken myosin light chain kinase is complex: multiple proteins are encoded and exhibit differential expression and localization. J. Cell. Biochem. 70: 402-413.

2. Kudryashov D.S, Chibalina M.V., Birukov K.G., Lukas T.J., Sellers J.R., Van Eldik L.J., Watterson D.M., Shirinsky V.P. (1999) Unique sequence of a high molecular weight myosin light chain kinase is involved in interaction with actin cytoskeleton. EEBSLett., 463, 67-71.

3. Чибалина M.B., Кудряшов Д.С., Шехошш Б.В., Ширинский В.П. (2000) Функциональные свойства и внутриклеточная локализация высокомолекулярной изоформы киназы легких цепей миозина. Цитология, 42: 248-255.

4. Воротников А.В., Крымский М.А., Чибалина М.В., Кудряшов Д.С., Ширинский В.П. (2000) Различия в форбол-зависимом фосфорилировании регуляторных белков и сокращении фазных и тонических гладких мышц. Цитология, 42: 378391.

5. Дуднакова Т.В., Степанова О.В., Чибалина М.В., Бирюков К.Г., Лапшин А.В., Ширинский В.П. (1996) Экспрессия продуктов гена киназы легких цепей миозина в гладком ышечных клетках аорты цыпленка. Тезисы ()ок.'шОов Всероссийской конференции "Прикладные аспекты исследования скелетных, сероечных и глаОкнхмышц", Пущино, с. 84-85.

6. Birukov K.G., Chibalina M.V., Kudryashov D.S., Stepanova O.V., Vorotnikov A.V., Sellers J.R., Collinge M„ Lukas T.J.. Van Eldik L.J., Watterson D.M., Shirinsky V.P.

(1997) MLCK-210 - a novel product of MLCK7KRP genetic locus. 2nd HHMl meeting of the International Research Scholars from the FSU and Eastern Europe, Warsaw, 38.

7. Chibalina, M.V., Kudryashov, D.S., Shekhonin, B.V., Shirinsky, V.P.(1998) Isolation, characterization and tissue distribution of myosin light chain kinase isofonns. Abstracts of the International Symposium "Biological motility: modern methods for studying", Pushchino, 30-31.

8. Vorotnikov A.V., Krymsky M.A., Kudryashov D.S., Nikashin A.V., Chibalina M.V., Shirinsky V.P. (1998) Phorbol ester stimulated protein phosphorylation in intact smooth muscle. Abstracts of the International Symposium "Biological motility: modern methods for studying", Pushchino, 176-177.

9. Krymsky M.A. Vorotnikov A.V., Kudryashov D.S., Chibalina M.V., Shirinsky V.P.

(1998) Ordered phosphorylation of KRP (telokin) and myosin light chain kinase in intact smooth muscle. Abstracts of the International Symposium "Biological motility: modern methods for studying", Pushchino, 75.

10. Vorotnikov, A.V., Krymsky, M.A., Chibalina, M.V., Shirinsky, V.P. (1998) Multiple site phosphorylation of myosin light chain kinase isofonns and kinase-related protein (telokin) in vitro and in vivo. Biophys. J. 74: A151.

11. Krymsky M.A., Kudryasliov D.S., Chibalina M.V., Lukas T.J., Watterson D.M., Shirinsky V.P., Vorotnikov A.V. (1999) Common sited phosphorylation of KRP (telokin) and myosin light chain kinase in intact smooth muscle cells. ,/. Muscle Res. Cell Motil. 20: 96.

12. Chibalina M.V., Sbeklionin B.V., Watterson D.M., Shirinsky V.P. (1999) Tissue distribution and intracellular localisation of MLCK. genetic locus products. ./. Muscle Res. Cell Motil. 20: 106.

13. Shirinsky V.P., Kudryashov D.S., Chibalina M.V., Birukov K.G., Lukas T.J., Sellers J.R., Van Eldik L.J., Watterson D.M. (1999) Potential role of a high-molecular-weight myosin light-chain kinase as a stabilizer of the actin cytoskeleton. Abstracts of the 4th HHM1 meeting of the International Research Scholars front the FSU and Eastern Europe, Moscow, 53.

14. Chibalina M.V., Krymsky M.A., Shirinsky V.P., Vorotnikov A.V. (1999) Involvement of MAP-kinases in the phorbol ester-induced phosphorylation of myosin light chain kinase and caldesmon in chicken aortic smooth muscle cells. Abstracts of the 2Hth European Muscle Congress, York, 200.

15. Kudryasliov D.S., Chibalina M.V., Birukov K.G., Lukas T.J., Sellers J.R., Van Eldik L.J., Watterson D.M., Shirinsky V.P. (1999) High molecular weight myosin light chain kinase unique sequence is involved in actin-bitiding and actin cytoskeleton stabilization. Abstracts of the 2Hth European Muscle Congress, York, 93.

Работа выполнена при финансовой поддержке НИМ! (грант 75195-546901) и РФФИ ([ранты 95-04-12260а и 96-04-106).

Список используемых сокращений:

1.СЛ - бычий сывороточный альбумин; ГМК - гладкомышечные клетки; ДАБ -диаминобензидин; ДС'Н - доденилсульфат натрия; РЛЦ - регуляторная легкая цепь миозина; ФСБ - фосфатно-солевой буфер; ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка; РОВн - форбол-12,13-дибутират.

Отпечатано в отделе оперативной печати Геологического ф-та МГУ Тираж (00 экз. Заказ № 3(

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чибалина, Маргарита Валериевна

Список сокращений, встречающихся в тексте диссертации.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Роль КЛЦМ в клеточной подвижности, опосредованной миозином 11-го типа.

1.1. Общая схема регуляции миозина II фосфорилированием.

1.2. Фосфорилирование регуляторных легких цепей гладкомышечного и немышечного миозинов КЛЦМ.

1.3. Фосфорилирование РЛЦ миозина другими протеинкиназами.

1.4. Роль КЛЦМ в регуляции различных форм подвижности эукариотических клеток.

2. Молекулярная организация и функциональные свойства классической КЛЦМ.

2.1. Доменная организация КЛЦМ.

2.2. Активация КЛЦМ Са /кальмодулином.

2.3. Связывание КЛЦМ с актином и миозином.

2.4. Фосфорилирование КЛЦМ различными протеинкиназами и модуляция активности КЛЦМ.

3. Гзнетический локус КЛЦМ как пример комплексной транскрипционной единицы у эукариот.

4. Функциональные свойства продуктов генетического локуса КЛЦМ.

4.1. Функциональные свойства К11Р.

4.2. Функциональные свойства высокомолекулярной изоформы КЛЦМ.

5. Экспрессия продуктов генетического локуса КЛЦМ в тканях и клетках.

5.1. Экспрессия КНР.

5.2. Экспрессия изоформ КЛЦМ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы.

Реактивы и материалы для биохимических и молекулярно-биологических исследований.

Реактивы и материалы для клеточно-биологических исследований.

Методы.

Биохимические и физико-химические методы.

Определение концентрации белков.

Электрофорез и денситометрия.

Приготовление образцов клеток и тканей для электрофореза.

Молекулярно-биологические методы.

Создание и характеристика молекулярно-генетических конструкций.

Иммунологические и иммунохимические методы.

Получение антител N875.

Получение и характеристика моноклональных антител 2Б4.

Аффинная очистка антител к КЛР, КЛЦМ-108 и уникальному фрагменту КЛЦМ-210.

Иммуноблоттинг.

Иммуноф луоресценция.

Иммунопреципитация.

Клеточно-биологические методы.

Выделение и культивирование клеток.

Выделение и культивирование гладкомышечных клеток.

Выделение и культивирование мезотелия.

Культивирование линейных клеток.

Экстракция КЛЦМ из культивируемых клеток.

Ингибирование КЛЦМ в культивируемых клетках.

Определение активации МАР-киназ.

Определение активации р42/р44 и р38 МАРК.

Определение активности JNK.

Метаболическое мечение клеток Р и in vivo фосфорилирование КЛЦМ.

Окрашивание клеток Cy3-N875.

Транзиторная трансфекция культивируемых клеток молекулярно-генетическими конструкциями.

Органная культура аорты в режиме механической стимуляции.

Статистический анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Антитела, использованные для анализа экспрессии продуктов генетического локуса КЛЦМ.

Экспрессия продуктов генетического локуса КЛЦМ в органах и тканях курицы.

Внутриклеточная локализация КПЦМ-210.

Локализация КЛЦМ-210 в гладкомышечных клетках.

Локализация КЛЦМ-210 в немышечных клетках, трансфицированных плазмидой, кодирующей КЛЦМ-210-GFP.

Некоторые функциональные свойства высокомолекулярной изоформы КЛЦМ.

Анализ взаимодействия уникального фрагмента КЛЦМ-210 с элементами цитоскелета in vivo.

Экстракция изоформ КЛЦМ из клеток.

Влияние ингибиторов активности КЛЦМ на морфологию и состояние актинового цитоскелета клеток, экспрессирующих преимущественно одну изоформу КЛЦМ.

Изучение экспрессии продуктов генетического локуса КЛЦМ в культивируемых сегментах аорты и гладкомышечных клетках аорты курицы.

Экспрессия изоформ КЛЦМ в органной культуре гладкомышечной ткани аорты при механической стимуляции.

5.2. Экспрессия продуктов генетического локуса КЛЦМ в первичных и пассированных ГМК.

5.3. Влияние гепарина на экспрессию изоформ КЛЦМ в первичных и пассированных ГМК.

6. Фосфорилирование КЛЦМ в культуре ГМК аорты курицы.

6.1. Фосфорилирование КЛЦМ при стимуляции ГМК окадаевой кислотой.

6.2. Фосфорилирование КЛЦМ при стимуляции ГМК форсколином.

6.3. Фосфорилирование КЛЦМ при стимуляции ГМК форболовым эфиром.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия, локализация и фосфорилирование изоформ киназы легких цепей миозина в клетках животных и человека"

Киназа легких цепей миозина (КЛЦМ) - ключевой Са -зависимый регулятор сокращения гладких мыщц и разнообразных форм подвижности немышечных клеток, таких как миграция, цитокинез, секреция и многих других.

Генетический локус гладкомьппечной/немьппечной КЛЦМ позвоночных имеет сложную организацию. Он кодирует три продукта: классическую КЛЦМ, молекулярная масса которой составляет 108 кДа, высокомолекулярную изоформу КЛЦМ с молекулярной массой 210 кДа и белок KRP (Kinase Related Protein). KRP представляет собой белок, идентичный по аминокислотной последовательности С-концевому домену КЛЦМ. Он экспрессируется с собственного промотора, который находится внутри интрона КЛЦМ. КЛЦМ-210 включает в себя всю последовательность и все функциональные домены КЛЦМ-108 и кроме того содержит протяженную уникальную последовательность, которая отсутствует у КЛЦМ-108. Несмотря на то, что структура гена КЛЦМ известна, никакие регуляторные единицы пока не найдены и молекулярно-генетические отношения двух изоформ КЛЦМ на сегодняшний день остаются невыясненными. Пока не понятно, являются ли они продуктами альтернативного сплайсинга или их экспрессия инициируется с альтернативных промоторов. Неизвестно также, как регулируется экспрессия этих белков в тканях и в процессе онтогенеза.

Свойства КЛЦМ-108 изучаются уже несколько десятков лет, в то время как КЛЦМ-210 была открыта совсем недавно. Известно, что КЛЦМ-210 тоже является протеинкиназой и фосфорилирует тот же субстрат, что и КЛЦМ-108, -регуляторные легкие цепи миозина II типа. Однако, другие свойства высокомолекулярной изоформы КЛЦМ изучены мало. Не известно ее внутриклеточное и тканевое распределение. Остается неясным, в чем заключаются функциональные различия двух изоформ.

Целью настоящей работы являлось изучение локализации, экспрессии и посттрансляционных модификаций продуктов генетического локуса киназы легких цепей миозина в клетках позвоночных.

В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить локализацию изоформ КЛЦМ в тканях и их экспрессию в культивируемых гладкомышечных клетках. 9

2. Установить внутриклеточное распределение КЛЦМ-210 и роль ее уникальной последовательности во взаимодействии с цитоскелетом.

3. Исследовать фосфорилирование КЛЦМ в культивируемых гладкомышечных клетках.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Чибалина, Маргарита Валериевна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что КЛЦМ-210 экспресснруется в основном в немышечных тканях и клетках (некоторых типах эпителия, эндотелии, фибробластах), а также в гладких мышцах аорты человека и животных, что предполагает участие КЛЦМ-210 в регуляции многообразных форм клеточной подвижности.

2. Впервые продемонстрировано, что КЛЦМ-210 локализуется совместно с микрофиламентами в культивируемых клетках. Во взаимодействии КЛЦМ-210 с микрофиламентами in vivo участвует ее уникальный N-концевой фрагмент. Он опосредует более прочное связывание КЛЦМ-210, по сравнению с КЛЦМ-108, с актиновым цитоскелетом и тем самым способствует его стабилизации.

3. Показано, что экспрессия обеих изоформ КЛЦМ в гладкомышечных клетках аорты регулируется периодическим растяжением и гепарином, а также зависит от состояния клеточных контактов.

4. Изучено фосфорилирование изЬформ КЛЦМ в культивируемых гладкомышечных клетках аорты курицы при стимуляции форболовым эфиром и форсколином. Установлено, что фосфорилирование КЛЦМ опосредуется р42егк2 МАРК, но не рЗ 8 МАРК, РКА и РКС.

123

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чибалина, Маргарита Валериевна, Москва

1. Воротников, А.В., Крымский, М.А., Чибалина, М.В., Кудряшов, Д.С., Ширинский В.П. (2000) Различия в форбол-зависимом фосфорилировании регуляторных белков и сокращении фазных и тонических гладких мышц. Цитология, 42: 378-391.

2. Степанова, О.В., Бирюков, К.Г., Ширинский, В.П., Ткачук, В.А. (1996) Влияние периодического растяжения гладкомышечных клеток на экспрессию в них маркерных белков сократительного фенотипа. Физиологический журнал им. И.М. Сеченова 82: 16-21.

3. Abe, М., Hasegawa, К. and Hosoya, Н. (1996) Activation of chicken gizzard myosin light chain kinase by Ca27calmodulin is inhibited by autophosphorylation. Cell Struct. Fund. 21, 183-188.

4. Adelstein, R.S. and Conti, M.A. (1975) Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin ATPase activity. Nature 256, 597-598.

5. Adelstein, R.S. and Klee, C.B. (1981) Purification and characterization of smooth muscle myosin light chain kinase. J. Biol. Chem. 256, 7501-7509.

6. Adelstein, R.S., Conti, M.A. and Anderson, W.Jr. (1973) Phosphorylation of human platelet myosin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3115-3119.

7. Adelstein, R.S., Conti, M.A., Hathaway, D.R and Klee, C.B. (1978) Phosphorylation of smooth muscle myosin light chain kinase by the catalytic subunit of adenosine 3': 5-monophosphate-dependent protein kinase. J. Biol. Chem. 253, 8347-8350.

8. Alessi, D.R., Cuenda, A., Cohen, P., Dudley, D.T. and Saltiel, A.R.(1995) PD 098059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase kinase in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 270, 27489-27494.

9. Amano, M., Ito, M., Kimura, K., Fukata, Y., Chihara, K., Nakano, Т., Matsuura, Y. and Kaibuchi, K. (1996) Phosphorylation and activation of myosin by Rho-associated kinase (Rho kinase). J. Biol. Chem. 271, 20246-20249.

10. Applegate, D. and Pardee, J.D. (1992) Actin-facilitated assembly of smooth muscle myosin induces formation of actomyosin fibrils. J. Cell Biol. 117, 12231230.

11. Au, Y.P., Kenagy, R.D., Clowes, M.M. and Clowes, A.W. (1993) Mechanisms of inhibition by heparin of vascular smooth muscle cell proliferation and migration. Haemostasis 23 Suppl 1, 177-182.

12. Benian, G.M., Kiff, J.E., Neckelmann, N., Moerman, D.G. and Waterston, R.H. (1989) Sequence of an unusually large protein implicated in regulation of myosin activity in C. elegans. Nature 342, 45-50.

13. Birukov, K.G., Shirinsky, V.P., Stepanova, O.V., Tkachuk, V.A., Hahn, A.W.A., Resink, T.J. and Smirnov, V.N. (1995) Stretch affects phenotype and proliferation of vascular smooth muscle cells. Mol. Cell. Biochem. 144, 131-139.

14. Bresnick, A.R. (1999) Molecular mechanisms of nonmuscle myosin-II regulation. Curr. Opin. Cell Biol. 11, 26-33.

15. Busch, S.J., Martin, G.A., Barnhart, R.L., Mano, M., Cardin, A.D. and Jackson, R.L. (1992) Trans-repressor activity of nuclear glycosaminoglycans on Fos and Jun/AP-1 oncoprotein-mediated transcription. J. Cell Biol. 116, 31-42.

16. Carey, D.J. (1991) Control of growth and differentiation of vascular cells by extracellular matrix proteins. Annu. Rev. Physiol. 53, 161-177.

17. Castellot, J.J.Jr, Addonizio, M.L., Rosenberg, R.D. and Karnovsky, M.J. (1981) Cultured endothelial cells produce a heparin-like inhibitor of smooth muscle cell growth. J.Cell Biol. 90, 372-379.

18. Castellot, J.J.Jr., Wong, K., Herman, B., Hoover, R.L., Albertini, D.F., Wright, T.C., Caleb, B.L. and Karnovsky, M.J. (1985) Binding and internalization of heparin by vascular smooth muscle cells. J. Cell Physiol. 124, 13-20.

19. Chamley-Campbell, J., Campbell, G.R. and Ross, R. (1979) The smooth muscle cell in culture. Physiol. Rev. 59, 1-61.

20. Chew, T.L., Masaracchia, R.A., Goeckeler, Z.M. and Wysolmerski, R.B. (1998) Phosphorylation of non-muscle myosin II regulatory light chain by p21-activated kinase (gamma-PAK). J. Muscle Res. Cell Motil. 19, 839-54.

21. Chrzanowska-Wodnicka, M. and Burridge, K. (1996) Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. J. Cell Biol. 133, 14031415.

22. Clowes, A.W., Clowes, M.M., Kocher, O., Ropraz, P., Chaponier, C. and Gabbiani, G. (1988) Arterial smooth muscle cells in vivo: relationship between actin isoform expression and mitogenesis and their modulation by heparin. J. Cell Biol. 107, 1939-1945.

23. Collins, T., Pober, J.S., Gimbrone, M.A., Hammacher, J.A., Betsholtz, C., Westermark, B. and Heldin, C.H. (1987) Cultured human endothelial cells express platelet-derived growth factor A chain. Am. J. Pathol. 126, 7-12.

24. Conti, M.A. and Adelstein, R.S. (1981) The relationship between calmodulin binding and phosphorylation of smooth muscle myosin kinase by the catalytic subunit of 3':5' cAMP-dependent protein kinase. J. Biol. Chem. 256, 3178-3181.

25. Craig, R., Smith, R. and Kendrick-Jones, J. (1983) Light-chain phosphorylation controls the conformation of vertebrate non-muscle and smooth muscle myosin molecules. Nature 302, 436-439.

26. Dabrowska, R., Aromatorio, D., Sherry, J.M. and Hartshorne, D.J. (1977) Composition of the myosin light chain kinase from chicken gizzard. Biochem. Biophys. Res. Commun. 78, 1263-1272.

27. Dabrowska, R., Hinkins, S., Walsh, M.P. and Hartshorne, D.J. (1982) The binding of smooth muscle myosin light chain kinase to actin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 107, 1524-1531.

28. De Lanerolle, P., Adelstein, R.S., Feramisco, J.R. and Burridge, K. (1981) Characterization of antibodies to smooth muscle myosin kinase and their use in localizing myosin kinase in nonmuscle cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 4738-4742.126

29. De Lanerolle, P., Nishikawa, M., Yost, D.A. and Adelstein, R.S. (1984) Increased phosphorylation of myosin light chain kinase after an increase in cyclic AMP in intact smooth muscle. Science 223, 1415-1417.

30. Desmouliere, A., Rubbia-Brandt, L. and Gabbiani, G. (1991) Modulation of actin isoform expression in cultured arterial smooth muscle cells by heparin and culture conditions. Arterioscler. Thromb. 11, 244-253.

31. Dudley, D.T., Pang, L., Decker, S.J., Bridges, A.J. and Saltiel, A.R. (1995) A synthetic inhibitor of the mitogen-activated protein kinase cascade. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7686-7689.

32. Edelman, A.M., Higgins, D.M., Bowman, C.L., Haber, S.N., Rabin, R.A. and Cho-Lee, J. (1992) Myosin light chain kinase is expressed in neurons and glia: immunoblotting and immunocytochemical studies. Brain Res. Mol. Brain. Res. 14, 27-34.

33. Engelberg, H. (1996) Actions of heparin in the atherosclerotic process. Pharmacol. Rev. 48, 327-352.

34. Ferrari, M.B., Ribbeck, K., Hagler, D.J. and Spitzer, N.C. (1998) A calcium signaling cascade essential for myosin thick filament assembly in Xenopus myocytes.«/. Cell Biol. 141, 1349-1356.

35. Fisher, S. A. and Ikebe, M. (1995) Developmental and tissue distribution of expression of nonmuscle and smooth muscle isoforms of myosin light chain kinase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 217, 696-703.

36. Fishkind, D.J., Cao, L.G. and Wang, Y.L. (1991) Microinjection of the catalytic fragment of myosin light chain kinase into dividing cells: effects on mitosis and cytokinesis. J. Cell Biol. 114, 967-975.

37. Foyt, H.L. and Means, A.R. (1985) Characterization and analysis of an apparent autophosphorylation of chicken gizzard myosin light chain kinase. J. Cyclic Nucleotide Protein Phosphor. Res. 10, 143-155.

38. Fritze, L.M., Reilly, C.F. and Rosenberg, R.D. (1985) An antiproliferative heparan sulfate species produced by postconfluent smooth muscle cells. J. Cell Biol. 100, 1041-1049.

39. Gallagher, P. J., Garcia, J. G. and Herring, B. P. (1995) Expression of a novel myosin light chain kinase in embryonic tissues and cultured cells. J. Biol. Chem. 270, 29090-29095.

40. Gallagher, P.J. and Herring, B.P. (1991) The carboxyl terminus of the smooth muscle myosin light chain kinase is expressed as an independent protein, telokin. J. Biol. Chem. 266, 23945-23952.

41. Gallagher, P.J. and Stull, J.T. (1997) Localization of an actin binding domain in smooth muscle myosin light chain kinase. Mol. Cell Biochem. 173, 51-57.

42. Gallagher, P.J., Herring, B.P. and Stull, J.T. (1997) Myosin light chain kinases. J. Muscle Res. CellMotil. 18, 1-16.

43. Gallagher, P.J., Herring, B.P., Griffin, S.A. and Stull, J.T. (1991) Molecular characterization of a mammalian smooth muscle myosin light chain kinase. J. Biol. Chem. 266, 23936-23944.

44. Garcia, J.G., Lazar, V., Gilbert-McClain, L.I., Gallagher, P.J. and Verin, A.D. (1997) Myosin light chain kinase in endothelium: molecular cloning and regulation. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 16, 489-494.

45. Garcia, J.G., Verin, A.D., Schaphorst, K., Siddiqui, R., Patterson, C.E., Csortos, C. and Natarajan, V. (1999) Regulation of endothelial cell myosin light chain kinase by Rho, cortactin, and p60src. Am. J. Physiol. 276, L989-L998.

46. Geuss, U., Mayr, G.W. and Heilmayer, L.M.G., JR. (1985) Steady-state kinetics of skeletal muscle myosin light chain kinase indicate a strong down regulation by products. Eur. J. Biochem. 153, 327-334.

47. Gilbert-McClain, L.I., Verin, A.D., Shi, S., Irwin, R.P. and Garcia, J.G. (1998) Regulation of endothelial cell myosin light chain phosphorylation and permeability by vanadate. J. Cell Biochem. 70, 141-155.

48. Goeckeler, Z.M. and Wysolmerski, R.B. (1995) Myosin light chain kinase-regulated endothelial cell contraction: the relationship between isometric tension, actin polymerization, and myosin phosphorylation. J. Cell Biol. 130, 613-627.

49. Goldberg, J., Nairn, A.C. and Kuriyan, J. (1996) Structural basis for the autoinhibition of calcium/calmodulin-dependent protein kinase I. Cell 84, 875887.

50. Gorecka, A., Aksoy, M.O. and Hartshorne, D.J. (1976) The effect of phosphorylation of gizzard myosin on actin activation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 71, 325-331.

51. Gotoh, Y., Nishida, E., Matsuda, S., Shiina, N., Kosako, H., Shiokawa, K., Akiyama, T., Ohta, K. and Sakai, H. (1991) In vitro effects on microtubule dynamics of purified Xenopus M phase-activated MAP kinase. Nature 349, 251254.

52. Guerriero, V. Jr., Rowley, D.R. and Means, A.R. (1981) Production and characterization of an antibody to myosin light chain kinase and intracellular localization of the enzyme. Cell 27, 449-458.

53. Guyton, J.R., Rosenberg, R.D., Clowes, A.W. and Karnovsky, M.J. (1980) Inhibition of rat arterial smooth muscle cell proliferation by heparin. I. In vivo studies with anticoagulant and nonanticoagulant heparin. Circ. Res. 46, 625-634.

54. Hannan, R.L., Kourembanas, S., Flanders, K.C., Rogelj, S.J., Roberts, A.B., Faller, D.V. and Klagsbrun, M. (1988) Endothelial cells synthesize basic fibroblast growth factor and transforming growth factor beta. Growth Factors 1, 7-17.

55. Hashimoto, Y. and Soderling, T.R. (1990) Phosphorylation of smooth muscle myosin light chain kinase by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II: comparative study of the phosphorylation sites. Arch. Biochem. Biophys. 278, 4145.

56. Hashimoto, Y., Sasaki, H., Togo, M., Tsukamoto, K., Horie, Y., Fukata, H., Watanabe, T. and Kurokawa, K. (1994) Roles of myosin light-chain kinase in platelet shape change and aggregation. Biochim. Biophys. Acta 1223, 163-169.

57. Hathaway, D.R. and Adelstein, R.S. (1979) Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium- binding protein calmodulin for activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 76, 1653-1657.

58. Hathaway, D.R., Adelstein, R.S. and Klee, C.B. (1981) Interaction of calmodulin with myosin light chain kinase and cAMP-dependent protein kinase in bovine brain. J. Biol. Chem. 256, 8183-8189.

59. Hayakawa, K., Okagaki, T., Higashi-Fujime, S. and Kohama, K. (1994) Bundling of actin filaments by myosin light chain kinase from smooth muscle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 199, 786-791.

60. Herbert, J.M., Clowes, M., Lea, H.J., Pascal, M. amd Clowes, A.W. (1996) Protein kinase C alpha expression is required for heparin inhibition of rat smooth muscle cell proliferation in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 271, 25928-25935.

61. Herring, B.P. and Smith, A.F. (1996) Telokin expression is mediated by a smooth muscle cell-specific promoter. Am. J. Physiol. 270, C1656-C1665.

62. Herring, B.P. and Smith, A.F. (1997) Telokin expression in A10 smooth muscle cells requires serum response factor. Am. J. Physiol. 272, C1394-C1404.

63. Herring, B.P., Nunnally, M.H., Gallagher, P.J. and Stall, J.T. (1989) Molecular characterization of rat skeletal muscle myosin light chain kinase. Am. J. Physiol. 256, C399-C404.

64. Holden, H.M., Ito, M., Hartshorne, D.J. and Rayment, I. (1992) X-ray structure determination of telokin, the C-terminal domain of myosin light chain kinase, at 2,8 A resolution. J. Mol. Biol. 227, 840-851.

65. Holzapfel, G., Wehland, J. and Weber, K. (1983) Calcium control of actin-myosin based contraction in triton models of mouse 3T3 fibroblasts is mediated by the myosin light chain kinase (MLCK)-calmodulin complex. Exp. Cell Res. 148, 117-126.

66. Hoover, R.L., Rosenberg, R.D., Haering, W. and Karnovsky, M.J. (1980) Inhibition of rat arterial smooth muscle cell proliferation by heparin. II. In vitro studies. Circ. Res. 47, 578-583.

67. Horowitz, A., Menice, C.B., Laporte, R. and Morgan, K.G. (1996) Mechanisms of smooth muscle contraction. Physiol. Rev. 76, 967-1003.

68. House, C. and Kemp, B.E. (1987) Protein kinase C contains a pseudosubstrate prototope in its regulatory domain. Science 238, 1726-1728.

69. Ikebe, M., Stepinska, M., Kemp, B.E., Means, A.R. and Hartshorae, D.J. (1987b) Proteolysis of smooth muscle myosin light chain kinase. Formation of inactive and calmodulin-independent fragments. J. Biol. Chem. 262, 13828-13834.

70. Ishihara, M., Fedarko, N.S. and Conrad, H.E. (1986) Transport of heparan sulfate into the nuclei of hepatocytes. J. Biol. Chem. 261, 13575-13580.

71. Ishikawa, T., Chijiwa, T., Hagiwara, M., Mamiya, S., Saitoh, M. and Hidaka, H.1988) ML-9 inhibits the vascular contraction via the inhibition of myosin light chain phosphorylation. Mol. Pharmacol. 33, 598-603.

72. Ito, M., Dabrowska, R., Guerriero, V., Jr. and Hartshorne, D.J. (1989) Identification in turkey gizzard of an acidic protein related to the C-terminal portion of smooth muscle myosin light chain kinase. J. Biol. Chem. 264, 1397113974.

73. Ito, M., Guerriero, V.J., Chen, X.M. and Hartshorne, D.J. (1991) Definition of the inhibitory domain of smooth muscle myosin light chain kinase by site-directed mutagenesis. Biochemistry 30, 3498-3503.

74. Itoh, T., Ikebe, M., Kargacin, G.J., Hartshorne, D.J., Kemp, B.E. and Fay, F.S.1989) Effects of modulators of myosin light-chain kinase activity in single smooth muscle cells. Nature 338, 164-167.

75. Jian, X., Hidaka, H. and Schmidt, J.T. (1994) Kinase requirement for retinal growth cone motility. J. Neurobiol. 25, 1310-1328.

76. Jian, X., Szaro, B.G. and Schmidt, J.T. (1996) Myosin light chain kinase: expression in neurons and upregulation during axon regeneration. J. Neurobiol. 31,379-391.

77. Johnson, J.D., Holroyde, M.J., Crouch, T.H., Solaro, RJ.and Potter, J.D. (1981) Fluorescence studies of the interaction of calmodulin with myosin light chain kinase. J. Biol. Chem. 256, 12194-12198.

78. Johnson, J.D., Snyder, C., Walsh, M. and Flynn, M. (1996) Effects of myosin light chain kinase and peptides on Ca2+ exchange with the N- and C-terminal Ca2+ binding sites of calmodulin. J. Biol. Chem. 271, 761-767.

79. Kanoh, S., Ito, M., Niwa, E., Kawano, Y. and Hartshorne, D.J. (1993) Actin-binding peptide from smooth muscle myosin light chain kinase. Biochemistry 32, 8902-8907.

80. Kawamoto, S., Bengur, A.R., Sellers, J.R. and Adelstein, R.S. (1989) In situ phosphorylation of human platelet myosin heavy and light chains by protein kinase C. J. Biol Chem. 264, 2258-2265.

81. Kemp, B.E., Pearson, R.B., Guerriero, V.J., Bagchi, I.C. and Means, A.R. (1987) The calmodulin binding domain of chicken smooth muscle myosin light chain kinase contains a pseudosubstrate sequence. J. Biol. Chem. 262, 2542-2548.

82. Kerrick, W.G. and Bourguignon, L.Y. (1984) Regulation of receptor capping in mouse lymphoma T cells by Ca2+-activated myosin light chain kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81, 165-169.

83. Klemke, R.L., Cai, S., Giannini, A.L., Gallagher, P.J., De Lanerolle, P. and Cheresh, D.A. (1997) Regulation of cell motility by mitogen-activated protein kinase. J. Cell Biol. 137, 481-492.

84. Knighton, D.R., Pearson, R.B., Sowadski, J.M., Means, A.R., Ten Eyck, L.F., Taylor, S.S. and Kemp, B.E. (1992) Structural basis of the intrasteric regulation of myosin light chain kinases. Science 258, 130-135.

85. Knighton, D.R., Zheng, J.H., Ten Eyck, L.F., Ashford, V.A., Xuong, N.H., Taylor, S.S. and Sowadski, J.M. (1991) Ciystal structure of the catalytic subunit of cyclic adenosine monophosphate-dependent protein kinase. Science 253, 407414.

86. Kobayashi, H., Inoue, A., Mikawa, T., Kuwayama, H., Hotta, Y., Masaki, T. and Ebashi, S. (1992) Isolation of cDNA for bovine stomach 155 kDa protein exhibiting myosin light chain kinase activity. J. Biochem. 112, 786-791.

87. Kojima, S., Mishima, M., Mabuchi, I. and Hotta, Y. (1996) A single Drosophila melanogaster myosin light chain kinase gene produces multiple isoforms whose activities are differently regulated. Genes. Cells. 1, 855-871.

88. Kokoza, V.A. and Raikhel, A.S. (1997) Ovarian- and somatic-specific transcripts of the mosquito clathrin heavy chain gene generated by alternative 5'-exon splicing and polyadenylation. J. Biol. Chem. 272, 1164-1170.

89. Kolodney, M.S. and Elson, E.L. (1993) Correlation of myosin light chain phosphorylation with isometric contraction of fibroblasts. J. Biol. Chem. 268, 23850-23855.

90. Kolodney, M.S. and Wysolmerski, R.B. (1992) Isometric contraction by fibroblasts and endothelial cells in tissue culture: a quantitative study. J. Cell Biol. 117, 73-82.

91. Komatsu, S. and Hosoya, H. (1996) Phosphorylation by MAPKAP kinase 2 activates Mg(2+)-ATPase activity of myosin II. Biochem. Biophys. Res. Commun. 223, 741-745.132

92. Kumar, R.S., Thekkumkara, T.J. and Sen, G.C. (1991) The mRNAs encoding the two angiotensin-converting isozymes are transcribed from the same gene by a tissue-specific choice of alternative transcription initiation sites. J. Biol. Chem. 266, 3854-3862.

93. Kureishi, Y., Kobayashi, S., Amano, M., Kimura, K., Kanaide, H., Nakano, T., Kaibuchi, K. and Ito, M. (1997) Rho-associated kinase directly induces smooth muscle contraction through myosin light chain phosphorylation. J. Biol. Chem. 272, 12257-12260.

94. Labeit, S., Gautel, M., Lakey, A. and Trinick, J. (1992) Towards a molecular understanding of titin. EMBO J. 11, 1711-1716.

95. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685.

96. Lazar, V. and Garcia, J.G. (1999) A single human myosin light chain kinase gene (MLCK; MYLK). Genomics 57, 256-267.

97. Lin, P.j., Luby-Phelps, K. and Stall, J.T. (1997) Binding of myosin light chain kinase to cellular actin-myosin filaments. J. Biol. Chem. 272, 7412-7420.133

98. Lokeshwar, V.B. and Bourguignon, L.Y. (1992) The involvement of Ca and myosin light chain kinase in collagen-induced platelet activation. Cell Biol. Int. Rep. 16, 883-897.

99. Ludowyke, R.I., Peleg, I., Beaven, M.A. and Adelstein, R.S. (1989) Antigen-induced secretion of histamine and the phosphorylation of myosin by protein kinase C in rat basophilic leukemia cells. J. Biol. Chem. 264, 12492-12501.

100. Lukas, T.J., Burgess, W.H., Prendergast, F.G., Lau, W. and Watterson, D.M. (1986) Calmodulin binding domains: characterization of a phosphorylation and calmodulin binding site from myosin light chain kinase. Biochem. 25, 1458-1464.

101. Lukas, T.J., Mirzoeva, S. and Watterson D.M. (1998) Myosin light chain kinase. In: Calmodulin and signal transduction (Van Eldik, L.J. and Watterson, D.M. Eds.), Academic Press, San Diego, 78-100.

102. Ma, X., Wang, Y. and Stephens, N.L. (1998) Serum deprivation induces a unique hypercontractile phenotype of cultured smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 274, C1206-C1214.

103. Majercik, M.H. and Bourguignon, L.Y. (1985) Insulin receptor capping and its correlation with calmodulin-dependent myosin light chain kinase. J. Cell Physiol. 124, 403-410.

104. Majercik, M.H. and Bourguignon, L.Y. (1988) Insulin-induced myosin light-chain phosphorylation during receptor capping in IM-9 human B-lymphoblasts. Biochem. J. 252, 815-823.

105. Matsumura, F., Ono, S., Yamakita, Y., Totsukawa, G. and Yamashiro, S. (1998) Specific localization of serine 19 phosphorylated myosin II during cell locomotion and mitosis of cultured cells. J. Cell Biol. 140, 119-129.

106. Mills, J.C., Stone, N.L., Erhardt, J. and Pittman, R.N. (1998) Apoptotic membrane blebbing is regulated by myosin light chain phosphorylation. J. Cell Biol. 140, 627-636.

107. Miralem, T. and Templeton, D.M. (1998) Heparin inhibits Ca27calmodulin-dependent kinase II activation and c-fos induction in mesangial cells. Biochem. J. 330, 651-657.

108. Miralem, T., Wang, A., Whiteside, C.I. and Templeton, D.M. (1996) Heparin inhibits mitogen-activated protein kinase-dependent and -independent c-fos induction in mesangial cells. J. Biol. Chem. 271, 17100-17106.

109. Mochida, S., Nonomura, Y. and Kobayashi, H. (1994) Analysis of the mechanism for acetylcholine release at the synapse formed between rat sympathetic neurons in culture. Microsc. Res. Tech. 29, 94-102.

110. Morgan, M., Perry, S.V. and Ottaway, J. (1976) Myosin light-chain phosphatase. Biochem. J. 157, 687-697.134

111. Morrison, D.L., Sanghera, J.S., Stewart, J., Sutherland, C., Walsh, M.P. and Pelech, S.L. (1996) Phosphorylation and activation of smooth muscle myosin light chain kinase by MAP kinase and cyclin-dependent kinase-1. Biochem. Cell Biol. 74, 549-557.

112. Murata-Hori, M., Suizu, F., Iwasaki, T., Kikuchi, A. and Hosoya, H. (1999) ZIP kinase identified as a novel myosin regulatory light chain kinase in HeLa cells. FEBS Lett. 451, 81-84.

113. Murphy, R.A. (1989) Special topic: contraction in smooth muscle cells. Annu. Rev. Physiol. 51, 275-283.

114. Nabeshima, Y., Fujii-Kuriyama, Y., Muramatsu, M. and Ogata, K. (1984) Alternative transcription and two modes of splicing results in two myosin light chains from one gene. Nature 308, 333-338.

115. Nishikawa, M., Sellers, J.R., Adelstein, R.S. and Hidaka, H. (1984b) Protein kinase C modulates in vitro phosphorylation of the smooth muscle heavy meromyosin by myosin light chain kinase. J. Biol. Chem. 259, 8808-8814.

116. Nishikawa, M., Shirakawa, S. and. Adelstein, R.S. (1985) Phosphorylation of smooth muscle myosin light chain kinase by protein kinase C. Comparative study of the phosphorylated sites. J. Biol. Chem. 260, 8978-8983.

117. Olson, N.J., Pearson, R.B., Needleman, D.S., Hurwitz, M.Y., Kemp, B.E. and Means, A.R. (1990) Regulatory and structural motifs of chicken gizzard myosin light chain kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 87, 2284-2288.

118. Ottlinger, M.E., Pukac, L.A. and Karnovsky, M.J. (1993) Heparin inhibits mitogen-activated protein kinase activation in intact rat vascular smooth muscle cells. J. Biol. Chem. 268, 19173-19176.

119. Owens, G.K. (1995) Regulation of differentiation of vascular smooth muscle cells. Physiol. Rev. 75, 487-517.

120. Park, C.S., Chang, S.H., Lee, H.S., Kim, S.H., Chang, J.W. and Hong, C.D. (1996) Inhibition of renin secretion by Ca2+ through activation of myosin light chain kinase. Am. J. Physiol. 271, C242-C2477.

121. Pearson, R.B., Jakes, R., John, M., Kendrick-Jones, J. and Kemp, B.E. (1984) Phosphorylation site sequence of smooth muscle myosin light chain (Mr = 20 000). FEBS Lett. 168, 108-112.135

122. Pearson, R.B., Misconi, L.Y. and Kemp, B.E. (1986) Smooth muscle myosin kinase requires residues on the COOH- terminal side of the phosphorylation site. Peptide inhibitors. J. Biol. Chem. 261, 25-27.

123. Pearson, R.B., Wettenhall, R.E., Means, A.R., Hartshorne, D.J. and Kemp, B.E. (1988) Autoregulation of enzymes by pseudosubstrate prototopes: myosin light chain kinase. Science 241, 970-973.

124. Pemrick, S.M. (1980) The phosphorylated L2 light chain of skeletal myosin is a modifier of the actomyosin ATPase. J. Biol. Chem. 255, 8836-8841.

125. Persechini, A., McMillan, K. and Leakey, P. (1994) Activation of myosin light chain kinase and nitric oxide synthase activities by calmodulin fragments. J. Biol. Chem. 269, 16148-16154.

126. Persechini, A., Gansz, K.J. and Paresi, R.J. (1996) Activation of myosin light chain kinase and nitric oxide synthase activities by engineered calmodulins with duplicated or exchanged EF hand pairs. Biochemistry 35, 224-228.

127. Potier, M.C., Chelot, E., Pekarsky, Y., Gardiner, K., Rossier, J. and Turnell, W.G. (1995) The human myosin light chain kinase (MLCK) from hippocampus: cloning, sequencing, expression, and localization to 3qcen-q21. Genomics 29, 562-570.

128. Pukac, L.A., Carter, J.E., Ottlinger, M.E. and Karnovsky, M.J. (1997) Mechanisms of inhibition by heparin of PDGF stimulated MAP kinase activation in vascular smooth muscle cells. J. Cell Physiol. 172, 69-78.

129. Reusch, P., Wagdy, H., Reusch, R, Wilson, E. and Ives, H.E. (1996) Mechanical strain increases smooth muscle and decreases nonmuscle myosin expression in rat vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 79, 1046-1053.

130. Robinson, M.J. and Cobb, M.H. (1997) Mitogen-activated protein kinase pathways. Curr. Opin. Cell Biol. 9, 180-186.

131. Rusconi, F., Potier, M.C., Le Caer, J.P., Schmitter, J.M. and Rossier, J. (1997) Characterization of the chicken telokin heterogeneity by time-of-flight mass spectrometry. Biochemistry 36, 11021-11026.

132. Russo, M.A., Guerriero, V.Jr. and Means, A.R (1987) Hormonal regulation of a chicken oviduct messenger ribonucleic acid that shares a common domain with gizzard myosin light chain kinase. Mol. Endocrinol. 1, 60-67.

133. Saitoh, M., Ishikawa, T., Matsushima, S., Naka, M. and Hidaka, H. (1987) Selective inhibition of catalytic activity of smooth muscle myosin light chain kinase. J. Biol. Chem. 262, 7796-7801.136

134. Saksela, O., Moscatelli, D., Sommer, A. and Rifkin, D.B. (1088) Endothelial cell-derived heparan sulfate binds basic fibroblast growth factor and protects it from proteolytic degradation. J. Cell Biol. 107, 743-751.

135. Sanders, L.C., Matsumura, F., Bokoch, G.M. and De Lanerolle P. (1999) Inhibition of myosin light chain kinase by p21-activated kinase. Science 283, 2083-2085.

136. Sato, M., Ye, L.H. and Kohama, K. (1995) Myosin light chain kinase from vascular smooth muscle inhibits the ATP-dependent interaction between actin and myosin by binding to actin. J. Biochem. 118, 1-3.

137. Schaffner, W. and Wetasman, O. (1973) Sensitive and spesific method for the determination of protein in dilute solution. Anal. Biochem. 56, 502-514.

138. Sellers, J.R. (1985) Mechanism of the phosphorylation-dependent regulation of smooth muscle heavy meromyosin. J. Biol. Chem. 260, 15815-15819.

139. Sellers, J.R. and Pato, M.D. (1984) The binding of smooth muscle myosin light chain kinase and phosphatases to actin and myosin. J. Biol. Chem. 259, 77407746.

140. Sellers, J.R., Spudich, J.A. and Sheetz, M.P. (1985) Light chain phosphorylation regulates the movement of smooth muscle myosin on actin filaments. J. Cell Biol. 101, 1897-1902.

141. Shimada, H., Shimizu, T., Kuwayama, H., Suzuki, M., Nagai, R. and Morii, H. (1995) Immunocytochemical localization of 155 kDa myosin light chain kinase and myosin heavy chain in bovine brain. Brain Res. 682, 212-214.

142. Silver, D.L., Vorotnikov, A.V., Watterson, D.M., Shirinsky, V.P. and Sellers, J.R. (1997) Sites of interaction between kinase-related protein and smooth muscle myosin. J. Biol. Chem. 272, 25353-25359.

143. Smith, A.F., Bigsby, R.M., Word, R.A. and Herring, B.P. (1998) A 310-bp minimal promoter mediates smooth muscle cell-specific expression of telokin. Am. J. Physiol. 274, C1188-C1195.137

144. Smith, J.L., Silveira, L.A. and Spudich, J.A. (1996) Activation of Dictyostelium myosin light chain kinase A by phosphorylation of Thrl66. EMBO J. 15, 60756083.

145. Smith, P.G., Moreno, R. and Ikebe, M. (1997) Strain increases airway smooth muscle contractile and cytoskeletal proteins in vitro. Am. J. Physiol. 272, L20-L27.

146. Smith, L., Su, X., Lin, P., Zhi, G. and Stull, T.J. (1999a) Identification of a novel actin binding motif in smooth muscle myosin light chain kinase. J. Biol. Chem. 274, 29433-29438

147. Smith, P.G., Roy, C., Dreger, J. and Brozovich, F.(1999b) Mechanical strain increases velocity and extent of shortening in cultured airway smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 277, L343-L348.

148. Sobieszek, A. (1991) Regulation of smooth-muscle myosin-light-chain-kinase. Steady-state kinetic studies of the reaction mechanism. Eur. J. Biochem. 199, 735-743.

149. Somlyo, A. V., Butler, T.M., Bond, M. and Somlyo, A.P. (1981) Myosin filaments have non-phosphorylated light chains in relaxed smooth muscle. Nature 294, 567569.

150. Stull, J.T., Hsu, L., Tansey, M.G. and Kamm, K.E. (1990) Myosin light chain kinase phosphorylation in tracheal smooth muscle. J. Biol. Chem. 265, 1668316690.

151. Stull, J.T., Kraeger, J.K., Kamm, K.E., Gao, Z.-H., Zhi, G. and Padre, R.C. (1996) Myosin light chain kinase. In: Biochemistry of smooth muscle contraction (Barany, M. Ed.), Academic Press, San Diego. 119-130.

152. Stull, J.T., Lin, P.J., Krueger, J.K., Trewhella, J. and Zhi, G. (1998) Myosin light chain kinase: functional domains and structural motifs. Acta Physiol. Scand. 164, 471-482.

153. Stull, J.T., Nunnally, M.N. and Michnoff, C.H. (1986) Calmodulin-dependent protein kinases. In: The Enzymes (Krebs, E.G. and Boyer, P.D. Eds), Academic Press, New York. 113-166.

154. Stull, J.T., Tansey, M.G., Tang, D.-C., Word, R.A., Kamm, K.E. and Tang, D.C. (1993) Phosphorylation of myosin light chain kinase: a cellular mechanism for Ca2+ desensitization. Mol. Cell Biochem. 127/128, 229-237.

155. Sugden, P.H. and Clerk, A. (1998) 'Stress-responsive' mitogen-activated protein kinases (c-Jun N-terminal kinases and p38 mitogen-activated protein kinases) in the myocardium. Circ. Res. 83, 345-352.

156. Sweeney, H.L., Bowman, B.F. and Stull, J.T. (1993) Myosin light chain phosphorylation in vertebrate striated muscle: regulation and function. Am. J. Physiol. 264, C1085-C1095.138

157. Tail, J.L. and Spudich, J.A. (1991) Characterization and bacterial expression of the Dictyostelium myosin light chain kinase cDNA. Identification of an autoinhibitory domain. J. Biol. Chem. 266, 16044-16049.

158. Tan, J.L., Ravid, S. and Spudich, J.A. (1992) Control of nonmuscle myosins by phosphorylation. Annu. Rev. Biochem. 61, 721-759.

159. Taubman, M.B., Grant, J.W.and Nadal-Ginard, B. (1987) Cloning and characterization of mammalian myosin regulatory light chain (RLC) cDNA: the RLC gene is expressed in smooth, sarcomeric, and nonmuscle tissues. J. Cell. Biol. 104, 1505-1513.

160. Thekkumkara, T.J., Livingston 3d, W., Kumar, R.S. and Sen, G.C. (1992) Use of alternative polyadenylation sites for tissue-specific transcription of two angiotensin-converting enzyme mRNAs. Nucleic Acids Res. 20, 683-687.

161. Tokui, T., Ando, S. and Ikebe, M. (1995) Autophosphorylation of smooth muscle myosin light chain kinase at its regulatory domain. Biochemistry 34, 5173-5179.

162. Torok, K. and Trentham, D.R. (1994) Mechanism of 2-chloro-(epsilon-amino-Lys75)-6-[4-(N,N-diethylamino)phenyl.-l,3,5-triazin-4-yl]calmodulin interactions with smooth muscle myosin light chain kinase and derived peptides. Biochemistry 33, 12807-12820.

163. Towbin, H., Staehlin, T. and Gordon, J. (1970) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 76, 4350-4354.

164. Tuazon, P.T. and Traugh, J.A. (1984) Activation of actin-activated ATPase in smooth muscle by phosphorylation of myosin light chain with protease-activated kinase I. J. Biol. Chem. 259, 541-546.

165. Turbedsky, K., Pollard, T.D. and Bresnick, A.R. (1997) A subset of protein kinase C phosphorylation sites on the myosin II regulatory light chain inhibits phosphorylation by myosin light chain kinase. Biochemistry 36, 2063-2067.

166. Turner, J.R., Angle, J.M., Black, E.D., Joyal, J.L., Sacks, D.B. and Madara, J.L. (1999) PKC-dependent regulation of transepithelial resistance: roles of MLC and MLC kinase. Am. J. Physiol. 277, C554-C562.

167. Umemoto, S. and Sellers, J.R. (1990) Characterization of in vitro motility assays using smooth muscle and cytoplasmic myosins. J. Biol. Chem. 265, 14864-14869.

168. Umemoto, S., Bengur, A.R. and Sellers, J.R. (1989) Effect of multiple phosphorylations of smooth muscle and cytoplasmic myosins on movement in an in vitro motility assay. J. Biol. Chem. 264, 1431-1436.

169. Verin, A.D., Gilbert-McClain, L.I., Patterson, C.E. and Garcia, J.G. (1998b) Biochemical regulation of the nonmuscle myosin light chain kinase isoform in bovine endothelium. Am. J. Respir. CellMol. Biol. 19, 767-776.

170. Verin, A.D., Lazar, V., Torry, R.J., Labarrere, C.A., Patterson, C.E. and Garcia, J.G. (1998a) Expression of a novel high molecular-weight myosin light chain kinase in endothelium. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 758-766.

171. Waters, S.B., Holt, K.H., Ross, S.E., Syu, L.J., Guan, K.L., Saltiel, A.R., Koretzky, G.A. and Pessin, J.E. (1995) Desensitization of Ras activation by a feedback disassociation of the SOS-Grb2 complex. J. Biol. Chem. 270, 2088320886.

172. Watterson, D.M., Collinge, M.A., Lukas, T.J., Van-Eldik, L.J., Birukov, K.G., Stepanova, O.V. and Shirinsky, V.P. (1995) Multiple gene products are produced from a novel protein kinase transcription region. FEBS Lett. 373, 217-220.

173. Wilson, A.K., Gorgas, G., Claypool, W.D. and de Lanerolle, P. (1991) An increase or a decrease in myosin II phosphorylation inhibits macrophage motility. J. Cell Biol. 114, 277-283.

174. Wysolmerski, R.B. and Lagunoff, D. (1990) Involvement of myosin light-chain kinase in endothelial cell retraction. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87,16-20.

175. Wysolmerski, R.B. and Lagunoff, D. (1991) Regulation of permeabilized endothelial cell retraction by myosin phosphorylation. Am. J. Physiol. 261, C32-C40.

176. Yamakita, Y., Yamashiro, S. and Matsumura, F. (1994) In vivo phosphorylation of regulatory light chain of myosin II during mitosis of cultured cells. J. Cell Biol. 124, 129-137.

177. Yerna, M.J., Dabrowska, R., Hartshorne, D.J. and Goldman, R.D. (1979) Calcium-sensitive regulation of actin-myosin interactions in baby hamster kidney (BHK-21) cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 76, 184-188.

178. Zavodny, P.J., Petro, M.E., Lonial, H.K., Dailey, S.H., Narula, S.K., Leibowitz, P.J. and Kumar, C.C. (1990) Cloning and characterization of a vertebrate cellular myosin regulatory light chain complementary DNA. Circ. Res. 67, 933-940.

179. Zhi, G., Herring, B.P. and Stull, J.T. (1994) Structural requirements for phosphorylation of myosin regulatory light chain from smooth muscle. J. Biol. Chem. 269, 24723-24727.

180. Я благодарю доктора Т.Н. Власик и В. Спирова за создание антител 2F4 к уникальному фрагменту КЛЦМ-210, а также доктора Б.В. Шехонина за сотрудничество.

181. Я благодарю своего рецензента Богачеву Наталью Владимировну за внимательное прочтение моей работы, ценные замечания и внесенные исправления.

182. Я глубоко признательна биофаку Московского государственного университета за данное мне мировоззрение. Я благодарю преподавателей кафедры биохимии за полученные мною базовые знания и навыки биохимической работы.