Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия и функциональные свойства глютаматных рецепторов в клетках Бергмановской глии мозжечка мышей

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия и функциональные свойства глютаматных рецепторов в клетках Бергмановской глии мозжечка мышей"

<§?

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

^ ^ ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ їм. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

*• (V, «ч/

Матяш Віталій Вікторович.

УДК 612. 32. 014.3: 547. 466.6

ЕКСПРЕСІЯ ТА ФУНКЦІОНАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ ГЛЮТАМАТНИХ РЕЦЕПТОРІВ В КЛІТИНАХ БЕРГМАНІВСЬКОЇ ГЛІЇ МОЗОЧКА МИШЕЙ

03.00.02- Біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Кійв-1997

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті Фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України та Центрі Молекулярної Медицини ім. Макса Дельбрюка, Берлін, Германія Науковий керівник доктор медичних наук

Верхратський Олексій Несторович,

Інститут фізіології ім. 0.0. Богомольця НАН України, пр.н.сп.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, член-кор. НАН України

Кришталь Олег Олександрович Інститут фізіології ім. 0.0. Богомольця НАН України, завідуючий відділом, доктор біологічних наук Костсрін Сергій Олексійович Інститут біохімії ім. 0.0. Паляадіна НАН України, завідуючий відділом.

Провідна установа; Інститут Молекулярної Біології та Генетики

НАН України, відділ структури та функцій нуклеїнових кислот, м. Київ.

Захист відбудеться 1997 р. о / У годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д 01.13.01 при Інституті Фізіології ім. 0.0. Богомольця НАН України за адресою: 252024 м. Київ-24, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту Фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Автореферат розіслано „“/¿І “ ¡997 рОКу.

Вчений Секретар Спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук

Сорокіна-Маріна 3.0.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.

Актуальність проблеми. Іони кальцію відіграють важливу роль в регуляції клітинних процесів, виступаючи в ролі вторинного посередника в усіх типах еукаріотачних клітин. Внутрішньоклітинна концентрація іонів кальцію регулюється ¡активністю ряду клітинних структур: потенціал- та хемокерованих каналів, метаботропяих рецепторів, кальцієвих насосів та обмінників плазматичної мембрани, а також внутрішньоклітинних кальцієвих депо та розчинними кальцієвими буферами цитоплазми.

Функціюванвя вказаних систем досить детально вивчено в нервових та м’язових клітинах, проте відносно мало відомо про механізми кальцієвої сигналізації в гліальних клітинах, зокрема в клітинах астроглії. В цих клітинах головуюча роль у генерації кальцієвих сигналів належить метаботрошшм та іонотропним мембранним рецепторам, які відіграють важливу роль в нейрогліальній взаємодії. Тому дослідження експресії астроцитами різних типів вейромедіаторних рецепторів, а також молекулярних механізмів, що лежать в основі кальцієвих сигналів, виникаючих при активації цих рецепторів, становить науковий інтерес. Крім того, цікавим є порівняння наборів рецепторів, що експресуються в нервово-гліальній парі, котру мояша визначити як функціональну одиницю нервово-гліальної мережі.

Мета та ляггачі роботи. Мета роботи полягала у вивченні кальцієвих сигналів, що виникають при активації нейромедиаторних рецепторів в клітинах Бергманівської глії та нейронах Пуркінь'є.

Для досягнення вказаної мети були сформульовані наступні задачі:

1.Розробити методику реєстрації змін внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію в клітинах Бергманівської глії в гостроізольованих зрізах мозочка мишей.

2.Вставовити типи нейротрансмітерних рецепторів, що експресуються клітинами Бергманівської глії, та вивчити їх функціональні властивості, використовуючи біофізичні та молекулярнобіологічні методи.

3.Провести аналогічне дослідження властивостей рецепторів в нейронах Пуркінь'є.

метаботропних глютаматних рецепторів тОІиШ і т01иК5. Показана відсутність в цих клітинах іонотропних глютаматних рецепторів каінатного типу. Вперше показано, що клітини Бергманівської глії та нейронами Пуркінь’є ехспресують практично однаковий набір рецепторів.

подальшого вивчення яейро-гліальної взаємодії в центральній нервовій системі, зокрема для встановлення механізмів участі гліальних клітин в забезпеченні синаптичної передачі.

Вперше показана зкспресія клітинами Бергманівської глії

Одержані дані є основою для

Основні положення роботи доповідались і обговорювались на І

конгресі нейробіологічного товариства Германід (1996), конференціях фізіологічного товариства Великобританії (1995, 1996), Європейській гліальній конференції (1997), на семінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (Київ) та Центру Молекулярної Медицини ім. М. Дельбрюка (Берлін). За матеріалами дисертації опубліковано 3 роботи.

літератури, опису методів дослідження, результатів дослідження, обговорення результатів, висновків та списку літератури із 196 джерел. Робота викладена на 130 сторінках та ілюстрована 23 рисунками.

1. Показана експресія в клітинах Бергманівської глії метаботропних глютаматних рецепторів тСІиШ та ггХИиНб, а також встановлено набір субодиниць, з яких складаються іонотровві тяютаматиі рецептори АМРА типу в цих клітинах (ИиЕА, ИиКВ).

2. Досліджені механізми глютаматіндуковаяого підвищення внутрішньо-клітинної концентрації іонів кальцію в клітинах Бергманівської глії.

3. Досліджено набір нейротрансмітерних рецепторів в нейронах Пуркінь'є, та встановлено, що він є практично ідентичним з набором нейротрансмітерних рецепторів в клітинах Бергманівської глії.

парасаіітальних зрізах мозочку мишей лінії НМШ віком від 20 до ЗО діб. Мишей забивали декапітацією, виділяли мозочок, та прикріпляли його цианоакрилатним клеєм до камери вібратома, заповненого охолодженим сольовим розчином. Товщина зрізів була 200 мкм. Зрізи переносили в постійно насичуваний карбогеном (5% С02 + 95% 02) карбонатний фізіологічний розчин і зберігали до використання при кімнатній температурі.

використаний метод patch-damp в конфігурації whole-cell. Мікроелектроди, виготовлені з боросилікатного скла, мали опір 5 - 6 МОм. Реєстрація проводилась за допомогою підсилювача ЕРС-7 чи ВРС-9 (List Electronics, Німеччина). Результати обробляли за допомогою комп'ютерної програми WINTIDA (НЕКА Electronic, Німеччина).

клітинами методом patch-clamp кальцієві індикатори (fura-2 або Oregon Green ВАРТА-1) входили до складу внутрішньоклітинного розчину. При загрузці клітин мембравопроникною формою кальцієвого зонда fura-2 (fura-2/AM), зрізи

Дисертація складається зі вступу, огляду

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

>иь. Дослідження проводились на гостроізольованих

Для реєстрації трансмембранних струмів був

При роботі з

витримували на протязі ЗО - 40 хвилин в зовнішяьоллітинному розчіні, що містив 5 мкмоль/л fura-2/AM при температурі ЗТС.

Методи р^сстраііІТ кядьиігвих _сигаалів. Виміри концентрації іонів кальцію в клітинах, заповнених індикатором fura-2, проводили з використанням однодетекторної двохвильової кальцієвої системи (Luigs-Neumann Gmbh, Німеччина), або методом цифрової відеомікроскопії. Для збудження флуоресценції використовували довжини хвиль 360 та 380 ям, реєстрацію проводили на довжині хвилі 510 нм. Для реєстрації кальцієвих сигналів в клітинах, заповнених індикатором Oregon Green ВАРТА-1, був використаний конфокальний лазерний скануючий мікроскоп ODYSSEY XL (Noran Instruments, США). Кальцієві сигнали, отримані за допомогою зонду Oregon Green ВАРТА-1, наведені у відношенні вимірюємого сигналу до сигналу у стані спокою, тобто на початку досліду.

клітинах методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Після закінчення електрофізіологічних досліджень, вміст клітин забирався в мікроелектрод докладанням до нього від'ємного тиску. Мікроелектроди були заповнені розчином, який містив (в ммоль/л): 130 КС1, 0,5 СаС12, 3 MgCl2, 3 Иа2АТФ, 10 HEPES, рН7,2. Після цього, вміст електроду (об'ємом приблизно 6 мкл) переносили в стерильну пробірку для ПЛР, яка містила 0,5 мкл 10 ммоль/л dNTPfs (Boehringer Mannheim), 1 мкл 0,1 ммоль/л ДТТ (Gibco-BRL), 0,5 мкл 30 U/мкл RNAsin (Promega) та 0,5 мкл 200 U/мкл зворотньої транскриптази (Superscript II, Gibco-BRL), загальний об’єм реакційної суміші становив приблизно 10 мкл. Після інкубації при 37"С на протязі 1 години для синтезу кДНК, реакцію зупиняли охолодженням до -20'С. Одержану в результаті цієї реакції кДНК використовували для подальшого аналізу полімеразною ланцюговою реакцією. ПЛР проводили в програмованому термоконтролері PCR9600 (Perbin Elmer, Applied Biosystems). Після початкової денатурації (94*С, 5 хв.) проводили 40 циклів ампліфікації (денатурація 94'С, 30 сек.; відпалювання 50°С, ЗО сек.; елонгація 72‘С, 30 сек.(+ 1 сек./цикл)) та кінцеву елонгацію - 72"С, 10 хв.). Для підвищення специфічності була використана nested-crpaTerm ПЛР, прн цьому 1 мкл продукту першого раунду ПЛР використовували для реампліфікації з іншою парою праймерів, другий раунд ПЛР проводили, як описано вище, але температура відпалювання була 55"С. Щоб запобігти отриманню помилково-позитивних результатів за рахунок ампліфікації геномної ДНК, позиції праймерів були вибрані на різних екзонах. Для ампліфікації mGluRl були використані наступні праймера: 5'-праймер ATT ГАТ ГГГ ЦАГ АНД ГАГ ATT АА, 3'-праймер ГГЦ ААГ AAA АЦЦ ЦГА ТГГ ЦТА Т, та nested Зґ-праймер ЦАТ ГГС АТА ГАТ ГГЦ ATT ГАТ Г. Для mGluR5: 5'-праймер ТТГ ГТА ГЦА АЦТ АЦА АЦА ТЦА ТЦА Ц, nested 5ґ-праймер ТАЦ АТЦ АТЦ ЦТГ ГЦЦ ААА ЦЦТ ГАГ А та З'-

праймер ГГГ ПТ ГАТ ГАС ТГЦ СГТ ТГГ ГТТ. Для ампліфікації субодиииць АМРА-рецепторів були використані наступні праймери: 5'-праймер ЦЦТ ДТА ГЦТ ТАТ ГАА АТЦ ТГГ АТГ ТГ, 3'-праймер ТЦГ ТАЦ ЦАЦ ДАТ ТТГ ДТТ TTC А, nested 5ґ-праймер ГЦГ ААТ ТЦТ ТТГ ГЦЦ ТАТ ГАГ АТЦ ЕГГ АТГ ТГ, nested Зґ-праймер ГЦГ ГТА ЦЦА АГТ ТТЦ ЦТЦ ЦАА ДТТ ТЦА ТГГ Т. Продукти ШІР аналізували електрофорезом в 2% агарозному гелі. У випадку mGluHl та niGluRö специфічність ампліфікованих фрагментів перевіряли секвенуванням. У випадку субодиниць АМРА рецепторів для визначення типів субодиниць був використаний рестриктазний аналіз.

Розчини. Стандартний сольовий розчин містив (у ммоль/л): NaCl - 125, KCl - З, СаС12 - 2,5, MgCl2 - 1, NaHC03 - 26, КН2Р04 - 1,8, глюкоза - 10 (рН=7,4). У без кальцієвому розчині кальцій було замінено еквімолярно на магній та додано Іммоль/л ЕГГА. Внутрішньоклітинний розчин містив (у ммоль/л): КС1 - 130, MgCl2 - З, Ь'а2АТФ - 2, HEPES - 10 (рН=7,4) и 200 мкмоль/л fura-2/K6 або 500мкмоль/л Oregon Green BAPTA-1/Кв (Molecular Probes, Eugene, USA). Аплікацію біологічно активних речовин проводили заміною розчину, яким проводили перфузію камери. Швидкість протоку розчину можна було змінювати від 1 до 20 мл/хв. (при об'ємі камери 0,5 мл). Досліди проводили при кімнатній температурі (22 - 24°С).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ Кальцієві транзіснти, що викликаються глютаматом та його аналогами у клітинах Бергманівської глії

Аплікація глютамату в концентраціях від ЗО до 100 мкмоль/л на протязі 10 с, викликала підвищення [Са.2+1 в усіх досліджених клітинах (п=22). Пороговою концентрацією, достатньою для ініціації сигналу, було 10 мкмоль/л, відповіді досягали максимальної амплітуди при концентраціях глютамату 300 -

ЮООмкмоль/л (рис. 1). Інкубація зрізів мозочка на потязі 5 хв. в присутності Імкмоль/л тетродотоксина не призводила до помітних змін глютамат -індукованого підвищення [Са2+], (п=24).

Для встановлення типів глютаматних рецепторів, що приймають участь у генерації кальцієвих сигналів, було досліджено дію агоністів глютаматних рецепторів, здатних селективно активувати різні підтипи цих рецепторів (рис. 2). Аплікація квісквалату, який є активатором як іоно-, так і метаботропних GluR, викликала підвищення [Са2*^ в усіх досліджених клітинах (п=37).

Аплікація селективного активатора метаботропних GluR 1-аміно-циклопентан-1,3-дикарбоксвлату ((1S,3R)-ACPD) викликала кальцієві травзієнти лише в 9 з 39 досліджених клітин. Каіват - активатор іонотрошшх GluR АМРА та каінатного підтипів, викликав значне підвищення [Ca2+]¡ в усіх досліджених клітинах

А 120

70-

240

га

О

70 J 240

30 мкМ ЄІи

20 с

ЮОмкМбІи

300 мкМ ЄІи

10 100 1000 10000 Ри]„(мкМ)

Рис.1. Залежність амплітуди глютаматіндукованих кальцієвих транзієнтів від концентрації глютамату в зовнішньоклітинному розчині. А: три репрезентативних кальцієвих транзієнта зареєстрованих у відповідь на аплікацію різних концентрацій глютамату. Б: Крива доза-ефект була отримана на основі 12 дослідів. Величини кальцієвих транзієнтів були нормалізовані до амплітуди кальцієвого транзієнта при аплікації 10 ммоль/л глютамата. Величина ЕС50для глютамату становила 132 мкмоль/л.

500 п

140

70

100 мкМ Квисквалат

~2о'<

ІООмкМОЯ.Зіу-АСРВ

100 мкМ КА

я

О

ЕПЛ .

70' 500 п

70

30 с ІООмкМ АМРА

30 с 100 мкМ NN10 А

Рис.2. Зміни внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію при аплікації агоністів глютаматних рецепторів.

(п=59), в той час, як два інших активатора іонотропних GluR - АМРА та NMDA (останній аплікували в безмагнієвому розчині, що містив 1 ммоль/л гліцину) не діяли на [Ca2+]¡ (п=22 та 19). Для з’ясування механізмів, що забезпечують індуковане глютаматом підвищення [Са2*],, провели порівняння кальцієвих траизієптів при аплікації глютамату, квісквалату та каінату в нормальному розчині, в присутності 10 мкмоль/л інгібітора іонотропних GluR CNQX та в безкальцієвому розчині. Як видалення іонів Са2+, так і CNQX призводили до незначного зниження амплітуди глютаматіндукованих кальцієвих транзієнтів (158±30 нмоль/л в нормальних умовах, 126±28 нмоль/л після 2 хв. інкубації в безкальцієвому розчині та 134±41 нмоль/л в присутності CNQX) (п=7) (рис. 3). Ні безкальцієвий розчин, ні CNQX не призводили до змін квісквалатіндукованих кальцієвих транзієнтів. Каінатілдуховаві кальцієві транзієнти повністю блокувались як при видаленні Саг+ із зовніпшьоклітикного середовища, так і CNQX . Ці дані вказують на те, що глютаматіидуковане підвищення [Са2+], в клітинах Бергманівської гяії відбувається за рахунок вивільнення Са2+ із внутрішньоклітинних депо. Щоб перевірити це припущення, була вивчена здатність фармакологічних агентів, що специфічно взаємодіють з внутрішньоклітинними кальцієвими депо (тапсигаргін та гепарин), модулювати глютаматіндуковаиі кальцієві сигнали в клітинах Бергманівської глії. Амплітуди глютаматіндукованих кальцієвих транзієнтів після інкубації з тапсигаргіном були набагато нижчі (90±35 нмоль/л) ніж до інкубації (163±40 нмоль/л). Повторна аплікація глютамату в присутності талсигаргіну викликала кальцієвий транзієнт з амплітудою лише 45±20 нмоль/л. Амплітуда цього тапсигаргіннечутливого компоненту не змінювалась навіть після 40 - 60 хв. інкубації з тапсигаргіном та при видаленні Са2* із зовшхпньоклітинного середовища (рис. 4), що свідчить про його внутрішньоклітинне походження. Щоб перевірити участь у генерації глютаматіндукованих кальцієвих транзієнтів івозитол-(1,4,5)-трисфосфату (ІРз) було використано внутрішньоклітинну аплікацію гепарину - селективного блокатора ІРа-чутливих кальцієвих каналів эндоплазмагичного ретикулуму. В цих дослідах спочатку реєстрували глютамагіндуковані кальцієві транзієнти в клітинах, загружеких мембрано-проникною формою -2/АМ). Після цього проводили діаліз клітин внутрішньоклітинним кальцієвого індикатора fura-2 (fura розчином, що містив 200 мкмоль/л fura-2 (контроль) чи fura-2 та гепарин (5мкмоль/л). Як показано на рис. 5, діаліз клітин на протязі 5 хв. внутрішньоклітинним розчииом, що містив лише fura-2, не призводив до помітних змін глютаматіндукованих кальцієвих сигналів (амплітуда до діалізу 155±34 нмоль/л, після - 151±37нмоль/л (п=6)). При діалізі клітин розчином, що містив 5мкмоль/л гепарину, амплітуди, кальцієвих сигналів були значно

я

О

1 мМ Єіи

О Саг+

1 мМ ЄІи

ю мкмсь'дх

О Саг»

100 мкМ КА

10 мкМ СИОХ

Рис. 3. Зміни внутрішньоклітинної концентрації іонів Са2+ під час аплікації гаютамату та каінату в безкальцієвому розчині чи в присутності СНС)Х

тшт ІмМ Сій

ОСа2*

5 хв. Юхв.

500 нМ Тапсигаргін

Рис. 4. Інкубація зрізів мозочка в присутності тапсигаргшу призводить до інгібування глютаматіндукованих кальцієвих транзієнтів.

о

90 -1

250 ч

90

1 мМ Ии

Контроль

25 с

1 мМ Єіи

1 мМ Єіи

5 мкМ Гепарин

1 мМ вій

Рис. 5. Внутрішньоклітинна аплікація гепарину інгібірує глютаматіндуковані кальцієві транзієнти в кітинах Бергманівської глії.

А

о

1 мМ вій

Рис. 6. Просторова гетерогенність плотаматіндукованих кальцієвих сигналів в клітинах Бергманівської глії. А: Положення компартментів клітини, в яких реєструвались представлені на Б кальцієві транзієнти. □ - сома, • - проксимальні відростки, О - дистальні відростки.

X

нижчими, ніж до діалізу (52±23 нмоль/л в порівнянні з 145±48 нмоль/л до діалізу, п=б).

Для вивчення просторових характеристик глютаматіядукопаних кальцієвих сигналів в клітинах Бергманівської глії було використано двохвильову флуоресцентну відеомікроскопію. Як показано на рис. 6, аплікація глютамату викликала швидке підвищення [Са2+]і у відростках і послідуюче, більш повільне підвищення [Са2+]і в сомі. Глютаматіндуковані кальцієві транзієнти у відростках досягали пікових значень на 20±5 с швидше в порівнянні з сомою (п=8). Ця просторова гетерогенність не змінювалась ні в присутності СНС)Х (п=4), ні в безкальцієвому розчині (п=5).

Експресія клітинами Бергманівської глії тОІиШ та шбІиИб метаботропних глютаматних рецепторів.

Для визначення підтипів метаботропних глютаматних рецепторів, активація яких призводить до вивільнення Са4+ із внутрішньоклітинних депо, було використано ПЛР на поодиноких клітинах. В 7 із 32 досліджених клітин була зареєстрована зкспресія твІиКІ мРНК і в 11 з 24 - тИиИ5-мРНК. Праймери, використані для детекції тОІиШІ, давали можливість одночасно досліджувати експресію двох відомих сплайсових варіантів цього рецептора - тОїиїїба та тЯиІІбЬ. В 9 з 11 позитивних клітин було зареєстровано експресію лише тЫиГ15а варіанта рецептора, в той час, як 2 клітини експресували обидва сплайсових варіанта рецептора (рис. 7).

Дослідження експресії АМРА/КА глютаматних рецепторів клітинами Бергманівської глії.

Аплікація агоністів АМРА/КА рецепторів каінату (100 мкмоль/л) та домоату (ІООмкмоль/л) викликала трансмембранні струми та кальцієві транзієнти в усіх досліджених клітинах (відповідно п=19 та п=9). Преінкубація зрізів мозочка в присутності 10 мкмоль/л СНС}Х призводила до повного подавления як струмів, так і кальцієвих транзієнтів. Селективний агоніст АМРА підтипу вІиК (±)-а-аміно-3-гідрокси-5-метилізоксазол-4-пропіонат (АМРА, 100 мкмоль/л) викликав трансмембранний струм, проте підвищення [Са2*]; в сомі клітин при цьому зареєстровано не було (п=5) (рис. 8). Аплікація АМРА в присутності циклотиазиду (100 мкмоль/л) - агента, що специфічно подавляє інактивацію АМРА-рецепторів, викликала значну потеншацію трансмембранних токів (п=25), що супроводжувалось підвищенням [Са2*], (рис. 8). В той же час, аплікація глютамату (п=5) та домоату (п=3) в присутності лектину конканавалину А, не супроводжувалась ніякими змінами трансмембранних токів чи кальцієвих транзієнтів. Це свідчить про те, що переважна більшість експресованих клітинами Бергманівської глії іонотропних Сіий належить до АМРА типу.

500 п.о.

200 п.о.

тЗШ5Ь

т&иН5а

Рис. 7. Результати аналізу експресії шИиШ та швІиЯЗ мРНК в поодиноких клітинах Бергманської глії методом ПЛР. М - маркери молекулярної ваги; 1 - 4 номера досліджуваних клітин.

А

стг юо мкм

АМРАЮОмкМ

Б

2.0 -1.5 -1 -

0.5 -0 -

Рис. 8. Потенціація АМРА-індукованих трансмембранних струмів (А) та кальцієвих транзієнтів (Б) в присутності циклотиазида в клітинах Бергманівської глії.

Зміни експресії GluRB субодияиці АМРА рецепторів під час постнатального розвитку в клітинах Бергманівської глії.

Експресію мРНК, що кодує субодиниці АМРА рецепторів, досліджували в клітинах Бергманівської глії миїлей двох вікових груп - б (п=5) та 20 (п=12) днів після народження. Полімеразну ланцюгову реакцію на поодиноких клітинах проводили як описано в розділі “Матеріали та методи досліджень". Для визначення типів субодиниць, экспресованих клітинами, був використаний рестриктазний аналіз. Одержані в результаті ПЛР фрагменти ДНК містили сайти рестрикції, специфічні для кожного типу субодиниць: ВатНІ для GluRA, Bglll для GluRB, Ndel для GluRC та EcoRI у випадку GluRD. В жодній з 12 досліджених клітин з вікової групи Р20 не спостерігалося експресії мРНК, що кодус субодиниці GluRB та GluRC. В 10 клітинах були присутні GluRA та GluRD мРНК, в 2 клітинах - лише GluRA. У віковій групі Р6, на відміну від Р20, було зареєстровано експресію GluRB мРНК. В 2 з 5 досліджених клітин спостерігалась експресія GluRA та GluRD мРНК, в 1 - GluRA та GluRB, в 1 - лише GluRB та лише GluRA в 1 клітині (рис. 9).

Відсутність змін кальцієвої проникності АМРА-рецепторів в процесі постнатального розвитку в клітинах Бергманівської глії.

Присутність у складі рецепторних комплексів АМРА-рецепторів редагованої форми субодиниць GluRB призводить до практично повної непроникності цих рецепторів для іонів Са2\ Тому ми порівняли в клітинах мишей названих вікових груп, зміни [Саг~], що виникають при аплікації селективного агоніста АМРА-рецепторів - АМРА в присутності циклотиазида, який специфічно подавляє інактивацію цих рецепторів. Коаплікація зазначених речовин викликала підвищення [Са“*], в 7 із 10 досліджених клітин у віковій групі Р20, та у всіх досліджених клітинах (п=6) у віковій групі Р6. Використаний в цих дослідах однохвильовий кальцієвий зонд Oregon Green ВАРТА-1 не дозволяв провести кількісне порівняння амплітуд кальцієвих траязієнтів в клітинах мишей двох вікових груп, тому одержані результати не виключають повністю невеликих відмінностей в кальцієвій проникності АМРА-рецепторів в клітинах Бергманівської глії в ці періоди онтогенезу.

Експресія нейронами Пуркін'є функціональних метаботропних глютаматиих рецепторів mGluRl підтипу.

Апликація глютамату в концентрації 1 ммоль/л викликала підвищення [Са2*]; в дендритах та сомі нейронів Пуркін'є (п=14). Селективний агоніст метабо-трошшх GluR (1S,3R)-ACPD (100 мкмояь/л) також викликав кальцієві транзієнти в сомі та дендритах цих клітин (п=5). Амплітуди кальцієвих сигналів в дендритах були в 7,5±0,6 раз вищі, ніж в сомі. Експресію нейронами Пуркін'є мРНК, що кодує mGluRl підтип метаботропних глютаматних рецепторів, досліджували, як описано

вище для клітин Бергманівської глії. В усіх досліджених клітинах (п=8) встановили акспресі» тОиШ-мРНК.

Кальцієві сигналя, що викликаються в нейронах Пуркін'є аплікацією АТФ, адреналіну та гістаміну.

Аплікація АТФ (100 мкмоль/л), гістаміну (100 мкмоль/л) та адреналіну (ІОмкмоль/л) викликала підвищення [Са2+1 в нейронах Пуркін'є. Амплітуди кальцієвих транзієнтів, що викликаються вказаними агоністами були відповідно 179±54 нмоль/л (п=46), 111±67 вмоль/л (п=39) та 203±94 (п=44). Преінкубація зрізів мозочка на протязі 5 хв. в присутності 1 мкмоль/л тєтродотоксину, Юмкмоль/л CNQX та 10 мкмоль/л бікукуліва не призводила до помітних змів кальцієвих транзієнтів, викликаних цими агоністами (п=11 для АТФ, 9 для гістаміну та 14 для адреналіну). Щоб встановити походження іонів кальцію, які входять в цитозоль під час кальцієвих сигналів, що викликаються цими агоністами, ми провели порівняння кальцієвих транзієнтів в нормальному та безкальцієвому розчинах. На відміну від викликаного деполяризацією підвищення [Са2+], під час аплікації 50 ммоль/л КС1, де кальцієві сигнали повністю інгібірувались в безкальцієвому розчині (п=21), АТФ (п=19), гістамін (п=17) та адреналін (п=27) викликали підвищення [Са2+1 в безкальцієвому розчині. Це свідчить про те, що всі три агоністи індукують вивільнення іонів Са2+ із внутрішньоклітинних депо.

Фармакологічні властивості кальцієвих сигналів, що викликаються АТФ,

' гістаміном та адреналіном.

Аплікація АДФ (100 мкмоль/л, п=8) , але не АМФ та аденозина (100 мкмоль/л, п=8), викликала підвищення [Са2т], в нейронах Пуркін'є. Це свідчить про те, що підвищення [Са2+1 при аплікації АТФ відбувається за рахунок активації Р2у підтипа пуринорецепторів. Гістамініндуковане підви-щення [Са2^ подавлювалось селективним антагоністом Н! гістамінових рецепторів хлорфеніламіном (Імкмоль/л, п=7), в той час як антагоністи Н2 та Н3 рецепторів ранітідан (Імкмоль/л, п=5) та тіопірамід (1 мкмоль/л, п=7) пс викликали ніяких змін гістамініндукованих кальцієвих транзієнтів. Викликані адреналіном кальцієві транзієнти повністю подавлювались селективним б локатором а1-адренорецепторів празозином (Імкмоль/л, п=7). В той же час, антагоністи аз- та р-адренорецепторів йохімбін (1 мкмоль/л, п=4:) та пропранолол (1 мкмоль/л, п=5) не викликали змін епінефрін - індукованих кальцієвих сигналів (рис. 10).

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ В даній роботі досліджували дію глютамату та його аналогів на [Са2+], та експресію глютаматних рецепторів в клітинах Бергманівської глії. Було встановлено, що головуюча роль в генерації глютаматіидукованих кальцієвих транзієнтів належить вивільненню іонів Са2+ із внутрішньоклітинних депо.

Рис. 9. Експресія мРНК шо кодує субодиниці ОІиКЛ- О АМРА рецепторів клітинами Бергманівської глії.

А 300 -,

50 ->

В

бо -і

270

5хі. /„

50 с

100 мкМ

100 мкМ 100 мкМ 100 мкМ

АДЕ АМФ АДФ

.........т’ЛН'Ачу 5 хв. '

т т 100 мкМ Гістамін

1 мкМ Хлорфенірамін

10 мкМ Адреналін

1 мкМ Празозін

Рис. 10. Фармакологічні властивості агоністіндукованих кальцієвих транзієнтів в нейронах Пуркін’є. А: Регістрація змін [Са2*]. при аплікації АТФ, аденозину (АДЕ), АМФ та АДФ. Б: Селективний інгібітор Н, гістамінових рецепторів хлорфенрамін повністю блокує гістамін-індуковане підвищення [Са2+]і. В: Селективний інгібітор а,-адренорецепторів празозін повністю блокує епінефрін-індуковане підвищення [Са2+]| .

u

Гяютаматіндуковаяе підвищення [CaJ<"]¡ практично не змінювалось при видаленні іонів Са2+ із зовнітньоклітинного середовища. Крім того, тапсигаргин значно знижував амплітуду глютаматіндукованих кальцієвих транзієнтів за рахунок подавлення функціюваиня SERCA-насосів. Ці транзієнти також подавлювались внутрішньоклітинною аплікацією гепарину - блокатора внутрішньоклітинних Нечутливих кальцієвих каналів. Описані ефекти є ознаками участі метаботропних глютаматних рецепторів в глютаматіндукованому підвищенні [Са2+],. Як було показано методом ПЛР на поодиноких клітинах, ці рецептори належать до mGluRl та mGluR5 типів. Клітини Бергманівської глії також ексщ>есують іояотропні GluR АМРА-лідтипу. Про це свідчить підвищення [Са2+], та виникнення трансмембранних токів під час аплікації агоністів іонотропних глютаматних рецепторів каінату, домоату та АМРА. Потенціація викликаемих АМРА трансмембранних струмів та кальцієвих транзієнтів в присутності циклотиазиду, який селективно блокує інактивацію АМРА-рецепторів, свідчить про експресію рецепторів цього підтипу клітинами Бергманівської глії. Крім того, відсутність потенціації домоат- та глютамагактивованих трансмембранних струмів вказує на те, що Бергманівська глія не екслресує каінатні рецептори. Методом ПЛР на поодиноких клітинах було встановлено, що АМРА-рецептори в клітинах Бергманівської глії дорослих мишей складаються з GluRA та GluRD субодиниць. Це узгоджується з високою кальцієвою проникністю цих рецепторів. Проте в популяції клітин Бергманівської глії молодих тварин (віком в діб після народження) було зареєстровано експресію GluRB субодиниці, присутність якої у складі рецепторного комплексу призводить до низької кальцієвої проникності останнього. Проте, у наших дослідах не спостерігалося значної різниці між кальцієвими сигналами, що виникають при селективній активації АМРА рецепторів у молодих та дорослих тварин. Це може бути пояснено тим, що GluRB субодиниця входить до складу лише частини рецепторних комплексів, що виражається в незначних змінах сумарної кальцієвої проникності мембрани при активації АМРА рецепторів. Можливо також, що в даному випадку має місце експресія нередагованої форми GluRB субодиниці, яка не була модифікована посттравскрипційно. Така форма субодиниці яе призводить до зниження кальцієвої проникності рецепторних комплексів.

Як відомо, клітини Бергманівської глії експресують окрім глютаматних, ще ряд нейротрансмітерних рецепторів: Р2-пурінорецептори, аі-адренорецептори та Нг гістамінові рецептори. Ми встановили, що нейрони Пуркія'є також експресують ці рецептори. Гістамінові та адренорецептори можуть забезпечувати синалтичну передачу від гістамінергічних нервових волокон, що беруть початок із туберомамілярного ядра гіпоталамуса та моноамінергічних волокон з locas coemíeus до нейронів Пуркін'є. Експресія клітинами Бергманівської глії

рецепторів до тих же нейромедіаторів, що й нейрони Пуркін'є, разом з відомим фактом про те, що клітини Бергманівської глії формують гліальну оболонку навколо цих нейронів, вказує на можливість участі Бергманівської глії в регуляції синаптичної передачі в корі мозочка.

ВИСНОВКИ

1.Більшість іонотропних глютаматних рецепторів, розташованих на плазматичній мембрані клітин Бергманівської глії, належать до АМРА типу, та складається з GluR-A та GluR-D субодинвць.

2.Показаяо, що в процесі постватальвого розвитку має місце подавления експресії мРНК, яка кодує GluR-B субодиницго. Проте це не викликає помітних змін кальцієвої проникності іонотропних глютаматних рецепторів.

3.Глютамат, фізіологічний аговіст іонотропних та метаботропних глютаматних

рецепторів, викликає підвищення [Са2*], в клітинах Бергманівської глії. Ведуча

. . . . 2+ . ______________________________. .

роль у цьому процесі належить вивільненню іонів Са із внутрішньоклітинних

депо. Вхід іонів Са2* із зовнішньоклітинного середовища через АМРА тип глютаматних рецепторів відіграє незначну роль в підвищенні [Са2+]; в сомі та проксимальних відростках.

4.Глютаматіндуковане підвищення [Са2+1 протікає через активацію InsP3-чутливих каналів ендоплазматичного ретикулуму, про що свідчить блокування цього ефекта тапсигаргином та гепарином.

5.В клітинах Бергманівської глії екслресується мРНК, яка кодує два типи метаботропних глютаматних рецепторів mGhiRl та mGluR5. Дані було одержано методом полімеразної ланцюгової реакції на поодиноких клітинах.

6.Для метаботропних глютаматних рецепторів в клітинах Бергманівської глії характерною є неоднорідність просторового розподілу, про що свідчать дані цифрової відеомікроскошї.

7.Клітини Бергманівської глії характеризуються набором нейротрансмітерних рецепторів, який практично повторює набір нейротрансмітерних рецепторів нейронів Пуркін’є, які знаходяться з ними в безпосередньому контакті. Це може відображати здатність клітин Бергманівської глії реагувати на синаптичну активність в синапсах на нейронах Пуркін'є.

Перелік робіт, опублікованих за матеріалами дисертації.

1. S. Kirisch.uk, V. Matiash, A. Kulik, N. Voitenko, P. Kostyuk, A. Verkhratsky / Activation of P2-purino-, at-adreno- and H^histamine receptors triggers cyto-plasmic calcium signalling in cerebellar Purkinje neurons. // Neuroscience.-1996.-73, No.3.-p.643-647.

2. В.В.Матяш, С.І.Кнрищук, О.Н.Верхратський. Експресія та функціональні властивості глютаматних рецепторів в клітинах Бергманівської глії in situ 11 Журнал Академії Медичних Наук України.-1997.-3, No.l.-C.lOO-lll.

3. V.Matyash, A.Verkhratsky. Expression of type 1 metabotropic glutamate receptors in Purkinje neurons of mice. // Нейрофизиология.-1997.-29.No.l.-C.35-39.

4. S.Kirischuk, V.Matiash, A.Kulic, P.Kostyuk, A.Verkhratsky. ATP, epinephrine and histamine induced calcium mobilization in cerebellar Purkinje cells. // Proceedings of the first meeting of Neurowissenschaftlichen Gesellschaft, Berlin, 1996, p. 69.

5. S.Kirischuk, V.Matiash, A.Kulic, A.Verkhratsky. ATP, epinephrine and histamine induced calcium mobilization in mouse cerebellar Purkinje cells. // Proceedings of the meeting of the Physiological Society of the UK, Bristol, 1996, p. 78.

6. S.Kirischuk, V.Matiash, F.Kirchhoff, H.Kettenmann, A.Verkhratsky. Bergmann glial cells in situ express mGluRl and mGluR5 metabotropic glutamate receptors // Proceedings of the Final symposium of the DFG study group, “Functions of glial cells“, Berlin, 1997, p.97.

АНОТАЦІЯ

Матяш В.В. Експресія та функціональні властивості глютаматних рецепторів в клітинах Бергманівської глії мозочка мишей. - Рукопис.

Дисертація ва здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 1997.

Глютаматіядуковані кальцієві транзієнти і трансмембранні токи досліджені в клітинах Бергманівської глії мозочка мишей методами мікрофлуоріметрії, цифрової видеомікроскопії, конфокальної мікроскопії та методом петч-клемп. Аплікація глютамата призводила до підвищення [Са2+], опосередковане активацією метаботропних і іонотропних глютаматних рецепторів; метаботропні рецептори грають у цьому процесі головну роль. Методом полімеразної ланцюгової реакції на поодиноких клітинах було встановлено, що ці клітини експресують тОІиК 1 та тС1иї?.5 метаботропні глютаматні рецептори ОиНА та СІиІІВ субодиниці іонотропних глютаматних рецепторів АМРА підтипу. В клітинах від тварин віком

6 днів після народження була виявлена експресія субодиниці йиЯВ, але це не упроводжувалось зниженням проникності для іонів Са2+ АМРА рецепторів у молодих тварин. Встановлено також, що нейрони Пуркін'є експресують а1-адрено, Ні-гистамінові та Р2-пуринорецептори, експресія яких була раніше показана на клітинах Бергманівської глії. Ці дані дозволяють зробити висновок, що Бергманівська глія має набір нейротраясмітерних рецепторів, що здатні реагувати на синалтичну передачу в синапсах, що утворені аферентними волокнами на нейронах Пуркін’є.

Ключові слова: мозочок, астроцити, Бергманівська глія, нейрони Пуркін'є, кальціометрія, глютаматні рецептори.

Матяш В.В. Экспрессия и функциональные свойства глютаматных рецепторов в клетках Бергмановской глии мозжечка мышей. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02. - Биофизика, Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, Киев, 1997.

Глютамативдуцированные кальциевые транзиенты и трансмембранные токи исследовали в клетках Бергмановской глии мозжечка мышей методами микрофлуориметрии, цифровой видеомикроскопии, конфокальной микроскопии и методом пэтч-клэмп. Аппликация глютамата вызывала повышение [Са2+]; опосредованное активацией метаботропных и ионотропных глютаматных рецепторов, метаботропные рецепторы играют в этом процессе основную роль. Как было установлено методом шпмеразной цепной реакции на одиночных клетках, эти клетки экспрессируют тСІчІЇІ и тОІиїїб метаботропные глютаматные

рецепторы и GluRA и GluRD субъединицы ионотропных глютаматаых рецепторов АМР А подтипа. В клетках от животных возрастом 6 дней после рождения была обнаружена экспрессия субъединицы GluRB, однако это не сопровождалось пониженной проницаемостью для ионов Са2+ АМРА рецепторов у молодых животных. Установлено также, что нейроны Пуркинье экспрессируют агадрено-, Hi-гистаминовые и Р2'Пуринорецепторы, экспрессия которых была ранее показана в клетках Бергмановской глин. Эти данные позволяют заключить, что Бергмавовская глия обладает набором вейротраисмиттерных рецепторов, способных реагировать на синаптическую передачу в синапсах, образуемых афферентными волокнами на нейронах Пуркинье.

Ключевые слова: мозжечок, астроциты, Бергмавовская глия, нейроны Пуркинье, кальциометрия, глютаматные рецепторы.

Matyash V.V. Expression and functional characteristics of glutamate receptors in Bergmann glial cells of mouse cerebellum. - Manuscript.

The thesis is presented in accordance with requirements for the degree of candidate of biological sciences in speciality 03.00.02. - Biophysics, A.A.Bogomoletz Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1997.

Glutamate-activated calcium transients and transmembrane currents were studied in Bergmann glial cells in acutely isolated slices of mouse cerebellum by employing fura-2 microfluorimetry, calcium imaging, confocal microscopy and patch-clamp techniques. Application of glutamate evoked rise in [Ca24], mediated by activation of metabotropic and ionotropic glutamate receptors. Metabotropic receptors appeared to play the major role in this process. As revealed by single cell RT-PCR technique, these cells exhibit mGluRl and mGluR5 types of metabotropic glutamate receptors and GluRA and GluRD subunits of ionotropic glutamate receptors of AMPA subtype. In 6 days old animals we have detected expression of GluRB subunit, but this does not result in decrease of calcium permeability of AMPA receptors of the young animals. We have shown also that Purkinje neurons express ai-adreno-, Hi-histamine and P2-purinoreceptors, which, as it was shown earlier, are expressed also by Bergmann glial cells. These data suggest that Bergmann glial cells are equipped with appropriate receptors to sense synaptic events in synapses formed by afferent fibers on Purkinje neurons.

Cerebellum, astrocytes, Bergmann glial cells, Purkinje neurons, calcium imaging and microfluorimetry, glutamate receptors.