Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальное обоснование подходов к этиотропной терапии чумы, вызванной антигенизмененными штаммами возбудителя

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальное обоснование подходов к этиотропной терапии чумы, вызванной антигенизмененными штаммами возбудителя"

На правахрукописи

ЛЮКШИНА ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПОДХОДОВ К ЭТИОТРОПНОЙ ТЕРАПИИ ЧУМЫ, ВЫЗВАННОЙ АНТИГЕНИЗМЕНЕННЫМИ ШТАММАМИ ВОЗБУДИТЕЛЯ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону

2004 г.

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Рыжко Инна Васильевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Васильева Галина Ивановна

доктор медицинских наук, Яговкин Эдуард Александрович

Ведущая организация:

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится «_с2_» 2004 г. в /3 на ¡заседании диссер-

тационного совета Д 208.082.01 при Ростовском государственном медицинском университете (344022 г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский 29)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного медицинского университета

Автореферат разослан <<¿56» 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

Н.Я. Корганов

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Yersinia pestis - возбудитель чумы -является этиологическим фактором природно-очагового заболевания, к которому чувствительны более чем 200 видов грызунов. Нозоареалы этой инфекции распространены по всем странам и континентам (исключая Австралию) и при обширных эпизоотиях инфекция может передаваться синантропным грызунам» (мышам, крысам), кошкам, верблюдам и др. Заражение человека происходит при укусах инфицированных блох, разделке туш больных животных, через пищу. От человека к человеку заболевание передается контактным путем при язвенно-бубонных формах инфекции и, что самое опасное, воздушно-капельным путем при чумной пневмонии.

Заболеваемость чумой среди людей за последние десятилетия неуклонно растет. По данным ВОЗ (цит. по Guiyoule A. et al., 2001), в течение 15 лет (19821996) в 24 странах зарегистрировано 23904 случаев чумы (Африка, Азия, Америка), из которых 2105 (8,8%) закончились летально. Имеются регионы, где заболевание чумой отмечается ежегодно с 1969 г. (WER, 2000) и наблюдается четкое нарастание числа больных. Так, за 14 лет (1969-1983) на О.Мадагаскар зарегистрировано 527 случаев, в период с 1984-1997 гг. (15 лет) - 5869; в Перу -за период 1969-1983 гг. (14 лет) - 379 случаев, с 1984 по 1997 гг. (15 лет) - 1826 случаев чумы. За последнее десятилетие увеличилось число сообщений об обнаружении антибиотикорезистентных штаммов чумного микроба (Атшабар Б.Б. и др., 2000; Rasoamanana В. et al., 1989; Lyamuya E.F. et al., 1992; Galimand M. et al., 1997; Guiyoule A. et al., 1998,2001; Wong G.D. et al, 2000).

Большую тревогу вызывают вспышки легочной чумы, которые не регистрировались в течение нескольких десятилетий, в Танзании и Китае в 1991 г. (Ткачев А.В. и др., Л994; Lyamuya E.F. et al., 1992), Индии - в 1994 и 2002 гг. (Butler Т., 1994; Gayaraman К., 1994; WER; 2002). В связи с усилением в настоящее время миграции населения, коммерческим туризмом, военными конфликтами существует не только потенциальная, но и реальная опасность завоза этой инфекции в любую страну мира (Мишанькин Б.Н. и др., 1995; Иннокенть-ева Т.И., 2001; Брюханова Г.Д., 2002). В России известны 12 активных природных очагов чумы, из которых 6 расположены на Северном Кавказе (Грижебов-ский Г.М. и др., 1997). В последние годы отмечены изменения в клинике и течении чумы, стали чаще регистрироваться затяжные формы заболевания, осложняющиеся менингоэнцефалитом, кишечные, ангинозные и другие формы инфекции (Покровский В.И., 1995; Дмитровский А.М., 1997). Авторы отмечают, что увеличение клинических проявлений чумы может быть связано с изменчивостью возбудителя, хотя прямых свидетельств этому положению не приводят.

В то же время давно зарегистрировано (Кочкарева А.Ф., 1972; Топорков В.П., 1987; Захаров А.Н., 1989; Баканурская Т.Л., 1991; Meka-Mechenko T.V., 2002), что к концу эпизоотии на территории природных очагов увеличивается число случаев выделения от грызунов антигенизмененных форм возбудителя и, прежде всего, утративших способность к продукции, капсульного антигена фракции I (Fra* фенотип), которые могут реверсировать к Fra+ фенотипу при сохранении плазмиды pFra. Некоторые авторы связывают такую изменчивость со способностью возбудителя переживать межэпизоотический период в популяции хозяев. Проведя анализ антигенного состава штаммов из разных очагов бывшего СССР, А.М. Кокушкин (1995) приходит к выводу, что число измененных штаммов с разным фено - и генотипом достигает 34%. В.В. Кутырев (1992) описывает выделение природных высоковирулентных штаммов возбудителя, уг-

/'ОС.НАЦМОНАЛЫ1АЯ БИБЛИОТЕКА

ративших плазмиду pFra (фенотип FraTox"). Целенаправленных исследований по изучению эпидемиологической значимости антигенизмененных штаммов возбудителя чумы не проводилось, хотя описаны заболевания людей с летальным исходом, вызванные возбудителем чумы с Fra* и Fra фенотипом (Lawton W.D., 1960; Winter C.C. et al., 1960; Williams I.E. et al., 1983; 1984). При детальном изучении 52 штаммов чумного микроба, выделенных от людей в разных очагах мира, наряду с типичными выявляли вирулентные штаммы возбудителя чумы, не продуцирующие антиген FI (с плазмидой pFra или без неё) (Лебедева С.А. и др., 2002).

Обнаружение антигена и антител с помощью применяемых в настоящее время коммерческих диагностикумов, основанных на детекции фракции I и антител к ней, оказывается в этих случаях невозможным. Регистрация таких фактов может быть осуществлена только при прямом выделении культуры чумного микроба от больного или умершего, что само по себе весьма сложно даже при неконтролируемом и неадекватном лечении антибиотиками (Терентьев А.Н. и др., 1987). В связи с этим не исключено, что случаи инфекции, вызванные возбудителем с Fra* фенотипом, могут оказаться не диагностированными. Это вызывает настоятельную необходимость внедрения в практику лабораторных исследований коммерческих диагностикумов, способных выявлять Fra" варианты возбудителя (Щербаков А.А. и др., 1990; Орлова Г.М. и др., 1992; Phillips et al., 1988). Важность своевременной детекции антигенизмененных форм чумного микроба обусловлена и тем, что еще в 1965 году В.В. Акимович и Л.Н. Шанина, доказали способность Fra* культур чумного микроба преодолевать противочумный иммунитет.

До последнего времени разработка подходов к этиотропной терапии чумы проводилась только с использованием высоковирулентных, типичных по плазмидному и антигенному составу штаммов чумного микроба. Доказана эффективность препаратов группы аминогликозидов, тетрациклинов, беталакта-мов (включая цефалоспорины III поколения), хинолонов (включая фторхино-лоны), рифампицина. Набор препаратов и схемы их применения представлены в новых «Методических указаниях» (МУ 3.4.1030 - 01, 2001). Исследования, проведенные в нашей лаборатории, показали, что некоторые препараты снижают свою эффективность при инфекции, вызванной природными и экспериментально полученным штаммами чумного микроба с полноценным плазмидным профилем, но утратившими способность к продукции капсульного антигена фракции I (Fra* фенотип). Однако для окончательного решения вопроса о рациональных подходах к экстренной профилактике и лечению инфекции, вызванной антигенизмененными штаммами не только с Fra* фенотипом, но и с FraTox", FraTox*Pst* фенотипом и разным генотипом (полноценный плазмид-ный профиль, генетически измененная pFra плазмида, продукция серологически атипичной фракции I, утрата плазмид pFra, pPst), требуются дополнительные исследования, которые позволили бы обобщить большой экспериментальный материал с последующим отбором эффективных препаратов и разработкой оптимальных схем их применения.

В настоящее время весьма остро стоит вопрос о возможности совершения актов биотерроризма (Онищенко Г.Г. и др., 2000). По критериям, разработанным отечественными учеными (Воробьев А.А., 2001, 2003), позволяющим оценивать степень опасности и вероятности применения биоагентов в качестве бактериологического оружия, чума занимает второе место после оспы; по данным зарубежных специалистов — третье место после оспы и сибирской язвы (Jezek Z.,2000; Leggiadro R.J., 2000; Broussard L.A., 2001; Heddurshetti R. et al.,

2001; Klietmann W.F., RuofFK.L. 2001; Martin G.J., Marty A.M., 2001; Polgreen P.M., Helms С 2001; Casadevall A., 2002). Биоагенты должны характеризоваться способностью вызывать инфекцию с атипичной клинической картиной, не поддающуюся лечению антибактериальными препаратами, иметь трудности в диагностике, преодолевать иммунитет. Варианты чумного микроба с Fra', FraTox", Fra" Tox" Pst" фенотипом полностью вписываются в эти требования. По мнению Т.А. Гремяковой (2004), в качестве агента биотерроризма наиболее вероятным является использование природных Fra" штаммов возбудителя чумы. Не исключена возможность применения в качестве биоагентов и антибиотикоустойчивых форм возбудителя. Медицинская служба России должна быть готова к адекватному осуществлению полномасштабных противоэпидемических мероприятий на случай чрезвычайной ситуации.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: провести отбор наиболее перспективных для профилактики и лечения чумы антибактериальных препаратов различных групп на основе изучения их активности in vitro и эффективности in vivo на модели чумы, вызванной антигенизмененными (Fra', Fra Tox", FraTox'Pst") формами возбудителя с различным генотипом и фенотипом.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. .Провести сравнительное изучение антибиотикограмм штаммов чумного микроба, полноценных в антигенном отношении, и их изогенных вариантов с различным генотипом и фенотипом.

2. .Изучить вирулентность и иммунитетпреодолевающие свойства антигениз-мененных штаммов возбудителя чумы.

3. .Дать сравнительную оценку эффективности различных антибактериальных препаратов в профилактике и лечении экспериментальной чумы белых мышей, обусловленной полноценными и антигенизмененными штаммами чумного микроба.

4. .Изучить возможность возникновения устойчивости к рифампицину и хино-лонам у антигенизмененных вариантов возбудителя чумы с сохранением фенотипа, высокой степени вирулентности и иммунитетпреодолевающих свойств.

5. .Оценить перспективы комбинированной терапии чумной инфекции, вызванной штаммом чумного микроба с Fra" фенотипом.

6. .Разработать ориентировочные схемы применения антибактериальных препаратов и их комбинаций для экстренной профилактики и лечения чумы, обусловленной антигенизмененными штаммами возбудителя.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Впервые в экспериментах использована большая коллекция антигенизме-ненных штаммов чумного микроба с разным генотипом и фенотипом, уклоняющихся от индикации коммерческими препаратами. Это: изогенные варианты штаммов 231 (от сурка) и 358 (от человека) с типичным плазмидным профилем, но утратившие способность продуцировать фракцию I; штаммы с генетически сконструированной плазмидой pFra, не продуцирующие фракцию I или продуцирующие серологически атипичную фракцию I; штаммы, полностью утратившие плазмиду pFra (фенотип Fra" Tox" ) или обе плазмиды - pFra и pPst (фенотип Fra" Tox" Pst"); природный штамм К-16 (от полуденной песчанки) с фенотипом Fra".

В ходе исследования впервые доказано: -штаммы чумного микроба, утратившие способность продуцировать антиген

FI (независимо от механизмов утраты), "мышиный" токсин, а также лишенные плазмиды pPst, вызывают в экспериментах на мышах затяжной инфекционный процесс, при котором снижается эффективность большинства препаратов, рекомендованных для профилактики и лечения чумы;

-при экспериментальной чуме, обусловленной антигенизмененными штаммами чумного микроба, доксициклин и ампициллин снижают свою эффективность, не обеспечивая эрадикацию возбудителя из макроорганизма, что приводит к рецидиву инфекции при использовании дополнительного контроля эффективности лечения введением животным гидрокортизона;

-фторхинолоны и аминогликозиды обеспечивают высокий профилактический и лечебный эффект в максимальных терапевтических дозах и курсом не менее 7 суток;

-рифампицин не может быть рекомендован как средство монотерапии, так как возникающие с частотой n*10"9-n*10"s Rif мутанты возбудителя чумы могут сохранять высокую вирулентность и вызывать инфекцию на фоне лечения этим препаратом;

-устойчивые к налидиксовой кислоте (Nalr) мутанты антигенизмененных штаммов чумного микроба обладают перекрестной резистентностью к фторхи-нолонам (МПК=0,4-10,0 мг/л) и при сохранении высокой степени вирулентности способны вызывать инфекцию на фоне интенсивной терапии фторхиноло-нами даже при значениях МПК=0,8-1,6 мг/л;

-при чуме, вызванной Fra" штаммом возбудителя, перспективно использование комбинаций фторхинолонов с рифампицином, цефалоспоринами III поколения или аминогликозидами.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Проведенная оценка эффективности представителей разных групп антибактериальных препаратов в профилактике и лечении экспериментальной чумы у беспородных белых мышей, обусловленной типичными по антигенному составу и антигенизмененными штаммами возбудителя, позволила предложить ориентировочные схемы их применения для экстренной профилактики и лечения чумы. Согласно результатам наших экспериментов доказана:

- нецелесообразность применения доксициклина и ампициллина и их комбинаций с фторхинолонами;

- перспективность использования в максимальных дозах и курсах применения

аминогликозидов (стрептомицин, амикацин, гентамицин и др.); фторхинолонов (ципрофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин); цефалоспоринов III поколения (цефтриаксон, цефотаксим); комбинаций фторхинолонов с рифампицином, аминогликозидами, цефа-лоспоринами III поколения;

комбинаций оральных форм ципрофлоксацина (офлоксацина) и рифампи-цина для целей экстренной профилактики в группах лиц с высоким риском заражения.

На основе полученных данных разработаны «Методические рекомендации по использованию антибактериальных препаратов в профилактике и лечении чумы, обусловленной антигенизмененными формами возбудителя ", одобренные Ученым Советом РНИПЧИ и утвержденные директором РНИПЧИ 26.12.2002г., протокол № 7, которые могут быть полезны для специалистов противочумной системы, врачей-инфекционистов системы здравоохранения РФ

и включены в лекционные материалы на курсах специализации бактериологов по ООИ, на семинарах, проводимых на базе РНИПЧИ.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Антигенизмененные штаммы чумного микроба, сохраняя высокий уровень вирулентности, чувствительность к антибактериальным веществам in vitro, обладая иммунитетпреодолевающими свойствами, вызывают в эксперименте на беспородных белых мышах затяжной инфекционный процесс, при котором снижается эффективность большинства препаратов, рекомендуемых для профилактики и лечения чумы.

2. Доксициклин и ампициллин, рекомендуемые для целей специальной экстренной профилактики и лечения чумы, нецелесообразно применять при инфекции, вызванной антигенизмененными формами возбудителя (Fra", Fra' Tox\ FraToxPst" фенотип), ввиду снижения их эффективности, неспособности обеспечивать очищение макроорганизма от инфекта и связанной с этим возможности развития рецидива заболевания.

3. Наиболее эффективными препаратами при инфекции, вызванной антигенизмененными формами возбудителя, являются: аминогликозиды (стрептомицин, гентамицин, амикацин), беталактамы (цефтриаксон), фторхинолоны (ци-профлоксацин, офлоксацин) и комбинации антибактериальных препаратов с синергидным характером действия (фторхинолоны с цефалоспоринами III поколения, аминогликозидами или рифампицином).

4. Ориентировочные схемы экстренной профилактики и лечения чумы с оптимальными дозами и курсами применения антибактериальных препаратов, представленные в «Методических рекомендациях по использованию антибактериальных препаратов в профилактике и лечении чумы, обусловленной анти-генизмененными формами возбудителя)", одобрены Ученым Советом РНИПЧИ и утверждены директором РНИПЧИ 26.12.2002г., протокол №7.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены:

- на научных конференциях молодых ученых Ростовского НИПЧИ в 2000г., 2001г., 2002г., 2003г.; на Ученом Совете Ростовского НИПЧИ в 2002г;

- на научно-практической конференции с международным участием «Инфекционные болезни в практике терапевта». - Харьков, 2001г.;

- на межрегиональной научно-практической конференции 16-17 октября 2001г., посвященной 80-летию Омского НИИПИ «Актуальные аспекты при-родно-очаговых болезней». - Омск, 2001г.;

- на третьей международной конференции, посвященной 80-летию института имени Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». - Санкт-Петербург, 2003 г.;

Отчет по теме №126-2-98 «Изучение эффективности антибактериальных препаратов широкого спектра действия при экспериментальной чуме, вызванной антигенизмененными штаммами чумного микроба (Fra", Fra'Tox"; Fra'Tox' Psf)», где автор является ответственным исполнителем, принят и одобрен Ученым Советом РНИПЧИ в декабре 2002г.

ПУБЛИКАЦИИ: Основные материалы диссертации опубликованы в 6 научных работах.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и указателя источников литературы. Общий объем диссертации 163 страницы. Работа иллю-

стрирована 46 таблицами. Библиографический указатель содержит 337 источников: 198 отечественных, 139 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Штаммы: 1) природные, высоковирулентные штаммы Y. pestis - 231 (от сурка) и 358 (от человека), К-16 с Fra* фенотипом (от полуденной песчанки); 2) экспериментальные штаммы чумного микроба: а) 231 Fra*, полученный в 1983 г. Л.ГТерасюк путем культивирования штамма 231 в бульоне Хотгингера с добавлением гипериммунной противочумной сыворотки; б) изогенные штаммы 231 и 358 с разным генотипом и фенотипом (Fra", Fra' Tox"; Fra* Tox" Psf), любезно предоставленные в наше распоряжение ГКПБ института "Микроб" (г.Саратов).

Минимальные подавляющие концентрации (МПК) препаратов в опытах in vitro определяли, используя метод двукратных серийных разведений антибактериальных веществ в агаре Хотгингера, рН 7,1±0,1. Посевная доза составляла п*107 микробных клеток (м.к.) по отраслевому стандартному образцу ГИСК им. Л.А. Та-расевича (ОСО -42-25-59-86 П). Учет результатов проводили через 48 ч роста культур Y. pestis при 28 °С. Оценку чувствительности/устойчивости проводили в соответствии с Критериями, разработанными Европейским обществом инфекционистов и микробиологов для неприхотливых бактерий (Statement 1996 CA-SFM).

Вирулентность штаммов чумного микроба изучали в опытах на беспородных белых мышах массой 18-20 г, которых подкожно инфицировали суспензиями суточных агаровых культур, выращенных при 28 °С, с использованием 4-6 заражающих доз и не менее четырех животных на одну дозу. Расчет значений ЛДзд и доверительных интервалов проводили по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина и А.А.Воробьева(1962).

Иммунитетпреодолевающие свойства изучали в опытах на белых мышах, подкожно иммунизированных второй генерацией вакцины чумной живой сухой (EV линии НИИЭГ) в дозе п*106 м.к. по стандарту мутности. Через 21 день животных инфицировали суспензиями культур изучаемых штаммов в дозах, равных 103104-105- 10б м.к. Для оценки степени преодоления иммунитета введено понятие индекс преодоления иммунитета (ИП) - отношение значения ЛД» исходного штамма на иммунном поголовье животных к значению ЛД50 антигенизмененного штамма на том же иммунном поголовье животных

Для оценки терапевтической активности антибактериальных препаратов в опытах in vivo беспородных белых мышей подкожно инфицировали взвесью суточной агаровой культуры (28 °С) Y. pestis в позе 104 М.К. по стандарту мутности, что соответствовало ~ 1000 ЛДя- Значения ЕД50 препаратов определяли по методу Кербера (Ашмарин И.П., Воробьев А.А.,1962). Для этого использовали не менее четырех лечебных доз препаратов, взятых с двукратным интервалом, при количестве животных - не менее шести на одну дозу. Расчет проводили, учитывая число выживших животных из числа зараженных в каждой группе. Суточные дозы антибактериальных препаратов, использованных в экспериментах на беспородных белых мышах, рассчитывали исходя из эквивалентных человекодоз с учетом коэффициентов для мышей и человека (Paget I.E., Barnes CM . 1964). С профилактической целью антибактериальные препараты применяли через 5 ч после заражения один раз в сутки на протяжении 5-7-10 дней. Лечение начинали через 24 ч после заражения и продолжали 7-10 дней. Срок наблюдения за животными составлял 30 дней. Контрольные группы животных не лечили. На протяжении каждого опыта осуще-

ствляли бактериологический контроль заражения и эффективности этиотропной терапии экспериментальной чумы. Культуры чумного микроба, использованные для заражения и выделенные от животных, в каждом опыте контролировали на наличие продукции фракции I в РНАт(Леви М.И., Момот А.Г., 1961).

Устойчивые к рифампицину (Rif) и налидиксовой кислоте (Nal1) мутанты чумного микроба получали методом однократного воздействия антибактериального препарата на плотной питательной среде (агар Хотгингера, рН 7,1± 0,1), содержащей 100 мг/л рифампицина или налидиксовой кислоты. Использовали суспензии двухсуточных агаровых культур (28 °С) в дозе 2-4*109 м.к. по стандарту мутности. Посевы инкубировали при 28 °С на протяжении 3-5 суток. Выросшие колонии отсевали для определения степени резистентности. Частоту мутаций определяли отношением числа мутантов к числу живых особей в посевной дозе культуры. Сравнительную оценку вирулентности особей в поцуляции исходных антибиотикочувствительных штаммов чумного микроба и мутантов проводили в опытах на белых мышах, исполь-

зуя для подкожного инфицирования одну заражающую дозу - 103 м.к. возбудителя чумы. Для заражения животных (6-10 мышей в группе) использовали суспензии суточных агаровых культур исходных штаммов 231 и 358 (по 6-10 субкультур), их анти-генизмененных вариантов (по 6-10 субкультур), а также мутантов этих штаммов, устойчивых к рифампицину и налидиксовой кислоте (по 6-10 Rif и NaT мутантов каждого штамма). Наблюдения за животными вели в течение 20 дней. Получив соотношение количества павших мышей к общему числу зараженных в каждой группе, прово-. дили расчет достоверности различий в вирулентности сравниваемых групп культур по критерию Фишера (Урбах В.Ю., 1963).

Эффективность комбинаций антибактериальных препаратов изучали на белых мышах, инфицированных суспензией суточной агаровой культуры Y. pestis 231 Fra", доза заражения составляла 104 м.к. (~1000 LD50). В каждую группу брали по 10 белых мышей. Для оценки сочетанного действия антибактериальных препаратов использовали заведомо неэффективные или недостаточно эффективные дозы препаратов. Контрольные животные получали только один из препаратов в тех же дозах, применение которых приводило к гибели 50-100% белых мышей. Статистическую обработку проводили по Г.Ф. Лакину (1973), сравнивая различия относительных показателей выживаемости белых мышей в опытных и контрольных группах. Различия между выживаемостью мышей в опытной и контрольной группах считали достоверными, если разница показателей (Р| - Рг) превышала ошибку в 2 и более раз, то есть, если коэффициент t оказывался более 2 (t>2). Для оценки взаимодействия антибиотиков пользовались схемой, предусматривающей четыре варианта: индифферентный, суммарный, синергидный, антагонистический.

Способность клеток чумного микроба продуцировать фракцию I изучали в трехкомпонентной серологической реакции нейтрализации антител - РНАт с использованием мелкосерийного эритроцитарного антигенного диагностикума производства Ростовского НИПЧИ:

Статистическую обработку результатов опытов проводили по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина и А.А.Воробьева (1962), по таблицам А.Я. Боярского, по B.C. Генесу (1964), по критерию Фишера (Урбах В.Ю., 1963), (1964), по Г.Ф. Лакину (1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В соответствии с целью и задачами исследования, прежде всего была изучена вирулентность взятых в эксперименты штаммов чумного микроба. Значения ЛД50

как типичных, так и антигенизмененных культур для беспородных белых мышей колебались в пределах 3-18 м.к., что свидетельствует об их высокой вирулентности. Сравнительный анализ средней продолжительности жизни (СПЖ) мышей, зараженных —1000 ЛД» изучаемых штаммов, показал, что в отличие от типичных по антигенному составу исходных штаммов 231 и 358, антигенизмененные культуры возбудителя (включая природный Fra' штамм К-16) вызывают статистически достоверно более затяжную инфекцию у мышей, что может иметь самостоятельное значение для результатов этиотропной терапии инфекции. Исключением был штамм 231 FraTox* (pFra*), заражение которым приводило к формированию такого же острого процесса, как и при инфицировании исходным штаммом 231.

Иммунизация мышей 2-ой генерацией вакцины чумной живой сухой (штамм EV линии НИИЭГ) в дозе 106 м.к. обеспечивала формирование у животных напряженного иммунитета к 21 дню при использовании для контрольного заражения типичных по антигенному составу штаммов чумного микроба 231 и 358. Значения ЛДя составляли Пх10 - 10 М.К. В том же опыте антигенизмененные штаммы оказались способными преодолевать иммунитет, что выражалось^в уменьшении значений ЛДзо на 2-3 порядка - ЛД5о=Пх10 -10 М.к. (ИП=ПХ10 -10 ). В меньшей степени такой способностью обладал штамм 231 Fra' (С) - JI/kifTi* 10 м.к. (ИП=7,0* 10).

Таким образом, антигенизмененные штаммы возбудителя чумы, в отличие от типичных, при сохранении у них высокой степени вирулентности способны преодолевать напряженный противочумный иммунитет у белых мышей.

Изучение чувствительности чумного микроба к разным группам антибактериальных препаратов показало, что значения МПК тетрациклинов, левомицетина, беталактамов, рифампицина, аминогликозидов, хинолонов в соответствии с Критериями... (Statement 1996 CA-SFM) свидетельствуют о чувствительности in vitro как типичных, так и антигенизмененных штаммов возбудителя к антибиотикам.

Сравнительную оценку эффективности антибактериальных препаратов в опытах на белых мышах, зараженных типичными и антигенизмененными штаммами возбудителя чумы, проводили по значениям ЕД50 препаратов и их терапевтической активности в профилактике (через 5 ч после заражения, курс 5-7-10 суток) и лечении (через 24 ч после инфицирования, курс 7-10 суток).

Доксициклин (вибрамицин)-пролонгированный представитель группы тетрациклинов и в настоящее время остается наиболее широко используемым препаратом для профилактики заболевания. Именно вибрамицином была проведена широкомасштабная профилактика чумы в Индии в 1994 г. при выявлении случаев легочной формы инфекции (Butler Т., 1994).

Изучение эффективности доксициклина при экспериментальной чумной инфекции, вызванной штаммами возбудителя с Fra" фенотипом, выявило резкое снижение активности этого препарата даже при использовании максимальных доз и увеличении продолжительности применения до 10 дней. Значения ЕД50 доксицик-лина в этих группах животных оказались в 2 - 3 раза выше, чем в группе мышей, инфицированных При профилактическом применении доксициклина в

течение 10 суток число выживших животных не превышало 70%. При сокращении курса лечения (5-7 дней) и уменьшении терапевтических доз процент выживших животных снижался (20%-60%). При обработке выживших животных гидрокортизоном (5 мг/мышь) в группе белых мышей, инфицированных штаммом 231 Fra', отмечали гибель 20% животных с выделением высоковирулентных культур из всех органов и тканей.

Поэтапное вскрытие мышей, инфицированных штаммами чумного микроба

231 и 231 Fia* на фоне профилактического применения доксициклина (суточная доза 50,0 мг/кг, 7 дней), показало, что выделение культур от животных, зараженных полноценным в антигенном отношении штаммом возбудителя, завершалось к шестым суткам. У 100% животных, инфицированных Y.pestis 231 Fra", на девятые сутки выделяли культуру из места заражения, у 33% - из печени, селезенки и крови. Даже на 36 день после инфицирования у 33 % мышей бактериологически регистрировали наличие возбудителя чумы в месте заражения, что объясняет рецидив инфекции у животных, обработанных гидрокортизоном.

Таким образом, проведенная серия экспериментов свидетельствует о нецелесообразности использования доксициклина для экстренной профилактики и лечения чумы, вызванной Fra" формами возбудителя.

Аналогичные данные получены в экспериментах с использованием ампициллина. Значения ЕД50 препарата при инфекции, обусловленной типичными штаммами Y.pestis (231 и 358), оказались в 1,6 - 2,6 раза ниже, чем при заболевании, вызванном изогенными вариантами возбудителя с Fra', FraTox", FraToxTst* фенотипом. Профилактическое (5 суток) применение ампициллина обеспечивало 80%-ное выживание белых мышей, зараженных ~ 1000 ЛД50 Y.pestis 231 и 358, в то время как в группах животных, инфицированных антигенизмененными изогенными штаммами чумного микроба, число выждаших животных составляло 20-60% с сохранением у части мышей возбудителя в селезенке, печени, регионарных лимфатических узлах, месте инфицирования. Даже 7-дневное применение ампициллина в дозе 500,0 мг/кг обеспечило выживание лишь 40% животных, инфицированных Y.pestis 231 Fra* Введение выжившим животным гидрокортизона (5 мг/мышь) через 30 дней после заражения приводило к гибели 30% мышей с выделением из органов и тканей вирулентных (ЛДм^Ю м.к.) культур возбудителя, сохранивших Fra" фенотип.

Таким образом, применение ампициллина при чуме, вызванной антигенизме-ненными штаммами возбудителя, нецелесообразно ввиду снижения его эффективности и неспособности обеспечить эрадикацию инфекта из макроорганизма, что может привести к тяжелым осложнениям и рецидиву инфекции.

В отличие от полусинтетического пенициллина- ампициллина представитель III поколения цефалоспоринов - цефтриаксон оказался значительно эффективнее. При отмеченной тенденции к увеличению значений этот препарат при профилактическом применении (5 суток) обеспечивал 80-100%, а при лечении - 100% выживание животных независимо от фенотипа и генотипа инфицирующего штамма (табл.1). При этом нами была использована доза антибиотика в 10 раз меньшая в сравнении с эквивалентной среднесуточной человекодозой. У выживших животных не регистрировали патологоанатомических изменений в органах и тканях, не выделяли культур

Высокоэффективными являются представители группы аминогликозидов. Значения ЕД50 стрептомицина, гентамицина и амикацина не имели статистически значимых отличий независимо от заражающего штамма возбудителя. Эти препараты обеспечивали 80-100% эффективность в профилактике (5 суток) и лечении ( 7 суток) экспериментальных животных (табл.2). Однако при бактериологическом исследовании органов мышей, инфицированных антигенизмененными штаммами чумного микроба и выживших после лечения аминогликозидами, в единичных случаях регистрировали наличие мелких очагов некроза без выделения культур возбудителя, что требует увеличения продолжительности курса терапии.

Таблица 1

Эффективность профилактического и лечебного применения цефтриаксона при чумной инфекции белых мышей, вызванной типичными и экспериментальными антигенизмененными штаммами возбудителя 1000 ЛД50)

Штамм чумного микроба, фенотип Суточная доза препарата Выжившие животные, % ± 1»5 Контроль без лече-

профилактика лечение ния,

мг/мышь мг/кг 5 суток 7 суток СПЖ*

231 1,0 50,0 100 100 0 (3,4)

231 Рга' то же тоже 100 100 0 (4,5)

231 Рга(М) _ м _ _ <« _ 80±18 100 0(5,3)

231 Рга" (С) в и _ в « _ 100 100 0(6,1)

231 Рга" Тох" _ и _ _ и _ 100' 100 0(4,3)

231 РгаТох'РвГ _ _ _ «1 в 100 100 0(6,3)

358 исх ш и т _ и _ 100 100 0 (4,0)

358 Рга" _ и _ _ « _ 80±18 100 0(6,9)

358 Рга" Тох' в « _ 100 100 0(5,3)

358 РгаТох'РяГ • м - _ 4« _ 100 100» 0(5,8)

Примечание: * - СПЖ - средняя продолжительность жизни

При изучении рифампицина — представителя группы рифамицинов было установлено, что значение ЕД50 антибиотика при инфекции белых мышей, вызванной природным ¥т* штаммом У.реБЙБ К-16, оказалось в 2 раза выше, чем при экспериментальной чуме, обусловленной У.реБЙв 231. В суточной дозе, соответствующей максимальной человекодозе, рифампицин обеспечивал выживание 8095% животных, зараженных штаммами возбудителя с Fra" фенотипом (табл.3). Несмотря на бактерицидный характер действия антибиотика, у животных, инфицированных и выживших после проведенного курса рифампицином, обнаруживали некротические узелки в селезенке и печени без выделения культуры. Это наблюдение свидетельствует о необходимости увеличения продолжительности профилактического применения рифампицина до 7 дней в случае инфекции, вызванной антигенизмененным возбудителем.

Фторированные производные хинолонов в настоящее время включены в арсенал средств, рекомендованных для экстренной профилактики и лечения чумы (МУ 3.4.1030-01).

В рамках настоящего исследования детально изучена эффективность фторхино-лонов - ципрофлоксацина и офлоксацина, имеющих форму как для приема внутрь, так и для парентерального введения. Было установлено, что значения ЕД50 препаратов при инфекции, вызванной антигенизмененными вариантами возбудителя, оказались в среднем в 2-3 раза выше, чем при экспериментальной чуме белых мышей, вызванной типичными штаммами возбудителя. Профилактическое применение ципрофлоксацина и офлоксацина в дозах, равных 62,5-125,0 мг/кг и 50,0-100,0 мг/кг, соответственно, в течение 7 дней обеспечивало 100%-ную выживаемость белых мышей независимо от фенотипа заражающего штамма чумного микроба (табл.4). Вскрытие животных, прошедших полный курс лечения в среднетерапевтических дозах препаратов (ципрофлоксацин-62,5 мг/кг; офлоксацин-50,0 мг/кг), на 30 день после заражения показало, что у части белых мышей (5-10%), зараженных У. реЯ1$231 Рга И К-16 (Ига), встречались некротические

Таблица 2

Эффективность профилактического и лечебного применения стрептомицина, ами-кацииа и геитамицииа при чуме белых мышей, вызванной типичными и экспериментальными антигенизмененными штаммами возбудителя чумы(~ ЮООЛД50)

Штамм * чумного Суточная доза препарата Выжившие животные, %±1»5 Контроль без лечения, вы-

микроба, фенотип мг/ мышь мг/кг профилактика 5 суток лечение 7 суток жившие животные, СПЖ

Ст )ептомицин

231 исх 2,0 100,0 100 100 0 (3,5)

231 Рга' тоже то же 100 100 0(5,0)

231Рга"(М) _ и _ • 44«. 100 100 0(6,2)

231 Рга" (С) _ 44 _ т и ш 100 100 0(7,3)

231Рга"Тох _ 44 _ т 44 - 100 100 0(4,0)

231РгаТохРзГ в 44 в . 44 ш 100 100 0 (5,8)

358 исх в 44 _ т и т 100 100 0(4,0)

358 Рга" в « __ т и т 100 100 0(6,2)

358 Рга" Тох" _ 44 т . 44 • 100 100 0(6,5)

358 РгаТох'РвГ _ и в - 44 - 100 100 0(5,0)

Амикацин

231 исх 2,0 100,0 100 100 0(5,0)

231 Рга* то же то же 100 100 0(5,6)

231 Рга" (М) _ м _ •44 «. 100 100 0(5,6)

231 Рга'(С) ж и _ _ 44 _ 100 100 0(7,4)

231 Рга" Тох" _ м _ _ 4* _ 100 100 0(4,7)

231Рга"Тох" - 44 - • 44 . 100 100 0(5,8)

358 исх в и ш _ «4 ^ 100 100 0(4,2)

358 Рга" • 44 - в « _ 100 100 0(6,0)

358 Рга" Тох" в и в « 44 « 100 100 0(5,7)

358 РгаТох'РкГ в и в ш и т 100 100 0(5,3)

Гентамицин

231 исх 2,0 100,0 100 100 0(4,3)

231 Рга" тоже то же 100 100 0(6,2)

231 Рга" (М) _ и _ _ 44 _ 80±18 90±14 0(5,5)

231 Рга" (С) _ 44 в в 44 _ 80±18 100 0(7,2)

231 Рга" Тох" в и _ ^ 44 _ 80±18 85±16 0(4,5)

231Рга"Гох" РвГ . 44 • _ 44 _ 100 100 0(5,7)

358 исх в _ 44 _ 100 100 0(4,5)

358 Рга" „ 44 в _ 44 в 100 100 0(5,5)

358 Рга" Тох" т _ 44 ^ 100 90±14 0(7,9)

358 РгаТохРвГ т и ш _ _ 100 90±14 0(6,0)

Таблица 3

Профилактическая и лечебная эффективность рифампицина при экспериментальной чуме белых мышей, вызванной штаммами возбудителя 231,

231 Бга, К-16 (Бга)

Суточная доза препарата Кратность введения, сутки Штамм чумного микроба, фенотип

231 | 231 Fra' | К-16 (Fra )

мг/мышь мг/кг Выжившие животные из 20 взятых в опыт, %±1*

Профилактика

2,5 125,0 5 100 80±18 50±23

5,0 250,0 100 95±10 80±18

Лечение

2,5 125,0 7 100 100 80±18

5,0 250,0 100 100 95±10

Контроль без лечения 0(3,4) 0(5,6) 0(6,1)

Таблица 4

Профилактическая и лечебная эффективность хинолонов при экспериментальной чуме, вызванной изогенными 231,231 Fia* и природным бесфракционным К-16 (Fra") штаммами возбудителя (~ 1000 LD50)

Препарат Суточная доза препарата Курс, сутки Штамм чумного микроба

231 | 231 Fra | K-16(Fra")

мг/ мышь мг/кг Выжившие животные, % ± 195

Профилактика

Налидик-совая кислота 5,0 250,0 5 85±16 30±21 50±23

Ципроф-локсацин 1,25 62,5 5 100 50±23 60±23

7 100 100 100

2,5 125,0 5 100 70±18 80±18

7 100 100 100

Офлокса-цин 1,0 50,0 5 90±14 80±18 60±23

2,0 100,0 5 100 90±14 85±16

7 100 100 100

Лечение

Ципроф-локсацин 1,25 62,5 7 100 70±18 60±23

2,5 125,0 7 100 9<ЬЫ4 80±18

Офлокса-цин 1,25 62,5 7 100 85±16 80±18

2,5 125,0 7 100 100 100

изменения в печени, селезенке, регионарных лимфатических узлах. Обработка выживших животных в этих группах гидрокортизоном (5 мг/мышь) не приводила к гибели животных. Использование препаратов в дозах, приближающихся к эквивалентным максимальным суточным человекодозам (ципрофлоксацин -125,0 мг/кг; офлоксацин - 100,0 мг/кг) в течение 7 суток обеспечивало не только 100 % выживаемость животных (табл.4), но и отсутствие патологоанатоми-ческих изменений в органах и тканях белых мышей. Это свидетельствует о необходимости использования с целью профилактики ципрофлоксацина и офлок-сацина в максимально допустимых суточных дозах и сроком не менее 7 дней, что дополнительно было подтверждено в опытах изучения активности офлоксацина с использованием для инфицирования мышей 8 заражающих штаммов возбудителя чумы.

Возможность возникновения антибиотикоустойчивых форм возбудителя на фоне лечения является дополнительной характеристикой перспективности применения антибактериальных препаратов. На примере рифампицина и налидиксовой кислоты был изучен характер нарастания устойчивости к этим препаратам у исходных и антигенизмененных штаммов чумного микроба.

Мутации к рифампицинорезистентности (Rif) как у исходных штаммов чумного микроба 231 и 35 8^ так и у изогенных антигенизмененных вариантов происходили с частотой и сопровождались снижением вирулентности, однако отбор высоковирулентных Rif мутантов, вызывающих инфекционный процесс, не поддающийся терапии рифампицином, оказывался возможным (табл. 5). В связи с этим монотерапия рифампицином нецелесообразна, необходимо проведение комбинированной терапии, обеспечивающей не только синергидный эффект, но и препятствующей формированию резистентности к этому препарату, тем более, что есть сведения (Wong I.D. et al., 2000) об устойчивости к рифампи-цину 20 % штаммов чумного микроба из 92 изученных.

Устойчивость к налидиксовой кислоте (NaT) у исходных штаммов чумного микроба 231 и 358 возникала, как правило, с частотой n 10"9 и не влияла на экспрессию вирулентности. У антигенизмененных вариантов возбудителя Nal мутации могли не влиять на вирулентность, или приводили к ее снижению. Необходимо отметить, что Rif и Nalr мутанты антигенизмененного штамма 358 (от человеках лишенного плазмиды pFra (FraTox" фенотип), полностью сохраняли вирулентность.

Варианты чумного микроба, устойчивые к налидиксовой кислоте (МПК=800-1600 мг/л), имели перекрестную резистентность к фторхинолонам. Значения МПК составляли для ципрофлоксацина-0,4-3,2 мг/л, офлоксацина -1,63,2 мг/л, пефлоксацина - 2,5-10 мг/л, норфлоксацина - 3,2 мг/л, ломефлоксацина -1,6-3,2 мг/л. Уровень устойчивости (МПК=0,8-1,6 мг/л) оказался достаточным, чтобы возбудитель вызывал летальный инфекционный процесс у белых мышей на фоне лечения фторхинолонами (табл. 5). Мутанты (Rif, Nal1) антигенизмененных штаммов сохраняли фенотип и способность преодолевать противочумный иммунитет.

Способность антигенизмененных культур чумного микроба персистировать в макроорганизме после курса антимикробной терапии при возможности сохранения высокой степени вирулентности у мутантов, резистентных к рифампицину и хинолонам, делает весьма актуальным обоснование комбинированного использования этих препаратов с другими антибиотиками.

Комбинация ципрофлоксацина с доксициклином или ампициллином не обеспечивала синергидного характера взаимодействия. В связи с этим представляется нецелесообразной не только монотерапия доксициклином, ампициллином, но

Таблица 5

Экспрессия вирулентности для белых мышей у Rif" И Nal мутантов чумного микроба на фоне лечения рифампицином и хинолонами (дозы заражения 101102-103-104 м.к.)

Штамм чумного микроба, фенотип Антибактериальный препарат, доза, мг/кг/сут, курс 7 суток

без лечения налидиксовая кислота, 250,0 ципрофлоксацин, 50,0 офлоксацин, 75,0 рифампицин, 250,0

Значение LDS0, доверительный интервал, м.к.

231 6 (2-16) >104 >104 >104 >10"

231 Nal" 5 (1-19) 7 (3*9) 5 (1-19) 5 (1-19) >104

231 Fra" NalR 34 (15-100) 28 (8-89) 50 (10-100) 50 (10*100) >104

231 Fra" ToxNal* 15 (7-29) 8 (2-20) 68 (22-215) 68 (22-215) Н.Д.

231 Rif11 8 (2-20) н.д. >104 >104 34 (15*100)

231 Fra" Rif" 34 (15-100) Н.Д. >104 >104 68 (22*215)

231 Fra Tox" Rif* 8 (2-20) нл. >104 >104 46 (15*147)

231 Fra" Tox'Psf Rif* 147 (47—464) н.д. Н.Д. Н.Д. 46 (15*147)

Примечание: н.д. — нет данных;

МПК препаратов, мг/л:

для мутантов — налидиксовая кислота — 800;

- ципрофлоксацин - 0,8;

- офлоксацин - 1,6; рифампицин - 2,0-4,0;

для мутантов Rif* - рифампицин - 800, к хинолонам -чувствительны (0,01-0,16)

и их комбинированное использование с фторхинолонами. Сочетанное применение ципрофлоксацина с цефотаксимом (цефалоспорин III поколения) или амикацином не приводило к антагонистическому эффекту в терапии чумной инфекции, вызванной штаммом чумного микроба с Fra" фенотипом, а при определенном подбо-редоз этих препаратов получали суммарный или синергидный эффект. Комбинации ципрофлоксацина и рифампицина обеспечивали синергидный характер взаимодействия (табл.6), что выражалось в значениях показателя t=2,1-9,0.

Использование синергидных комбинаций препаратов представляется наиболее перспективным для профилактики и лечения чумной инфекции, вызванной антигенизмененными вариантами возбудителя. Для целей экстренной профилактики у контактных наиболее приемлемым является сочетание ципрофлоксацина (офлоксацина, пефлоксацина) с рифампицином в формах для применения внутрь.

Таблица 6

Результаты сочетанного использования ципрофлоксацина с рифампицином в лечении экспериментальной чумы белых мышей, вызванной У. ре$и&231 Рга"

Препараты, их сочетания Дозы Количество выживших животных, % Коэф-

мг/мышь мг/кг фициент!

Опыт Ципрофлоксацин + рифам-пицин 0,00125 + 0,05 0,00125 + 0,1 0,00125 + 0,2 0,0025 + 0,005 0,0025 + 0,1 0,0025 + 0,2 0,005+0,05 0,005+0,1 0,005+0,2 0,0625 + 2,5 0,0625 + 5,0 0,0625+10 0,125 + 2,5 0,125 + 5,0 0,125 +10 0,25+2,5 0,25+5,0 0,25+10 30 50 60 90 80 90 90 90 100 <2 2,1 <2 9,0 4.2 3.3 2,6 2,6 3,6

Кон- Ципрофлоксацин 0,00125 0,0025 0,005 0,0625 0,125 0Д5 10 0 40

троль Рифам-пицин 0,05 0,1 ОД 2,5 5 10 0 10 30

Контроль заражения - 0

Проблема поиска новых антибиотиков и их комбинаций для лечения чумы, обусловленной антигенизмененными штаммами У-реБ^Б, продолжает оставаться актуальной.

Результаты проведенных исследований позволили разработать ориентировочные схемы применения антибактериальных препаратов для экстренной профилактики и лечения чумы у людей, вызванной антигенизмененными штаммами возбудителя (табл.7, 8). Ориентировочные схемы разработаны нами с учетом сведений о применении антибактериальных препаратов, приведенных в «Практическом руководстве по антиинфекционной терапии» под редакцией Л.С. Страчунского с соавт. (2002), в справочных пособиях М.Д. Машковского (1998), Дж. Сэнфорда с соавт. (1996), С.В.Яковлева, В.ПЛковлева (1998; 2003), Е.А.Ушкаловой с соавт. (2002), Видаля (2003).

В отличие от «Методических указаний» (МУ 3.4 1030-01), утвержденных в 2001г., доксициклини ампициллин не включены в ориентировочные схемы в связи с их малой эффективностью даже при использовании максимальных суточных доз и максимальном курсе применения и неспособностью обеспечить эрадикацию инфекта из макроорганизма, что может привести к тяжелым осложнениям и рецидиву инфекции.

Фторхинолоны - ципрофлоксацин и офлоксацин предлагается использовать в максимальных дозах и курсах (экстренная профилактика - не менее 7 дней, лечение бубонной чумы - не менее 10 дней).

В случае комбинированного применения антибактериальных препаратов их необходимо использовать в меньших дозах, но максимальными курсами.

Таблица 7

Ориентировочные схемы применения антибактериальных препаратов в экстренной профилактике чумы, вызванной антигенизмененными штаммами

чумного микроба

Антибактери- Способ Разовая доза, г Кратность Средняя Средняя продолжитель-

альный препарат применения применения в суточная ность курса профилактики,

сутки доза, г сутки

Ципрофлоксацин Внутрь 0,5 2 1,0 >7

Офлоксацин Внутрь 0,4 2 0,8 >7

Ципрофлоксацин* + рифампицин Внутрь Внутрь 0,5 0,3 1 1 0,5 0,3 >7

Гентамицин или 0,16 0,16

нетилмицин, В/м или 1 или >7

тобрамицин 0,2 ОД

Амикацин или

стрептомицин, В/м 1,0 1 1,0 >7

канамицин

Цефтриаксон В/м 1,0 1 1,0 >7

Цефотаксим В/м 1,0 2 2,0 >7

Примечание: * - в комбинации ципрофлоксацин можно заменить на офлокса-цин (разовая доза - 0,4 г) В/м - внутримышечное введение препарата

Аминогликозиды и цефалоспорины III поколения также целесообразно применять максимальными курсами терапии (профилактика -7 суток; лечение - 10-14 суток). Их использование для целей экстренной профилактики возможно с использованием безыгольных иньекторов - одним из массовых способов применения

Рифампицин обеспечивает высокий профилактический и лечебный эффект, но в связи с высокой частотой возникновения рифампицинорезистентных мутантов, монотерапия рифампицином нецелесообразна. Перспективно использование рифампицина в комбинациях с фторхинолонами, цефалоспоринами Ш поколения или аминогликозидами.

В ориентировочные схемы включена также схема «ступенчатой» терапии антибактериальными препаратами легочной и септической форм чумы, которая предусматривает внутривенное введение препаратов в первые дни заболевания с последующим переходом на прием внутрь или внутримышечное использование по мере улучшения состояния больного (табл. 8).

Предлагаемые схемы применения антибактериальных препаратов, приведенные в «Методических рекомендациях по использованию антибактериальных препаратов в профилактике и лечении чумы, обусловленной антигенизменен-ными формами возбудителя», могут быть полезны для инфекционистов при появлении случаев чумы, вызванной как типичными, так и антигенизмененными формами возбудителя.

Таблица 8

Ориентировочные схемы «ступенчатой терапии» антибактериальными препаратами легочной и септической форм чумы, вызванной _антигенизмененными штаммами чумного микроба_

Антибактериальный препарат Способ применения Разовая доза, г Кратность применения в сутки Средняя суточная доза, г Средняя продолжительность курса профилактики, сутки'

Ципрофлокса-цин В/в Внутрь 0,4 0,75 2 0,8 14

Офлоксацин В/в Внутрь 0,4 2 0,8 14

Гентамицин или нетилмицин, тобрамицин В/в В/м 0,16 или ОД 2-3 0,32-0,48 или 0,4-0,6 10-14

Амикацин или стрептомицин, канамицин В/в В/м 0,75 2 10-14

Цефтриаксон В/в В/м 2,0 2 4,0 10-14

Ципрофлокса- цин + рифампицин В/в Внутрь В/в Внутрь 0,2 0,5 0,6 0,3 2 2 1 2 0,4 1,0 0,6 0,6 10-14

Ципрофлокса- цин + гентамицин В/в Внутрь В/в В/м 0,2 0,5 0,16 016 2 2 1 1 0,4 1,0 0,16 0,16 10-14

Ципрофлокса- цин + цефтриаксон В/в Внутрь В/в В/м 0,2 0,5 1,0 1,0 2 2 2 2 0,4 1,0 2,0 2,0 10-14

Рифампицин + гентамицин В/в Внутрь В/в В/м 0,6 0,3 0,16 016 1 2 1 1 0,6 0,6 0,16 0,16 10-14

Рифампицин-+ цефтриаксон В/в Внутрь В/в В/м 0,6 0,3 1,0 1,0 1 2 2 2 0,6 0,6 2,0 2,0 10-14

Цефтриаксон + гентамицин В/в В/м В/в В/м 1,0 1,0 0,16 016 2 2 1 1 2,0 2,0 0,16 0,16 10-14

ВЫВОДЫ

1 .Антигенизмененные штаммы чумного микроба с Fra*, FraTox", FraTox'Psf фенотипом и ^разным генотипом сохраняют высокую степень вирулентности (ЛД50=3-18м.к.)и способны преодолевать противочумный иммунитет у мышей.

2. Штаммы чумного микроба, утратившие способность продуцировать антиген F I (независимо от механизмов утраты), "мышиный" токсин, а также лишенные плазмиды pPst, вызывают в экспериментах на мышах затяжной инфекционный процесс, при котором снижается эффективность большинства препаратов, рекомендованных для профилактики и лечения чумы.

3 Утрата способности продуцировать капсульный антиген фракцию I, «мышиный» токсин, пестицин не сопровождается изменением чувствительности in vitro штаммов чумного микроба к антибактериальным препаратам группы тетрацикли-нов, аминогликозидов, беталактамов, хинолонов, рифампицину, левомицетину.

4. Доксициклин и ампициллин нецелесообразно применять для экстренной профилактики и лечения чумы, вызванной антигенизмененными формами возбудителя, ввиду снижения их эффективности, неспособности обеспечивать очищение макроорганизма от инфекта и связанной с этим возможности развития рецидива заболевания, что доказано с помощью дополнительного контроля эффективности терапии введением выжившим животным гидрокортизона.

5. Рифампицин и фторхинолоны (ципрофлоксацин, офлоксацин) обеспечивают высокий профилактический и лечебный эффект только в максимальных терапевтических дозах и курсом не менее 7 суток.

6. Аминогликозиды (стрептомицин, амикацин, гентамицин) и цефалоспорин III поколения — цефтриаксон эффективны для целей профилактики и лечения чумы независимо от антигенной структуры возбудителя.

7. Рифампицинорезистентные и устойчивые к налидиксовой кислоте варианты исходных штаммов 231,358, атакже их изогенных антигенизмененных вариантов с Fra*, FraTox", FraTox'Pst" фенотипом возникают с частотой с доказанной возможностью сохранения высокой степени вирулентности. варианты имеют перекрестную резистентность к фторхинолонам. Устойчивые к рифампи-цину и хинолонам антигенизмененные вирулентные мутанты способны вызывать инфекцию, не поддающуюся терапии рифампицином и фторхинолонами, преодолевать противочумный иммунитет.

8 Для экстренной профилактики и лечения чумы, вызванной антигенизменен-ными формами возбудителя, наиболее перспективным является применение комбинаций антибактериальных препаратов с синергидным характером действия: фторхинолонов с рифампицином, цефалоспоринами III поколения или аминогли-козидами.

9 Разработаны ориентировочные схемы применения антибактериальных препаратов для экстренной профилактики и лечения чумы, вызванной антигенизме-ненными штаммами возбудителя.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рыжко И.В., Щербанюк А.И., Цураева Р.И., Скалыга Е.Ю Аминогликозиды и офлоксацин в профилактике экспериментальной чумы, вызванной природными и антигенизмененными (Fra*, FraTox*) штаммами возбудителя //Инфекционные болезни в практике терапевта: Матер, науч.-практ. конф. с международным участием. - Харьков. - 2001. - С. 225-226.

2. Рыжко И.В., Щербанюк А.И., Мишанькин Б.Н., Цураева Р.И., Скалыга Е.Ю., Дудина Н.А., Гаевская Н.Е. Современное состояние и перспективы совершенствования экстренной профилактики и этиотропной терапии чумы // Матер, межрегион, науч.-практ. конф. 16-17 октября 2001г., посвящ. 80-летию Омского НИИПИ "Актуальные аспекты природно-очаговых болезней".-Омск-2001.-С.172-174.

3. Рыжко И.В., Цураева Р.И., Скалыга Е.Ю., Гаевская Н.Е., Дудина НА Эффективность сочетанной специфической (EV Rif*) и экстренной профилактики рифампицином при экспериментальной чуме, вызванной Fгa и Fгa' вариантами возбудителя. // Матер, межрегион, науч.-практ. конф. 16-17 октября 2001г., посвящ. 80-летию Омского НИИПИ "Актуальные аспекты природно-очаговых болезней". - Омск.-2001.- С. 176-178.

4. Самоходкина ЭД, Щербанюк А.И., Рыжко И.В., Цураева Р.И., Скалыга Е.Ю. Эффективность офлоксацина при профилактике и лечении экспериментальной чумы, обусловленной природными и антигенизмененными штаммами возбудителя //Антибиотики и химиотерапия. - 2002. - Т.47, №3. - С.26-29.

5. Скалыга Е.Ю., Рыжко И.В., Щербанюк А.И., Цураева Р.И., Молдаван ИА. Отбор эффективных антибактериальных препаратов и их комбинаций при экспериментальной чуме, вызванной антигенизмененными штаммами чумного микроба //Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Матер, третьей международной конф., посвящ. 80-летию института имени Пастера.-СПБ, 2003. - С.142.

6. Рыжко И.В., Щербанюк А.И., Скалыга Е.Ю., Цураева Р.И., Молдаван И.А. Изучение возможности возникновения вирулентных антигенизмененных ^га"; FгaTox") мутантов чумного микроба, устойчивых к рифампицину и хинолонам // Антибиотики и химиотерапия.-2003.-Т.48,№4.-С. 19-23.

Сдано в набор 20 февраля 2004 г. Подписано к печати 20 февраля 2004 г. Формат 84x108 1/16 Печать лазерная. Гарнитура Тайме. Объем 1,0 усл. п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в компьютерном центре Ростовского НИПЧИ.