Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активная и пассивная иммунотерапия и ее сочетанное применение с антибактериальными препаратами при экспериментальной чуме

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Активная и пассивная иммунотерапия и ее сочетанное применение с антибактериальными препаратами при экспериментальной чуме"

ЦЕЦХЛАДЗЕ Нино Сулеймановна

АКТИВНАЯ И ПАССИВНАЯ ИММУНОТЕРАПИЯ И ЕЁ СОЧЕТАННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ С АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЧУМЕ

03.00.07. - микробиология 14.00.36. - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону- 1998

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник И.В.Рыжко доктор биологических наук, старший научный сотрудник Л.П. Алексеева

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Л.В.Самойлова

Ведущая организация ■

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Г.М.Сергеева

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт.

Защита состоится " 1998 г. на заседании диссертационного

совета Д0743201 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410005, г.Саратов, Университетская ул., 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Автореферат разослан " 3 " 998г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

Г.А.Корнеев

Актуальность проблемы.

Заболеваемость чумой по данным ВОЗ (Wkly Epidemiol Ree. 1993, 1994, 1995, 1996) неуклонно растет, особую настороженность вызывают вспышки легочной чумы в Танзании и Китае в 1991 г. (Ткачев A.B., Мурначев Г.П., 1994; Lyamuya E.F.e.a., 1992), а также в Индии в 1994 г. (Butler D., 1994; Jayaraman K.S., 1994), которые не регистрировались уже несколько десятилетий. Только своевременное проведение противоэпидемических мероприятий способно локализовать очаг инфекции.

Экстренная и специфическая профилактика, высокоэффективная терапия инфекции являются важнейшими составляющими в системе противоэпидемических мероприятий и требуют постоянного совершенствования. Одним из направлений таких разработок может явиться оценка перспектив сочетанного применения средств этиотропной и иммунотерапии (активной и пассивной). Необходимость этих исследований обусловлена несколькими причинами. Прежде всего, схемы экстренной профилактики некоторыми препаратами (ампициллин, доксициклин, фторхинолоны и др.) рассчитаны на 7 дней при сроке изоляции 6 дней, и вакцинация предполагается через 2 дня после окончания превентивной терапии, что создает сложности организационного плана. Эффективность профилактического применения ряда химиопрепаратов оказывается сниженной, если инфекция вызвана возбудителем с Fra" фенотипом, что требует увеличения курса антибиотикотерапии (Самоходкина Э.Д., 1992, 1993; Рыжко И.В. и др., 1995).Такие штаммы выделяются от носителей во всех природных очагах чумы СНГ (Филиппов A.A. и др., 1992; Кокушкин A.M., 1995). Зарегистрированы случаи выделения Fra" культур и от умерших людей (Lawton W.D.e.a., I960; Winter С.С.е.а., 1960; Williams J.E.e.a., 1978; 1983; 1994). Может возникнуть необходимость вакцинации на фоне антибактериальной терапии инфекции другой этиологии. Лечение, начатое на фоне генерализации процесса, малоэффективно даже при условии интенсивной патогенетической терапии. И, наконец, нельзя исключить возможность включения в эпидпроцесс штаммов возбудителя чумы с множественной лекарственной устойчивостью,

что осложнит своевременный выбор эффективного средства этиотропной терапии.

Несмотря на то, что целесообразность сочетанной специфической и экстренной профилактики в эпидочаге не вызывает сомнений, возможность ее осуществления ограничивается антибиотикочувствительностью вакцины ЕУ. Однако к настоящему времени уже получена полиантибиотикорезистентная вакцина, не уступающая по имыуногенности эталонному штамму ЕУ, и химическая — на основе протективного антигена возбудителя чумы — фракции I (Дальвадянц С.М., 1990; Евстигнеев В.И. и др., 1991; Домарадский И.В. и др., 1993), за рубежом используется убитая вакцина Ь'БР. Внедрение в практику таких вакцин, на наш взгляд, должно сопровождаться совершенствованием схем сочетанной специфической и экстренной профилактики чумы с использованием новых высокоэффективных препаратов (в частности, фторхинолоноз).

В последние годы внимание исследователей направлено на использование пассивной иммунотерапии с целью повышения эффективности лечения различных инфекций. Преимущество введения в инфицированный макроорганизм антител заключается в немедленной их реализации после поступления в гемо- и лимфосистему, что не только обеспечивает их воздействие на иммунную систему, но делает возможным прямое действие на микроорганизм, его опсонизацию, фагоцитоз и элиминацию из макроорганизма. Развитие гибридомной технологии позволяет надеяться на получение и клиническое использование для иммунотерапии инфекционных заболеваний моноклональных антител (МКАт), полученных к антигенам вирулентности возбудителей. Экспериментальные аспекты профилактики и лечения чумы с помощью МКАт к антигенным детерминантам возбудителя могут явиться основой для поиска оптимального набора терапевтически эффективных моноклональных антител.

Цель работы.

Поиск новых подходов к разработке рациональных схем сочетанной специфической (активной, пассивной) профилактики и антибактериальной терапии на модели экспериментальной чумы белых мышей.

Задачи исследования:

1) дать сравнительную характеристику влияния хинолонов (налидиксовой кислоты, ципрофлоксацина, пефлоксацина, офлоксацина, норфлоксацина) на формирование поствакцинального и постинфекционного иммунитета при экспериментальной чуме;

2) оценить преимущество профилактического применения хинолонов на фоне иммунизации животных устойчивым к ним вариантом Y.pestis EV Nalr в сравнении с использованием только антибактериальных препаратов;

3)изучить профилактическое действие гамма-глобулина и иммуноглобулина G из лошадиной чумной агглютинирующей сыворотки и влияние иммунотерапии на эффективность позднего (через 48-72 ч после заражения) начала антибактериальной терапии;

4) провести отбор препаратов МКАт, узнающих различные эпитопы фракции I (Ф1), липополисахарида (ЛПС) и "мышиного" токсина (МТ), обладающих терапевтической активностью при экспериментальной чуме белых мышей;

5) оценить перспективность пассивной иммунотерапии с помощью МКАт и их комбинаций per se и в сочетании с использованием антибактериальных препаратов на поздних стадиях развития инфекции.

Научная новизна.

Установлено, что фторхинолоны (ципрофлоксацин, пефлоксацин, офлоксацин) в отличие от норфлоксацина и налидиксовой кислоты, подавляют формирование постинфекционного противочумного иммунитета при начале их применения на стадии регионарной инфекции. Сочетанная специфическая (иммуногенный вариант штамма Y.pestis EV Nalr ) и экстренная (хинолоны) профилактика не только повышает эффективность последних, но и обеспечивает формирование высокой степени защиты от повторного заражения -1000 ЛДя Y.pestis 231.

Профилактическое применение гамма-глобулина и

иммуноглобулина С позволяет значительно повысить эффективность позднего (через 48-72 ч после заражения) начала этиотропной терапии.

Показана возможность отбора терапевтически активных МКАт к Ф1, ЛПС, МТ и создания их комбинаций, по своей эффективности не уступающих антибактериальным препаратам широкого спектра действия.

Использование МКАт и их комбинаций повышает эффективность позднего применения антибактериальных препаратов (через 72 ч после заражения) при экспериментальной чуме, обусловленной не только типичным в антигенном отношении штаммом возбудителя, но и его вариантом, утратившим способность синтезировать капсульный антиген фракцию Ф1.

МКАт к эпитопам Ф1, ЛПС, МТ, обладающие протективными свойствами, могут быть использованы не только для создания препаратов, высокоэффективных в профилактике и лечении чумы, но и для целенаправленного поиска антигенных детерминант, полезных при конструировании новых вакцинных препаратов против этой инфекции.

Практическая значимость.

Доказана принципиальная возможность повышения эффективности хинолонов в сокращенные сроки (до 5 дней) и создания в период изоляции (6 дней) специфической защиты от чумы, что способствует обоснованию новых схем сочетанной специфической и экстренной профилактики чумы.

Из 15 препаратов МКАт (к Ф1, ЛПС, МТ) отобраны пять, обладающие терапевтической активностью в профилактике и лечении экспериментальной чумы белых мышей. Показана целесообразность их комплексного использования с антибактериальными препаратами. Разработаны и утверждены Ученым Советом РПЧИ "Методические рекомендации по использованию хинолонов нового поколения (ципрофлоксацина, пефлоксацина, офлоксацина) в профилактике и лечении чумы, обусловленной полноценными в антигенном отношении штаммами чумного микроба и вариантами, лишенными способности продуцировать фракцию I".

Положения, выносимые на защиту.

1) Сочетанная специфическая и экстренная профилактика чумы (фторхинолоны) позволяет повысить эффективность последней при сокращении срока до 5 дней и создать невосприимчивость к последующему заражению возбудителем чумы.

2) Профилактическое применение пассивной специфической иммунотерапии (гамма-глобулин, МКАт) повышает эффективность позднего применения антибактериальных препаратов в сроки, когда этиотропная терапия не обеспечивает выживания животных.

3) Набор протективных МКАт к Ф1, ЛПС, МТ позволяет создать комбинации, наделенные профилактическими и лечебными свойствами, не уступающими по эффективности антибактериальным препаратам широкого спектра действия при экспериментальной чуме белых мышей.

Апробация работы.

Основное содержание диссертации отражено в 7-ми опубликованных работах.

Материалы диссертации докладывались на конференциях молодых ученых РПЧИ (1994, 1995, 1996), утвержден и представлен в ГКСЭН заключительный отчет по теме: "Иммуноглобулины в терапии экспериментальной чумы", где автор является ответственным исполнителем.

Структура диссертации.

Монография изложена на 179 страницах, состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, содержит 34 таблицы. Библиография представлена 212 отечественными и 130 зарубежными источниками.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы.

В опытах использовали более 3000 беспородных белых мышей, массой 18-20 г.

Заражение животных производили подкожно вирулентным штаммом чумного микроба 231 (708), его изогенным вариантом 231 Fra", утратившим способность продуцировать серологически тестируемый капсульный антиген фракцию I, а также трансконьгогантом 231 R57 с плазмидной устойчивостью к гентамицину.

Для иммунизации животных использовали эталонный вакцинный штамм EV линии НИИЭГ (получен из института "Микроб") и высокоиммуногенный вариант EV Nalr — с хромосомной устойчивостью к налидиксовой кислоте, ципрофлоксацину, офлоксацину, пефлоксацину, норфлоксацину, полученный методом однократного воздействия на плотной питательной среде, содержащей 100 мкг/мл налидиксовой кислоты.

В работе использовали хинолон первого поколения — налидиксовую кислоту (невиграмон, фирма "Хиноин", Венгрия), фторхинолоны — ципрофлоксацин (квинтор, фирма "Bayer", Англия), пефлоксацин (Государственный научный центр, г.Москва), офлоксацин (таривид, фирма "Höchst", Германия), норфлоксацин (нолицин, фирма "KRKA", Словения), а также стрептомицин, гентамицин, доксициклин отечественного производства и амикацин (фирма "Bristol", Югославия), цефотаксим (клафоран, фирма "Roussel", Франция).

Для изучения профилактического и лечебного действия при чумной инфекции белых мышей были использованы препараты гамма-глобулина и иммуноглобулина G из чумной агглютинирующей лошадиной сыворотки (производство Иркутского НИПЧИ), а также препараты моноклональных антител (МКАт) к Ф I (9 препаратов к 5-ти эпитопам), МТ (4 препарата к 4-м эпитопам), ЛПС (2 препарата к 2-м эпитопам) чумного микроба. Гибридомы и препараты МКАт были получены и охарактеризованы сотрудниками РПЧИ Е.А. Щербаковой и O.K. Бичулъ.

Расчет суточной дозы антибактериальных препаратов, исходя из среднесуточной человекодозы, производили по формуле, предложенной Y.E. Paget & Y.M. Barnes (1964). Иммуноглобулины использовали в дозах 0,25-1,0 мг/сут/по белку.

Вирулентность культур чумного микроба оценивали при подкожном заражении белых мышей с использованием 4-6 инфицирующих доз и не менее 4-х животных на дозу. Расчет значений ЛД50 и доверительных интервалов производили по модифицированному методу Кербера (Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 1962).

Сравнительную оценку иммуногенности культур эталонного штамма EV и его Nalr мутанта (без лечения и на фоне лечения хинолонами) проводили с использованием 4-х доз (200-1000-5000-25000 м.кл.).3аражение мышей производили через 20 суток после иммунизации 200 ДСЬ вирулентного штамма 231, как это рекомендовано в ТУ 42-14 на вакцину живую чумную сухую

(1975) с последующим подсчетом значений ЕД50 (Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 1962).

Напряженность поствакцинального и постинфекшюнного (после этиотропной терапии) иммунитета изучали с использованием постоянной дозы антигена (10й м.кл.) штаммов EV и EV Nal'; 104 м.кл. штаммов 231, 231Fra~. Контрольное заражение животных (через 20 дней после иммунизации или заражения) осуществляли культурой штамма чумного микроба 231 в дозах 103-м.кл. и рассчитывали значение ЛД50. Параллельно определяли значение ЛД50 заражающего штамма для интактных животных. Производили подсчет индекса зашиты (ИЗ), как это рекомендовано Салтыковым P.A. с соавт.

(1976).

Изучение эффективности иммуноглобулинов и антибактериальных препаратов проводили при начале лечения через 5 ч (профилактика), сутки, двое, трое и пять суток (лечение) после заражения животных вирулентными штаммами чумного микроба (231, 231Fra—, 231 R57) в дозах 10'-102-103-104 м.кл. Производили расчет значений ЛД50 на фоне лечения одной дозой препарата и значений ЛД5о заражающего штамма для интактных животных. Индекс эффективности (ИЭ) определяли по отношению значений ЛД50 для леченых животных к значению ЛД50 заражающего штамма для интактных белых мышей.

Характеристику протективной активности препаратов давали также при использовании одной заражающей дозы возбудителя (-1000 ЛДзо) с

последующей статистической обработкой результатов с помощью таблиц А .Я. Боярского (1955) и B.C. Генеса (1964).

Сочетанное применение иммунных и антибактериальных препаратов предполагало следующее: вакцинация (106 м.кл., однократно) через 5 ч после заражения животных с одновременным началом этиотропной терапии (5 дней); введение иммуноглобулинов через 5 ч после заражения (3-5 дней) с последующим (через 2-3-5 дней после заражения) началом лечения антибактериальными препаратами (3-5-7 дней).

В процессе работы постоянно контролировали способность клеток чумного микроба продуцировать капсульный антиген фракцию I в трехкомпонентной серологической реакции нейтрализации антител (Леви М.И., Момот А.Г., 1961).

Оценивали также фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов белых мышей в отношении штаммов чумного микроба 231 и 231Fra" и влияние на нее МКАт к Ф1, МТ и ЛПС. Ишенеишюсть фагоцитоза оценивали количественно по проценту активных макрофагов в первый час наблюдения (% АФ), по фагоцитарному индексу в первый и шестой час наблюдения (ФИЬ ФИ,), а также по индексу завершенности фагоцитоза (ИЗФ).

Результаты исследования и их обсуждение.

К настоящему времени известно, что этиотропная терапия чумы у вакцинированных более эффективна, чем у лиц, не подвергавшихся иммунизации (Руководство по проф.чумы, 1972). В эксперименте также показано ,что на фоне иммунологической перестройки эффективность антибактериальной терапии повышается. При этом доказано , что после вакцинации резистентность макроорганизма к заражению чумой формируется уже к 5-м суткам (Самойлова Л.В., 1963).Нам предстояло доказать, что вакцинация после заражения в сочетании с экстренной профилактикой имеет серьезные преимущества перед раздельным их применением. Первым этапом наших исследований явилось изучение влияния вакцинации эталонным штаммом EV на течение и исход экспериментальной чумы у белых мышей. Для этого через 5 ч после заражения белых мышей культурами Y.pestis 231 и варианта 231Fra~ в дозе -1000 ЛД50 их иммунизировали подкожно культурой

и

штамма ЕУ (доза 10б м.кл., примерно соответствующая человекодозе в 300 млн м.кл.).

Установлено, что вне зависимости от фенотипа заражающего штамма иммунизация в ранние сроки после инфицирования приводила к выживанию 7-17% животных (при 100%-ной гибели контрольных мышей) и увеличивала среднюю продолжительность жизни на 1-2 суток. Полученные данные укладываются в описанный "феномен переживания" (Анисимова Т.И., Свинцова Е.М., 1976), который нами создается искусственно при введении в организм инфицированного вирулентным штаммом животного большой дозы иммуногенных клеток вакцинного штамма ЕУ. Значения ИЗ составляли 83-179. Вакцинация через 24 ч после заражения не способствовала выживанию животных, но и не оказывала отрицательного влияния на исход экспериментальной чумы. Таким образом, благоприятное воздействие вакцинации на стадии регионарной инфекции на модели острого процесса у мышей свидетельствует о целесообразности ее проведения у изолированных, далее если предположить, что какая-то часть из них инфшцгрована и находится в инкубационном периоде заболевания.

В следующей серии экспериментов была проведена оценка преимуществ сочетанной специфической и экстренной профилактики с использованием высокоиммуногенного штамма ЕУ Ма1г с хромосомной устойчивостью к налидиксовой кислоте (НК) и перекрестной — к фторхинолонам: цштрофлоксацину (ЦФ), офлоксацину (ОФ), норфлоксацину (НФ), пефлоксацину (ПФ).

Сравнительные данные по влиянию хинолонов на поствакцинальный иммунитет свидетельствуют о том, что ципрофлоксацин, пефлоксацин, офлоксацин подавляли формирование иммунитета у мышей, иммунизированных культурой штамма ЕУ (ЕД50 > 25000 м.кл.), но не препятствовали иммунной перестройке макроорганизма при использовании в качестве вакцинирующего штамма ЕУ Ма!г, устойчивого к этой группе препаратов. Значение ЕДзо составляло 2 236 — 5 590 м.кл., что соответствует требованиям ТУ 42-14 на чумную вакцину (1975). Налидиксовая кислота и норфлоксацин не влияли на формирование защиты у животных вне

зависимости от иммунизирующего штамма, что свидетельствует о возможности их применения совместно с вакцинацией антибиотикочувствительным штаммом EV.

Далее мы оценили формирование постинфекционного иммунитета у мышей при начале профилактического лечения хинолонами через 5 ч после инфицирования (курс 5 дней), одновременно учитывая эффективность сочетанной (EV Nal") и экстренной (хинолоны) профилактики, а также формирование противочумного иммунитета.

Установлено, что при заражении белых мышей ~ 1000 ЛД50 штамма чумного микроба 231 профилактическое использование налидиксовой кислоты (5 мг/мышь/сут), офлоксацина (1,5 мг/мышь/сут), щшрофлоксацина (1 мг/мышь/сут), пефлоксацина (2 мг/мышь/сут), обеспечивало выживание 72100% животных. Профилактика норфлоксацином (2 мг/мышь/сут) и ципрофлоксацшюм в дозе 0,5 мг/мышь/сут была менее эффективна и способствовала выживанию только 50-62% животных.

Дозы хинолонов рассчитывали, исходя из среднесуточной человекодозы. Контрольное заражение излеченых животных проводили через 30 дней после первого инфицирования культурой штамма чумного микроба 231 в дозах 103-104-10s-106 м.кл., что составляло 100-100 ООО ЛД50. Оказалось, что ципрофлоксацин даже в неэффективной дозе (0,5мг/мышь/сут), офлоксацин, пефлоксацин, подавляли формирование постинфекционного иммунитета (ИЗ = п 102-103), в то время как профилактическое применение налидиксовой кислоты^ норфлоксацина, не препятствовало развитию иммунологической перестройки макроорганизма: ИЗ составлял п-104-105. Это свидетельствует о бактериостатическом действии этих препаратов in vivo. Однако надо отметить, что налидиксовая кислота и норфлоксацин при 5-ти дневном курсе терапии были менее эффективны, чем ципрофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин. Лечение хинолонами, начатое через 5 ч после заражения мышей одновременно с вакцинацией культурой штамма чумного микроба EV Nalr (106), во всех группах было высокоэффективно при сроке терапии 5 дней (80-100% выживших).

Аналогичные наблюдения были получены и при инфицировании белых мышей У.резйБ 231 Ига", что особенно ценно в связи с более низкой эффективностью хиполонов при такого рода инфеющи.

Важным представляется тот факт, что после сочетанной специфической и экстренной профилактики формируется полноценный противочумный иммунитет (ИЗ=п-104-105) вне зависимости от примененного для превентивного лечения представителя хинолонов.

Экстраполяция полученных данных на людей позволяет заключить, что для лиц, находящихся в изоляции, наиболее целесообразным не только с точки зрения эффективности, но и в организационном и экономическом плане, является проведение курса экстренной профилактики на фоне вакцинации, которое в 5-ти дневный срок предотвращает развитие инфекции у зараженных и обеспечивает у всех прошедших изоляцию формирование специфического 1гмму]пгтета.

Подводя итоги настоящему разделу работы, следует подчеркнуть настоятельную необходимость внедрения в практику противочумной службы страны уже разработанных полиантибиотикорезистентных (Дальвадьянц С.М., 1990; Евстигнеев В.И. и др., 1991; Домарадский И.В., 1993) и (или) химических вакцин.

В последние годы особое внимание исследователей направлено на использование пассивной иммунотерапии в качестве средства воздействия на систему иммунитета с целью повышения эффективности лечения различных инфекций. Иммунотерапия позволяет снизить интоксикацию и избежать тяжелых последствий антибактериальной терапии на фоне уже развившегося инфекционного процесса.

Наши исследования на модели экспериментальной чумы белых мышей, вызванной штаммом чумного микроба с плазмидной устойчивостью к гентамицину, показали, что профилактическое использование иммунных препаратов, будь то гамма-глобулин или однократная вакцинация культурой штамма ЕУ, приводили к выживанию части животных и увеличению продолжительности жизни павших белых мышей (ИЭ=16-150). Сочетанное введение иммуноглобулина даже с неэффективным антибиотиком оказывалось

еше более перспективным (ИЭ= и • 103), т.к. приводило к большему числу выживших животных (до 90%) в некоторых опытах при заражающей дозе 10"1 м.кл. Хороший эффект обеспечивало сочетанное применение через 5 ч после заражения животных гамма-глобулина (0,5 мг/мышь/сут по белку, 5 дней) и подкожной вакцинации штаммом ЕУ в дозе 106 м.кл. (в разные лапки)(ИЭ= п • Ю3), что свидетельствует о перспективности иммунотерапии инфекции, особенно в случае возбудителя, устойчивого к антибактериальным препаратам, когда необходим резерв времени для подбора антибиотика, к которому чувствителен инфицирующий штамм возбудителя.

Возможности иммунотерапии экспериментальной чумы белых мышей оценивали также при использовании иммуноглобулина й. Было показано, что 2 серии препарата обладали различной протектишюй активностью, что свидетельствует о необходимости тщательного подбора метода очистки ^О, предполагающего максимальное сохранение его биологических свойств с минимальными анафилактическими реакциями. Установлено, что профилактическое использование ^О обеспечивало выживание части животных и увеличение продолжительности жизни павших белых мышей.

Интересными, на наш взгляд, являются результаты последовательного профилактического применения гамма-глобулина, иммуноглобулина О и лечения антибактериальными препаратами на поздних стадиях развития инфекции. Обеспечение положительного результата антибиотикотерагши на фоне генерализации процесса остается проблемой нерешенной, и все мероприятия, направленные на изменение сроков диссеминации возбудителя, представляются важными.

Установлено, что применение гамма-глобулина через 5 ч после заражения (1 мг/мышь/сут по белку, 5 дней) с последующим (через 72 ч после заражения) подключением этиотропной терапии стрептомицином или доксициклином обеспечивало высокий терапевтический эффект при использовании для заражения возрастающих доз возбудителя чумы (101-10г-103-104 м.кл.) (ИЭ= п-103) . Раздельная терапия была достоверно менее эффективна. При иммунотерапии в течение 5 дней с последующим лечением амикацином в дозе 2,0 мг/мышь/сут (3 дам) выживало 70-80% белых мышей,

инфицированных ~ 1000 ЛД«о У.реБЦз 231, в то время как использование только амикацина (на б, 7, 8 сутки после заражения) приводило к выживанию лишь 20% животных. Применение 3-х дневной профилактики пшма-глобулином и 1цО способствовало выживанию части животных, однако начатое через 72 ч после заражения и иммунотерапии лечение ципрофлоксацином или цефотаксимом приводило к выживанию 70-95% и 90-100% животных, соответственно. Если животных лечили только антибактериальными препаратами в те же сроки, то выживало 25-30% белых мышей. Достоверность отличий в эффекпгености терапии составляла 95,0-99,9%.

Испытание профилактической активности 9 препаратов МКАт к 5-ти эпитопам капсулыюго антигена фракции I показало, что их эффективность может быть различна даже в случае, если они узнают один и тот же эпитоп. Эксперименты на модели чумы у белых мышей позволили определить два наиболее эффективных препарата МКАт-Ф1, продуцируемых гибридомами Впр2 и Е^ В.1, причем только при заражении тигагпгым п аптнгешюм отношении штаммом У. реБйя 231 (ИЭ=1,8 • 103 — 6,0 • ]03), но не вариантом, утратившим способность продуцировать калсульный антиген фракцию I.

Изучение профилактического действия МКАт к 4-м эпитопам МТ на животных, зараженных У.ревПз 231 и 231 Ига", показало, что два препарата МКАт-МТ обладали высокой эффективностью, обеспечивая результат, аналогичный результатам применения антибактериальных препаратов широкого спектра действия(ИЭ=2- 103). Однако, как и в случае применения МКАт-Ф1, излечивалась только инфекция, вызванная типичным по антигенному составу штаммом возбудителя чумы.

В нашем распоряжении было 2 препарата МКАт к ЛПС чумного микроба. Один из них оказался полностью неэффективным, применение другого обеспечивало выживание части животных, зараженных У.резЙБ 231 (ИЭ=1,4 - 10"), но не штаммом чумного микроба 231 Рга".

Отсутствие терапевтической активности МКАт к МТ и ЛПС в отношении инфекции, вызванной антигенизмененным штаммом возбудителя, наряду с ранее зарегистрированным снижением эффективности ряда

антибактериальных препаратов при такого рода инфекции, требует особого внимания при разработке схем профилактики и лечения этой формы чумы.

Дальнейшие эксперименты были направлены на оценку перспектив использования смесей МКАт к различным антигенам чумного микроба для получения не только профилактического, но и лечебного эффекта на модели экспериментальной чумы белых мышей.

Опыты по изучению профилактического и лечебного действия препаратов МКАт-Ф1 (Вн Рг) и МКАт-ЛПС (1Хге) и в составе смесей показали, что как профилактическая, так и лечебная эффективность смесей была выше (80-100%), чем каждого из препаратов в отдельности. Если учесть, что всего было поставлено 6 опытов, достоверность различий по непараметрическому критерию знаков составляла 97,5%. В аналогичных экспериментах на мышах, инфицированных У.реБйБ 231 Бта", эффекта получено не было.

Сравнительное изучение профилактического и лечебного действия МКАт-МТ (МП-8) показало, что профилактика обеспечивала выживание 83100% (ИЭ=2-103) животных, что соответствует эффективности антибактериальных препаратов. Лечебное действие оказалось менее выраженным, несмотря даже на трехкратное увеличение дозы иммуноглобулина: ИЭ составлял только 93. Применение МКАт-ЛПС (Ь04) было полностью неэффективным, однако совместное введение МКАт-МТ и МКАт-ЛПС, начатое через 24 ч после заражения, по числу выживших животных (90-100%), значениям ЛД50 и индексу эффективности (ИЭ= 2

• 103) было высокоэффективным, что свидетельствует о необходимости включения в предполагаемую композицию терапевтически активных МКАт к ЛПС чумного микроба, даже если они сами по себе эффективностью не обладают.

В трех независимых экспериментах по изучению активности смесей МКАт к Ф1, МТ и ЛПС чумного микроба было также показано преимущество смесей перед эффективностью каждого компонента в отдельности.

Заключительным этапом исследования явилась оценка последовательного профилактического (5 дней) применения МКАт и

последующего лечения докснщпошном или стрептомицином (6, 7, 8, 9, 10 день после заражения).

В опытах на животных, зараженных возрастающими дозами У.резЬБ 231, применение МКАт к Ф1 чумного микроба способствовало вьмсиванию 83-100% животных только в том случае, если на 6 день после инфицирования подключали этиотропную терапию антибиотиками. Доксициклин и стрептомицин, примененные в те же сроки, были неэффективны. Применение одних МКАт в 2-3 раза было менее эффективным.

На модели инфекции, обусловленной У.реБйз 231 Рга", профилактическое применение смеси МКАт-Ф1, МТ, ЛПС не давало результатов, отличных от данных на нелеченых животных; неэффективно было применение стрептомицина и доксициклина на 6, 7, 8, 9, 10 день после заражения. Последовательное применение смеси МКАт и доксициклина также оказалось неэффективным. В то же время профилактическое применение смеси МКАт позволило получить высокий терапевтический эффект от позднего применения стрептомицина (83-100% выживших животных) при полной неэффективности раздельной иммуно-и антибиотикотерапии. Полученные наблюдения подтверждают высокую терапевтическую активность аминогликозидов при инфекции белых мышей, вызванной штаммами возбудителя, утратившими способность продуцировать капсульный антиген (Самоходкина Э.Д. и др., 1994). Кроме того, полученные данные доказывают перспективность профилактического использования иммуноглобулинов для обеспечения эффекта позднего применения аминогликозидов вне зависимости от фенотипа заражающего штамма.

Таким образом, именно смесь МКАт к Ф1, МТ, ЛПС может явиться основой для дальнейшего изучения качественного и количественного состава композиций МКАт с наибольшим терапевтическим действием при экспериментальной чуме не только в случае раннего начала лечения, но и на стадии генерализации инфекции.

Результаты проведенной работы свидетельствуют о необходимости дальнейших разработок и внедрения в практику профилактических и лечебных мероприятий по предупреждению возникновения и ликвидации очага чумы

активной (вакцинация) и пассивной иммунотерапии (специфические иммуноглобулины, моноклональные антитела) и её сочетания с высокоэффективными антибактериальными препаратами. ВЫВОДЫ

1. Иммунизация белых мышей на стадии регионарной чумной инфекции способствует выживанию части животных и увеличению средней продолжительности жизни павших, зараженных 100-1000 ЛДзо штаммов чумного микроба как с Fra+, так и с Fra" фенотипом.

2. Высокоэффективные хшюпоны нового поколения — ципрофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин подавляют формирование поствакцинального (эталонный штамм EV) и постинфекционного иммунитета в отличие от менее активных — налидиксовой кислоты (хинолон первого поколения) и норфлоксацина. Устойчивый к хинолонам иммуногенньш вариант EV Nalr обеспечивает формирование полноценного иммунитета на фоне применения всех взятых для исследования представителей хинолонов.

3. Сочетанная специфическая (EV Nal1) и экстренная профилактика (ципрофлоксацином, офлоксацином, пефлоксацином, норфлоксацином, налидиксовой кислотой) характеризуется высокой эффективностью (курс - 5 дней) и обеспечивает формирование противочумного иммунитета к повторному заражению возбудителем чумы.

4. Гамма-глобулин и иммуноглобулин G из чумной агглютинирующей сыворотки, примененные для целей профилактики, способствуют выживанию части животных и увеличению продолжительности жизни павших белых мышей, инфицированных Y.pestis 231 и его вариантом с плазмидной устойчивостью к гентамицину.

5. Использование в профилактических целях гамма-глобулина и иммуноглобулина G (3-5 дней) позволяет достичь высокого терапевтического эффекта от лечения доксициклином, стрептомицином, ципрофлоксацином, цефотаксимом, начатого в поздние сроки после инфицирования животных (через 72 ч после заражения), когда применение только антибактериальных препаратов достоверно менее эффективно.

6. Изучение профилактической активности 15-ти препаратов моноклональных антител к фракции 1, "мышиному" токсину и липополисахариду чумного микроба при чумной инфекции белых мышей, вызванной типичным в антигенном отношении штаммом чумного микроба, позволило произвести отбор терапевтически эффективных МКАт: двух препаратов МКАт-Ф1, двух — МКАт-МТ, одного — МКАт-ЛПС. Не обнаружено МКАт, обладающих протективной активностью при инфекции, обусловленной возбудителем с Рга" фенотипом.

7. Смеси моноклональных антител ( МКАг-Ф1 - МКАт-ЛПС; МКАт-МТ +МКАт-ЛПС; МКАт-Ф 1 + МКАт-МТ + МКАт-ЛПС ) имеют более высокую терапевтическую активность, чем каждый препарат в отдельности в профилактике и лечении экспериментальной чумы.

8. Профилактическое применение смеси МКАт с последующим (на 6, 7, 8, 9, 10 сутки) использованием для лечения доксициклина или стрептомицина обеспечивает высокий терапевтический эффект (83-100% выживших животных) при инфицировании белых мышей У.реБПБ 231; у животных, зараженных изогенным вариантом У.резйэ 231 Рга , аналогичный результат получен только при использовании стрептомицина; применение одних антибиотикоов в эти сроки неэффективно.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Цецхладзе Н.С., Цураева Р.И., Рыжко И.В. Эффективность сочетанной специфической (антиген фракции I) и экстренной (ампициллин, доксициклин) профилактики при экспериментальной чуме белых мышей // Актуальные вопросы профилактики чумы и др. инфекц. заболеваний. Материалы межгосударственной научно-практ. конф., посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы. Ставрополь, 1994.-С. 104.

2. Рыжко И.В., Самоходкина Э.Д., Цураева Р.И., Пасюков В.В., Щербанюк А.И., Касаткина И.В., Цецхладзе Н.С. Представители различных групп Р-лактамов в терапии экпериментальной чумы // II Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". - Тезисы докладов. - М„ 1995,- С.256.

3. Цецхладзе Н.С., Рыжко И.В., Цураева Р.И., Самоходкина Э.Д. Профилактическая эффективность фторхинолонов на фоне иммунизации устойчивым к ним штаммом ЕУ КаГ при экспериментальной чуме белых мышей// Материалы Международной конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс". Тезисы докладов. - Саратов, 1996,- С.284.

4. Рыжко И.В., Щербанюк А.И., Касаткина И.В., Самоходкина Э.Д., Цураева Р.И., Цецхладзе Н.С., Пасюков В.В., Рощина Н.В. Сравнительное изучение фторхинолонов и цефалоспоринов Ш поколения в профилактике и лечении экспериментальной чумы, обусловленной типичными и серологически атипичными по штаммами чумного микроба // Антибиотики и химиотерапия,- М., 1997. - Т.42, N 1.-С.12-16.

5. Рыжко И.В., Самоходкина Э.Д., Цураева Р.И., Щербанюк А.И., Цецхладзе Н.С., Кузенкова Е.Б. Особенности этиотропной терапии чумной инфекции, вызванной атипичными штаммами возбудителя с Р1" фенотипом // Материалы VI! съезда Всероссийского общества эпидемиологов и паразитологов.- М.1997. Т.2.-С. 361-362.

6. Рыжко И.В., Алексеева Л.П., Цецхладзе Н.С., Цураева Р.И., Щербакова Е.В., Самоходкина Э.Д. Моноклональные антитела к антигенам чумного микроба (фракция I, "мышиный" токсин, липополисахарид) в профилактике и лечении экспериментальной чумы // Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов и паразитологов. - М.1997. Т.1.-С * 305-306.

7.Цураева Р.И., Рыжко И.В.,Самоходкина Э.Д.,Цецхладзе Н.С. Постинфекционный иммунитет у белых мышей , обусловленный слабовирулентным бесфракционным штаммом возбудителя чумы 231 Р1~ // Материалы научно-практ.конф., посвященной 100-летию образования противочумной службы России .- Саратов ,1997.Т.1.- С.255.

Отпечатано копировально-множительным центром, Б. Садовая, 79, Заказ 101, Тираж 100