Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспериментально-клиническое изучение споровых пробиотиков
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Экспериментально-клиническое изучение споровых пробиотиков"
На правах рукописи
ОСИПОВА Ирина Григорьевна
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СПОРОВЫХ ПРОБИОТИКОВ
03.00.07 - миф о биологи я
Автор еферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва 2006
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имЛ.А.Тарасевича Роспотребнадзора
Научный консультант:
доктор медицинских наук,
профессор Михайлова Наталия Александровна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
доктор медицинских наук доктор биологических наук
Орлова Валентина Сергеевна Горская Елена Михайловна Лахтин Владимир Михайлович
Ведущая организация:
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф. Гамалеи РАМН
Защита состоится « » (У Ь 2006 г в /Г часов на заседании диссертационного совета Д212.203.05 в Российском Университете Дружбы Народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке РУДН по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.
Л, бт
Автореферат разослан « сХо_2006 г
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент / ' О.Б.Гигани
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность. Проблема профилактики и коррекции дисбиозов приобретает в последнее время все большее значение для здравоохранения и требует постоянного расширения номенклатуры средств, восстанавливающих нормальную микрофлору организма человека. В клинической практике применяются биопрепара-ты-пробиотики, изготовленные на основе бактерий, представителей нормальной микрофлоры (Онищенко Г.Г. с соавт., 2002; Бондаренко В.М., Воробьев A.A., 2004; Шендеров Б.А., 2005). При разработке пробиотиков нового поколения в качестве перспективных рассматривают препараты на основе спорообразующих бактерий рода Bacillus, а также комплексные пробиотики, сочетающие бактерии разных родов, характеризующихся взаимодополняющим спектром биологических свойств (Смирнов В.В. с соавт., 1994; Сорокулова И.Б., 1998; Hong H.A. et al., 2005).
Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus широко распространены в окружающей среде, являясь одним из основных компонентов микрофлоры почв, воды, воздуха. Человек в процессе жизнедеятельности, постоянно контактирует с ними (Andersson A.M. et ai, 1999; Garbeva P. et ai, 2003). Бациллы характеризуются рядом свойств, обусловливающих их определенное преимущество перед другими микроорганизмами, используемыми в качестве основы пробиотиков (Cartman S. T. et al, 2004; Cutting S.M., 2004; Senesi S., 2004). Апатогенные бациллы безвредны для макроорганизма при наличии выраженного антимикробного действия, антагонистический спектр которого у различных штаммов может значительно отличаться (Ноа N.T. et al., 2000; Sanders М.Е. et al., 2003; Duc L.H. et ai, 2004). Это позволяет создавать комплексные препараты с использованием культур, дополняющих друг друга по своим антимикробным свойствам.
В медицинской практике разных стран уже несколько десятилетий применяются биопрепараты на основе бактерий рода Bacillus. В странах Западной Европы широко распространен пробиотик бактисубтил (фирма "Marion Merrell»,1Франция) и его аналог флонивин БС (фирма "Galenika", Югославия). Их основу составляет штамм B.cereus IP 5832 из коллекции Института Пастера (Париж). Известен биопрепарат цереобиоген Ç'Xing Jian", Китай) на основе штамма B.cereus DM-423. Вьетнамский пробиотик биосубтил в качестве активного компо-
цента содержит штамм B.subtilis. Препарат энтерогермин (фирма "Sanofi Winthrop Италия) состоит из четырех штаммов B.clausii Т, N/K, О/С и SIN, устойчивых к различным антибиотикам. Несмотря на имеющийся опыт применения споровых пробиотиков в мировой практике здравоохранения (Франция, Югославия, Китай, Япония), в России долгое время велась дискуссия о безопасности таких препаратов и возможности их широкого применения.
В настоящее время вопрос безопасности пробиотиков созданных даже на основе представителей нормофлоры, стоит особенно остро. Описаны случаи единичных инфекционных осложнений, вызываемых у иммунокомпрометированных больных, культурами, которые имеют статус GRAS (generally recognized as safe) — лактобациллами (Saleman N. et al. , 2003) и бифидобактериями {Ha G. Y. et al., 1999), и единичные наблюдения о регистрации бактериемии у недоношенных новорожденных, вызванной бифидобактериями и лактобактериями (Бондаренко В.М., Петровская В.Г., 1997). В связи с этим вопросу комплексной оценки безопасности штаммов, предназначенных для бактериотерапии и коррекции дисбиозов, должно уделяться особое значение. Анализ материалов доклинических исследований биопрепаратов, давно используемых в практике здравоохранения, свидетельствует об отсутствии стандартных критериев оценки безопасности пробиотиков.
В нашей стране при отборе штаммов - кандидатов в пробиотики основное внимание уделяют спектру и выраженности их антагонистической активности, технологичности при производстве препаратов. Подобная характеристика является недостаточной, поскольку она не раскрывает механизма терапевтического эффекта пробиотика, его позитивного воздействия на макроорганизм и биосовместимости с другими видами бактерий нормальной микрофлоры (Алешкин В.А. с соавт., 2005; Бондаренко В.М., Грачева Н.М., 2005; Шендеров Б.А., 2005). Отсутствие достаточно полных данных о взаимоотношениях между пробиотическими и условно-патогенными бактериями приводит порой к неправильному выбору пробиотика для лечения и, как следствие этого, отсутствию положительного эффекта. Этому также способствуют отсутствие единых принципов отбора новых перспективных штаммов для изготовления пробиотиков и методов контроля биологических свойств производственных штаммов, обеспечивающих безопасность и лечебную эффективность. На сегодня установленным фактом считается, что биопрепараты
должны быть стандартными и стабильными, соответствовать требованиям нормативной документации в течение всего срока годности. Обеспечить высокое качество пробиотиков возможно при использовании эффективной стандартной промышленной технологии, отвечающей требованиям GMP, адекватных методов контроля качества, удобной лекарственной формы, надежной упаковки, регламентированных условий хранения. Вышеизложенное обусловливает актуальность проведения многосторонних исследований безопасности, изучение биологических свойств штаммов in vitro и in vi'vo, в частности, колонизационной активности (адгезии, антагонистической активности, чувствительности к антибиотикам и биологическим жидкостям, персистентности и.т.п.) при отборе культур - кандидатов для создания пробиотиков.
Цель настоящего исследования — разработка критериев безопасности споровых бактерий рода Bacillus в экспериментах in vitro и in vivo и обоснование принципов конструирования комплексных споровых пробиотиков и системы контроля их качества, обеспечивающих безопасность и клиническую эффективность бактерийных препаратов.
Основные задачи исследования
1. Разработать комплексные подходы оценки пробиотической активности штаммов бактерий рода Bacillus, включающие тесты in vitro и in vivo на экспериментальных моделях дисбактериоза кишечника и острого инфекционного процесса.
2. С учетом биологических особенностей пробиотической активности отобранных штаммов бацилл сконструировать новые комплексные споровые пробиотики.
3. Провести сравнительный анализ специфической активности споровых пробиотиков с коммерческими лакто- и бифидосодержащими биопрепаратами, а также оценить ее изменение под влиянием физических факторов, в частности низко-интенсивного лазерного излучения (НИЛИ).
4. На примере комплексного пробиотического препарата оценить терапевтическую и профилактическую эффективность различных лекарственных форм биоспорина на взрослых и детях при дисбиозах различной локализации.
Научная новизна. Впервые обоснована целесообразность комплексного изучения биологических свойств и антагонистической активности штаммов бактерий рода Bacillus на моделях in vitro и in vivo при разработке препаратов на их основе.
Критериями отбора пробиотических штаммов бацилл являются: отсутствие гемолитической, лецитиназной, гиалуронидазной активностей; антибиотикоустойчивость хромосомной природы и отсутствие плазмид, несущих этот признак;
устойчивость к антибактериальному действию желудочного сока и желчи; антагонистическая активность по отношению к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов, выделенных от больных с дисбиозами различной локализации;
отсутствие или низкий уровень адгезии и способности к персистентности; безопасность (включающая изучение общей, «острой» и «хронической» токсичности, токсигенности, вирулентности, угнетение антитоксической функции печени, отсутствие дермонекротического эффекта);
биологическая совместимость штаммов при разработке комплексных препаратов;
оценка корригирующих и протективных пробиотических свойств на экспериментальных моделях дисбактериоза, индуцированного введением антибиотиков, и острой инфекции, вызванной E.coli OJ57.H7. Впервые с использованием разработанных критериев отбора производственных штаммов бактерий р.Bacillus сконструированы новые споровые пробиотики -биоспорин СB.subtilis 3 и B.licheniformis 31), витаспорин (B.subtilis 11В), ирилис (B.subtilis 07 и B.licheniformis 09) и субтикол (B.subtilis 3, B.licheniformis 31 vi E.coli M-17). По признаку антибиотикоустойчивости проведена селекция штаммов {B.subtilis 3 и B.licheniformis 31) и создан комплексный препарат — биспорин (B.subtilis 3/Re и B.licheniformis 31/Re). Новые комплексные препараты обладали более широким спектром антагонистической активности по сравнению с коммерческими препаратами: бактисубгилом, энтерогермином, ацилактом, лактобактери-ном, бифидумбактерином, энтеролом.
Продемонстрировано преимущество комплексных препаратов (биоспорин, биспорин, ирилис, субтикол) перед монопрепаратами за счет проявления синерги-ческой антагонистической антимикробной активности.
Впервые установлено, что антагонистическая активность споровых комплексных пробиотиков превосходит таковую коммерческих препаратов из нор-мофлоры. Установлено отсутствие влияния низко-интенсивного лазерного излучения (НИЛИ) на антагонистическую активность споровых бактерий и его воздействие на уровень адгезии. Показано, что НИЛИ статистически значимо снижало уровень адгезивной активности бифидумбактерина и лактобактерина.
Сравнительное изучение специфической активности споровых пробиотиков и пробиотиков нормофлоры показало, что различные формы одного и того же пробиотика не отличаются по антагонистическим свойствам, тогда как уровень адгезивной активности препаратов в свечевых формах снижался вследствие экранирования рецепторов макроорганизма и адгезинов микробных клеток жировыми основами.
Установлено, что разработанный пробиотик биоспорин в разных лекарственных формах обладает высокой терапевтической и профилактической эффективностью при дисбиозах различной локализации.
Научная новизна работы подтверждена 11 патентами.
Теоретическое и практическое значение работы. В практику здравоохранения России и Украины внедрен споровый пробиотик биоспорин (приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации N353 от 29.12.92 г. и Украины N219 от 22.10.93 г.), он внесен в Государственный реестр лекарственных средств под № 92/353/16 (патенты РФ № 1722502 и Украины № 689), зарегистрирован в Российской Федерации (регистрационное удостоверение № 010094) и на Украине (№ 12.22.10.93). Расширена сфера применения биоспорина в гинекологии (патент РФ №2131258 и инструкция по применению).
Результаты научной работы нашли свое отражение в комплекте нормативной и научной документации: на биоспорин утверждены Фармакопейные статьи в Российской Федерации (ФС 42-3476-98 и ФСП 42-03703278-02) и на Украине (ФС
42У- 200/8-142-97), инструкции по применению и регламент производства (ЭРП №580-96).
В настоящее время промышленное производство биоспорина осуществляется в России Центром военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ (ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ, г.Екатеринбург), а на Украине -ОАО "Днепрофарм". За время выпуска препарата рекламаций на его качество и сведений о побочном действии, связанных с его приемом, не поступало.
Для производства споровых пробиотиков медицинского назначения селекционированы штаммы В. subtil is 3, 3/Re (ГКПМ №263), IIB (ВКМВ-2218Д). 07 (ВКПМ В-8611) и B.licheniformis 31, 31/Re (ГКПМ№263), 09 (ВКПМ В-8610), депонированные во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К.Скрябина и в коллекции микроорганизмов ГИСК им.Л.А.Тарасевича.
Положения, выносимые на защиту
> Использование комплексной оценки пробиотических свойств штаммов in vitro и in vivo позволяет обеспечить требования безопасности, предъявляемые к препаратам на основе бактерий рода Bacillus.
> Антагонистическую активность штаммов бацилл и пробиотических препаратов необходимо изучать как in vitro, так и in vivo на моделях экспериментального дисбактериоза и острой инфекции.
> Разработанные комплексные пробиотики превосходят препараты нормофло-ры по антагонистической активности. На них не оказывает отрицательного влияния низко-интенсивное лазерное излучение (НИЛИ).
> Разработанный пробиотик биоспорин, в различных лекарственных формах, обладает высокой терапевтической и профилактической эффективностью при ОКИ и дисбиозах различной локализации у детей и взрослых.
Личный вклад соискателя. Автору принадлежат: разработка концепции и направления исследований, непосредственное осуществление экспериментальных исследований, анализ и теоретическое обобщение полученных данных, формулирование выводов. В работе использованы материалы, полученные в основном лич-
но автором, а также в соавторстве с сотрудниками следующих организаций: Институтом микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного HAH Украины, ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН, РУДН, РМАПДО, ММА им. Сеченова.
В выполнении отдельных этапов работы принимали участие следующие научные сотрудники: д.б.н. Сорокулова И.Б., д.м.н., профессор Саркисов С.Э., к.м.н. Григорьева Л.В., к.м.н. Терешкина Н.В., к.м.н. Созаева Л.Г., н.с. Евлашкина В.Ф., к.м.н. Васильева Е.А., к.м.н. Буданова Е.В., к.м.н. Несчисляев В.А., н.с. Лукьянова О.Ю» аспиранты Колганова Т.В., Тауфнк Джарадат, Чумаева Т.В. и Гайдеров A.A. Автор выражает глубокую благодарность руководителю лаборатории д.м.н. Чу-прининой Р.П. и всем сотрудникам лаборатории бактерийных вакцин и вивария ГИСК им.Л.А.Тарасевича за неоценимую помощь в выполнении данной работы. Всех соавторов настоящих исследований автор искренне благодарит. Особая благодарность д.м.н., проф. Бектимирову Т.А. и к.м.н. Озерецковскому H.A.
Апробация работы и публикации. Основные результаты проведенных исследований были доложены на научно-практической конференции «Перспективы использования эубиотика «Биоспорин» в практике здравоохранения и военно-медицинской службы» (Екатеринбург, 1997); 2-ой международной конференции, посвященной 100-летию Пермского НПО «Биомед» (Пермь, 1998); международном конгрессе «Аптека-2000» (Москва, 2000), VI Российско-итальянской научной конференции (Санкт-Петербург, 2000); научно-практических конференциях НПО «Биомедицинские технологии» (Москва, 2000; 2002; 2003); Международной научно-практической конференции памяти Г.И.Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002); Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», посвященной 105-летшо Пермского НПО «Биомед» (Пермь, 2003); Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, сим-биотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2004); Международной конференции «Пробиотики, новая эпоха» (Нью-Йорк, 2004); 4-ом Съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2004); III конгрессе педиатров- инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей. Инфекция и иммунитет» (Москва, 2004); V
съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2005); IV конгрессе детских инфекционистов России (Москва, 2005).
Диссертация апробирована и рекомендована к защите на заседании Ученого совета ФГУН ГИСК им.Л.А.Тарасевича и на заседании кафедры микробиологии медицинского факультета РУДН.
По теме диссертации опубликованы 51 печатная работа, из них 1 методические рекомендации, I монография, 19 статей в научных журналах, 19 тезисов в сборниках конференций, 11 патентов на изобретения.
Объем и структура работы. Диссертация построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 283 страницах текста компьютерной верстки и иллюстрирована 66 таблицами и 26 рисунками. Список литературы представлен 499 источниками (181 отечественных и 318 зарубежных).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Объектом исследования являлись:
> штаммы бактерий рода Bacillus (п~Ю);
> патогенные и условно-патогенные штаммы микроорганизмов (п=456), выделенные от больных с острыми кишечными инфекциями (ОКИ), различными дисбиозами кишечника и влагалища, а также полученные из музея культур ГИСК им.Л.А.Тарасевича.
В экспериментах использовали препараты:
> биоспорин сухой (лиофилизат) - коммерческие серии, изготовленные ЦВТП БЗ ШШМ МО РФ (г.Екатеринбург);
> биоспорин таблетки - экспериментально-производственные серии, изготовленные ЦВТП БЗ ШШМ МО РФ (г.Екатеринбург);
> биоспорин суппозитории - лабораторно-эксперименталыше серии;
> витаспорин сухой (лиофилизат) - лабораторно-экспериментальные серии, изготовленные филиалом ФГУ предприятия «НПО «Микроген» Мгшздравсоц-развития РФ «Иммунопрепарат» г.Уфа;
> биспорин жидкий, ирилис жидкий, субтикол - лабораторно-экспериментальные серии.
Препаратами сравнения были коммерческие серии пробиотиков (в различных лекарственных формах): бактисубтила, энтерогермина, колибактерина, бифи-кола, бактиспорина, энтерола, бифидумбактерина, бифидина, лактобактерина, аци-лакта.
Исследования осуществлены на лабораторных животных: мышах (обоего пола) линии "Ыаск" и F (CBAxBl), массой 10-16 г (п=1050); мышах беспородных (обоего пола), массой 14-16 г (п=1950); морских свинках (обоего пола) массой 300 г (п=50); беспородных крыс (обоего пола), массой 180-240 г (п=150), кроликах (обоего пола) массой 1250-1500 г (п=50). При выполнении экспериментов на животных руководствовались «Правилами гуманного обращения с лабораторными животными» (2003).
Использованы стандартные питательные среды, традиционно применяемые в микробиологических исследованиях.
Применены биологические жидкости: желчь медицинская консервированная (ООО «Самсон-мед», г.Санкт-Петербург) и сок желудочный натуральный «Эквин» («Иммунопрепарат», Уфа);
Для генерирования НИЛИ использовали прибор «Рикта» (частота 5-5000 /Гц) (Хейфец Ю.Б., 1999).
Изучение культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств:
- штаммов бактерий р.Bacillus проводили в соответствии с Методическими рекомендациями (Смирнов В.В. с соавт., 1983);
- патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) проводили общепринятыми методами (Биргер М.О., 1992; Bergey, 1986).
Определение чувствительности штаммов к антибиотикам изучали дискодиф-фузионным методом в соответствии с Методическими указаниями (Москва, 1983) с использованием стандартного набора антибиотиков (НИЦФ, г.Санкт-Петербург).
Для оценки устойчивости бактерий к действию биологических жидкостей ЖКТ штаммы инкубировали при 37 °С в течение двух часов с желудочным соком или желчью. В пробирку с 1 мл бактериальной взвеси добавляли 9 мл биологической жидкости с последующим определением количества жизнеспособных клеток методом серийных разведений с высевом на среду Гаузе №2. Адгезивные свойства бактерий изучали на:
• формалинизированых эритроцитах человека (Брилис В., 1984), степень адге-зивности считали нулевой при СПА от 0 до 0,99; низкой — от 1,00 до 1,99; средней — от 2,00 до 3,99 и высокой > 4,00;
• эпителиоцитах влагалища;
• эпителиальных клетках кишечника крыс и мышей (Горская Е.М.с соавт.,1989), уровень адгезии отдельных штаммов бактерий условно дифференцировали на четыре степени: неадгезивную (СПА = 0); слабоадгезивную (СПА =1-5); сред-неадгезивную (СПА = 5 - 10); высокоадгезивную (СПА выше 10).
Воздействие ПИЛИ на бактериальные культуры и эритроциты проводили в течение 1 и 10 мин при частоте 1000 Гц.
Антагонистическую активность штаммов пробиотиков в отношении клинических штаммов УПМ определяли методом отсроченного антагонизма (ФС 423476-98), антагонистическую активность считали нулевой - при зоне задержки роста тест-штамма до 5 мм, низкой - от 5 до 10 мм, средней - от 10 до 15 мм, высокой -от 15 до 20 мм, очень высокой - выше 20 мм.
Оценку персистирования пробиотических штаммов бацилл в желудочно-кишечном тракте проводили на мышах линии "black" массой 14-16 г. Мышам однократно перорально вводили исследуемую культуру в дозе 1х109 КОЕ/0,5 мл. Свежий кал взвешивали и гомогенизировали в физиологическом растворе (ЗФР). Затем последовательные десятикратные разведения высевали на агаризованную среду Гаузе №2. Посевы инкубировали при температуре 37 °С в течение 48 ч. Выросшие колонии идентифицировали по морфологическим и биохимическим признакам.
Экспериментальный дисбактериоз у мышей вызывали путем перорального введения доксициклина (0,2 мг/ сут в течение 1 или 5 сут) или ампиокса (4 мг/сут
в течение 14 сут) (Лиходед В.Г. с соавт., 1998). Количественный анализ микрофлоры проводили по методике, разработанной Бочковым И.А.с соавт. (1988).
Безопасность производственных штаммов бактерий р.Bacillus оценивали по отсутствию токсичности, токсигенности и вирулентности в соответствии с Методическими рекомендациями (Смирнов В.В. с соавт., 1983).
При изучении «острой» и «хронической» токсичности использовали Методические рекомендации доклинических испытаний новых медицинских иммунобиологических препаратов (РД 42-28-8-89).
При исследовании дермонекротических свойств штаммов бацилл морским свинкам внутрикожно вводили 1x109 КОЕ/0,5 мл и наблюдали за животными в течение 3 сут.
Определение влияния штаммов бактерий p.Bacillus на детоксицирующую функцию печени («гексеналовая проба») осуществляли в опытах на беспородных крысах массой 180-240 г. Опытной группе пробиотическую культуру вводили пе-рорально в дозе 50x109 КОЕ/0,5 мл, ежедневно в течение 10 сут. Контрольной группе ежедневно перорально вводили 0,5 мл физиологического раствора в течение 10 сут. Затем каждому животному вводили гексенал и определяли продолжительность наркоза. Рассчитывали среднее арифметическое длительности гексеналового наркоза. На угнетение детоксицирующей функции печени указывало статистически значимое удлинение продолжительности наркоза у животных, получавших испытуемый штамм (в сравнении с продолжительностью наркоза у контрольных животных).
Полученные данные обработаны с помощью методов вариационной статистики, позволяющих вычислять параметры достоверной значимости результатов исследования (Гланц, 1999). Статистическую значимость различий между группами оценивали с использованием непарного t-критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Результаты в таблицах и на рисунках представлены в виде средней арифметической, ее стандартной ошибки (М±т) и коэффициента корреляции (г).
Результаты оценивали на основании данных 3-5 опытов.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Модель для экспериментального изучения штаммов
В решении многих проблем биологии и медицины решающую роль играют экспериментальные исследования на животных, позволяющие моделировать необходимые состояния, изучать динамику патологического процесса (Мардвинова Г.В., 2004). Данный раздел работы включает модельные эксперименты на мышах по доклиническому изучению лечебной эффективности коммерческих пробиотиков при экспериментальном дисбактериозе и остром инфекционном процессе, вызванным введением энтеропатогенного штамма E.coli 0157:117 (патент РФ №225214).
На первом этапе работы моделировали дисбактериоз на мышах, путем ин-трагастрального введения ампиокса (4 мг/сут в течение 14 сут) или доксициклина (однократно в дозе 0,2 мг). Введение антибиотиков вызывало изменение состава микрофлоры, характеризующееся увеличением количества энтеробактерий, лакто-зонегативной кишечной палочки, грибов рода Candida. При этом обнаружено повышение уровня адгезивной активности УПБ и способности к адгезии энтероци-тов. Выявлена транслокация лактозонегативной кишечной флоры во внутренние органы животных (легкие, почки, тимус и печень). Полученные результаты согласуются с данными литературы о том, что при дисбиозе наблюдается чрезмерное увеличение УПМ, повышение уровня ее адгезивной активности и транслокация микрофлоры в несвойственные ей биотопы (Бондаренко В.М. с соавт., 2004; Горская Е.М.,1994).
Для коррекции экспериментального дисбактериоза применяли пробиотики (ПБ) - колибактерин, лактобактерин, ацилакт, бифидин и бифидумбактерин в двух дозах: ч.д. «человеческая» (терапевтическая доза) и м.д. «мышиная» (терапевтическая доза в пересчете на массу мыши), ежедневно в течение 24 сут (в соответствии с инструкциями по применению). Исследования состава микрофлоры проводили через 7 сут после последнего введения ПБ.
При изучении влияния колибактерина на состав микрофлоры установлено изменение в соотношении видов кишечной палочки, увеличение лактозоположи-тельных кишечных палочек (на 2-3 lg). Выявлено незначительное увеличение уровня лактобактерий (на 1 lg), однако количество бифидобактерий, стафилокок-
ков и грибов рода Candida не изменялось. При изучении влияния лактосодержащих ПБ на состав микрофлоры обнаружено увеличение количества лактобактерий (на 23 lg), статистически значимое уменьшение стафилококков (на 2 IgJ, тогда как содержание бифидобактерий и грибов рода Candida не изменялось. В группе животных, получавших бифидумбактерин, увеличилось только количество бифидобактерий (на 2-3 lg), состав остальной флоры не менялся. В группе животных, леченных бифидином, обнаружено увеличение уровня бифидобактерий (на 3-4 lg) и статистически значимое уменьшение стафилококков и лактозонегативных эшерихий. Следует, отметить, что разница между различными дозами одного и того же препарата не выявлена.
Таким образом, применение препаратов ПБ, при экспериментальном дисбак-териозе, способствовало увеличению нормофлоры, тогда как уровень УПМ оставался без изменения.
Известно, что ПБ применяются также и при ОКИ, в связи с этим нами была смоделирована острая инфекция, вызванная E.coli 0157.Н7. В работе использовали штамм E.coli Ol57. Н7 № 212, выделенный у детей с геморрагическим колитом, полученный из Государственного научно-исследовательского института инфекционных болезней Японии (г. Токио). В серии экспериментов установлено, что LDso Для штамма E.coli 0157.Н7 №212 составило 1x109 КОЕ/0,5 мл при в/б введении. В экспериментах по отработке заражающей дозы определено, что данная инфекция лучше моделировалась на животных с экспериментальным дисбактериозом. Для развития дисбактериоза препарат ампиокс вводили всем группам животных (кроме 2 контрольной группы) per os ежедневно в течение 14 сут, дача антибиотика прекращалась за 1 сут до заражения.
Для лечения и профилактики инфекции применяли различные коммерческие ПБ (колибактерин, бификол, биофлор, лактобактерин, ацилакт, бифидин и бифидумбактерин) перорально 1 раз в сутки в двух дозах: ч.д. и м.д.
В эксперименте участвовали три группы мышей: первая - получала ПБ параллельно с ампиоксом в течение 5 дней, введение препаратов прекращали за 1 сут до заражения; вторая - получала ПБ за два дня до заражения и 3 дня после заражения (курс ПБ составил 5 сут); третья -начала получать ПБ в одной дозе (ч.д.) через
1 сут после заражения в течение 5 дней (рис.1). 1 контрольная группа животных, до заражения получала только ампиоксperos; 2 контрольная группа - по 0,5 мл ЗФР.
Лучше всего инфекцию перенесли животные 1-й группы, при этом лактосо-держащие ПБ (лактобактерин, ацилакт) и бифидин оказались эффективными в малых дозах (выживаемость составила 80 и 50 % соответственно); ацилакт и колисо-держащие препараты (колибактерин, бификол, биофлор) в больших дозах, защищали 100 и 60 % мышей. Во второй группе максимальный эффект выявлен в подгруппе животных, получавших большие дозы. Следует отметить, что эффективной оказалась «мышиная» доза биофлора, тогда как аналогичная доза колибактерина не защищала. В 3 группе выживаемость на уровне 50 и 60 % установлена у мышей получавших лакто- и колисодержащие пробиотики. Бифидумбактерин оказался малоэффективным во всех группах при данной инфекции (выживаемость на уровне 20-30%).
100 ■ 90 ■ 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Вч.д. Шм.д.
а в в
Í-S
и
ЗЙИ
5 S-
-е- t
ц, ю
С -е-
о. о с
-е-
Ю Ш Ш
& -е- S
Я X «
Ю IQ «Э
I O
& £
CL О с
■е-
Я f
19 * X
ю ш щ
Е
я X
Ч ш
■е-
s
ш
S £
X
с о ъс
! *
IÚ ш
Ч- гм J J
I группа
II группа
III группа
Рис.1. Лечебное действие пробиотиков при инфекции, вызванной Е.соИ 0157:Н7
В модельных экспериментах по изучению лечебной эффективности пробиотиков впервые получены доказательства необходимости стандартного доклинического изучения различных доз и схем применения препаратов-пробиотиков. Таким образом, при создании новых биопрепаратов должны быть использованы стан-
дартные критерии отбора пробиотических штаммов, основанные на анализе их активности как in vitro, так и in vivo.
Разработка критериев отбора пробиотических штаммов
Основываясь на многолетнем всестороннем изучении биологии бактерий рода Bacillus, отобраны 5 штаммов аэробных спорообразующих бактерий B.subtilis 3, IIB (ВКМВ-2218Д). 07 (ВКПМВ-8611) и B.licheniformis 31, 09 (ВКПМВ-8610) для дальнейшего включения в состав новых препаратов-пробиотиков. Для сравнения изучены штаммы, входящие в состав зарубежных коммерческих препаратов: B.cereus IP5832 (бактисубтил) и B.clausii (энтерогермин).
С целью получения вариантов, устойчивых к антибиотикам, штаммы B.subtilis 3 и B.licheniformis 31 многократно пассировали на питательном агаре с возрастающей концентрацией антибиотиков. В результате такой селекции были получены культуры B.subtilis 3/Re и B.licheniformis 31 /Re, депонированные в коллекции ГИСК им.Л.А.Тарасевича под номерами ГКПМ №264 и ГКПМ №263 соответственно.
В рамках доклинического изучения и с целью формирования требований к производственным штаммам бактерий рода Bacillus проведено комплексное изучение их биологических свойств.
На первом этапе рассматривали культурально-морфологические и биохимические свойства с учетом того факта, что пробиотические культуры не должны быть генетически близки к тем видам, среди которых встречаются патогенные.
Изучаемые пробиотические культуры существенно различались своими фи-зиолого-биохимическими характеристиками (табл.1). Так, штаммы В. lichenifortnis, в отличие от штаммов В. subtilis, характеризовались способностью расти в анаэробных условиях. Различались они также и по другим свойствам (ферментация некоторых углеводов, продукция аргининдегидролазы и др.).
Таблица 1
Культуральные, морфологические и биохимические свойства бактерий _ пробиотических штаммов рода Bacillus_
Свойства Штаммы бактерий рода Bacillus
Все reus 1Р 5832 В. clau sii В. subtili s 3 Bliche niform is 31 B.subti Iis IIB B.subti Iis 3/Re Bliche niform is 31 /Re B. subti Iis 07 B. liehe niform is 09
Рост в анаэробных условиях + - - + - - + - +
Ферментация - глюкозы -арабинозы - ксилозы - маннита + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Образование кислоты и газа из глюкозы - - - - - - - - -
Образование кислоты из глюкозы + + + + + + + + +
Утилизация - цитрата - пропионата + + + + + + + + + + + +
Гидролиз - крахмала - мочевины - казеина - тирозина + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Редукция нитратов + + + + + + + + +
Образование газа из N03" в анаэробных условиях + + + +
Обесцвечивание ме-тиленового синего + + + + + + + + +
Катал аза + + + + + + + + +
Реакция Фогес-Проскауэра + + + + + + + + +
Аргининдегидролаза - - - + + - + - +
Лецитиназа + - - - - - - - -
Гиалуронидаза + - - - - - - - -
Гемолитическая активность + - - - - - - - -
Образование глобул поли-Р-ксимасляной кислоты на глюкоз-ном агаре
Лизоцимная активность - - + + - + + + +
Рост при 50 °С - + + + + + + + +
Рост при 65 °С - - - - - - - - -
Рост при 7% ЫаС1 + + + + + + + +
Все культуры, кроме штамма B.cereus IP5832, характеровались отсутствием гемолитической активности. У них не обнаружены ферменты (лецитиназа, гиалу-ронидаза), которые могли обусловливать патогенные свойства штамма.
В последние годы появились сообщения о попытках совместного применения биопрепаратов с антибиотиками (Tirel M.L. et al., 1990). Поэтому при создании нового пробиотика необходимо располагать сведениями об антибиотикоустойчи-вости бактериальных культур и включать в его состав штаммы с различной чувствительностью к антимикробным препаратам. Исследование показало, что все изучаемые штаммы были устойчивы к азтреонаму (зона задержки роста до 5 мм). Родительские штаммы B.subtilis 3 и B.licheniformis 31 были устойчивы только к трем антибиотикам: ампициллину, бензилпенициллину, цефуроксиму.
Селекционированные штаммы B.subtilis З/Re и B.licheniformis 31/Re оказались резистентными одновременно к ампициллину, метициллину, оксациллину, бензилпенициллину, цефтазидиму, цефтизоксиму, цефуроксиму, ванкомицину, клиндамицину, полимиксину Е, мономицину, неомицину. У штамма В. subtilis IIB выявлена устойчивость к карбенициллину, азтреонаму, полимиксину Е. Штаммы B.subtilis 07 и B.licheniformis 09 оказались устойчивы к цефуроксиму и цефтизоксиму, но B.licheniformis 09 был еще устойчив к метициллину, ампициллину, пипе-рациллину и бензилпенициллину. При разработке новых пробиотиков, устойчивых к антибиотикам, предпочтение необходимо отдавать культурам с хромосомной природой устойчивости (Tuomola Е. et al., 2001). Поэтому было проведено изучение плазмидного профиля исследуемых штаммов бацилл, которое показало отсутствие плазмидной ДНК у этих штаммов (Сорокулова И.Б., 1999). Таким образом, отмеченная антибиотикорезистентность пробиотических культур не обусловлена наличием у них плазмид, а является специфической видовой характеристикой B.subtilis и B.licheniformis. Значимость устойчивости к антибиотикам как таксономического признака для бактериий рода Bacillus обсуждалась в литературе (Reva, 1995; Ivanova, 1999).
Антагонистическую активность штаммов определяли in vitro методом отсроченного антагонизма на среде Гаузе №2. Установлено, что виды B.subtilis (3. Re/3, 07) и В- licheniformis (31, Re/31, 09) по антагонистической активности дополняли друг друга, проявляя высокий антагонизм к широкому спектру УПМ (рис.2).
Рис.2. Антагонистическая активность штаммов бактерий р.ВасШиз
Примечание. * р<0,01 и **рХ),01 по отношению к другому пробиотическому штамму
При изучении устойчивости штаммов к секретам желудочно-кишечного тракта выявлена высокая резистентность штаммов В.Искет/огт1з к желудочному соку, а штаммов В.зиЫШз - к желчи (табл.2). Штаммы В. сегеиз 1Р5832 и В.ЫаизИ оказались более чувствительны к желчи и желудочному соку.
Таблица 2
Устойчивость бацилл-пробиотиков к воздействию желудочного сока и желчи
Название штамма Количество жизнеспособных клеток, Ig (КОЕ/мл)
Исходное После 2 ч экспозиции
в желудочном соке в желчи Контроль ЗФР
B.suhtilis 3 9,0 5,0-6,0* 7,0-8,0* 9,0
B.licheniformis 31 9,0 7,0-8,0* 5,0-6,0* 9,0
B.subtilis 3/Re 9,0 5,0-6,0* 7,0-8,0* 9,0
B.licheniformis 31/Re 9,0 8,0* 5,0-6,0* 9,0
B.subtilis IIB 9,0 5,0* 6,0-7,0* 9,0
B.subtilis 07 9,0 5,0-6,0* 8,0* 9,0
B.licheniformis 09 9,0 8,0* 5,0-6,0* 9,0
B.cereus IP 5832 9,0 5,0* 5,0-6,0* 9,0
B.clausii 9,0 5.0-6,0* 6,0-7,0* 9,0
Примечание: * р<0,01 в сравнении с исходными показателями
Сравнительное изучение адгезивной активности штаммов бактерий рода Bacillus к эпителиальным клеткам кишечника мышей (энтероциты и колоноциты)
выявило, что штаммы В.виЫШз 3, 3/И.е, 07 обладали низкой адгезивностью (рис.3). Штаммы В.ПсИеп1/огт1з 31, 31/Яе, 09 проявляют средний уровень адгезивной активности к энтероцитам и к колоноцитам. Штаммы В.зиЫШ$ 11В и В.сегеш 1Р 5832 проявляли высокий уровень адгезивности к энтероцитам и низкий - к колоноцитам.
Рис 3. Адгезивная активность пробиотических штаммов бацилл к эпителиальным клеткам кишечника мышей
Примечание: * р<0,01 и **р>0,01 по отношению к другой разновидности эпителия.
10
15 18
24
В.виЬКИэ 3 В. ПсЬепКоггтиз 31/Ре "В.ИсЬетГоптмз 09
Время наблюдения, сутки
МсЬел!йэпп15 31 В.зиЫШз З/Яе В.сегеиз 1Р 5832
"В. $иЬИН«11В ■В.аиЬиИа 07
Рис. 4. Динамика персистирования штаммов-пробиотиков в желудочно-кишечном тракте мышей
Проведено исследование длительности персистирования бацилл в желудочно-кишечном тракте, в котором установлено, что штаммы B.lichcniformis i/Re, 31, 07 и B.subtilis 3/Re, 09 элиминировали из кишечника мышей в течение 7-10 сут после их однократного введения. А штаммы (B.subtilis 11В и B.cereus 1Р 5832), проявившие высокую адгезивность, персистировали в кишечнике в течение 15-24 сут (рис.4).
Таблица 3
Изучение вирулентности, токсичности и токсигенности бацилл-пробиотиков
Вирулентность Токсичность Токсигенность
№ штамма Доза Кол-во Доза (хЮ' Кол-во Доза Кол-во
(х10* живых/ КОЕ) живых/ (мл) живых/
КОЕ) павших павших павших
мышей мышеи мышеи
В. subtilis 3* 1 10/0 0,5 10/0 0,5 10/0
5 10/0 1,0 10/0 1,0 10/0
10 10/0 2,0 10/0
В. Ucheniformis 31" 1 10/0 0,5 10/0 0,5 10/0
5 10/0 1,0 10/0 1,0 10/0
10 10/0 2,0 10/0
Bacillus cereits IPS832 0,5 5/5 0,5 5/5 0,5 0/10
1 1/9 1,0 1/9 1,0 0/10
5 0/10 2,0 0/10
10 0
Примечание: Аналогичные результаты получены для штаммов В.5иЫШ$ З/Ие, 11В, 07
** Аналогичные результаты получены для штаммов В.ИсИет/огтк 309
При исследовании биологической безопасности выявлено, что штаммы В.зиЫШя и В.Искет^птз в отличие от В.сегеиз 1Р 5832, не обладали вирулентностью, токсичностью и токсигенностью (табл.3).
Таблица 4
Влияние штаммов бактерий рода Bacillus на длительность гексаналового сна у крыс
Исследуемый штамм Кол-во Вес жи- Доза гексанала Продолжитель-
живот- вотных (мл 5%-ного ность сна (мин)
ных (Г) раствора) I
B.subtilis 3 10 210±23 0,414±0,06 21,5
B.subtilis IIB 10 215±24 0.426±0,04 23,0
B.subtilis 3/Re 10 210±22 0.466±0,05 22,1
B.subtilis 07 10 205±25 0.412±0,08 21,5
B.licheniformis 31 10 209±24 0.424±0,0 3 22,3
B. lieh en ifo rm is 09 10 207±24 0.416±0,06 21,1
B.licheniformis 31/Re 10 211±21 0.419±0,04 22,2
Контроль (физ. p-p) 10 211±25 0,426±0,07 23,5
Помимо этого, введение животным культур штаммов В.зиЬйШ и В.ИсИет/отйз не приводило к нарушению антитоксической функции печени (табл.4), также отсутствовали признаки некроза и другие симптомы местных реакций у всех животных.
Проведенные исследования «острой» и «хронической» токсичности показали, что штаммы В.зиЬйШ и В.Ис1геп1/огт1в не вызывали во внутренних органах и ЦНС животных изменений, указывающих на наличие токсического действия при введении доз, значительно превышающих человеческие (табл.5).
Таблица 5
Изучение «острой» и «хронической» токсичности пробиотических бацилл
Название штамма Способ введе- Доза введе- Количество животных
ния ния КОЕ/О,5 мл живых/ павших
Bacillus subtilis 3* в/в 10x10' 10/0
в/б 10x10' 10/0
per os 100x10" 10/0
per os 1x104 10/0
Bacillus lichemformis 31 в/в 10x10' 10/0
в/б 10x10* 10/0
per os 100x10' 10/0
per os 1x104 10/0
Bacillus cereus IP58-32 в/в 1,0x10* 0/10
b/b 0,5x10' 10/10
в/б 1,0x10' 0/10
в/б 0,5x10* 10/10
per os 100x10' 10
per os 1x104 10
Контроль физ.раствор в/в 0,5 мл 20
в/б 0,5 мл 30
per os 0,5 мл 30
per os 0,5 мл 30
Интактные - - 30
- - 30
Примечание: в/в — внутривенное введение; в/б — внугрибрюшиннос введение.
* Аналогичные результаты получены для штаммов B.subtilis i/Re, 11В, 07 " Аналогичные результаты получены для штаммов B.licheniformis 31/Re, 09
Гистологические исследования подтвердили отсутствие токсических изменений в тканях и внутренних органах лабораторных животных.
Необходимо отметить, что парентеральное введение штамма В.сегеиз 1Р 5832 в дозе 1x109 КОЕ (терапевтическая доза) вызывает 100 % гибель животных. При введении этой культуры в более низких концентрациях у животных отмечаются
патологические изменения в легких (рис.5). Другие пробиотические штаммы бацилл не оказывали патологического воздействия на организм лабораторных животных (рис.6).
ЧТу -
• АДГ-- fv*?
fc-i >
: *- Л л V v «w *
.Jf^'C^V
ыл
Рис.5. Опыт. Оетрая токсичность, в'б введение В.ссгеи5 1Р 5832 (7 сут). Легкие: выраженное полнокровие, крупноочаговые кровоихшяния. Окр гематоксилин-эозин. Ув.Х400
i*Vti Prf- I ^'Ъ^Гъ.
■С
к
• * Kf
it"
iW.,
■C i. JU. V ^
Рис.6. Опыт. Острая токсичность, в/б введение В.ИсЬеш/огпйз 31, (7 сут). Легкие: норма. Окр. гематоксилин-эозин. Ув.Х400
Хроническая токсичность штаммов B.subtilis и В licheniformis исследована на трех видах животных - мышах, крысах, кроликах. При гистологическом исследовании внутренних органов и тканей животных, взятых на 1 и 7 сутки после введения штаммов, каких-либо признаков патологии не зарегистрировано.
Выявлено, что при пероральном введении штаммов B.subtilis и B.licheniformis у значительного числа животных выявлена умеренная или выраженная гиперплазия лимфоидного аппарата тонкого кишечника, которая, по-видимому, свидетельствует о местном иммуномодулирующем эффекте.
Известно, что сплсно- и гепатомегалия являются опосредованными показателями инфекционного процесса {Zhou JS. et а!.. 2000). В данном исследовании не обнаружено микроскопических изменений морфологии селезенки и печени у животных, получавших исследуемые штаммы B.subtilis и B.licheniformis. Селезеночный индекс мышей, которым вводили эти культуры, не отличался от показателей животных контрольной группы. При бактериологическом исследовании крови и внутренних органов животных установлено отсутствие диссеминацин этих культур, т.е. они характеризовались как неинвазивные.
Таким образом, всестороннее изучение пробиотических штаммов B.subtilis и B.licheniformis in vitro и in vivo показало их безопасность, т.к. они не вызывали каких-либо патологических изменений у животных.
На основании полученных результатов нами определены наиболее перспективные штаммы споровых бактерий, на основе которых можно создать принципиально новые биопрепараты и определить методические подходы к конструированию комплексных пробиотиков.
Конструирование комплексных пробиотиков
Для конструирования комплексных биопрепаратов отобраны штаммы В. зиЬНШ и В. Искеп'^огт1к, существенно различающиеся своими физиолого-биохимическими характеристиками и спектром антагонистической активности (табл.1 и рис.2), что являлось определяющим фактом для создания комплексных препаратов для расширения спектра специфической активности. Представляло интерес изучение взаимного влияния штаммов друг на друга (табл.6).
Таблица 6
Результаты изучения взаимного влияния у пробиотических штаммов бацилл
Зоны задержки роста тест-культур в мм |
КИОСПОРИН ВИТА-СПО-РИН . i ■1 . ' 'Л ИРИЛИС
subtilis >v В. lichen iformis Í B.subtilis 11В Í&stt6ti- subtilis. 07 BJichen ifórmis i 09
■ ■"
В. subtilis 3 к ^ ? 1,2+0,1 7,1 ±0,3 2,4+0,1 1,3+0,2 2,5+0,1 2,3+0,2
B.licheniformis : ■ЗГ'Ж^ т-ЛйХ:. 1,3+0,1 — 19,5+0,8 4,4+0,2 3,2+0,2 4,5+0,2 3,5+0,2
B.subtilis ИВ 17,6+0,2 18,1+0,7 — 17,6+0,6 20,4+0,5 21,5+0,6 20,3+0,3
2,2+0,1 2,1+0,1 7,9+0,34 2,9+0,1 2,8+0,2
4,4+0,2 3,4+0,2 16,9+0,4 ■ Ш. 3,5+0,2 2,4+0,1
В. subtilis 07 2,4+0,2 2,6+0,1 8,5+0,3 2,5+0,3 3,5+0,5 r 1,2+0,2
-- B.tícheníformis 3,8+0,3 4,4+0,2 18,8+0,3 4,2+0,2 3,5+0,3 1,1+0,7
Проведенные эксперименты показали отсутствие антагонистических взаимоотношений у изучаемых штаммов, кроме штамма В.зиЬиШП В.
Па основании композиций штаммов В.зиЬи7/5 3 и В.ИсИеп1/огт1з 31 был создан препарат биоспорин, защищенный патентами РФ №1722502 и Украины №689. Антибиотикорезистентные штаммы В.зиЬИИя З/Яе и В.ПсИеп1/огпй$ 31/Яе составили основу препарата биспорин (патент РФ №2219238). Штаммы В.зиЫШз 07 и В.Ис11еп1/огт15 09 явились основой пробиотика ирилис (патенты России № 2264453 и № 22264454).
Иной методический подход, основанный на колонизационной активности (адгезивности и антагонизма) был применен при создании препарата субтикол, (штаммы В зиЫШз 3 и В.ИсИет/огпиз 31, и Е.соИ М-17), защищенного патентом РФ №2129432.
Таблица 7
Специфическая активность пробиотиков из бацилл
Тест-культуры K-BO Количество штаммов, чувствительных к пробиогикам *
тест- БИО- ВИТАС- БИС- ИРИ- СУБТИ- БАКТИ- ЭНТЕ-
штам- спо ПОРИН ПОРИН ЛИС КОЛ СУБТИЛ РОГЕР-
мов РИН мин
Shigella sonriei 13 12 9 13 12 13 0 0
Shigella flexneri 8 6 ■ 4 7 6 7 0 0
Salmonella tvphi** 1 1 0 1 1 1 0 0
S. typhimurium** 2 2 0 2 2 2 0 0
Escherichia coli*** 29 26 19 25 20 29 0 0
Klebsiella pneumoniae 10 9 7 10 10 10 0 0
Setratia marcescens*** 11 11 7 10 11 11 0 0
Proteus vulgaris 18 18 10 15 15 18 0 0
Proteus mirabilis 19 18 8 16 16 19 0 0
Staphylococcus aureus*** 25 25 20 25 25 25 0 0
Pseudomonas aeruginosa 8 5 2 4 3 8 0 0
Candida albicans 30 30 26 30 26 29 0 0
Yersinia spp. 20 20 4 19 18 19 0 0
Bacillus antkracis** 2 2 # 2 2 2 0 0
Enterococcus spp. 22 22 15 22 22 22 0 0
Примечание: *зона задержки роста тест-штаммов более 15 мм; ** - вакцинный штамм; -*** полирезистентные к антибиотикам культуры; # - не изучали
Штамм B.subíilis IIB, обладающий изоантагонизмом в отношении всех изученных культур, использован для разработки препарата витаспорин (патент РФ №2181596).
На следующем этапе проведено сравнительное изучение антагонистической активности разработанных нами препаратов (биоспорина, витаспорина, биспори-на, ирилиса и субтикола) и зарубежных коммерческих аналогов (бактисубтила и энтерогермина) в отношении к различным патогенным и УПМ (музейным, вакцинным и клиническим штаммам полирезистентных к антибиотикам микроорганизмов /п=219/) табл.7.
Исследования показали, что в преобладающем большинстве созданные нами комплексные препараты проявляли высокую антагонистическую активность по отношению к патогенным и условно-гтатогенным микроорганизмам. Наиболее высокую степень антагонизма проявляли биоспорин и субтикол.
В установленных нами параметрах (более 15 мм) витаспорин проявлял низкую антагонистическую активность, а у бактисубтила и энтерогермина она вообще не регистрировалась.
Таким образом, в опытах in vitro комплексные ПБ, по сравнению с монопрепаратами, проявляли более широкий спектр антагонистической активности.
На следующем этапе работы изучено воздействие разработанных ПБ на состав микрофлоры мышей интактных и с экспериментальным дисбактериозом. Препараты вводили per os ежедневно в течение 7 сут в двух дозах «ч.д.» и «м.д.». Исследование состава микрофлоры проводили через 7 сут после последнего введения ПБ. Комплексные препараты оказывали корригирующее действие на состав микрофлоры: наблюдалось увеличение лактозоположительных кишечных палочек и лактобактерий на 2-3 lg, содержание бифидобактерий не изменялось, тогда как элиминировались стафилококки и грибы. Эффект монопрепаратов витаспорина и бактисубтила оказался менее выраженным.
В ряде экспериментов изучена эффективность разработанных препаратов для лечения и профилактики острой кишечной инфекции (рис.7). Исследования проводили по описанной выше схеме для инфекции, вызванной E.coli 0157. Пробио-тики применяли перорально 1 раз в сутки в двух дозах: ч.д. и м.д. В эксперименте участвовали три опытные группы животных с экспериментальным дисбактериозом
и две контрольные. Первой опытной группе вводили ПБ параллельно с ампиоксом в течение 5 дней, введение препаратов прекращалось за 1 сут до заражения; во второй - ПБ вводили за два дня до заражения и в течение 3 дней после заражения (курс ПБ составил 5 сут); в третьей - ПБ вводили в одной дозе (ч.д.) через 1 сут после заражения в течение 5 дней. Первой контрольной группе животных до заражения вводили только ампиокс per os; вторая контрольная группа - получала по 0,5 мл ЗФР.
Комплексные препараты оказывали выраженный профилактический эффект (на уровне 80-90 %) при использовании в мышиной дозе, в человеческой дозе только субтикол обеспечивал 100 % выживаемость (1-ая группа).
На фоне развивающегося дисбактериоза (2-ая группа) эффект от приема препаратов оказался значительно ниже, в пределах 10-60 % выживших животных. Процент выживших животных, получавших человеческие дозы, достигал 50-60 %, тогда как малая доза была не эффективной и обеспечивала защиту не более 10 и 20 %.
Введение ПБ в человеческой дозе после заражения оказывало защитный эффект на уровне 30-60 %. Следует отметить, что монопрепараты были менее эффективны.
I группа
□ человеческая доза В мышиная доза
- IH-pyrma-------------ш группа.
-й-
---5-----Ж---------------й------
— д---s---д -
д
S-------
Т
£ m
е i 5 >, ^ « и ю
£ m
i X X X
X X X
Ь CL CL си
Ю О О о
>* С С с
X о о о
о в X
£ « LC X из £ m ш
Рис.7. Защитное действие пробиотиков при инфекции, вызванной E.coli 0157:Н7
Полученные в -экспериментах данные свидетельствовали, что ПГ> ь малых дозах проявляли только профилактическую эффективность, тогда как терапеши-чсский эффект наступал после приема препаратов в больших дозировках.
Таким образом, результаты опытов in vitro, доказывающие антагонистические свойства разработанных комплексных пробиотиков против патогенных и УГ1М, выделенных при дисбактериозах различной этиологии, нашли подтверждение в экспериментах in vivo.
В доклинических исследованиях комплексных пробиотиков выявлено преимущество биоспорина по антагонистической активности, низким адгезивным свойствам, высокой скорости элиминации. Это позволило в дальнейшем провести изучение его специфической активности в различных лекарственных формах и при воздействии физических фактов.
Сравнительное изучение специфической активности различных
пробиотиков
На данном этапе работы проведено сравнительное изучение специфической активностей коммерческих пробиотиков (лактобактерина, бифидумбактсрина и ацилакта) и биоспорина в разных лекарственных формах (лиофилизат, таблетки и суппозитории).
Специфическая активность разных лекарственных форм пробиотиков оценивается по антагонизму, активности кислотообразования и по количеству живых микробов в дозе препарата, и при этом не учитывается такой важный показатель как адгезивная активность-
Исследования антагонистической активности различных лекарственных форм (табл.8): лиофилизат, таблетки, суппозитории в отношении регламентированных тест-штаммов показали, что форма выпуска пробиотиков не влияет на показатель антагонистической активности (р>0,05).
Преследуя цель расширить сферу применения биоспорина для коррекции дисбпозов влагалища, нами изучены антагонистические свойства препарата в отношении УПМ, выделенных из вагинального отделяемого женщин с бактериальным вапшозом (БВ) и вульвовагннальным кандидозом (ВВК) (табл.0).
Таблица 8
Показатели антагонистической активности пробиотиков в отношении _р егл а м енти ро ва н н ы х тест-шта м м о в_
Название про-биотика Лекарственная форма* Зона задержки роста тест-культур в мм
S. aureus 209 С albicans 885-653 S.sonnei 5069 5. ßexneri 337 P.mirahit is 237 E.coli 157 Р. vulgaris 177
Био-спорин Лиофилизат 32,2±2,9 32,2±1,8 17,6±0,5 20,2±2,3 18,0±1,8 20,5±2,5 21,6+1,0
Таблетки 31,9+3,2 30,8+2,8 17,0±2,3 19,4+3,7 17,4±2,8 20,1 ±2,0 19,8+3,1
Суппозитории 31,1+3,6 31,5+3,5 1б,0±3,9 18,6+3,5 16,9±2,2 19,9±3,0 21,2+2,1
Бифи-дум-бакте-рин Лиофилизат 12,2±0,8 6,6±1,0 13,5±1,0 11,6+1,2 13,0±1,0 12,4+1,0 13,0+0,8
Таблетки 11,8±1,4 5,0+1,0 12,5±0,8 11,3±0,4 12,5±0,3 12,1±0,7 13,5+0,5
Суппозитории 11,8±0,8 4,0+0,5 12,2±0,4 11,1+0,5 12,1 ±0,9 11,6±0,4 12,1±0,8
Лакто-бакте-рин Лиофилизат 26,9±1,3 4,8±1,5 2б,4±1,8 24,0±1,7 23,0±2,1 24,1 + 1,5 25,1±2,1
Таблетки 25,5±1,5 4,2±1,7 25,8±1.8 25,1+2,7 23,7±2,4 24,9+2,5 24,8±2,1
Суппозитории 25,1 + 1,4 4,7±1,1 26,0±1,7 23,0±1,5 22,0±1,7 25,0+1,2 24,1±1,8
Аци-лакт Лиофилизат 25,5+2,5 3,8+0,5 26,4+1,8 26,1±3,2 22,9+2,3 26,2+3,6 24,4±2,4
Таблетки 25,9+3,5 4,1 ±0,7 25,8±1,8 24,3±2,3 23,2±1,4 25,9±1,6 25,8±2,5
Суппозитории 24,1±2,4 3,711,2 2б,0±1,7 25,0±2,7 22,5±1,5 25,5±2,5 25,1 ±2,8
Примечание: в таблице приведены средние данные 5 экспериментов исследованы 10 серий каждой формы препарата
разница между различными формами препарата недостоверна ( р>0,05)
Таблица 9
Характеристика антагонистической активности биоснорина в отношении УПМ, выделенных от больных с БВ и ВВК
Название тест-культуры Кол-во штаммов Зона задержки роста тест-культур, мм (М±тп)*
Лиофилизат Таблетки Суппозитории
Candida albicans 53 30,52±3,5 31,2±2,8 29,7±3,4
C.parapsilosis 5 28,8±2,4 28,1±3,0 26,9+4,2
C.pseudotropicalis 2 4,5±2,5 3,9±2,2 2,5±2,1
C.stellatoidea 14 29,79±4,6 30,1 ±3,4 28,4±3,8
Staphylococcus aureus 56 33,95±7,7 32,8±5,3 30,5±7,2
S.epidermidis 32 27,13±4,5 28,0±3,9 27,8±3,5
Enterococcus fecalis 27 26,32+5,1 28,2±4,8 25,25+2,4
Escherichia coli 48 24,71 ±3,23 23,1±4,3 22,7+4,5
Klebsiella pneumonia 20 22,4+2,7 22,5+3,6 20,9+2,9
Enterobacter spp. 17 25,2+4,6 24,8±3,1 24,1 ±2,9
Примечание: в таблице приведены средние данные 5 экспериментов
* разница между различными формами препарата недостоверна р>0,05
Полученные данные свидетельствовали о том, что биоспорин во всех изученных лекарственных формах проявлял высокую антагонистическую активность в отношении к стафилококкам, грибам рода Candida, энтерококкам, кишечным палочкам и к другим УПМ, выделенным из влагалищного отделяемого обследованных женщин с БВ и ВВК.
Кроме того показано, что форма выпуска биоспорина не влияла на показатель антагонистической активности (р>0,05). Следует отметить, что известные пробиотики (лактобактерин, бифидумбактерин и др) оказались не эффективны в отношении грибов рода Candida.
Для изучения уровня адгезии разных лекарственных форм пробиотиков (биоспорина, лактобактерина, ацилакта и бифидумбактерина) использованы эритроциты человека и изолированные эпителиальные клетки влагалища (табл.10).
Таблица 10
Сравнительная характеристика адгезивной активности биоспорина
и пробиотиков
Пробиотики Лекарственная форма препарата Показатели адгезивной активности на модели
Эритроцитов Клеток влагалищного эпителия
ИАМ К,% ИАМ К,%
Лактобактерин лиофилизат 3,3±0,2* 86±7,8* 11,4±0,2* 100*
суппозитории 1,2± 0,1** 32+6,5** 5,5+ 0,2** 100*
таблетки 3,0±0,21* 87±5,9* 10,8±0.3* 100*
Ацилакт лиофилизат 2,9±0,1* 63±4,9* 3,3±0,2* 96+2,2*
суппозитории 1,2+ 0,1** 24±5,3** 1,8+0,1** 88+3,1**
таблетки 2,5+0,3* 62±3,8* 3,5±0,21* 98+2,3*
Бифидумбактерин лиофилизат 6,8+0,3* 73±4,2* 9,9±0,1* 100*
суппозитории 1,4± 0,1** 34±5,4** 3,8± 0,3** 64±5,4**
таблетки 6,4±0,25* 71 ±4,3* 9,1+0,2* 100*
Биоспорин лиофилизат 1,1+0,1* 86+5,4* 6,2±0,1* 100*
суппозитории 0,4+ 0,2** 38±7,3** 2,4± 0,1** 100*
таблетки 1,2±0,16* 85±4,9* 6,5± 0,2* 100*
Примечание: в таблице приведены средние данные 5 экспериментов; ИАМ - индекс адгезивности микроорганизма;
К(%) - процент эритроцитов, имеющих на своих поверхностях прилипшие микробы; * р>0,05 по отношению к другой лекарствен; ** р<0,05 по отношению к другой лекарственной форме.
Наиболее высокий показатель адгезивности пробиотиков в виде лиофилизата и таблеток по отношению к эритроцитам и эпителиоцитам наблюдался у культур,
составляющих основу бифидумбактерина и лактобактерина. У биоспорина выявлена низкая адгезия к эритроцитам и средняя - к эпителиоцитам, у ацилакта определены низкие показатели адгезии на обеих моделях.
В результате установлено, что лиофизат и таблетки всех пробиотиков не имели статистически значимых различий по показателям адгезивности (р>0,01). В то время как у суппозиториев показатели были достоверно ниже (/><0,01).
Таким образом, проведенное сравнительное изучение специфической активности различных лекарственных форм биоспорина и коммерческих пробиотиков подтвердило важность изучения адгезивности наравне с регламентированными показателями, характеризующими качество препарата.
В настоящее время для коррекции дисбиотических нарушений пробиотики назначают в комплексе с физическими процедурами, оказывающими общий санирующий эффект, в частности, совместно с ультразвуковым воздействием, с низкоинтенсивным лазерным излучением (Тауфик Хусейн Т.Д., 2002).
Учитывая это обстоятельство, нами проведены исследования воздействия низко-интенсивного лазерного излучения (НИЛИ) на количество живых бактерий в дозе пробиотиков и уровень их антагонистической активности. Установлено, что лазерное излучение не оказывало статистически достоверного влияния на количество живых бактерий и на уровень антагонистической активности пробиотиков.
В доступной литературе нами не обнаружено сведений о воздействии НИЛИ на адгезивные свойства пробиотиков. Однако, если блокирование адгезии патогенов целесообразно, то снижение адгезивности пробиотических штаммов нежелательно, в ряде случаев это может привести к неблагоприятным последствиям. В связи с этим было изучено воздействие НИЛИ на адгезивные свойства пробиотиков и уропатогенных эшерихий как наиболее вероятных возбудителей урогени-тальных инфекций (табл. 11).
При воздействии НИЛИ на бактерии в течение 10 мин достоверно снижался уровень адгезивности у бифидумбактерина, лактобактерина и штаммов Escherichia coli NU14/pPKL9, 407, 88, JJF10, JJP160 (p>0.01).
На другие объекты исследования (биоспорин, витаспорин, биспорин, ирилис, ацилакт, колибактерин и субтикол и штаммы E.coli 0157:117 и 391) лазерное воздействие не оказывало существенного влияния (р>0.05). Вероятно, различный уро-
вень снижения адгезии у разных штаммов связан с типом адгезинов на поверхности клеток, определяющих чувствительность клеток к воздействию НИЛИ.
Таблица 11
Показатели адгезивности пробиотиков и уропатогенных эшерихий до и
после воздействия НИЛИ
Исследуемый препарат Показатели адгезивной активности
До воздействия НИЛИ Воздействие НИЛИ 1000 Гц (10 мин)
На бактерии На эритроциты
СПА К% СПА К% CIIA к%
Биоспорин 1,6*0,1 86,2±3,5 1,4*0,2* 87,5*2,5* 1,5±0,3* 85,6*2,5*
Витаспорин 1,5*0,1 74,5±5,1 1,4*0,2* 72,2*2,2* 1,3*0,1 * 77,1*3,3*
Биспорин 1,8*0,2 87,7±6,5 1,6*0,2* 86,8*4,5* 1,8*0,1* 86,5+4,3*
Ирилис 2,0*0,1 89,5*5,0 2,4*0,3* 86,9*3,5* 2,3*0,1* 87,4*3,0*
Бифидумбактерин 6,8±0,3 73,4±4,3 3,8*0,2** 60,2*2,5** 2,0*0,2** 40,2*2,6**
Лактобактерин 3,3*0,2 86,5±1,5 2,0±0,1 ** 63,2*2,1 ** 1,5*0,1** 43,5*2,5**
Ацилакт 2,6*0,1 63,2*2,1 2,2±0,2* 60,5*1,2* 2,1±0,3* 60,0*1,5*
Колибактерин 4,7±0,5 95,8±1,6 4,6*0,3* 96,4±2,1 * 3,2*0,1* 85,6*2,2*
Субтикол 5,2±0,4 96,5±3,5 4,8*0,4* 93,1*2,0* 3,5*0,2* 86,5*2,5*
Escherichia coli NU14 1,1±0,1 62,5±5,9 0.9±0,1 * 65,5*4,7* 0.2*0,1 ** 35,5*2,5**
E.coli NU14/pPKL9 6,1 ±0,4 98,7±9,7 4.4*0,6** 100,0±8,7* 1.2*0,2** 40,5*3,1**
E.coli 407 2,9±0,1 89,7±7,4 1.7*0,2** 59,7±8,6** 0,4*0,1** 29,2+4,3**
E.coli 88 2,5*0,1 47,9±8,7 0.6*0,1** 40,3±7,8* 0,4*0,1** 10,3*0,1**
E.coli JJF10 1,1 ±0.2 51,2±4,7 0.4±0,1 ** 48,6*5,1 * 0.1*0,1** 12,4+1,2**
E.coli JJP160 1,2*0,2 50,0±6,5 0.7*0,2* 49,9±9,5* 0,3*0,1** 14,3*1,2**
E.coli 391 0,8±0,1 54,8±7,8 0.9*0,3* 61,5±7,6** 1,5*0,3 85,6*2,5**
E.coli OJ57.H7 (212) 1,9±0,3 79,6±5,8 1.6*0,1* 70,3±8,4** 1,3*0,1* 77,1*3,3*
Примечание: В таблице приведены средние данные 5 экспериментов * р>0,05 по отношению к показателю до воздействия НИЛИ ** р<0,05 по отношению к показателю до воздействия НИЛИ СПА- средний показатель адгезивности;
К - коэффициент эритроцитов имеющих на своей поверхности адгезирующие бактерии
Кроме того, изучено влияние НИЛИ на рецепторную активность эритроцитов (табл.11). Выявлено достоверное снижение уровня адгезии (СПА и К %) у би-фидумбактерина, лактобактерина, колибактерина, субтикола и штаммов Escherichia coli NU14, NU14/pPKL9, 407, 88, JJF10, 0157 212) ((p>0.05). Исключение составили биоспорин, ирилис, биспорин, витаспорин и ацилакт, у которых после лазерной экспозиции эритроцитов адгезивность не снижалась (р<0.05).
Таким образом, в опытах in vitro показано, что низкочастотное импульсное лазерное излучение (НИЛИ) блокировало адгезины УПБ и тем самым препятствовало их колонизации в организме. Обработка эритроцитов НИЛИ приводила к ин-гибированию рецепторов, что также выражается в снижении адгезии. УПБ оказались более чувствительны к воздействию НИЛИ, чем пробиотические культуры.
Полученные данные обосновывают возможность совместного применения НИЛ И и пробиотиков (ацилакта, биоспорина, биспорина, ирилиса, витаспорина) в комплексной коррекции дисбиотических нарушений, поскольку лазерное воздействие не оказывает влияние на специфическую активность биопрепаратов.
Завершающим этапом внедрения препарата в клиническую практику является проведение клинических исследований. Изучение безопасности, переносимости и клинической эффективности биоспорина явилось предметом нашей дальнейшей работы.
Клинические исследования биоспорина
Клинические исследования биоспорина проведены в несколько этапов, в соответствии с программами утвержденными Комитетом МИБП.
На первом этапе проведено изучение безопасности и переносимости биоспорина на здоровых добровольцах обоего пола в возрасте от 25 до 57 лет (п=21) по схеме, приведенной в табл.12.
Таблица 12
Схема проведения испытания на добровольцах
№№ Кол-во Разовая доза Кратность Длительность
группы добров. Этапы приема в сут приема в сут приема в сут
1 группа 11 1 120хЮуКОЕ 1 3
2 группа 5 1 1х10чКС)Е 2 10
3 группа 5 1 120х10уКС>Е 1 3
II 1хЮчКОЕ 2 10
Все добровольцы находились под систематическим врачебным патронажем не менее 2 мес с начала применения препарата. За весь период наблюдения ни в одном случае не появились показания к досрочному прекращению приема биоспорина.
После приема препарата все основные лабораторные, бактериологические и клинические показатели остались в пределах нормы и свидетельствовали о хорошей переносимости, безопасности и ареактогенности биоспорина для здоровых лиц. Это явилось основанием для проведения государственных испытаний его безопасности и лечебной эффективности на взрослом контингенте больных в
МНИИЭМ им.Г.Н. Габричевского, Киевском институте усовершенствования врачей и Днепропетровском научно-исследовательском институте гастроэнтерологии.
Предусматривались следующие показания для назначения биоспорина: при лечении острых желудочно-кишечных инфекций, вызываемых различными патогенными и условно-патогенными микроорганизмами (п=66); при лечении дисбак-териозов различной этиологии (п=208) и в качестве средства профилактики в очагах острых кишечных инфекций(п=661).
В испытаниях были использованы два варианта биоспорина: с большим - 1-9x109 КОЕ (В-1) и малым - 1-9x106 КОЕ (В-2) содержанием микробных клеток в дозе. В качестве препарата сравнения использовали лактобактерин.
Больные разделены на три группы и получали зашифрованный препарат по 1 дозе 2 раза в сутки в течение 10 дней. За время приема ни в одной группе не зарегистрировано ни одного случая побочных реакций, что свидетельствовало о хорошей переносимости препаратов (табл.13).
Таблица 13
Сроки исчезновения клинических симптомов у больных ОКИ на фоне
лечения пробиотиками
Используемый препарат Клинические признаки (средний показатель в днях М±т))
Исчезновение интоксикации Ликвидация болевого синдрома Нормализация стула Нормализация температуры Улучшение аппетита Элиминация возбудителя
Основная группа (В-1) 2,2±0,28 2.6±0,12 3,0+0,22 2,8±0,21 2,7±0,14 3,1*0,31
Основная группа (В-2) 2,6+0,21 3,3±0,29 3,8+0,36 2,9±0,11 2.8±0,22 3,810,17
Контрольная группа (Лактобактерин) 2,3 ±0,2 7 3,6±0,39 3,1 ±0,21 3,1±0,21 2,8±0,31 3,2+0,21
Наибольшая клиническая терапевтическая эффективность при ОКИ выявлена у биоспорина с высоким содержанием микробных клеток в одной дозе, поскольку он обеспечивал более короткие сроки исчезновения клинических симптомов (табл.13) и высокую элиминацию широкого круга патогенов (рис.8).
Рис. 8. Элиминация патогенов при лечении биоспорином и лактобактерином ОКИ
Биспорин с большим содержанием живых микробных клеток оказался также наиболее эффективным при лечении пациентов с хроническими заболеваниями органов пищеварения, осложненными дисбактериозами различной степени выраженности (рис.9).
При изучении профилактической эффективности в группе риска зашифрованные препараты применяли при санации сотрудников очистительных сооружений в периоды опасности возникновения случаев ОКИ. Среди 217 наблюдаемых, получавших лактобактерин, зарегистрировано 3 случая ОКИ (1,4 %), у 218 лиц, получавших биоспорин с малым содержанием живых микробных клеток, выявлен 1 случай ОКИ (0,4%) и не зарегистрировано ни одного случая ОКИ среди 226 человек, получавших биоспорин с большим содержанием живых микробных клеток. В контрольной группе лиц, не получавших препаратов в этот же период времени, диагностировано 9 случаев ОКИ (3,0%).
Степень дисбактериоза __В Норма П1 степень_□ II степень E3III степень □ IV степень
Рис 9. Характеристика степени выраженности дисбактериоза кишечника до и после лечения пробиотиками
Важным результатом проведенных клинических испытаний явились данные о зависимости эффективности биоспорина от количества живых микробов в дозе препарата. Установлено, что оптимальной является доза 1-9x109 КОЕ. Результаты клинических испытаний подтвердили данные, полученные in vivo на экспериментальной модели инфекции вызванной E.coli 0157:117, которые обосновывают количественные характеристики терапевтически оптимальной дозы биоспорина сухого (лиофилизата).
Положительные результаты клинической апробации биоспорина на взрослых позволили перейти к клиническим испытаниям биоспорина на детях. Испытания проведены на базе клинического отдела Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского (п=52) и Центра выхаживания недоношенных детей при Детской специализированной клинической больнице № 14 г. Киева (п=40).
Изучена лечебная эффективность биоспорина у детей в возрасте от 3-х дней до 14 лет при острых кишечных инфекциях и дисбактериозах различной степени выраженности с дисфункцией кишечника или без нее. Препарат применяли в дозе 0,5x109 КОЕ 2 раза сутки в течение 10-15 дней.
В клиническом отделе Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского под наблюдением находилось 52 ребенка: 27 больным препарат назначали для лечения ОКИ (сальмонеллеза у 6 детей; шигеллеза - у 3 детей и ПТИ - у 18 детей) и коррекции дисбактериозов - 25 пациентам. Кишечные инфекции в основном протекали с синдромами гастроэнтероколита или энтероколита, в 7 случаях диагностирован гемоколит. Среднетяжелая форма течения заболевания наблюдалась у 22 пациентов, легкая - у 5. В 3-х случаях биоспорин назначали в целях прекращения бактерионосительства патогенных микроорганизмов в связи с отсутствием эффективности предшествующей антибиотикотерапии.
У всех больных с ОКИ отмечено положительное влияние биоспорина на течение болезни: со 2-го дня приема препарата уменьшались явления интоксикации, к 3-4 дню от начала терапии нормализовался стул, к 7 - 10 сут наступала полная элиминация возбудителей.
При различных заболеваниях (атопический дерматит; синдром нарушенного кишечного всасывания; гипотрофия; цитомегаловирусная инфекция; легочный пневмоцистоз; хламидиоз), сопровождающихся дисбактериозами кишечника, эффективность коррекции оценивали по исчезновению симптомов дисфункции кишечника, уменьшению метеоризма, болей в животе, улучшению аппетита, прибавки в весе, а также нормализации кишечной микрофлоры. По окончании курса приема препарата у детей наблюдали исчезновение абдоминального синдрома, уменьшение нервозности, восстановление ночного сна, при исходном наличии диарейного синдрома - уменьшение кратности стула и исчезновение в нем патологических примесей. У детей с атопическим дерматитом в 6 из 7 случаев выявлены положительные сдвиги в течении основного заболевания по мере восстановления нормального биоценоза кишечника.
После курса лечения биоспорином степень выраженности дисбиоза уменьшилась (рис.10).
В Центре выхаживания недоношенных детей Детской специализированной клинической больницы № 14 г. Киева под наблюдением находилось 40 недоношенных новорожденных (27 девочек и 13 мальчиков), с различными формами пре-и перинатальной патологии, в возрасте от 3-х дней до 2-х мес. У всех детей наблюдались отсутствие прибавления или потери массы тела, различная степень
обезвоживания, у 32 новорожденных отмечались дисфункции ЖКТ, проявлявшиеся в виде рвоты, срыгивания, учащения и разжижения стула, появления в фекалиях слизи, зеленой окраски и др. Биоспорин применяли в дозе 0,5x109КС)Е дозы 2 раза в сутки в течение 7-10 дней.
Анализ клинического течения заболевания новорожденных с проявлениями энтероколита и дисфункцией кишечника, показал, что улучшение общего состояния детей, сопровождающееся исчезновением явлений дегидратации и интоксикации, отмечалось уже со 2-3 дня лечения биоспорином. У них улучшался аппетит, усваивалась пища, исчезали срыгивание и рвота, уже с 1- 2 дня прекращался процесс потери массы тела, а со 2 - 3 дня дети начали набирать вес. Улучшение характера стула начиналось с 3 дня, а полная его нормализация наблюдалась к 5 - 8-му дню лечения.
В подгруппе детей, получавших биоспорин в связи с выраженным дисбак-териозом без клинических проявлений дисфункции кишечника, также констатировали улучшение общего состояния. Более высокой стала ежедневная прибавка массы тела. У них за весь период наблюдения не зарегистрированы диспепсические явления, у ряда детей с аллергическим анамнезом во время приема биоспо-рина и после его окончания не появились изменения со стороны кожных покровов и слизистых. Более того, при нормализации стула значительно уменьшалась или полностью исчезала опрелость кожи.
в До лечения
— —
— _
пт
1 , ЕЕ птп
N I II III IV
Степень дисбактериоза
Рис 10. Характеристика степени выраженности дисбактериоза кишечника при разных нозологиях заболеваний ЖКТ у детей на фоне лечения биоспорином
При применении биоспорина не зарегистрировано ни одного случая побочного действия препарата, каких-либо явлений непереносимости и показаний к досрочному прекращению его приема.
Состав бактериальной флоры кишечника детей после лечения характеризовался высоким содержанием бифидобактерий (Ю9КОЕ и выше в 90%) и лактоба-цилл (108 КОЕ в 87,5%), отмечено полное исчезновение условно-патогенных энте-робактерий (только у 4 -х детей они обнаруживались в количестве 103 -Ю5КОЕ), снижение количества стафилококка (у 9 детей -103, у одного Ю4КОЕ), нормализация общего количества кишечных палочек, со снижением гемолизирующих (с 82,5 до 25%) и слабо ферментирующих (с 90% до 30%) ее форм.
При бактериологическом посеве крови и мочи в процессе лечения и после его окончания микроорганизмы рода Bacillus не выделены.
Полученные результаты свидетельствовали о высокой эффективности препарата биоспорин у новорожденных детей при лечении диспепсии и дисбак-териозов.
Результаты Государственных испытаний биоспорина сухого явились основанием для его регистрации в Российской Федерации (№ 010094) и на Украине (№ 12.22.10.93).
С целью улучшения потребительских свойств в ЦВТП была разработана новая форма препарата биоспорин в таблетках. Лабораторные исследования показали, что таблеточная форма по регламентированным показателям качества соответствовала препарату, выпускаемому во флаконах в виде лиофилизата. Для доказательства переносимости и терапевтической эффективности новой лекарственной формы проведены Государственные испытания в инфекционной клинике ЦГУ № 2 г. Екатеринбурга. Препарат в таблетках назначали в качестве средства лечения острых кишечных инфекций (дизентерии Флекснера 2а) и дисбактериозов различной этиологии, в клинических исследованиях участвовало 300 больных.
Опытная группа получала биоспорин в таблетках, контрольная первая получала биоспорин сухой (лиофилизат), вторая - традиционное антибактериальное лечение.
Исследования показали, что биоспорин в таблетках по своей клинической и микробиологической эффективности не уступает биоспорину сухому (лиофилиза-ту). Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации биоспорин в таблетках зарегистрирован и внесен в Государственный реестр лекарственных средств.
Для расширения сферы применения биоспорина с целью коррекции дисбио-за влагалища проведены исследования в поликлинике и стационаре городской больницы им. С. П. Боткина, являющейся учебно-клинической базой Российской Медицинский Академии последипломного образования.
Биоспорин назначался не только местно, но и перорально. В зависимости от способа и схемы лечения бактериального вагиноза (БВ) пациентки были разделены на 3 группы, численностью по 50 человек каждая. Первая группа больных получала только биоспорин перорально и интравагинально; вторая группа - перорально получала препарат имидозольного ряда - тиберал; третья группа - в течение 7 дней перорально получала тиберал, затем - биоспорин (перорально и интравагинально).
Использование биоспорина в качестве монотерапии БВ оказалось эффективным только в 38% случаев (отмечено уменьшение количества выделений, уменьшение симптомов воспаления влагалища и цервикального канала /р<0,05/). Монотерапия дисбиоза влагалищного биотопа тибералом была клинически эффективна в 78 % случаев (отмечено уменьшение количества выделений, уменьшение симптомов воспаления влагалища и цервикального канала /р<0,05/). Комбинированная двухэтапная схема лечения оказалась эффективной в 98 % случаев, отмечена полная нормализация клинических показателей.
Двухэтапное комбинированное лечение БВ приводило к уменьшению случаев (96 %) ближайших и отдаленных рецидивов бактериального вагиноза, а также к стойкому восстановлению индигенной микрофлоры влагалища /р<0,05/. Случаев осложнений и непереносимости биоспорина не было зарегистрировано.
При микробиологическом исследовании, проведенном на 5-6 сут после окончания лечения, в первой группе выявлено (табл.14) статистически значимое снижение уровня факультативных анаэробных бактерий - стафилококков, клебси-елл, кишечных палочек, грибов рода Candida; увеличение количества лактобацилл
/р<0,05/, отсутствие элиминации строгих анаэробов и микроаэрофилов (гардне-релл).
Таблица 14
Результаты микробиологического обследования влагалищного отделяемого пациенток (в %) через 5-6 сутки после окончания терапии_
Пока- lg Количество больных, %
Микроорганизмы затели КОЕ/ 1 группа 2 группа 3 группа
нормы, мл (Биоспорин) (Тиберал) (Тиберал+Биоспорин)
lg
КОЕ/мл
до после до после до после
Lactobaclerium отс 4 0 6 0 2 0*
spp. <3 76 0* 72 72 80 2*
3 20 2* 22 28 18 4*
>4 £4 0 98* 0 0 0 94*
Bifidobacterium отс 20 0* 22 26 18 0*
spp. <3 70 16* 68 74 72 2*
3 10 4 10 0* 8 20
>4 5>4 0 80* 0 0 2 78*
Bacteroides spp. <3 12 32 18 80* 18 54*
3 36 18* 26 14 30 38
3 £4 52 50 56 6* 52 8*
Mobiluncus spp. отс ОТС 80 84 74 98* 70 100*
>1 20 16 26 2* 30 0*
Gardnerella spp. <3 20 30 24 88* 32 64*
3 26 28 32 4* 16 26
<3 ¿4 54 ... 22* ... 44 ... ..... &* 52.. 10?.
Staphylococcus отс 90 100* 92 86 92 100*
aureus отс <3 4 - 2 2 4 -
3 - - 2 4 4 -
ы 6 - 4 8 - -
S.epidermidis отс. отс 84 100* 92 84 80 100*
<3 12 6 14 4 -
3 4 - 2 2 16
Streptococcus spp. отс. отс 90 100* 86 90 86 100*
>2 10 14 10 14 _*
Candida spp. отс отс 42 98* 46 22* 50 96*
<3 52 2* 28 38 30 4*
3 6 - 24 20 10
>4 - - 2 20* 10
Escherichia coli отс. отс 82 98* 84 98* 90 98
22 12 2* 16 2* 10 2
Klebsiella spp. отс. отс 86 92 88 98 86 96
>2 14 8 12 2 14 4
Enterobacter spp. отс. отс 92 100* 94 100 94 100
>2 8 6 - 6 -
Micrococcus spp. отс. отс 96 94 96 100 94 100
22 4 6 4 - 6 -
Примечание: в каждой группе 50 больных; отс. и «-»- отсутствуют; * разница достоверна
Во второй группе уменьшилось количество микроаэрофилов, облигатно-анаэробых бактерий и лактобактерий /р<0,05/, увеличивалось количество грибов рода Candida и золотистого стафилококка /р<0,05/. В третьей группе происходила элиминация факультативной и облигатно-анаэробной микрофлоры, микроаэрофи-лов - гарднерелл и грибов рода Candida и увеличение количества лактобацилл, что свидетельствовало о полном восстановлении эубиоза влагалищного биотопа.
Полученные данные свидетельствовали о высокой терапевтической эффективности пробиотика биоспорина как средства моно- и в комплексной терапии вульвовагинального кандидоза и бактериального вагиноза. На основании проведенных исследований разработана Инструкция по применению биоспорина в гинекологической практике, утвержденная Минздравом РФ 14.09.98 г., и получен патент РФ №2131258 на способ коррекции дисбиозов вагины с помощью биоспорина, открывший принципиально новое направление использования спорового пробиотика.
Проведенное экспериментально-клиническое изучение споровых пробиоти-ков свидетельствует об их высоком лечебно-профилактическом потенциале.
ВЫВОДЫ
1. Разработана система комплексной оценки штаммов бактерий рода Bacillus, включающая изучение биологических, физиолого-биохимических и пробиотиче-ских свойств культур, обеспечивающая выполнение требований безопасности и стандартности споровых пробиотиков.
2. Обосновано использование моделей экспериментального дисбактериоза и острой кишечной инфекции in vivo для оценки пробиотических свойств штаммов бактерий.
3. На основе комплексного изучения совокупности биологических свойств, а также селекции бесплазмидных штаммов рода Bacillus (в частности, антибиотикоустой-чивых) сконструированы комплексные препараты-пробиотики на основе штаммов, дополняющих друг друга по антагонистической активности и подобранных оптимальных соотношениях: биоспорин {Fi. sub tills 3 и B.licheniformis 31), биспорин (B.subtilis 3/Re и B.licheniformis 31/Re), ирилис (B.subtilis 07 и B.licheniformis 08),
субтикол (B.subtilis 3, B.licheniformis 31 и E.coli M-17) и монопрепарат — витаспорив (B.subtilis ИВ).
4. Выявлены преимущества по спектру антагонистической активности разработанных комплексных препаратов по сравнению с коммерческими споровыми препаратами к пробиотиками нормофлоры. Форма выпуска препарата не влияла на показатели специфической активности (антагонистическая активность, количество живых микробов в дозе), но только у пробиотических штаммов в свечевой форме статистически значимо уменьшалась адгезивность. Воздействие низко-интенсивного лазерного излучения (НИЛИ) не влияло на проявление антагонистических и адгезивных свойств споровых пробиотиков и ацилакта, при этом у бифидумбактерина и лактобактерина снижалась адгезивная активность. Полученные данные обосновывают перспективу совместного применения споровых пробиотиков и НИЛИ при лечении воспалительных процессов, сопровождающихся различными дисбиозами.
5. Доказана безопасность, переносимость и клиническая эффективность биоспори-на (лиофилизата и таблеток) при лечении ОКИ и заболеваний желудочно-кишечного тракта, осложненных дисбиозами различной этиологии, у взрослых и детей.
6. Выявлена профилактическая эффективность биоспорина в группах риска по возникновению острых кишечных инфекций.
7. Обосновано новое направление использования спорового гтробиотика-биоспорина в гинекологической практике для лечения вульвовагинального канди-доза и бактериального ваги поза.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Чупринина Р.П., Скорикова (Осипова) И.Г., Евлашкина В.Ф. Препараты для профилактики и лечения дисбактериозов различной этиологии//В монографии: «Актуальные проблемы создания и применения иммунологических препаратов для диагностики и профилактики инфекционных болезней». -Пермь. -1993. -Т.1 -С.264-279
2. Патент РФ №1722502. Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека /Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая O.A., Берилло Э.А., Скорикова (Осипова) И.Г. с соавт.//Бюл. №12(46)30.03.92
3. Патент Украины №689. Препарат бюспорин для проф!лактики та лжування шлунково-кишкових захворювань людиини /Смирнов В.В., Резшк С.Р., Сорокулова 1.Б., В'юницька В.А., Слабоспицька А.Т., Берилло Е.А., Скорикова (Осипова) 1.Г. Чаплинський В.Я., Тофан A.B./ 15.12.93. Бюл.№2
4. Созаева Л.Г., Назарова Г.К., Рябинская Г.В., Осипова И.Г. Диагностика бактериального вагиноза у больных гормоно- ассоциированными доброкачественными заболеваниями/Тр. конф. посвящ. Рогонову Б.С.: «Актуальные вопросы хирургии». Москва. -1997. -С. 170
5. Созаева Л.Г.,Осипова И.Г., Сорокулова И.Б., Саркисов С.Э. Опыт клинического применения споровых пробиотиков в лечении бактериального вагиноза // Сб.матер. научно-прак. конференции: «Перспективы использования эубиотика — Биоспорин в практике здравоохранения и военно-мед.службы», Екатеринбург, 1997.-С. 25-26
6. Созаева Л.Г., Саркисов С.Ю., Осипова И.Г. Опыт клинического применения препарата Биоспорин у больных с бак.вагинозом// там же -С. 21 -24
7. Осипова И.Г., Сорокулова И.Г., Созаева Л.Г. Некоторые аспекты механизма защитного действия споровых пробиотиков//В кн.: Современная вакципология: Тез.докл. 2-ой международ.конфер. посвящ. 100-летию Пермского НПО «Био-мед» 16-18.06.98.-Пермь.-1998. -С.144
8. Осипова И.Г., Сорокулова И.Б., Терешкина Н.В., Григорьева Л.В.Изучение безопасности бактерий рода Bacillus, составляющих основу некоторых пробиотиков// Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии.- 1998. - №6. -С.68-70
9. Патент РФ №2131258. Способ коррекции микрофлоры вагины/ Смирнов В.В., Сорокулова И.Б., Осипова И.Г., Созаева Л.Г., Саркисов С.Э.// 10.05.99 Бюл.№16
10. Патент РФ №2129432. Биопрепарат-субтикол для профилактики и лечения инфекционных болезней/Смирнов В.В., Сорокулова И.Б., Осипова И.Г.// 27.04.99 Бюл.№12
11. Осипова И.Г., Сорокулова И.Б., Евлашкина В.Ф., Чупринина Р.П. Изучение клинической эффективности пробиотика - Биоспорин при лечении ОКИ //Тезисы международного конгресса «Аптека-2000».- М. -2000. -С.56
12. Осипова И.Г., Сорокулова И.Б., Евлашкина В.Ф., Чупринина Р.П. Изучение клинической эффективности пробиотика - Биоспорин при лечении дисбактериозов различной этиологии //там же -С.57
13.Созаева Л.Г., Саркисов С.Э., Осипова И.Г., Сорокулова И.Б. Изучение эффективности Биоспорина в гинекологической практике при лечении вульвоваги-нального кандидоза//там же -С.64
14. Осипова И.Г., Евлашкина В.Ф.,Чуггринина р.П. Изучение профилактической эффективности Биоспорина//Сб.ст.: «Клинико-фармацевтические формуляры в стационаре и поликлинике» (10-11 октября 2000 г). - Самара, 2000. -С. 17-18
15.Созаева Л.Г., Осипова И.Г, Сорокулова И.Б. Применение Биоспорина для коррекции дисбиоза влагалища //там же - С. 18-19
16. Горбунов С.Г., Осипова И.Г., Созаева Л.Г., Васильева Е.А., Чумаева Т.В. Био-спорин - новый пробиотик для профилактики послеоперационных гнойно-септических осложнений в гинекологической практике. В кн. «Инфекционные болезни. Диагностика, лечение, профилактика». /Труды VI Российско-итальянской научной конференции. С-Пб.- 2000- С. 14-16.
17. Поспелова В.В., Осипова И.Г., Дарсания М.Ш., Ханина Г.И. Экспериментальное обоснование разработки пробиотика «Бифидин сухой» с использованием обезьян для оценки его эффективности.//Материалы Российской конф.: Организм и окружающая среда: жизнеобеспечение и защита человека в экстремальных условиях. (Москва, 26-29 сентября 2000 г}- М., - 2000. -Т.Н. -С.28-260
18.Ватанабэ X., Осипова И.Г., Чеснокова B.JL, Васильева Е.А., Кравцов Э.Г., Евлашкина В.Ф., Чупринина Р.П., Шобухова Т.С., Колганова Т.В., Абрикосова Н.Ю. Некоторые аспекты взаимодействия пробиотиков с веротоксин-продуцирующими Escherichia coli 0157:117 //Сб.тр.: Биомедицинские технологии. Вып. 13, -М. -2000. -С.69-76
19. Осипова И.Г., Созаева Л.Г., Евлашкина В.Ф., Васильева Е.А., Колганова Т.В., Чумаева Т.В., Лукьянова О.Ю., Медведева Е.А. Адгезивная активность пробиотиков, применяемых в гинекологической практике.// Сб.тр.: Биомедицинские технологии. Вып. 16, - М. -2001. -С. 19-23
20. Колганова Т.В., Ватанабэ X., Далин М.В., Васильева Е.А., Осипова И.Г., Лившиц В.А., Лукьянова О.Ю., Евлашкина В.Ф. К вопросу о механизме защитного действия пробиотиков. .// Сб.тр.: Биомедицинские технологии. Вып. 16, - М. -
2001. - С.23-29
21.Н.М.Подзолкова, Л.Г.Созаева, М.М.Дамиров, И.Г.Осипова Эффективность бе-тадина в комплексном лечении больных бактериальным вагинозом//Журн. Акушерство и гинекология. -2001.-№6. - С.50-51.
22. Патент РФ №2177152 Способ контроля антагонистической активности препаратов для лечения и профилактики дисбактериозов / Несчисляев В.А., Арчакова Е.Г., Чистохина Л.П., Фадеева И.В., Чупринина Р.П., Осипова И.Г., Евлашкина В.Ф.//20.12.2001 Бюл.№35
23.Колгана Т.В., Джарадат Т., Ермолаев А.В., Осипов И.Г. , Далин В.М., Васильева Е.А.. К вопросу о комплексном воздействии импульсного инфракрасного лазерного излучения и аспарагиназы на штаммы E.coli, выделенные при заболеваниях мочеполовой системы//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,
2002, №6, т. 133, С. 681-683.
24. Колгана Т.В., Джарадат Т., Ермолаев А.В., Осипова И.Г., Васильева Е.А.. К вопросу о комплексном воздействии импульсного инфракрасного лазерного излучения и полифенолоксидазы на адгезивную способность штаммов E.coli, выде-
ленных при заболеваниях мочеполовой системы//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2002, № 7, т. 134, С. 190-192
25.0сипова И.Г., Терешкина Н.В., Григорьева Л.В., Евлашкина В.Ф., Лукьянова О.Ю., Поспелова В.В., Лянная A.M., Левченко Т.А., Васильева Е.А. Изучение безопасности бифидобактерий, составляющих основу некоторых пробиоти-ков//Сб.матер. международной научно-практической конференции памяти Г.И.Гончаровой: «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования». М. -2002. -С. 16-17
26. Сорокулова И.Б., Осипова И.Г., Смирнов В.В., Васильева Е.А. Разработка методов генетического типирования бацилл-пробиотиков// там же - С.21-22
27.Чумаева Т.В., Осипова И.Г., Васильева Е.А., Колганова Т.В., Золотарева О.В., Саркисов С.Э. Изучение адгезивной активности пробиотиков различных лекарственных форм, применяемых в гинекологической практике// там же -С.24
28. Колганова Т.В., Джарадат Т., Чумаева Т.В., Осипова И.Г., Васильева Е.А., Лукьянова О.Ю., Буданова Е.В., Золотарева О.В., Кульчицкая М.А. К вопросу о воздействии лазерного излучения и пробиотиков на штаммы E.coli, выделенные от людей с заболеваниями мочевыделительной системы // там же -С.25
29. Патент РФ №2181596 .Лекарственный препарат из бактерий рода Bacillus /Байгузина Ф.А., Алсынбаев М.М., Штроман Г.А., Кулагин В.Ф., Осипова И.Г., Байгузина С.Н.// 27.04.2002 Бюл. № 12
30. Патент РФ №2225214. Способ профилактики и лечения геморрагического энтероколита бактерийными препаратами - пробиотиками/Далин В.М., Осипова И.Г., Васильева Е.А., Кравцов Э.Г, Колганова Т.В., Чеснокова В.Л.// 27.06.2002 Бюл.№18
31. Патент РФ №2219238. Штаммы бактерий B.subtilis и B.licheniformis, используемые для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиозов и биопрепарат Биспорин для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиозов/Сорокулова И.Б., Смирнов В.В., Осипова И.Г., Прудников А.О.//' 20.12.2003 Бюл.№35
32. Осипова И.Г., Михайлова H.A., Сорокулова И.Б., Васильева Е.А., Гайдеров A.A. Споровые пробиотики// Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии. - 2003. -№3.- С.113-119
33.Чумаева Т.В., Осипова И.Г., Васильева Е.А., Колганова Т.В., Золотарева О.В., Саркисов С.Э. Изучение адгезивной активности пробиотиков различных лекарственных форм, применяемых в гинекологической практике//"Биомедицинские технологии", Вып. 19.- М.- 2002.- с. 100-104
34. Чумаева Т.В., Осипова И.Г., Васильева Е.А., Колганова Т.В., Золотарева О.В., Евлашкина В.Ф. Сопоставление эффективности различных лекарственных форм пробиотиков, используемых в акушерско-гинекологической практике, по степени антагонистической и адгезивной активности//"Биопрепараты" №1(9), март.-2003-С. 17-20
35. Осипова И.Г., Колганова Т.В., Васильева Е.А., Чумаева Т.В., Евлашкина В.Ф. К вопросу о комплексном воздействии импульсного инфракрасного лазерного излучения и пробиотиков на штаммы Escherichia coli, выделенные от людей с заболеваниями мочевыделительной системы//в кн.: Актуальные вопросы вакцин-но-сывороточного дела в XX веке: Матер. Всерос. конф. - Пермь, 2003. - С.293-297
36. Гатауллин А.Г., Гайдеров А.А., Михайлова Н.А., Осипова И.Г., Романенко Э.Е. Биологические свойства штаммов Bacillus subtilis различного происхождения// там же - С.329-332
37. Чупринина Р.П., Осипова И.Г., Евлашкина В.Ф., Ладыгина А.В. Доклинические испытания новых пробиотиков//В кн.: Пробиотики, пребиотики, синбиоти-ки и функциональные продукты питания: Матер.междунар.конф. - Москва,
2004.-С. 10
38.Гайдеров А.А., Гатауллин А. Г., Васильева Е. А., Михайлова Н.А., Осипова И.Г. Изучение воздействия препаратов пробиотиков на макрофагальное звено неспецифического иммунитета.//там же С. 21
39. Сорокулова И.Г., Осипова И.Г., Пинчук И.В., Урдачи М.. Изучение безопасности пробиотических штаммов бацилл// там же С.55
40. Поспелова В. В., Семенихина В.Ф., Сундукова М.Б., Осипова И.Г. и др. Результаты доклинического изучения пробиотика "Бифидин"// там же. —С.110
41.Чумаева Т.В., Золотарева О.В., Васильева Е.А., Осипова И. Г. Обоснование применения пробиотиков в составе различных схем лечения для коррекции дис-биозов влагалища у беременных// там же.- С. 207
42. Осипова И.Г., Терешкина Н.В., Евлашкина В.Ф., Васильева Е.А., Кульчицкая М.А., Лукьянова О.Ю. Изучение безопасности производственных штаммов, составляющих основу Окарина и Колибактерина// там же - С. 209
43. Осипова И.Г., Васильева Е.А., Евлашкина В.Ф., Буданова Е.В.Корригирующее действие пробиотиков при экспериментальном геморрагическом колите, вызванном Escherichia coli 0157.Н7/ там же - С. 211
44,Осшхова ИХ,, Евлашкина В.Ф., Васильева Е.А. Классификация пробиотиков, достоинства и недостатки//Материалы 3-го конгресса педиатров-инфекционистов России: Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей. Инфекция и иммунитет. Москва 8-10.12.2004.,-С.247
45. Арзуманян В.Г., Михайлова Н.А., Гайдеров А.А., Баснакьян И.А., Осипова И.Г Количественный способ оценки отсроченного антагонизма пробиотических культур против оппортунических дрожжей// Ж. клинич. лаб. диагностика, №5,
2005.- С.53-54
46. Патент РФ №2247570. Способ оценки специфической активности препаратов пробиотиков различных лекарственных форм и производственных штаммов по уровню их адгезивной активности/ Осипова И.Г., Чумаева Т.В., Васильева Е.А., Далин М.В., Евлашкина В.Ф., Золотарева О.В.// 10.03.2005.- Бюл.№7
47. Осипова И.Г., Васильева Е.А., Евлашкина В.Ф. Дисбиозы кишечни-ка//Методические рекомендации. М.: Изд. РУДН, 2005. - 44 с.
48. Осипова И.Г., Сорокулова И.Б., Васильева Е.А., Буданова Е.В. Доклинические испытания новых споровых пробиотиков//Вестн.РАМН №12,2005.- с.36-39
49. Патент РФ №2264453. Биопрепарат Ирилис ветеринарного назначения /Сорокулова И.Б., Осипова И.Г., Васильева Е.А., Евлашкина В.Ф., Остроумов Ю.И., Доронин А.Н.//20.11.2005. Бюл. № 32
50. Патент РФ №2264454. Биопрепарат Ирилис на основе бактерий рода Bacillus для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиоза различной этиологии и штаммы бактерий B.subtilis и B.licheniformis, используемые для изготовления биопрепарата/Сорокулова И.Б., Осипова И.Г., Васильева Е.А. Терешкина Н.В., Саркисов С.Э.// 20.11.2005. - Бюл. № 32
51.Сорокулова И.Б., Осипова И.Г., Терешкина Н.В., Васильева Е.А., Буданова Е.В. Изучение безопасности бацилл-пробиотиков// Вестн.РАМН №1, 2006.- С. 50-54
СОКРАЩЕННЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ
БВ - бактериальный вагиноз ВВК - вульвовагинальный кандидоз ЖКТ - желудочно-кишечный тракт
ЗФР - забуференный фосфатами физиологический раствор м.д. -доза для мышей
НИЛИ - низкоинтенсивное импульсное лазерное излучение ИАМ - индекс адгезивности микроорганизма КР - колонизационная резистентность КОЕ - колониеобразующая единица
К - коэффициент, процент эритроцитов, имеющих на своей поверхности прилипшие микробы
НД - нормативная документация
ОКИ - острые кишечные инфекции
ПБ - пробиотики
ч.д. -доза для человека
СПА - средний показатель адгезии
УПМ/УПБ - условно-патогенные микроорганизмы/бактерии
ФС - фармакопейная статья
ФСП- фармакопейная статья предприятия
ОСИПОВА Ирина Григорьевна (Россия). Экспериментально-клиническое изучение споровых пробиотиков.
Диссертация посвящена вопросам разработки принципиально новых комплексных пробиотиков на основе аэробных спорообразующих бактерий рода Bacillus. Теоретически обоснованы и практически реализованы подходы к созданию комплексных биопрепаратов с широким спектром действия.
На основе аэробных спорообразующих бактерий р.Bacillus разработаны споровые пробио-тики - биоспорин, витаспорин, биспорин, субтикол, ирилис для лечения и профилактики инфекционных заболеваний человека. Проведены широкомасштабные исследования по изучению биологических свойств и безопасности отобранных штаммов in vitro и in vivo. Разработаны критерии отбора производственных штаммов. На экспериментальных моделях in vivo отработаны дозы и схемы изучения эффективности пробиотиков. Продемонстрировано преимущество комплексных препаратов (биоспорин, биспорин, субтикол, ирилис) перед монопрепаратами (витаспорин, бактисубтил), обусловленное подбором про-биотических штаммов, дополняющих друг друга по физиолого-биохимическим свойствам и спектру антагонистической активности. Новые препараты отличаются от коммерческих зарубежных пробиотиков (бактисубтила и энтерогермина) широким спектром антагонистической активности и высокой степенью безопасности.
Изучена безопасность, переносимость и клиническая эффективность биоспорина в медицинских учреждениях Москвы, Киева, Днепропетровска и Екатеринбурга на разных кон-тингентах больных. Отмечена его хорошая переносимость и высокая лечебная эффективность при лечении ОКИ, дисбактериозов различной этиологии, бактериальных вагинозов и вульвовагинальных кавдидозов. В настоящее время биоспорин зарегистрирован в России и на Украине, утверждена вся необходимая нормативная документация. Промышленный выпуск биоспорина осуществляется ЦВТП БЗ МО РФ (г.Екатеринбург, Россия) и ОАО «Днепрофарм» (г.Днепропетровск, Украина).
Ключевые слова: аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus, пробиотические штаммы, споровые пробиотики, безопасность.
OSIPOVA I.G. (Russia). Experimental-clinical study of spore probiotics
The dissertation is dedicated to the problem of development of principally new complex probotics based on aerobe spore-forming bacteria of the Bacillus genus. Approaches fundamentally to creation of complex biopreparates with a wide spectrum of effectiveness have been theoretically based and implemented in practice. Spore probiotics biosporin, vitasporin, bisporin, subticol, irilis for the treatment and prevention of infectious diseases of humans have been developed on the base of aerobe spore-forming bacteria of the Bacillus genus. Wide-scale research of biological characteristics and safety of selected strains has been done. Criteria for selection of the strains for production purposes have been developed. Dose and schemes of the efficacy of probiotics have been studied on experimental models in vivo. The advantages of complex probiotics in comparison with monopreparations (vitasporin, bactisubtil) have been demonstrated. These advantages are based on the fact that the strains included in complex preparations supplement each other by physiological, biochemical features and spectrum of antagonistic activity.
The new preparations have advantages in comparison with commercially produced foreign probiotics - bactisubtil and enterogermina - by their wider spectrum of antagonistic activity. Safety and clinical efficacy of biosporin have been studied in hospitals of Moscow, Kiev, Dnepropetrovsk and Ekatherinburg on different contingents of patients. Biosporin was highly effective for the treatment of acute enteric infection, disbiosis of different etiologies, bacterial vaginosis and candidiasis of vagina . By now biosporin has been reqistered in Russia and Ukraine. All the necessary documentation has been approved. Biosporin is now produced in Ekatherinburg (Russian) and Dnepropetrovsk (Ukraine).
Key words: aerob spore-forming bacteria of the Bacillus genus, probiotic strains, spore probiotics, safety.
Осипова И.Г.
Экспериментально-клиническое изучение споровых пробиотиков, 2006 г ООО «Бизнес Креатив»,
105064, Москва, Гороховский пер., 4, 2006—тираж 50экз.,48с
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Осипова, Ирина Григорьевна
ВВЕДЕНИЕ
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. НОРМАЛЬНАЯ МИКРОФЛОРА
1.1. Микрофлора кишечника и ее роль в обеспечении состояния здоровья 16 организма хозяин
1.1.1. Бактерии рода Bacillus как компоненты нормальной микрофлоры
1.1.2. Нарушения колонизационной резистентности - дисбиозы. Модели 33 дисбактериозов
1.2. Колонизационная резистентность вагинального биотопа и ее механиз- 43 мы
1.2.1. Дисбиоз влагалищного биотопа
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ ПРОБИОТИКОВ
2.1. Композиционный состав пробиотиков
2.2. Пробиотики на основе бактерий рода Bacillus
2.3. Критерии отбора культур в состав пробиотиков
ГЛАВА 3. МЕХАНИЗМЫ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ 61 ПРЕПАРАТОВ ПРОБИОТИКОВ
ЧАСТЬ И. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1.1. Материалы
1.2. Методы
1.2.1. Исследование культурально-биохимических свойств бакте- 72 рий р.Bacillus
1.2.2. Исследование культурально-биохимических свойств микроорганиз
1.2.2.1. Микробиологическое исследование вагинального биотопа
1.2.3. Микроскопический метод исследования вагинальных мазков 74 1.2. 4. Определение адгезивной активности 75 1.2. 4.1. Метод определения адгезии микробов к эритроцитам
1.2.4.2. Метод определения адгезии микробов к эпителиальным 76 клеткам кишечника крыс или мышей
1.2.4.3. Определение уровня адгезивной активности штаммов пробиоти- 78 ков на модели эпителиальных клеток влагалища человека
1.2.5. Определение чувствительности штаммов к антибиотикам
1. 2.6. Определение антагонистической активности 79 1.2.6.1. Определение антагонистической активности пробиотиков в отно- 79 шение к клиническим штаммам УПМ
1.2.7. Определение устойчивости бактерий к действию биологических 80 жидкостей
1.2.8. Обработка НИЛИ
1.2.9. Моделирование дисбактериоза у животных
1.2.10. Методы изучения безопасности 82 1.2.10.1. Изучение острой и хронической токсичности
1.2.10.2. Изучение безвредности
1.2.10.3. Изучение вирулентности
1.2.10.4. Изучение токсичности
1.2.10.5. Изучение токсигенности
1.2.10.6. Изучение дермонекротических свойств
1.2.10.7. Определение влияния споросодержащих препаратов на детокси- 85 цирующую функцию печени («гексеналовая проба»)
1.2.11. Оценка персистирования штаммов рода Bacillus в желудочно- 86 кишечном тракте мышей
1.2.12. Методы статистической обработки результатов исследований
ГЛАВА 2. МОДЕЛЬ ДЛЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ ШТАММОВ
2.1. Моделирование дисбактсриоза на мышах 87 2.1 Л. Влияние доксициклина на фекальную микрофлору мышей
2.1.2. Влияние ампиокса на состав фекальной микрофлоры
2.1.3. Изучение адгезивной активности УПБ при экспериментальном дис- 91 бактериозе
2.1.4. Изучение транслокации УПБ при экспериментальном дисбактериозе
2.1.5. Использование пробиотиков для коррегирования дисбиоза
2.2. Моделирование инфекционного процесса вызванного E.coli 0157. Н7 96 2.2.1. Использование пробиотиков для профилактики и лечения инфекции, 99 вызванной E.coli 0157:Н
ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА КРИТЕРИЕВ ОТБОРА ШТАММОВ
3.1. Изучение безопасности штаммов бактерий рода Bacillus в опытах на 105 лабораторных животных
3.2. Изучение биологических свойств штаммов пробиотиков в опытах 114 in vitro и in vivo
ГЛАВА 4. КОНСТРУИРОВАНИЕ КОМПЛЕКСНЫХ ПРОБИОТИКОВ
4.1. Биоспорин
4.2. Витаспорин
4.3. Биспорин
4.4. Субтикол
4.5. Ирилис
4.6. Сравнительное изучение новых споровых пробиотиков с другими 142 коммерческими препаратами на основе бацилл
4.7. Использование пробиотиков для коррекции дисбиоза
4.8. Использование споровых пробиотиков для профилактики и лечения 146 инфекции, вызванной Е.соИ 0157:Н
ГЛАВА 5. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ 150 РАЗЛИЧНЫХ ПРОБИОТИКОВ
5.1. Изучение антагонистической активности различных лекарственных 150 форм пробиотиков
5.2. Адгезивная активность различных лекарственных форм пробиотиков
5.3. Изучение влияния низкочастотного инфракрасного лазерного излуче- 156 ния (НИЛИ) на специфическую активность пробиотиков
5.3.1. Влияние НИЛИ на жизнеспособность бактерий
5.3.2. Воздействие НИЛИ на антагонистическую активность пробиотиков
5.3.3. Воздействие НИЛИ на уровень адгезии пробиотиков и патогенных 160 E.coli
ГЛАВА 6. КЛИНИЧЕСКАЯ АПРАБАЦИЯ БИОСПОРИНА
6.1. Испытание безопасности и переносимости биоспорина на доброволь- 165 цах
6.2. Государственные испытания безопасности, переносимости и клиниче- 168 ской эффективности биоспорина сухого
6.2.1. Результаты испытания безопасности, переносимости и клинической 169 эффективности биоспорина при ОКИ на ограниченном контингенте больных взрослых
6.2.2. Результаты испытания клинической эффективности биоспорина при 172 лечении дисбактериозов различной этиологии па взрослых больных
6.2.3. Изучение клинической эффективности препарата на детях
6.3. Изучение профилактической эффективности биоспорина сухого
6.4. Изучение клинической эффективности препарата биоспорин, таблетки 189 при лечении ОКИ и дисбактериозов
6.5. Расширение сферы применения биоспорина. Клиническая эффектив- 199 ность биоспорина при лечении бактериального вагиноза
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспериментально-клиническое изучение споровых пробиотиков"
Проблема профилактики и коррекции дисбактериозов приобретает в последнее время все большее значение, поэтому является актуальным расширение номенклатуры средств восстанавливающих нормальную микрофлору организма, человека [4; 288; 336]. Для нормализации нарушенного микробиоценоза в практике здравоохранения все более широко применяются биопрепараты-пробиотики, изготовленные на основе микроорганизмов [29; 61; 122; 165; 247]. По данным ряда исследователей эффективность бактерийных препаратов определяется биологическими свойствами входящих в них штаммов [29; 41; 46; 138; 438; 469; 480]. При разработке пробиотиков нового поколения в качестве перспективных рассматривают препараты на основе спо-рообразующих бактерий рода Bacillus различных видов. А также комплексные про-биотики, сочетающие бактерии разных родов, характеризующихся взаимодополняющим спектром антагонистической активности и адгезивпости, и препараты для коррекции дисбиотических нарушений не только кишечного, но и влагалищного биотопов [148; 153; 154/ 305].
Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus широко распространены в окружающей среде [11; 13; 62; 72; 80; 95]. Бактерии рода Bacillus являются одним из основных компонентов микрофлоры почв, воды, воздуха, и человек в процессе жизнедеятельности постоянно контактирует с ними [192; 271; 313]. Бациллы характеризуются рядом свойств, обусловливающих их несомненное преимущество перед другими микроорганизмами, используемыми в качестве основы пробиотиков [225; 236; 448]. Они (кроме B.anthracis и B.cereus) безвредны для макроорганизма и характеризуются антагонистическими свойствами, спектр которых у различных штаммов может значительно отличаться [246; 301; 367; 443]. Это позволяет создавать комплексные препараты на основе отобранных культур, дополняющих друг друга по своим антимикробным свойствам.
В медицинской практике различных стран уже несколько десятилетий применяются биопрепараты на основе бактерий рода Bacillus [181; 182; 191; 486; 490]. В странах Западной Европы широкое распространение получил пробиотик бактисубтил фирма "Marion Merrell» /Франция/) и его аналог флонивин БС (фирма "Galenika" /Югославия/). Основу этих препаратов составляет штамм B.cereus IP 5832 из коллекции Института Пастера (Париж). Известен также биопрепарат цереобиоген ("Xing Лап", Китай), действующее начало которого - штамм B.cereus DM-42S. Вьетнамский препарат биосубтил в качестве активного компонента содержит штамм B.subtilis. Препарат энтерогермин (фирма "Sanofi Winthrop", Италия) состоит из четырех штаммов B.clausii Т, N/K, О/С и SIN, устойчивых к различным антибиотикам.
Несмотря на длительный опыт применения споровых пробиотиков в мировой практике здравоохранения (Франция, Югославия, Китай, Япония), в России долгое время велась дискуссия о безопасности и возможности широкого применения таких препаратов. В настоящее время вопрос безопасности пробиотиков созданных даже на основе представителей нормофлоры стоит особенно остро. Описаны случаи инфекционных осложнений, вызываемых такими культурами, которые имеют статус GRAS (generally recognized as safe) - лактобациллами [453] и бифидобактериями [287]. Имеются сведения о регистрации у новорожденных бактериемии, вызванной бифидобактериями и лактобактериями [27]. В связи с этим вопросам комплексной оценки безопасности штаммов, предназначенных для бактериотерапии, должно уделяться особые значения. Анализ материалов доклинических исследований пробиотиков, давно используемых в практике здравоохранения, показал отсутствие стандартных критериев безопасности пробиотиков.
В нашей стране при отборе штаммов — кандидатов в пробиотики основное внимание уделяют спектру и выраженности их антагонистической активности, а также технологичности при производстве препаратов. Подобная характеристика является недостаточной, т.к. она не раскрывает механизма воздействия пробиотика, его взаимодействие с макроорганизмом и другими видами бактерий [29; 122; 124; 168]. Отсутствие достаточно полных данных о взаимоотношениях между пробиотическими и условно-патогенными бактериями приводит порой к необоснованному назначению тех или иных лечебных препаратов и, как следствие этого, отсутствию положительного эффекта. Кроме того, не разработаны единые принципы отбора новых перспективных штаммов для изготовления пробиотиков, а также для контроля производственных штаммов; требуют совершенствования методы и критерии оценки биологических свойств, обеспечивающих безопасность и лечебную эффективность препарата, полученного на основе изучаемых штаммов. Биопрепараты должны быть стандартными и стабильными, соответствовать требованиям ФСП в течение всего срока годности. Для обеспечения соответствующего качества препаратов необходима эффективная стандартная промышленная технология, отвечающая требованиям GMP, адекватные методы контроля качества, удобная и эффективная лекарственная форма, надежная упаковка, регламентированные условия хранения.
Следовательно, для отбора пробиотических культур необходимо проведение многосторонних исследований безопасности, изучение биологических свойств in vitro и in vivo, ассоциированных с колонизационной активностью: адгезией, спектром антагонистической активности, чувствительности к бактерицидному действию биологических жидкостей и химиотерапевтических препаратов.
Цель настоящего исследования - разработка критериев безопасности споровых бактерий рода Bacillus в экспериментах in vitro и in vivo и обоснование принципов конструирования комплексных споровых пробиотиков и системы контроля их качества, обеспечивающих безопасность и клиническую эффективность бактерийных препаратов.
Основные задачи исследования:
1. Разработать комплексные подходы оценки пробиотической активности штаммов бактерий рода Bacillus, включающие тесты in vitro и in vivo на экспериментальных моделях дисбактериоза кишечника и острого инфекционного процесса.
2. С учетом биологических особенностей пробиотической активности отобранных штаммов бацилл сконструировать новые комплексные споровые пробиоти-ки.
3. Провести сравнительный анализ специфической активности споровых пробиотиков с коммерческими лакто- и бифидосодержащими биопрепаратами, а также оценить ее изменение под влиянием физических факторов, в частности низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ).
4. На примере комплексного пробиотического препарата оценить терапевтическую и профилактическую эффективность его различных лекарственных форм био-спорина на взрослых и детях при дисбиозах различной локализации.
Научная новизна
Впервые обоснована целесообразность комплексного изучения биологических свойств и антагонистической активности штаммов бактерий рода Bacillus на моделях in vitro и in vivo при разработке препаратов на их основе.
Критериями отбора пробиотических штаммов бацилл являются:
- отсутствие гемолитической, лецитиназной, гиалуронидазной активностей;
- антибиотикоустойчивость хромосомной природы или отсутствие плазмид, обеспечивающих ее;
- устойчивость к антибактериальному действию желудочного сока и желчи;
- антагонистическая активность по отношению к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов, выделенных от больных с дисбиоза-ми различной локализации;
- отсутствие или низкий уровень адгезии и способности к персистентности;
- безопасность (включающая изучение общей, «острой» и «хронической» токсичности, токсигенности, вирулентности, угнетение антитоксической функции печени, отсутствие дермонекротического эффекта); биологическая совместимость штаммов при разработке комплексных препаратов; оценка протективных пробиотических свойств на экспериментальных моделях дисбактериоза, индуцированного введением антибиотиков, и острой инфекции, вызванной E.coli 0157:Н7.
Впервые на основе аэробных спорообразующих бактерий р.Bacillus сконструированы новые споровые пробиотики - биоспорин (B.subtilis 3 и B.licheniformis 31), ви-таспорин (B.subtilis IIB), ирилис (B.subtilis 07 и B.licheniformis 09) и субтикол (B.subtilis 3, B.licheniformis 31 и E.coli М-17). По признаку антибиотикоустойчивости проведена селекция штаммов (B.subtilis 3 и B.licheniformis 31) и разработан комплексный препарат - биспорин (B.subtilis 3/Re и B.licheniformis 31/Re). Новые комплексные препараты обладали более широким спектром антагонистической активности по сравнению с коммерческими препаратами: бактисубтилом, энтерогермином, ацилак-том, лактобактерином, бифидумбактерином, энтеролом.
Продемонстрировано преимущество комплексных препаратов (биоспорин, биспорин, ирилис, субтикол) перед монопрепаратами за счет проявления синергиче-ской антагонистической антимикробной активности.
Впервые установлено, что антагонистическая активность споровых комплексных пробиотиков превосходит таковую коммерческих препаратов из нормофлоры. Установлено отсутствие влияния низко-интенсивного лазерного излучения (НИЛИ) на споровые бактерии и его воздействие на уровень адгезивной активности. Показано, что НИЛИ статистически значимо снижает уровень адгезивной активности би-фидумбактерина и лактобактерина.
Сравнительное изучение специфической активности споровых пробиотиков и пробиотиков нормофлоры показало, что различные формы одного и того же пробио-тика не отличаются по антагонистическим свойствам, тогда как уровень адгезивной активности препаратов в свечевых формах снижается вследствие экранирования рецепторов макроорганизма и адгезинов микробных клеток жировыми основами.
Установлено, что разработанный пробиотик биоспорин в разных лекарственных формах обладает высокой терапевтической и профилактической эффективностью при дисбиозах различной локализации.
Научная новизна работы подтверждена 11 патентами.
Теоретическое и практическое значение работы
В практику здравоохранения России и Украины внедрен споровый пробиотик биоспорин (приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации N353 от 29.12.92 г. и Украины N219 от 22.10.93 г.), он внесен в Государственный реестр лекарственных средств под № 92/353/16 (патенты РФ № 1722502 и Украины № 689), зарегистрирован в Российской Федерации (регистрационное удостоверение № 010094) и на Украине (№ 12.22.10.93). Расширена сфера применения биоспорина в гинекологии (патент РФ №2131258 и инструкция по применению).
Результаты научной работы нашли свое отражение в комплекте нормативной и научной документации: на биоспорин утверждены Фармакопейные статьи в Российской Федерации (ФС 42-3476-98 и ФСП 42-03703278-02) и на Украине (ФС 42У-200/8-142-97), инструкции по применению и регламенты производства (ЭРП №58096).
В настоящее время промышленное производство биоспорина осуществляется в России - Центром военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ (ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ, г.Екатеринбург), а на Украине ОАО "Днепрофарм". За время выпуска препарата не зарегистрированы случаи производственного брака, рекламаций не поступало.
Для производства споровых пробиотиков медицинского назначения селекционированы штаммы B.subtilis 3, 3/Re (ГКПМШ63), 11В (ВКМВ-2218Д), 07 (ВКПМ В-8611) и B.licheniformis 31, 31/Re (ГКПМ№263), 09 (ВКПМВ-8610), депонированные во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К.Скрябина и в коллекции микроорганизмов ГИСК им.Л.А.Тарасевича.
Положения, выносимые на защиту
Использование комплексной оценки пробиотических свойств штаммов in vitro и in vivo позволяет обеспечить требования безопасности, предъявляемые к препаратам на основе бактерий рода Bacillus.
Антагонистическую активность штаммов бацилл и пробиотических препаратов необходимо изучать как in vitro, так и in vivo на моделях экспериментального дисбактериоза и острой инфекции.
Разработанные комплексные пробиотики превосходят препараты нормофлоры по антагонистической активности. На них не оказывает отрицательного влияния низкоинтепсивное лазерное излучение (НИЛИ).
Разработанный пробиотик биоспорин, в различных лекарственных формах, обладает высокой терапевтической и профилактической эффективностью при ОКИ и дисбиозах различной локализации у детей и взрослых.
Личный вклад соискателя
Автору принадлежат: разработка концепции и направления исследований, непосредственное осуществление экспериментальных исследований, анализ и теоретическое обобщение полученных данных, формулирование выводов. В работе использованы материалы, полученные в основном лично автором, а также в соавторстве с сотрудниками следующих организаций: Институтом микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного HAH Украины, ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН, РУДН, РМАПДО, НПО «Биомед» г.Пермь, ДП «Биофаг» ГУП «Иммупопрепарат», ММ А им. Сеченова.
В выполнении отдельных этапов работы принимали участие следующие научные сотрудники: д.б.н. Сорокулова И.Б., д.м.н., профессор Саркисов С.Э., к.м.н. Григорьева Л.В., к.м.н. Терешкина Н.В., к.м.н. Созаева Л.Г., н.с. Евлашкина В.Ф., к.м.н. Васильева Е.А., к.м.н. Буданова Е.В., н.с. Лукьянова O.IO, аспиранты Колганова Т.В., Тауфик Джарадат, Чумаева Т.В. и Гайдеров A.A. Автор выражает глубокую благодарность руководителю лаборатории д.м.н. Чуприниной Р.П. и всем сотрудникам лаборатории бактерийных вакцин и вивария ГИСК им.Л.А.Тарасевича за неоценимую помощь в выполнении данной работы. Всех соавторов настоящих исследований автор искренне благодарит. Особая благодарность д.м.н., проф. Бектимирову Т.А. и к.м.н. Озерецковскому H.A.
Апробация работы и публикации
Основные результаты проведенных исследований были доложены на научно-практической конференции «Перспективы использования эубиотика «Биоспорин» в практике здравоохранения и военно-медицинской службы» (Екатеринбург, 1997); 2-ой международной конференции, посвященной 100-летию Пермского НПО «Биомед» (Пермь, 1998); международном конгрессе «Аптека-2000» (Москва, 2000), VI Российско-итальянской научной конференции (Санкт-Петербург, 2000); научнопрактических конференциях НПО «Биомедицинские технологии» (Москва, 2000; 2002; 2003); Международной научно-практической конференции памяти Г.И.Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002); Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», посвященной 105-летию Пермского НПО «Биомед» (Пермь, 2003); Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, симбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2004); Международной конференции «Пробиотики, новая эпоха» (Нью-Йорк, 2004); 4-ом Съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2004); III конгрессе педиатров- инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей. Инфекция и иммунитет» (Москва, 2004); V съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2005); IV конгрессе детских инфекционистов России (Москва, 2005).
Диссертация апробирована и рекомендована к защите на заседании Ученого совета ФГУН ГИСК им.Л.А.Тарасевича и на заседании кафедры микробиологии медицинского факультета РУДН.
По теме диссертации опубликованы 51 печатная работа, из них 1 методические рекомендации, 1 монография, 19 статей в научных журналах, 19 тезисов в сборниках конференций, 11 патентов на изобретения.
Объем и структура работы
Диссертация построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 283 страницах текста компьютерной верстки и иллюстрирована 66 таблицами и 26 рисунками. Список литературы представлен 499 источниками (181 отечественных и 318 зарубежных).
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Осипова, Ирина Григорьевна
ВЫВОДЫ
1. Разработана система комплексной оценки штаммов бактерий рода Bacillus, включающая изучение биологических, физиолого-биохимических и пробиотиче-ских свойств культур, обеспечивающая выполнение требований безопасности и стандартности споровых пробиотиков.
2. Обосновано использование моделей экспериментального дисбактериоза и острой кишечной инфекции in vivo для оценки пробиотических свойств штаммов бактерий.
3. На основе комплексного изучения совокупности биологических свойств, а также селекции бесплазмидных штаммов рода Bacillus (в частности, антибиотикоустой-чивых) сконструированы комплексные препараты-пробиотики на основе штаммов, дополняющих друг друга по антагонистической активности и подобранных оптимальных соотношениях: биоспорин (B.subtilis 3 и B.licheniformis 31), биспорин (B.subtilis 3/Re и B.licheniformis 31/Re), ирилис (.B.subtilis 07 и B.licheniformis 08), субтикол (B.subtilis 3, B.licheniformis 31 и E.coli М-17).
4. Выявлены преимущества по спектру антагонистической активности разработанных комплексных препаратов по сравнению с коммерческими споровыми препаратами и пробиотиками нормофлоры. Форма выпуска препарата не влияла на показатели специфической активности (антагонистическая активность, количество живых микробов в дозе), но только у пробиотических штаммов в свечевой форме статистически значимо уменьшалась адгезивность. Воздействие низко-интенсивного лазерного излучения (НИЛИ) не влияло на проявление антагонистических и адгезивных свойств споровых пробиотиков и ацилакта, при этом у бифидумбактерина и лактобактерина снижалась адгезивная активность. Полученные данные обосновывают перспективу совместного применения споровых пробиотиков и НИЛИ при лечении воспалительных процессов, сопровождающихся различными дисбиозами.
5. Доказана безопасность, переносимость и клиническая эффективность биоспори-на (лиофилизата и таблеток) при лечении ОКИ и заболеваний желудочно-кишечного тракта, осложненных дисбиозами различной этиологии, у взрослых и детей.
6. Выявлена профилактическая эффективность биоспорина в группах риска по возникновению острых кишечных инфекций.
7. Обосновано новое направление использования спорового пробиотика-биоспорина в гинекологической практике для лечения вульвовагинального канди-доза и бактериального вагиноза.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Осипова, Ирина Григорьевна, Москва
1. Авдошин В. П. Неспецифические воспалительные заболевания почек, мочевыводящих путей и половых органов у мужчин//Кн.:Низкоинтеисивная лазерная терапия. Под ред. Москвина С. В.- М. -2000.- Гл. 15 С. 406-423
2. Азизов И. С., Тургунов Е. М. Влияние электроимпульсной обработки органов брюшной полости на гистотаксис и адгезию госпитальных штаммов микроорганизмов// www.antismed.ru
3. Акопян Т.Э., Емельянова А.И., Кравченко Н.Ф. с соавт. Профилактика осложнений после кесарева сечения у пациенток с БВ .//Тезисы докладов VI Российского национального конгресса «Человек и Лекарство», 19-23 апреля 1999 г. -М. -1999. -С.269
4. Алешкин В.А., Тихонова Н.Т. и др. Новое направление бактериотера-пии комплексные пробиотики // Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования: Сб. мат. конф. - М., 2002. - С. 47.
5. Алтон Л.В. Развитие и выживаемость бактерий рода Bacillus в морской и речной воде //Гигиена и сан.- 1988.- № 9.- С.14-16.
6. Андрейчин М.А. Антимикробные свойства желчи и желчных кислот // Антибиотики. 1980.- 25 (12). - С.936-939.
7. Анкирская A.C. Бактериальный вагиноз//Акушерство и гинекология. -1995. -№6. -С.6-13.
8. Анкирская A.C., Прилепская В.Н., Байрамова Г.Р., Муравьева В.В. Бактериальный вагиноз: особенности клинического течения, диагностика и лече-иие//Рус.мед.ж. -1998. -Т.6, №5. -С.276-282.
9. Анкирская A.C., Муравьева В.В. Микробиологическая диагностика оппортунистических инфекций влагалища.//Клин. микробиол. антимикроб, химио-терап. 2001. 3(2). С. 190-194
10. Анкирская A.C., Уварова Е.В., Муравьева В.В. и др. Особенности нормальной микрофлоры влагалища у девочек дошкольного возрас-та.//Журн.микробиол.- 2004, №4.- С.54-58
11. Архангельская О.Н. Изучение обсемененности образцов коммерческих салатов и винегретов// Журн. микробиол.- 1988. № 10. - С. 113-114.
12. Архипов A.C. Бактерии-антагонисты, продуценты перекиси водорода, обитающие в кишечнике животных.// Автореф.дис.канд.биол.наук.- Днепропетровск., 1967.- 17 с.
13. Африкян Э.Г. Аэробные спорообразующие бактерии и их энтомопато-генные свойства: Автореф. дис. . д-ра биол. наук: 03.00.07. / МГУ. М. - 1970. - 38 с.
14. Бабаева Т.А. Морфолого-культуральные и физиологические свойства спорообразующих бактерий // Уч. зап. Азерб. ун-та. Сер. биол. н. 1973. - № 4. - С. 22-28.
15. Бабин В.Н., Домарадский И.В., Дубинин A.B., Кондракова O.A. Биохимические и молекулярные аспекты симбиоза человека и его микрофлоры // Журн. Рос. хим. о-ва им. Д.И.Менделеева. 1994. - Т. 38. - № 6. - С. 66-78.
16. Байко A.B., Алешкин В.А., Афанасьев С.С. и др. Микрофлора влагалища у девочек препубертатного возраста. Журн.микробиол. 2001, 2: 91-94.
17. Байрамова Г.Р. Клинические особенности и эффективность различных методов терапии бактериального вагиноза// Автореф.дис.канд.мед.иаук.- М.,1996.- 25 с.
18. Балтрашевич А.К., Комаровская Т.П. Способ определения чувствительности анаэробных микроорганизмов к антибиотикам с использованием стандартных дисков // Антибиотики. 1982 . - №8. - С . 32 - 36.
19. Белоцерковцева Л.Д. Коррекция микроценоза влагалища и кишечника на фоне антибиотикотерапии. //Вопр.гипкол., акуш. и перинатол., 2003, 2(4): 94-97.
20. Билетова Н.В., Корнелаева Р.П., Кострикина Л.Г. и др. Санитарная микробиология. М.: Пищевая промышленность, 1980. - 352 с.
21. Блохина И.Н., Дорофейчук В.Г. Дисбактериозы// Л., 1979
22. Богатков С.В., Фролова Т.Т., Грачева И.М. и др. Оптимизация гидролиза белков щелочной протеиназой // Прикл. биохимия и микробиол. 1982. - 18, № 1.-С. 71-75.
23. Бонд ВМ, Горская ЕМ. Новые подходы к моделированию, диагностике и лечению дисбактериозов кишечника//Мед аспекты микробной экологии, 1992, вып 6.- С 23-26
24. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса. Журн.микробиол. 1999, 5:34-39
25. Бондаренко В.М. «Острова» патогенности бактерий. Журн.микробиол. 2001,4:67-74
26. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. Ранние этапы развития инфекционного процесса и двойственная роль нормальной микрофлоры // Вестник РАМН.1997.-№3.-С. 7-10.
27. Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника у взрослых//КМК Scientific Press. -М., 2003.- 220 с.
28. Бондаренко В.М., Воробьев A.A. Дисбиозы и препараты с пробиотиче-ской функцией.//Журн.микробиол.- 2004. -№1. С.84-92.
29. Бондаренко В.М., Лиходед В.Г., Воробьев A.A. Иммунорегуляция численности грамотрицательной микрофлоры кишечника. //Журп.микробиол.-2004. -№4.-С.90-93.
30. Борисов Ил., Шопова Е. Клинико-микробиологические находки у женщин с заболеваниями влагалища//Акуш.и гинекол. -1996. -35, №1-2. -С.22-23.
31. Бочков И.А., Трофимов О.Д., Дарбеева О.С. и др. Упрощенная методика подсчета микроорганизмов при изучении аутофлоры человека// Лаб Дело, -6.-С 43-47, 1988
32. Брилине Т.А. Адгезия лактобацилл влагалища и половые гормоны //Автореф.дис.канд.мед.наук.- М., 1990.- 22 с.
33. Брилис В.И. Адгезивные свойства лактобацилл //Автореф. дис.канд.мед.наук. -Тарту. -1990. 25 с.
34. Брилис В.И., Брилине Т.А., Ленцнер A.A., Ленцнер Х.Б. А. С.1076441 (СССР). Изобретения.- 1984.- № 4
35. Брилис В.И., Брилеие Т.А., Ленцнер Х.Б., Ленцнер A.A. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов //Лаб. Дело. -1986. -№ 4. -С.210-212.
36. Буданов П.В., Баев О.Р. Диагностика и вариант комплексного лечения нарушений микроценоза влагалища. Вопросы гинекол., акушер, и перинатолог. 2002, 1(2).- С. 73-76
37. Венцковский Б.М., Товстановская В.А., Гуцуляк Р.В., Янковский Д.С., Дымент Г.С Применение пробиотиков в комплексной терапии и профилактике воспалительных заболеваний в акушерстве и гинекологии: Метод, рекомендации. — К., 2001.—28 с.
38. Воробьев A.A., Абрамов H.A., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дис-бактериозы актуальная проблема медицины //Вестник АМН. -1997. - № 3. -С.3-9.
39. Воробьев A.A., Лыкова Е.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции // Ж. микробиол., эпидемиол., иммунол. — 1999.—№6. —С. 102- 105.
40. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, ее защитная роль в организмеи обоснование сфер применения препарата бифидумбактерина: Автореф. Дис.дра биол. Наук. -М., 1982. -38 с.
41. Гончарова Г.И., Козлова Э.П., Лянная A.M., Чистякова В.И. Значение бифидофлоры для организма человека и необходимость ее нормализации.//Новые лекарственные препараты. Экспресс-информация. -М., 1987. -Вып.4. -С. 1-5.
42. Гончарова Г.И., Семенова Л.П., Лянная A.M. и др. Бифидофлора человека, ее нормализующие и защитные функции // Антибиотики и мед. биотехнол. -1987. 32, №3.-С. 179-183.
43. Гончарова Г.И., Дорофейчук В.Г., Смолянская А.З., Соколова К.Я. Микробная экология кишечника в норме и при патологии // Антибиотики и химиотерапия. 1989. - 34, № 6. - С. 462-466.
44. Горская Е.М. Повышение неспецифической резистентности макроорганизма при пероралыюм применении эубиотиков из лактобацилл // Иммунобиол. препараты. М., 1989 - С. 181-185.
45. Горская Е.М., Манохина И.М., Горелов A.B., Поспелова В.В., Рахимова Н.Г. Методические рекомендации по определению адгезии бактерий кишечного происхождения к эпителиальным клеткам тонкого и толстого кишечника// М.-1989.-7 С.
46. Горская Е.М. Механизмы развития микроэкологических нарушений в кишечнике и новые подходы к их коррекции.// Научн. доклад на соискание степени док. мед. наук.- Москва.- 1994.- 53 с.
47. Грачева Н.М., Колганова Н.А., Щербаков И.Т. с соавт. Микробная экология и состояние слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта у больных аллергическими заболеваниями//Журн.микробиол.- 2004 №2.- С.79-81.
48. Грачева Н.М., Партии О.С., Леонтьева Н.И., Щербаков И.Т. Применение препаратов из метаболитов нормальной микрофлоры в лечении больных острыми кишечными инфекциями // Эпидемиол. и инфекц. болезни. 1996. - № 3. - С. 30-32.
49. Гриценко В. А., Бухарин О. В. Экологические и медицинские аспекты симбиоза Escherichia coli и человека.// Журн.микробиол.- 2000.- № 3 с. 92-99
50. Гриценко В.А., Брудастов Ю.А., Кудря Е.В., Васильева Л.И. Сравнительный анализ чувствительности к желчи энтеробактерий // Журн.микробиол.-— 2002. — № 3. — С. 65 67.
51. Гриценко В.А., Брудастов Ю.А., Журлов О.С., Чертков К.Л. Свойства эшерихий, выделенных из организма мышей при бактериальной транслокации после иммоболизационного стресса // Журн.микробиол.- .- 2000.- № 1.- С.37-41.
52. ДалинМ.В., ФишН.Г. Адгезины микроорганизмов// Итоги науки и техники.- ВИНИТИ,-Микробиология.- 1985.-Т.16.- 107 С.
53. Динчева Е. Микробиологическое изучение мясного фарша //Научн. тр. Высш. ветеринарно-мед. ии-та. 1970. - 22. - С. 139-146.
54. Дубинин А.В., Бабин В.Н., Раевский П.М. Трофические и регулятор-ные связи кишечной микрофлоры и макроорганизма // Клинич. мед. 1991. - № 7. -С. 24-28.
55. Евдокимова Н.В. Некоторые аспекты распространения в почвах представителей рода Bacillus в связи с кинетикой их роста // Тр. 10 науч. конф. мол. ученых фак. почвоведения МГУ, Москва, 28-30 нояб. 1988 / МГУ. М. - 1989. - С. 25-26.
56. Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И., Коршунов В.М. Характеристика микроорганизмов, колонизирующих кишечник человека // Ж. микро-биол., эпидемиол., иммунол. 2002. - № 5. - С. 98 - 104.
57. Затула Д.Г., Резник С.Р. Влияние метаболитов споровых сапрофитных бактерий на организм человека и животных. Киев: Наукова думка, 1973. - 119 с.
58. Зорина В.В., Николаева Т.Н., Бондаренко В.М. Модуляция иммунной системы лактобактериями./Журн.микробиол., 2004 №6, С.57-60.
59. Иммунологические препараты и перспективы их применения в инфек-тологии /под ред. Онищенко Г.Г., Алешкина В.А., Афанасьева С.С., Поспеловой В.В.//ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, М., 2002. 595 с.
60. Иванова Е.П., Михайлов В.В., Андреев Л.В. Морские бациллы и некоторые подходы к их идентификации // Микробиол. журн. 1992. - 54, № 1. - С.27-33.
61. Калина Г.П. Санитарная микробиология. //М.: Медицина, 1969. 186с.
62. Кира Е.Ф. Бактериальный вагиноз. //Акушерство и гинекология. -1999. № 5. - С.69-76.
63. Кира Е.Ф. Бактериальный вагиноз // Санкт-Петербург. 2000, 363 с.
64. Кира Е.Ф. Бактериальный вагиноз (клиника, диагностика, лечение) //Автореф.дис. .докт.мед.наук. -Л. 1995. -44 С.
65. Кира Е.Ф., Кочеровец В.И., Поспелова В.В., Ханина Г.И. Применение эубиотиков для лечения бактериального вагиноза //Антибиот.химитер. -1994. -№ 39. -с.31-35.
66. Карапетян А.О. Биологический антагонизм некоторых представителей кишечной микрофлоры и опухолевых клеток (в свете данных морфологических ибактериологических исследований).//Автореф.дис.канд.мед.наук. -М., 1987. -17с.
67. Кисина В.И., Зудин Б.И. Результаты анкетного опроса дерматологов и акушеров-гинекологов по проблемам бактериального вагиноза.//ЗППП. -1995. -№1. -С.30-32.
68. Климшок СЛ., См1рнов В.В. Д1я бактерш-антагошспв на аеробну мшрофлору шюри людини // Мжробюл. ж. 1997. - 59, № 1. - С. 53-60.
69. Коган А.С., Салганик Р.И., Ефимов Ю.М. и др. Применение иммобилизованных бактериальных протеаз для пролонгированной энзимотерапии гнойных хирургических заболеваний // Вестник хирургиию 1982. - 128, № 4. - С. 60-63.
70. Коробушкина Е.Д., Черняк А.С., Минеев Г.Г. Растворение золота микроорганизмами и продуктами их метаболизма // Микробиология. 1974. - 43, № 1. -С. 49-54.
71. Коршунов В.М., Володин Н.Н., Ефимов Б.А. и др. Микроэкология влагалища. Коррекция микрофлоры при вагинальных дисбактериозах //Уч. пособие. М., 1999. —79 с.
72. Коршунов В.М., Логадырь Т.А., Ефимов Б.А. и др. Влияние энтерококков на восстановление микрофлоры кишечника, измененной в результате анти-биотикотерапии и углеводного питания // Антибиотики и химиотерапия. 1989. -34., № 6. - С. 433-437.
73. Коршунов В.М., Поташник Л.В., Ефимов Б.А. и др. Качественный состав нормальной микрофлоры кишечника у лиц различных возрастных групп // Журн. микробиол. 2001. - №2. - 57 с.
74. Костючек Д.Ф. Особенности гнойно-септической инфекции после аборта: Вопросы патогенеза, клиники, дифференциальной диагностики и лечения на современном этапе: Автореф. дис. .д-ра мед. наук. Л., 1988. -39 с.
75. Кочурко ЛИ, Лиходед ВГ, Лобова ЕА. Показатели иммунитета к эндотоксину грамотрицательных бактерий при кишечных дисбактериозах// Журн. микробиол,- 1998.- №5.-С 25-27
76. Кременчуцкий Г.Н., Горбунова Л.Г., Юргель Л.Г. и др. Биологические свойства аэрококков-антангонистов представителей микробиоценозов человека // Микробиол. журн. - 1994. - 56, № 4. - С.36-42.
77. Кругликов В.Д., Цураева Р.И., Рыжков И.В. и др. Возможность приживления Lactobacillus acidophilus в кишечнике белых мышей на фоне бактериальной терапии // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммуиобиол. 1997. - № 1. - С. 67-69.
78. Кузнецов С.И. Микрофлора озер и ее геохимическая деятельность. -Л.: Наука, 1970. 224 с.
79. Кулагина Г.М., Фмалкина С.В. Микрофлора кишечника у работников вредных производств//Журн.микробиол.- 2004. №4 - С.59-61.
80. Курепина Н.Е., Хмель И.А. Микроцины: природа и генетическое детерминирование // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1986. -№4.-С.З-10.
81. Ларсен В. Микрофлора родовых путей в норме //Репродуктивное здоровье: Пер. с англ.: Т. 1: Общие инфекции:-М.: Медицина, 1988. -С. 17-45.
82. Лахтии В.М., Алешкин В.А., Лахтин М.В. и др. Лектины, адгезины и лектиноподобные вещества лактобацилл и бифидобактерий//Вестник РАМН. -2006. -№1.-С.28-35
83. Леванов A.B. Феномен бактериальной транслокации условно патогенных микроорганизмов из желудочно-кишечного тракта // Антибиотики и химиотерапия. —2001. — Т. 46, № 5. — С. 28 30.
84. Лекарственная устойчивость бактерий//Бюл.ВОЗ -1983. -Т.61, №3. -С.12-21
85. Ленцнер A.A. Актуальные проблемы микроэкологии влагалища //Научная конференция «Гнойновоспалительпые заболевания и осложнения в аку-шерско-гинекологической практике». Материалы. Л., - 1991. -№ 9. -с.72-73.
86. Ленцнер A.A. Лактобациллы микрофлоры человека //Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских паук. -Тарту, -1973.
87. Ленцнер A.A., Ленцнер Х.П., Микельсаар М.Э. и др. Лактофлора и колонизационная резистентность // Антибиотики и мед. биотехнол. 1987. - 32, № 3. -С.173-179.
88. Летучих А. А. Кольпиты: Патогенез, классификация, диагностика: Сообщ. 1. //Акушерстсво и гинекология. -1985. № 2. -С.61-66.
89. Литяева Л.А. Бактериоскопическое и бактериологическое исследование влагалищного содержимого беременных женщин //Лаб. дело. 1991. -№ 9. -с.72-73.
90. Литяева Л.А., Закопаева Е.С., Борисов С.Д. Применение бифидумбак-терина для долечивания детей первого года жизни с бактериозом после острых кишечных инфекций // Бифидобактерии и их использ. в клинике, мед. пром-сти и с.х. -М., 1986.-С. 113-116.
91. Лиходед В. Г., Яковлев М. Ю, Лиходед Н. В. с соавт. Состояние анти-эндотоксинового иммунитета при экспериментальном кишечном дисбактериозе у мышей.// Журн. микробиол.-1998.- №4.- с. 14-16
92. Лобырева Л.Б. Липолитическая активность спорообразующих бактерий Bacillus subtilis // Микробирология. 1979. - 48, № 2. - С. 208-211.
93. Логинова Л.Г., Храпцова Г.И., Головина М.Г. и др. Термофильные бактерии горячих источников Камчатки // Микробиология. 1976. - 45, № 6. - С. 1087-1091.
94. Макиров К.А., Волков Д.Г., Рахимберлина P.M. Индикация Вас. mesentericus в некоторых объектах внешней среды // Тр. НИИ краев, патол. Каз. ССР. 1973(1974). - 25.- С. 66-68.
95. Малик НИ, Панин АН, Вершинина ИЮ. Пробиотики: теоретические и практические аспекты// Био №3(18), март 2002
96. Мартынов А.В., Туркутюков В.Б. Антибиотикорезистентность культур Streptococcus pneumoniae, выделенных у лиц с внебольничной пневмонией.
97. Марцишевская P.JL, Шибалова И.П. Исследование вагинального отде-ляемого.//Лаб.дело. -1990. -№6. -С.38-43.
98. Медуницын Н.В., Покровский В.И. Основы иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных болезней: Учебное пособие//М., «ГЭОТАР-Медиа», 2005.-556 с.
99. Методические рекомендации: Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника. М., 1986. —23 с.
100. Мешкова Н.В., Симонова А.А. Почвенные бактерии, сохранившие жизнеспособность в течение тысячелетий в условиях "вечной мерзлоты" // Тр. 8-й науч. коиф. молодых ученых факультета почвоведения МГУ (Москва, 14-16 апр. 1986 г.).-М., 1989. С.92-95.
101. Михайлова Н.А., Кузнецова Т.Н., Кунягина О.В. Лечебно-профилактический биопрепарат «Бактиспорип»/Патепт РФ №2130316 , С12 N112011 (С 12N 1/20, С12 R1:125) Заявка 23.01.97, опуб. 20.05.99. Был.№14
102. Муравьева В.В. Микробиологическая диагностика бактериального ва-гиноза у женщин репродуктивного возраста.// Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. -М. -1997.
103. Мухаммедов И.М., Шадиев Х.К., Абдуллаев М.И. с соавт. Нарушения микрофлоры кишечника и иммунной системы у детей, больных витилиго. Журн.микробиол.- 2004,- №2,- С.74-76.
104. Мюллер Г., Литц П., Мюнх Г. Микробиология пищевых продуктов растительного происхождения. М.: Мир, 1977. - 343 с.
105. Мосина Л.В. Распространение аэробных спорообразующих бактерий в почвах европейской части СССР// Изв АН СССР, сер. биол. 1974. - № 2. - С. 283286.
106. Никитенко В.И. Медицинский институт Оренбурга представляет препарат споробактерин // JAMA. 1991. - 64, № 1. - С.31.
107. Никитенко ВИ, Захаров ВВ, Бородин АВ и др. Роль транслокации бактерий в патогеннезе хирургических инфекций// Хирургия, 2001, №2, с 63-66
108. Николаева Т.Н., Зорина В.В., Бондаренко В.М., 2004; Роль цитокинов в модуляции иммунореактивиости организма бактериями рода Lactobacillus./Журн.микробиол., 2004, №6, С. 101-106.
109. Никонов Н.К., Борщевская Р.П., Курников Г.10. Опыт лечения гени-тальных микроплазм в этиологии послеродового эндометрита. //Акушерство и гинекология. -1993. № 3. -С.20-23.
110. Орлова М.В., Смирнова Т.А., Шамшина Т.Н. и др. Антибактериальная активность Bacillus laterosporus // Биотехнология. 1995. - № 1-2. - С. 23-26.
111. ОСТ 91500.11.0004-2003: «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» утв. МЗ РФ № 231 от 09.06.2003
112. Парфенов А.И, Калоев ЮК. Дисбактериоз кишечника// Молек мед. Журн.- 1998,- 1-С 12-18
113. Перетц JT.Г. Значение нормальной микрофлоры для организма человека. М., 1955.- 435 с.
114. Петрова Л. Диференциране на култури от род Bacillus, изолирани от месни полуконсерви // Ветеринарно-медицински науки. 1975. - 12, № 8. - С. 82-88.
115. Петровская В.Г., Марко О.П. Микрофлора человека в норме и патологии. М.: Медицина, 1976. - 217 с
116. Подопригора Г.И. Иммунные и неспецифические механизмы колонизационной резистентности.//Антибиотики и колонизационная резистент-ность./Труды ВНИИ антибиотиков .- М. -1990. -вып.Х1Х. -С. 15-25.
117. Полянская Л.М., Добровольская Т.Г., Исаева C.B. Динамика численности и структуры популяции Bacillus sphaericus в почвах // Биодинам, почв: 3 Всес. симп., Харку, 25-27 окт., 1988: Тез. докл. Таллин, 1988. - С.130.
118. Поспелова В.В. Микробные биопрепараты для коррекции бактериоценоза кишечника, их конструирование и применения. Автореф.докт.мед.наук. 1. М., 1979.-38 с.
119. Поспелова В.В., Грачева Н.М., Ханина Г.И. с соавт. Эубиотики эффективное средство нормализации микрофлоры и вклад МНИИЭМ в их разработку (к 100-летию института)// Врач. -1997. - №4. -С.30-32
120. Поспелова В.В., Манвелова М.А., Рахимова Н.Г. и др. Ацидофильные лактобактерии и их значение в системе средств, регулирующих бактериоце-ноз//Медицинские аспекты микробной экологии. -М., 1991. С.175-182.
121. Поспелова В.В., Рахимова Н.Г., Королева А.И. и др. Изыскание защитных сред для повышения качества сухого колибактерина // Кишечные и воздушно-капельные инфекции. М., -1969. - 13. - С. 355-363.
122. Постникова Е.А., Ефимов Б.А., Володин H.H., Кафарская Л.И., Жури. Микробиол., 2004. №2., С.64-69.
123. Попкова С.М., Кичигина Е.Л., Лещук С.И. с соавт. Оценка влияния отваров лекарственных растений и противобактериальных антител к бифидобакте-риям на их адгезию in vitro. Жури, микробиол., 2004, №2, С.70-74.
124. Прилепская В.Н., Байрамова Г.Р. Современные представления о бактериальном вагинозе.//Вест. Рос. ассоц. акушеров- гинекологов. -1996. -№ 3. -С.40-42.
125. Приели С.Дж.Ф., Джонс В.М., Дхар Дж., Гудвин Л. Что такое нормальная влагалищная флора?//Заболев. передаваем, полов, путем. -1997. -№ 4. -С.12-18.
126. Ратникова И.А., Гаврилова H.H., Колокова H.H. Идентификация антибиотических веществ молочнокислых бактерий // Биотехнология. 1995. - № 5-6. -С. 19-20.
127. Рахимберлина P.M., Макиров К.А., Волков Д.Г. К вопросу об обсеме-ненности Вас. mesentericus почвы и продуктов северной и южной зон Казахстана // Тр. НИИ краев, патол. Каз. ССР. 1974. - 26. - С. 202-204.
128. Рахимберлина P.M. Частота обнаружения Вас. mesentericus в мучных изделиях и влияние его на пищевые качества хлеба // Материалы 2-го объединенного съезда гигиенистов, эпидемиологов и инфекционистов Казахстана. Алма-Ата. -1975. -1. - С. 253-254.
129. РД 42-28-8-89 Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов. Основные положения/ М-во здравоохранения СССР. -Москва, 1989.-31с.
130. Резник С.Р., Слабоспицкая А.Т., Смирнов В.В. Некоторые биологические свойства бактерий рода Bacillus, выделенных из организма людей // Микро-биол. журн. 1985. - 47, № 3. - С. 53-59.
131. Риск развития инфекции; заключение Научного комитета от 16 мая 2003 года; http:// europa.eu.int/cmm/food/fs/sc/indexen.html.
132. Савицкая К.И., Русаенова Е.В., Нехорошева А.Г. и др. Микрофлора толстой кишки больных с длительно текущей уроинфекциеи// Мед аспекты микробной экологии. 1993/1994. - выл 7/8- С 173-175
133. Сайтов М.М., Никитенко В.И., Есипов В.К., Писецкий С.Н. О роли дисбактериоза в развитии хирургической инфекции// Дисбактериозы и эубиотики: Тез.докл. Всероссийской научно-практической конференции. -М., 1996.- С.32
134. Салливан А., Норд К. Место пробиотиков в терапии инфекций желу-дочно-кишечиого тракта у человека.// Клинич.микробиол.и антимикробная химиотерапии.- 2003 .-№3.- Т.5. -С.275-284.
135. Серов В.И., Шаповаленко С.А. Микробиоценоз влагалища и инфекционные вульвовагиниты: выбор препарата для рациональной терапии. /Вопросы ги-некол., акушер, и перинатолог. 2004, 3(4).- С.24-32.
136. Симова Б. Проучвания върху протеолитичните микроорганиз-ми в млечпи и месни хранителни продукта // Хигиена и здравеопазв. 1986. - 29, № 2. -С. 55-60.
137. Слабоспицкая А.Т., Крымовская С.С., Резник С.Р. Ферментативная активность бацилл, перспективных для включения в состав биопрепаратов // Микро-биол. журн. 1990. - 52, № 2. - С. 9-14.
138. Смирнов В.В., Василевская И.А., Резник С.Р. Антибиотики. К.: Вища школа, 1985.- 191 с.
139. Смирнов В.В., Резник С.Р. Бактерии рода Bacillus продуценты антибиотиков // Проблемы изыскания и биотехнологии новых антибиотиков. - М.: Медицина, 1982.-С.53.
140. Смирнов В.В., Резник С.Р. Перспективи використання у тварипництв1 живих культур аеробних спороутворюючих бактерш // Bicu. АН УРСР. 1983. - № 4. - С.53-57.
141. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ. - Киев: Наукова думка, 1982.-279 с.
142. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных// Киев.- 1983.- 51С.
143. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Выоницкая В.А. О некоторых механизмах возникновения бессимптомной бактериемии // Микробиол. журн. 1988. - 50, № 5 - С. 56-59.
144. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А. Дискуссионные вопросы создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры теплокровных // Микробиол. журн. 1992. - 54, № 6. - С. 82-94.
145. Созаева Л.Г. Коррекция дисбиоза влагалищного биотопа споровым пробиотиком биоспорином// Автореф. дис. . кан. мед. наук. М., - 1999 -19с.
146. Соколова К.Я., Соловьева И.В., Попова Е.В. Федотова М.Н. Новые подходы к изучению и оценке микробиоценозов влагалища.//Респ.сб.науч.тр. «Ау-тофлора человека в норме и патологии и ее коррекции». -1988. -С.5-10.
147. Соловьева И. В. Характеристика микрофлоры влагалища женщин в норме и патологии // Автореф. дис. . кан. мед. наук. М., 1987 -17с.
148. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов//Антибиотики и химиотерапия, 1998, 43:2 С.20-23
149. Сорокулова И.Б. Теоретическое обоснование и практика применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых пробиоти-ков/Дис.док.биол.наук., Киев., 1999., 180 с.
150. Стародубцева Н.В. Диагностика бактериального вагиноза и микробиологические рекомендации по его рациональному лечению.//Сб.науч.тр.Уральского НИИ дерматологии и венерологии. -Екатеринбург. -1995. -С.22-28.
151. Станчева Надя. Състав на липолитичните микроорганизми, изолирани от прясно овче мляко // Животновьд. науки. 1997. - 34, № 1-2. - С. 72-75.
152. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования // Под ред. Биргера М.О. М.: Медицина, 1982. - С. 170-172.
153. Тарасенко ВС, Никитенко ВИ, Кубышкин ВА. Острый панкреатит и транслокация бактерий// Вест. Хирургии.- 2000.- С 86-89.
154. Тауфик Хусейн Тауфик Джиродат Оценка воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на основных возбудителей и эффективности комбинированной терапии острого пиелонефрита//Автореф.к.м.н. М., 2002. 19 с.
155. Тихомиров А.Л., Олейник Ч.Г. Бактериальный вагиноз: некоторые аспекты патогенеза, клиники, динамики и лечения./Гинекология. Изд. «Медиа Медика»,- 2004,- Т.6, №2.- С.62.
156. Топчий М.П. Применение препарата из живых культур сенной палочки при дисбактериозе телят: Автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.07 /Ин-т микробиологии АН БССР. Минск, 1979. - 22 с.
157. Ханьмова Т., Боянова Ц. Микрофлора на пшениченото зърно //Хранит, про-сть. 1972. - 21, № 4. - С. 34-37.
158. Цвелев 10. В., Кира Е.Ф., Кочеровец В. И. Неспецифический вагиноз: Дисбакгериоз или воспаление влагалища? Диагностика и лечение // Вопросы антибактериальной терапии инфекционных осложнений в не инфекционной клинике. -М. >1987. -С. 189-190.
159. Чахава О.В. Гнотобиология о микрофлоре организма хозяина и антн-биотикотерапии//Антибиотики и мед.биотехнология. -1987. -№3. -с.170-173
160. Червип В.В., Червинец В.М., Бондарепко В.М., Базлов С.Н. Язвенная болезнь, хронический гастрит и эзофагит в аспекте дисбактериоза эзофагогастро-дуоденальной зоны. -Тверь: ООО «изд. «Триада», 2004. 2000 с.
161. Чернякова В.И., Береза Н.М., Селезнева С.И. с соавт. Бактериологическая и иммунологическая эффективность биоспорипа при неспецифическом язвенном колите//Микробиол.журн., 1993, 55, №3, с.63-67
162. Чеснокова BJ1. Варианты штамма Е.соН Ml7, перспективные для получения эубиотиков//Автореф. дис. канд мед. наук: 03.00.07.- М. 1998, 20 с.
163. Чупринина Р.П. Биопрепараты: требования к отбору производственных штаммов, оценка показателей, проблемы стандартизации // Пробиотические микроорганизмы современное состояние вопроса и перспективы использования: Сб. мат. конф. - М ., 2002. - 10 -11с.
164. Чхаидзе И. Г., Лиходед В. Г., Лиходед М. В. с соавт. Корректирующее действие антител при экспериментальном кишечном дисбактериозе.//ЖМЭИ.-1998.-№14. С. 12-14
165. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том I: Микрофлора человека и животных и ее функции. М., 1998. - 287 с.
166. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. T.III: Пробиотики и функциональное питание. М, 2001. - 288 с.
167. Шкарупета М.М., Коршунов В.М., Савенкова В.Т., Пинегин Б.В. Влияние перорального введения индигенных микроорганизмов на устойчивость мышей к сальмопеллезной инфекции //ЖМЗИ 1988. - № 7. - С. 46-50.
168. Шопова Е. Lactobacillus spp. в содержимом влагалища здоровых жеп-щин//Инфектология. -2002. -39, №3.- С.29-31.
169. Янковский Д.С. Состав и функции микробиоценозов различных биотопов человека// Журн. Здоровье женщины 4(16)/2003. -с. 145-158
170. А.с. 1235896 А 1 СССР, МКИ4 С 12 0 1/02 А 61 L 9/00. Способ предупреждения распространения госпитальной инфекции // В.И.Никитепко, О.Б.Бухарин, И.К.Никитенко и др. (СССР). № 3747625/28-14; Заявл. 30.05.84; Опубл. 08.11.86, Бюл. № 21.
171. Щ 179. А.с. 1723117 А1 СССР, МКИ5 С 12 N 1/20, А 61 К 35/74. Штамм бактерий Bacillus pulvifaciens, используемый для изготовления лечебно-профилактического препарата против бактериальных инфекций у животных /
172. B.И.Никитенко, И.К.Никитенко, С.М.Пау (СССР). Опубл. 30.03.92, Бюл. № 12.- 3 с.
173. Пат. 8443 Укра'ша, МКИ А 61 К 35/74. Cnoci6 лжування пнйно-септичних шсляродових захворювань / CMipnoB В.В., Резник С.Р., Сорокулова 1.Б. та ¡н. (Укра'ша). -AI 13968868; Заявл. 30.06.85; Опубл. 30.09.96, Бюл. № 3.- 2 с.
174. Пат. 5364623 США, МКИ5 А61К 35/00, С12Р 1/00. Antibiotic produced by Bacillus subtilis ATCC 55422 capable of inhibiting bacteria/ Patel P.S., Mayerl F., Mayers E.; Britol-Myers Squibb Co. N 55162; Заявл. 30.04.93; Опубл. 15.11.94; НКИ 424/116.
175. Пат. 5372810 США, МКИ5 A6IK 37/00, С12N 1/00. Composition for the prevention and treatment of diarrhea in livestock / Onishi N., Yamashiro A., Ajinomoto
176. C, Inc. (Япония) № 973572; Заявл. 09.11.92; Опубл. 13.12.94, № 1-229653; НКИ 424/93.4.
177. Пат. 5374545 США, МКИ5 C12N 9/00, C12N 1/20. Cell wall lytic enzymes from Bacillus pabuli / Liu Chi-Li, Overholt Janet M; Novo Nordisk A/S. N 86388; Заявл. 01.07.93; Опубл. 20.12.94; НКИ 435/183.
178. Abdel-Baki M.M., El-Samahy S.K., Seleha H. Morad M.M. Cake-mix sup-plemenation with soybean, sweet potato of peanut flours. I. Chemical, microbiological and pheological studies // Baker's Dig. 1980. - 54, N 5. - P. 28-30.
179. Abd-et-Malek Y., El-Leithy M.A., Awad Y.N. Microbiological studies on Egyptian "Balady" bread-making. II Microbial and chemical changes during dongh fermentation // Chem., Microbiol., Technol. Lebensm. 1974. - 3, N 5. - P. 148-153.
180. Adami A, Cavazzoni M. Occurrence of selected bacterial groups in faeces of piglets fed with Bacillus coagulans as probiotic. Basic Microbiol 1999;39:3-9.
181. Adams MR. Safety of industrial lactic acid bacteriaII J Biotechnol 1999, Feb 19;68(2-3):171-8
182. Albot G., Bernard-Bruker N. Nouvean traiment des diarrhes par les emulaions de Bacillus subtilis // Exrait. de la Semaine des Hop. de Paris. 1950. - N 5. -613-623.
183. Alexopoulos C., Karagiannidis A., Kritas S. K., et al. Field Evaluation of a Bioregulator Containing Live Bacillus cereus Spores on Health Status and Performancem of Sows and their Litters// J. Vet. Med. 2001, A 48, 137-145
184. Alvarez-Olmos M. I., Oberhelman R.A. Probiotic Agents and Infectious Diseases: A Modern Perspective on a Traditional Therapy//CID 2001:32 (1 June) • 1567• 1576
185. Andersson A.M., Weiss N., Rainey F.,Salkinoja-Salonen M.S. Dust-borne bacteria in animal sheds, schools and children's day care centres// J.Appl.Microbiol. 1999; 86; p.622-634
186. Antai S. P. Study of the Bacillus flora of Nigerian species // Int. J. Food. Microbiol.- 1988.- N 3. P. 259 - 261.
187. Asahara T, Nomoto K, Watamiki M et al. Antimicrobial activity of intrau-really administrated probiotic L.casei in a murine model of E.coli UTI// J.Antimicrob.Agents.Chemother., Jun 2001, 45(6):1751-1760
188. Bai X, Liu X, Su Y. Inhybitory effects of intestinal mucus on bacterial adherence cells after surface .burns// Clin. Med. J., May, 2000, 113(5):449-450
189. Bailey MT, Coe CL. Maternal separation disrupts the integrity of the intestinal microflora in .infant rhesus monkeys// Dev Psychobiol Sep; 1999, 35(2): 146-55
190. Baldson M.J. Treatment of Gardnerella vaginalis syndrom with a single 2 gram oral dosage of metronidazole //Scand. J. Infect. Dis. -1983. -Suppl. 40. P. S101-S102.
191. Beaumont M. Flavouring composition prepared by fermentation with Bacillus spp.// International Journal of Food Microbiology 75 (2002) 189- 196
192. Benedettini G., Delibero G., Pierotti R. et al Immunomodulation by Bacillus subtilis spores // Boll. 1st. Sieroter. Milan. 1983. -62, N 6. - P. 509-516.
193. Bengmark S. Ecological control of the gastrointestinal tract: the role of pro* biotic flora. Gut 1998; 42:2-7.
194. Benno Y., Endo K., Takeo M., et al. Comparison of fecal microflora of elderly persons in rural and urban areas of Japan // Apl. Environ. Microbiol.- 1989,- № 5.-P.1100-1105.
195. Benno J., Mitsuoka T. Bifidobacteria and microflora // Development of intestinal microflora in human and animals. 1986.- 5, N 1. - P. 13-25.
196. Benoni G. Antibiotic administration and oral bacterial therapia in infants // Chemioterapia. 1984. - 3, N 5. - P. 291-294.
197. Berg R.D. Bacterial translocation from the intestines//Jikken Dobutsu, 1985,34:1:1-16
198. Berg R.D. Bacterial translocation from the gastrointestinal tract//Appl. Eny-iron. Microbiol. -1995. -Vol.3, №4. p. 149-154.
199. Bergey,s Manual of Systematic Bacteriology:Vol.1., 3 /Ed. N. R. Krieg, H. G. Holte- Baltimore etc.: Williams & Wilkins . 1986. -P. 965-1600.
200. Berkel H. Graduelle Bewertung Fett und Eiweib spaltender Wirkungen von Stammen der Gattung Bacillus unter Laborbedingungen // Fleischwirtachaft. 1976. - 56, N3.-P. 395-398.
201. Berkel H., Hadlok R. Lecitinase- und Toxinbildung durch Stamme der Gattung Bacillus// Lebensmittelhyg. 1976. - 27, N 2. - P. 63-65.
202. Bernet M.F., Brassart D., Neeser J-R., Servin A. Adgesion of human bifidobacteria! strains to cultured human intestinal epithelial cells and inhibition of enteropathogen-cell interaction // Appl. Environm. Microbiol. 1993. - 59. - P. 4121-4128.
203. Beuth J, Ko HL, Shroten H et al. Lectin mediated adhesion of Streptococcus pneumoniae and its specific inhibition in vitro and in vivo// Zbl.Bakt.Hyg., 265, 160-168,1987
204. Bezkorovainy A. Probiotics: determinants of survival and growth in the gutIIAm J Clin Nutr 2001 ;73(suppl):399S-405S.
205. Bibel D., Lovell D. Survival of Bacillus licheniformis on human skin // Appl. and Environ, microbiol. 1978. - 35, N 6. - P. 1128-1135.
206. Blanc-Pottard AB, Solomon F, Kayser J, Groisman EAII J. Bacteriol., 1999, v.181, p. 998-1004
207. Boeye H., Aerts M. Numericl taxonomy of Bacillus isolates from North sea sediments // Int. J. Syst. bacteriol. 1976. - 26, N 4. - P. 427-441.
208. Bomar M.T. Mikrobiologische Bestandsaufnahme von Fertigsalaten in der Jahren 1985 und 1987 // Ernähr. Umschau. - 1988. - 35, N 11. - P. 392-395, 398.
209. Bomba A., Nemcova R., Herich R. et al. Interaction of Lactobacillus spp. and enteropathogenic Escherichia coli under in vitro and in vivo conditions // Vet. med. -1996.-41, N5.-P. 155-158.
210. Borriello S. P., Hammes W. P, Holzapfel W. et al. Safety of Probiotics That Contain Lactobacilli or Bifidobacteria//CID 2003:36 (15 March) .P.775-780
211. Bouhnik Y., Pochart P., Marteau P. et al. Effect of intestinal microflora modifications on the clearance of an exogenous Bifidobacterium sp. ingested in a fermented dairy product// Gastroenterology. 1991. - 100. -A516.
212. Brankova R., Gyosheva B., Michailova M., Georgiev G. Antimicrobial activity of lactic acid bacteria against intestinal and food-borne pathogens // Biotechnol.and Biotechnol. Equip. 1994. - 8, N 4. - P. 13-18.
213. Brook J. Isolation of non-sporing anaerobic rods from infection in children//J.CIin.Microbiol., 1996, 45:21-26
214. Bürge H.A., Solomon W.R., Boise J.R. Microbial prevalence in domestic humidifiers // Appl. and Environ, microbiol. 1980. - 39, N 4. - P. 840-844.
215. Buts J.C., Bernasconi P., Van Craynest M.P. et al. Response of human and rat small intestinal mucosa to oral administration of Saccharomyces boulardii // Pediatr. Res. 1986.-20.-P. 192-196.
216. Caldini G., Trotta F., Cenci G. Inhibition of 4-nitroquinoline-l-oxide genotoxicity by Bacillus strains //Research in Microbiology 153 (2002) 165-171
217. Cartman S.T. and La Ragione R.M. Spore probiotics as animal feed supplements //In: Bacterial SPORE Formers: Probiotics and Emerging Application (Ricca, E., Henrigues, A.O. and Cutting, S.M., Eds).- 2004. p. 155-161
218. Castelvetn F., Ambroggy F., Gola S. Stabilizzazione microbiologica di paste alimentari farcite "freche" ad attivita dell'acqua inferiore a 0,94 pastorizzate // Ind. conserve. 1986. - 61, N 4. - P. 333-337.
219. Casula G, Cutting SM. Bacillus probiotics: spore germination in the gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol 2002;68:2344-52.
220. Cauci S. et al. Specific immune response against Gardnerella vaginalis hemolysin in patients with bacterial vaginosis.//Am J Obstet Gynecol. -1996. -175(6). -C.1601-1605.m
221. Cebra JJ, Jian H-Q, Sterzl J, Tlaskalova'-Hogenova' H. The role of mucosal microbiota in the development and maintenance of the mucosal immune system. In: Pearay LO, ed. Mucosal immunology. San Diego: Academic Press, 1999:267-80.
222. Chapoy P. Traitement des diarrhees aigues infantiles: essai controle de saccharomyces boulandii // Ann. Pediatr. 1985. - 32. - P. 1-3.
223. Clare P., Kurtzer T. The role of bacterial vaginosis in the development of peripartim infection //Abstract book therd international symposium on vaginitis/vaginosis. -Funchal, 1997. -168. -№4. -C.303-307.
224. Conway P.L., Gorbach S.L., Goldin B.R. Survival of lactic acid bacteria in the human stomach and adhesion to intestinal cells //J. Dairy Sci. 1987. - 70, N 1. - P. 112.
225. Coppi F.// Results of treatment with Bacillus subtilis spores (Enteroger-mina) after antibiotic therapy in 95 patients with infection calculosis // Chemioterapia. -1985,-4, N6.-P. 467-470.
226. Corazza G.R., Sorge M., Strocchi A. et al. Non-absorbable antibiotics and small bowel bacterial overgrowth // Ital. J. Gastroenterol. 1992. - 24, N 9. - P. 4-9.
227. Cowan MM, Horst EA, Luengpailin S, Doyle RJ. Inhibitory Effects of Plant Polyphenoloxidase on Colonization Factors of Streptococcus so-brinus 6715//Antimicrobial agents and chemiotnerapy, Vol. 44, No. 9, p. 2578-2580, 2000
228. Cutting S.M. Spores as oral vaccines// Ricca E., Henriques A.O., Cutting S.M., eds. Bacterial spore formers: proboitics and emerging application. Narfolk, UK: Horizon Bioscences Press; 2004,- p.201-206
229. Darouich RO, Hull RA. Bacterial interference for prevention of UTI// J Spinal Cord Med, Summer 2000, 23(2):136-141
230. Davies M. Bacterial cells as anti-tumor agents in man // Rev. Environ. Health. 1982. - 4, N 1. - P.31-56.
231. Davidson J.N., Hirsch D.C. Bacterial competion as a means of preventing diarrhea in pigs. Infect. Immunol. -1976:13: 17773-1774.
232. Denis F. Les Bacillus de s milieu marin: Etude de 120 souches // C.R.Soc.biol. 1971 (1972). - 165, N 12. - P. 2404-2408.
233. Donohue, D.C., Deighton, M., Ahokas, J.T., Salminen, S., 1993. Toxicity of lactic acid bacteria. In: Salminen, S., von Wright, A. (Eds.), Lactic Acid Bacteria, Marsel Dekker Inc, New York, pp. 307-317
234. Donders Gilbert G.G., Vereecken A., Salembier G. et al. Assessment of vaginal lactobacillary flora in wet mount and fresh or delayed Gram's stain// Infec. Deseases Obstet. and Gynecol. -1996. -4, №> 1. -C.2-6.
235. Doyle RJ. Contribution of the hydrophobic effect to microbial infection// Microbes and Infection, Apr.;2(4):391-400, 2000
236. Drago L, Gismondo MR, Lombardi A et al. In hibition of in vitro growth of enteropathogen by new lactobacillus isolates of human intestinal origin// FEMS microbial Lett, 15:153(2):455-463, 15 Aug 1997
237. Drasar B., Hill M. Human intestinal flora. London: Acad, press, 1974.261 p.
238. Duc L. H., Hong H. A., Barbosa T.M. et al. Characterization of Bacillus Probiotics available for human use.//App. and Environmental. Macrobiol., Apr. 2004, V.70, № 4 p.2161-2171
239. Dunne C., O'Mahony L., Muiphy L. et al. In vitro selection criteria for pro-biotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings .¡¡Am J Clin Nutr 2001;73(suppl):386S-92S.
240. Elliott SJ, Krejany EO, Mellies JL. et al. Esp G, a novel type III system-secreted protein from Enteropathogenic Escherichia coli with similarities to VirA of Shigella flexneri// Infect Immun, 2001, Jun, 69(6):4027-4033
241. Elmer GW, Surawiz CM, McFarland LV. Biotherapeutic agents: a neglected modality for the treatment of selected intestinal and vaginal infections. JAMA 1996; 275:870-6.
242. El Marrakchi A., Tantaoui-Elaraki A., El Mane, Tifrit L. La flore mikrobienne du smen marocain. 1. Flores naturelle et flore d'interet hygiénique // Lait. -1988.-68, N2.-P. 205 -217.
243. Eschenbach D. History and review of bacterial vaginosis.//Am Jm Obstet Gynecol. -1993. -V.169 (2 Pt2). -C.441-445
244. Fagade O.E., Oso B.A. Microflora associated with natural flora fermentation of pineapple (Ananas comosus (L.) Merr.) for alcoholic beverage production // Nahrung. 1989. - 33, N 6. - P. 509-515.
245. Fais S. Lymphocyte activation by Bacillus subtilis spores // Boll. 1st. Sieroter. Milan. 1987. -66, N 5. - P. 391-394.
246. Farina C, Arosio M, Mangia M, Moioli F. Lactobacillus casei subsp. rham-nosus sepsis in a patient with ulcerative colitis// J Clin Gastroenterol, Sept, 2001, 33(3):251-2
247. Fasoli S., Marzotto M., Rizzotti L. et al. Bacterial composition of commercial probiotic products as evaluated by PCR-DGGE analysis/ International Journal of Food Microbiology 82 (2003) 59-70
248. Feignier C., Besson P., Michel G. Studies on lipopeptide biosynthesis by Bacillus subtilis : Isolation and characterization of iturin" , surfacin+ mutants // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - 127, N 1-2. - P. 11-15.
249. Filice G.A., Hayes P.S., Counts G.W., et al. A meningococcal disease: bacterial interference and cross-reactive bacteria among mucosal flora // J. Clin. Microbiol.1985.-22, N2.-P. 152-156.
250. Finegold S.M. Normal human intestinal flora. // Ann. 1st. super, sanita.1986. 22, N 3. - P.731-737
251. Fiorini G., Cimminello C., Chianese R. et al. Bacillus subtilis selectively stimulates the synthesis of membrane bound and secreted IgA // Chimioterapia. 1985. -4.-P. 310-315.
252. Foegeding P.M., Stanley N.W. Growth and inactivation of microorganisms isolated from unpasteurized egg // Food Sei. 1987. - 52, N5. - P. 1219-1223, 1227.
253. Forestier С.,De Champs С., Vatoux С., Joly В. Probiotic activities of Lactobacillus casei rhamnosus: in vitro adherence to intestinal cells and antimicrobial properties. Res Microbiol. 2001; 152: 167-173.
254. Fox M. The philogeny of procaryotes // Science.- 1980. 209, N 4455. - P.457.
255. Franza С. M.A.P., Stilesb M.E., Schleiferc К. H. et al. Enterococci in foods—a conundrum for food safety// International Journal of Food Microbiology 88 (2003) 105- 122
256. Fukushima Michihiro, Nakano Masuo Effect of a mixture of organisms, Lactobacillus acidophilus or Streptococcus faecalis on cholesterol metabolism in rats fed on a fat- and cholesterol-enriched diet // Brit. J. Nutr. 1996. - 76, N 6. - P. 857-867.
257. Fujii Т., Suzuki K., Sugihara K. et al. Изменение в количестве и спектре пищевой и санитарной микробной флоры в продукте "Шиокара" с малой концентрацией соли // J.Tokyo Univ. Fish. 1991. - 78, N1. - С. 1 -10.
258. Fuller R. A review: probiotics in man and animals // J. Appl. Bacteriol.-1989.- 66, N 5.- P.365-378.
259. Fuller R. Probiotics in human medicine //Gut. 1991. - 32, N 4. - 439-442.
260. Fuller R. History and development of probiotics // Probiotics. The scientific basis. London: Chapman & Hall, 1992. - P.l-9.
261. Fuller R., Gibson G.R. Modification of the intestinal microflora using probiotics and prebiotics // Scand. J. Gastroenterol. 1997. - 32, Suppl. n 222. - P. 28-31.
262. Garbeva P., van Veen J.A., van Elsas J.D. Predominant Bacillus spp. In agricultural soil under different management regimes regimes detected via PCR-DGGE. // Microb. Ecol. 2003; 45; p.302-316.
263. Garola-Armesto R.M., Sutherland A.D. Temperature characterization of psychrotrophic and mesophilic Bacillus species from milk // J. Dairy Res. 1997. - 64, N 2.-P.261-270.
264. Gaskins HR. Immunological aspects of host/microbiota interactions at the intestinal epithelium. In: Mackie RI, White BA, Isaacson RE, eds. Gastrointestinal microbiology. New York: International Thomson Publishing, 1997: 537-87.
265. Gedek B. Mikrobielle Leistungsforder in der Schweinefutterung // Mitteilungen Tierzucht und Futterung. Wien. - 1987. - P. 13-32.
266. Geddia Т., Cappa F., Cialfi R. et al. Prevelence of nonspecific vaginitis and correlation with Isolation of Gardnerella vaginalis In Italian outpatients //Europ. J. Epidemiol. -1989. -Vol. 5. N 4. -P.529-531.
267. Gedek B. Mikrobielle Leistungsforder in der Schweinefutterung // Mitteilungen Tierzucht und Futterung. Wien. - 1987. - P. 13-32.
268. Gibriel A. Y., Abd-El A.T.H. Measurment of heat resistance parameters for spores isolated from canned products // J.Appl. Bacteriol. 1973. - 36, N 2. - P. 321-327.
269. Gilliland S.E., Nelson C.R., Maxwell C. Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus // Appl. Environ. Microbiol. 1985. - 49, N 2. - P. 377-381.
270. Goh C, Taweechaisupapong S, Taylor KG, Doyle RJ. Polycarboxylates inhibit the glucan-binding lectin of Streptococcus sobrinus// Biochimica et Biophysica ACTA, Sep. 1,1519(1): 111-6,2000
271. Goldin B.R., Gorbach S.L. Alterations in fecal microflora enzymes related to diet, age, Lactobacillus supplements, and dimethylhydrazine // Cancer. 1977. - 40, N• 12.-P. 2421-2426.
272. Goldin B.R., Gorbach S.L. Effect of Lactobacillus acidophilus dietary supplementation on 1,2-dimethylhydrazine dihydrochloride-induced intestinal cancer in rats // J. Natl Cancer Inst. 1980. - 64, N 2. - P. 263-265.
273. Goldin B.R., Gorbach S.L. Effect of milk and Lactobacillus feeding on human intestinal bacterial enzyme activity // Amer. J. Clin. Nutr. 1984. - 39, N 6. - P. 756761.
274. Gonzales R., Pirali F., Ravizzola G. et al. Stimolazione seletiva dell'espressione di antigeni HLA-DR su linfociti T in vivo in seguito a somministrazione di "vaccini" orali // Boll. Microbiol. Indag. Lab. 1989. - 9. - P. 5-9.
275. Green D.H., Wakeley P.R., Page A., et al. Characterization of two Bacillus probiotics. Appl Environ Microbiol 1999;65:4288-91.
276. Guida V., Guida R. Importansia do Bacillus esporulados aerobios em gastroe=nterologia e nutricao // Rev. Brasil, med. 1978. - 35, N12. - P. 702-707.
277. Gupta P.K., Mitai B.K., Garg S.K. Antagonic activity of Lactobacillus acidophilus fermented milk against different pathogenic bacteria // Indian J.Exp. Biol. -1996. -34, №12. -P. 1245- 1247.
278. Ha G.Y., Yang C.H., Kim H., Chong Y. Case of sepsis caused by Bifidobacterium longum. J.Clin. Microbiol, 1999, 37,4, 1227-1228
279. Haenal H., Bendig J. Intestinal flora in health and disease // Progr. Food and Nutr. Sei.- 1975.- N1.- P. 21-64.
280. Hammes W.P., Tichaczek P.S. The potential of lactic acid bacteria for the production of safe and wholesome food // Z. Lebensm. Unters. Forsch. 1994. - 198, N 3. -P. 193-201.
281. Hansen G, Mclntire JJ, Yeung VP, et al. CD4(+) T helper cells engineered to produce latent TGF-betal reverse allergen-induced airway hyperreactivity and inflammation. J Clin Invest 2000; 105: 61-70.
282. Havenaar R., Ten Brink B., Huis in't Veld JHJ. Selection of strains for pro-biotic use//Probiotics. The scientific basis. London: Chapman & Hall, 1992. - P. 209224.
283. Hefco G., Rugina V., Olteanu Z. et al. The influence of various carbon source on the fermentation with a-amylase producing strains of B. subtilis// An. sti. Univ. Iasi. Sei. 1996. - 42. - P. 141-146.
284. Hennequin C., Kauffmann-Lacroix C., Jobert A., et al. Possible Role of Catheters in Saccharomyces boulardii Fungemia//Eur J Clin Microbiol Infect Dis (2000) 19:16-20
285. Henry R. Un nouven traitement de la plaie vaviquese: lemultion de Bacillus subtilis // La Vie Medicala. 1950. - N 1. - P. 75-76.
286. Henry R., Mielle F., Morh H. Le Bacillus subtilis en thérapeutique intestinale // Gaz. Med. France. 1950. - 57, N 10. - P. 537-541.
287. Hillier S.L. Clindamycin treatment of bacterial vaginosis //Rev. Con-temp. Phannacother. -1992. №3. -P. 263-268.
288. Hiller S.L. Diagnostic microbiology of bacterial vaginosis // A»er. J. Obstet. Gynecol. -1993. -P.455-459.
289. Hillier S.L. Krohn M.A. Watts D. et al. Microbiology efficacy of in-travaglnal Clindamycin cream for the treatment of bacetrial vaginosis //Gbstel. Gynecol.• -1990.-Vol. 7. №3.-P. 407-412.
290. Hillier S.L. Eschenbach D.A. Zambrano D. Clindamycin in the treatinent of obstetric-gynecologic infections // Clindamycin in the treatment of human Infections. -Kalamazoo-. The Upjohn Company, -1992. -P. 7.1-7.24.
291. Hiller S.L., Krohn M.A., Rabe L.K., Klebanorr S.J et al. The normal vaginal flora, H 0 -producing lactobactelal vaginosis In pregnant women. //Department of Obstet Gynec. Clin. Infect. DIs. -1993. -vol. lo. -Suppl. 4- -P. 273-281.
292. Hoa NT, Baccigalupi L, Huxham A, et al. Characterization of Bacillus species used for oral bacteriotherapy and bacterioprophylaxis of gastrointestinal disorders. Appl Environ Microbiol 2000; 60:5241-7.
293. Hoerr R.A., Bostwick E.F. Bioactive Proteins and Probiotic Bacteria: Modulators of Nutritional UeaWW/Nutrition Volume 16, Numbers 7/8, 2000: 711-713
294. Hoffman T., Troup B., Szabo A., et al. The anaerobic life of Bacillus sub-tilis: Cloning of the genes encoding the respiratory nitrate reductase system // FEMS Microbiol. Lett. 1995. -131, N 2. - P. 219-225.
295. Holzapfel W.H., Schillinger U. Introduction to pre- and probiotics.//Food Research International 35(2002).- p. 109-116
296. Hong H.A. Due L.H., Cutting S.M. The use of bacterial spore as probiot-ics// FEMS Microbiol. Reviews 29 (2005).- p.813-835
297. Hooper LV, Bry L, Falk PG, et al. Host-microbial symbiosis in the mammalian intestine: exploring an internal ecosystem. BioEssays 1998; 20:336-43.
298. Hosoi T, Amenati A, Kiuchi K, Kaminogawa S. Changes in fecal microflora induced by intubation of mice with Bacillus subtilis (natto) spores are dependent upon dietary components. Can J Microbiol 1999;45:59-66.
299. Hong H.A., Due Le Hong, Cutting Simon M. The use of bacterial spore formers as probiotics//FEMS Microbiology Reviews 29 (2005).- c.813-835
300. Ishibashi N., Yamazaki S. Probiotics and safetyIIAm J Clin Nutr 2001;73(suppl):465S-470S.
301. Isolauri E., Juntunen M., Rautanen T et al. A human Lactobacillus strain (Lactobacillus GG) promotes recovery from acute diarrhea in children// Pediatrics. -1991. 88, N1.-P. 90-97.
302. Isolauri E. Probiotics in human disease// Am J. Clin Nutr 2001;73(suppl): 1142S-6S.
303. Isolauri E, Arvola T, Sütas Y, Salminen S. Probiotics in the management of atopic eczema. Clin Exp Allergy 2000; 30: 1605-10.
304. Ivanova E.P.,Vysotskii M.V., Svetashev V.l. et al. Characterisation of Bacillus strains of marine originII Int. Microbiol. 1992; p.302-316
305. Joesoef M.R., Schmid G.P., Hillier S.L. Bacterial vaginosis: review of treatment options and potential clinical indications for therapy// Clin. Infect. Dis. -1999.-Jan.28, Suppl.l.l-p.57-65
306. Johnson J., Weissman S., Steel A. et al. Clonal and Pathotypic Analysis of Archetypal Escherichia coli Cyctitis Isolate NU14// The Journal of Infectious Diseases,m 2001, 184, p. 900-908
307. Joint FAO/WHO group. Guidelines for the evaluation of probiotics in food. 2002. p. 1-11
308. Jones R, Ellbogen M, Dunlay R. Lactobacillus allograft pyelonephritis and bacteremia//Nephron, Dec 2000, 86(4):502
309. Jshibashi N, Yamazaki S. Probiotic and safety// Am J Clin Nutr, 2001, 73 (suppl), p 4659-4709
310. Jshibashi N, Yamazaki S. Probiotic and safety// Am J Clin Nutr, 2001, 73 (suppl), p 4659-4709
311. Kakkos SK et al. Nonabsorbable antibiotics reduce bacterial and endotoxin translocation in hepatectomised rats HPB// Surg, 1997, 10:5:283-289-291
312. Kalliomaki M., Salminen S., Arvilommi H. et al. Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebo-controlled \хЫ11 Lancet 2001; 357: 1076-79
313. Katz E., Demain A.L. The peptide antibiotics of Bacillus: chemistry, biogenesis and possible function // Bacteriol. Rev. 1977. - 41, N 2. - P. 449-474.
314. Kayser F.H. Safety aspects of enterococci from the medical point of view// International Journal of Food Microbiology 88 (2003) 255- 262
315. Khalafalla S.M., Shehata A.E., Elmagdoub M.N.I, et al. Spore-forming bacteria in buffaloes' milk // Milchwissenschaft. 1976. - 31, N 12. - P. 738-741.
316. Kikuchi Masanory, Hashizume Kiyoko, Matsui Yukio. Изучение бактерий продуцентов протеолитических ферментов в пастеризованном молоке. I. Bacillus subtilis, выделенная из пастеризованного молока // J. Cool. Dairy Agr. - 1972. - 4, N 2.-P. 91-98.
317. Kim H.S., Gilliland S.E. Lactobacillus acidophilus as a dietary adjunct for molk to aid lactose digestion in humans // J. Dairy Sci. 1983. - 66, N 7. - P. 959-966.
318. Kim K.P., Rhee C.H., Park H.D. Degradation of cholesterol by Bacillus subtilis SFF34 isolated from Korean traditional fermented flatfish // Letters in Applied Microbiology 2002, 35,468-472
319. Kim Wonkeuk, Choi Keehyun, Kim Yongtaek et al. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp. strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang // Appl. and Environ. Microbiol. 1996. - 62, N 7. - P. 2482-2488.
320. Kimmey M.B., Elmer G.W., Surawicz C.M., McFarland L.V. Prevention of further recurrences of Clostridium Difficile colitis with Saccharomyces boulardii // Dig. Dis. Sci. 1990.-35.-P. 897-901.
321. King B.D. Microbial inhibition in bakery products a review // Baker's Dig. - 1981.-55, N5.-P. 8-10,12.
322. Knowles S., Choudhury Т., Shear N.H. Metronidazole hypersensitivity .//Ann. Pharmacother. -1994. -V.28(3). -C.325-326.
323. Kolars J.C., Levitt M.D., Aouji M., Savaino D.A. Yogurt an autodigesting source of lactose //New Engl. J. Med. - 1984. - 310, N 1. - P. 1-3.
324. Kornegay E.T., Thomas H.R. Bacterial and yeast preparations for starter and grower rations // Virginia polytechnic Institute and State University, Research• Division Report, N 151. Blacksburg, Virginia, USA, 1973.
325. Korschunov V.M., Smeyanov V.V., Efimov B.A. et al. Therapeutic use of an antibiotiresistant Bifidobacterium preparation in men exposed to high-dose y-irradiation // J.Med. Microbiol. 1996. - 44, N 1. - P. 70-74.
326. Krishnamurthy B.V., Karunasagar I. Microbiology of shrimps handled and stored in chilled sea water and in ice // J. Food Sci. and Technol. 1986. - 23, N 3. -P.148-152.
327. Kruis W et al. Double-blind comparison of an oral E.coli preparation and mesalazine in maintaining remission of ulcerative colitis. Aliment Prarmacol Ther. 1997:11:853-858.
328. Lammers K. M., Helwig U., Swennen E., et al. Effect of Probiotic Strains on Interleukin 8 Production by HT29/19A Cells/ZThe Americ. of Gastroent. 2002- V.97. -№5.-S.l 182-1186
329. Landini P., Corti E., Goldstein B.P., Denaro M. Mechanism of action of purpuromycin // Biochem. J. 1992. - 284, N 1. - P.47-52.
330. Larson P.G. Vaginal flora in health and disease/ Clin. Obstet. Gynecol., 36 (1).- 107.-1993.
331. Larson P.G., Galask R.P. Vaginal microbial flora composition and in-fuences of host physiology .//Ann/ Inter. Med. -1982. -96. -C.926.
332. Lawrence C., Nauciel C. Production of interleukin-12 by murine macrophages in response to bacterial peptidoglycan// Infect. Immun. 1998. - 66, N 10. - P. 4947-4949.
333. Lebbadi M., Galvez A., Valdivia E. et al. Biological activity of Amoebicin m4-A from Bacillus licheniformis M-4 // Antimicr. Agents and Chemother.- 1994. 38, N8.-P. 1820-1823.
334. Lee M.-L.T., Ross R.A., Onderdonk A.B. Application of in vitro and in vivo to the study of micro flora//Microb. Ecol. Health and Bisease. -1995. -8 №1. -C.xxxi.
335. Lee M.-L.T., Ross R.A., Onderdonk A.B. In vitro interactions of vaginal isolates of lactobacilli with other members of vaginal flora// Microb. Ecol. Health and Bisease. -1995. -8 №1. -C.xxxi.
336. Lefebore G.M., Leblanc R. The kinetics of change in bacterial spore germination// Phisiological Models in Microbiology. Boca Raton, Florida: CRC Press Inc., 1988. - II. - P.45-71.
337. Lidbeck A., Edlund C., Gustafsson J.-A. et al. Impact of Lactobacillus acidophilus on the normal intestinal microflora after administration of two antimicrobial agents // Infection. 1988. - 16, N 6. - P.329-336.
338. Lidbeck A., Overvik E., Rafter J. et al. Effect of Lactobacillus acidophilus supplements on mutagen excrection in faeces and urine in humans // Microb. Ecol. Health and Disease. 1992. - 5, N 1. P. 59-67.
339. Lindbeck A., Edlund C., Guatafsson J.-A. et al. Impact of Lactobacillus acidophilus on the normal intestinal microflora after administration of two antimicrobial agents // Infection. 1988.- 16, N 6.- P. 329 - 336.
340. Luc R.G. La importancia del Bacillus subtilis en la terapéutica intestinal // Med. Clin. 195 8. - 31, N 9. - P.420-424.
341. Lukasova J. Proteolyticke mikroorganismy v jatrovych vyrobcich // Vet. med. (CSSR). 1982. - 27, N 3. - P.185-190.
342. Lulko A., Molehanov R. New remedy aerococcobacterinum for local wound treatment // 5th Eur. Congr. Clin. Microbiol, and Infect. Diseases, Oslo, Sept. 911,1991: Abstr.-Oslo, 1991.-P. 130.
343. Lyons T.P., Fallon R.J. The probiotic concept: comming of age// World Biotech. Rept., 1986. prot. Conf., San Francisco, nov. 1986. Vol.2., Pt.7., New York, London. 1986. - P.69-80.
344. Majamaa H, Isolauri E. Probiotics: a novel approach in the management of food allergy. Jllergy Clin Immunol 1997; 99: 179-85.
345. Malchow H.A.Crohn's disease and E.coli. A new approach in therapy to maintain remission of colonic Crohn's disease. J.Clin.Gastroenterol. 1997:25:653-658.
346. Malin M, Verronen P, Korhonen H, et al. Dietary therapy with Lactobacillus GG, bovine colostrum or bovine immune colostrum in patients with juvenile chronic arthritis: evaluation of effect on gut defence mechanisms. Inflammopharmacology 1997;5:219-36.
347. Manca M.C., Lama L., Improta R. et al. Chemical composition of two exopolysaccharides from Bacillus thermoantarcticus // Appl. and Environ. Microbiol. -1996.-62, N9.-P. 3265-3269.
348. Marcy J.A., Kraft A.A., Hotchkiss D.K. et al. Effect of acid and neutral pyrophosphates on the natural bacterial flora of a cooked meat system // J.Food Sci. 1988.- 53, N 1. P. 28-30.
349. Marteau P., Rambaud J-C. Potential for using lactic acid bacteria for therapy and immunomodulation in man // FEMS Microbiol Rev. 1993. - 12. - 207-220.
350. Marteau P. Impact of ingested lactic acid bacteria on the immune response in man // Lactic acid bacteria, actes du colloque Lactic 94. Caen: Presses Universitaires deCaen, 1995. - P. 31-42.
351. Marteau P., Seksik P. Jian R. Probiotics and intestinal health effects: a clinical perspective // British Journal of Nutrition (2002), 88, Suppl. 1, S51-S57
352. Marteau P., Boutron-Ruault M. C. Nutritional advantages of probiotics and prebiotics// British Journal of Nutrition (2002), 87, Suppl. 2, S153-S157
353. Martinez FD, Holt PG. Role of microbial burden in aetiology of allergy and asthma. Lancet 1999; 354 (suppl 2): 12-15.
354. Marshall V.M., Taylor E. Ability of neonnatal human Lactobacillus isolates to remove cholesterol from liquid media // Int. J. Food Sci. and Technol. 1995. - 30, N 5.-P. 571-577.
355. Martin J.H. Heat resistant mesophilic microorganisms// J. Dairy Sci. 1981.- 64, N 1. P. 149-156.
356. Mayer L. Mucosal immunity and gastrointestinal antigen presentation. Pe-diatr Gastroenterol Immunol 2000; 30(Suppl):S4-S12.
357. Mazza P. The use of Bacillus subtilis as an antidirrhoeal microorgan-ism//Boll. Chim. Farm. -1994. 133. -p.3-18
358. Mcfarlane G, Cummings JH. Probiotics and prebiotics: can regulating the activities of intestinal bacteria benefit health? BMJ 1999; 318: 999-1003.
359. McGhee JR, Lamm ME, Strober W. Mucosal immune responses: an overview. In: Pearay LO, ed. Mucosal immunology. San Diego: Academic press, 1999:485506.
360. Me Tigue M.A., Kelly C.T., Doyle E.M., Fogarty W. The alkaline amylase of the alkalophilic Bacillus sp. IMD 370 // Enzyme and Microb. Technol. 1995. - 17, N 6.-P. 570-573.
361. Mendonca Analucia Longman, Mariano Rosa de Lima Ramos, de Araujo Janete Magali et al. Bacillus spp. produtores de proteases: isolamento, caracterizacao e melhoramento de В. cereus (C124) //Arg. biol. e tecnol. 1996. - 39, N 2. - P. 359-372.
362. Michanie S., Bryan F.L., Alvarez P. et al. Critical control points for foods prepared in households whose members had either allerged typhoid fever or diarrhea // Int. J. Food Microbiol. 1988. - 7, N 2. - P. 123-134.
363. Mitchel AR, Hayek LJ. Lactobacillus endocarditis//.! Infect, May 1999, 38(3):200-201
364. Miyzuchi Masaki, Shinano Haruo, Akiba Minoru Микробиологическое изучение термообработанпых продуктов. I Выживаемость микроорганизмов в консервах промыш-ленного изготовления // Bull. Fac. Fish. Hokkaido Univ. 1980. - 31, N4.-P. 362-373.
365. Muller U. Fleisch- und Fleischproduktver- derbnis eiweibabbauende aerobe Sporenbildner // Fleischerei. 1995. - 46, N 9. - P. 66-68, 73-74, 76, 78-79.
366. Muscettola M, Grasso G, Blach-Olszewska Z, et al. Effects of Bacillus sub-tilis spores on interferon production. Pharmacol Res 1992;26:176-7.
367. Muscettola M., Grasso G., Migliaccio P., Gallo V.C. Plasma interferon-like activity in rabbits after oral administration of Bacillus subtilis spores // J. Chemother. -1991. 3, Suppl. 3. - P. 130-132.
368. Nagy E., Petterson M., Mardh P.A. Antibiosis between bacteria isolated from the vagina of women with and without sings of bacterial with joghurt// Acta Ob-stet.Gynecol.Surv. -1993. -V.72. -1 1. -P. 17-19.
369. Nakayama M, Itoh K, Takabashi E. Cyclophosphamid induced bacterial translocation in E.coli C25-monoassociated specific pathogen-free mice// Microbiol Immunol, 1997,41:8:587-593
370. Neri A., Rabinerson D., Kaplan B. et al. Bacterial vaginoss drugs versus alternative treatment.// Obstet.Gynecol.Surv. -1994. -49(12). -C.809-813.
371. Netherwood T, Bowden R, Harrisson P, O'Donnel AG et al. Gene transfer in the gastrointestinal tract//Appl Env Microbiol, Nov 1999, v 65, No 11, p 5139-5141
372. Nicholson W. L., Munakata N., Horneck G. et al. P. Resistance of Bacillus endospores to extreme terrestrial and extraterrestrial environments. Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2000) 64: 548-572
373. Nicholson W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment.// CMLS, Cell. Mol. Life Sei. 59 (2002) 410^16
374. Nikodemusz I. Microbiologie des viandes et charcuteries en Hongrie // Med. et nutr.- 1982.- 18, N 1.-P.61-62.
375. Nomoto K., Yokokura T., Mitsuyama M. et al. Prevention of indigenous infection of mice with Escherichia coli by nonspecific immunostimulation // Antimicrob. Agents and Chemother. 1992. - 36, N 2. - P. 361-367.
376. Ocana V., Pesce A., Holgado R. Characterisation of bacteriocin-like substance produced by vaginal Lactobacillus salivarius strain. Appl. Envir. Microbiol. 1999, 65 (12): 5631-5635/
377. Odunfa S. A., Adewuyi E. Y. Optimization of process of conditions for the fermentation of locust bean (Parkia biglobosa) // Chem., Microbiol., Technol. Lebensm. -1985,- 9, N5,- P. 6-10.
378. Odunfa S. A., Oyewole O.B. Identification of Bacillus species from "iru", a fermented African locus bean product// J. Basic Microbiol. 1986. - 26, N 2. - P. 101-108.
379. Ogbadu L.J., Okagbuet R.N. Fermentation of African locus bean (Parkia biglobosa) seeds: involvement of different species of Bacillus // Food Microbiol. 1988. -5,N4.-P. 195-199.
380. Oggioni M. R., Ciabattini A., Cuppone A. M., Pozzi G. Bacillus spores for vaccine delivery Vaccine 21 (2003) S2/96-S2/101
381. Ohashi A. Clinlcobacteriological study on nilcrobiol flora in the vaginal mi-crobiol flora accosding to the menstrual cycle //J.Jap.Ass.Infect.Dis., -1980 -V.54, 1 7 -321-330.
382. Onda T., Yanagida F. Tsuji M., et al. Time series analysis of aerobic bacterial flora during Miso fermentation// Letters in Applied Microbiology 2003, 37, 162-168
383. Orhage K, Nord C.E. Bifidobacteria and lactobacilli in human health // Drugs Exp. And Clin. Res. 2000. - 26, №3. - C.95-111.
384. Ouwehand AC. Antimicrobial components from lactic acid bacteria. In: Salminen S, von Wright A, eds. Lactic acid bacteria, microbiology and functional aspects. New York: Marcel Dekker Inc, 1998:139-60.
385. Ovejro de Aqua S., Suarez F., Santos J. Estudio de la microflora del genero Bacillus en semiconservas carnicas // An. Fac. Veterin. 1972. - 18, N1. - P.41-51.
386. Overman B.A. The vaginal as an ecologic system. Current in standing and clinical applications. // J. Nurse Midwifery. -1993. Vol. 38,1 3. - P. 146-151.
387. Owens WE, Berg RD. Devivation of a breeding colony of germ-free athymic mice by cesarean section and faster nursing// J Immunol Methods, 1981, 42:1 :-115-119
388. Palumbo S. Identification of Bacillus from sausage products and species // J. Appl. Bacteriol. 1978. - 38, N 2. - P. 99 - 105.
389. Pandey J.N., Sharma T.S. Studies on the bacterial content of pasteurized milk of milk supply scheme "Patna" in relation to public health // Indian J. Microbiol. -1979,- 19, N4.-P. 236-237.
390. Pat No 10147536 (1998). Agent for disease caused by bacterial toxin
391. Pat No 10287521 (1998) 0157 bactericine and its production
392. Pat No 10298105 (1998). Preventing and curing agent for infectious disease caused by enterohemorrhagic E.coli
393. Pelug W., Lingens F. Vitamin B6 biosynthese in Bacillus subtilis // Hoppe-m Seyler's Z. Phisiol. Chem. 1978. - 359, N 5. - P. 559-570.
394. Perdigon G, Macias M.E.N., Alvarez S. et al. Effect of perorally administered Lactobacilli on macrophage activation in mice // Infect. Immun.- 1986.- 53, N 2. P.404-410.
395. Perdigon G., Alvarez S., Rachid M. et al. Symposium: probiotic baceria for humans: clinical systems for evaluation of effectiveness. Immune system stimulation by probiotics//J. Dairy Sci. 1995. - 78, N 12. - P. 1597-1606.
396. Perdigon G.,, Alvarez S., Nader de Macias M.E. Lactobacilli administered orally induce release of enzymes from peritoneal macrophages in mice // Milchwiss.1986.-41,N6.-P. 344-348.
397. Pichard B., Larue J.-P., Thouvenot D. Gavaserin and saltavarin, new peptide antibiotics produced by Bacillus polymyxa // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - 133, N 3.-P. 215-218.
398. Platz-Christensen J.J., Mattsby-Baltzer I., Thomsen P. et al. Endotoxin and interleukin-1 alpha in the cervical mucus and vaginal fluid of pregnant women with bacterial vaginosis.//Am.J.Obstet. Gynecol. -1993. Vol.l69(5). -C.l 161-1166.
399. Pothoulakis C., Kelly C.P., Joshi M.A.D. et al. Saccharomyces boulardii inhibits Clostridium difficile toxin A binding and enteroxicity in rat ileum // Gastroenterology. 1993. - 104. - P.l 108-1115.
400. Prokesova L., Novakova M., Mara M. Effect of Bacillus firmus and other sporulating aerobic microorganisms on in vitro stimulation of human lymphocytis // Folia Microbiol. 1994. - 39. - P. 501-504.
401. Pulkkinen P., Saranen M., Kaaja R. Ametronidazole combined with nystatin (vagitories) in the prevention of bacterial vaginosis after initial treatment with oral metronidazole.//Gynecol Obstet Invest. -1993. -36(3). -C.l81-184.
402. Rambaud J.C. Ecologie bacterienne du tube digestif et defense de l'organisme// Ann. Gastroenterol. Hepatol. Paris. 1992. - 28, N 6-7. - P. 263-266.
403. Rasavi B, Shilling M. Chondritis attributable to Lactobacillus after ear piercing//Diagn Microbiol Infect Dis, May 2000; 37(1 ):75-76
404. Read A.E., McCarthy C.F., Heaton K.W., Laidlow J. Lactobacillus acidophilus (ENPAC) in treatment of hepatic encephalopathy// Brit. Med. J. 1966. - 1, N 12. - P.1267-1269.
405. Reid G, Bruce AW, McGroarty JA. et al. Is there a role for Lactobacilli inprevention of urogenital and intestinal infections? Clin Microbiol Rev 1990; 3:335-44.
406. Reid G. Probiotic agents to protect the urogenital tract against infection// Am J Clin Clin. 2001, Nutr, 73 (suppl), 437s-443s
407. Reid G. Probiotic Therapy and Functional Foods for Prevention of Urinary Tract Infections: State of the Art and Science// Curr Infect Dis Rep Dec 2000;2(6):518-522
408. Renner H.W., Munzner R. The possible role of probiotics as dietary an-timutagen // Mutat. Res. 1991. - 262, N 4. - P. 239-245.
409. Research news. Microbiology of milk and milk products // Milk Ind. 1992. -94,N4.-P. 29, 32,33.
410. Rocchietta J. The use of Bacillus subtilis in the treatment of the diseases // Minerva Med. 1969. - 60, N 3/4. - P. 117-123.
411. Roczniakowa В., Kujawa K. Lactobacillus acidophilus w profílaktyce I lec-zeniu zaburzen truwiennych u zwierzgt // Prz. hodow. 1987. - 55, N 3. - P. 5-7.
412. Rodney D., Berg P.D. Bacterial translocation from the gastrointestinal tract //Медицинские аспекты микробной эколоии. -М., 1993/1994.- Вып. 7/8, 4.1. С.53-70.
413. Rogers R. Bacillus isolated from refrigerated doughs, wheat flour and wheat//Cereal Chem. 1978. - 55, N 5. - P. 671 - 674.
414. Roos N. M., Katan M. B. Effects of probiotic bacteria on diarrhea, lipid metabolism, and carcinogenesis: a review of papers published between 1988 and \ШИАт J Clin Nutr 2000;71:405-11.
415. Rosenfeldt V, Michaelsen KF, Jakobsen M. et al. Effect of probiotic Lactobacillus strains in young children hospitalized with acute diarrhea //Pediat. Infect. Disease J. May 2002. 21 (5): 411-416
416. Rowland I.R. Metabolic interactions in the gut // Probiotics. The scientific basis. London: Chapman & Hall, 1992. - P. 29-53.
417. Rusch V. Immunostimulation als therapeutisches Prinzip // Wiss. Z. E. M. Arndt-Univ., Greifswald. Med. R. 1989. - 38, N 1-2. - P. 75-82.
418. Saarela M., Máttó J., Mattila-Sandholm T. Safety Aspects of Lactobacillus and Bifidobacterium Species Originating from Human Oro-gastrointestinal Tract or from Probiotic Products//Microbial Ecology in Health and Disease 2002; 14: 233-240
419. Saavedra JM. Microbes to fight microbes: a not so novel approach to controlling diarrheal disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1995; 21: 125-9.
420. Sakata Hiroshi, Fujita Kozo, Yoshioka Hajime. The effect of antimicrobial agents on fecal flora of children// Antimicrob. Agents and Chemother. 1986. - 29, N 2. -P. 225-229.
421. Salminen S, Bouley C, Boutron-Ruault MC, et al. Functional food science and gastrointestinal physiology and function. Br J Nutr 1998; 80 (suppl 1): 147-71.
422. Salminen S, Isolauri E, Salminen E. Clinical uses of probiotics for stabilizing the gut mucosal barrier: successful strains and future challenges. Antonie Van Leeu-wenhoek 1996;70:347-58.
423. Salminen S, Laine M, von Wright A. et al. Development of selection criteria for probiotic strains to assess their potential in functional foods: a Nordic and European approach. Biosci Microflora 1996;15:61-7.
424. Salminen S, Bouley C, Boutron-Ruault MC, et al. Functional food science and gastrointestinal physiology and function. Br J Nutr 1998; 80 (suppl 1): 147-71.
425. Salminen S, Isolauri E, Salminen E. Clinical uses of probiotics for stabilizing the gut mucosal barrier: successful strains and future challenges. Antonie Van Leeu-wenhoek 1996;70:347-58.
426. Salminen S, von Wright A, Morelli L. et al. Demonstration of safety of probiotics // Int J Food Microbiol, 1998, Oct 20;44(l-2):93-106
427. Salvatorelli G., Marchetti M.G., Betti V. et al. Comparison of the effects of microwave radiation and conventional heating on Bacillus subtilis spores // Microbios. 1996.- 87,N352.-P. 169-174.
428. Sanders M.E., Morelli L., Tompkins T.A. Sporeformers as human probities: Bacillus, Sporolactobacillus, and Brevibacillus//Comprehensive Rev. Food Sci. Food safety 2,- 2003.- p. 101 -110
429. Sanfilippo L, Li CK, Seth R. et al. Bacteroides fragilis enterotoxin induces the expression of IL-8 and transforming growth factor-beta (TGF-beta) by human colonic epithelial cells. Clin Exp Immunol 2000; 119: 456-63.
430. Schaechter M., Medoff G., Eisenstein B.(.//Mechanisms of Microbioal Disease -2 nd ED. Baltimore, 1991
431. Schmidt H., Hansen J.G. A wet smear criterion for bacterial vagino-sis.//Scand J. Prim. Health. Care. -1994. 12(4). -C.233-238.
432. Senesi S. Bacillus spores as probiotic products for human use// In: Ricca E., Henriques A.O., Cutting S.M., eds. Bacterial spore formers: probiotics and emerging application. Norfolk, UK: Horizon Bioscences Press; 2004. -p. 131-141
433. Senesi S, Celandroni F, Tavanti A, Ghelardi E. Molecular characterization and identification of Bacillus clausii strains marketed for use in oral bacteriotherapy. Appl Environ Microbiol 2001;67:834-9.
434. Simon GL, Gorbach SL. Normal alimentary tract microflora. In:Blaser MJ, Smith PD, Ravdin JI, Greenberg HB, Guerrant RL, eds. Infections of the gastroenterology tract. New York: Raven Press, 1995:53-68.
435. Smirnov V. V., Reznik S. R., Vasziljevskaja I. A. Aerob sporakepzo Bakte-riumok. Budapest: Medicina, 1986. - 224 p.
436. Soper D.E. Bacterial vaginosis and postoperative infections.//Am J Obstet Gynecol. 1993. -169(2 Pt 2). - C.467-469.
437. Spinosa MR, Braccini T, Ricca E. On the fate of ingested Bacillus spores. Res Microbiol 2000;151:361-8.
438. Spreafico F., Polentarutti N., Vecchi A. et al. L'effetto immunostimolatore dell spore di B. subtilis: aspetti sperimentali// Chemioter. Antimicrob. 1980. - 4. - P. 259- 261.
439. Strange R.E., Dark F.A. Cell-wall lytic enzymes at sporulation and spore germination in Bacillus subtilis apecies // J. Gen. Microbiol. 1957. - 17, N 2. - P. 525537.
440. Sudo N, Sawamura S, Tanaka K, Aiba Y, Kubo C, Koga Y. The requirement of intestinal bacterial flora for the development of an IgE production system fully susceptible to oral tolerance induction. J Immunol 1997; 159: 1739-45.
441. Surawicz C.M., McFarland L.V., Elmer G.W., Chinn J. Treatment of recurrent Clostridium difficile colitis with vancomycin and Saccharomyces boulardii // Am. J. Gastroenterol. 1989. - 84. - P. 1285-1287.
442. Swedberg J., Steiner I.F., Deiss F. et al. Comparison of singie-dose vs, one-week course of metronidazole for symptomatis bacterial vaginosis.//JAMA. -1985. -254. -C.1046-1049.
443. Tachikawa T; Seo G; Nakazawa M; Sueyoshi M; Ohishi T; Joh K Estimation of probiotics by infection model of infant rabbit with enterohemorrhagic Escherichia coli 0157-.H7). Kansenshogaku Zasshi, 72(12): 1300-5 1998 Dec
444. Takahara Y., Hirose Y., Yasuda N. et al. Effects of peptidelipids produced by Bacillus on the enzymatic lysis of gram-negative bacterial cells // Agric. Biol. Chem. -1976.-40, N9.-P. 1901-1903.
445. Takahashi M; Taguchi H; Yamaguchi H; Osaki T; Sakazaki R; Kamiya S. Antagonistic interaction between Clostridium butyricum and enterohemorrhagic Escherichia coli OI57:H7. Kansenshogaku Zasshi, 73(1):7-14 1999 Jan
446. Tamang, J.P. Role of microorganisms in traditional fermented foods. Indian Food Ind. 1998. V. 17, 162- 167.
447. Tamminga K., Beumer R. R., Kampelmacher E.H., Keijbets M.J.H. Mikro-bieel bederf van geschilde, geheel of gedeeltelijk gaargekookte, vakuumverpakte aardap-pelen // Voedingsmid-delentechnologie. 1980. - 13, N 20. - P. 12-17.
448. Tan T.C., Qian Z.R. Activity of the enzyme system in thermally killed Bacillus cells//Enzyme and Microb. Technol. 1996. - 19, № 2. - P. 150-156.
449. Tannock G.W. The normal microflora: new concepts in health promotion // Microbiol. Sci. 1988. - 5, N1. - P. 4-8.
450. Tannock G.W. Probiotic properties of lactic-acid bacteria: plenty of scope for fundamental R&D.TIBTECH July 1997 (V.15):270-274
451. Tannock G.W. Probiotics. A Critical Review. Horizon Sci. Press, Norfolk, England. 1999
452. Tannock G.W. Molecular assessment of intestinal microflora. Am.J.Clin.Nutr. 2001,73 (suppl):410-414
453. Tanzer JM, Livingston J, Thompson AM. The microbiology of primary dental caries in humans// J Dent Educ, Oct 2001, 65(10): 1028-37
454. Thach P.N., Vu T.C., Nguen T.H. Le Bacillus subtilis en therapeutique et dans la prophilaxie // Rev. Immunol. 1968. - 72, N S. - P. 53-58.
455. Thomas S.B. The microflora of bulk collected milk. Part I.// Dairy Ind. -1974. 39, N 7. - P.237-240.
456. Thompson C, McCarter YS, Krause PJ et al. Lactobacillus acidophilus sepsis in neonate. J Perinatal, Jun 2001; 21(4):258-260
457. Tenne F.D., Foor S.R., Sinclair J.B. Association of Bacillus subtilis with soybean seed // Seed Sci. Technol. 1977. - 5, N 4. - P. 763-769.
458. Tihole F. Fizioloski pomen bacteriemije z jejunalno mikrofloro// Zdrav. vestn.- 1982.- 51.-P.3-5.
459. Tirel M.L., Levesque A., Lefrancois S. //Comp. Immunol. Microbiol. Infect.-1990. -13, N 3. P. 155-162.
460. Tohyama K., Kobayashi Y., Kan T. et al. Effect of lactobacilli on urinary indican excretion in gnotobiotic rats and man // Microbiol. Immunol. 1981. - 25, N 1. -101-112.
461. Tran Thu Hua, Le Hong Due, Isticato R., Baccigalupi L. et al. Fate and Dissemination of Bacillus subtilis Spores in a Murine Mode//Appl. And Envirjn. Macrobiol. , Sept. 2001, Vol. 67, No. 9, p. 3819-3823
462. Tuomola E., Crittenden R., Playne M. et al. Quality assurance criteria for probiotic bacteria //Am J Clin Nutr 2001;73(suppl):393S-8S.
463. Ucuncu E.E. Untersuchungen über die Mikroflora des türkischen Kefirs // Dtsch. Milchwirt. 1989.40, N 2. - P. 898-899.
464. Van der Waaij D. Antibiotic choice: The importance of colonization resis-tance.//N.Y.:Acadlmic Press. -1983. -298 C.
465. Vaerewijck M.J.M., Vos P. De, Lebbe L., et al. Occurrence of Bacillus sporothermodurans and other aerobic spore-forming species in feed concentrate for dairy cattle//Journal of Applied Microbiology 2001,91, 1074-1084
466. Vanderhoof J. A. Probiotics: future directionsIIAm J Clin Nutr 2001;73(suppl):l 152S-5S.
467. Vanderhoof JA, Young R. Use of probiotics in childhood gastrointestinal disorders. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1998; 27:323-32.
468. Vaseeharan B,. Ramasamy P. Control of pathogenic Vibrio spp. by Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimp Penaeus monodon// Letters in Applied Microbiology 2003, 36, 83-87
469. Von Bockelmann I. Bacillus i miolk och gradde // Nord, mejeriind. 1977. -4, N 12. - P.523, 526-527.
470. Waes, G. Aerobic mesophilic spores in raw milk. Milchwissenschaft (1976)31,521-525.
471. Wang J., Fung D. Y., 1996. Alkaline-fermented foods: a review with emphasis on pidan fermentation. Critical Reviews in Microbiology, 22, 2 , 101-138.
472. Wei H., Kan E. Bacillus cereus "Cereobiogen" as a growth promoter of Bifidobacterium in infantile diarrhea therapy// Recent advances in germfree research. Tokyo: Tokai University press, 1981. - P. 475-480.
473. Weinder P.M. Ein Beitrag zur mikrobiologischrn Qualitätskontrolle von AFG // Getranke-Ind. 1982. - 36, N 1. - P.18-19,20,22.
474. Wolf, B. W., Garleb, K. A, Ataya, D. G., Casas I.A. 1995. Safety and tolerance of Lactobacillus reuteri in healthy adult male subjects. Microbial Ecology in Health and Disease, 8,41-50
475. Work E. The action of a lytic enzyme from spores of a Bacillus on various species of bacteria // Ann. Inst. Pasteur. 1959. - N 4. - P. 468-480.
476. Wu C. Li Z., Xiong D. Relationship between enteric microelogic disbiosis and bacterial translocation in acute necrotizing pancreatitis// World J Gastroenterol, Jun 1998,4(3)242-245
477. Wu C, Li Z. The pathogenesis of infection complicated by acute ne-crozing pancreatitis: an experimental study// Zhonghua Wai Ke Za Zhi , Apr 1998, 36(4):23 0-233
478. Yakimov M.M., Timmis K.N., Wray V., Fredrickson H.L. Characterization of a new lipopeptide surfactant produced by thermotolrrant and halotolerant subsurfase Bacillus licheniformis BAS50// Appl. Envir. Microbiol. 1995. - 61, N 5. - P. 1706-1713.
479. Yoshii, H. Vol. V Microorganisms in Miso. In Miso Technical Handbook ed. Zenkoku Miso Gijutu-kai pp. Tokyo: Meiwa Insatsu. (1996) 45-51.
480. Zhang X, Rosenberg HM, Doyle RJ. Inhibition of the cooperative adhesion of Streptococcus sanguis to hydroxylapattte// FEMS, Sep. 15; 59(3):315-8, 1990
-
Осипова, Ирина Григорьевна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2006
-
ВАК 03.00.07
- Морфофункциональная оценка влияния пробиотика олин на организм цыплят-бройлеров
- Обмен веществ и продуктивность молодняка свиней при применении комплекса пробиотиков в условиях промышленной технологии
- Жидкая форма пробиотика Биод-5 и его эффективность при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят
- Влияние пробиотиков Ветом 2, Оралин 35G и Энтероцин на продуктивность и естественную резистентность организма молодняка кроликов
- Экспериментальное обоснование применения различных лекарственных форм пробиотиков для коррекции дисбиозов влагалища
