Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЭФР - зависимая передача сигнала при участии фосфолипазы С γ1 и транскрипционного фактора SP1

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "ЭФР - зависимая передача сигнала при участии фосфолипазы С γ1 и транскрипционного фактора SP1"

На правах рукописи

ЧУПРЕТА ¿^^Б ОД Сергей Владимирович 1 ^

ЭФР-ЗАВИСИМАЯ ПЕРЕДАЧА СИГНАЛА ПРИ УЧАСТИИ ФОСФОЛИПАЗЫ Су1 И ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА

ЭР1

03.00.25 - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1999

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, С.-Петербург и Университете Мичигана, Анн Арбор, США

Научные руководители: Проф. Ю. Мершант,

Университет Мичигана, США кандидат биологических наук Н.Д.Медведева Институт цитологии РАН С.-Петербург

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук И.М. Константинова Институт цитологии РАН С-Петербург

доктор биологических наук В.И.Морозов

НИИ физической культуры С-Петербург

Ведущее учреждение: Биолого-почвенный факультет

Санкт-Петербургского Государственного

Университета, С.-Петербург

Защита состоится "2?. "января 2000 года в 12> ч. на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института цитологии РАН Реферат разослан "25" 1999 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета д.б.н. Л.Н.Писарева

Ь -М'^3/ Ъ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одно из ключевых мест в клеточной биологии занимает изучение механизмов проведения клеточного сигнала. Особое внимание при этом уделяется факторам роста - полипептидам, регулирующим пролиферацию, дифференцировку, либо апоптоз разных типов клеток. Наиболее изученным на сегодняшний день является эпидермальный фактор роста (ЭФР). Связываясь на поверхности клеточной мембраны со специфическим рецептором, ЭФР вызывает в клетке ряд событий, приводящих в конечном счете к передаче внешнего сигнала на геном.

Классическая схема ЭФР-опосредованной передачи сигнала в клетке включает в себя ассоциацию ЭФР с рецептором ЭФР (ЭФР-Р), что вызывает димеризацию последнего и автофосфорилирование рецепторной тирозинкиназы, расположенной на С-концевом участке молекулы ЭФР-Р и экспонированной в цитоплазму. Активированная таким образом тирозинкиназа ЭФР-Р приобретает, в свою очередь, способность активировать, путем фосфорилирования, ряд внутриклеточных субстратов, осуществляющих дальнейшее проведение сигнала (Никольский и др., 1987). Наиболее изученными на сегодняшний день являются так называемые STAT и Ras пути проведения сигнала. В первом случае активная тирозинкиназа ЭФР-Р вызывает фосфорилирование STAT белков, что влечет за собой образование транскрипционноэктивных гомодимеров которые, в свою очередь, транспортируются в ядро, где вызывают активацию генов раннего ответа (Darneü, 1997). Центральным событием Ras-пути передачи сигнала является активация малой ГТФазы Ras. Далее сигнал с активированного Ras передается на каскад серин-треониновых протеинхиназ. Первой в этом ряду оказывается с-Raf киназа, которая передает сигнал на МЕК киназы, а те, в свою очередь, активируют серин-треониновые киназы ERK семейства. Последние

транспортируются в ядро, где фосфорилируют такие ядерные мишени, как Elk-1, Elf-1, а также Sapla (Marshall, 1994).

Необходимо отметить, что одновременно с активацией сигнальных путей, мембранный ЭФР-Р кластеризуется в окаймленных ямках и интернализуется в эндосомы (Pastan, Willingham, 1981). В дальнейшем ЭФР-рецепторные комплексы могут рециклировать на плазматическую мембрану, либо транспортироваться в составе зндосом в область пара-Гольджи, где затем деградируют в лизосомах (Beguinotet al., 1984, Sorkin et al., 1988). Первоначально считалось, что интернализация активированного рецептора ЭФР является механизмом, обеспечивающим снижение уровня сигнала, однако в последнее время появились работы, свидетельствующие об участии интернализованных рецепторов в активации таких сигнальных молекул, как фосфоинозитол-3-киназы и ERK1.2 (Vieira et al., 1996, Xue, lucocq, 1998). Таким образом, хотя и на единичных примерах, было продемонстрировано участие интернализованного рецептора в проведении сигнала. Хорошо установленным фактором является то, что рецептор-опосредованный эндоцитоз зависит от системы микротрубочек. В связи с этим, особый интерес приобретает проблема участия цитоскелета в процессе передачи сигнала в клетке. С другой стороны, в последние годы активно изучается феномен перестройки цитоскелета под действием факторов роста. Показана ассоциация многих сигнальных белков с элементами цитоскелета и активная роль цитоскелета в проведении клеточного сигнала (Ding et al., 1996, Keenan and Kelleher, 1998). Тем не менее, роль интернализованного рецептора факторов роста и роль цитоскелета, вносящих существенные изменения в классическую картину передачи сигнала под действием ростовых факторов, остается далекой от полного понимания. Парадоксально, но до настоящего недостаточно внимания уделяется изучению механизмов передачи сигнала, запускаемых рецепторами факторов роста выходящих за рамки STAT и Ras-путей передачи сигнала. Так, крайне мало известно о механизме регуляции активности такого ключевого фермента как фосфолипаза С..

Фосфолипаза Су1 (ФЛСу1) - субстрат рецепторов факторов роста -является одним из ключевых участников передачи сигнала в клетках. Активированная ФЛСу1 осуществляет гидролиз фосфоинозитид(4,5)-бифосфата с образованием вторичных мессенджеров - фосфоинозитид(1,4,5)-трифосфата и диацилглицерина, которые, в свою очередь, вызывают выход ионов Са2+ из внутриклеточных депо и активируют протеинкиназу С (Berridge, 1993). Известно, что ФЛСу1 активируется при действии на клетку факторов роста, и в частности, ЭФР (Cockroft , Thomas, 1992.). Однако механизм этой активации до сих пор остается неясным. Так .например показано, что в отсутствие стимуляции ростовыми факторами, хлетки содержат пул активной ФЛСу1, вполне достаточный для гидролиза значительного количества фосфоинозитид(4,5)-бифосфата и запуска дальнейших каскадов передачи сигнала (Rhee, 1991). Таким образом можно предположить существование дополнительных механизмов, участвующих в регуляции активности данного фермента.

Крайне мало на сегодняшний день известно о механизмах передачи сигнала при помощи факторов роста на транскрипционные факторы семейства Sp1. Данные транскрипционные факторы имея в составе молекулы ДНК-связывающий цинковый мотив обладают способностью активировать широкий спектр генов содержащих GC-богатые промоторы (Kadonaga et al., 1987). На настоящий момент охарактеризовано несколько протеинкиназ модулирующих активность данного семейства транскрипционных факторов, а также показана роль б этом процессе О-гликозилирования (Нзп., Kudîovv , 13S7). Так например, описано участие в активации Sp1 для протеинкиназы С (РКС), а так же ДНК-зависимой протеинкиназы (Pal et al., 1998, Chun et al., 1998). Не так давно была продемонстрирована активация транскрипционного фактора Sp1 под действием ЭФР, однако вопрос о механизмах проведения сигнала с рецептора ЭФР на Sp1 до настоящего времени остается открытым (Ford et al., 1997). Таким образом, необходимо признать, что несмотря на значительные успехи в данной области, сложившаяся картина передачи митогенного сигнала с

рецепторов ростовых факторов на клеточный геном далека от завершения и имеет в своем составе ряд белых пятен.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось, изучение возможных механизмов, регулирующих проведение клеточного сигнала под действием ЭФР на примере ФЛСу1 и транскрипционного фактора Бр1.

В связи с этим задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1. Определить с какими элементами цитоскелета взаимодействует ФЛСу1 в клетках А-431.

2. Выяснить возможность активации ФЛСу1 интернализованным рецептором ЭФР.

3. Изучить механизмы активации транскрипционного фактора Эр1 при действии ЭФР.

4. Охарактеризовать протеинкиназу, участвующую в активации транскрипционного фактора Бр1.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Фосфолипаза Су1 под действием ЭФР ассоциируется с интернализованным рецептором ЭФР в составе эндосом и перераспределяется вместе с ним в ходе рецептор-опосредованного эндоцитоза.

2. ФЛСу1 ко-локализуется с цитокератиновыми промежуточными филаментами.

3. ЭФР-зависимая активация транскрипционного фактора Бр1 осуществляется при участии новой серин/треониновой протеинкиназы.

Научная новизна работы

Изучена внутриклеточная локализация и перераспределение под действием ЭФР фосфоинозитид-специфической фосфолипазы Су1 в клетках А-

431. Впервые показана ассоциация ФЛСу1 с промежуточными филаментами цитокератиновой природы.

Продемонстрирована возможность активации ФЛС-/1, а также других цитоплазматических сигнальных молекул при помощи интернализованного ЭФР-Р.

Изучена динамика активации транскрипционного фактора Sp1 под действием ЭФР. Показано, что проведение митогенного сигнала, запускаемого рецептором ЭФР, и приводящее к активации Sp1 осуществляется с участием Ras- пути передачи сигнала.

Выявлена новая серин-треониновая киназа осуществляющая активацию транскрипционного фактора Sp1. Показано, что ERK и ERK-родственные киназы не участвуют в фосфорилировании Sp1. Осуществлена частичная очистка "Sp1 киназы" и охарактеризованы ее свойства.

Теоретическое и практическое значение работы

Полученные данные о возможности запуска каскадов передачи сигнала в клетке не только с участием мембранного, но и интернализованного рецептора ЭФР существенно расширяют и дополняют общую картину передачи сигнала, регулирующего клеточную пролиферацию.

Полученные данные об ассоциации ФЛСу1 не только с актиновыми микрофиламентами, но и цитокератиновыми промежуточными филаментами расширяют традиционные представления о функции цитоскелета, и в особенности о роли промежуточных фила,ментов, которым, до сих пор, предписывалась лишь опорная функция в клетке.

Данные, полученные в ходе изучения механизмов активации транскрипционного фактора Sp1 важны для понимания механизмов, регулирующих клеточную пролиферацию в ответ на действие ЭФР.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Материалы диссертации были изложены на Международном конгрессе по молекулярной и клеточной биологии (Брайтон, Великобритания, 1997), Ежегодном конгрессе Американской Гастроинтерологической Ассоциации (Орландо, США, 1999), на 18-ом ежегодном симпозиуме по клеточной и молекулярной биологии (Анн Арбор, США, 1998), на научных семинарах медицинского института Ховард Хьюз (Анн Арбор, США, 1998), на семинарах лаборатории физиологии клеточного цикла Института цитологии РАН, а также научных семинарах университета Мичигана (Анн Арбор США,).

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 15" Z публикации и списка публикаций по теме диссертации. Работа изложена на 4 2.4 страницах машинописного текста и иллюстрирована 2 ^ рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Клеточные линии и их культивирование

В работе использовались клетки эпидермоидной карциномы человека А-431, а также клетки аденокарциномы кишечника человека AGS. Клетки культивировались в среде DMEM содержащей 10% фетальной сыворотки, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. За 48 ч до стимуляции клеток ЭФР, клетки переводили на среду F-12, содержащую 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и не содержащую сыворотки. Стимуляция клеток проводилась рекомбинантным человеческим ЭФР в конечной концентрации 20 нг/мл. В опытах с цитохалазином Б клетки после инкубации в течении 24 ч в среде с низким содержанием сыворотки (0.5%) обрабатывали в течении 1.5 ч 20 мМ цитохзлазина Б, и затем добавляли ЭФР. Предобработка клеток нокодазолом проводилась в течение 1.5 ч в концентрации 20 мкг/мл. Обработка

клеток PD98059 - ингибитором МЕКК1 проводилась в течении 1 ч при конечной концентрации ингибитора 50 мкМ/мл среды.

Иммунофлуоресцентный анализ.

Клетки выращенные на покровных стеклах промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), фиксировали 0.25% акролеином на PBS в течение 10 мин, промывали P3S, затем пзрмеабилизировали в течение 5 мин 0.5% раствором Тритона Х-100 в буфере следующего состава: 10 мМ Pipes (pH 6.8); 250 мМ сахароза; 3 мМ MgCI2; 150 мМ КС!; 1 мМ EGTA; 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ).

Для приготовления цитоскелетных препаратов клетки обрабатывали 2 мин 1 %-ным раствором Тритона Х-100 в буфере следующего состава: 10 мМ Pipes (pH 6.8); 4 М глицерин; 3 мМ MgCI2; 150 мМ KCl; 1 мМ EGTA; 1 мМ ФМСФ. С целью блокирования неспецифического связывания антител препараты инкубировали в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 1 ч. ФЛСу1 выявляли с помощью поликлональных антител (Santa Cruz). Цитокератины выявляли с помощью мснокпональных антител (Sigma). Для выявления актина использовали фаллоидин, конъюгированный с TRITC. Препараты просматривали в флуоресцентном микроскопе Zeiss и фотографировали на пленку А2.

Субклеточное фракционирование.

Субклеточное фракционирование проводили по методу Мак Брайда (McBride et al., 1991). Клетки выращенные на чашках Петри диаметром 90 мм промывали PBS, добавляли буфер, содержащий: 20 мМ HEPES pH 7.4; 150 мМ KCl; 2 мМ MgCI2; 4 мМ бензамидин; 1 мМ ФМСФ и соскребали с чашек. Далее клетки разрушали пропусканием через шприц и центрифугировали (600 д. 5 мин 4°С). При этом осаждалась ядерная фракция и разрушенные клетки. После этого супернатант центрифугировали при 8000 g 20 мин при 4 °С. Супернатант представлял собой цитозольную фракцию, а осадок - фракцию, обогащенную

мембранами. Мембранную фракцию ресуспендировали в том же буфере, содержащем 1 % Тритона Х-100 и центрифугировали при 12000 g в течение 15 мин. Супернатант представлял собой белковую фракцию, растворимую в Тритоне Х-100, а осадок - фракцию не растворимую в тритоне. Белки фракций разделяли с помощью денатурирующего электрофореза и переносили на нитроцеллюлезную мембрану (Immobilon Р). ФЛСу1 выявляли методом ECL с помощью моноклональных антител против ФЛСу1.

Получение рекомбинантных белков

Е. Coli BL21 (DE3) трансформированная плазмидой, содержащей ген человеческого Sp1 полной либо укороченной длины наращивалась в течение ночи при температуре +25°С в 300 мл среды LB, содержащей ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. На следующий день культура переносилась в 1 л свежей LB и через 1 ч для запуска экспрессии рекомбинантного белка добавлялся изопропил-р-тиогалактопиранозид (IPTG) в конечной концентрации 0.4 мМ. Через 2-3 ч бактерии осаждались путем центрифугирования и ресуспендирозалась в 15 мл охлажденного лизирующего буфера (1% Тритон X-100; 1мМ EDTA; 1 мМ OTT; 2мкг/мл апротинин; 1 мкг/мл леупептин; 1 мкг/мл пепстатин; 0.1 мМ ФМСФ), а затем разрушались с помощью ультразвука. Бактериальный дебрис удалялся центрифугированием при 27000 G в течение 20 мин при 4 °С. Супернатант инкубировали в течении 1 ч с 3 мл глютатион-Сефарозы 4В, осадок промывали 1%-ным раствором Тритона Х-100 в PBS. Степень очистки и экспрессия рекомбинантного белка контролировалась с помощью электрофореза.

Метод сдвига электрофоретической подвижности.

Клетки AGS лизировали по методике, описанной выше. Олигонуклеотид, соответствующий участку связывания Sp1 на гастриновом промоторе радиоактивно метили, используя фрагмент Кленова и а-Э2Р-сЮТР. 10 мкг клеточного лизата инкубировали в течение 10 мин в 20 мкл буфера,

содержащего 10 мМ Tris-HCI, рН=7.9; 1мМ ZnCI2; 100 мМ KCl; 1мМ EDTA; 300 нг dldC; 1мМ DTT; 5 мМ МдСЬ; 10% глицерина; 30000 срт радиоактивно-меченного олигонуклеотида. В случае фосфатазной обработки клеточных белков, фосфатазу кишечника теленка (CIP) в количестве 1-5 единиц добавляли в реакционную смесь и инкубировали а течение 20 мин перед добавлением олигонуклеотида. Меченые олигонукпеотиды выявляли с помощью метода авторадиофафии.

Меченые клеток радиоактивным ортофосфатом и иммунопреципитация.

Клетки AGS , выращенные на чашках Петри, инкубировали в течение 1 ч в ростовой среде DMEM не содержащей фосфата. Затем ростовую среду заменяли на бесфосфатную среду DMEM, содержащую 100 мкС'|/мл [32Р] ортофосфэта. В этих условиях клетки инкубировали дополнительно 3 ч и затем обрабатывали PD98059 и стимулировали ЭФР. Затем клетки лизировали в RIPA буфере (1% нонидета Р-40; 1% диоксихолата Na; 0,1% SDS; 150 мМ NaCi; 10 мМ Na3P04; рН=7.2; 2 мМ EDTA; 50 мМ NaF; 0.2 мМ ортованадата Na; 1 мкг/мл апротинина). Клеточный дебрис удаляли путем центрифугирования, а Sp1 иммунопреципитировали при помощи поликлональных антител против Sp1 и протеинА-агарозы. Иммунный комплекс промывали RIPA буфером и разделяли с помощью денатурирующего электрофореза. Фосфорилированный Sp1 выявляли авторадиографически.

!п vitro киназная р^вкция

В случае использования для in vitro киназной реакции тотального клеточного лизата, клетки лизировали буфером, содержащим ЮмМ HEPES pH 7.7; 30 мМ NaCI; 2% глицерина; 0.5% Тритона Х-100; 3 мМ MgCI2; 0.2 мМ EDTA; 0.2 мМ ортованадата Na; 2 мМ NaF; 2 мМ пирофосфата Na и 1 таблетку протеазного ингибитора Complete™ (Boehringer-Mannheim) на 10 мл лизирующего буфера. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием. Все дальнейшие процедуры проводились при +4°С. 25 мкг рекомбинантного GST-

Sp1, иммобилизованного на глютатион-Сефарозе инкубировали с 200 мкг тотального клеточного белка или 10 мкг белка хроматографических фракций в бООмкл связывающего буфере (20 мМ HEPES рН 7.7; 50 мМ NaCI; 2.5 мМ MgCI2; 0.1 мМ EDTA; 0.05% Тритон Х-100) в течении 3 ч. Несвязавшиеся белки удалялись путем промывки Сефарозы тем же буфером . Затем Сефарозу ресуспендировали в 30 мкл киназного буфера (20 мМ HEPES рН 7.7; 20 мМ MgCk; 20 мМ р-нитрофенилфосфат; 0.1 мМ ортованадат Na; 2 мМ DTT; 2 мМ ATP; 5j.iCi у-32Р-АТР) и инкубировали 30 мин при 30 °С. Далее пробы переносили на лед и промывали киназным буфером, не содержащим у-32Р-АТР. Затем белки разделяли в 7.5% или 10% SDS-полиакриламидном геле. Гель сушился и подвергался авторадиографии.

Анионообменная хроматография

Клетки на чашках Петри трижды промывали охлажденным PBS и затем лизировали на льду буфером следующего состава: 50 мМ (3-глицерофосфат рН 7.2; 0.1 мМ ортованадат Na; 2 мМ MgCI2; 1мМ EGTA; 0.5% Тритон Х-100; 10мкг/мл леупептин; 2 мкг/мл апротинин; 1мМ DTT. Через 15 мин клетки снимали с чашек и центрифугировали в течение 15 мин при +4°С. Супернатант (2-4 мг тотального белка) наносился на анионообменную колонку (MonoQ) предварительно уравновешенную буфером А: 50мМ Д-глицерофосфат рН 7.2; 0.1 мМ ортованадат Na; 1мМ EGTA; 1мМ DTT. Связавшиеся белки элюировали возрастающим градиентом концентрации NaCI (0-560 мМ).

Фосфоаминокислотный анализ

In vitro фосфорилированные рекомбинантные Sp1 белки, или эндогенный Sp1, иммунопреципитированный из клеток, меченных радиоактивным ортофосфатом, разделяли при помощи денатурирующего SDS-электрофореза, участки геля, содержащие фосфорилированный белок вырезали, белки элюировали и подвергали фосфоаминокислотному анализу на тонкослойных хроматографических пластинах по стандартной методике.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ассоциация ФЛСу1 с мембранным и интернализованным рецептором ЭФР в клетках А-431.

Для выяснения клеточной локализации ФЛСу1 и рецептора ЭФР в нестимулированных клетках, и клетках обработанных ЭФР использовался метод двойной непрямой иммунофлуоресценции. Было показано, что в нестимулированных клетках А-431 рецептор ЭФР расположен на клеточной мембране, в то время как ФЛСу1 диффузно распределяется в цитоплазме. Обработка клеток ЭФР вызывала интернализацию рецептора ЭФР в ходе рецептор-опосредованного эндоцитоза. При этом, через 15 мин после действия ЭФР, ФЛСу1 выявляется в расположенных по всему объему клетки, в эндосомах и частично ко-локализуется с ЭФР-Р. Через 30 мин этот фермент обнаруживается в составе эндосом в области пара-Гольджи и также ко-локализуется там с рецептором ЭФР.

В одновременно проводимых экспериментах клетки А-431 лизировали, ЭФР-Р иммунопреципитировали, разделяли с помощью денатурирующего электрофореза. Далее белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и выявляли ФЛСу1. Оказалось, что в нестимулированных клетках не обнаруживается ассоциации ФЛСу1 и ЭФР-Р, в то время как через 15 мин после действия ЭФР в преципитате выявляется белок, соответствующий ФЛСу1.

Таким образом, можно заключить, что ФЛСу1 частично связывается с рецептором ЭФР в составо зндосом.

Дополнительные доказательства связи ФЛС с интернализованным ЭФР-Р получены в опытах с нокодазолом - агентом, разбирающий микротрубочки. Методом ко-иммунопреципитации было показано, что обработка клеток нокодазолом не влияла на ассоциацию ФЛСу1 и ЭФР-Р. Иная картина наблюдалась при анализе внутриклеточного распределения ФЛСу1 под действием нокодазола. Методом двойной иммунофлуоресценции было показано, что в клетках, обработанных нокодазолом, но нестимулированных

ЭФР, ЭФР-Р выявлялся на клеточной мембране. При этом ФЛСу1 распределялась по всей цитоплазме, так же как и в клетках, не обработанных нокодаэолом. Под действием ЭФР, ФЛСу1 и ЭФР-Р ко-локализовались в эндосомах, расположенных на переферии клетки. Продвижения эндосом к ядру клетки не происходило, что согласуется с литературными данными. Таким образом, можно сделать вывод о том, что ФЛСу1 ассоциируется не только с мембранным, но и с интернализованным рецептором ЭФР и перераспределяется вместе с эндосомами внутри клетки.

В случае, если гипотеза об участии интернализованного ЭФР-Р в запуске митогенного сигнала верна, то при действии на клетки нокодазола, блокирующего продвижение эндосом внутрь клетки, должно происходить снижение фосфорилирования по тирозину белков, участвующих в проведении сигнала. Иммуноморфологический анализ показал, что большая часть белков, фосфорилированных по тирозину ко-локализуется с рецептором ЭФР, перераспределяясь вместе с ним в ходе рецептор-опосредованного эндоцитоза. В то же время, распределение фосфорилированных по тирозину белков под действием ЭФР в клетках предобработанных нокодазолом практически не изменялось со временем, они выявлялись в составе эндосом, расположенных по переферии клетки.

В одновременно проводимых экспериментах пул фосфорилированных по тирозину белков определяли с помощью иммуноблотинга. Оказалось, что при действии на клетку нокодазола спектр выявляемых в них белков, фосфорилированных по тирозину, такой же, как и о контрольных клетках. Однако при стимуляции ЭФР клеток, предобработанных нокодазолом, фосфорилирование по тирозину белков заметно снижается, несмотря на то, что ЭФР-Р фосфорилирован в той же степени, что и в клетках, не обработанных нокодазолом.

Суммируя полученные данные можно предположить, что интернализованный рецептор может являться дополнительной стартовой точкой для запуска каскадов передачи сигнала в клетке.

Связь ФЛСу1 с элементами цитоскелета в клетках А-431.

Вопрос об участии цитоскелета в проведении сигнала в клетке поднимается очень давно. Наибольшее внимание исследователей привлекают перестройки актинового цитоскелета, происходящие при действии различных агонистов. Показана связь некоторых клеточных рецепторов с элементами цитоскелета. В частности обнаружена ассоциация рецептора ЗФР с актиновыми филаментами (van Bergen en Henegouwen et al., 1992). Субстрат каталитического действия фосфолипаз С - фосфоинозитид(4,5)бифосфат (Р1Р2) регулирует состояние актинового цитоскелета в клетке, поскольку с ним ассоциированы ахтин-связывающие белки: профилин, гельзолин, виллин, дСарЗЭ, а-актинин и некоторые другие (Jamney, 1994; Lee, Rhee, 1995). Иммуноморфологические исследования локализации PIP2 в клетке показали, что он ко-локализуется с пучками микрофиламентов и присутствует в фокальных контактах (Fukami et al., 1994). Для выяснения вопроса о связывании ФЛСу1 с элементами цитоскелета клетки А-431 фракционировали по методу, изложенному в разделе "Материалы и методы". При этом выделяли фракцию, содержащую растворимые цитоллазматические белки (фракция 1), фракцию белков, растворимых в Тритоне Х-100, куда попадают в основном белки клеточных мембран, и фракцию не растворимую в Тритоне Х-100 (фракция 3), представляющую собой цитоскелетные элементы. Белки каждой фракции разделяли с помощью денатурирующего электрофореза, переносили на нитроцеллюлезную мембрану и выявляли ФЛСу1 с помощью моноклональных антител. Оказалось, что в нестимулированных ЭФР клетках основной пул ФЛС-/1 содержится во фракции 1, меньшее ее количество во фракциях 2 и 3. При обработке клеток ЭФР происходило резкое перераспределение ФЛСу1 из цитоплазматической в мембранную фракцию. При этом содержание фосфолипазы в цитоскелетной фракции не изменялось, либо незначительно увеличивалось.

Для выявления ко-локализации ФЛСу1 с актином использовали метод двойной иммунофлуоресценции, при котором актин выявляли меченым фаллоидином, а ФЛСу1 - поликлональными антителами, как это описано выше. Актин в клетках А-431 представлен в виде подмембранного тяжа и хорошо выраженных стресс-фибрилл. ФЛСу1 в тех же клетках частично ко-локализуется с подмембранным актином, но не со стресс-фибриллами, что соответствует ранее полученным в нашей лаборатории данным.

Для выяснения вопроса о том связана ли ФЛСу1 с другими элементами цитоскелета был использован цитохалазин Б - ингибитор полимеризации актина. Действие цитохалазина Б приводило к разборке актина так, что он выявлялся в виде отдельных скоплений. В тех же клетках ФЛСу1 ко-локализовалзсь с актиновыми агрегатами, однако кроме того обнаруживалась в составе тяжей, связанных с разобранным актином и представляющих собой, по-видимому цитоскелетные элементы неактиновой природы.

Для выявления элементов цитоскелета, с которыми связывается ФЛСу1 были использованы цитоскелетные препараты клеток А-431, в которых растворимые цитоплазматические белки, в том числе ФЛСу1, присутствующая в этой фракции, вымывались. При таком способе обработки клеток оказалось возможным выявить минорные количества белка, связанного с цитоскелетом, которые на обычных препаратах маскируются белком растворимой фракции.

Известно, что в клетках А-431 виментиновые промежуточные филаменты отсутствуют. Сеть цитокератиновых филаментов в этих клетках представлена околоядерным скоплением и отходящими от него тяжами. Результатом одновременной окраски клеток на цитокератины и ФЛСу1 является практически полная ко-локализация ФЛСу1 с цитокератиновыми филаментами (рис.1). Таким образом, оказалось, что в клетках А-431 ФЛСу1 ко-локализуется с промежуточными филаментами цитокератиновой природы.

Для выявления микротрубочек в клетках А-431 использовали моноклональные антитела против тубулина. Была продемонстрирована хорошо

развитая сеть микротрубочек в этих клетках, однако ко-локализации ФЛСу1 с ними обнаружить не удалось.

Суммируя полученные данные можно сделать вывод, что в клетках А-431 ФЛСу1 связывается не только с акгиновыми микрофиламентами, но и с цитокератиновыми промежуточными филаментами.

Рис.1. Ко-лскализация ФЛСу1 и цитокератиновых промежуточных филаментов в клетках А-431. А - выявление цитокератинов. В - выявление ФЛСу1.

ЭФР-зависимое ДНК-связывание транскрипционного фактора Sp1.

Для изучения влияния ЗФР на активность транскрипционного фактора Sp1 нами был использован метод ретардации. Клетки AGS стимулировали ЭФР. Далее клетки лизировали и затем клеточный лизат инкубировали с радиоактивно-меченным олигонуклеотидом, соответствующим участку связывания Sp1 с гастриновым промотором. В результате данных экспериментов нами было показано, что ДНК-связывающая активность транскрипционного фактора Sp1 начинает возрастать на 5 мин стимуляции клеток ЭФР и достигает своего максимума между 30 мин и 1 ч стимуляции. Далее она постепенно снижается и через 6 ч достигает базального уровня (рис. 2).

Активация сигнальных белков в клетке происходит как правило в результате ЭФР-зависимого фосфорилирования. Следующей нашей задачей являлось изучение вопроса о том, является ли активация Sp1 с помощью ЭФР результатом фосфорилирования данного транскрипционного фактора при помощи ЭФР-зависимых протеинкиназ, либо в этом процессе принимают участие иные механизмы, модифицирующие активность Sp1. Для решения этой задачи, клеточный лизат, использующийся для ретардации, преинкубировался с различными количествами фосфатазы кишечника теленка (CIP), обладающей способностью к неспецифическому дефосфорилированию белков, и, в частности Sp1.

В результате этих экспериментов было показано, что предобработка фосфатазой клеточных лизатов, полученных из ЭФР-стимулирозанных клеток, приводит к резкому снижению ДНК-связывающей активности транскрипционного фактора Sp1.

Таким образом, приведенные выше данные позволяют утверждать, что ЭФР активирует транскрипционный фактор Sp1 путем его фосфорилирования с помощью ЭФР-зависимой протеинкиназы.

Time 0 5' 15' 30' 1h 2 3 4 5 6

123 4 5 6 7 8 9 10

Рис.2. Изменение ДНК-связывающей активности транскрипционного фактора Sp1 под действием ЭФР.

Динамика ЭФР-зависимого фосфорилирования транскрипционного фактора Sp1.

Для детального исследования феномена активации транскрипционного фактора Sp1 посредством его ЭФР-зависимого фосфорилирования, клетки AGS стимулировали ЭФР, лизировали и затем клеточный лизат использовался для фосфорилирования рекомбинантного человеческого Spl. Данная серия экспериментов показала, что эндогенные, ЭФР-активируемые клеточные киназы способны фосфорилировать как рекомбинантный Sp1 полной длины, так и мутантную форму белка, не содержащую С-концевого домена, включающего ДНК-связывающую последовательность. Обнаруженный пик фосфорилирования соответствует 30 мин стимуляции клеток ЭФР, а включение радиоактивного фосфата превышает баззльный уровень фосфорилирования в 4 раза.

Необходимо отметить, что динамика фосфорилирования Sp1 в данных экспериментах коррелирует с ЭФР-зависимой ДНК-связь;аающей активностью этого транскрипционного фактора.

На сегодняшний день хорошо известным фактом является существование двух основных классов протеинкиназ, участвующих в проведении сигнала в клетке: тирозиновых и серин-треониновых протеинкиназ. Таким образом, следующей задачей было определение типа протеинкиназы, осуществляющей ЭФР-зависимое фосфорилирование Sp1. Для решения этого вопроса использовался метод фосфоаминокислотного анализа на тонкослойных хроматографических пластинках, причем анализу подвергался как рекомбинантный Sp1, фосфорилированный с помощью у-32Р-АТР в ходе in vitro киназной реакции, так и эндогенный Sp1, иммунопреципитированный из AGS клеток, предварительно меченных радиоактивным ортофосфатом.

А.

В.

рз^

Рис.3. Фосфоаминокислотный анализ эндогенного Бр1. А - клетки не стимулированные ЭФР. В - клетки стимулированные 20 нг/мл ЭФР в течении 30 мин. рБ - фосфосерин, рТ - фосфотреонин, Р, - неорганический ортофосфат.

Полученные результаты свидетельствуют, что ЭФР-стимулируемое фосфорилирование Sp1 является серин-треониновым, причем сходные результаты были получены как для рекомбинантного, так и для эндогенного транскрипционного фактора Sp1.

Необходимо подчеркнуть, что хотя метод фосфоаминокислотного анализа не позволяет количественно оценить соотношение серинового и треонинового фосфорилирсзания, тем не менее можно сделать вывод о преимущественном сериновом фосфорилировании транскрипционного фактора Sp1 под действием ЭФР.

Роль Ras-ERK пути передачи сигнала в активации транскрипционного фактора Sp1.

Одним из наиболее вероятных ЭФР-зависимых сигнальных путей способным участвовать в активации Sp1 является Ras/ERK путь передачи транскрипционного сигнала. Исследуя ДНК-связывающую активность транскрипционного фактора Sp1 в клетках предобработанных ингибитором одного из основных компонентов Ras пути - МЕКК1 - PD98059, мы показали, что данный ингибитор эффективно блокирует ДНК-связывание Sp1.

Для ответа на вопрос является ли фосфорилирование Sp1 также Ras/ERK зависимым процессом AGS клетки перед стимуляцией ЭФР преинкубировались с PD98059. In vitro киназная реакция с использованием лизатов клеток предобработанных PD98Q59 показала -60% ингибирование фосфорилирования Sp1 после ЭФР стимуляции в сравнении с контрольными клетками необработанными PD98059. Поскольку PD98059 оказывает ингибирующий зффект на ЭФР-зависимсе фосфорилирование Sp1 in vitro, следующей задачей было исследовать оказывает ли PD98059 ингибирующий эффект на активацию транскрипционного фактора Sp1 в клетках. Для этого клетки стимулированные или нестимулированные ЭФР в присутствии или отсутствии PD98059 обрабатывали радиоактивным ортофосфатом. Далее клетки лизировали, эндогенный Sp1 иммунопреципитировали и белки преципитат разделяли в денатурирующем электрофорезе. Оказалось, что

обработка клеток PD98059 приводит к подавлению ЗФР-опосредованного фосфорилирования траскрипционного фактора Sp1 как in vitro так и in vivo.

Таким образом, ингибитор одного из компонентов Ras-пути передачи сигнала вызывал как подавление ДНК-связывания, так и фосфорилирования траскрипционного фактора Sp1 под действием ЭФР.

Роль ERK 1,2 в ЭФР-опосредованной активации транскрипционного фактора Sp1.

Обобщая полученные нами ранее данные о ЭФР-зависимой активации Sp1, наиболее вероятным кандидатом на роль киназы участвующей в фосфорилировании Sp1 под действием ЭФР становятся ERK 1 и 2. Данное предположение кажется тем более очевидным, что рекомбинантный ERK2 обеспечивает in vitro крайне высокий уровень фосфорилирования Sp1, что было использовано в позитивных контролях при проведении киназных реакций

[MoCQ, mftl О'

30' EGF

ъуЛу-Ь-х&'Я-ж ЪиМ1

* L

-}<• rSpf

207

íd-SplsBQ«.

85

rSp1

12 34 36788 10 11 1213 1« Рис.4.1п у^о киназиая реакция с использованием топоО фракций, полученных из не стимулированных либо стимулированных ЭФР клеток. Дорожки 1-13 соответствуют возрастающему градиенту №С1. Дорожка 14 - рекомбинантному ВПК2.

in vitro. Для выяснения вопроса действительно ли ERK опосредуют активацию Sp1, или данный транскрипционный фактор фосфорилируется с помощью иной МЕКК1 -зависимой киназы, лизат, полученный из клеток обработанных либо необработанных ЭФР фракционировался на аниснообменной колонке. Далее фракции содержащие ERK выявлялись используя антитела против ERK2, а также против активной формы ERK1,2. В дальнейшем фракции использовались для in vitro киназной реакции. Как показано на рис 4. фракции обладающие максимальной киназной активностью соответствуют 420-460 мМ NaCI, в то время как ERK1 и 2 зллюируются в промежутке 200-300 мМ NaCI. Таким образом, было продемонстрировано, что Sp1 киназная активность не связана с ERK1 и 2.

Дополнительно хроматографические фракции клеточных лизатов были исследованы на распределение таких серин-треониновых протеинкиназ как р38, JNK, RSK 1,2 и 3, а также ДНК-зависимой протеинкиназы. Было продемонстрировано, что ни одна из вышеперечисленных протеинкиназ не содержится в хроматографических фракциях, обладающих Sp1 киназной активностью.

ВЫВОДЫ

1. Фосфолипаза Су1 под действием ЭФР способна ассоциироваться с интернализованным рецептором ЭФР в составе энд осам и перераспределяется вместе с ним в ходе рецептор-опосродованного эндоцитоза. Таким образом, интернализованный ЭФР-Р может служить дополнительной стартовой точкой для запуска каскадов передачи сигнала в клетке.

2. Фосфолипаза Су1 взаимодействует с элементами цитоскелета в клетках А-431. Впервые продемонстрирована ко-локализация ФЛСу1 с цитокератиновыми промежуточными филаментами.

3. ЭФР регулирует ДНК-связывающую активность транскрипционного фактора вр1 путем фосфорилирования по остаткам серина и треонина.

А. Обнаружена и частично охарактеризована новая серин-треониновая протеинкиназа, осуществляющая ЭФР-зависимое фосфорилирование транскрипционного фактора Бр1.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Н.Д. Медведева, С.В. Чупрета, М.Ю. Дьяконова, Д.Б. Творогов, А.Д. Благовещенская, Н.В. Цупкина, Н.Н. Никольский Влияние нокодазола на перераспределение фосфоинозитид-специфической фосфолипазы Су1 в процессе передачи митогенного сигнала в клетках А-431. Цитология. 1997. 39: 872-377.

2. С.В. Чупрета, А.Л. Евдонин, Д.Б. Творогов, Н.В. Цупкина, Н.Н. Никольский, Н.Д. Медведева Связь фосфоинозитид-специфической фосфолипазы Су1 с элементами цитоскелета в клетках А-431. Цитология. 1998. 40: 185-189.

3. С.В. Чупрета, А Л. Евдонин, Д.Б. Творогов, академик Н.Н. Никольский, Н.Д. Медведева Ассоциация фосфоинозитид-специфической фосфолипазы Су1 с промежуточными филаментами в клетках А-431. ДАН. 1998. 360: 706-708.

4. Medvedeva N.D., Chupreta S.V., Blagoveschenskaia A.D., Diakonova M.Y., Vinogradova N.A., Nikolsky N.N. Internalization of activated epidermal growth factor receptor-phospholipase СП1 complexes. Abst. symp. ECBO 97 p.i.

5. Sergey Chupreta, Susan A. Tarle, Ming Du, Andrea Todisco, Juanita L. Merchant The Ras-ERK signaling pathway stimulates the gastrin promoter in human gastric cells through Sp1 phosphorylation. Abst. 18th Annual cellular and molecular biology graduate program fall symposium. P.27. Ann Arbor. 1998.

6. S. Chupreta, S. A. Tarle, M. Du, A. Todisco, Juanita Merchant Phosphorylation of Spl by a novel EGF-inducible kinase. Abst. AGA annual meeting Orlando 1999.

7. Sergey Chupreta, Ming Du, Andrea Todisco, Juanita L. Merchant. EGF stimulates gastrin promoter through activation of Sp1 kinase activity. Amer. Physiol. 2000.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Никольский Н. Н., Соркин А. Д., Сорокин А. Б. 1987. Эпидермальный фактор роста. Л. Наука. 200с.

BeguinotL., Lyall R.M., Willingham М.С., Pastan !. Down-regulation of the epidermal growth factor receptor in KB cellsis due to receptor internalization and subsequent degradation in lysosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. 1984. 81: 2384-2388.

Berridge M. J. Inositol triphosphate and calcium signaling. Nature. 1993. 361: 315325.

Chun R.F., Semmes O.J., Neuveut C., Jeang K.T. Modulation of Sp1 phosphorylation by human immunodeficiency virus type 1 Tat. J. Virol. 1993. 72: 2615-1629.

Cockroft S., Thomas G. M. H. Inositol lipid specific phospholipase С isozymes and their different regulation by receptors. Biochem. J. 1992. 288: 1-14.

Darnell J.E.Jr. STAT's and gene regulation. Science. 1997. 277: 16301635.

Ding A., Chen В., Fuortes M., Blum E. Association of mitogen-activated protein kinases with microtubules in mouse macrofages. J. Exp. Med. 1996.183:1899-1904.

Ford M.G., Valle J.D., Soroka C.J., Merchant J.L. EGF receptor activation stimulates endogenous gastrin gene expression in canine G cells and human gastric eel) cultures. J. Clin. Invest. 1997. 99: 2762-2771.

Fukami K., Endo Т., Immamura M., Takenawa T. a-Actinin and vinculin are PIP2-binding proteins involved in signaling by tyrosine kinase. J. Biol. Chem. 1994. 269: 1518-1522.

Han I., Kudlow J.E. Reduced О glycosylation of Sp1 is associated with increased proteasome susceptibility. Mo!. Cell Biol. 1997. 17: 2550-2558.

Janmey P. A. Phosphoinositides and calcium as regulators of cellular actin assembly and disassembly. Anna Rev. Physiol. 1994. 56:169-191.

Kadonaga J.T., Carner K.R., Masiarz F.R., Tjian R. Isolation of cDNA encoding transcription factor Sp1 and functional analysis of the DNA binding domain. Cell. 1987. 51:1079-1090

Keenan C., Kelleher D. Protein kinase C and the cytoskeleton. Cell Signal. 1998. 10: 225-232.

Lee S. B., Rhee S-.G. Significance of PIP2 hydrolysis and regulation of phospholipase C isozymes. Curr. Opin. Cell. Biol. 1995. 7:183-189.

Marshall K. 1994. The MAPK cascade. Curr. Op. Gen. Devel. 4: 82-90

McBride K., Rhee S.-G., Jaken S. 1991. Immunocytochermical localization of phospholipase Cy1 in rat embryo fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 71117115.

Pal S., Claffey K.P., Cohen H.T., Mukhopadhyay D. Activation of Sp1-mediated vascular permeability FactorA/ascular endothelial growth factor transcription requires specific interaction with protein kinase zeta. J. Biol. Chem. 1998. 273: 26277-26280.

Pastan I.H., Willingham M.C. Journey to the center of the cell: role of the receptosome. Science. 1981. 214: 504-509.

Rhee S.-G. Inositol phospholipid-specific phospholipase C: interaction of the isoform with tyrosine kinase. TIBS. 1991.16: 297-301.

Sorkin A.D., Teslenko L.V., Nikolsky N.N. The endocytosis of epidermal growth factor in A431 cells: a pH of microenvironment and the dynamics of receptor complex dissociation. Exp. Cell Res. 1988. 175: 192-205.

van Bergen en Henegouwen P. M. P., den Hartig j. C., Romeyn P., Verkleij A. J., Boonstra J. The epidermal growth factor receptor is associated with actin filaments. Exp. Cell Res. 1992. 199: 90-97.

Vieira A.V., Lamaze C., Schmid S.L., Control of EGF receptor signalling by clatrin-mediated endocytosis. Science. 1996. 274: 2086-2089.

Xue L., Lucocq J. ERK2 signalling from internalised epidermal growth factor receptor in broken A431 ceils. Cell Sinnal. 1998. 10: 339-348.

_Лицензия ЛР № 06394 от 08 09 97

Подписано в печать'2<? 4У Объем в п л Тираж ПС Заказ № /ев.

Отпечатано в издательстве "Нестор" 195 251, Санкт-Петербург Политехническая, 29

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чупрета, Сергей Владимирович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. .И

2.1. Структура рецептора ЭФР.

2.2. Активация и рецептор-опосредованный эндоцитоз ЭФР, роль интернализованного ЭФР-Р в запуске и проведении митогенного сигнала.

2.3. основные пути передачи сигнала с рецептора ЭФР.

2.4. фосфолипаза су1, ее структура и свойства.

2.5. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЛСу1.

2.6. РОЛЬ ФЛСу1 ВО ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ РЕГУЛЯЦИИ.

2.7. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФЛСу 1 С ЭЛЕМЕНТАМИ ЦИТОСКЕЛЕТА.

2.8. транскрипционный фактор бр1, его структура и свойства.

2.9. Регуляция активности транскрипционного фактора бр1.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Клеточные линии и их культивирование.

3.2. Иммунофлуоресцентный анализ.

3.3. иммунопреципитация, электрофорез и иммуноблотинг.

3.4. Субклеточное фракционирование.

3.5. получение рекомбинантных белков.

3.6. анионообменнаяхроматография.

3.7. ш У1ТЯО киназная реакция.

3.8. Мечение клеток радиоактивным ортофосфатом и иммунопреципитация.

3.9. киназная реакция в геле.

3.10. Метод сдвига электрофоретической подвижности.

3.11. фосфоаминокислотный анализ.

3.12. количественный анализ включения радиоактивного ортофосфата.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Ассоциация ФЛСу1 с мембранным и интернализованным рецептором ЭФР в клетках А431.

4.2. Связь ФЛСу1 с элементами цитоскелета в клетках А431.

4.3. ЭФР-зависимое ДНК-связывание транскрипционного фактора 8р1.

4.4. Динамика ЭФР-зависимого фосфорилирования транскрипционного фактора Бр1.

4.5. Роль Яаз-Еяк пути передачи сигнала в активации транскрипционного фактора Бр1.

Введение Диссертация по биологии, на тему "ЭФР - зависимая передача сигнала при участии фосфолипазы С γ1 и транскрипционного фактора SP1"

Одно из ключевых мест в клеточной биологии занимает изучение механизмов проведения клеточного сигнала. Особое внимание при этом уделяется факторам роста - полипептидам, регулирующим пролиферацию, дифференцировку, либо апоптоз разных типов клеток. Наиболее изученным на сегодняшний день является эпидермальный фактор роста (ЭФР). Связываясь на поверхности клеточной мембраны со специфическим рецептором, ЭФР вызывает в клетке ряд событий, приводящих в конечном счете к передаче внешнего сигнала на геном.

Классическая схема ЭФР-опосредованной передачи сигнала в клетке включает в себя ассоциацию ЭФР с рецептором ЭФР (ЭФР-Р), что вызывает димеризацию последнего и автофосфорилирование рецепторной тирозинкиназы, расположенной на С-концевом участке молекулы ЭФР-Р и экспонированной в цитоплазму. Активированная таким образом тирозинкиназа ЭФР-Р приобретает, в свою очередь, способность активировать, путем фосфорилирования, ряд внутриклеточных субстратов, осуществляющих дальнейшее проведение сигнала (Никольский и др., 1987). Наиболее изученными на сегодняшний день являются так называемые STAT и Ras пути проведения сигнала. В первом случае активная тирозинкиназа ЭФР-Р вызывает фосфорилирование STAT белков, что влечет за собой образование транскрипционноактивных гомодимеров которые, в свою очередь, транспортируются в ядро, где вызывают активацию генов раннего ответа (Darnell, 1997). Центральным событием Ras-пути передачи сигнала является активация малой ГТФазы Ras. Далее сигнал с активированного Ras передается на каскад серин/треониновых протеинкиназ. Первой в этом ряду оказывается c-Raf киназа, которая передает сигнал на МЕК киназы, а те, в свою очередь, активируют серин/треониновые киназы Erk семейства. Последние транспортируются в ядро, где фосфорилируют такие ядерные мишени, как Elk-1, Elf-1, а также Sap la (Marshall, 1994).

Необходимо отметить, что одновременно с активацией сигнальных путей, мембранный ЭФР-Р кластеризуется в окаймленных ямках и интернализуется в эндосомы (Pastan, Willingham, 1981). В дальнейшем ЭФР-рецепторные комплексы могут рециклировать на плазматическую мембрану, либо транспортироваться в составе эндосом в область пара-Гольджи, где затем деградируют в лизосомах (Beguinotet al., 1984, Sorkin et al., 1988). Первоначально считалось, что интернализация активированного рецептора ЭФР является механизмом, обеспечивающим снижение уровня сигнала, однако в последнее время появились работы, свидетельствующие об участии интернализованных рецепторов в активации таких сигнальных молекул, как фосфотидилинозитол-3-киназы (ФИ-З-К) и Erkl,2 (Vieira et al., 1996, Xue, Lucocq, 1998). Таким образом, хотя и на единичных примерах, было продемонстрировано участие интернализованного рецептора в проведении сигнала. Хорошо установленным фактором является то, что рецептор-опосредованный эндоцитоз зависит от системы микротрубочек. В связи с этим, особый интерес приобретает проблема участия цитоскелета в процессе передачи сигнала в клетке. С другой стороны, в последние годы активно изучается феномен перестройки цитоскелета под действием факторов роста. Показана ассоциация многих сигнальных белков с элементами цитоскелета и активная роль цитоскелета в проведении клеточного сигнала (Ding et al., 1996, Keenan and Kelleher, 1998). Тем не менее, роль интернализованного рецептора факторов роста и роль цитоскелета, вносящих существенные изменения в классическую картину передачи сигнала под действием ростовых факторов, остается далекой от полного понимания. Парадоксально, но до настоящего недостаточно внимания уделяется изучению механизмов передачи сигнала, запускаемых рецепторами факторов роста выходящих за рамки STAT и Ras-путей передачи сигнала. Так, крайне мало известно о механизме регуляции активности такого ключевого фермента как фосфолипаза С.

Фосфолипаза С/1 (ФЛСу1) - субстрат рецепторов факторов роста - является одним из ключевых участников передачи сигнала в клетках.

Активированная OJICyl осуществляет гидролиз фосфоинозитид-4,5-бифосфата с образованием вторичных мессенджеров - фосфоинозитид-1,4,5-трифосфата и диацилглицерола, которые, в свою очередь, вызывают выход ионов Са2+ из внутриклеточных депо и активируют протеинкиназу С (ПКС) (Berridge, 1993). Известно, что OJICyl активируется при действии на клетку факторов роста, и в частности, ЭФР (Cockroft, Thomas, 1992). Однако механизм этой активации до сих пор остается неясным. Так например показано, что в отсутствие стимуляции ростовыми факторами, клетки содержат пул активной ФЛСу1, вполне достаточный для гидролиза значительного количества фосфоинозитид-4,5-бифосфата и запуска дальнейших каскадов передачи сигнала (Rhee, 1991). Таким образом можно предположить существование дополнительных механизмов, участвующих в регуляции активности данного фермента.

Крайне мало на сегодняшний день известно о механизмах передачи сигнала при помощи факторов роста на транскрипционные факторы семейства Spl. Данные транскрипционные факторы имея в составе молекулы ДНК-связывающий цинковый мотив обладают способностью активировать широкий спектр генов содержащих GC-богатые промоторы (Kadonaga et al., 1987). На настоящий момент охарактеризовано несколько протеинкиназ модулирующих активность данного семейства транскрипционных факторов, а также показана роль в этом процессе О-гликозилирования (Han, Kudlow, 1997). Так например, описано участие в активации Spl РКС, а так же ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-ПК) (Pal et al., 1998, Chun et al., 1998).

He так давно была продемонстрирована активация транскрипционного фактора Spl под действием ЭФР, однако вопрос о механизмах проведения сигнала с рецептора ЭФР на Sp 1 до настоящего времени остается открытым (Ford et al., 1997). Таким образом, необходимо признать, что несмотря на значительные успехи в данной области, сложившаяся картина передачи митогенного сигнала с рецепторов ростовых факторов на клеточный геном далека от завершения и имеет в своем составе ряд белых пятен.

В связи со всем сказанным выше в настоящей работе представлялось актуальным изучение механизмов, регулирующих проведение клеточного сигнала под действием ЭФР на примере ФЛСу1 и транскрипционного фактора Spl.

Таким образом одной из задач данного исследования стало изучение взаимодействия ФЛСу1 с разнообразными элементами цитоскелета, а также возможность ассоциации ФЛСу1 с интернализованным ЭФР-Р в клетках А431. В результате было продемонстрирована ассоциация ФЛСу1 с подмембранным актином в клетках А431, а также впервые показана ко-локализация этого фермента с промежуточными цитокератиновыми филаментами, которым до настоящего момента преписывалась лишь опорная функция. Также была показана возможность ассоциации ФЛСу1 с интернализованным в составе эндосом рецептором ЭФР. Были приведены данные, свидетельствующие в пользу того, что интернализованный ЭФР-Р может служить дополнительной точкой запуска митогенного сигнала, активируя разнообразные цитоплазматические сигнальные молекулы, и, в часности, ФЛСу1.

Другой нашей задачей являлось изучение механизмов активации транскрипционного фактора 8р1 под действием ЭФР. В результате было продемонстрировано, что передача митогенного сигнала на транскрипционный фактор Бр 1 осуществляется при участии Каз-Егк пути проведения сигнала. При этом было показано, что активация 8р1 является следствием серин/треанинового ЭФР-зависимого фосфорилирования данного белка при помощи новой протеинкиназы, отличной как от Егк 1,2, так и от других извесных серин/треаниновых протеинкиназ, участвующих в регуляции активности 8р1. Была проведена частичная очистка "8р1 киназы" и охарактеризованы некоторые ее свойства.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Чупрета, Сергей Владимирович

6. выводы.

1. Фосфолипаза Cyl под действием ЭФР способна ассоциироваться с интернализованным рецептором ЭФР в составе эндосом и перераспределяется вместе с ним в ходе рецептор-опосредованного эндоцитоза. Таким образом, интернализованный ЭФР-Р может служить дополнительной стартовой точкой для запуска каскадов передачи сигнала в клетке.

2. Фосфолипаза Cyl взаимодействует с элементами цитоскелета в клетках А431. Впервые продемонстрирована ко-локализация ФЛСу1 с цитокератиновыми промежуточными филаментами.

3. ЭФР регулирует ДНК-связывающую активность транскрипционного фактора Spl путем фосфорилирования по остаткам серина и треонина.

4. Обнаружена и частично охарактеризована новая серин/треониновая протеинкиназа, осуществляющая ЭФР-зависимое фосфорилирование транскрипционного фактора Sp 1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чупрета, Сергей Владимирович, Санкт-Петербург

1. Благовещенская А.Д. Регуляция эндоцитозного пути рецепторов эпидермального фактора роста (ЭФР) Автореф. канд. дис. Л. 1996.

2. Никольский Н. Н., Соркин А. Д., Сорокин А. Б. 1987. Эпидермальный фактор роста. Л. Наука. 200с.

3. Alessi D.R., Cuenda A., Cohen P., Dudley D.T., Saltiel A.R. PD 098059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase kinase in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 1995. 270: 27489-27494.

4. Armstrong S.A., Валу D.A., Leggett R.W., Mueller C.R. Casein kinase II-mediated phosphorylation of the С terminus of Spl decreases its DNA binding activity. J. Biol. Chem. 1997. 272: 13489-13495.

5. Bar Sagi D., Rotin D., Batzer A., Mandiyan V., Schlessinger J. SH3 domains direct cellular localization of signaling molecules. Cell. 1993. 74: 83-91.

6. Basheemddin K., Li X., Rechtoris C., Mazzone T. Platelet-derived growth factor enhances Spl binding to the LDL receptor gene. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1995. 15: 1248-1254.

7. Beguinot L., Lyall R.M., Willingham M.C., Pastan I. Down-regulation of the epidermal growth factor receptor in KB cell endosis due to receptor internalization and subsequent degradation in lysosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. 1984. 81: 2384-2388.

8. Berridge M. J. Inositol triphosphate and calcium signaling. Nature.1993. 361: 315-325.

9. Boonstra J., Rijken P., Humbel B., Cremers F., Verkleij A., van Bergen en Henegouwen P. The epidermal growth. Cell. Biol. Int. 1995. 19: 413-430.

10. Braun S., Raymond W.E., Racker E. Synthetic tyrosine polymers as substrates and inhibitors of tyrosine-specific protein kinases. J. Biol. Chem. 1984. 259: 2051-2054.

11. Carpenter G. Receptor tyrosine kinase substrates: src homology domains and signal transduction. FASEB Journal. 1992. 6: 3283-3289.

12. Carraway K.L., Carraway C.A.C. Signaling, mitogenesis and the cytoskeleton: where the action is. Bioessays. 1995. 18: 171-175.

13. Chen W.S., Lazar C.S., Poenie M„ Tsien R.Y., Cill G.N., Rosenfeld M.G. Requirement for intrinsic protein tyrosine kinase in the immediate and late action of the EGF-receptor. Nature. 1987. 328: 820-823.

14. Cheng H.F., Jiang M.J., Chen C.L., Liu S.M., Wong L.P., Lomasney J.W., King K. Cloning and identification of amino acid residues of humanphospholipase C81 essential for catalysis. J. Biol. Chem. 1995. 270: 54955505.

15. Chin Y.E., Kitagawa M., Su W.C., You Z.H., Iwamoto Y., Fu X.Y. Cell growth arrest and induction of cyclin-dependent kinase inhibitor WAF1/CIP1 mediated by STAT1. Science. 1996. 272: 719-722.

16. Chun R.F., Semmers O.J., Neuvent C., Jeang K.T. Modulation of Spl phosphorylation by human immunodeficienty virus type 1 Tat. J. Virol. 1998. 72: 2615-2629.

17. Cifuentes M.E., Honkanen L., Rebecchi M.J. Proteolytic fragments of phosphoinositide-specific phospholipase C-51. Catalytic and membrane binding properties. J. Biol. Chem. 1993. 268: 11586-11593.

18. Cockroft S., Thomas G. M. H. Inositol lipid specific phospholipase C isozymes and their different regulation by receptors. Biochem. J. 1992. 288: 1-14.

19. Cohen S., Fava R.A. Internalization of functional EGF receptor kinase complexes in A431 cells. J. Biol. Chem. 1985. 260: 12351-12358.

20. Courey A.J., Tjian R. Analysis of Spl in vivo revials multiple transcriptional domains, including a novel glutamine-rich activation motif. Cell. 1988. 55: 887-898.

21. Coutey A.J., Holtzaman D.A., Jackson S.P., Tjian R. Synergistic activation by the glutamine-rich domains of human transcription factor Spl. Cell. 1989. 59: 827-836.

22. Darnell J.E. STATs and gene regulation. Science. 1997. 277:16301635.

23. Davis R.J., The mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Biol. Chem. 1993. 268: 14553-14556.

24. Datta P.K., Raychaudhuri P., Bagchi S. Association of pl07 with Spl: genetically separable regions of pl07 are involved in regulation of E2F- and Spl-dependent transcription. Mol. Cell. Biol. 1995. 15: 5444-5452.

25. Davis R.J. Independent mechanism account for the regulation by PKC of the EGFR affinity and tyrosine kinase activity. J. Biol. Chem. 1988. 263: 9462-9469.

26. De Luca P., Majello B., Lania L. Sp3 represses transcription when tethered to promoter DNA or targeted to promoter proximal RNA J. Biol. Chem. 1996. 271: 8533-8536.

27. Dent P., Haser W., Haystead T.A.J., Vincent L.A., Roberts T.M., Sturgill T.W. Activation of mitogen-activated protein kinase kinase by v-Raf in NIH 3T3 cells and in vitro. Science. 1992. 257: 1404-1407.

28. Diakonova M., Chilov D., Arnaoutov A., Alexeev V., Nikolsky N., Medvedeva N. Intracellular destribution of phospholipase C y 1 in cell lines with different levels of transformation. Eur. J. Cell Biol. 1997. 73: 360-367.

29. Ding A., Chen B., Fuortes M., Blum E. Association of mitogen-activated protein kinases with microtubules in mouse macrofages. J. Exp. Med. 1996. 183: 1899-1904.

30. Eck M.J., Paganon S., Triib T., Nolte R.T., Shoelson S.E. Structure of the IRS-1 PTB domain bound to the juxtamembrane region of the insulin receptor. Cell. 1996. 85: 695-705.

31. Femald A.W., Jones G.A., Carpenter G. Limited proteolysis of phospholipase C-yl indicates stable association of X and Y domains with enhanced catalytic activity. Biochem. J. 1994. 302: 503-509.

32. Ford M.G., Valle J.D., Soroka C.J., Merchant J.L. EGF receptor activation stimulates endogenous gastrin gene expression in canine G cells and human gastric cell cultures. J. Clin. Invest. 1997. 99: 2762-2771.

33. Fruman D.A., Meyers R.E., Cantley L.C. Phosphoinositide kinases. Annu. Rev. Biochem. 1998. 67: 481-507.

34. Fukami K., Endo T., Immamura M., Takenawa T. a-Actinin and vinculin are PIP2-binding proteins involved in signaling by tyrosine kinase. J. Biol. Chem. 1994. 269: 1518-1522.

35. Georgatos S.D., Maison C. Integration of intermediate filaments into cellular organells. Int. Rev. Cytol. 1996. 164: 91-138.

36. Glenney J R., Chen J.W.S., Lazar C.S., Walton G.M., Zokas L.P., Rosenfeld M.G., Gill G.N. Ligand-induced endocytosis of the EGF receptor is blocked by mutant inactivation and by microinjection of anti-phosphotyrosine antibodies. Cell. 1988. 52: 675-684.

37. Goldman R.D., Khuon S., Chon Y.H., Steinert P.M. The function of intermediate filaments in cell shape and cytoskeletal integrity. J. Cell Biol. 1996. 134: 971-984.

38. Greenfield C., Hiles I., Waterfield M.D., Federwisch M., Wollmer A., Blundell T.L., McDonald N. Epidermal growth factor binding induces a conformational change in the external domain of its receptor. EMBO J. 1989. 8: 4115-4123.

39. Guglielmo G.M., Baass P.C., Ou W.J., Posner B.I., Bergeron J.J. Compartmentalization of SHC, GRB2 and mSOS, and hyperphosphorylation of Raf-1 by EGF but not insulin in liver parenchyma. EMBO J. 1994. 13: 4269-4277.

40. Hackel P.O., Zwick E., Prenzel N., Ullrich A. Epidermal growth factor receptor: critical mediators of multiple receptor pathway. Curr. Opin. Cell Biol. 1999. 11: 184-189.

41. Hagen G., Muller S., Beato M., Suske G. Spl-mediated transcriptional activation is repressed by Sp3. Embo J. 1994. 13: 3843-3851.

42. Han I., Kudlow J.E. Reduced O glycosylation of Spl is associated with increased proteasome susceptibility. Mol. Cell Biol. 1997. 17: 25502558.

43. Hemandez-Sotomayor S.M., Carpenter G. Non-catalytic activation of phospholipase C-yl in vitro by epidermal growth factor receptor. Biochem. J. 1993. 293: 507-511.

44. Hibi M., Lin A., Smeal T., Minden A., Karin A. Identification of an oncoprotein and UV-responsive protein kinase that binds and potentiates the c-Jun activation domain. Genes Dev. 1993. 7: 2135-2148.

45. Hirokawa N. Kinesin and dynein supeifamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 1998. 279: 519-526.

46. Homma Y., Takenawa T. Inhibitory effect of src homology (SH) 2/SH3 fragments of phospholipase C-y on the catalytic activity of phospholipase C isoforms. Identification of a novel phospholipase C inhibitor region. J. Biol. Chem. 1992. 267: 21844-21849.

47. Hwang S.C., Jhon D.Y., Bae Y.S., Kim J.H., Rhee S.G. Activation of phospholipase C-y by the concerted action of tau proteins and arachidonic acid. J. Biol. Chem. 1996. 271: 18342-18349.

48. Jackson S.P., MacDonald J.J., Lees-Miller S., Tjian R. GC box binding induces phosphorylation of Spl by a DNA-dependent protein kinase. Cell. 1990. 63: 155-165.

49. Jackson S.P., Tjian R. O-glicosylation of eukariotic transcription factors: implications for mechanisms of transcriptional regulation. Cell. 1988. 55: 125-133.

50. Janmey P. A. Phosphoinositides and calcium as regulators of cellular actin assembly and disassembly. Annu. Rev. Physiol. 1994. 56: 169-191.

51. Kadonaga J.T., Camer K.R., Masiarz F.R. Tjian R. Isolation of cDNA encoding transcription factor Sp 1 and functional analysis of the DNA binding domain. Cell. 1987. 51: 1079-1090.

52. Kaibuchi K., Fukumoto Y., Oku N., Takai Y., Arai K., Muramatsu M. Molecular genetic analysis of the regulatory and catalytic domains of protein kinase C. J. Biol. Chem. 1989. 264: 13489-13496.

53. Karlseder J., Rotheneder H., Wintersberger E. Interaction of Spl with the growth- and cell cycle-regulated transcription factor E2F. Mol. Cell. Biol. 1996. 16: 1659-1667.

54. Kashles O., Szapary D., Bellot F., Ullrich A., Schlessinger J., Schmidt A. Ligand-induced stimulation of EGF-receptor mutants with altered transmembrane region. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1988. 85: 9567-9571.

55. Keely P.J., Parise L.V. The alpha2betal integrin is a necessaiy co-receptor for collagen-induced activation of Syk and the subsequent phosphorylation of phospholipase Cy2 in platelets. J. Biol. Chem. 1996. 271: 26668-26676.

56. Keenan C., Kelleher D. Protein kinase C and the cytoskeleton. Cell Signal. 1998. 10: 225-232.

57. Kim H.K., Kim J.W., Zilberstein A., Margolis B., Kim J.G., Schlessinger J., Rhee S.G. PDGF stimulation of inositol phospholipid hydrolysis requires PLC-/1 phosphorylation on tyrosine residues 783 and 1254. Cell. 1991. 65: 435-441.

58. Koblan K.S., Schaber M.D., Edwards G., Gibbs J.B., Pompliano D.L. src-homology 2 (SH2) domain ligation as an allosteric regulator: modulation of phosphoinositide-specific phospholipase C/\ structure and activity. Biochem J. 1995. 305: 745-751.

59. Margolis B., Rhee S.G., Felder S., Mervic M., Lyall R., Levitzki A., Ullrich A., Zilberstein A., Schlessinger J. EGF induces tyrosine phosphorylation of phospholipase C-/1: a potential mechanism for EGF receptor signaling. Cell. 1989. 57: 1101-1107.

60. Marin M., Karis A., Visser P., Grosveld F., Philipsen S. Transcription factor Spl is essentialfor early embryonicdevelopment but dispensable for cell growth and differentiation. Cell. 1997. 89: 619-668.

61. Marshall K. The MAPK cascade. Curr. Op. Gen. 1994. Devel. 4: 8290.

62. Mayo K.H. Epidermal growth factor from the mouse. Biochemistry. 1985. 24: 3783-3794.

63. Mc Cormick. How receptors turn Ras on. Nature. 1993. 363: 15-16.

64. McBride K., Rhee S.-G., Jaken S. 1991. Immunocytochermical localization of phospholipase C/l in rat embryo fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 : 7111-7115.

65. Merchant J.L., Du M., Todisco A. Spl phosphopylation by Erk2 stimulates DNA binding. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. 254: 454461.

66. Merchant J.L., Demediuk B., Drand S.J. A GC-rich element confers epidermal growth factor responsiveness to transcription from the gastrin promoter. Mol. Cell. Biol. 1991. 2686-2691.

67. Merchant J.L., Shiotani A., Mortensen E., Shumaker D., Abraczinskas D. EGF stimulation of the human gastrin promoter requires Spl. J. Biol. Chem. 1995. 270: 6314-6319.

68. Misra U.K., Gawdi G., Pizzo S.V. Ligation of the alpha 2-macroglobulin signalling receptor on macrophages induces protein phosphorylation and an increase in cytosolic pH. Biochem. J. 1995. 309: 151-158.

69. Moolenaar W., Bierman A., Tily B., Defize L., Ullrich A., Schlessinger J. A point mutation at the ATP-binding site. EMBO J. 1988. 7: 707-710.

70. Moitensen E.R., Marks P.A., Shiotani A., Merchant J.L. Epidermal growth factor and ocadaic acid stimulate Spl proteolysis. J. Biol. Chem. 1997. 272: 16549-16547.

71. Moustakas A., Kardassis D. Regulation of the human p21/WAFl/Cipl promoter in hepatic cells by functional interactions between Spl and Smad family members. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. 95: 6733-6738.

72. Nesterov A., Lysan S., Vdovina I., Nikolsky N., Fujita D.J. Phosphorylation of the epidermal growth factor receptor during internalization in A-431 cells. Arch. Biochem. Biophys. 1994. 313: 351-359.

73. Noh D.Y., Shin S.H., Rhee S.G. Phosphoinositide-specific phospholipase C and mitogenic signaling. Biochim. Biophys. Acta. 1995. 1242: 99-113.

74. Pal S., Claffey K. P., Cohen H. T., Mukhopadhyay D. Activation of Spl-mediated vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor transcription requires specific interaction with protein kinase J. Biol. Chem. 1998. 273: 26277-26280.

75. Pal S„ Claffey K.P., Cohen H.T., Mukhopadhyay D. Activation of Spl-mediated vascular permeability Factor/Vascular endothelial growth factor transcription requires specific interaction with protein kinase zeta. J. Biol. Chem. 1998. 273: 26277-26280.

76. Pascal E., Tjian R. Different activation domains of Spl govern formation of multimers and mediate transcriptional synergism. Genes Devel. 1991. 5: 1646-1656.

77. Pascall J.C., Brown K.D. Identification of a minimal promoter element of the mouse epidermal growth factor gene. Biochem. J. 1997. 324: 869-875.

78. Pastan I.H., Willingham M.C. Journey to the center of the cell: role of the receptosome. Science. 1981. 214: 504-509

79. Pastan I.H., Willingham M.C. Receptor-mediated endocytosis of hormones in cultured cells. Ann. Rev. Phisiol. 1981. 43: 239-250.

80. Pei Z., Yang L., Williamson J.R. Phospholipase C-y 1 binds to actin-cytoskeleton via its C-terminal SH2 domain in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. 228: 802-806.

81. Persengiev S.P., Saffer J.D., Kilpatrick D.L. An alternatively spliced form of the transcription factor Sp 1 containing only a single glutamine-rich transactivation domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. 92: 9107-9111.

82. Peterson M.G., Tanese N., Pugh B.F., Tjian R. Functional domains and upstream activation properties of cloned human TATA binding protein. Science. 1990. 248: 1625-1630.

83. Philipsen S., Suske G. A tale of three fingers: the family of mammalian Sp/XKLF transcription factors. Nucl. Acid. Res. 1999. 27: 29913000.

84. Plopper G.E., McNamee H.P., Dike L.E., Bojanowski K., Ingber D.E. Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex. Mol. Biol. Cell. 1995. 6: 1349-1365.

85. Ren Y., Satoh T., Yamada M., Hashimoto K., Konaka S., Iwasaki T., Mori M. Stimulation of the preprothyrotropin-releasing hormone gene by epidermal growth factor. Endocrinology 1998. 139: 195-203.

86. Rhee S., Choi K. Regulation of inositol phospholipid-specific PLC isozymes. J. Biol. Chem. 1992. 267: 12393-12396.

87. Rhee S.-G. Inositol phospholipid-specific phospholipase C: interaction of the isoform with tyrosine kinase. TIBS. 1991. 16: 297-301.

88. Rhee S.G., Bae Y.S. Regulation of phosphoinositide-specific phospholipase C isozymes. J. Biol. Chem. 1997. 272: 15045-15048.

89. Rogers S., Wells R., Reshstein M. Amino acid sequences common to rapidly degraded protein: The PEST hypothesis. Science. 1986. 234: 364-368.

90. Rohde M., Warthoe P., Gjetting T., Lukas J., Bartek J., Strauss M. The retinoblastoma protein modulates expression of genes coding for diverse classes of proteins including components of the extracellular matrix. Oncogene. 1996.12: 2393-2401.

91. Rohlff C., Ahmad S., Borellini F., Lei J., Glazer R.I. Modulation of transcription factor Spl by cAMP-dependent protein kinase. J. Biol. Chem. 1997. 272: 21137-21141.

92. Roos M.D., Su K., Baker J.R., Kudlow J.E. O glycosylation of an Spl-derived peptide blocks known Spl protein interactions. Mol. Cell. Biol. 1997. 17: 6472-6480.

93. Ryu S., Tjian R. Purification of transcription cofactor complex CRSP. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 1999. 96: 7137-7142.

94. Schlessinger J., Ullrich A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 1992. 9: 383-391.

95. Seedorf K., Kostka G., Lammers R., Bashkin P., Daly R., Burgess W.H., van der Bliek A.M., Schlessinger J., Ullrich A. Dynamin binds to SH3domains of phospholipase C / and GRB-2. J. Biol. Chem. 1994. 269: 1600916014.

96. Smith M.R., Liu Y.L., Kim H„ Rhee S.G., Kung H.F. Inhibition of serum- and ras-stimulated DNA synthesis by antibodies to phospholipase C. Science. 1990. 247: 1074-1077.

97. Smith M.R., Liu Y.L., Matthews N.T., Rhee S.G., Sung W.K., Kung H.F. Phospholipase C-y 1 can induce DNA synthesis by a mechanism independent of its lipase activity. Proc. Natl. Acad. Sci.U S A. 1994. 91: 6554-6558.

98. Smith M.R., Ryu S.H., Suh P.G., Rhee S.G., Kung H.F. S-phase induction and transformation of quiescent NIH 3T3 cells by microinjection of phospholipase C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. 86: 3659-3663.

99. Soderquist A.M., Caipenter G. Glycosylation of the epidermal growth factor receptor in A-431 cells. The contribution of carbohydrate to receptor function. J. Biol. Chem. 1984. 259: 12586-12594.

100. Sorkin A., Heldin K., Waters C., Caipenter G., Beguinot L. Multiple autophosphorylation sites of EGF-R are essential for receptor kinase activity and intemalisation. J. Biol. Chem. 1992. 267: 8672-8678.

101. Sorkin A.D., Teslenko L.V., Nikolsky N.N. The endocytosis of epidermal growth factor in A431 cells: a pH of microenvironment and the dynamics of receptor complex dissociation. Exp. Cell Res. 1988. 175: 192205.

102. Stacey D.W., Kung H.F. Transformation of NIH 3T3 cells by microinjection of Ha-ras p21 protein. Nature. 1984. 310: 508-511.

103. Su K., Roos M.D., Yang X., Han I., Paterson A.J., Kudlow J.E. An N-terminal region of Spl targets its proteasome-dependent degradation in vitro. J. Biol. Chem. 1999. 274: 15194-15202.

104. Swairjo M.A., Concha N.O., Kaetzel M.A., Dedman J.R., Seaton B.A. Ca(2+)-bridging mechanism and phospholipid head group recognition in the membrane-binding protein annexin V. Nat. Struct. Biol. 1995. 2: 968-974.

105. Todderud G„ Wahl M., Rhee S., Carpenter G. Stimulation of PLC/1 membrane association by EGF. Science. 1990. 249: 296-298.

106. Too C.K. Induction of Spl activity by prolactin and interleukin-2 in Nb2 T-cells: differential association of Spl-DNA complexes with Stats. Mol. Cell. Endocrinol. 1997. 129: 7-16.

107. Touhara K., inglese J., Pitcher J.A., Shaw G., Lefkowitz R.J. Binding of G protein beta /-subunits to pleckstrin homology domains. J. Biol. Chem. 1994. 269: 10217-10220.

108. Ullrich A., Schlessinger J. Signal transduction by receptor with tyrosine kinase activity. Cell. 1990. 61: 287-307.

109. Vega Q., Cochet C., Filhat 0., Chang C.-P., Rhee S., Gill G.A. Site of tyrosine phosphorylation in the C-terminus of EGF-receptor is required to activate phospholipase C. Mol. Cell Biol. 1992. 12: 128-135.

110. Vieira A.V., Lamaze C., Schmid S.L., Control of EGF receptor signalling by clatrin-mediated endocytosis. Science. 1996. 274: 2086-2089.

111. Wang J.C., Van Dyke M.W. Spl, USF, and GAL4 activate transcription independently of TFIID-downstream promoter interactions. Biochim. Biophys. Acta. 1994. 1218: 308-314.

112. Wells A. EGF receptor. Int. J. Biochem. Cell Biol. 1999. 31: 637-643.

113. Wiesmuller L., Wittinghofer F. Signal transduction pathways involving Ras. Cell. Signal. 1994. 6: 247-267.

114. William D., Singer H., Brown A., Stemweis P. Regulation of eukariotik phosphatidilinositol-specific phospholipase C and phospholipase D. Annu. Rev. Biochem. 1997. 66: 475-509.

115. Xue L., Lucocq J. Erk2 signalling from internalised epidermal growth factor receptor in broken A431 cells. Cell Sinnal. 1998. 10: 339-348.

116. Yang L.J., Rhee S.G., Williamson J.R. Epidermal growth factor-induced activation and translocation of phospholipase C-y 1 to the cytoskeleton in rat hepatocytes. J. Biol. Chem. 1994. 269: 7156-62.

117. Yarden Y., Schlessinger J., Epidermal growth factor induces rapid, reversible aggregation of purified epidermal growth factor receptor. Biochemistry. 1987. 26: 1443-1445.