Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ассоциация фосфолипазы Сy и рецептора эпидермального фактора роста (ЭФР) в клеточных линиях с различным ответом на ЭФР

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Ассоциация фосфолипазы Сy и рецептора эпидермального фактора роста (ЭФР) в клеточных линиях с различным ответом на ЭФР"

АССОЦИАЦИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ С у И РЕЦЕПТОРА

ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА (ЭФР) В КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ С РАЗЛИЧНЫМ ОТВЕТОМ IIЛ

ЭФР

03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ИЕТЕГВУРГ 19%

Работа выполнена i Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург.

Научные руководители: доктор биологических наук, академик

H.H. Никольский, кандидат биологических наук

НД. Медведева,

Институт цитологии РАН,

С-Петербург.

Официальны« оппоненты: доктор биологических наук

И.М.Константинова,

Институт цитологии РАН,

С-Петербург; кандидат биологических наук М.В. Филатов, Петербургский институт ядерной физики,

С.-Петербург, Гатчина.

Ведущее учреждение: Институт эволюционной физиологии и биохимии

им. Сеченова, С-Пегербург.

Защита состоится " 14 " нюня 1996 года в 13 ч.

на засеаашш Диссертационного совета Д.002.73.01 Института

цитологам РАН по адресу:

Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института цитологии РАН.

Реферат разослан " № " мая_1996 года.

Ученый секрегэрь .Диссертационного совета

д.б.н.

Л.Н.Писарсва

Актуальность прблемы.

В настоящее время в клеточной биологии большое внимание уделяется изучению процессов, связаных с регуляцией репродукции клеток эукаркот. Одним из них является действие ростовых факторов. Многие ростовые факторы (РФ), гормоны, нейротрансмиттеры, связываясь с соответствующими рецепторами на плазматической мембране клеток, активируют внутриклеточные реакции, приводящие клетки к синтезу ДНК и, в итоге, к их к., leimio. Рецепторы РФ, в частности рецептор эпидермалыюго фактора роста (ЭФР-Р), обладают протеинкиназной активностью, специфичной по тирозину, то есть являются рецепторными тирозинкиназами (РТК). Связывание РФ с рецептором приводит к активации РТК, катализирующей фосфорилирование как самого рецептора, так и некоторых белков, участвующих во внутриклеточной передаче митогениого сигнала с поверхност и клеток к ядру. Несмотря на огромное количество работ, посвященных изучению этих процессов, их механизмы к настоящему времени остаются предметом исследований.

Когда было обнаружено, что у большинства типов клеток одной из первичных реакций на связывание РФ с рецептором является увеличение уровня внутриклеточного инозитолтрифосфата (ИТФ), стимулирующего выход ионов Са++ из внутриклеточных "хранилищ", и появление диацилглнцерола (ДЛГ), физиологического активатора протеинкиназы С (ПКС) , особое внимание было уделено пиролизу инознтолфосфолипидов (И'!'), в результате которого и появляются ИТФ и ДАГ. Ферментом, катализирующим этот гидролиз оказалась фосфолипаза С. К настоящему времени известно 4 изоформы (типа) этого фермента : а, р, б и у. Каждый тип включает в себя несколько подтипов, обозначаемых арабскими цифрами после греческих букв: ФЛСу1, ФЛСу2. Показано, что все ФЛС обладают двумя сходными каталитическими доменами, назваными X и Y К настоящему времени удалось установить два основных механизма активации этого фермента: бактериальные токсины, аналоги гуанозинтрифосфата изменяют активность ФЛС через G-белки; так же акшвность ФЛС может изменяться при действии РФ i .тем прямой каталептики модификации фермента (},оСФ0РИЛ11Р0Ва!!Ием- Продемонстрировано, чти тирозипкиназный домен рецепторов, в частности ЭФР-ренеп гора (ЭФР-Р), необходим для инициации пиролиза ИФ. Известно, что именно ФЛС.у1 сшч:оби» к ассоциации с рецепторами РФ и, вероятно, активируется пуни фосфорнлнровання по тирозину за счет активности РТК. Однако сини, меж.-п фосфорилированием по тирозину и увеличением способност <!'Ж s I гидролизовать фосфатидилшюзитол фосфаты не так проста, кпк что ктак» ' п начале исследований в этой области. Фосфорилирование очищеииои ФЛГу! vitro не приводило к увеличению ее активности ; замешете-". nnimm in ,,пм. » фосфорилирования .Y-783, в молекуле ФЛСу1 не пршкчшло к .пнгнижм .каталитической активности in vitro; и- го же время ^кшроч-ия тч (■■■•ч., i ,i>

в метках N111 ЗТЗ вела к полному блокированию ФРВТ-индуцированного пшролта ИФ. В таких клеточных линиях как А431, NIH ЗТЗ, Ref52 и др. G-белки не участвуют в активации ФЛСу1, однако на первичных гепатоштах крысы показано, что во взаимс, ействии ФЛСу1 с ЭФР-Р кроме РТК принимает участие G-бслок. Более того, Смит с соавторами (Smith et.al.,1994) показали способность ФЛСу1 независимо от ее липазной активности индуцировать синтез ДНК. в клетках NIH3T3.

В отличие от других изозимов фосфолипаза Cyl, кроме кагалитических X и У доменов, содержит так называемые Src-гомалогачные последовательности (SH домены). SH2 домен обеспечивает связь белка с фосфотирозин (pY)-содержащнми последовательностями других белков, SH3 домен, предположительно, обеспечивает связь белков с актиновым цитоскелегом Обнаружение белков, имеющих подобные домены, но обладающих каталитическими активносгями (Nek, р85 субъединица фосфатидилинозитол-3 кииазы, Drk, Sem5 ), но адаптирующих белок-белковые взаимодействия за счет этих структурных доменов, наводит на мысль о наличии подобной адаптерной функции и у ФЛСу.

Еще одним обстоятельством, придающим значимость рассматриваемой проблеме,является отсутствие какой либо информации о функции и участии в активации и/или врегуляции ФЛСу ряда белков, хо-чммунопреципитирующих с этим ферментом.

Так же до сих пор остаются невыясненными ни вопрос о влиянии количества рецепторов РФ (ЭФР-Р), ил вопрос о различиях ФЛСуЬзависимых механизмов, запускаемых ростовыми факторами в нормальных и трансформированных клетках.

Цели и задачи исследования.

Цель» данной работы являлось изучение взаимодействия рецептора ЭФР и ФЛСу1, а также других белок-белковых взаимодействий, индуцированных ЭФР на клеточных линиях с различным ответом на действие ЭФР. В связи с этим задачи исследования определены следующим образом:

1. Выявить наличке ФЛСу1 в различных тканях и клеточных линиях. Определить, существует лк взаимодействие между ФЛСу1 и ЭФР-Р.

2. Сравнить ассоциацию ФЛСу'. и ЭФР-Р в «легочных линиях, где ЭФР индуцирует и не нидуцирует синтез ДНК.

3. Сравнить фосфорилированке ФЛСу1 к других белков в нормальных и внеокотранеформированных клеточных дгниях.

4. Исследозат; ЭФР-ччдуцировшшую ассоциацию ФЛСу1 с другими белками в нормальных и высокограпсформированных клеточных линиях.

5. Определить влияние количества ЭФР-Р на активацию ФЛСу1.

. Научная новизна полученных результатов.

Установлено наличие я распределение ФЛСу 1 в тканях некоторых органон крысы и в некоторых клеточных линиях, таких как А431, МГ22, первичных гепатоцитах мыши., первичных фибробластах человека. Показано, что данный фермент присутствует в относительно большом количестве в гомогенатах мозга н печени крыс, в меньшей степени - в гомогенатах почек и легкого, практически отсутствует в гомогенатах селезенки и сердца. В кллках МГ22 и в первичных гепатоцитах ФЛСу1 присутствует в относительно большем и примерно равном количестве.

В клетках А431 обнаружена ассоциация ЭФР-Р и ФЛСу! как до, так и после обработки клеток ЭФР. Это предполагает независимость ассоциации ФЛСу с ЭФР-Р от активирования РТК в эгих клетках.

Выявлен ранг не описанный белок с молекулярной массой 66 кДа (рбб), способный к ассоциации с ЭФР-Р. Пептидное картирование рбб свидетельствует, что этот белок является фрагментом ФЛСу 1, возможно продуктом ее естественного протеолиза. Предполагаются конкурентные отношения между ФЛСу1 и рбб за места свя.>ывания с ЭФР-Р в клетках А431.

На клетках мышиной гелатомы определено количество и аффинность рецепторов ЭФР, показано ингибпрующее действие ЭФР на синтез ДНК. Продемонстрирована ЭФР зависимая ассоциация ЭФР-Р и ФЛСу1. Вопреки ожидаемому, в клетках МГ22 белок рбб, ассоциированный с ЭФР-Р и ко-иммунопреципишрую/ций с ФЛСу1, не был обнаружен. При этом выявлялись белки с молекулярными массами 70 и НО кДа, хо-иммунопреципитирукчдие с ФЛСу1, фосфорилкруюшиеся по тирозину при действии ЭФР.

На первичных гепатоцитах мыши определено количество ЭФР-Р, примерно равное количеству ЭФР-Р клеток мышиной гепатомы. Показано индуцирующее действие ЭФР на елнгез ДНК. При ЭФР-индуцированной ассоциации с ЭФР-Р и фосфоршшроваиии ФЛСу1 не обнаружен фосфоршмромнным по тирозину р]10. Отсутствие фосфорилированного р110 огличает первичные гепатоциты мыши от клеток мышиной гепатомы.

Практическая ценность работы.

Сравнение клеток сходного происхождения (МГ22 и первичных гепатоцитов) позволило выявить некоторые отличия в ФЛСуЬзапнспмых биохимических путях, активизированных действием ЭФР, в нормальных и ьысокотрансформированных клетках.

Применение антител, выработанных на 8Н-содержащий участок ФЛСу1, позволяет иммуиопреципитировать другие йН-содержагшх белки и выявлять и* взаимодействия и ЭФР-зависимое фосфорнлировлиие при помощи антител к рУ.

Совмещение протеолитического расщепления белков с пептидным картированием в процессе электрофореза втрое сокращаег .смя проветри

стандартной процедуры, позволяет использовать для создания пептидных карт небольшие количества белков и протеаз, заметно уменьшает «¿специфическую деградацию белков.

Апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Материалы диссертации были представлены на 4-ои Европейском конгрессе по клеточной биологии (Прзга,Чехословак1М, 1954), докладывались на Российских конференциях и научных семинарах лаборатории физиологии меточного цикла Института цитологии РАН.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов экспериментов, обсуждения результате®, выводов и списка литературы, содержащего публикаций. Работа изложена на //У страницах машинописного текста и иллюстрирована // рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Материалы и методы исследования.

Клеточные линии и их культивирование.

В работе использовали клетки эпидермальиой карциномы человека линии А431, клетки мышиной гепатомы линии МГ22. первичные фибробласты человека полученные, из Банка клеточных хультур (Институт цитологии РАН), первичные гепатошгш мыши, полученчые коллагеназным расщеплением перфорированной nesei:взрослых самцов мышей по методу JI. Янга (Yang et.al., 1ВС, 1991, 266, 22451-22458). Клетки А431 и МГ22 высевали на пластиковые чашки Петри (Nun'/) в срсде ДМ11М с 10 % сыворотки крупного рогатого скота. Первичные гепатоциты выращивали в таких же чашках Петри в среде ДМЕМ:Р12 (1:1) с добавлением 10 % сыворотки крови плодов коров (Sigma) и 5 мкг/мл инсулина. Первичные фибробласты выращивали в среде ДМЕМ, содержащей 15 % сыворотки крови плодов коров (Sigma). Для опытов асе клеточные линии высевали на 50 либо 100 мм чашки Петри с плотностью 25-40 тыс.кдеток/см2 . В опыт брали монослойные культуры. Для анализа синтеза ДНК использоьали клеточные культуры, достигшие 70-80% от монослоя.

Получение иодированных лигзндоь.

Иодирование ЭФР проводили с использованием йодогена и 1!5I-Na (Wiley, Cunnigham, 19S2).

Равновесное сзязывание ,Ы1-ЭФР.

Клетки МГ22 и первичные генатоциты выращивали до 80-90 % моиослоя в 24-луночных платах (Flow) при 37°С в сред с ДМНМ:Р12, содержащей 10 % сыворотки крови плодов коров в атмосфере с 0,5 % СОг. Все эксперименты по связыванию проводились на льду. Специфическая активность 1;!1-ЭФР составляла от 200000 до 400000 ерш на 1нг ЭФР. Клетки инкубировали в среде ДМЕМ, содержащей 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 25 мМ HEPES, рН7,4 с различными концентрациями 12<1-ЭФР (от 0,5 до 200 нг / мл.) После трехчасовой инкубации клетки промывали 3 раза средой, не содержащей лигаида, после чего лизнровали 1М раствором NaOH и определяли связанную с клетками радиоактивность на у-счетчикс (Beckman). Неспецифическое связывание определяли добавг шем 300-кратного избытка немечеиного ЭФР к клеткам, которое не превышало 0,5%. Определение специфического связывания ЭФР и подсчет количества и аффинности сайтов связывания проводили согласно программе LIGAND .

Определение синтеза ДНК.

Клетки выращивали до 70-80% от монослоя в 24 луночных платах. ЭФР был получен в Лаборатории физиологии клеточного цикла из подчелюстных слюнных желез мышей самцов (Соркин А.Б. и ££-.,1989). ЭФР (Юнг/мл) добавляли в кондиционированную среду на разные сроки от 4 до 36 часов. Синтез ДНК определяли введением в культуральную среду метки (ыС-тимидина) на 1 час при 37°С. После промывок клетки лизировали 0,4 М NaOH и определяли процент включения меченного предшественника методом сцинтилляционной спектроскопии на счетчике ßeckman LS 8100 .

Антитела.

В работе использовали поликлональиые моноспецифические антитела, выработанные к С-концевом" пептиду ФЛСу1, любезно предостаь/:нные нам проф. Г. Карпентером (США), описанные ранее (Artega et.al. 1992). Антитела на SH2-SH2-SH3 - содержащий домен ФЛСу1 получены в Лаборатории физиологии клеточного цикла (Алексеев и др., 1993). При получении антител использовался 5Н2-5Н2-5НЗ-глюгатион-8-трансфераза гибридный белок, экспрессируемый в E.co)i. Штамм E.coli, трансфецированный плазмидой рОех 3, содержащей кДНК этого белка, любезно предоставлен проф. Дж.Шлесоинджсром (США). В ряде экспериментов использовали моноклональные антитела к ФЛСу! (State Biotechnology). Моноклональные антитела к ЭФР-Р Mab-108 любстио предоставлены проф. Дж.Шлесеииджером (США). Антитепа к фосфотрочину были получены в Лаборатории физиологии клеточного цикла .

Опр. еленне распределения ФЛСу1 в органах крысы.

Для экспериментов брали взрослых самцов крыс (¡50-200г.) линии \У15'агс]. Сразу после декапитации органы замораживали в жидком азоте. Образцы весом 5г. гомогенизировали в 35 мл. холодного буфера, содержащего ЮмМ Тги-НС1. рН 7,4, -1мМ ЕДТА, 1мМ РМЭР, 5 мкг/мл леупсшина, 5 мкг/мл апротинина. Гомогенаты центрифугировали 1000 g 12 мин. Сунернатант отбирали и центрифугировали при 27000 £ в течение часа. К очищенным таким образом гомогенатам добавляли антитела к ФЛСу1, белок А-сефарозу и проводили иммунопреципитацию при +4°С в течение 3 часов. После электрофореткческого разделения иммунопрсципнтатов и переноса белков на нитроцеллюлозу выявляли ФЛСу! Всстер! блот анализом.

Выявление специфической ассоциации ЭФР-Р и ФЛСу1.

Клетки выращивали в 100 мм чашках Петри до монослоя. Перед введением ЭФР клетки инкубировали в среде ДМЕМ, содержанки 0,1% БСА и 200 мМ HEPES, pH 7,4 в течение 15 мин., после чего ЭФР (200н-/мл) в той же среде добавляла к клеткам на различчые промежутки времени при 37сС. После 3 промывок фосфатао-солевым буфером (ФСБ) клетки лизировали на льду буфером, содержащим 1% NP-40, 50мМ Tris-HCl, 0,1% БСА, 5мМ ЕДТА, 10 мкг/мл леупептинэ, 10 мкг/мш апротинина, 3 мМ PMSF. После лизиса и центрифугирования (Змии. 9000 g) в лизаты добавляли моноклональные антитела к рецептору ЭФР - Mab 108, белок А-ссфароза и козьи антитела, выработанные против иммуногл обули' ib мыши. Иммунопреципитацию ЭФР-Р проводили в течение 2 часов при +4°С. Иммунопреципитацию ФЛСу1 проводили либо полигональными гнтителами на 8Ш-8Н2-&НЗ-содержащий участок ФЛСу1, либо моноспецифическими антителами, выработанными на С-коицевой пептид ФЛО/1 в течение 3 часов при +4°С. После злектрофоретического разделения и переноса имкуног.реципитировавших белков на нитроцеллюлезу выявлялась ФЛСу1 антителами, выработанными на различные участки фермента. В качестве системы выявления комплекса антиген-антитело использоезли коньюгаты козьих антител, выработанных против иммуноглобулинов кролика, с щелочной фосфатазой.

Определение фосформирования Се:«ков ют тирозину.

Обработанные и необработанные ЭФР клегки (как это описано ранее) носле 3 промывок. ФСБ лидировали холодным буфером, содержащим 20мМ KEPES, p¡17,3, 50мМ I iV. 10 об.% глицерина. 1% тритона Х-100, 1мМ NajVO,, 2,5мм нитрофенилфосфэта, ¡мМ PMSF. После центрифугирования 9000 g 10 мин. к супсрнатантам добавляли антитела либо к ЭФР-Р, либо к ФЛСу1. После нммунопрешшигашш. электрофореза и переноса белков на нитроцеллюлозу

белки, содержащие фосфотиродан выявляли поликлоналышми или моноклональними шггитслами к фосфотирозину.

Протеолигическое расщепление и пептидное картирование. После иммунопреципитации ФЛСу! из лизатов клеток А431 и алектрофоретического разделения белков акриламидкмй гель окрашивали Cumassic blue G 250 по стандартной методике. Белковые полосы, соответствующие 145кДа, ббкДа ii 47кДа,вырезали из геля, открашивали в 7% уксусной кислоте при интенсивном перемешивании. Кусочки геля подравнивали под размер и помещали в "карманы" 15% полиакриламидного SDS-геля. Пространство вокруг кусочка заполняли 5-7мкл буфера, содержащего 125мМ Ti is-НС1, рН 5,8, 0,1% SDS, 3% Р-меркаптоэтанола, 20% глицерина. Протеазу (модифицированный трипсин, Sigma) разводили в буфере, содержащем 125мМ Tris-HCl, рН 6,8, 0,1% SDS, 10% глицерина так, чтобы соотношение белок:протеаза было 1:200 или 1:100. После нанесения разведенной протеазы (не более 5 мхл) в "карман" начинали электрофорез при напряжении 100В в течение 15-20 минут. Далее электрофорез выключали на 15-30 минут, после чего продукты протеолиза разделяли при напряжении 200 В. Окрашивание геля серебром проводили по стандартной методике.

Результаты исследования.

Обнаружение ФЛСу1 в органах крысы и в нехогорых клеточных линиях. Гомогенаты сердца, почек, легкою, селезенки, мозга и печени крысы приготавливали, как описано в материалах и методах. Иммунопреципитация и иммуноблот анализ ФЛСт1 продемонстрировали наличие значительного количества этого фермента в гомогенатах мозга и печени. В легком ФЛСу1 выявлялась в несколько меньшем количестве. В гомогенатах почек и селезенки фермент практически не детектировался, а в сердце ФЛСу1 таким методом не обнаруживалась (рис.1). Такт клеточные линии, как А431, МГ22, HER14, Не La, К562, а также первичные человеческие фибробласты и первичные гепатоштгы мышк были проверены на наличие ФЛСу1 методом иммунопреципнташш и иммуноблота. Выяснилось, что фермент имеется во всех исследованных клетках. Относительно большое количество })ермснта обнаруживалось в клетках МГ22 и первичных гепатецитах, меньшее его количество выявлялось в клетках К562 и HeLa, и еще меньшее - в А431 и в HER14.

1 2 3 4 5 6

, ид» г^-г?-

Рис. !. Содержание ФЛСу1 в гомогенатах некоторых органов крысы. Выявление ФДСу1 иммунопрецигштадаей и иммуноблотом с антиФЛСу1 антителами. 1-сердцс, 2-селезенка, 3-;:епсос, 4-мозг, 5-печень, б-почки.

Ассоциация ФЛСу! и ЭФР-рецептора в клетках А431.

Известно, что ФЛСу1 способна ассоциироваться с рецепторами ростовых факторов. Ранее была продемонстрирована: ко-иммунопрештитацяя ЭФР-Р и ФЛСу1 с использованием различных антител к ФЛСу1. Также было показано, что некоторые моноклональные антитела к ФЛСу1 узнают другае, отличные от ФЛСу1, белки. Один из них с молекулярной массой 47кДа был описан как белок №:к, имеющий такие же последовательности, что и ФЛСу!.

В наших экспериментах ЭФР-Р был иммуноиреципитироьан из лизатов клеток А431, как описано в материалах и методах. Вестерн-блот анализ с ислсяьзованием ангиФЛСу! антител показал, что в необработанных Э<1>Р клетках А431 полоса с молекулярной массой 145 кДа, соответствующая ФЛ Су1, выявлялась вместе с белками, молекулярная масса которых 60 и 66 кДа (рис 2). Такая ко-иммулопрецинитация гыявлялагь, как с использованием полнклональных и моноклональных антител к ЭФР-Р, так и с использованием дьух типов антител к ФЛСу1. Подобная ассоциация может быть объяснена тем, что ЭФР-Р независимо от активации рецепторной тирозннкиназы способен спя ;ываться с ФЛСу1.

1 г

рбб-

(>66-

1 2

Г ; | | ;

' I ;

Н1'

Рис. 2. Ко-иммунолреципитация ФЛСу1 и ЭФР-Р. Клсгки А431 были лизированы до (1) и после (2) обработки ЭФР (Юнг/мл). После преципитации ЭФР-Р белки выявлялись антиФЛСу! антителами.

Рис. 3. Вестерн-блот анализ ФЛСу1. Клетки А431 были лизированы до (1) и после (2) обработки ЭФР и ко-иммунопреципитирующие с ней белки выявлялись антнФЛСу! антителами.

»лс

Для определения специфичности связывания рбО и рбб антиФЛСу1 антителами была проведена иммунопрецнпитация ФЛСу1 и лиэатов обработанных и необработанных ЭФР клеток А431 (рис 3). Вестерн-блот анализ с антителами к С-хонцевому пептиду ФЛСу1 продемонстрировал специфичность взаи'.юдсистпия антиФЛСу1 антител с рбб. Ранее бьшо показано, что белок с молекулярной массой 64 кДа ко-иммунспреципитирует с ФРВТ рецептором в ФРВТ обработанных и покоящихся РАБ клетках . Белки со сходными молекулярными массами обнаруживались различны» I антителами к ФЛСу1 на различных клеточных линиях . Такое обнаружение возможно в случае, если белок либо непосредственно взаимодействует, либо родственен ФЛСу1.

ш ~

20 ~ ~ ^

«ЯШ- - ' , ...

1 I

! V"

Рис. 4. Пептидные карты Кек (1), рбб (2) и ФЛО/1 (3).

Для проверки, является ли рбб родственным ФЛОу1 белком, нами было проведено пептидное картирование этих белков. Сравнение основных полипептидов, полученных при переваривании рбб и ФЛСу1 модифицированным трипсином подтвердило их схожесть. При этом полученные карты рбб и ФЛСу1 отличались от карт Мск (рис. 4). Таким образом, обнаруженный рбб является фрагментом ФЛСу1 и, возможно, продуктом ее естественного протеолиза. Ассоциация рбб с ЭФР-Р наталкивает на мысль о возможной конкуренции между ФЛСу! и рбб за места связывания с ЭФР-Р. Учитывая важность ФЛСу1 в процессе передачи митогенного сигнала от рецепторов РФ можно предполагать, что такая конкуренция может быть одной из причин, по которым в клетках А431 ЭФР не вызывает индукцию синтеза ДНК..

Определение ЭФР рецепторов и способности ЭФР индуцировать синтез ДНК в клетках мышиной гепатомы линии МГ22.

Клетки мышиной гепатомы , как и А431, являются ьысокотрансформированной клеточной линией, полученной в Институте цитологии в 1951 году.

Наличие ЭФР-Р в этих клетках было определено методом иммунопреципитации и иммуноблота с использованием различных антител к рецептору ЗФР. На рис.5 представлен имм\т>облот ЭФР-Р клеток А431 и М1"22, выявленного мо; жлональными антиЭФР-Р антителами МаЫ08. Количественная оценка сайтов связывания ЭФР проводилась методом равновесного связывания '~51-ЭФР с клетками. В результате исследования было обнаружено, что - на плазматической мембране клегок содержится 8,8 пкМ рецепторов на 10'' клеток.

что составляет 5,3x1с4 ЭФР-Р на клетку (рис.б). Так хе было установлено, что рецепторы ЭФР разделяются по сродству к ЭФР на два типа, согласно модели, предложсной Соябом с соавторами - на высокоаффинные и низкоаффинные. Клетки МГ22 имеют 1,1х104 высокоаффннпых и 4,2х104 низкоаффинных рецепторов на клетку . Таким образом, общее количество ЭФР-Р в клеках МС22 примерно в 30 раз меньше, чем в А 431. При этом доля высокоаффинных сайтов связывания ЭФР составляет 1/5 часть от обшего числа рецепторов, что выше, чем во МН01ИХ других клетках.

Была проверена способность ЭФР влиять на синтез ДНК в клетках мышиной гепатомы. Оказалось, что добавление ЭФР г. клетка»/ не индуцирует синтез ДНК, более того, в присутствии ЭФР в течение ¡8-24 часов в культуралыгой среде уровень синтеза ДНК этой клеточной линии не привышал 70-100 % относительно контрольных, необработанных ЭФР клеток (рис. 11). Таким образом, несмотря на содержание ЭФР-Р, близкое к таковому для нормальных клеток, клетки МГ22 не отвечают индукцией синтеза ДНК на действие ЭФР, как и клетки А431.

Выявление ассоциации ФЛСу! и ЭФР-Р в клетках МГ22.

Было предположено, что в клетках МГ22, как и в клетках А431, отсутствие реализации митогкнного сигнала от ЭФР может быть связано с нарушениями подмембранного этапа проведения митогенного сигнала. В частности .ожидалось, что, как и в клетках А431, антителами на ФЛСу1 будет выявляться рбб, ассоциированный с ЭФР-Р.

1 2

¡ФГ-Г-

рбб-

Рис. 5. Иммуноблот анализ ЭФР-Р в клетках А431 (1) и МГ 22 (2).

Рис. 7. Иммунонреципитаиня и иммуноблот ФЛСу1 в клетках МГ 22 (1) и А431 (2).

Рис. 6. Скэтчард-анализ связывания Ч-ЭФР с клетками мышиной гепатомы МГ 22 в течение 3 часов при О С.

Дня проверки этого предположения была проведена иммунопреципитация и иммуноблот ФЛСу1 из лизатов клеток МГ22. При достаточно большом количестве выявляемой таким способом ФЛСу1, рбб нами обнаружен не был (рис. 7). Для выявления ассоциации ЭФР-Р и ФЛСу1 использовались антиЭФР-Р антитела Mab 108 и антитела на С-концевой я на SH2-SH2-SH3 участки ФЛСу1.

Иммунопреципиташи ЭФР-Р с дальнейшим выявлением ФЛСу1 обработанных ЭФР (200нг/мл) клеток продемонстрировала ассоциацию рецептора с ферментом. При этом максимальное взаимодействие наблюдалось через 2-5 минут после обрабо1*и жлегок ЭФР (рис. 8). Обнаружение фэсфорилпрования белков с использованием энтитс.1 к фосфэтирозину выявило, что ФЛСу1 максимально фосфорилярована в те же первые 2-5 минут.

Т«яже показано, что при действии ЭФР с ФЛСу1 ко-иммунопрсципчтируют белки с молекулярной массой 70 и 110 к Да, выявляемые антителами к фосфотирозиьу (рис. 9).

0 2 5 10 15

«л—í

0 2 5 10 15

pilo-»

«

* 1 .

•»< Wt >4 *

М/ : -

iMyJteiöisJ'

Рис. 8. Ассоциация ФЛСу! с ЭФР-Р после стимуляции клеток МГ 22 через различные промежутки времени (в минутах). ЭФР Р был преципитировап моноклонглыыми антителами Mab 108. ФЛСу! выявлялась моноклональными акмтеламн.

Рис. 9. Ко-и.чмунопреципиггцкя фосфорили!юванных по тирозину ФЛСу! и других белкоз клеток МГ 22 через различные промежутки времени (в минутах). Иммуноблот с антителами к фосфотирознну.

Белок с молекулярной массой 110 кДа выявлялся при преципитации ФЛСу! антителами к 8Н2-8Н2-5НЗ участку, но не был обнаружен антитепами к фосфотнрозину при преципитации ФЛСу1 моноспецифическими антителами к С-концевому участку. Это может быть объяснено тем, что р110 содержит ЭН2 и/или 8НЗ участки. Подобное предположение подтверждается данными полученными группой Яша, что в цитоскелетной фракции ЭФР-обработанных гепатоцитов бьш обнаружен белок такого же молекулярного веса ко-иммунопрсципитирующий с ФЛСу1. Роль этого белка в отношении ФЛСу1 остается невыясненной и может быть предметом дальнейших исследований регуляции фосфолипазы и ЭФР-шщуцированных белок-белковых взаимодействий. Фосфоршшрующийся при действии ЭФР белок р70 так же остается пока не охарактеризованным.

Опредслсни«* ЭФР рецепторов и способности ЭФР индуцировать синтез ДНК в первичных гепатоцнтах мыши.

Количественное определение сайтов связывания ЭФР на клетках первичных гепатовдто» было проведено но ране: описанной методике. Оказалось, что количество и аффинность ЭФР-Р у первичных гепатоцитов мыши и у клеток мышиной гепатомы схожи (рис. 10) и составляют 1хЮ4 высокоаффинных и 4,7x104 низкоаффинных рецепторов ЭФР.

При действии ЭФР (10иг/мл) на первичнче гепатоциты происходила индукция синтеза ДНК. Присутствие ЭФР в течение 18-22 часов в культуральной среде увеличивало уровень синтеза ДНК до 250% относительно контрольных, необработанных ЭФР клеток (рис. 11).

125

Рнс. 10. Скэтчард-анализ связывания 1-ЭФР клетками первичных гепатоцитор мыши в течение 3 часов при С С.

225-

й 200 ■ е; о о.

я 175-

о и

750 Н

л

§ 125-

I

Е 100-

а4 2

75-

50-

25-

Т

Т

5 10 15 20 25 30 35

Время инкубации с ЭФР (Юнг/мл) (час).

4С

Рис. 11. Синтез ДНК в клетках М122 и первичных гепатоцитах мыши.

А МГ22

• первичные гепатоциты мыши

г

1 2 3 4 5 6

вне-*-р'|о—>.

Л

« В

£ * 11 И)'

Ш',. Г* «у-*

5 10 15 5 10 15 (мин.)

Рис. 12. Фосфорилирование по тирозину ФЛОу) ч ко-иммунопреципитирующих с ней белков в различные промежутки времени (в минутах) после стимуляции клеток ЭФР. 1-3-кльтки МГ 22, 4-6 - первичные гепатоцг ы мыши.

Ассоциация ФЛСу1 и ЭФР-Р в первичных гепатоцитах мыши. Методом иммукопреципитации и иммуноблота была продемонстрирована ассоциация ФПСу! и ЭФР-Р в первичных шпагонитах. При этом ФЛСу! бьиа максимально фосфорилирована по тирозину в первые 2 минуты обработки клеток ЭФР (200нг/мл), как это было показано и дня клеток мышиной гепаюмы. Но в отличие от них, белок с молекулярной массой 110 кДз не выявлялся антителами на фосфслирозин (рис. 12). Тем не менее гпри иммуног.реципитацин ФЛСу1 антителами к 3112-3112-8113 участку этот белок обнаруживался этими гнтгп 1амн.

Выводы.

1. Фосфолшша Су1 обнаруживается во многих тканях и клеточных линиях. Такое ее широкое распространение может свидетельствовать об универсальности функций, выполняемых этим ферменгом. Учитывая широкое распространение ЭФР-Р, можно предполагать наличие устойчивых механизмов, связывающих ЭФР-Р и ФЛСу1.

2. Обнаружение в клетках карциномы человека линии А431 белка. рбб, являющегося частью ФЛО/1, ассоциирующегося с ЭФР-Р, предполагает возможную конкуренцию между рбб и ФЛСу1, что может являться одним из нарушений проведения митогенного сигнала от ЭФР, выражающегося в отсутствии индукции синтеза ДНК ростовым фактором.

3. В отличие от клеток линии А431, высокотрансформированные клетки мышиной гепатомы МГ22 содержат на плазматической мембране в 30 раз меньшее количество ЭФР-Р, что к клетки первичных гепатоцитов. Независимо от меньшег числа сайтов связывания ЭФР, ростовой фактор не индуцирует синтез ДНК в клетках МГ22.

4. В клетках МГ22 обнаружено ЭФР-завчсимое фосфорилирование ФЛСу1 рецептором ЭФР. Динамика фосфорилирования и ассоциации фермента в клетках МГ22 соответствует динамике, обнаруженной на червячных гемтоцитах.

5. В отличие от клеток А431, методом иммунопрсципитации ЭФР-Р и ФЛСу1 в клетках МГ22 не выявлен белок рбб. Однако обнаруживаются белки р70 и р110, ко-иммунопреципитирующие с ФЛСу1 и фосфорк фующиеся по тирозину при действии ЭФР. Учитывая возможное наличие вН-доменов в этих белках, предполагается их участие в регуляции активности и/или взаимодействий ФЛСу1.

6. Отсутствие ко-иммунопреципитирующего с ФЛСу1 фосфорилироватшого по тирозину после действия ЭФР р110 беяка в первичных гепатоцитах, отличает эти клетки от высокотраисформированных МГ22 в ФЛСу1-зависимом пути передачи митогенного сигнала от рецептора ЭФР.

7. Показана ЭФР-зааисимая ассоциация ФЛСу! с ЭФР-Р во всех исследованных типах клеток. Она, вероятно, является необходимым звеном в реализации митогенного эффекта ЭФР. Однако прелифератывный эффект ЭФР не является прямым следствием активации ФЛСу1 и регулируется на более поздних этапах прохождения митогенного сигнала.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Алексеев В.Ю., Благовещенская А.Д., Виноградова Н.А., Решетникова Г.Ф. —« Получение и очистка поликлональных антител к фосфолнназе Cyl.// Цитолотч,-1992, -т.34, - N9,-С. 73.

Alexeyev V.Yu., Medvcdeva N.D., Tsupkina N.V.. Nikolsky N.N., бб-kilodalton \f protein associated to epidermal growth factor receptor is a proteolytic fragment of PLCyl. // Cell Eiol. International, - 1994, - v. 18, - No 5, - p. 48(5.

Alexeyev V.Yu., Medvedeva N.D., Tsupkina N.V., Nikolsky N.N.. A 66-kilodalton protein associated with epidermal growth factor receptor is a proteolytic fragment of \f phosphoinositide-specific phosphlipase C. // FEBS Ldtters - 1994, - v. 356, - p. 299 301.

Н.Д. Медведева, В.Ю. Алексеев, Д.В. Шилов, H.B. Цупкина, H.H. Никольский Фосфолипаза Cyl и белок рбб в клеточных линиях с антипролиферативным ответом на действие ЭФР. // Доклады Академии Наук, - 1996, (в печати).

Алексеев В.Ю., Медведева Н.Д., Действие эпидермального фактора роста на клетки мышиной гепатомы лииии МГ 22. // Цитологии - 1996, (в печати).

Медведева Н.Д.. Алексеев В.Ю. Ассоциация белка рбб и рецептора ЭФР в клетках HER !4 и CD126. // Цитология - 1996, (в печати).

Отпечатано в типографии ПИЯФ Зак.266, тир. 100, уч.-изд. л. 1; 7/V-1996 г.