Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ассоциация фосфолипазы С y и рецептора эпидермального фактора роста (ЭФР) в клеточных линиях с различным ответом на ЭФР

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Ассоциация фосфолипазы С y и рецептора эпидермального фактора роста (ЭФР) в клеточных линиях с различным ответом на ЭФР"

На правах рукописи УДК 576.362:576.535.5

АЛЕКСЕЕВ Виталий Юрьевич

АССОЦИАЦИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ С у И РЕЦЕПТОРА

ЭПИДЕРМАЛЫЮГО ФАКТОРА РОСТА (ЭФР) В КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ С РАЗЛИЧНЫМ ОТВЕТОМ НА

ЭФР

03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕГЕРБУГГ 1996

Работа выполнена а Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург.

Научные руководители: доктор биологических наук, академик

H.H. Никольский, кандидат биологических наук

НД. Медведева,

Институт цитологии РАН,

С.-Петербург.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

И.М.Константинова,

Институт цитологии РАН,

С-Петербург; кандидат биологических наук MB. Филатов, Петербургский институт ядерной физики,

С-Петербург, Гатчина.

Ведущее учреждение: Институт эволюционной физиологии и биохимии

им. Сеченова, С-Пегербург.

Защита состоится " 14 " июня 1996 года в 13 ч.

на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института

цитологии РАН по адресу:

Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института цитологии РАН.

Реферат разослан " "_мая_1996 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

д.б.н. Л.Н.Писарсва

Актуальность прблемы.

В настоящее время в клеточной биологии большое внимание уделяется изучении! процессов, связаных с регуляцией репродукции клеток эукариот. Одним in них является действие ростовых факторов. Многие ростовые факторы (РФ), гормоны, нейротраисмиттеры, связываясь с соответствующими рецепторами на плазматической мембране клеток, активируют внутриклеточные реакции, приводящие клетки к синтезу ДНК и, в итоге, к их д ¡синю. Рецепторы РФ, в частности рецептор эпндермального фактора роста (ЭФР-Р), обладаю! протсинкииазной актявностью, специфичной по тирозину, то есть являются рецепторными тирозинкиназами (РТК). Связывание РФ с рецептором приводит к активации РТК, катализирующей фосфорилирование как самого рецептора, так и некоторых белков, участвующих во внутриклеточной передаче митогенного сигнала с поверхности клеток к ядру. Несмотря на огромное количество работ, посвященных изучению этих процессов, их механизмы к настоящему времени остаются предметом исследований.

Когда было обнаружено, что у большинства типов клеток одной из первичных реакций на связывание РФ с рецептором является увеличение уровня внутриклеточного инозитолтрифосфата (ИТФ), стимулирующего выход ионов Са'"' из внутриклеточных "хранилищ", и появление диацшнлицерола (ДА Г), физиологического активатора протеинкипазы С (ПКС) , особое внимание было уделено пиролизу инозитолфосфолипидов (И'1>), в результате которого и появляются ИТФ и ДАГ. Ферментом, катализирующим этот гидролиз оказалась фосфолипаза С. К настоящему времени известно 4 изоформы (типа) этого фермента : а, (3, 6 н у. Каждый тип включает в себя несколько подтипов, обозначаемых арабскими цифрами после греческих букв: ФЛСу1, ФЛСу2. Показано, что все ФЛС обладают двумя сходными каталитическими доменами, назваными X и Y К настоящему времени удалось установить два основных механизма активации этого фермента: бактериальные гоксинм, ашикии 1уанозинтрифосфата изменяют активность ФЛС через О-белки; ык же икщинк* ii ФЛС может изменяться при действии РФ i -тем прямой к<чвалентнон модификации фермента <}»осфорилирова!1ием. Продемонстрировано, что тирозиикиназный домен рецепторов, в частности ЭФР-репсп гора (10ФР-Р), необходим для инициации гидролиза ИФ. Известно, что именно ФГТОМ ,-п;,, , Г ц., к ассоциации с рецепторами РФ и, вер о» щи. амш<ир)Ч'<. »-л.. •< фосфорнлнровання но тирозину за счет акгивнчог !';К. Олнан> и..(ч фосфоршшрованием но тирозину и увеличение« способ», vm ■1>'1> , ! гидролизовать фосфат идилинозчтол фосфаш не их np -i i. к.>к Н" •<■ г ■ начале исследований в этой области. Фосфорилирог.-нш. i"'ii:::jiii:o;i vJoli у( ш vhro не приводило к увеличению се активности ; замстстк; опиши щ , .лЬ..« фосфорилирования .Y-783, в молекуле ФЛСу1 не приводило к тмерч'ш.. . , каталитической активности in vitro; (t го же время уктрессия пот (.м,.-., ,,vr ,|i ,

в ю.егках NIH ЗТЗ вела к полному блокированию ФРВТ-индуцированного пиролиза ИФ. В таких клеточных линиях как А431, NIH ЗТЗ, Rcf52 и др. О-белки не участвуют в активации ФЛСу1, однако на первичных гепатоцитах крысы показано, что во взаиме, ействии ФЛСу1 с ЭФР-Р кроме РТК принимает участие G-белок. Более того, Смит с соавторами (Smith et.al.,1994) показали способность ФЛСу1 независимо от ее липазной активности индуцировать синтез ДНК в клетках NIH3T3.

В отличие от других изозимов фос^юлипаза Су1( кроме каталитических X и Y доменов (содержит так называемые Src-гомалогичные последовательности (SH домены). SH2 домен обеспечивает связь белка с фосфотирозин (pY)-содержашими последовательностями других , белков, SH3 домен, предположительно, обеспечивает связь белков с актиновым цитоскелегом Обнаружение белков, имеющих подобные домены, не обладающих каталитическими активносгями (Nek, р85 субьединица фосфатидилинозитол-3 киназы, Drk, Sem5 ), но адаптирующих белок-белковые взаимодействия за счет этих структурных доменов,наводит на мысль о наличии подобной адаптерной функции и у ФЛСу.

Еще одним обстоятельством, придающим значимость рассматриваемой проблеме,является отсутствие какой либо информации о функции и участии в активации и/или в--регуляции ФЛСу ряда белков, ко-чммунопреципитирующих с этим ферментом.

Так же до сих пор остаются невыясненными ни вопрос о влиянии количества рецепторов РФ (ЭФР-Р), ни вопрос о различиях ФЛСу 1 -зависимых механизмов, запускаемых ростовыми факторами в нормальных - и трансформированных клетках.

Цели и задачи исследования.

Целые данной работы являлось изучение взаимодействия рецептора ЭФР и ФЛСу1, а также других белок-белковых взаимодействий, индуцированных ЭФР на клеточных линиях с различным ответом на действие ЭФР. В связи с этим задачи исследования определены следующим образом:

1. Выявить наличке ФЛСу! в различных тканях и клеточных линиях. Определить, существует лк взаимодействие между ФЛСу1 и ЭФР-Р.

2. Сравнить ассоциацию ФЛСу! и ЭФР-Р в «легочных линиях, где ЭФР индуцирует и не индуцирует синтез ДНК.

3. Сравнить фосфорилирование ФЛСу1 и других белков в нормальных и внеокотранеформировшшых клеточных линиях.

4. Исследоаат. ЭФР-шиуцировашую ассоциацию ФЛСу1 с другими белками в нормальных и пыеоко трансформированных клеточных линиях.

5. Определить влияние количества ЭФР-Р на активацию ФЛСу1.

Научная новизна полученных результатов.

Устаноатсно наличие и распределение ФЛСу I в тканях некоторых органов крысы и в некоторых клеточных линиях, таких как А431, МГ22, первичных гепэтоцитах мыши, первичных фибробластах человека. Покачано, что данный фермент присутствует в относительно большом количестве з гомогенатах мозга и печени крыс, в меньшей степени - в гомогенатах почек и легкого, практически отсутствует в гомогенатах селезенки и сердца. В кло.ках МГ22 и н первичных гепатоцитах ФЛСу1 присутствует в относительно большем и примерно равном количестве.

В клетках А431 обнаружена ассоциация ЭФР-Р и ФЛСу1 как до, так и после обработки клеток ЭФР. Это предполагает независимость ассоциации ФЛСу с ЭФР-Р от активирования РТК в этих клетках. •

Выявлен ранг не описанный белок с молекулярной массой бб кДа (рбб), способный к ассоциации с ЭФР-Р. Пептидное картирование рбб свидетельствует, что этот белок является фрагментом ФЛСу1, возможно продуктом ее естественного протеолиза. Предполагаются конкурентные отношения между ФЛСу1 и рбб за месга связывания с ЭФР-Р в клетках А<*31.

На клетках мышиной гепатомы определено количество и аффинность рецепторов ЭФР, показано ипгибирующее действие ЭФР на синтез ДНК. Продемонстрирована ЭФР зависимая ассоциация ЭФР-Р и ФЛСу1. Вопреки ожидаемому, в клетках МГ22 белок рбб, ассоциированный с ЭФР-Р и ко-иммунопреципитируюшпй с ФЛСу1, не был обнаружен. При этом выявлялись белки с молекулярными массами 70 и 110 кДа, ко-иммуноиреципнтирук'шие с ФЛСу1, фосфорилируюшиеся по тирозину при действии ЭФР.

На первичных гепатоцитах мыши определено количество ЭФР-Р, примерно равное количеству ЭФР-Р клеток мышиной гепатомы. Показано индуцирующее действие ЭФР на синтез ДНК. При ЭФР-мндупированнон ассоциации с ЭФР-Р и фосфорилироватш ФЛСу1 не обнаружен фосфорилнрованным по тироишу рПО. Отсутствие фосфорилированного рПО отличает первичные гсштоциты мьшш от клеток мышиной гепатомы.

Практическая ценность работы.

Сравнение клеток сходного происхождения (МГ22 и первичны.-, гепатоцитов) позволило выявить некоторые отличия в ФЛСу1-зависпмых биохимических путях, активизированных действием ЭФР, в нормальных и высокотрансформировшшых клетках.

Применение антител, выработанных на ЯН-содержаншй участок ФЛО/1, позволяет нммунопреципитировать другие ЬН-содсржапих белки и выявлять их взаимодействия и ЭФР-зависимос фосфорилирование при помонш антнтел к рУ.

Совмещение протеолитического расщепления белков с пептидным картированием в процессе элсктрбфорсза втрое сокращает время нр<>пс.чс...<я

стандартной процедуры, позволяет использовать для создания пептидных карт небольшие количества белков и протеаз, заметно уменьшает неснецифическую деградацию белков.

Апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Материалы диссертации были представлены на 4-о*< Европейском конгрессе по клеточной биологии (ПрзгаЛехословакия, 1954), докладывались на Российских конференциях н научных семинарах лаборатории физиологии клеточного цикла Института цитологии РАН.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов экспериментов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего //<? публикаций. Работа изложена на /18 страницах машинописного текста и иллюстрирована /У рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Материалы и методы исследования.

Клеточные линии и их культивирование.

В работе использорали метки эпидермальаой карциномы человека линии А431, клетки мышиной гепатомы линии МГ22. первичные фибробласты человека полученные из Банка клеточных культур (Институт цитологии РАН), первичные генатоциты мыши, полученные г.оллагеиазным расщеплением перфузированной пече!-'. взрослых самцов мышей по методу Л. Янга (Yang et.al., TBC, 1991, 266, 22451-22458). Клетки А431 и МГ22 высевали на пластиковые чашки Петри (NunV) в среде ДМЕМ с 10 % сыворотки крупного рогатого скота. Первичные генатоциты выращивали в таких же чашках Петри в среде ДМЕМ:Р12 (1:1) с добавлением 10 % сыворотки крови плодов коров (Sigma) и 5 мкг/мл инсулина. Первичные фибробласты выращивали в среде ДМЕМ, содержащей 15 % сыворотки крови плодов коров (Sigma). Для опытов все клеточные линии высевали на 50 либо 100 мм чашки Петри с плотностью 25-40 тыс.клеток/см2 . В опыт брали монослойные культуры. Для анализа синтеза ДНК использовали клеточные культуры, достигшие 70-80% от монослоя.

Получение иодированных лигандов.

Иодирование ЭФР проводили с использованием йодогена и 125I-Na (Wiley, Cunnigham, 1982).

Равновесное связывание Ш1-ЭФР.

Клетки МГ22 и первичные генатоциты выращивали яо 80-90 % монослоя в 24-луночных платах (Flow) при 37°С в среде ДМЕМ:Р12, содержащей 10 % сыворотки крови плодов коров в атмосфере с 0,5 % СО;. Все эксперименты по связыванию проводились на льду. Специфическая активность ,;51-ЭФР составляла от 200000 до 400000 ерш на 1нг ЭФР. Клетки инкубировали в среде ДМЕМ, содержащей 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 25 мМ HEPHS, рН7,4 с различными концентрациями 1251-ЭФР (от 0,5 до 200 нг / мл.) После трехчасовой инкубации клетки промывали 3 раза средой, не содержащей лиганда, после чего лизировали 1М раствором NaOH и определяли связанную с клетками радиоактивность на у-счетчикс (Bcckman). Неспецифическое связывание определили добавп шем 300-краткого избытка немечепного ЭФР к клеткам, которое не превышало 0,5%. Определение специфического связывания ЭФР и подсчет количества и аффинности сайтов связывания проводили согласно программе LIGAND .

Определение синтеза ДНК.

Клетки зыращивали до 70-80% от монослоя в 24 луночных платах. ЭФР был получен в Лаборатории физиологии клеточного цикла из подчелюстных слюнных желез мышей самцов (Соркин А.Б. и ¿г.,1989).ЭФР (Юнг/мл) добавляли в кондиционированную среду на разные сроки от 4 до 36 часов. Синтез ДНК определяли введением в культуральную среду метки ("С-тимидина) на 1 час при 37°С. После промывок клетки лизировали 0,4 М NaOH и определяли процент включения меченного предшественника методом сцинтилляциошюй спектроскопии на счетчике Beckman LS 8100 .

Антитела.

В работе использовали поликлональные моноспецифические антитела, выработанные к С-концевом" пептиду ФЛСу1, любезно предостаь/.енные нам проф. Г. Карпентером (США), описанные ранее (Artcga et.al. 1992). Антгела на SH2-SH2-SH3 - содержащий домен ФЛСу1 получены п Лаборатории физиологии клеточного цикла (Алексеев и др., 1993). При получении антител использовался БШ-ЗШ-ЗШ-глюгатион-З-трансфераза гибридный белок, экспрессируемый в E.coli. Штамм E.coli. трансфецировашшй нлазмидой pGex 3, содержащей кДНК этого белка, любезно предоставлен проф. Дж.Шлео-ннджсром (США). В ряде экспериментов использовали моноклональные антитела к ФЛСу1 (State Biotechnology). Моноклональные антитела к ЭФР-Р Mab-108 любезно предоставлены проф. Дж.Шлессинджером (США). Антитела к фосфотрозиму были получены в Лаборатории физиологии клеточного цикла .

Опр. еленне распределения ФЛСу1 в органах крысы-Дня экспериментов брали взрослых самцов крыс (150-200г.) линии \УЬ<агс1. Сразу после дскапнтацни органы замораживала а жидком азоте. Образцы весом 5г. гомогенизировали в 35 мл. холодного буфера, содержащего ЮмМ Тпв-НСЬ рН 7,4, 1мМ ЕДТА, 1мМ РМБР, 5мкг/мл леупептина, 5 мкг/мл апротинина. Гомогенаты цагтрифугировали 1000 g 12 мин. Супернатант отбирали и центрифугировали при 2700Э у в течение часа. К очищенным таким образом гомогенатам добавляли антитела к ФЛСу1, белок А-ссфарозу и проводили иммуиопреципитацию при +4°С в течение 3 часов. После электрофоретического разделения иммунопреципитатов и переноса белков на нитроцеллюлозу выявляли ФЛСу1 Всстер!. Гшот анализом.

Выявление специфической ассоциации ЭФР-Р и ФЛСу1.

Клетки выращивали в 100 мм чашках Петри до монослоя. Перед введением ЭФР клетки инкубировали в среде ДМЕМ, содержащей 0,1% БСА и 200 мМ HEPES, pH 7,4 в течение 15 мин., после чего ЭФР (200(г/мл) в той же среде добавляли к клеткам на различные промежутки времени при 37сС. После 3 промывок фосфатно-ссшевым буфером (ФСБ) клетки лизировачи на лвду буфером, содержащим 1% NP-40, 50мМ Tris-HCl, 0,1% БСА, 5мМ ЕДТА, 10 мкг/мл леупептина, 10 мкг/мл апротинина, 3 мМ PMSF. После лизиса и центрифугирования (Змии. 9000 g) в лизаты добавляли моноклональные антитела к рецептору ЭФР - МаЫ08, белок А-сефароза и козьи антитела, выработанные против иммуноглобулиг -»в мыши. Иммуиопреципитацию ЭФР-Р проводили в течение 2 часов при +4°С. Иммуиопреципитацию ФЛС/1 проводили либо поликлональнымн антителами на 8Н2-8Н2-&НЗ-содержздий участок ФЛСу1, либо моноспецифичеекими антителами, выработанными на С-коицевой пептид ФЛСу) в течение 3 часов при +4°С. После влектрофоретического разделения и переноса иммунопреципитировавших белков на нитроцеллкшезу выявлялась ФЛСу! антителами, выработанными на различные участки фермента. В качестве системы выявления комплекса антиген-антитело использовали коньюгаты козьих антител, выработанных против иммуноглобулинов кролика, с щелочной фосфатазой.

Определение фосфорилирования белков по тирозину.

Обработанные и необработанные ЭФР клегки (как это описано ранее) после 3 промывок ФСБ лидировали холодным буфером, содержащим 20кМ KEPES, рН7,3, 50мМ I iF. 10 об.% глицерина, 1% тритона Х-100, 1мМ Na3VO,, 2,5мм г.итрофснилфосфэта, 1мМ PMSF. После центрифугирования 9000 g 10 мин. к супернагантам добавляли антитела либо к ЭФР-Р, либо к ФЛСу1. После нммунопрешшиганни, электрофореза и переноса белков на нитроцеллюлозу

белки, содержащие фосфотирозин выявляли лопиклоиальпыми или моноклоналыпши антителами к фосфотнрозину.

Протеолмггическое расщепление и пептидное картирование. После иммунопреципитации ФЛСу! из лизатов клеток А431 и алектрофоретического разделения белков акриламидкый гель окрашивали Cumassie blue G 250 по стандартной методике. Белковые полосы, соответствующие 145кДа, ббкДа ri 47кДа,вырезали из геля, открашивали в 7% уксусной кислоте при интенсивном перемешивании. Кусочки геля подравнивали под размер и помещали в "карманы" 15% полиахриламидного SDS-геля. Пространство вокруг кусочка заполняли 5-7мкл буфера, содержащего 125мМ Tris-НС1, рН 6,8, 0,1% SDS, 3% Р-меркаптоэтанола, 20% глицерина. Протеазу (модифицированный трипсин, Sigma) разводили в буфере, содержащем 125мМ Tris-HCl, рН 6,8, 0,1% SDS, 10% глицерина так, чтобы соотношение белокшротеаза было 1:200 или 1:100. После нанесения разведенной протеазы (не более 5 мхл) в "карман" начинали электрофорез при напряжении 100В в течение 15-20 минут. Далее электрофорез выключали на 15-30 минут, после чего продукты протеолнза разделяли при напряжении 200 В. Окрашивание геля серебром проводили по стандартной методике.

Результаты исследования.

Обнаружение ФЛСу1 в органах крысы и в некоторых клеточных линиях. Гомогснаты сердца, почек, легкою, селезенки, мозга и печени крысы приготавливали, как описано в материалах и методах. Иммунопреципнтация и иммукоблот анализ ФЛСу1 продемонстрировали наличие значительною количества этого фермента в гомогенатах мозга и печени. В легком ФЛСу! выявлялась в несколько меньшем количестве. В гомогенатах почек и селезенки фермент практически не детектировался, а в сердце ФЛСу1 таким методом не обнаруживалась (рис.1). Такт клеточные линии, как А431, МГ22, HBR14, HcLa, К562, а также первичные человеческие фибробласты и первичные гепатоциты мыши были проверены на наличие ФЛСу! методом иммупопрешпштанин и иммуноблота. Выяснилось, что фермент имеется во всех исследованных клаках. Относительно большое количество ¡жрмента обнаруживалось в клетках МГ22 и первичных гепатецитах, меньшее его количество выявлялось в клетках К562 и HeLa, и еще меньшее - в А431 и в HER14.

.12 3 4 5

Рис. 1. Содержание ФЛСу1 в гомогенатах некоторых органов крысы. Выявление ФДС/1 иммунопреципитацией и иммунобяотом с антиФЛСу1 антителами. 1-сердце, 2-селсзснка, 3-легкое, 4-мозг, 5-псчень, б-почки.

Ассоциация ФЛСу! и ЭФР-рецептора в клетках А431.

Известно, что ФЛСу1 способна ассоциироваться с рецепторами ростовых факторов. Ранее была продемонстрирована' ко-иммунопрещтитация ЭФР-Р и ФЛСу1 с использованием различных антител к ФЛСу1. Также было показано, что некоторые моноклональные антитела к ФЛСу1 узнают другие, отличные от ФЛОу1, белки. Один из них с молекулярной массой 47кДа бьи описан как белок Nek, имеющий такие же последовательности, что и ФЛС.у1.

В наших экспериментах ЭФР-Р бьи иммунопреципитироьан из лизатов клеток А431, как описано в материалах и методах. Всстерн-блот анализ с использованием антиФЛСу! антител показал, что в необработанных ЭФР клетках А431 полоса с молекулярной массой 145 кДа, соответствующая ФЛСу1, выявлялась зместе с белками, молекулярная масса которых СО и бб кДа (рис 2). Такая хо-иммуно/.'репипитацкя выявлялась, как с исгсользовлпием поликлональных и моноклональных антитш к ЭФР-Р, так и с использованием двух типов шггитея к ФЛСу1, Подобная ассоциация может быть объяснена тем, что ЭФР-Р независимо от активации рецепторной тирозинкиназы способен связываться с ФЛСуЬ

Рис. 2. Ко-иммунопреципитация ФЛСу1 и ЭФР-Р. Клегки А431 были лизированы до (I) и после (2) обработки ЭФР (Шнг/мл). После преципитации ЭФР-Р белки выявлялись антиФЛСу! антителами.

Рис. 3. Вестерн-блот анализ ФЛСу1. Клетки А431 были лизированы до (1) и после (2) обработки ЭФР и ко-иммунопрецшштирующие с не.) белки выявлялись антнФЛСу1 антителами.

Для определения специфичности связывания рбО и рбб антиФЛС>'1 антителами бьиа проведена имм)1<опрештитация ФЛСу! и лизатов обработанных и необработанных ЭФР клеток А431 (рис 3). Вестерн-блот анализ с антителами к С-концевому пептиду ФЛСу] чродемоистрировал специфичность взаимодействия антиФЛСу 1 антител с рбб. Ранее было показано, что белок с молекулярной массой 64 кДа ко-иммунепреципитирует с ФРВТ рецептором в ФРВТ обработанных и покоящихся РАЕ клетхах . Белки со сходными молекулярными массами обнаруживались различны» ч антителами к ФЛСу1 на различных клеточных линиях . Такое обнаружение возможно в случае, если белок либо непосредственно взаимодействует, либо ¡юдственен ФЛСу1,

к Да 1

45—

292014-

V

и

и

[I

Рис, 4. Пептидные карты №к (1), рбб (2) к ФЛСу! (3).

Для проверки, является ли рбб родственным ФЛСу1 белком, нами было проведено пептидное картирование этих белков. Сравнение основных полипептидов, полученных при переваривании рбб и ФЛСу1 модифицированным трипсином подтвердило их схожесть. При этом полученные карты рбб и ФЛСу1 отличались от карт Кск (рис. 4). Таким образом, обнаруженный рбб является фрагментом ФЛСу! и, чозможно, продуктом ее естественного протеолиза. Ассоциация рбб с ЭФР-Р наталкивает на мысл', о возможной конкуренции между ФЛСу1 и рбб за места связывания с ЭФ1?-Р. Учитывая важность ФЛСу! в процессе передачи митогенного сигнала от рецепторов РФ можно предполагать, что такая конкуренция может быть одной из причин, по которым в клетках А431 ЭФР не вызывает индукцию синтеза ДНК.

Определение ЭФР рецепторов и способности ЭФР индуцировать синтез ДНК в клетках мышиной гепатомы линии МГ22.

Клетки мышиной гепатомы , как и А431, являются ьысокотрансформированной клеточной линией, полученной в Институте цитологии в 1951 году.

Наличие ЭФР-Р в этих клетках было определено методом иммунопреципитации и имиун облога с использованием различных антител к рецептору ЭФР. На рис.5 представлен иммчноблот ЭФР-Р клеток А431 и М1"22, выявленного мо; -»тональными антиЭФР-Р антителами МаЫ08. Количественная оценка сайтов связывания ЭФР проводилась методом равновесного связывания '"'1-ЭФР с клетками. В результате исследования было обнаружено, что - на плазматической мембране клеток содержится 8,8 пкМ рецепторов на 10"* клеток,

что составляет 5,3* 104 ЭФР-Р на клетку (рис.6). Так же было установлено, что рецепторы ЭФР разделяются по сродству к ЭФР на два типа, согласно модели, предложеной Соябом с соавторами - на высокоаффинные и низкоаффинные. Клетки МГ22 имеют 1,1хЮ4 высокоаффшшых и 4,?х104 низкоаффинных рецепторов на клетку . Таким образом, общее количество ЭФР-Р в клеках МГ22 примерно в 30 раз меньше, чем в А431. При этом доля высокоаффшшых сайтов связывания ЭФР составляет 3/5 часть от обшего числа рецепторов, что выше, чем во мно1их других клгт*ах.

Быяа проверена способность ЗФР влиять на синтез ДНК в клетках мышиной гепатомы. Оказалось, что добавление ЭФР с клеткам не индуцирует синтез ДНК, более того, в присутствии ЭФР в течение 18-24 часов в хультуралыюй среде уровень синтеза ДНК этой клеточной линии не привышал 70-100 % относительно кош-рольных, необработанных ЭФР клеток (рис. И). Таким образом, несмотря на содержание ЭФР-Р, близкое к таковому для нормальных клеток, клетки МГ22 не отвечают индукцией синтеза ДНК на действие ЗФР, как и клетки А431.

Выявление ассоциации ФЛОу! п ЭФР-Р в клетках МГ22.

Было предположено, что в клетках МГ22, как и в клетках А431, отсутствие реализации митогмшого сигнала от ЭФР может быть связано с нарушениями нодыембранного этапа проведения митогенного сишала. В частности,ожидалось, что,как и з клетках А431, антителами на ФЛСу1 будет выявляться рбб, ассоциированный с ЭФР-Р.

Рис. 5. Иммуноблот анализ ЭФР-Р в клетках А431 (1) и МГ 22 (2).

Рис. 7. Иммунонреципитацня и иммуноблот ФЛСу! в клетках МГ 22 (1) н А431 (2).

Рис. 6, Скэтчард-анализ связыванияП-ЭФР с клетками мышиной гепатомы МГ 22 в течение 3 часов при О С.

Для проверки этого предположения бьша проведена иммунопреципитация и иммуноблот ФЛСу 1 из лизатов клеток МГ22. При достаточно большом количестве выявляемой таким способом ФЛСу1, рбб нами обнаружен не был (рис. 7). Для выявления ассоциации ЭФР-Р и ФЛСу1 использовались антиЭФР-Р антитела Mab iÖ8 и антитела на С-концевой и на SH2-SH2-SH3 участки ФЛСу1.

Иммунопрсципиташи ЭФР-Р с дальнейшим выявлением ФЛСу1 обработанных ЭФР (200нг.'мл) клеток продемонстрировала ассоциацию редсптора с ферментом. При этом максимальное взаимодействие наблюдалось через 2-5 минут после обработки клеток ЭФР (рис. 8). Обнаружение фосфорилпрования белков с использованием злтитсЛ к фосфотирозину выявило, что ФЛСу! максимально фосфорилирована в те же первые 2-5 минут.

Та:' же показано, что при действии ЭФР с ФЛСу1 ко-иммуиопреципитируюг белки с молекулярной массой 70 и 110 к Да, выявляемые антителами к фосфотирозину (рис. 9).

0 2 5 10 15

¥

pllo-

2 5 10 15

О

Рис. 8. Ассоциация ФЛСу1 с ЭФР-Р после стимуляции клеток МГ 22 через различные промежутки времени (в минутах). ЭФР-Р был прешшитирзван моноклональными антителами Mab ¡08. ФЛСу! выявлялась монпхлональнммм a¡ ' делами.

Рис. 9. Ко-иммунопреципитация фосфорили(юваш1Ых по тирозину ФЛСу! и других белков клстох МГ 22 через различные промежутки времени (в минутах). Иммуноблот с антителами к фосфотирозину.

Белок с молекулярной массой 110 кДа выявлялся при преципитации ФЛСу! антителами к ЭШ-ЭШ-ЗЮ участку, но не был обнаружен антителами к фосфотирозину при преципитации ФЛСу1 моноспецифическими антитепами к С-концевому участку. Это может быть объяснено тем, что рИО содержит БН2 и/или ЗНЗ участки. Подобное предположение подтверждается данными полученными группой Ян га, что в цитоскелетной фракции ЭФР-обработанных гепатоцитов был обнаружен белок такого же молекулярного веса ко-иммунопрсципитирующий с ФЛСу!. Роль этого белка в отношении ФЛСу1 остается невыясненной и может быть предметом дальнейших исследований регуляции фосфолипазы и ЭФР-индуцированных белок-белковых взаимодействий. Фосфорилирующийся при действии ЭФР белок р70 так же остается пока не охарактеризованным.

Определение ЭФР рецепторов и способности ЭФР индуцировать синтез ДНК в первичных гепатоцитах мыши.

Количественное определение сайтов связывания ЭФР на клетках первичных гепатоцитов было проведено но ранее описанной методике. Оказалось, что количество и аффинность ЭФР-Р у первичных гепатоцитов мыши и у клеток мышиной гепатомы схожи (рис. 10) и составляют 1х104 высокоаффинных и 4,7x10* низкоаффинных рецепторов ЭФР.

При действии ЭФР (Юнг/мл) на первичиме гепатоциты происходила индукция синтеза ДНК. Присутствие ЭФР в течение 18-22 часов в культуральной среде увеличивало уровень синтеза ДНК до 250% относительно контрольных, необработанных ЭФР клеток (рис.11).

Рис. 10. Скэтчард-анализ связывания 1-ЭФР клетками первичных гепатоцито? мыши в течение 3 часов при С С.

250-1

225-

Ъ 200

I

S 175■

0 M

5 150 A

сЧ

1 125-

I

* foo-

I

£

75-

50-

25-

T

T

T

5 10 15 20 25 30 35 Время инкубации с ЭФР (Юнг/мл) (час).

40

Рис. 11. Синтез ДНК в клетках Ml 22 и первичных гепатоцитах мыши.

А МГ22

• первичные гепатоциты мыши

1 2 .3 4 3 6

5 10 15 5 10 15 (мин.)

Рис. 12. Фосфорилирование по тирозину ФЛСу! и ко-иммунопрецинитируюших с ней белков в различные промежутки времени (в минутах) после стимуляции клеток ЭФР,1-3-кл«ки МГ 22, 4-6 - первичные гепатощ ч мыши.

Ассоциация ФЛСу) и ЭФР-Р в первичных гепатоцтах мыши.

Методом иммунопрсцичитации ,1 иммуноблота была продемонстрирована ассоциация ФПСу1 и ЭФР-Р в первичных 1епатопитах. При этом ФЛСу1 была максимально фосфорилироьана по тирозину в первые 2 минуты обработки клеток ЭФР (200нг/ми), как это было показано и для клеток мышиной ютатомы. Но я отличие от них, белок с молекулярной массой 110 кДз не выявлялся антителами на фосфотирозин (рис. 12). Тем не менее,при иммуног.решшитацин ФЛСу1 антителами к ЗН2-ЗП2-5НЗ участку этот белок обнаруживался этьми лшп [ами.

Выводы.

1. Фосфолипаза Су1 обнаружипастся во многих тканях н клеточных линиях. Такое ее широкое распространение может свидетельствовать об универсальности функций, выполняемых этим ферментом- Учитывая широкое распространение ЭФР-Р, можно предполагать наличие устойчивых механизмов, связывающих ЭФР-Р и ФЛСу1.

2. Обнаружение в клетках карциномы человека линии А431 белка. рбб, являющегося частью ФЛС/1, ассоциирующегося с ЭФР-Р, предполагает возможную конкуренцию между рбб и ФЛС/1, что может являться одним из нарушений проведения митогенного сигнала аг ЭФР, выражающегося в отсутствии индукции синтеза ДНК ростовым фактором.

3. В отличие от клеток линии А431, высокотрансформироваппые клетки мышиной гепатомы МГ22 содержат на плазматической мембране в 30 раз меньшее количество ЭФР-Р, что и клетки первичных гепатоцитов. Независимо от меньшег числа сайтов связывания ЭФР, ростовой фактор не индуцирует синтез ДНК в клетках МГ22.

4. В клетках МГ22 обнаружено ЭФР-зависимос фосфорилирование ФЛСу1 рецептором ЭФР. Динамика фосфорилирования и ассоциации фермента в клетках МГ22 соответствует динамике, обнаруженной на первичных гспатоцитах.

5. В отличие от клеток А431, методом иммунопрсципитации ЭФР-Р и ФЛСу1 в клетках МГ22 не выявлен белок рбб. Однако обнаруживаются белки р70 и рПО, ко-иммунопреципитирующие с ФЛСу1 и фосфора (рующиеся по тирозину при действии ЭФР. Учитывая возможное наличие БН-домснов в этих белках, предполагается их участие в регуляции активности и/или взаимодействий ФЛСу1.

6. Отсутствие ко-иммунопреципитирующего с ФЛСу! фосфорилира важного по тирозину после действия ЭФР рПО белка в первичных гепатоцитах, отличает эти клетки от высокотрансформированных МГ22 в ФЛСу 1-зависимом пути передачи митогенного сигнала от рецептора ЭФР.

7. Показана ЭФР-зависимая ассоциация ФЛСу! с ЭФР-Р во всех исследованиых типах клеток. Она, вероятно, является необходимым звеном в реализации митогенного эффекта ЭФР. Однако пралиферативный эффект ЭФР не является прямым следствием активации ФЛСу1 и регулируется на более поздних этапах прохождения митогенного сигнала.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Алексеев В.Ю., Благовещенская А.Д., Виноградова Н.А., Решетникова Г.Ф. Получение и очистка поликлональных антител к фосфолипазе Су\Л Цитология,-1992, - т.34, - N 9, - С. 73.

Alexeyev V.Yu., Medvctleva N.D., Tsupkina N.V., Nikolsky N.N., бб-kilodalton protein associated to epidermal growth factor receptor is a proteolytic fragment of PLCyl. // Ceil Biol. International. - 1994, - v. 18. - No 5, - p. 486.

Alexeyev V.Yu., Medvedeva N.D., Tsupkina N.V., Nikolsky N.N., A 66-kilodalton protein associated with epidermal growth factor receptor is a proteolytic fragment of phosphoinositidc-specific phosphlipase C. // FEBS Lettters - 1994, - v. 356, - p. 299 301.

Н.Д. Медведева, В.Ю. Алексеев» Д.В. Шилов, H.B. Цупкина, Н.Н. Никольский Фосфолипаза Су1 и белок рбб в клеточных линиях с антипролиферативным ответом на действие ЭФР. // Доклады Академии Наук, - 1996, (в печати).

Алексеев В.Ю., Медведева Н.Д., Действие эпидермального фактора роста на клетки мышиной гепатомы линии МГ 22. // Цитологи* 1996, (в печати).

Медведева Н.Д., Алексеев В.Ю. Ассоциация белка рбб и рецептора ЭФР в клетках HER 14 и CD126. // Цитология - 1996, (в печати).

Отпечатано в типографии ПИЯФ Зак. 266, тир. 100, уч.-изд. л. 1; 7/V-1996 г.