Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЭФФЕКТЫ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ И ГИПЕРТЕРМИИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НА ОПУХОЛЕВЫЕ И НОРМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ И ТКАНИ ЖИВОТНЫХ

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "ЭФФЕКТЫ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ И ГИПЕРТЕРМИИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НА ОПУХОЛЕВЫЕ И НОРМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ И ТКАНИ ЖИВОТНЫХ"

всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной радиологии

На правах рукописи

ШТЕЙН Людмила Викторовна удк 616—(№6,04—№5.849.114—0s5.832.8-№2.9+616—00) .38/29

ЭФФЕКТЫ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ И ГИПЕРТЕРМИИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НА ОПУХОЛЕВЫЕ И НОРМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ И ТКАНИ животных

03.00,01 — радиобиология

Автореферат

диссертация на соискание ученой степени • кандидата биологических наук

Обнинск — 1984

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте медицинской радиологин АМН СССР.

Научный руководитель:

доктор биологических наук А. Г. Клтоплянников Официальные оппоненты:

доктор биологических наугс Вайксон А: А.: " '

кандидат биологических наук. ВасильевА^ В..

Ведущая организация— Научно*исследовательский институт онкологии и медицинской радиологии МЗ БССР.

Защита состоится 23 апреля 1984 г. в И часов на заседании специализированного Совета К 120.81.01 во Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии МСХ СССР-(249020, г. Обнинск, Калужской обл:, ВНИИСХР).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной радиологии..

Автореферат разослан марта 4й/1^? .

Ученый секретарь специализированного Совета,

кандидат биологических наук Н. И. Санжарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Ь настоящее время » качестве агента, значительно кзыеняюцего радиочувствительность, интенсивно изучается воздействие гипертермии. Кроме того, изучение действия гипертермии »ажио в плане повшения радиочувствительности злокачественных новообразования ( Александров H.H. и соавт., I960; Коно-плянников и соавт., 1983; Field, Bleehen, 1979). Это обусловлено ЦвЛЪЫ рядом эффектов гипертериического воздействия, которые могут значительно улучшить результаты лучевой терапии опухолей (Коноплян-ников А,Г., Отейн Л.В., 1977; Suit, t977t Hehn,1979). Метод терыо-лучевой терапии уже успешно применяется в некоторых онкорадиологй-ческкх клиниках кашей страна и за рубежом, однако дм его широкого внедрения в практику и разработки оптимальних схем лечения с максимальным терапевтическим выигрышем необходимо решить ряд вопросов, которое до настоящего времени изучены недостаточно'. К ним, в нерву» очередь, откосятся количественные закономерности повревдаицего и радиосексиб илиэируюцего действия Гипертермии на различные нормальные н опухолевые клетки, связь между наблодаемыми клеточными аффектами и динамикой роста опухоли, проявление эффекта при различных схемах фракционирования дози иониэярущей радиации tt гипертермии, & также оценка фактора терапевтического выигрыша цри той или иной схеме лечения. Подобные .сведения мокко подучить в строгих 'количественных опытах на различных перевиваемых опухолях и нормальных тканях животных. Это позволило определить тот ряд'актуальных задач, которые требовали експериментального решения и составили предмет настоящей диссертационной работы,

Нель работы состояла в сравнительном изучении повревдалщего и радиомодифицирухщего действия гипертермии на опухолевые и нормальна« клетки и ткани животных в условиях, когда возможна строгая количественная характеристика ¡эффекта нагревания и облучения.

* *

Основные задачи исследования заключались в следующем:

- изучении закономерностей радиосенсибилизирувдего и повреждавшего действия гипертермии на: а) различные нормальные и опухолевые

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. сегьскохоз. академии им. К. А. Тимирязева

Инв N2..

клетки животных; б) перевиваемые опухоли с различной споростью роста; в) нормальную ткань - кожу - при однократной шш фракционированном воздействии;

- изучении характера морфологических изменений в тканях'после воздействия радиации и гипертермии на экспериментальной модели резистентной опухоли - крысиной рабдомиосаргсоме Е-1;

- сопоставлении повреждающего эффекта гипертермии, создаваемой различными источниками {иммерсия в воде, СВЧ- и УВЧ-иэлучения) на клетки;

- оценке терапевтического выигрыша при сочетании воздействия гипертермии и облучения на перевиваемую опухоль животных.

Научная новизна. При выполнении настоящей работы получены новые данные о термочувствительное™ стволовых клеток гемолозгическоЯ системы и клеток перевиваемых опухолей млекошетащих. Обнаружено, что у мысеЯ клетки перевиваемого лейкоза примерно в 5 раз термочувствительное стволовых кроветворных клеток.

Установлено, что гипертермия является радиосенсибилизатором, в то время как облучение не сенсибилизирует клетки к последующему нагревания. С повышением дозы облучения аффект гипертермической радиосенсибилиэацки возрастает.

Редкомодифицирупцее действие гипертертк в значительно большей степени проявляется в отношении медленно растущей радиореэистентной опухоли В-1, чем для быстрорастущей радиочувствительной саркош Т-1; это свидетельствует о перспективности применения гипертермического воздействия для преодоления радиорезистентности медленно пролифери-рущих опухолевых клеток.

Морфологический анализ опухоли К-1 показал, что доя действия гипертермии характерна значительная вариабельность степени повреяде-кия соседних участков опухоли до сравнению с эффектом облучения, что связано с неравномерным отводом тепла из нагреваемой опухоли.

Ори однократном или фракционированном воздействии гипертермии и облучения на кожу крью наблюдается тот же характер зависимости эффекта от числа фракций и продолжительности облучения, что и при воздействии только облучения.

Установлено, что при лечении крыс с саркомой-45 включение в курс лучевой терапии дополнительного гипертермического воздействия дает терапевтический выигрыш - усиление равное 2,2 для опухоли по сраа-ненжю с 1,4 для кожи, с оценкой величин» ФТВ (фактора терапевтического выигрыша) равного 1,6.

- з -

Лтктическ&я анячюгостъ работа и предложения яр нспадьзовахкю полученных результатов. Проведенные исследования дают экспериментальное обоснование Дія оценки ожидаемого редиомодифицируоцег» и поврекдахщего аффекта гипертермия на портальные и опухолевые ткани. Эти данные могут быть использованы при разработке оптимальных схем терюрадиотер&пии в кяитгоесхой практике«

Важным для клинического применения является вывод о «ом, что плакирование и оценка аффекта фракционированного воздействия тернолуче-воЯ терапии могут бскь проведены на основе широко используемой лучевыми терапевтами концепции "номинальной стандартной дозы".

.Феномен большей терморезистентности КОЕ-С оо сравнении с опухолевым клетками лейкозаХа в будущем, возможно, удастся применить для освобождения от опухолевых клеток костного мозг» больных лейко-аами, используемого дня аутотршспяантацни;

Денные по сравнении повреждающего действия гипертермии, созданное различными источниками нагревания (воздействие СВЧ- к УВЧ-излучения, нагревание водой), позволяет прийти к важному для практика выводу о том, что во всех случаях определяющими являются температура и продолжительность нагревания.

Данные диссертационной работы используются при разработке Всесоюзной межведомственной программы "ііоднфшсатор" ж могут быть внедрены в практику таких учреждений как Всесоюзный онтологический центр АШ СССР, НИИ онкологий' и медицинской радиологи» КЗ БССР и других учреждений, эанкмащтася'разработкой методов термолучевой терашиг

опухолей. ■ _

Кроме того« в ряде подразделений ШИ медицинской радиологии АШ СССР применяется предложенное автором устройство для измерения температур» (рационализаторское предложение 9 047 or 18.02.SO Г.).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на Г49 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, трёх глав собственных исследований , обсуждения результатов, выводов и.указателя литератур«*. В библиографии содержится список ЗЗ-гработ отечественных и 179 публикаций з&добежжее авторов. Работу иллюстрирую £4 рисунка и II таблиц.

Аттообавдя работы. Цатериалы диссертации доложены Hat I. X Всесоюзном съезде рентгенологов и радиологов (Ереван, 1977). 2. Всесоюзном симпозиуме по радиобиологическим основам лучевой терапии г.лл (Ленинград, I960). 3. ХІ-Й научной конференции молодых учёных и с«е-циахнетов ШИМР ЛДО СССР (Обнинск, I9QI). 4, Всесоюзной конференции по радиомодификации в лучевой терапии опухолей (Обнинск, І9Й2).

Диссертационная работа апробирована на научной конференции экспериментального сектора Научно-исследовательского института медицинской радиологии Ш СССР 30 коня 1083 года и 17 февраля 1964 года на научной конференции отдела животноводства во Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии.

мшхиш и методы иссдедовАниа

В качестве моделей дм изучения эффектов ионизирующей радиации и гипертермии на клеточном уровне были выбраны клетки лейкоза La, перевиваемые на шпак линии С57/ВС6, клетки асцнтной.кадоинош Эр-лиха (АКЭ), поддерживаемой на белых нелинейных ышах, к стволовые кроветвортае клетки костного мозга мышей-гибридов î^oçT/bIicei) .

Исследования реакции тканей la viro быт выполнены на коке и не- -ревквных опухолях T-I» 8-1 и саркоме-45, пассируемых соответственно на крысах линия "Август"■ "Was " и "Бистар'.-Веего а опытах ислоль-8 о вел о 3000 ыытеЯ к крыс. Животных содержали на стандартном рационе в обычных условник лабораторного виварии.

На 6-е сутки после перевивки у донора лейхозных клеток в стерильных условиях извлекали селезёнку к на физиологическом растворе готовили суспензию! содержащую 5*10° клеток/мл. 0,2 мл этой суспензии перевивали мышам внутрибргахнно. Выживаемость ( S) клеток после различных воздействий оценивали ка основании удлинения срока жизни (at) опытных животных по сравнению с контрольная». На хажду» экспериментальную точку брейм по 4-5 мышей, опыты повторяли 3-4 раза. Установлено (А. Г.Коногшпмкков, 1975), что le 3» ££ , максимальная

2,2

ошибка в оценке 1&3 не превышает

Штамм акэ поддерживали еженедельными*вцутрибровкнныыи перевивками 0,2 мл асшгтической жидкости (~3*107клеток>. Дм опытов асцит брали через 6-7 суток после перевивки, в стационарный период роста опухоли, разводя его физиологическим растворам до концентрации 5*10® кл/кл, и после необходимее воздействий вводили по 0,2 tu вну-' трибргаинно интактнш мышам. Для получения солидного варианта суспензию, содержащую I07 кя/ия, вводили по 0,1 см** под кощу бедра* Действие нагревания и облучения на клетки акэ оценивали по следующим критериям: а) подсчитывая при наблюдении в фазовоконтрастном микроскопе сразу после воздействия долю клеток с локальными нарушениями клеточной мембраны; б) трансплантируя клетки внутрибрппинно интахтнЕМ мышам и сравнивая через различные сроки общее содержание

опухолевых клеток у контрольных и опытных животных, а также частоту прививаемости асцитаой опухоли; в) трансплантируя клетки ЬКЭ под кожу и изучая частоту прививаемости и динамику роста солидных опухолей. В каждую группу одного воздействия или одного срока учёта врали но 5-6 мышей.^ _

Вккиваемость стволов«* кроветворных клеток (К02-С) после воздействия облучения к гипертермии изучали с помощь» методики селезёночных экзоколонкй (1111, кеСиПовН, 1951)^ Для этого за сутки до трансплантации клеток костного поэта мышей-реципиентов облучали лучами в дозе 8 Гр. Суспензию клеток костного мозга, предназначенную для трансплантации, готовили на1среде 199 из костного мозга бедренной кости нескольких ньией-доноров, Нагреванию или облучению -подвергали суспензии, содержащие Ю6 кл/ид, затек их разводили до концентрации, обеспечивающей формирование на селезёнке мышей-реципиентов 5-10 колоний, и вводили внутривенно. В каядой группе било по 8-12 животных. Через 8 суток мышей убивали цервикалъной дисло-жацией, извлекали селезёнки, фиксировали в течение 2-3 часов в растворе Буэна м переносили в 70% спирт. Эффективность того иди иного воздействия оценивали, подсчитывая на поверхности селезёнки количество колоний, сформированных КСЕ-С. Выживаемость КОЕ-С определяли как описано в методических рекомендациях А.Г.Коносшскникова (1975).

Все манипуляции с клетками, кроме нагревания, проводили при температуре тажцего льда. Нагревали кдетрчные суспензии в ультратермостате, контролируя температуру о точностью до ¿0,1°С, в стеклянных ампулах; содержащих по I см** суспензии. СВЧ- и УВЧ - нагревание проводили в специальных кюветах с помощь» терапевтических аппаратов "Луч-2* И "УВЧ-30". Температуру во время нагревания измеряли термо-' датчиком, изготовленным на основе термопары.

Облучали суспензии У-лучами на установке "Луч-11* при мощности ДОЗЫ 0,670,5 Гр/мин.

Для перевивки солидных опухолей готовили взвесь из I части измельчённой опухоли и 3 частей раствора Хенкса (для саркомы-45 его соотношение было 1:2) и вводили подкожно в правое бедро (по 0,2 мл) или средни» часть хвоста (по 0,1 ил) крыс.

Изучение динамики роста опухолей проводили, измеряя каждые 2-3 суток их линейные размеры в трёх взаимно' перпендикулярных направлениях и затем вычисляя объём по форцуле Шрека: 1Г« (а*в-с), где а, в, с - длина, ширина и высота новообразования, доя характеристики среднего объёма опухоли в каждой группе вычисляли значение среднего геометрического путём преобразования, значений объёмов опухоли

- б -

в мм^ в логарифмы этих величин. Критериями эффективности противоопухолевого действия гипертермии и облучения служили параметры криви* динамики роста опухолей, торможение роста и высчитываемый по следующей формуле коэффициент торможения роста опухолей (Т):

Т - Tfo-'Z-Vs х 100%, где Vitсредний объём опухолей контрольной Vk

групп«; V0 - средний объём опухолей опытной группы. Последуицеа попарное сравнение эффектов для двух или более групп опухолей в определённые сроки проводили, используя обычные методы вариационной статистики. .

При изучении реакции кожи хвоста крыс на лучевое и гипертерми-чесхое воздействия использовали методику балльных оценок, подобную предложенной ранее (ahtwell» Wrlght, 1Э67),

При сравнительном изучении действия гипертермии на опухоли крас "T-I" и "R-I" локальное нагревание проводили с помощью инфракрасной лампы. Температуру в опухоли во время нагревания измеряли ¡электрическим термометром с точностью -0,2°С, поместив термодатчих под центр опухоли.

Нагревание кожи и саркомы-45, перевитой под кожу хвоста крыс, осуществляли путём погружения хвоста наркотизированных животных в нагреваемую в ультратермостате воду» На основании предварительных результатов температуру воды устанавливал^! учитывая, что температура опухоли на 1°С, а подкожной клетчатки - на 0,5°С ниже, чем вода.

Локальное У-облучение кожи и опухолей крыс производили на установке "Луч-I" при мощности дозы 2-3 Гр/мин. При сочетаниях воздействиях интервал между нагреванием и облучением составлял 5-10-икнут. За ГО-15 минут до начала облучения или нагревания крыс наркотизировали енутрибршинным введением нембутала (60 мг/кг массы тела).

Для гистологического исследования рабдомиосаркомы R-I после раздельного или совместного действия гипертермии и ионизирущей радиации крыс убивали через I, 2, 4, 7 и, : ряде случаев, 30 суток после воздействия. Ткани фиксировали в жидкости Карнуа. Приготовленные парафиновые срезы окрашивали гематоксилин-эозином, толувдиновым синим, азокариином, серебрили по Футу, выборочно проводили гистохимические реакции Брате, Фёльгена, Шика.

Результаты экспериментов были обработаны при помощи обычных методов вариационной статистики и регрессионного анализа (В.Ю.Урб&х, 1964). Доверительные интервалы для средних величин вычисляли, принимая 9556 уровень значимости. Обработка данных была проведена в основном на ЭВМ "Раздан-3".

РЕЗУЛЬТАТЫ ЖСПЕРИКЕИТАЛЫШ ИССЛЕДОВАНИЙ И ЮС ОБСУЖДЕНИЕ

I, Поврездающее и радиосенсибилизирущее действие гипертермии на опухолевые и нормальные клетки

На рис. I представлены данные о зависимости «ыхиваемости меток лейкоза Ьа от времени нагревания в температурном диапазоне 40-45°С.

3 ^ Рис'.1. Зависимость между

временем нагревания и логарифмом ДОЛИ ВЫЖИВШИХ леЭкозньсе КЛетйН при различных температурах воз-' действия.

По оси абсцисс - время нагревания (?), мин; по ее» ординат - логерафы доли выживших клеток (1е 5},

Уравнения регрессии для различите групп следующие:

40°С lg 3 ш - Q,1S - 3,02$

4I°C le S - 0,05 - 0,061 <Г

42°С 1е 3 Ш 0,11 - 0,129<С

43°С Is S ш - 0,39 - O.JOOT

44 °С 1е а т - 0,09 - 0,473 с

45°С 1в 3 ш - 0,01 - о

Подученные данные свидетельствуют о том, что выживаемость клеток с увеличением продолжительности нагревания уменьшается по экспоненциальному закону, тая что дозовые кривые напоминают аналогичные кривые для случаев облучения. Поэтому количественной характеристикой повреждащего действия гипертермии может служить величина отражащая неклон экспоненциального участка кривой. Вычисленные из уравнений регрессии величины составили; 17,1, 7,1, 3,4. 1.6, 0,9 и 0,5 минут, для температур 40, 41,. 42 , 43 , 44 и 45°С соответственно Таким образом, при повышении температуры на 1°С время равноэффек-тивного повреждающего действия гипертермия в этом диапазоне температур сокращается примерно вдвое. Подобная зависимость была описа- ■ на и для клеток » культуре (Field, Bleehen, 1979), опухолей (cyile^

1963) и кож« »шей (О.К.Нурпевев, А.Г.Конмумнников, 1991).

Для изучения термочувствительности АКЭ суспензии, содержащую 10 клеток, нагревали la vltro в течение X часа в диапазоне температур 37-42°С или сохраняли в течение этого времени на льду {контрольная группа) и затем трансплантировали по 0,2 ид внутривршикно ттактньм реципиентам. Через 4, 7, 10 и 14 суток ыьапей убивали и « подсчитывали общее количество опухолевых клеток в брюшной полости. Эти оггыты показали, что наиболее подходящей температурой для последующего изучения эффекта редкоеенсибилиэацни является 41°С, а время воздействия - 15-60 минут. Параллельно была изучена приживаемость и динамика роста привившихся опухолей солидного варианта АКЭ после подкожного введения нагретой ln vitro в теченйе I часа при 39-42°С суспензии. Прививаемость опухолей с увеличением температура уменьшалась и на 9-е сутки составляла*, для 0°С - I005Í, 39°С - I0üí, 40°С - 88$, 4I°C - 80Í и 42°С - I4Í. Таким образом, прививаемость клеток резко падала при нагревании до 42°С. Нагревание при этой температуре вызывало задержку появления опухолей в среднем на 5 дней и удлиняло продолжительность жизни мышей в среднем на 15 дней; объем опухоли у них был в 1,5 раза меньше, чем у контрольних мышей.

Использование клеток АКЭ, которые изолированы одна от другой, позволяло при наблюдении в фазовоконтрастном микроскопе выявить после гкпертедоического воздействия характерные изменения плазматической мембран« в виде локальны* выпячиваний различной величины. Такие клетки начинали прокрашиваться невитальным красителем нигрозином. Эти данные согласуются с гипотезой, согласно которой Ьдной из вероятных "мигаеней" гипертермического повревдения являются плазматические мембраны (Е.И.Волков я соавт., 1981; VI, 1979).

Для стволовых кроветворных клеток повреждающее действие гипер- -термин было изучено в диапазоне температур 41-44°С. Данные о выходе селезёночных колоний использовались доя построения кривих "бремя нагревания - логарифм доли вшивших клеток которые so всём изученном диапазоне температур имели з-образный характер о "плечом" и последующим экспоненциальным участком (рис. 2). Ложно видеть, что е роете« температуры воздействия величина плеча уменьшается и особенно большое изменение наблюдается при переходе от 41*41 к 42^С (табл. I). Значение S« изменяется.также неравномерно, поэтому для количественной характеристики KCIE-C удобнее пользоваться значением характеризующим время нагревания, приводящее к выживанию 10$ исходного числа клеток. При повышении температуры к» 1°С оно уменьшается примерно в 2,5 раза.

Рис. Z, Кривые гипертермической инактивации KGE-C при различных температурах. По оси абсцисс - время нагревания в мину« - тах по оси ординат - логарифм доли еьамваих клеток

( 1еЗ ). Экспериментальные данные на экспоненциальных участках кривых удовлетворяют сведущим уравнениям регрессии: 41 °С 1еЗ • 1.4e - 0,015^ 43^ Ies - 0*66 - 0.054Í 42°С 1еЗ - 0,40 - 0.019Т 44°С le» - 0,77 - 0,152^

Таблица I.

Параметры, характеризующие термочувствительность КОЕ-С

Температура воздействия,

■ °С мин м«к мин

41 100,0 29,3 167,5

42 20,0 22,6 72 »9

43 12,3 8,1 31,0

44 5.1 2,9 1 И,6

Сравнение термочувстаительности Слизких- по проясхозденио югёток -лейкоза 1а и КОЕ-С показало, что опухолевые клетки в 3-6 раз термочувствительнее, чей нормальные {табл. 2). Этот феномен в будущем возможно удастся использовать для освобождения от опухолевых клеток костного мозга больных лейкозами, используемого для аутотракс-шгангации.

Сопоставление полученных нами данных с результатами описанных в

литературе сведений о термочувствительности клеток млекопитающих в культуре (табл. 2) позволило прийти к выводу о том, что клетки, взятые для нагревания непосредственно из организма, являются более термочувствительными, чем выращенные la rltro.

Таблица

' Термочувсгвительность различных клеточных линяй мышей

Температура, °С Данные диссертационной паботы £Ьоуап е.а*, 1977 ITieleen Lelth е.в., 1477

' Ьа КОЕ-С LU2 LU2 HíT-fi

МИН мин По мин ь*. мин Do МИН D» мин ь. мин МИН D» мин

41 42 43 44 45 3,4 1,6 0,9 0,5 17,2 8,6 2,0 1.9 л.о 29,3 22,6 8,1 2,8 167,5 72,9 31,0 П,6 46,0 10,0 ife.O 50,0 74,4 28,3 10,8 4.3 2.4 гг,б гсе,о

Зависимость тепловой инактивации клеток и тканей подобна температурной зависимости химических реакций первого порядка, поэтому может быть формально проанализирована путём графического ■ представ-„ ления зависимостей между температурой и скоростью инактивации в координатах Аррениуса. Энергию активации вычисляли по приведённой И1е1в«п и соавторами (1982) формуле;

Я - « 1« А - (/«-/В 1л ,

где К - скорость тепловой инактивации; с0 - величина, характеризующая наклон кривой теплового выпивания клеток;х - константа донной ' реакция в изученном диапазоне температур;А -.газовая постоянная <8,ЗГ4 Д*-К" »град-*); Т - абсолютная температура в градусах Кельвина. При расчётах принимали, что I Дж соответствует 0,239'Ю-^ юсал.

Дня всего изученного диапазона температур для клеток лейкоза 1<а и АКЭ наблюдается только сдан тип реакции повреждения, энергия активации которого составляет для клеток лейкоза 141 ккал/и и для АКЭ -130 ккая/и (гибель клеток оценена по «неточности через 6 суток после трансплантации) и 146 ккал/У (по тесту прививаемости). При оценке скорости'тепловой инактивации КОЕ-С, по интегральному показателю !>]» - перелом построенного в Аррениусовых координатах графика также отсутствует. Однако при оценке скорости тепловой инактивации

по показателю Do можно видеть перелом графика в области 42°С • рис. 3). Вероятно это связано просто с более быстрым ростом эначе- . ния С«<>• чем Ъе , при переходе от 42°С к 4Х°С. Наклоны Лррениусо-вш гр^иков (для кривой I» диапазон 42-44°С) е обоих случаях близки и карактеризухтся значением энергии активации 100-120 юсал/Н.

Рис. 3. Зависимость иевду температурой нагревания и скоростью тепловой инактивации KQE-C, оцениваемой по величине I/b, (I) или значения 1/о(в (2).

По оси абсцисс - обратная температура в градусах Кельвина (I/TK соответствующие значения температуры в °С даны на верхней оси графика; по оси ординат -логарифм обратных значений De в мин"1 { igl/t>e) или таких же значений £><а (справа дано абсолютное значение I/bi). Кривая I на участке от 42 до 44°С и вся кривая 2 описываются следующими уравнениями регрессии: I. Is » 13в,8 - Q,«5*105(J)j 2. lg (J) - 120,4 - 0,Э85'105ф

Таким образом, в изученном диапазоне температур для клеток лейкоза Ьа, ДКЭ и КОЕ-С наблцдаетя только един тип реакции гипертермического повреждения, энергия активации которого находится в пределах 100-150 ккал/И. Величины такого'порядка соответствуют энергии, необходимой для тепловой инактивации ферментов и денатурации , белков (Dewey е.е., 1977) Xonopljaxmllcov, 1931) и характерны как для нормальных и злокачественных клеток в культуре, так и тканей 1а т1то .нагреваемдас при температуре свыше 42-43°С (О.КЛ^рпешев, А.г.коноплятшков, 1981} Leltfa е.а., 1977t Field, Bleches, 1979). . Это позволяет предположить, что, вероятно,_ одни и те же индуцированные гютертедопгеским воздействием процессы вызывают гибель клеток la vitro, некроз нормальных тканей и излечение от опухолей. Отсутствие перелома кривых в диапазоне 42-43°С, который обычно наблцца-ется для клеток млекопитавдих в культуре, возможно связано с тем, что в данном случае изучалась реакция клеток, размножающихся в организме, которые является более термочувствительными, или же в ус-

ловиях наших акспериментов не развивается термотолерантность,-которая* как предполагают leроск и Eruer ÍI960), является основной причиной перелона Арреняу^ова графика.■

При изучении радиомодифинкрущего действия гипертермии на клетки лейкоза La, АКЭ и KQE-C бшш получены дозовые. кривые выживаемости для контрольной популяции клеток и клеток, подвергнутых перед облучением гипертеркическому воздействии. Результаты одного из таких опытов, проведённых на клетках лейкоза, представлены на pite. 4, а проведённого на K0R-C - на рис. б. Дополнительное воздействие гипертермии приводит к увеличению радиочувствительности клеток. Для лейкоза La величина De уменьшается с 2,32 Гр в контроле до 1,48 Г)? в I группе к до 0,66 Гр во 2-Й; для КОЕ-С - с 0,97 Гр в контроле до 0,61 Гр при воздействии гипертермии. Причём с повышением температуры ti уровня начального теплового повреждения радиосенсибшшэирувдее ' действие гипертермии возрастает. Расхождение кривых свидетельствует о том, что с ростом дозы облучения растёт и индекс сенсибилизации, т.е. кроме суммации повреждающего действия радиации и гипертермии наблгдается "сверхаддитивный" эффект. Так, при облучении в дозе 4 Гр после нагревания до 43°С в течение 10 минут выживаемость понижается за счёт облучения до 2,2*10' , за счёт нагревания до 2,9*Ю-4 и до б,б*10-' - за счёт "сверхаддитивного" эффекта. Следовательно, при совместном применении облучения и гипертергаи на опухоли наибольшего эффекта следует ожидать а случае использования схема облучения крупным» фрахциями.

Рис. 4. Кривые радиационной инактивации клеток лейкоза La в контроле (I), при предварительном нагревании до 411 в течение 20 шщ (2) и до 43% в течение 10 мин (3).

lio оси абсцисс - доза излучения (В), Гр; по оси ординат -доля выживших клеток (le в).

Экспериментальные данные описываются следующими уравнениями регрессии:

1. lg S • 0,10 - 0,183 D

2. les ш 1,33 - 0,295 о

3. le 3 . - 3,54 - О,В

2 4 6 доза излучения,Гр

- ІЗ -

Рис. 5. РадиосенсибшіизирувщиЙ эффект гипертермии при ^-облучении КОЕ-С (слева) и зависимость эффекта радкосенсибнлизации от осаракте- • ра сочетания двух воздействий во времени (справа). Стрелками показан отдельный эффект каждого юс двух воздействий ( У- облучение в дозе 1,5 Гр; Г - гипертермия 4Э°С* 30 мин). По оси абсцисс,- доза излучения <Ю> в Гр (слева) или величина интервала (час) между облучением и нагреванием (справа); по оси ординат - для обеих чаете* рисунка - логарифм выжившей доли КОЕ-С (іе з). Экспериментальные точки только одного облучения (I) или нагревания с немедленным последующим облучением (2) удовлетворяет следующем уравнениям регрессии: I. 3 - 0,30 - 0,447 » 2, з - - 1,15 - 0,710 О

На КОЕ-С был также изучен эффект сочетания облучения в дозе .1,5 Гр и прогревания при 43°С в течение 30 минут, когда два воздейс- ■ твия разделял I час и когда каждое из этих воздействий предшествовало другому (рис. 5, справа).-Пунктирной линией на рисунке показан уровень простей аддитивности' эффектов двух воздействий. Гипертермия, проведанная аа-1 час до облучения, обладала выраженным редиосенси-бидизирущим эффектом, который только немного уступал сенсибилизации при облучении сразу после нагревания. В то же время нагревание через'I час после облучения практически не сенсибилизировало КОЕ-С к действии'радиации, так как выживаемость клеток определялась простой аддптивностьо двух повреждающих,агентов. Эти данные хорошо согласуются с современными представлениями о той, что нагревание мнги-бирует процессы пострадиационной репарации клеток (ім«еу «.а,,1990).

В этом случае отсутствие радиосенсибилигируидего эффекта при нагревании через I час после'облучения можно истолковать как ¡завершение в течение этого времени репарации радиационных повреждений, способных сннергичесядм способом взаимодействовать с эффектами, гипертермии. Б то же время предварительное нагревание выключает на более длительный срок ферменты репарации и поэтому приводит к реализации эффекта.радиосенсибилиэация. Аналогичные зависимости суммирования эффектов нагревания и облучения для КОЕ-И наблвдали вгшпег и-соавторы <1Ш2).

При изучении временных зависимостей инактивируккцего действия нагревания для предварительно облучённых или необлучённых клеток лейкоза Ьа, АКЭ и КОЕ-С не было обнаружено повышения термочувствительности у облучённых клеток по сравнение с необлучёнными. Таким образе», радиация не является специфическим сенсибилизатором к после- ' дуетчему воздействию нагревания(рис. 6). ■

Рис. 6. Зависимость относительного содержания АЙЭ от времени нагревания при температуре 41°С для необлучённых и) и предварительно облучённых в дозе 4 Гр клеток АКЭ 12).

По оси абсцисс - время инкубации в мин; по оси ординат -догарифм относительного содержа-, ния клеток АКЭ на.6-е сут-

ки после перевивки. Уравнения регрессии;

1, <1в ^ ) = 0,23 - О.ОІЗС

2. ) - - 0,14 - 0,013 <Г

В настоящее время используются различные методы нагревания тканей (иммерсия в водяной,бане, СВЧ- и УВ^-иэлучения). Поэтому актуальной задачей является сравнение повреждающего и радиомодифициру»-щего аффектов гипертермии, создаваемой этими способами,. Этот раздел исследования был выполнен на клетках лейкоза Ьа, суспензии которых нагревали как в термостате, так и при помощи аппаратов "ЛУЧ-2 и "УВЧ-30". Как видно из табл. 3, выживаемость клеток во реех"сравниваемых группах была примерно одинаковой (колебания в уровнях логарифма выживаемости лейкознъи клеток находились в пределах её воз-

моядаой ошибки, * 0,19). По-видимому, в условия* наших экспериментов вклад "специфического компонента* миіфоволнового излучения а поврездащее действие гипертермии не велик и им можно пренебречь. Это подтверждают и эксперименты, в которых клетки инкубировали в течение 30 минут при 15°С и параллельно при этой температуре а течение такого же времени воздействовали УВЧ-полем при терыогенной мощности генератора 30 ватт. В данном случае, когда повревдаящее действие нагревания отсутствовало, специфического действия УВЧ-поля также не н&Стодаяи (животные в 2-х группах, которым трансплантировали клетки лейкоза, погибали одновременно). Таким образом, эти данные позволяют прийти к важному для практики выводу о том, что во всех случаях определяющим фактором является температура и продолжительность нагревания.

Таблица .3.

Выживаемость клеток лейкоза 1л при нагревании суспензии различными способами

Логарифм доли выживших клеток (is 5 - 0,19)

нагревания 37°С, 60 мин 39<%, 55 мин 40°С, 45 мин 40°С, 60 мин 42°С, ■ '60 мин

Водяная баня - 0,29 - 0,91 - 0,72 -1,34 -4,00

СВЧ-излучение - 0,38 - 0,68 - -1,15

УВЧ-иэлучение - 0,19 - 1,00 - 0,75 -1,05 -4,21

2. Повреждающее « радяосенси&шгаирущее действие гипертерти

на опухоли

Использование Гипертермии при лечении злокачественных новообразований носит в основном эмпирический характер, поскольку информация о зависимости радиомодифщируацего действия нагревания от кинетики роста опухолей и их радиочувствительности практически отсутствует. Поэтому в данном разделе работы была поставлена задача изучить радиомодифкцируядее действие нагревания двух различающихся по радиочувствительности и скорости роста опухолей крыс: фибросаркоыы T-I и рабдомиосархомч R-I. Локальное нагревание опухолей в этих эксперимента* проводили с помощью инфракрасной лампы мощность» 150 ватт. Температуру во время нагревания измеряли электрическим термометром. На рис. ? представлены результаты этих опытов.

Т1

СУТКИ после П£Г£*И1КИ

Рис^.7. Влияние раздельного и совместного воздействия облучения и гипертермии на кинетику роста опухолей крыс: Т-1 и й-1

I - контроль;'2 - нагревание (4г°С, I час); 3 - однократное облучение (20 Гр); 4 - облучение (20 Гр> +■ нагревание (42°С, I час И 5 - нагревание (42°С, I час) +• облучение (20 Гр); 6 - двукратное об лучение (20 Грх2) через ? дней; 7 - двукратное облучение (20 Грх2) через 7 дней + нагревание (42°С, I час) сразу после первого сеанса облучения. Стрелки - сроки облучения (У) и гипертермического воздействия (Г). По оси абсцисс - время после перевивки опухолей в сут к ах; по оси ординат - средняя величина объёма опухолей в мм3 (V).

Радиосенсибялиэирущее действие гипертермии в условиях наших опытов в значительно большей мере было выявлено для медленно растущей ,радиореэястентной опухоли. Такая же зависимость была обнаружена и в работе ¿еьпеоп (1979), проведённой ка четырёх опухолях

мдагей. Это может свидетельствовать о том, что вклад гипертермии в обцув реакций опухоли определяется, в основном, усилением повреждения «токсических клеток, которые находятся а условиях плохого пита ния и низких значений рН.

При дополнительном морфологическом изучении действия гипертермии й радиации на опухоль К-Г было показано, что в ранние сроки сутки) после совместного действия гипертермии И ^-облучения В МОр^О логической картине доминируют эффекты гияертермического воздействия я в более поздние - радиационного. Для действия гипертермии также характерна значительная локальная вариабельность степени повреждения в соседних участках по сравнению с эф^.ктчм облучения, что, но-

видимому, связано с различиями в развитии сосудистой сети опухоли, определяющей скорость тешюотвода при нагревании. Более сильный повреждающий эффект наблюдался в центральных участках новообразования, объёмный кровоток в которых меньше, чем на периферии.

Таким образом, результаты морфологических исследований также подтверждают представления о гипертермии как идеальном адъюванте для ионизирующей радиации, так как к действию нагревания наиболее чувствительны радиорезистентные гипоксические зоны оцухоли.

3. Влияние гипертермии и облучения на кожу крыс и оценка фактора терапевтического выигрыша

При применении термолучевой терапии в онкологический практике необходимо знать зависимость эффективности воздействия на опухоль от режима фракционирования дозы и окружающие её нормальные ткани.

В нашей работе информацию по этому вопросу ми получали путём сопоставления эффекта одного облучения или совместного воздействия прогревания при 43°С в течение I часа и поел едущего облучения коки хвоста крыс "Август" при следующих схемах воздействия: I. однократное воздействие (1Н/1Т, где В- число фракций, Т - длительность курса в сутках); 2. трехкратное воздействие (Зн/5Т); 3. шестикратное (6Я/12Т); 4. девятикратное (9в/19Т). В каждой схеме было по три группы животных, отличавшихся по дозе облучения так, чтобы можно было построить доэовую зависимость для оценки яэоэффективноЯ дозы облучения, приводящей в период выраженной кожной реакции к развитию влажного этидерыита. Результаты экспериментов приведены на рис. 8. Как можно видеть, наклоны кривых (или, что эквивалентно, показатели степеней в фодаулах) изоэффехта для двух сравниваемых видов воздействия (только облучение или гипертермия совместно с облучением) по каждому из двух параметров (к или Т) весьма сходны, а основное различие связано с тем, что з случае дополнительного пгаертермнчес-кого воздействия примерю в 2 раза снижается доза облучения. Это свидетельствует, по-видимоцр, о том, что протекающие в нормальных ' тканях между фракциями репаративные процессы (в первую очередь процессы репопуляции клеток) в двух сравниваемых условиях идут с одинаковой скоростью. Поэтому для прогнозирования эффекта и оценки толерантной для нормальной ткани дозы при повторяющемся совместном воздействия гипертермии и радиации достаточно в опыта» установить величину модифицирующего эффекта гипертермии при од нократном облучении и затем использовать её при определении эффективной дозы, приходящейся на одну фракцию воздействия, & эффект фракционирования учитывать с обычных-позиций концепции "номинальной стандартной дозы!

Рис. 8. Кривые зависимости суммарной дозы облучения (Ь) от числа фракций .(и ) или продолжительности облучения в сутках IX) при индукции изоэффективного поражения коли воздействием облучения или облучения и гипертермии Графики построены в двойных логарифмических координатах. По оси абсцисс - число фракций (А) или время облучения (Б). Оо оси ординат - суммарная доза излучения в Гр. Экспериментальные значения удовлетворяют следующим уравнениям регрессии: Г.Одно облучение А в " 3940-Я ^ в . 3910'Т?»25

Об лучение и 'гипертермия - Х920-Н 0,33 * й - 1910-Т°»23

Количественной оценкой преимущества» получаемого при использовании дополнительного гипертермического воздействия при лучевом лече- ' нии опухолей, является фактор терапевтического выигрыша (ФТВ), определяемый как отношение вИДопуз(олУФИДно$«альноЙ укаж). В наших исследованиях был определён ФТВ л^и локальном совместном воздействии гамма-облучения и гипертермии на кожу хвоста и саркому-45, перевиваемую под кожу хвоста крыс Вистар. При нагревании кожи температура веды была 43(5%, при нагревании опухолей - 44°С. При таких условиях температура в опухолях объёмом 100-400 мм® и подкожной клетчатке составляла 43^0,2°С, время её достижения не превышало 5 минут. Прогревание проводили в течение 30 минут перед облучением; интервал между воздействиями составлял 5-10 минут. Величина ФТВ при такой схеме лечения крыс с саркомой-45 составила 1,5-1,6, что свидетельствует .о больших перспективах использования дополнительного гипертермического воздействия при лучевом лечении злокачественных новообразований.

ВЫВОДЫ

1. Количественно охарактеризована теричувствительность клеток перевиваемых опухолей у мышей - лейкоза Ьа и асцитной карциномы Орлиха {АКЭ) и нормальной ткани - стволовых кроветворных клеток (КОЕ-С), нагревавшихся. в условиях 1» и затем трансплантированных в организм животных. Показано, что в изученном диапазоне температур (40-45°С)'кривые "время-нагревания - клеточная выживаемость*1 спрямляются в полулогарифмических координатах. При повыяении температуры воздействия на 1°С время равноэффектнвного воздействия ■ для всех изученных клеток сокращается примерно вдвое. Стволовые кроветворные клетки в диапазоне 40-44% в 3-6 раз более терморезистентны, чем аналогичные по природе клетки мышиного лейкоза.

2. При фазовоконтрастной микроскопии нагретых клеток АКЭ выявлена характерная картина повреждения клеточной мембраны. При перевивке клеток АКЭ; подвергавшихся нагреванию, с ростом,температуры нагревания увеличивается латентный период развития опухолей.

3. Нагревание сенсибилизирует клетки лейкоза Х>а, АКЭ и КОЕ-С к поел едущему воздействию ионизирующей радиация и в этом случае наблюдаемый эффект превышает простую" сую<у двух повреждающих агентов. С ростом дозы облучения индекс гиперт ернической сенсибилизации возрастает.

4. Показано, что при нагревании клеток лейкоза Ьа различными способами (иммерсия в воде, воздействие СВЧ- к УВЧ-излучения) определяющими уровень повреждения факторами являются температура нагревания и его продолжительность.

'5. Изучение родиосексибилязирующего действия гипертермии на опухоли крыс, различающиеся по радиочувствительности и скорости роста (Т-1 и И-1) показало, что значительный модофщирущий эффект достигается при воздействии на медленно растущую ради ореэиотентную р&б-домиосаркому К-1. Морфологический анализ этой опухоли показал, что для действия гипертермии характерна значительная локальная вариа- * бельноеть степени повреждения соседних участков опухоли по сравнению с эффектом облучения.

6. При однократном и фракционированном совместном воздействии гипертермии и облучения на кожу крыс наблюдается ,тот же характер зависимости эффекта от числа фракций или продолжительности облучения, что и при воздействии только облучения. Это позволяет использовать аппарат концепции "номинальной стандартной дозы" ДЛЯ оценки

оценки толерантного уровня совместного воздействия ГИПертерШМ! и облучения« если для дозы облучения вводить поправку на фактор тепловой сенсибилизации.

7. Величина фактора терапевтического выигрыша, достигаемого за счёт дополнительного воздействия гипертермии при облучении опухоли KJSJC - сархомы-45» составляет 1,5-1,6, что свидетельствует о реальном расширении редиотерапевткческого интервала при термолучевом лечении злокачественных новообразований.

СПИСОК РАБОТ, СШБЛИКОЕАННЮС ПО ТЕШ ДИССЕРТАЦИИ

1, Конопляннияов А.Г., Сынзьошс Б.И., Штейн'Л.В., Саекко A.C., Скла бовск&я Ы.В. Влияние гипертермии на репарацию повреждений ДОК и на выживаемость клеток асцитного рака Эрлиха. В кн.: "Радиочувствительность и лучевая терапия опухолей", Д., 1976, с. 51-52.

2, Коноплянкиков А.Г., Штейн Л.В. Использование гипертермии доя подавления репаративных процессов в опухолевых клетках и для повышения эффективности лучевой терапии. Кед. радиология, 1977» К, с. 23-27.

3» Коношишников А.Г.,Свиногеееа Т.П., Штейн Л.В. Влияние гипертермии и облучения на кинетику роста рабдомиосаркомы R-I. в кн.: "X Всесоюзный съезд рентгенологов и радиологов", Ереван, Х977, с. 74-75.

4. Коноплянкиков А.Г., Свиногеева Т.П., Штейн Л.В. Влияние гипертермия и облучения на перевиваемые опухоли животных, йед.'радиология, 1978, # I, с. 29-31.

5. Конопдянников А.Г., Курпешев O.K., Штейн Л.В. Дозо-временныв

. зависимости изоэффективного поражения кожи крыс при гамма-об-яуЧении или совместном воздействии гипертермии и гамма-лучей ^о. В кн.: "Радиация и организм", Обнинск, 1979, с. 19-21.

6. Конопдянников А.Г.* Коногияннилова O.A., Курпепев O.K., Пятен-хо B.C., Штейн Л.В.'Радиобиологические предпосылки использования гипертермии для повмпенкя эффективности лучевой терапии злокачественных новообразований. В кн.: "Радиобиологические основа лучевой терапии", Д.,-1980, чЛ1, «. 55-58.

7» Конопляннмков А.Г., Курпешев O.K., Штейн Л.В. Дозо-временные . зависимости иэозффективкого поражения коки крыс при облучения -или совместном воздействии нагревания и облучения. В кн.: "Радиобиологические основы лучевой терапии". Д., 1980, ч,11, о. 5859.

8. Душников Е.Ф.,-Свиногеева Т.П., Штейн Л.В., Коноплянникоа А.Г.

Морфология раб домносаркомы крыс после раздельного или комбинированного воздействия ионизирующей радиации и гипертермии. — Мед. радиология, 1981, № 8, с. 53—60,

9. Штейн Л. В. Р а днос е ней б и л изи ру ющее и повреждающее действие гипертермии на клетки асцитной карциномы Зрлн-ха. В кн.: «Радиомодификаторы в лучевой терапии опухолей», Обнинск, 1982, с. 74.

10, Коиоплянииков А. Г., Колесникова А, И., Лепехина Л. А., Штейн Л. В., Каплан В. П., Тришкина А. И. Термочувствительность некоторых способных к клонообразова-нин> клеток нормальных и опухолевых тканей животных и человека. В кн.: «Радиомодификаторы в лучевой терапии опухолей», Обнинск, 1982, с. 53—55.

11. Курпешев О. К., Коиоплянииков Л. Г., Пятенко В. С., Штейн Л. В. Радиосенсибилизирующий и повреждающий эффекты гипертермии на нормальные и опухолевые ткани, В кн.; «Радиация и организм», Обнинск, 1982, с. 28—30.

12, Штейн Л. В., Коиоплянииков А. Г. Оценка терапевтического выигрыша при сочетанном действии ионизирующей радиации и гипертермии на кожу и перевиваемую крысиную саркому-45. В кн.: «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической радиологии», Свердловск, 1983, с. 51— 52.

13, Штейн Л. В., Коиоплянииков А. Г. Радиосенсибилизи-рующее и повреждающее действие гипертермии на различные биологические системы. Радиосенсибилизирующее и повреждающее действие гипертермии на клетки мышиного лейкоза Ьа. — Радиобиология, 1983, т. 23, № 4„ с. 489—492.

14. Штейн Л. В., Коноплянников А. Г. Радиосенсибилизирующее и повреждающее действие гипертермии на различные биологические объекты. Клетки асцитной карциномы Эр-лнха. — Радиобиология, 1983, т. 23, № 6, с. 770—773.

ТС-02082

Заказ 2542

Тираж !0й

Малдорослэвецк£я городск&н типография укрепления >1 тгльств. ПОЛ игр «Ф «II и книжной торговли КолужсУс"*! облисполком»