Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДНК-индуцированная генетическая нестабильность у Bacillus subtilus и ее особенности

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "ДНК-индуцированная генетическая нестабильность у Bacillus subtilus и ее особенности"

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК УКРАГНИ 1НСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНО! БЮЛОГ11 ТА ГЕНЕТИКИ

На правах рукопису

УДК 575.224

П1ДПАЛА Ольга Володимир1вна

ДНКЛНДУКОВАНА ГЕНЕТИЧНА НЕСТАБ1ЛЬН1СТЬ У BACILLUS SUBTILIS ТА II ОСОБЛИВОСТ1

03.00.26 - молекулярна генетика

Автореферат дисертаци на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук

К и I в -1997

Дисертавдею б рукэпис

Роботу виконано у Е1дд1ла>: молекулярно! генетики та генетики людини 1нституту молекулярно'1 61ологП та генетики HAH Укра!ни

Науковий KepiBHUK: кандидат 61олог1чних наук, I.С.КАРПОВА

Офхщйй опоненти: доктор 61олог1чних наук,

професор С. С. МАЛЮТА,

доктор медичних наук,

професор Т. I. БУНевСЬКА

Пров1дна уотанова: Укршнський науковий ririeHi^Hiiii центр MOS Украши

Захист в!дбудеться а ¡и j.997 року о /О годшп

на saoiflaHHi Спец1ал1вовано'1 вчено! ради Д.01.86,01. 1нституту юлекулярно! бюлогП та генетики HAH Украшх за адресов: 25£143, Й11В-143, вул. Академика Заболотного, 150.

3 дисертащею модна огнайомитись у б1бл!отец1 ¡нституту молекулярно! бхологп та генетики HAH Украши.

Автореферат poaiслано_ 1997 рок1/.

Вчений оекретар Спещал1вовано'1 вчено! ради кандвдзт бюлог1чних наук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТЙ

АКТУАЛЬНIСТЬ ПРОБЛЕМ. Тривалий час спадвову М1нливасть розглядали як хаотичкий i некерований процес.1з в1дкриттям мо-б!льних генетичних елемент!в стало очевидним.що в природi яби-ще MimjiBOCTi, зокремз pisni прояви генетично! нестабильности можуть аумовлюватися наявшстю та активною певник ДНК-EUiOHiix структур. На сьогодн1 геном розглядають як динатчну систему, що активно реагуе на BMiKii навколишнього середовшца.

Природн1 кестабьтьк! мутапд! мзють тенденща до cTaöiii-аацп, що ускладнюв 'ix вгшчення. З'ясувалося, що для експери-менталького моделювання генетично! нестаб!льност1 зручними в пол!нуклеотидш поагпдавнас-т!, якл можуть спричшяти мутац!! у про- i eyKapioTiB is тривалою генетичною кестаб!льн!стк>. Sa аналог!ею до погедднки природних моб!льних генетичних елемен-tib. припускать, що фрагмент» чужосадно! ДНК можуть !нтегрува-ти до генома господаря, актив!вувати його власн1 моб!льн1 еле-менти, або може Ехдбуватися i те, i те (Гершензон С.М., 1991). Викориотання ДНК-мутагенезу для експериментальнсго моделювання генетично! нестаб1льност1 дав змогу тривалий час виЕчати це ЯЕиш.е га pismix контрольованих умов,шр в п!дходсы до розкриття механ1зм1в регульсвано! м!нливост1.

МЕТА РОБОТИ - вивчити прояв ДНК-1ндукованоТ генетично'! нестаб1льност! Bacillus subtilis пор!вняно 1з вз.домими прикладами природних та експеримэнтзльних систем генетично'! неста-б1льност1.

Перша частина роботи присвячена доол1дженню явища надне-стаб1льност1, опричкнено! ддбю еукар1отично1 ДНК на прикладi лейцинового ауксотрофа is наголосом на таких проявах,що можуть св1дчити про наявн1сть та актнвшсть транспозонопод!бно! структури. Були поставлен! конкретн1 завдання: вивчити HKicHi та ильклсн! характеристики нестаб1льност1, зокрема частоту та

спектр мутащй у поколениях; досл1дити вшшв стресових умов ( температури ) та системи Батально! рекомбёнацП на прояв не-стабШно! мутацП та П транспозицп;спроба вщЦлення фактора генетично! нестабёльност1.

Друга частпна роботи присвячена: 1) розробленню просто! тест - системи для в!дбору потенвдйно мутагенних конструкций; 2) моделюванню явшца генетично! нестаб1льност1 в використанням в1дс>мих еукарёотичних посл!довностей у склад1 рекомбз.нантних ДНК.Завдання друго! чзстини роботи охоплгавалн: порёЕняльне до-слёдження мутагекно! активност1 ДНК спорз.днених рекомбз.нантних плазм!д !з вставкою еукар1отични>: посл1довностей;в1дб1р ¿нсер-цёйннх мутац1й;поЕук нестабё.льних вар1ант1в та !х ыолекулярно-генетична характеристика; одержання прямих доказёв транспози-цёйност! ёнсерцёйних мутавдй.

НАУКОВА НОВИЗНА. Охарактеризовано наднестабёльну систему на прикладё ауксотрофного по лейцину мутанта В.зиЫлПз, спри-чиненого дёею еукарёотично! ДНК (оселедца), що Еёдрёзнявтъся вёд в!доми>: систем генетично! нестабёльностё повднанням певних влаотивостей як еукарёотичних систем ( надзвичайко високз частота ревертування, варёабельнёсть фенотипового прояву ознакк), так 1 прокарёотичних (гюдовжений у часх процес ревертування, гетерогеннёсть ревертантёв, змёна характеру ревертування).

Розроблено просту тест-систему для вёдбору потенцёйно му-тагенних рекомбёнантних молекул ДНК. Показано,щр мутагенна ак-тивнёсть залезкить вёд якостё клонованого фрагмента,де найбёль-шу мутагеннёсть виявляб А1и-повтор генома людини сам чи в по-вднаннё хз ёншими генами еукарёотёв.

Молекудярно-генетичшшп методами на прикладё А1и-повтору генома людини доведено, що чужорёдна ДНК може ёктегрувати до генома Е.БиЫпНз 1 спричиняти генетично нестабёльнё мутацё!.

3"'всовано,що А1 и-повтор генома людинл може тривалии час peruii-куватись у склад! бзктер!ально1 хромосоми та эма.нюватп свою локалхзащю.

Одержана колекидя нестаб!льних мутант1в може бути внко-ристзна для поглибленого досл!дження природи й законом1рностей ДНК-!ндуковано1 генетично! нестаб!льност1. спецкф1чност! iH-серщйного мутагенезу та умов, шр спрпяють утвореннкз de novo нових моб!льних генетичних структур.

ПРАКТИЧНЕ ЗНАЧЕНИЯ РОБОТИ. Юптини B.subtills, яо здатн! погллнати будь-яку ДНК у простих експернменталыпк умовах, мо-жуть бути вручиi для тестунання потенщйко мутагекних конст-рукщй, що е вашшм для генно! Tepani'i та гекно! 1нзкенерИ. Водночас Bifli6paHi високомутагешп конструкцП молекул ДНК зможуть бути EiiKopucTSHi для одержання рАддисяих мутащй та з метою маркерування reHiB i регуляцп "ixHbo'i активности 0CH0BHI ПОЛОЖЕНИЯ 5 ЩО ВИНОСЯТЬСЯ НА ЗАХИСТ:

1. Еукар!отична ДНК !э енсокою частотою може спричиняти у бак-терх! трнвалу генетичну нестабальнхсть.

2. Мутзгенна активн1сть чужор1дно1 ДНК залежить В1Д якостД по-л1нуклеот11дно1 посл!довност1,зокрема наявност1 повторюваних елемент1в.

3. Причиною генетично! нестаб1льност1 може бути 1нтеграц!я чу-жорхдно! ДНК.

4. 1нтегрована чужор1дка посл!довн1сть може тривалий час утри-муватись у хромосом! реципиента i зм1нювати свою локал1за-ц!ю.

АПР0ЕАД1Я РОБОТИ. OcHOBHi результат« дисертзцП допов1да-лися на конкурса молодих вчених (I®Pir,1987) та буди представлен! тезово на XVI Mi«народному генетичному KOHrpeci (Канада, Торонто,1988), конференцп молодих вчених (1ФР1Г, 1989), на VI

та VII Всесоюзних симпозиумах " Молекулярн1 мехатгыи генетнч-них процес1в " (Москва, 198?, 1991). За штер1алами дисертацП опубликовано 5 статей i тези трьох допов1дей.

СТРУКТУРА ТА ОБСЯГ РОБОТИ. Дисертащю викладено на 139 сторонах. Бона м1стить вступ,огляд л1тератури,матер1али i ме-тоди, екслериыентальну частину, обговорення резулътат1в, вис-новки, а також. додатки. Список л1тератури охоплюе 215 наимену-вань. Дисертащю про1люстровзно 31 рисунком та 11 таблицами.

Основыi результата, викладен! у дисертацП,одержан! автором caMocTiHHo. Експерименти з молекулярно-генетичного анал1зу мутантов (дот- i блот-г1бридизац1я) були sfliiicHeHi стльно з! ойвробхтниками в!дд1лу регуляторних MexaHisMiB кл1тини 1МБ1Г НАНУ 1.е.Коотецьким, С.е.Римар та сп!вроб!тниками в!дд1лу генетики MiKpoopraHiSMiB 1нституту загально! генетики РАН (Москва) Г.Б.Савченко, В.I.Еашк!ровш та Ф. К.Хасановим.

ОБ'вКТИ ТА МЕТОДИ Д0СЛ1ДЖЕНЬ

Штами бактерит та плазм!ди. У процес1 виконання роботи використовувалися так1 штами Bacillus subtilis: SHGW, СНР42 (i3 колекцП I® РАН, С.- Петербург); штами KITiB,BD170,BD224, нздаш Г.В.Савченко (!з колекц!! лабораторп генетики Miwpoop-raHiBMiB 13Ген РАН, Москва); Leu5-3, содержаний I.С.Карповой.

Для здхйснення експеримент1в використано плазм1ди : pBD54 (i3 колекцп лабораторП генетики MinpoopraHiSMiB 13Ген РАН, Москва); PBR322, pUCIS та pUClQ ( is колекц1! 1МБ1Г НАНУ ); pBR322ins та pBR322insN, надан1 Ю.М.Пацковсъким (IMBir НАНУ); pALl ( is колекцП 1нституту цитологи РАН, С.- Петербург ); pWT i рА401, надан1 В.П.Шульженком та pAins - I.C-Варзановсш (1МБ1Г НАНУ).

Середовища i реактиви.Ддя вирощування бактер^альних куль-

тур як псшнощнне середовшце використовувзли 1,5 S агар Хот-тёнгера, а як тшмэльне - напёвтверде 1 X середовище агару, розведене ровчшом Сшцайвена. До селективних агаризованих се-редовщ додавали атнокислоти в кёкцевих концентрзщях: для L-аьпнокислот - 50 мкг/мл, для ПЬ-ам1нокислот - 100 мкг/мл; азо-THCTi основи - £0 мкг/мл; вётамёни - 1 мкг/мл та антибхотики у таких ганцевих концентращях: хлорамфен1кол - 20 мкг/мл. кана-М1цин - 5 мкг/мл, м1том1щш - 0,05 мкг/мл, рифамтцин - 3 мкг/ мл.

У робот! вккориетовувалн рестрикций ендонуклеазк вироб-ництва НВ0 "Фермент" ( Вяльнюс, Литва ) за умов, рекомендована виробниками ферментёв.

Трансформац1ю кошетентних юптин B.subtilis здёйснювали за модифакованим методом Анагностопулоса i Сп1цзйзена (Прозоров, 1980).

Одержання препаратов ДНК. Хрсмосомну ДНК B.subtilis одер-жували за модифёкованкм методом Kipôi (Прозороз, 1980) та методом м1к1-екотрачц1й (за курсами ЕМВ0). Плагм^ну ДКК is K_2i-ткн B.subtilis одержували методом лужноё денатурацП Б1рнбокма i Дол! (Birnboim, Doly, 1979).

Рестрикц1ю здпюнюваяи, як зазначено (Маниатис, 1984).

Електрофорез ДКК проводили у горизонтальних пластинках 0,8 агарози у трис-ацетатному буфер! протягом 16 годин за к1мнатно'1 температурп. В1зуал1ззц1ю смуг у гeлi зд1йснювали шляхом забарвлення розчином бромистого етщцю ( 1,5 мкг/мл ). Фотографували на ультрэ$1олетов^ ламп1 через оранжевий ф1льтр на шпвку Miкрат 200.

ДНК - мутагенез здёйснювали за ыодиф!кованою методикою (Карпова и др., 1994).

Дот- i блот-г1бриднзац1я. Перенесения ДНК на н1троцелю-

лозн1 ф1льтри зд!йснювали за методом Стта i Саммерса ( Smith, Summers, I960). Г!бридизац!ю ДНК is м1ченою пробою проводили у пол1етиленових пакетах за загальноприйнятою методикою ( Маниа-тис и др., 1984).

РЕЗУЛЬТАТ!! ДОСУПДЖЕНЬ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ

ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНЕТИЧНО! НЕСТАБ1ЛЬН0СТ1, СПРИЧИНЕНО!

Д16Ю СУМАРНОГО ПРЕПАРАТУ ЧУЖ0Р1ДН01 ДНК

5м1на прояву нестабЬтьност! з часом у лейцинзалежного ауксотрофа Leu 5-3

Объектом досл1дження був представник групи нестаб1льних лейцинових ьг/TSHTiB, спричинених Д1ею комерц!йного препарату еукар!отично! ДНК (ДНК оселедця) (Карпова И.О., 1979).

Головною особливштю лейциноЕого ауксотрофа Leu 5-3 була надзвичайно Еисока частота ревертування, яка на дев"ять поряд-к!в перевив/вала частоту ревертування батьивського штаму. У nepsiCHoro мутанта частота вар1ювала в1д клону до клону за середнього значения 54,5 Надзвичайно високу частоту ревертування, що сягав десятк1в BiflcoTKiB, описано для вищих рослин на прикладд антоц!ановз1Х nirMeHTiB.I! пояснвють !нсерц1бю контро-люючого елемента не до структурного гена,а до регуляторно! зо-ни,що призводить до прояву/непрояву гена на piBHi транскрипц!! (Fincharn J.R.S,, 1973). У рослпн варивали posMip та iHTeHCim-н!сть забарвдення плям.У нестабильного дейцинвалежного ауксотрофа Leu 5-3 варивали posMip колон!й ревертант!в, моза!чн!сть !х складу, чутливють до лейцину.

Шсля зберагакня культури впродовж трпвалого часу прояви

неста51льност1 пом1тко зм1нпллсь, а саме: частота ревертування зменшилась до 20-25 динатка ревертування зм!нилась так, що процес формування ревертант1в в1дбувався не 72 годлни, а три-вав до 96 годин ( рис.1 ). Явище змгни прояв1в нестаб1лъност1 ауксотрофносй вхдоме для штзше сальмонелл, що м1стять при-родний моб1льний генетичнкй елемент(Зт1Ь-Кеагу Р. Г. ,1972).

(4 Еч о Е* о

га

Ш

2* *! гг г* 72 2* а 96

тривал1сть шкубацП, години

г* ж ы

%* Ш

Ж

30

Рис.1. Розпод1л ревертактхв у рсзс1вах окремих клон1в лейциновсго ауксотрофа Ьеи 5-3 за часом и: формування на селективному середовншд: а - п!сля вид1лення мутачт1в; б - теля трпвалого збер1гання; 1-5 - номери клон1в

Дослпдження впдиву температури на прояв нестаб1дьнос.т1

BiflOMO, шр температурний стрес може впливати на прояви генетично! нестаб1льност1.

Бивчення впливу температури на прояв нестаб1льност1 лей-цинового мутанта Leu 5-3 показало, що пом1рне тдвищення температури iHKyöaiii'i до-45° С не впливало на виживання за умов повноцшного середовища. Проте на селективному середовищ без лейцину, а особливо ie лейцином, спостерхгали значне зниження частоти ревертування (рис.2). Це можна пов'язати is активности фермент1в, якл причетно до б1осинтезу лейцину.

Нетривале прогроЕаннл протягом 30 хв за температури 75°С, яке авичайно використовують для одержання спор ciHHoi палички, стимулювало масовий перехо.д фактора нестаб1льнос.т1 ie лейцино-вого до триптофанового оперона (Leu"^ Leu+Trp~) (рис.3).

б

^ 120 <о

'S 100

х я

а а> я а> а,

<й

S 40 t< о л V

80

60

20

I

I.

12 3 номери дослав

Рис.2. Вплив зм1ни температури на характер ревертування лейцинзалежного мутанта Leu 5-3 на середовшц без лейцину (а) та з лейцинам (б); [" I- 37°С; 45°0

- Q -

^Leü^

Прогрёвання 75°С, 30 хв

Витримування 3?°C, 20 год

98,7 %

0,94 %

0,35 %

Рис.з. Умови перемщення нестабёльно! муташл i3 ленцинового до триптофзнового оперона

Триптофанзалежн! ауксотрофи морфологёчио вёдрёзнялись вёд вих1ДНого батьк1вського мутанта Leu 5-3. При "ix posciBi спосте-рёгали появу видимих мозшчних колонёй, а також "ревертантёв" до вшадного типу (Leu+Trp"-^-Leuд).

Отже, за дИ високо! температури в потомствё нестабз.льно-го мутанта спостерёгали одночасне поеднання двох або бхльше мутащнннх подёй.

- 10 -

Транспозищйн! мутацП та ixHi особливост1

Шсля переыщення нестабильно! мутащ! is лейцинового до триптофанового оперона опостер1гали нестаб1льн1сть, яка за характером в!др1знялась вгд нестаб!льност1 вихлдного мутанта Leu 5-3. HecTaöiabHicTb триптофанзалежних пох1ДНих проявлялась на повнощ иному середовщ! (виникнення нових прямих стаб!льних i нестаб1льних мутащй, багато is яких формують моза!чн1 коло-Hi!) (табл.1). Також спостер1гали появу видимих мутант1в, у

Таблиця 1

Фенотипи i стаб!льн1с.ть ауксотрофних мутащй, до внникають у потомств! Тгр~ ауксотрофа

Фенотип К!льк1сть Доазпджено Ревертанти Hosi мутант1в, субклон!в до феноти- аук-п-ЗЭ/1488 пу Тгр_,% сот--рофи,

вщцлено вивчено %

Trp~Nic" 12 о fw 1630 1,7 1,4

Trp'Leu" 2 179 0 1,7

Trp~Met~ 2 о 190 0 2,7

Тгр'Суз"(Met-) g 2 205 7,0 0

Trp'Cys^Met*) 1 1 311 0 2,3

Тгр"А1а"д 1 1 112 0 0,9

Trp'Nic'Met1 1 1 135 Ci r.l 6,7

Trp~Met~Thr~ 1 1 130 75,4 1,5

Trp'Pur'Vit* 1 1 436 61,9 8,9

Не 1дентиф1кован1 16

Примхтка: Vit - сушш водорозчинних в!таш.н1в,П10 стимулюе piCT;

Pur - piCT на аденШ або ryaHiHi;

- - неповний ауксотроф;

Д - нестз6!льн!сть за типом мутацп Leu 5-3.

яких були BMiHGHi: форма i posMip колон!й,будова i густина по-верхн1,забарвлення 1 деяк1 iHmi ознаки. Внасл1док пошуклв най-складнших нестаб1дьних мутант!в було знайдено алан1нового ауксотрофа (рис.4), який повднуЕав у co6i два вкщг згадаш ти-пи нест-аб1льност1: високу частоту ревертування за селективних умов, яка за характером нагадувала ревертаб1льн1сть вих!дного штаму Leu 5-3;здатн!сть давати прям! ауксотрофт та видит му-тацП за неселектиЕних умов, як у триптофаноЕих аукс-отроф1в.

Тгр~А1а~

—Гпр"А1а"Х

Рис.4.

Схема перетворення нестаб1льно1 мутацп в екс-периментальк1й систем! генетшно! нестабШнос-Ti лейцинзалежного ауксотрофа Leu 5-3

Зазначенё особливостё можна пояснити,припустивши,щр фактор не-стабёльностё внаслёдок тривалого зберёгання, пересёвання, температурного стресу, еберёгши здатнёсть до ёндукування високо'ё ревертабёльностё в межах лещинового оперона,набув властивёсть викликати мутацё: у рёзних локусах, вёддалених один вёд одного. Можливо, внаслёдок таких перемёщень фактор нестабёльностё сам зазнае якёсних змён.

Впд]щ системи загадьно! рекомбёкацёё на прояв нестабёльностё

Спёльною властивёстю scix вёдомих прикладёв генетичноё нестабёльностё, спричинених юбёльними генетичними елементами, в незалежнёсть Бёд функцёонування системи загально! рекомбёка-Ц11, а сзме гена гесЕ, продукт якого у В. subtilis s аналогом Ree-А бёлка E.coli.

Введения до генома нестабёльного аланiнового ауксотрофа мутацё'1 гесЕ4 не спричинило зниження рёвня його двонаправленод мутабёльностё як стосовно ревертування, так i щрдо прямого му-тування ( табл.2 ). Очевидно, реалёзацёя генетично! нестабёль-hoctI дослёджуваного мутанта не пов'язана is активности гена гесЕ4.

Генетична нестабёльнёсть за плазмёдними маркерами

Для видёлення транспозоноподёбних елементёв дотримуються загальнопршшято! схеми, коли до клётини вводить плазмёду-мё-шень i3 Kiль.кома маркерами стёйкостё до антибёотикёв i за ёнактивацёею одного ёз маркерёв проводять селекдёю структур,що включили транспозон (транспозоноподёбну структуру).

Таблица 2

Частота прямих ауксотрофних мутащй у потомств! нестабильного штаму до 1 теля введения маркера гесЕ4

Штам

п- I (гес.+) п- I (гесЕ4)

Клон Доойд- Кдльк1сть Частота Клон Досл1д- К1льк1сть Частота

жено мутанйв мутан - жено мутантов мутан-

субкло- Т1В, * субкло- т1в, %

н1в н!в

1 1368 170 1С л а 345 21 6,1

2 103 1 1,0 Г) 287 1 0,4

О О 621 5 0,8 О 1191 34 2,9

4 878 38 4,3 4 936 о 0,2

с и 830 15 1,8 с 1687 51 3,0

6 3569 37 1,0 6 98 19 19,2

Середня частота мутант1в 3.55+1.9 5,3+3,0

Р<0,95

1з метою видхлення фактора нестаб1льност1 ми ввели до не-стаб1льних штам1в не!нтегративну стаф1лококову плагм!ду рВВБ4 ( СтГКтГ ), спод1ваючись на перех!д фактора нестабШност1 на плазм!ду.1з частотою близько 5 % ми отримали плзгшдних транс-формант!з 1з 1нактивованим маркером стяйкост! до канат цнну (СтгКпг). Проте при розс1вах цих трансформант 1 в з*ясувалось,зцр вони набулд нестаб1льност1 за плазм1дними маркерами. У деяких випадках плазм1дна нестаб1льтс.ть повднувалась ¿з новою аук-сотрофн1стю за хромосомними маркерами. Електрофоретичне дослл-дження препарамв плззшдяо! ДНК,влд1лених 1з цих мутант1в,по-

казало наявн1сть поряд is плазкйдною ДНК, високомолекулярно! ДНК. Рестриктний аиал1з i блот-габридизащя показали, що дослужена високомолекулярна ДНК нагадуе хромосомну посл1дов-Н1сть 1з невеликими фрагментами ДНК плазм1дного походження.

Анайзуючи одержан! результата, можна прилустити, що фактор нестаб!льн1ст1 В1др!зняёться в1д класичних транспозонiв тим, що щэ перебувае у стан1 формуЕання i не мае еволшДйно закр1пленого механ!зму транспозиц1!. Це може бути пов'язане з тим, що неста61льн!сть цього типу спричинена фрагментом еука-pi0TH4H0'i ДНК, яка штегрувала до бактериального генома.

Р03Р0БЛЕННЯ ЕКСПЕРШ.ЕНТАЛЬНГ) I СИСТОЛИ ГЕНЕТИЧН01 НЕСТА-Б1ЛЬНОСТ1 3 ВЖЗРИСТАННЯМ РЕКОМЕIНАНТНИХ ДНК

Пор1вняльна оц!нка мутагенност! рекомб!нзнтнкх плазм!д

Друга частика роботи присвячена моделюванню явища гене-тично! нестаб!льност1 з використанням вадомих еукар1отичнкх поол1довностей у оклад! рекомб1нантних плазм!д.Було використа-но 9 imasMifl E.coli загального походження, якл р!знились м1ж собою розм!рами та як1стю клонованого фрагмента, i3 них три векторы! (pBR322,pUCIS i pUC19) i 6 рекомб!кантних is вставками : Alu-повтору генома людини (pALl) , гена !нсул1ну людини ( pBR322ins, pBR322insN ), Alu-повтору i гена !нсул1ну людини (pAins), Alu-повтору i гена алал1попроте!ну людини anoAl (pWT) та ще ARS-n0CJifi0BH0CTi кукурудзи ( рА401 ) (рис.5). Мутагенну aKTHBHicTb рекомб!нантних плазм1д визначали за частотою шдук-д!'1 ауксотрофних мутант!в.

Серед комерщйних плазмхд мутагенний' ефект проявляла рВН322, тод1 як. мутагешпсть у вшадку дП риС18 та р11С19 дос-тов1рно не перевищувала спонтанний (рис.5). Немутагенними вия-вшшсь таксис 1 дв! пох!дн! рВР322 - рВК322!пз та рВК322!пзМ.

3,0

2,8

2,6

2,4

2,2

2,0

1,8

1,6

1.4

1.2

« 1,0 со

н °-8

| 0.6 3.

га 0,4 о 0,2

1

а

а

шш

Контроль

▲ ▲ ▲ ▲▲▲ АЛ

Рис.5. Мутагенна актившс-ть рекомб1нзнтних плаз-тд у трансформащйн1й систем! В. бцЫпИб [ I- 50 мкг/мл I- 100 мкг/'мл

у

Чотири похёднё pUC'18, якё у сво1й структурё несуть Alu-повтор людини сам, чи у поБднзннё ёз ёншиыи генами еукарёотёв ( pALl, pWT, pAins, pA401), проявляли високу мутагенну активность. Серед них наймутагеннёшою була рекомбёнантна плазмёда pWT.

Мутагенну активнёсть рекомбёнантних плазмёд E.coli можна пояснити 1ХНЬою' ёнтеграцёБЮ до хромосоми ciHHo'i палички, оскё-льки в1домо, що еони не реплёкуються у цёй системё.

Рекомбёнантнё плазмёди, що проявляли високу мутагенну активность, рознились posMiром,природою вставки, але sei вони мали у сво1й структур! Alu-повтор, який е мобёльним генетичним елементом генома людини. Очевидно,AIи-побтор,який у геном! лю-динп е "гарячою точкою" рекомбёнацё!, може визначати ёнтегра-цёйнё можливостё рекомб1нантних молекул.

Бажливо було провести пошук ёнсерцёйних мутантов серед ауксотрофёв, одержаних внаслёдок д!о рекомбёнантних плазмёд.

Пошук ёнсерцёй серед ауксотрофних мутадёй, спричикених дёвю рекомбёнантних ДНК

Для вёдбору потенцёиних ёнтегрантёв як зонд використали мёчену ДНК плазмёди рА401, яка мала в сво!й структур! всё до-слёджуванё типи полёнуклеотидних вставок.

Було перевёрено 57 мутантних кдонёв, видёлених у дослёдних пробах, ё 3 мутанти, що спонтанно виникли у контролё (рис.6а). За результатами дот-гёбридизацё! видно, що ёз зондом гёбриди-зувалась ДНК 8 з ЕО мутантёв, ёндукованих нативною плазмёдою

г д

Е

1 23 45 6789 10 11 12

А *

Б ' »

у®

В - * $ 0 • ' # , *

»

1 2 3 4 5 6

. *

9

п

Рис.6. Пошук 1нсерц1йни>: мутант1в ва допомогою дот-г!б-ридизацп:

а - масовии скршпнг ДНК мутантних клон1в,одержа-них за допомогою ДНК рекомб1нантних плазшд : рЭТ (А1- БЗ); рШУЕссИ (Б9-В5) ;рА401 (Б7-Г7); рА401/'ЕсоР1 (Г8-Д9);спонтанн! мутантп у конт-рол1 (Д10-Д12); Е-негативний контроль ДНК фагу \ 1

б - 1дентнф1кац1я вставки чужор1дно1 ДНК за доломогою зощце, м1чених по (32р) dATP : 1-пол1-нуклеотидна посл!довн1сть А1и-повтору людини, ¡Ызольованого гена апол1попроте!ну А1 людини: А1-Б6,Г1-Дб - ДНК мутантних клон1в; В,Е -контрольн1 проби ( В1-ВЗ - ДНК А1и-ловтору у розведеннях; В5,Е5 - ДНК фагу X; В6, Е5 - ДНК плззмхди рА401 ; Е1-ЕЗ - посл1довн1сть гена алоА1 у розведеннях)

>

Р'аТ, 1 3 в 10 мутант!в, 1ндукованих л1н1йною формою щео плаз-м!ди. 1з 27 мутант!в, одержаних за допомогою нативно! ( 13 ) 1 л1н1йно'1 ДНК плазмз.ди рА401, лише один клон зв'язався з моткою. Цо дат ов1дчать на користь онтеграцо! рекомб1нантно! ДНК або П фрагмента до хромосоми сонно! палички. Той факт, що лише 12 1з 57 ауксотрофних мутант!в (21 %) виявплись онтегрэнтами, це потребуе пояснения.

1з метою з'ясування природи ¿нтегрованих нуклеотидних по-слодовностей ДНК 12 виявлених "онтегрантав" г1бридизувалн 1з ¿зольованими посл1довностями А1и-повтору генома людини а гена ажш попрете! ну апоА1 людини. Як видно оз рис.66, 3 клони гоб-рцдизувались 1з послодовн1стю А1и-повтору, а 2 Ипаих - 1г по-сл1довн1стю гена апоА1. У «одному вяпадку ми не спостер1гали онтегращ! усов! рекомб!нактно! молекули у геном рецппоента. Решта 7 клотв, певно,мостили вставку векторно! частини конст-рукцой.

Використання бактероально! модел1 давало можливость про-сте^шти за долею единичного А1и-повтору генома людини 1 Еста-новити ймов1рность його решпкацП, тракспозипо! чи елом1нащ! ва умов гетеролог1чного оточення.

3 огляду на високу частоту ревертування ( в1д 1,6 'Ю-'-"5 -3,2 'Ю-4 до 5 • Ю-4 - 1 'Ю-5),а також зростання частоти пря-мих ауксотрофних мутантов (яка досягала 2,5 - 3,4 £), вс! три А1и-1нтегранти еиявляли двонаправлену нестаболъность. Треба зазначити, що спектр як первинного, так 1 вторинного мутагенезу обмежувався чотирма основнимп фенотипами (Азр~- аспараг!нова кислота; iiv-- 1золепцин-вал1н; ОггГ - орнз.тин; ТЬг-- трео-нон).

Модекулярно-генетична характеристика нестабильность спричинено! iHcepiilero Alu-повтору генома двдини

Для детальншого вивченяя було в1д1брано 1нсерд1йного мутанта Alu-ЗЗ з новою ауксотрофн1стю по !золейцину-вад1ну (Lys-Ilv~).

Анаиз складу колон1й ревертант!в цього штаму показав, ¡до вони s псевдоревертантами-моза!ками, якi складаються !з двох основних TîiniB кл!тин : первинного ауксотрофного фенотипу С Lys-Ilv- ) та зм1неного фенотипу, де реверс!я по !золейцину-вал1ну поБднувалась !з появою ауксотрофностД по acnapariHOBiiï кислой ( Lys_Ilv+Asp~).

Використовуючи г1бридизащю по Саузерну були досл!джен! OGHOBHi типи колон1й,що виникають у потомств! iHcepiiifffioro мутанта за умов повнощнного i мШмального середовшца. Як зонд використовували ДНК плазм!ди pAL'l, шр м1стить Al и-повтор генома людини.

Елот-г1бриднзад1я хромосомно! ДНК,внд!лено! i3 клотз, щр виросли на повнощнному середовищ, в ycix випадках показала наявн1сть двох зон гДбридизац!! (рис.7, а-в). Анал1з матер1алу клонiв псевдоревертант1в показав, появу додаткових зон г!бриди-задд! (рис.7, г-е). Зв'язування м1ченого зонду is хромосомою в ycix випадках се!дчить про збереження антегровакого повтору в ход1 репл1кац1!,а поява додаткових зон г1бридизацП у pasi ви-користання селективного середовища може бути насл!дком перемД-щення Alu-повтору генома людини. Отже, фенотипов! вiдмihhogтi колон!й за ауксотрофтстю аб1гапться !з даними денситометр!! рад!оавтограф!в ДНК,вид!лено! i3 клон1В вгайдного !нсерц1йного мутанта i похгдних в1д нього псевдоревертантДв.

Б1дстань, мм

Рис.7. Результата денситометрп радюавтограф1в, одержаних теля Г1бридиващ.1 по Саузерну хромосомно"! ДНК, вндз.лено1 Дз субклотв шеерщйного мутанта В. subt.il Дб (а-в) та його нащадга.в, сформованих на селективному середовищ1 (г-е)

Таким чином, можна тдеумувати, що обидв! досл1джен1 нами системи генетично! нестаб1льност1, маючи м1ж собою стльт ри-си, в1др1зняються в1д вхдомих природних та Андукованих неста-б1льннх мутантхв прокар1от1в. 0собливост1 досл1джувано1 неста-бiльнocтi лог1чно пов'язати 1з тим,що вони буди cпpичинeнi дД-ею екзогенно! ДНК еукарДотичного походження, яка на 60-80 збагачена повторюваними посл1довностями р1зних клас1в. Це тд-тверджувться фактом внеоко! мутагенностД рекомб1нантних плаз-мДд,що мають у своему склад1 А1и-повтор генома людини. Очевидно,що мутагенна активн1сть 1, пов'язана з нею,генетична неста-б1льтсть визначавться певйими полхнуклеотидними посл1довнос-тями, якх здатн1 1нтегрувати до бактериального генома за механизмом незаконно! рекомбшаци.

ЕИСНОВКИ

1.Охарактеризовано систему генетично! нестаб1льност1 лей-цинзалежного мутанта Bacillus subtilis Leu 5-3, спричине-ного дёею сумарного препарату еукар1отично! ДНК (оселед-ця).

2.Одержано сукупшсть даних, якл свёдчать про наявнёсть у нестабёльного лейцинзалежного мутанта Leu 5-3 транспозо-нопод1бно"1 структури: SMiKa частоти та спектру мутагенезу у чао1;вплив температури на ревертаб1льн1сть i трзнспози-щпн!сть; одночасне повднання двох або бёльше мутащйних подin; транопсзищшпсть мутавдй; гес-незалежшш характер прояву генетично"! нестаб1льност1.

3.Створено контролъовану експериментальну систему генетично! нестабёльностё Bacillus subtilis, 1ндуктором якоЗ е рекомб1нантнЗ плазмёди, що м!стять еукар!отичн1 гени.

4.Показано,що мутагенна активтсть рекомбёнантних конструкций залежить в1д ЗхньоЗ структури, зокрема наявностё Alu-повтору генома людини.

Б.Продемонстровано ёнсерщйну природу мутащй у Bacillus subtilis, спричинених Д15Ю ДНК рекомбёнантних плазм!д, що м1стять eyKapiOTi!4Hi посл1довност1.

б,Одержано npHMi докази на вористь участ! мобьтьного еле-мента людини у виникнешй генетично! нестаб1льност1 у Bacillus subtilis: ёнсерщйна природа;варёабельнёсть вставки у подалысих поколённях; факт транспозищ!.

СПИСОК РОБ1Т, ОПУЕЛ1КОВАНИХ ЗА TEt^GSO ДИСЕРТАЦП

1.Карпова И.С., Пидпала О-В. Проявления нестабильности у лей-цинзависимого ауксотрофа Bacillus subtilis, полученного с помощью ДНК сельди //Цитология и генетика.- 1986,- 20, N1.-С.40-46.

2.Карпова И. С., Пидпала О.В. Нестабильность и транспозиции мутации, индуцированной у сенной палочки с помощью чужеродной ДНК.-Тезисы VI Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 1987 .- С.164-165.

3-Karpova I.S., Pidpala O.V. Instability in Bacillus subtilis which involves chromosomal and plasmid markers // XVI th International Congress of Genetics, Toronto, 1988.- P.425.

4.Пидпала O.B., Карпова И.С. Транспозиция нестабильной мутации сенной палочки, полученной с помощью чужеродной ДНК // Докл. АН УССР, Серия "Б".- 1989, N 9.- С.78-80.

5.Карпова И.С., Пидпала О.В. Генетическая нестабильность у Bacillus subtilis, индуцируемая чужеродной ДНК // Мутагенное действие природных и синтетических полинуклеотидов. - Киев: Наук, думка, 1990.- С.43-71.

6.Карпова И.С., Пидпала O.B. Нес-независимая нестабильность у Bacillus subtilis.- Тезисы VII Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов " , Москва, 1990.-С.225.

7.Карпова И.С., Пидпала О.В. йес-независимая нестабильность у Bacillus subtilis // Биополимеры и клетка.- 1991. - 7, N 2.-С.15-19.

В.Карпова И.С.,Пидпала О.В.,Шульженко И.Н., Костецкий И.Е.,Ко-рецкая Н.В.,Лукаш Л.Л.Мутагенная активность ДНК рекомбинант-ных плазмид в компетентной культуре Bacillus subtilis // Цитология и генетика.- 1994.- 28, N 1.- С.66-73.

АННОТАЦИЯ

Пидпала O.B. ДНК-индуцированная генетическая нестабильность у Bacillus subtiiis и ее особенности.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.26 - молекулярная генетика.

Институт молекулярной биологии и генетики HAH Украины, Киев, 1997.

Защищаются 5 научных работ, которые содержат результаты исследований по изучению ДНК-индуцированной генетической нестабильности у Bacillus subtiiis. Показано, что чужеродная ДНК эукзрнстического происхождения ( коммерческий препарат, либо фрагменты, клонированные в составе рекомбшэнтных плазмид) может вызывать у В.subtiiis генетическую нестабильно-сть.Установлено, что исследуемая система генетической нестабильности имеет общие черты о некоторыми известными нестабильными системами зукзриот и прокариот. С помощью метода блог-гибридизации выявлено, что в геном ряда генетически нестабильных мутантов произошла встройка Alu-повтора. Обнаружено, что Alu-повтор генома человека сохраняется в составе бактериального генома и может при этом изменять свою локализацию. Предполагается, что исследуемые ДНК-мутагенез и генетическая нестабильность связаны с присутствием определенных полинуклеотпдкых последовательностей, очевидно повторами,которые способствуют незаконной ре-комбинацш между негомологичными последовательностями ДНК.

SUMMARY

Pidpala 0.V. DNA-induced genetic instability in Bacillus subtilis and its peculiarities.

The Candidate Thesis for a Philosophy Doctor degree in speciality 03.00.26 - molecular genetics.

Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Science of the Ukraine, Kyiv. 1997.

5 scientific publications, which contain results of the investigation of DNA-induced genetic instability in Bacillus subtilis are presented. Genetic, instability in B.subtilis induced by foreign DNA of eukariotic origin (commercial preparation or fragments being cloned in recombinant plasmids) was investigated.lt has. been shown that the similarity of genetic instability under study with some known eukariotic and proka-riotic genetic instability systems occurs. Data obtained by blot-hybridisation demonstrated the Alu-repeat insertion in some geneticaly instable mutants.It was shown that Alu-repeat of the human genom remains in the bacterial genome and can change its location there. Df!A-rnut.3genic activity and genetic instability under study are supposed to be connected with particular polynucleotide sequences, presumably repeats which stimulate illegitimate recombination between nonhomologous sequences.

Ключав1 слова: ДНК-мутагенез, рекомб1кантн1 плазм!ди, ге-нетична нестаб1льн1сть, iHcepijiiiHi мутацп, транспозицп, Alu-повтор генома людини.