Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дивинилэфирсинтаза CYP74B16 листьев льна

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Дивинилэфирсинтаза CYP74B16 листьев льна"

На правах рукописи

Горина Светлана Сергеевна

ДИВИНИЛЭФИРСИНТАЗА СУР74В16 ЛИСТЬЕВ ЛЬНА: ОБНАРУЖЕНИЕ, МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ И СВОЙСТВА

03.01.05 — физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 8 АПР 2013

Казань-2013

005057756

Работа выполнена в лаборатории оксилипинов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук (КИББ КазНЦ РАН)

Научный руководитель: академик РАН,

директор института КИББ КазНЦ РАН Александр Николаевич Гречкин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент

руководитель группы ИФР им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва Ирина Васильевна Голденкова-Павлова

доктор биологических наук, заведующий лабораторией КИББ КазНЦ РАН, г. Казань Фарида Вилевна Минибаева

Ведущая организация: Федеральное государственное автономное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) Федеральный Университет», г. Казань

Защита состоится 25 апреля 2013 г. в II00 часов на заседании диссертационного совета Д002.005.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при КИББ КазНЦ РАН по адресу: 420111, г. Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31, а/я № 30, тел/факс (843)2927347, kibmail@mail.knc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Казанского научного центра РАН.

Автореферат разослан «22. » марта 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Анастасия Анатольевна Пономарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Постановка проблемы и ее актуальность. Липоксигеназный каскад является одной из важных сигнальных систем растений. В результате функционирования этого каскада происходит образование физиологически активных веществ - оксилипинов [Тарчевский, 2001]. Оксилипины обнаружены у животных, протеобактерий, бурых и красных водорослей, а также у всех наземных растений [Lee et al., 2008]. У высших растений они участвуют в регуляции роста, дифференцировке клеток, морфогенезе, органогенезе, а также в формировании устойчивости растений к различным биотическим и абиотическим стрессорам [Ttoh et al., 2002; Stumpe, Feussner, 2006]. Ключевыми ферментами липоксигеназного каскада, обеспечивающими разнообразие оксилипинов, являются липоксигеназы, катализирующие первую реакцию каскада — образование гидроперекисей жирных кислот, и ферменты уникального семейства CYP74 цитохромов Р450, ответственные за их дальнейшее превращение. Семейство CYP74 включает три типа ферментов: алленоксидсинтазы (АОС) и дивинилэфирсинтазы (ДЭС), которые являются дегидразами, а также гидропероксидлиа-зы (ГПЛ), относящиеся к изомеразам. Множество неохарактеризованных генов ферментов CYP74 в геномах различных организмов свидетельствует о вероятности существования в данном семействе ферментов с другими типами катализа.

Ранее было показано, что в листьях льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) содержится значительное количество дивинилового эфира — (9Z, 1 \Е, 1 'Z,3'Z)-12-(1 ',3 гексадиенилокси)-9,11-додекадиеновой ((со52)-этероленовой) кислоты. Образование (m5Z)-этероленовой кислоты наблюдалось также in vitro в результате инкубации экзогенной 13-гидроперекиси а-линоленовой кислоты - (9Z,1 Щ13£, 152)-13-гидроперокси-(9,11,15)-октадекатриеновой кислоты (13-ГПОТ) - с экстрактом листьев льна [Chechetkin et al., 2008]. Однако до выполнения настоящей работы у льна был известен единственный представитель семейства CYP74 - алленоксидсинтаза LuAOS (GenBank: ААА03353.1), продуктом реакции которого является окись аллена, но не дивиниловый эфир [Song et al., 1993].

К настоящему времени изучено несколько десятков гидропероксидлиаз и алленоксид-синтаз. В то же время, клонировано только четыре гена, кодирующих дивинилэфирсинтазы [Itoh, Howe, 2001; Stumpe et al., 2001; Fammartino et al., 2007; Stumpe et al., 2008; Gullner et al., 2010]. Существует мнение, что ферменты этого класса не имеют широкого распространения в природе. Исследованные до сих пор рекомбинантные ДЭС синтезируют диви-ниловые эфиры, имеющие транс-двойные связи по обе стороны от эфирного мостика. Ни один из ферментов, синтезирующих дивиниловые эфиры с г/ис-двойной связью по одну сторону от эфирной связи, до сих пор изучен не был.

Цель и задачи исследования. Целью наших исследований явилось выявление и структурно-функциональная характеристика фермента, ответственного за синтез (ю5Z)-этероленовой кислоты в листьях льна-долгунца. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявление, характеристика и клонирование открытой рамки считывания гена, кодирующего фермент, ответственный за биосинтез (ш5.2Г)-этероленовой кислоты у льна-

долгунца.

2. Получение очищенного препарата функционально активного рекомбинантного фермента, ответственного за биосинтез (ш52)-этероленовой кислоты в растениях льна-долгунца.

3. Выяснение особенностей каталитического действия исследуемого фермента льна-долгунца. Определение субстратной специфичности и кинетических параметров катализа для данного фермента.

4. Характеристика структуры каталитически значимых доменов целевого фермента.

5. Определение вклада отдельных аминокислотных остатков в формирование типа катализа целевого фермента методом сайт-направленного мутагенеза: получение мутантных форм фермента и сравнение особенностей каталитического действия фермента дикого типа и его мутантных форм.

Научная новизна работы. Впервые выявлен ген дивинилэфирсинтазы ЬцБЕЯ льна-долгунца (Ыпит жИайьз'ипит Ь.) и клонирована его открытая рамка считывания. Получен очищенный препарат функционально активного рекомбинантного фермента. Предпочтительными субстратами фермента являются 13-гидроперекиси жирных кислот, что отличает его от ранее изученных дивинилэфирсинтаз.

1дЯ)Е8 идентифицирована как первый фермент СУР74В, гомологичный 13-гидропероксидлиазам подсемейства СУР74В и, вместе с тем, являющийся дивинилэфир-синтазой.

Впервые получена мутантная форма дивинилэфирсинтазы ШЭЕЗ Е292С. В отличие от ЬиЛЕЗ дикого типа, мутантная форма Е292С проявляла активность алленоксидсинтазы, а не дивинилэфирсинтазы. Тем самым продемонстрировано, что для определения типа катализа критически важным является не гомология ферментов СУР74, определяемая по общему сходству аминокислотных последовательностей, а тонкое строение отдельных консервативных доменов.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные расширяют знания о ферментах семейства СУР74 и вносят вклад в понимание функционирования липоксиге-назной сигнальной системы растений, способствующей их адаптации к неблагоприятным условиям.

Применение разработанной технологии получения и очистки цитохромов растений, основанной на использовании различных систем экспрессии рекомбинантных генов, дает возможность получения препаративных количеств рекомбинантных белков для последующего использования в промышленности, часто ограниченного низкой доступностью природных ферментов. Новые рекомбинантные ферменты с измененными каталитическими свойствами могут быть использованы для создания генетически модифицированных растений, удовлетворяющих требованиям современного сельскохозяйственного производства и стать основой инновационных технологий переработки сырья с использованием биокатализаторов, в том числе иммобилизованных ферментов.

Расширение сведений о генах и белках одного семейства облегчает идентификацию и

характеристику новых представителей; кроме того, это позволяет усовершенствовать классификацию и проясняет эволюционное происхождение и значение при первоначальном появлении семейств ферментов и структурных белков. Полученные знания приближают нас к ответам на многие фундаментальные вопросы эволюции и экологии.

Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут использоваться в учреждениях медицинского, сельскохозяйственного, биологического и биотехнологического профилей, занимающихся получением рекомбинантных ферментов, исследованием взаимосвязи структуры и функций белков, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, физиологии растений, биотехнологии и молекулярной биологии в ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась с 2009 по 2013 гг. в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Липоксигеназы и цитохромы семейства CYP74: структура и роль в катализе биосинтеза оксилипинов - эндогенных биорегуляторов растений» (гос. регистрационный номер: 01200901959). Исследования автора, частично поддержаны грантами РФФИ № 09-04-00915-а, № 11-04-01601-а, МК-1439.2011.4, АНТ № 14-33/2011, государственными контрактами № 16.740.11.0197 и № 14.740.11.0797, атакже грантом ведущей научной школы НШ-825.2012.4. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на 13-ом ежегодном симпозиуме студентов-биологов Европы «SymBioSE 2009» (Казань, 2009); на 13-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009); на II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); на Российской школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии» (Казань, 2010); на V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010); на 36-ом конгрессе FEBS «Biochemistry for Tomorrow's Medicine» (Италия, Турин, 2011); на VII Съезде общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011); на V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011); на 3-ем Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011); на конгрессе FESPB и EPSO «Plant Biology Congress Freiburg 2012» (Германия, Фрайбург, 2012); а также на итоговых конференциях Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2010, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из них три статьи в отечественных и зарубежных рецензируемых изданиях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы, а

также приложения. В работе представлено 10 таблиц, 1 схема и 34 рисунка. Список литературы включает 204 источника; из них 196 — иностранных.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Растительный материал. Объектом исследований служили растения льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) сорта Новоторжский. Растения выращивали в течение 35 дней в открытом грунте при ежедневном поливе и естественном освещении. Для индукции экспрессии генов ферментов CYP74 растения инокулировали клетками штамма Pectobacte-rium atrosepticum SCRI1043, полученного из коллекции Белорусского государственного университета (г. Минск).

1.2. Определение последовательности и клонирование целевого гена. Тотальную РНК из листьев льна выделяли с помощью набора RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Германия). Полноразмерную двуцепочечную кДНК (дц-кДНК) получали с использованием коммерческого набора MINT (Евроген, Москва). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе DNAEngine (Bio-Rad, США). Все праймеры синтезировали в НПО «Сингол» (Москва). Для клонирования амплифицированной ДНК использовали вектор pGem-T Easy (Promega, США). Нуклеотидные последовательности ДНК определяли с помощью ДНК-анализатора 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems, США).

1.3. Модификация первичной структуры целевого фермента. Плазмидную ДНК выделяли с помощью набора AxyPrep Plasmid Miniprep Kit (Axygen, США) согласно протоколу производителя. Предварительный анализ ДНК проводили после ее электрофорети-ческого разделения в агарозных гелях с помощью системы Gel-Doc и пакета программ Quantity One (Bio-Rad, США). Для сайт-направленного мутагенеза целевого гена использовали ПЦР с модифицированными праймерами.

1.4. Получение рекомбинантных ферментов. Для экспрессии рекомбинантного гена использовали вектор рЕТ-32 Ek/LIC (Novagen, США), реципиентами которого служили клетки штаммов Е. coli NovaBlue и Tuner(DE3)pLysS (Novagen, США). Культуры клеток Е. coli выращивали в питательных средах М9 [Маниатис и др., 1984], SOC и Luria-Bertani [Гловер, 1988]. Компетентные клетки Е. coli для трансформации плазмидами получали с использованием ДМСО [Inoue et al, 1990]. Наработку целевого белка индуцировали добавлением в среду 0,5 мМ изопропил-р-тиогалактозида (ИПТГ).

Клеточные лизаты получали с использованием коммерческого стабилизирующего раствора BugBuster (Invitrogene, США). Очистку рекомбинантного белка проводили метал-лоаффинной хроматографией на колонках Bio-Scale Mini Profinity IMAC в хроматографи-ческой системе BioLogic LP (Bio-Rad, США). Целевой белок элюировали Na-фосфатным буфером (pH 7.5), содержащим ЗОмМ гистидина и 0.5 % 3-[(3-холамидопропил)диметиламмоний-]-1-пропансульфонат (ХАПС). Электрофорез белков проводили в денатурирующих условиях в полиакриламидном геле (ПААГ) по Лэмли [Ос-терман, 1981] в системе PowerPac Universal MiniProtean (Bio-Rad, США). Гели окрашивали Coomassie R250.

Ферментативную активность очищенных препаратов LuDES определяли по снижению оптического поглощения субстрата при 234 им, измеряемого с помощью спектрофотометра Lambda 25 (Perkin-Elmer, США). Кт и кса, рассчитывали с использованием пакета программ SigmaPlot 11 (Systat Software Inc., США).

1.5. Получепие субстратов для исследования каталитического действия целевых ферментов. Гидроперекиси жирных кислот получали инкубацией линолевой и а-линоленовой кислот с соевой и томатной липоксигеназами. Полученные в результате реакции гидроперекиси очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) на колонках с обращенной фазой Nucleosil 5 ODS (250x4.6 мм) (Macherey-Nagel, Германия), на колонках с нормальной фазой Separon SIX (150x3.2 мм; 5 мкм) (TESSEK Ltd, Чехия), на колонках дня хирально-фазовой ВЭЖХ Chiralcel OD-H и Chiralcel ОВ-Н (Daicel Chemical Industries Ltd., Япония).

1.6. Условия проведения и анализ продуктов реакций, катализируемых целевыми ферментами. Гидроперекись (3 мкМ) инкубировали с ферментом 15 мин при 20 °С в 10 мл 100 мМ Ыа-фосфатного буфера (рН 7.0). Реакционную смесь экстрагировали смесью гексана с этилацетатом (1:1) при комнатной температуре. Затем растворитель выпаривали, а продукты реакции растворяли в 1,5 мл метанола и восстанавливали, выдерживая в течение 30 минут в присутствии NaBH4. Восстановленные продукты метилировали диазомета-ном, после чего диазометан выпаривали, продукты растворяли в метаноле и гидрировали водородом над РЮ2. После удаления катализатора продукты высушивали и триметилсили-лировали. После упаривания силилирующей смеси продукты экстрагировали гексаном. Очистку продуктов проводили с помощью ВЭЖХ, после чего проводили их анализ методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) с помощью масс-спектрометра QP5050A, соединенного с газовым хроматографом GC-17A (Shimadzu, Япония).

1.7. Статистический анализ данных проводили с применением стандартных математических методов (расчет среднеквадратического отклонения, сравнение средних по критерию Стьюдента). Данные представлены в виде средних значений из 4 измерений в трех независимых биологических повторностях.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Выявление н клонирование последовательностей генов ранее не охарактеризованных ферментов CYP74 льна-долгунца

Обнаружение в листьях льна-долгунца дивинилового эфира - (м52)-этероленовой кислоты [Chechetkin et al., 2008] - позволило предположить, что ранее обнаруженная ал-леноксидсинтаза LuAOS [Song el al., 1993] является не единственным представителем CYP74 у данного растения. Недостаточный объем данных о геноме льна ограничивал возможности выявления гена фермента, отвечающего за синтез дивиниловых эфиров - диви-нилэфирсинтазы. В связи с этим, нами была предпринята попытка поиска и идентификации гена, кодирующего предполагаемую дивинилзфирсинтазу льна, по гомологичным последовательностям ДНК других растений.

Ключевым моментом исследования являлся выбор участков кодирующих последовательностей генов ферментов CYP74, которые отличались бы от последовательностей генов других цитохромов Р450, но, вместе с тем, были достаточно консервативными для генов семейства CYP74. В дальнейшем эти последовательности использовали при конструировании вырожденных праймеров для амплификации фрагментов целевых генов в ПЦР.

Для выбора праймируемых участков проводили сравнительный анализ аминокислотных последовательностей известных ферментов CYP74 разных видов растений. В зависимости от степени сходства аминокислотных последовательностей все ферменты разделили натри группы. В каждой группе выделяли и сравнивали каталитически важные домены, из которых наиболее консервативными оказались В'-спираль и ERR-триада. По их аминокислотным последовательностям с учетом частоты встречаемости кодонов у высших растений определили наиболее вероятные кодирующие нуклеотидные последовательности, на основе которых сконструировали три пары олигонуклеотидных праймеров.

Ферменты разделили на группы следующим образом. В первую группу (ДЭС) включили охарактеризованные к настоящему времени дивинилэфирсинтазы растений семейства пасленовых (Solanaceae). Праймеры LDF (gTCAAAATCAACATggCACC) и LDR (gl'1'lCCCTTCCATTAgACC) оказались строго комплементарны выбранным участкам генов данной группы. Вторую группу (ГШГ) составили гидропероксидлиазы люцерны (Medí-cago truncatuld), апельсина (Citrus sinensis), гуавы (Psidium guajavá), дыни (Cucumis meló), померанца (Citrus aurantium), поскольку по сравнению с другими гидропероксидлиазами эти ферменты обладают наибольшим сходством первичной структуры и субстратной специфичности с известными дивинилэфирсинтазами. На основе последовательностей кодирующих их генов сконструировали вырожденные праймеры LHF (gA(A/g)AAg(C/g)ACAAgAgCAC(g/C)gT(g/T)TTC) и LHR

(CA(T/A)Ag(A/C)A(g/A)CTC(C/g/A)CCTTTCTTg). Третья группа (АОС) включала алле-ноксидсинтазу льна (Linum usitatissimum, GenBank Ш: U00428.1) и гидропероксидлиазу тополя (Populus trichocarpa, GenBank Ш: EF145878), который среди растений с расшифрованным геномом оказался таксономически наиболее близким видом для льна. Считается, что у таксономически близких видов аминокислотные последовательности гомологичных белков обладают высокой степенью сходства даже при функциональной дивергенции (в данном случае проявляющейся в предполагаемом различии типов каталитической активности ферментов). На основе нуклеотидных последовательностей генов третьей группы сконструировали праймеры LAF (CCAACATgCC(T/A)CC(T/g/C)ggCCC(C/T/A)TTC) и LAR (gTCTC(A/C)(C/g)gC(T/C)C(A/g)TT(T/C)gACC). Сконструированные праймеры использовали для выявления последовательностей, гомологичных генам семейства CYP74, в библиотеке кДНК.

Тотальную РНК выделяли из листьев льна. За сутки до выделения РНК растения ино-кулировали суспензией клеток P. atrosepticum SCRI1043. На основе выделенной РНК получали библиотеку двуцепочечной кДНК с помощью реакции обратной транскрипции. Смесь кДНК использовали в качестве источника матрицы для гнездовой ПЦР с различны-

ми комбинациями праймеров.

При использовании вырожденных праймеров LAF-LAR (группа АОС) и LHF-LHR (группа ГПЛ) происходило образование продуктов реакции размером около 1000 п.н., что соответствует расчетной протяженности центральных областей генов CYP74 при их амплификации с используемыми праймерами. Полученные фрагменты клонировали в векторе pGem-T Easy (Promega, США), после чего определили их нуклеотидную последовательность. При использовании в ПЦР праймеров LDF-LDR (группа ДЭС) образование продуктов амплификации не происходило.

Последовательности фрагментов LHF-LHR имели высокую степень сходства с генами ферментов подсемейства CYP74B многих видов растений. Это подсемейство включает в себя 13-специфичные гидропероксидлиазы. До настоящего времени для льна не было описано ни одного представителя подсемейства CYP74B.

Следующим этапом определения структуры новых генов подсемейства CYP74B льна стала амплификация последовательностей 5 - и З'-концевых участков их кДНК методом RACE. Амплифицированные концевые участки клонировали и определяли их последовательности.

Известно, что цитохромы Р450 растений часто представлены множеством изоформ, кодируемых семействами генов. Поскольку клонированные нами 5'- и З'-фрагменты могли соответствовать генам разных изоформ, проводили дополнительный раунд амплификации полноразмерных кДНК, соответствующих транскриптам генов подсемейства CYP74B льна. Для этого использовали праймеры, комплементарные 5'- и З'-концевым участкам. Полученные ампликоны также клонировали с использованием вектора pGem-T Easy; их последовательности определили. На рис. 1 представлена полная последовательность одного из клонов гена подсемейства CYP74B льна, предварительно обозначенного нами как ген изоформы 1 фермента CYP74B.

Открытая рамка считывания (ОРС) данного гена размером 1419 п.о. ограничена стартовым и терминирующим кодонами ATG и TGA, соответственно. Полученная кДНК, соответствующая полпоразмерной мРНК, фланкировала 5'- и 3 '-нетранслируемыми областями и полиадениновой последовательностью, что типично для зрелой мРНК растений. Возле стартового кодона расположена последовательность Козака, распознаваемая рибосомами при инициации трансляции у эукариот [Lutcke el al., 1987]. Представленная последовательность содержит гуанин в положении +4, что характерно для мРНК высших растений. В положении -3 от предполагаемой ОРС находится консервативный тимин. Совокупность выявленных особенностей анализируемой последовательности позволила заключить, что полученная кДНК соответствует функциональному гену, кодирующему полипептид размером 473 аминокислотных остатка (рис. 1). Трансляция полученной нуклеотидной последовательности выявила наличие консервативных доменов, характерных для ферментов семейства CYP74, а именно - центрального домена I-спирали (I-helix central domain, IHCD), ERR-триады, PPV-домена и консервативного остатка цистеина.

семейству CYP74B и проявляет высокую степень сходства первичной структуры с 13-ГПЛ.

2.2. Получение рекомбинантного белка CYP74B16

Для получения рекомбинантного белка CYP74B16 ОРС соответствующего гена поместили в экспрессирующий вектор рЕТ-32 Ek/LIC (Novagen,CIIIA) методом безлигазного клонирования. Для наработки и очистки рекомбинантного фермента разработали оригинальную методику, составленную на основе нескольких протоколов.

Для разрушения ассоциации белка с фрагментами мембран бактерий и предотвращения его агрегации в растворах во всех процедурах выделения и очистки фермента CYP74B16 предусматривалось использование различных детергентов. Были испытаны различные концентрации Тритона Х-100 (0.3-1%), полиоксиэтилен-10-тридецил-эфира (ПОЭТЭ) (0.3-1%) и ХАПС (0.1-1%). Наилучшие результаты были достигнуты при использовании ХАПС в концентрации 0.5 %.

С использованием вектора рЕТ-32 Ek/LIC получили рекомбинантный белок, содержащий дополнительную последовательность из шести гистидинов на С-конце, что позволило провести очистку фермента с помощью металлоаффинной хроматографии. Осветленный центрифугированием лизат наносили на колонку Bio-Scale Mini Profinity IMAC (BioRad, США), уравновешенную 10 объемами буфера трис-HCl (рН 7.5, 50 мМ), содержащего 300 мМ NaCl и 0.5 % ХАПС. После нанесения лизата колонку промывали тем же буфером до достижения устойчивого минимума оптической плотности раствора при 280 нм. После этого колонку промывали Na-фосфатным буфером (рН 7.5, 50 мМ), содержащим 100 мМ NaCl и 3 мМ гистидина, для освобождения от неспецифически связанных белков. Целевой белок элюировали с колонки Ыа-фосфатным буфером (рН 7.5, 50 мМ), содержащим 100 мМ NaCl, 30 мМ гистидина и 0.5 % ХАПС, и концентрировали ультрафильтрацией через центрифужный фильтр AmiconUltra 50k (Millipore, США).

2.3. Исследование кинетики реакций, катализируемых рекомбинантным ферментом CYP74B16, с различными субстратами

На первом этапе исследования каталитических свойств рекомбинантного фермента CYP74B16 подбирали оптимальные условия проведения реакции. Для этого испытывали реакционные смеси с различными значениям рН (рис. 3). В результате установили, что рекомбинантный белок CYP74B16 проявляет каталитическую активность в широком диапазоне рН, с выраженным максимумом активности в слабощелочных условиях, при значениях рН от 7.5 до 8.0 (рис. 3). Дальнейшие исследования проводили при рН 7.5.

Каталитическую активность и субстратную специфичность фермента описывают константа каталитическая и константа Михаэлиса. Для построения графиков зависимостей начальных скоростей реакций от концентраций субстратов (9- и 13-гидроперекисей лино-левой (ГПОД) и а-линоленовой (ГПОТ) кислот) измерения проводили по 6-9 точкам. О превращении субстрата свидетельствовало постепенное снижение в ходе реакции характерного для гидроперекисей оптического поглощения при 234 нм в ходе реакции.

Рис. 3. Зависимость каталитической активности рекомбинантного фермента CYP74B16 от значения рН реакционной смеси. Белый треугольник — Иа-ацетатный буфер (рН 5.0); черные треугольники - Na-фосфатный буфер (рН 6.0-8.0); черные кружки - буфер трис-HCl (рН 7.5-8.5); белый кружок - буфер глицин-NaOH (рН 9.0).

Из полученных данных сделали вывод, что сродство рекомбинантного фермента CYP74B16 к (135)-ГПОТ значительно выше, чем к (136>ГПОД, (95)-ГПОД (табл. !) и (95)-ГПОТ (данные не представлены). В то же время, максимальную каталитическую активность рекомбинантный фермент CYP74B16 проявляет по отношению к (135)-ГПОД. Соотношение kcJKm свидетельствует, что 13-гидроперекиси а-линоленовой и линолевой кислот являются предпочтительными субстратами (табл. 1). Такие субстратные предпочтения характерны для большинства ГПЛ, относящихся к подсемейству CYP74B.

Таблица 1. Константы каталитические и константы Михаэлиса рекомбинантного фермента, рассчитанные для каждого субстрата с помощью пакета программ SigmaPlot 11 software (Systat Software Inc., USA).__

Субстрат Константа каталитическая, kcat (СЄК ) Константа Михаэлиса, Кт (мкмоль) KJ Km (сек^'мкмоль-1) Субстратная специфичность, %

(135)-ГПОТ 545.8±12.9 28.0±1.9 19.5 100

(135)-ГПОД 956.4±31.7 132.5±5.8 7.22 37

(95)-ГПОД 33.7±1.1 122.4+8.6 0.28 1.4

2.4. Идентификация рекомбинантного фермента CYP74B16 льна как дивинилэ-фирсинтазы нового типа

Для определения типа каталитической активности проводили характеристику продуктов превращения 13-гидроперекисей жирных кислот при участии рекомбинантного фермента CYP74B16. Продукты инкубации (135)-ГПОТ с рекомбинантным ферментом CYP74B16 переводили в триметилсилильные производные метиловых эфиров (Ме/ТМС) и подвергали анализу методом ГХ-МС (рис. 4).

Анализ выявил наличие одного преобладающего продукта, в спектре которого имеется молекулярный ион [М]+ при m/z 306. Его масс-спектр был идентичен спектру, описанному ранее для метилового эфира (со52)-этероленовой кислоты [Hamberg, 1998; Chechetkin et ai, 2008] и этероленовой кислоты [Grechkin et al., 1995]. Время удерживания основного продукта соответствовало таковому для (ш52)-этероленовой кислоты. Анализ продуктов

реакции в виде Ме/ТМС после восстановления боргидридом натрия и каталитического гидрирования выявил полностью гидрированный дивиниловый эфир - 13-оксанонадекановую кислоту (рис. 4) - и продукт фрагментации цепи - 12-гидрокси-додеканоевую кислоту (Ме/ТМС).

Соотношение 12-гидрокси-додеканоевой кислоты к гидрированному дивиниловому эфиру, определенное по интегрированию хроматограмм ГХ-МС, составляло 10:90. Дивиниловый эфир являлся преобладающим продуктом. Каких-либо продуктов алленоксидсин-тазной реакции в результате проведенных экспериментов обнаружено не было.

Образование С^-фрагмента может происходить двумя различными путями. Во-первых, дивиииловые эфиры могут подвергаться частичному кислотному гидролизу. Во-вторых, нельзя исключать, что фермент CYP74B16 может проявлять минорную гидропе-роксиддиазную активность наряду с дивинилэфирсинтазной. При участии ДЭС чеснока (Allium sativum), алленоксидсинтаз риса (Oryza sativa) и резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana) из (135)-ГПОТ также образуются небольшие количества 13-гидропероксидлиазных продуктов [Cho et al., 2010].

Метиловые эфиры продуктов реакции анализировали также с помощью ВЭЖХ. Анализ подтвердил присутствие одного основного продукта с максимумом поглощения в метаноле при 267 нм (рис. 5). Данное соединение очищали на обратной и нормальной фазах. Его дальнейшее исследование проводили методом ЯМР-спектрометрии. 'Н-ЯМР спектр исследуемого вещества оказался идентичным спектру (ю52)-этероленовой кислоты, полученному ранее [Chechetkin et al., 2008]. Таким образом, полученные данные позволили идентифицировать основной продукт преобразования (135)-ГПОТ как (ю52)-этероленовую кислоту, а фермент CYP74B16 - как дивинилэфирсинтазу.

А

Время удерживания, мин

7.5 ' ' ' 1Ö.Ö ' 1г.5 '

Рис. 4. Результат анализа продуктов инкубации рекомбинантного фермента CYP74B16 с 13-гидроперекисью а-линоленовой кислоты методом ГХ-МС: (А) хромато-грамма продуктов инкубации (Ме/ТМС) по полному ионному току (TIC), (Б) электронный масс-спектр метилового эфира основного продукта, (В) электронный масс-спектр метилового эфира основного продукта после каталитического гидрирования.

MsHPL (278)

ludes (ззо) ещщ^щ

As des <318} k3ctfa<33

(324)

(338) GV5gSftO)

<379) KWTíUiMEW-ji

(381) K^rJfiAHB^KP«'

(325) <347)

mshpl (337) ti

ludes

As DES LeDES

LeAOS3 (425)

LeAOSl (468)

LuAQS (470) CmHPL <413)

PgHPL (431)

MsHPL <423)

.............J

|KILs|TTGfl

2.5. Особенности первичной структуры и функции рекомбинантной LuDES

Как указывалось выше, структура LuDES имеет высокую степень сходства со структурами других членов подсемейства CYP74B (рис. 6). Однако ее последовательность имеет несколько уникальных аминокислотных замен, затрагивающих каталитически важные домены и субстрат-распознающие сайты [Gotoh, 1992]. Особое внимание было уделено строению домена IHCD, для которого ранее было показано первостепенное значение для определения типа катализа [Toporkova et al., 2008]. Как у всех ферментов подсемейства CYP74B, в первом сайте домена IHCD последовательности LuDES находится остаток лейцина (Leu-286) (рис. 6а, домен IHCD, положение 1). В следующем сайте находится остаток аланина, тогда как у всех остальных ферментов CYP74B в данном положении находится остаток глицина (рис. 6а, домен IHCD, положение 2). Непосредственно после домена IHCD, в положении 292, в последовательности LuDES находится остаток глу-таминовой кислоты. У всех алленоксидсинтаз и гидропероксидлиаз (в том числе подсемейства CYP74B) в этом положении находится консервативный остаток глицина (рис. 6а). У всех дивинилэфирсинтаз в данном положении остаток глицина замещен остатком другой аминокислоты (рис. 6а).

Еще одной особенностью LuDES является геометрическая специфичность образуемого дивинилового эфира - (со52)-этероленовой кислоты. Эта особенность объединяет LuDES с дивинилэфирсинтазами растений рода лютик (Ranunculus), которые также локализованы в листьях и предпочтительно утилизируют (135)-ГПОТ в качестве субстрата [Hamberg, 1998; 2002; 2004; 2005]. Синтез (ш57)-этероленовой кислоты и других подобных дивиниловых эфиров происходит у бурых водорослей рода ламинария (Laminaria) [Proteau, Gerwick, 1993], однако дивинилэфирсинтазы растений родов ламинария и лютик к настоящему моменту не были выделены, а кодирующие их гены не были клонированы и секве-

Рис. 6. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей каталитически важных доменов ферментов СУР74: (А) 1-спираль с доменом 1НСВ, пронумерованным 1-6, (Б) ЕШ1-триада, обозначенная символом ♦ и включающая РРУ-домен, обозначенный символом (В) гем-связывающий домен, включающий консервативный гем-связывающий лиганд - цистеин, обозначенный звездочкой.

ксильного радикала с гемовым железом). Второй стадией у АОС является отщепление атома водорода с образованием экзо-двойной связи при оксиране, т.о. синтезируется окись аллена. У ДЭС вторая стадия иная - гемолиз углерод-углеродной связи в оксиране с образованием винил-эфирного радикала. Третьим и заключительным этапом катализа является отщепление атома водорода от радикала с образованием второй двойной связи дивинило-вого эфира. Переключение между этими механизмами и является последствием мутации E292G (Схема 1).

Полученные результаты позволяют заключить, что сделанное нами предположение о роли домена IHCD в определении типа катализа CYP74 оказалось верным. Кроме того, подтвердились результаты сравнительного анализа первичной структуры цнтохромов CYP74, выявившие существенные аминокислотные остатки в определенных позициях.

На основании проведенных расчетов впервые была проведена конверсия дивинилэ-фирсинтазы в алленоксидсинтазу в результате единичной замены аминокислотного остатка. Этот результат вносит существенный вклад в представление об эволюции ферментов CYP74 и цитохромов Р450 в целом.

В то же время, следует признать, что наши знания о механизмах детерминации того или иного типа реакции являются неполными и исследования в этом направлении нуждаются в дальнейшем развитии. С учетом аналогичных данных, полученных ранее [Lee et al., 2008; Toporkova et al., 2008], существенной корректировке может быть подвергнута также классификация цитохромов Р450.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Количество исследованных ферментов CYP74 неуклонно возрастает. По мере накопления результатов структурно-функциональной характеристики ферментов CYP74 все явственнее становятся противоречия в существующей классификации семейства Первоначально все описанные ферменты CYP74 четко разделяли на четыре подсемейства: CYP74A, CYP74B, CYP74C и CYP74D [Itoh, Howe, 2001]. В последнее время появляется все большее количество ферментов CYP74, которые, согласно принятому критерию 55 % идентичности, не могут быть отнесены к описанным подсемействам. Примерами таких ферментов являются ДЭС чеснока, 9/13-ГПЛ однодольных, ферменты CYP74 фискомит-реллы {Physcomitrella patens) и растений семейства сосновые (Pinaceae). Обнаруженные недавно [Lee et al., 2008] ферменты коралла (Acropora palmate), ланцетника {Branchiostoma floridae) и трихоплакса (Trichoplax adhaerens), а также представителей рода метилобакте-рий (Methylobacterium), согласно принятому критерию 40 % идентичности, не являются членами семейства CYP74. В связи с этим Д. Нельсон счел целесообразным ввести понятие клана CYP74 [Nelson, Werck-Reichhart, 2011]. По данной классификации CYP74 являлся кланом, состоящим из единственного семейства [Nelson, Werck-Reichhart, 2011]. Однако недавно Д. Нельсон для ферментов протеобактерий и животных создал новые семейства (CYP440 - CYP444) [Nelson, 2013]. Автор отводит клану CYP74 одно из центральных мест в эволюции цитохромов Р450. При этом он полагает, что, возникнув у животных, гены

этих ферментов были перенесены в растения посредством метилобактерий. Соответственно разной эволюционной истории ферменты животных и растений отнесены к разным семействам. С такой позицией не согласны некоторые исследователи [Lee et al., 2008]. В своей работе они идентифицировали рекомбинантные ферменты коралла, ланцетника и представителей рода метилобактерия, как алленоксидсинтазу, эпоксиалкогольсинтазу и гидро-пероксидлиазу, соответственно. Ли с сотр. считают, что функциональное сходство не менее важно для классификации, чем идентичность последовательности. Эти авторы также ссылаются на прецедент обширного семейства CYP51, члены которого, принадлежащие представителям различных царств, имеют идентичность значительно менее 40 %. Таким образом, в настоящее время нет единства мнений относительно классификации CYP74.

Результаты настоящей работы показывают, что среди хорошо изученных подсемейств CYP74 могут появляться новые члены, гомологичные другим членам подсемейства и при этом радикально отличающиеся от них по типу катализа. Так, LuDES, относящаяся к подсемейству CYP74B по сходству первичной структуры, является ДЭС, в отличие от всех остальных изученных ферментов CYP74B, обладающих активностью 13-ГПЛ. Также как гены других представителей CYP74B, ген LuDES экспрессируется в листьях, и фермент предпочтительно использует 13-ГПОТ в качестве субстрата. Однако в отличие от ГПЛ, LuDES катализирует превращение 13-ГПОТ не в полуацеталь, а в (ш52)-этероленовую кислоту.

В соответствии с имеющимися в нашем распоряжении данными, нами было предпринято построение одного из возможных вариантов филогенетического древа клана CYP74. Первоначальный отбор последовательностей был проведен с помощью программы BLAST. В качестве референсной (внешней) последовательности использовали первичную структуру фермента CYP74 (GI: 170743950) метилотрофной бактерии (Methylobacterium sp. 4-46). Этот подход «наиболее удаленного предка» позволил нам построить филогенетическое древо, которое включало не только известные ферменты CYP74 растений, но и последовательности клана CYP74 протеобактерий и животных (рис. 9). Филогенетический анализ клана CYP74 показал, что члены подсемейства CYP74B наиболее близки к ферментам CYP74 голосеменных и членам клана CYP74 протеобактерий (Рис. 9). Этот результат в некоторой степени согласуется с тем фактом, что недавно описанный рекомбинантный фермент метилотрофной бактерии (Methylobacterium nodularis) - член клана CYP74 - был идентифицирован как 13-ГПЛ [Lee et al., 2008].

Недавние работы по сайт-направленному мутагенезу [Lee et al., 2008; Toporkova et al., 2008] показали, что единичные аминокислотные замены в некоторых каталитически важных сайтах могут привести к превращению АОС в ГПЛ, но не в ДЭС. В то же время, все проведенные замены в последовательности ГПЛ приводили исключительно к нарушению катализа. Исходя из этого, было сделано предположение, что гипотетический предковый фермент CYP74 мог обладать активностью ГПЛ.

Предполагалось, что с точки зрения молекулярной эволюции гидропероксидлиазная реакция для ферментов CYP74 является базовой, а алленоксидсинтазная и дивинилэфир-

аминокислотной последовательности с представителями подсемейства CYP74C. Таким образом, подсемейство CYP74D выделено лишь по функциональному признаку. Формально, CYP74C и CYP74D следовало бы рассматривать как единое подсемейство.

Круг секвенированных геномных последовательностей продолжает стремительно расширяться. При этом темп молекулярного клонирования и функционального изучения рекомбинантных белков все более отстает от темпа геномных исследований. Появляются новые подсемейства и даже семейства. Опыт настоящей работы показывает, что даже среди совершенно однородных подсемейств появляются ферменты (такие как LuDES (CYP74B16)) с каталитической функцией, принципиально отличной от той, которая может быть предсказана на основании сходства первичной структуры и другим формальным критериям классификации.

Можно было бы предположить, что ¿uDES является природным мутантом 13-ГПЛ. Хотя 13-ГПЛ льна до сих пор не изучена, проведенный нами анализ геномной базы данных льна выявил частичную последовательность (около 45 % полноразмерного представителя CYP74), которая по всем особенностям первичной структуры, в том числе каталитически важных сайтов, является типичной 13-ГПЛ (CYP74B). Эта последовательность имеет не более 76 % идентичности по отношению к LuDES. Таким образом, очевидно, LuDES является не мутантом, а паралогом до сих пор не изученной и не полностью секвенированной гидропероксидлиазы LuHPL льна. Таким образом, если превращение ГПЛ в ДЭС имело место, начавшись с дупликации гена и единичной мутации, оно продолжилось значительной модификацией первичной структуры, приведшей к закреплению приобретенного типа катализа.

LuDES - не единственная ДЭС, катализирующая образование (ш52Г)-этероленовой кислоты или родственных (ш52)-дивиниловых эфиров. Такие дивиниловые эфиры выявлены у трех видов бурых водорослей, а также двух видов рода лютик (Ranunculus). Сходный ди-виниловый эфир с (Z,^-бутадиеновым фрагментом был обнаружен также в красной водоросли полинейра (Polyneura latissima) [Grechkin, 2002]. Соответствующие дивинилэфир-синтазы остаются совершенно неизученными. Они могут оказаться либо ортологами LuDES, либо представителями других (возможно, новых) подсемейств CYP74.

ВЫВОДЫ

1. Методами биоинформатики выявлены консервативные последовательности генов семейства CYP74 цитохромов Р450 и разработаны универсальные праймеры для амплификации кДНК, соответствующих транскриптам данных генов.

2. Клонированы нуклеотидные последовательности, соответствующие трем полноразмерным мРНК генов подсемейства CYP74B, обнаруженным в транскриптоме растений льна (Linum usitatissimum L.), инокулированных клетками фитопатогенного штамма Pectobacterium atrosepticum SCRI1043. Получен очищенный препарат функционально активного рекомбинантного фермента CYP74B16 (GenBank ID: HQ286277.1).

3. Установлено, что предпочтительными субстратами рекомбинантного фермента

CYP74B16 являются 13-гидроперекиси а-линоленовой и линолевой кислот, продуктами превращения которых являются дивиниловые эфиры (®52)-этероленовая и (а>5Z)-этеролевая кислоты, соответственно. Фермент CYP74B16 идентифицирован как 13-специфичная дивинилэфирсинтаза, которой присвоено тривиальное название LuDES.

4. По критериям молекулярной филогении дивинилэфирсинтаза LuDES льна отнесена к подсемейству CYP74B, включавшему до настоящего времени исключительно 13-специфичные гидропероксидлиазы.

5. Впервые осуществлено превращение дивинилэфирсинтазы в алленоксидсинтазу в результате сайт-направленного мутагенеза. Получена мутантная форма LuDES с заменой E292G, у которой необычный для этого сайта остаток глутаминовой кислоты замещен на консервативный для алленоксидсинтаз и гидропероксидлиаз остаток глицина. Мутантная форма E292G, в отличие от дикой формы, превращает 13-гидроперекись а-линоленовой кислоты в алленоксидсинтазные продукты (а-кетол и 12-оксо-10,15-фитодиеновую кислоту), но не в дивиниловый эфир.

6. Продемонстрировано участие LuDES в ответных реакциях растений на патогены (Pecto bacterium atrosepticum SCRI1043): после инфицирования растений клетками патогенного микроорганизма происходит активация экспрессии гена LuDES в листьях льна; а продукт реакции, катализируемой LuDES - (а>52)-этероленовая кислота - сдерживает рост клеток бактерий в культурах in vitro.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК

1. Выявление и первичная характеристика нового цитохрома CYP74B1 льна (Linum usitatissimum) / Ю. В. Гоголев, С. С. Горина, H. Е. Гоголева, Я. Ю. Топоркова, JI. Ш. Мухтарова, И. Р. Чечеткин, А. Н. Гречкин // Доклады Академии Наук. — 2011. - Т.440. -С.540-543.

2. Novel aliéné oxide synthase product formed via Favorskii rearrangement: mechanistic implications for 12-oxo-10,15-phytodienoic acid biosynthesis / A.N. Grechkin, N.V. Lantsova, Y.Y. Toporkova, S.S. Gorina, F.K. Mukhitova, B.I. Khairutdinov// Chembiochem. - 2011. - V. 12. -P.2511-2517.

3. Green leaf divinyl ether synthase: gene detection, molecular cloning and identification of the unique CYP74B subfamily member / Y.V. Gogolev, S.S. Gorina, N.E. Gogoleva, Y.Y. Toporkova, I.R. Chechetkin, A.N. Grechkin // BBA - Molecular and Cell Biology of Lipids. - 2012. -V. 1821.-P. 287-294.

Работы, опубликованные в материалах научных мероприятий

1. Gorina, S.S. Detection and characterization of a new CYP74 transcript in flax (Linum usitatissimum) leaves / S.S. Gorina, N.E. Mukhametshina, Yu.V. Gogolev // Abstracts / Изд-во КГУ. - Kazan, 2009. - P. 54.

2. Горина, C.C. Обнаружение и характеристика гена CYP74 льна-долгунца {Linum usita-

tissimum) Z C.C. Горина, H.E. Мухаметшина, Ю.В. Гоголев ZZ Сб. тезисов Z Изд-во Пущин-ского НЦ РАН. - Пущино, 2009. - С. 12-13.

3. Характеристика транскриптома представителей семейства CYP74 льна-долгунца (Ыпит usitatissimum) Z C.C. Горина, P.T. Габбасов, H.E. Мухаметшина, Ю.В. Гоголев ZZ Материалы конгресса Z РИО ПГУ. - Пермь, 2009. - С.207-208.

4. Молекулярное клонирование гена дивинилэфирсинтазы льна-долгунца (Linum usitatissimum) Z C.C. Горина, H.E. Гоголева, Ю.В. Гоголев, И.Р. Чечеткин, А.Н. Гречкин ZZ Сб. Тезисов Z Изд-во: Каз.ун-т. - 2010. - С. 17.

5. Клонирование гена дивинилэфирсинтазы льна-долгунца (Linum usitatissimum) Z C.C. Горина, H.E. Гоголева, Ю.В. Гоголев, И.Р. Чечеткин, А.Н. Гречкин ZZ Материалы конференции Z Научная книга. - Саратов, 2010. - С. 45.

6. The unique enzyme of the CYP74B subfamily from flax (Linum usitatissimum L.) Z S.S. Gorina, Y.Y. Toporkova, N.E. Gogoleva, L.S. Mukhtarova, I.R. Chechetkin, Y.V. Gogolev and A.N. Grechkin ZZ Abstracts Z Wiley Blackwell, FEBS. - Torino, Italy, 2011. - P. 314.

7. Characterization of cytochromes P450 of the CYP74 family by the example of maize Z Y.Y. Toporkova, S.S. Gorina, L.S. Mukhtarova, Y.V. Gogolev and A.N. Grechkin. ZZ Abstracts Z Wiley Blackwell, FEBS. - Torino, Italy, 2011. - P.319.

8. Дивинилэфирсинтаза LuDES льна - новый фермент подсемейства CYP74B Z C.C. Горина, Я.Ю.Топоркова, НЕ. Гоголева, Л.Ш. Мухтарова, И.Р. Чечеткин, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин ZZ Тезисы докладов Z Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского. - Нижний Новгород, 2011. - С. 196.

9. Характеристика семейства CYP74 цитохромов Р450 кукурузы (Zea mays) Z Я.Ю. Топоркова, C.C. Горина, Л.Ш. Мухтарова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин ZZ Тезисы докладов Z Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского. — Нижний Новгород, 2011.-С. 702.

10. Характеристика дивинилэфирсинтазы LuDES льна — нового представителя неклассических цитохромов Р450 подсемейства CYP74B Z С.С. Горина, Я.Ю. Топоркова, Н.Е. Гоголева, Л.Ш. Мухтарова, И.Р. Чечеткин, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин ZZ Тезисы докладов Z Карельского НЦ РАН. - Петрозаводск, 2011. - С. 364.

П.Цитохромы Р450 семейства CYP74 кукурузы Z Я.Ю. Топоркова, С.С. Горина, Л.Ш. Мухтарова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин ZZ Тезисы докладов Z Карельского НЦ РАН. - Петрозаводск, 2011. - С. 292.

12. Дивинилэфирсинтаза LuDES льна (Linum usitatissimum L.) уникальный фермент подсемейства CYP74B цитохромов Р450 Z С.С. Горина, Топоркова Я.Ю., Гоголева Н.Е., Мухтарова Л.Ш., Чечеткин И.Р., Гоголев Ю.В., Гречкин А.Н. ZZ Тезисы докладов Z «Клеточная сигнализация у растений». — Казань, 2011. — С.42.

13. Structural and functional characteristics of new divinyl ether synthase (CYP74B16) from flax (Linum usitatissimum L.) Z S.S. Gorina, Y.Y. Toporkova, L.S. Mukhtarova, Y.V. Gogolev, A.N. Grechkin ZZ Abstracts Z Plant Biology Congress. - Freiburg, Germany. - 2012. - P. 14.

Подписано в печать 18.03.2013. Форм. бум. 60x84 1/16. Печ. л. 1,5. Тираж 150. Заказ №1803/1. Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии «Вестфалика» (ИП Колесов В.Н.) 420111, г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-92 e-mail: westfalika@inbox.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горина, Светлана Сергеевна, Казань

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И БИОФИЗИКИ КАЗАНСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ГОРИНА Светлана Сергеевна

ДИВИНИЛЭФИРСИНТАЗА СУР74В16 ЛИСТЬЕВ ЛЬНА: ОБНАРУЖЕНИЕ, МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ И СВОЙСТВА

I

Специальность 03.01.05 - физиология и биохимия растений

^^ Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

«О со

Ю 5 I

со 8

ио

® 5 НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

см

^^ N академик РАН А.Н. Гречкин

Казань-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12

1.1. Оксилипины как элементы защиты и развития растения 12

1.2. Биосинтез оксилипинов растений 17

1.3. Общая характеристика цитохромов Р450 20

1.4. Общая характеристика ферментов семейства CYP74 26

1.4.1. Алленоксидсинтазы 31

1.4.2. Гидропероксидлиазы 34

1.4.3. Дивинилэфирсинтазы 38

1.4.4. Эпоксиалкогольсинтазы 40

1.5. Сравнение механизмов катализа цитохромов CYP74 и классических монооксигеназ Р450 41

1.6. Внутриклеточная локализация ферментов CYP74 46

1.7. Регуляция экспрессии генов ферментов CYP74 50

1.8. Лен-долгунец (Linum usitatissimum L.) как объект исследования 51

1.9. Постановка цели исследования 52 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 54

2.1. Методы биоинформатики 54

2.2. Подготовка растительного материала 54

2.3. Выделение тотальной РНК из листьев льна-долгунца 57

2.4. Реакция обратной транскрипций и получение двуцепочечной

к ДНК 58

2.5. Полимеразная цепная реакция 58

2.5.1. Стандартные условия проведения реакции 58

2.5.2. Амплификация фрагментов целевых генов de novo с помощью ПЦР с вырожденными праймерами 59

2.5.3. Амплификация 5'- и З'-фрагментов целевых генов 59

2.6. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в ага-

розном геле 60

2.7. Молекулярное клонирование гена LuDES 61 2.7.1. Молекулярное клонирование гена алленоксидсинтазы

ZmAOSl кукурузы 62

2.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 62

2.9. Сайт-направленный мутагенез 63

2.10. Характеристика вектора рЕТ-32 Ek/LIC 65

2.11. Характеристика использованных штаммов Е. coli 67

2.12. Хранение штаммов Е. coli и рекомбинантных плазмид 68

2.13. Среды для культивирования бактерий 68

2.14. Приготовление компетентных клеток Е. coli 69

2.15. Трансформация компетентных клеток Е. coli 69

2.16. Индукция синтеза рекомбинантных белков 70

2.17. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламид-

ном геле 71

2.18. Выделение и очистка рекомбинантного белка 72

2.19. Реактивы и материалы для исследований катализа рекомбинантных ферментов ' 73

2.20. Получение гидроперекисей жирных кислот 74

2.21. Кинетические исследования рекомбинантной LuDES 75

2.22. Проведение реакций, катализируемых рекомбинантными ферментами, с гидроперекисями жирных кислот 75

2.23. Анализ продуктов реакций, катализируемых рекомбинантной LuDES, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 76

2.23.1. Хроматография на обращенной фазе 76

2.23.2. Хроматография на нормальной фазе 77

2.24. Спектральные исследования 77

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 79

3.1. Конструирование вырожденных праймеров для выявления генов ранее не охарактеризованных ферментов СУР74 льна-долгунца , 79

3.2. Выявление и клонирование последовательностей генов ранее ^охарактеризованных ферментов СУР74 льна-долгунца 84

3.3. Получение рекомбинантного белка СУР74В16 90

3.4. Исследование кинетики реакций, катализируемых рекомби-нантным ферментом СУР74В16, с различными субстратами 97

3.5. Идентификация рекомбинантного фермента СУР74В16 льна

как дивинилэфирсинтазы нового типа 103

3.6. Особенности первичной структуры и функции рекомбинант-ной1лЯ)Е8 110

I

3.7. Сайт-направленный мутагенез рекомбинантной ЬиОЕ8 113

3.8. Каталитические свойства мутантной формы ЬиБЕБ Е29Ю 115 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 127 ВЫВОДЫ 134 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 136 ПРИЛОЖЕНИЕ 159

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

1. АОС - алленоксидсинтаза;

2. ГПЛ - гидропероксидлиаза;

3. ДЭС - дивинилэфирсинтаза;

4. ЭАС - эпоксиалкогольсинтаза;

5. ЛОГ - липоксигеназа;

6. ПОГ - пероксигеназа;

7. АОЦ - алленоксидциклаза;

8. АФК - активные формы кислорода;

9. ЬиОЕБ - дивинилэфирсинтаза льна-долгунца (Ыпит тИаНязипит Ь.); Ю.ЬиАОЗ - алленоксидсинтаза льна-долгунца (Ыпит ияНаНязтит Ь.);

11. А1А08 - алленоксидсинтаза резуховидки Таля (АгаЫс1орз1з (каИапа); 12.9-ЛОГ - липоксигеназа, окисляющая полиненасыщенную жирную кислоту по атому углерода в положении 9;

13ЛЭ-ЛОГ - липоксигеназа, окисляющая полиненасыщенную жирную кислоту по атому углерода в положении 13;

14.ПНЖК - полиненасыщенная жирная кислота;

15.СРС - субстрат-распознающий сайт; 16.18:2 - линолевая кислота;

17.18:3 — а-линоленовая кислота;

18.13-ГПОТ - (92,1 \Е,\3£,152)- 13-гидроперокси-(9,11,15)-октадекатриеновая кислота;

19.13-ГПОД - (92,1 \Е, 13^-13-гидроперокси-(9,11 )-октадекадиеновая кислота; 20.9-ГГ10Т - (95,1ОЕ, 122,152)-гидроперокси-( 10,12,15)-октадекатриеновая кислота;

21.9-ГПОД - (95,10£,122)-9-гидроперокси-(10,12)-октадекадиеновая кислота;

22.9ДО-ЭОД - (122)-9,10-эпокси-(10,12)-октадекадиеновая кислота;

23.12,13-ЭОД - (92)-12,13-эпокси-(9,11)-октадекадиеновая кислота;

24.9,10-ЭОТ - (1 ОЕ, 122)-9,10-эпокси-( 10,12,15)-октадекатриеновая кислота;

25.12,13-ЭОТ - (9г,11^;,135,152)-12,13-эпокси-(9,11,15)-октадекатриеновая кислота;

26.12-ОФДК - (152)-12-оксофито-10,15-диеновая кислота; 27.12-ОФЕК- 12-оксо-10-фитоеновая кислота; 28.10-ОФДК - (157)-10-оксо-11,15-фитодиеновая кислота; 29ЛО-ОФЕК— 10-оксо-11-фитоеновая кислота;

30.а-кетол - 12-оксо-13-гидрокси-(92,152Г)-октадекадиеновая кислота;

31.(со52)-этероленовая кислота - (92,1 \Е,\%3'2Г)-12-(Г,3'-гексадиенилокси)-9,11-додекадиеновая кислота;

32.СК - салициловая кислота;

33.НАД(Ф)Н - никотинамиддинуклеотидфосфат восстановленный;

34.ФАД - флавинадениндинуклеотид;

35.ФМН - флавинмононуклеотид;

36.Трис - трис-(гидроксиметил)-аминометан;

37. ДСН - додецилсульфат натрия;

38.ПААГ - полиакриламидный гель; 39.ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

40. ДМСО - диметилсульфоксид;

41.ФМСФ - фенилметилсульфонилфлуорид;

42.ПЦР - полимеразная цепная реакция;

43.дНТФ - смесь дезоксинуклеозидтррфосфатов; 44.0РС - открытая рамка считывания;

45.ИПТГ - изопропил-р-Б-1-тиогалактопиранозид;

46.КОЕ - колониеобразующие единицы;

47. Диазометан - ]Ч-нитрозотолуол-4-сульфометиламид;

48.ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

49.ТМС - триметилсилил;

50.Ме/ТМС - ТМС-производное метилового эфира;

51.ГХ-МС - газовая хромато-масс-спектрометрия.

ВВЕДЕНИЕ

Постановка проблемы и ее актуальность. Липоксигеназный каскад является одной из важных сигнальных систем растений. В результате функционирования этого каскада происходит образование физиологически активных веществ - оксилипинов [Тарчевский, 2001]. Оксилипины обнаружены у животных, протеобактерий, бурых и красных водорослей, а также у всех наземных растений [Lee et al., 2008]. У высший растений они участвуют в регуляции роста, дифференцировке клеток, морфогенезе, органогенезе, а также в формировании устойчивости растений к различным биотическим и абиотическим стрессорам [Itoh et al., 2002; Stumpe, Feussner, 2006]. Ключевыми ферментами липокси-геназного каскада, обеспечивающими разнообразие оксилипинов, являются ли-поксигеназы, катализирующие первую реакцию каскада - образование гидроперекисей жирных кислот, и ферменты уникального семейства CYP74 цито-хромов Р450, ответственные за их дальнейшее превращение. Семейство CYP74 включает три типа ферментов: алленоксидсинтазы (АОС) и дивинилэфирсинта-зы (ДЭС), которые являются дегидразами, а также гидропероксидлиазы (ГПЛ), относящиеся к изомеразам. Множество ^охарактеризованных генов ферментов CYP74 в геномах различных организмов свидетельствует о вероятности существования в данном семействе ферментов с другими типами катализа.

Ранее было показано, что в листьях льна-долгунца (Limim usitatissimiim L.) содержится значительное количество дивинилового эфира -(9Z,1 \Е,\ 'Z,3'Z)-12-(1 ',3'-гексадиенилокси)-9,11-додекадиеновой ((со5Z)-

этероленовой) кислоты. Образование (со52)-этероленовой кислоты наблюдалось также in vitro в результате инкубации экзогенной 13-гидроперекиси а-линоленовой кислоты - (?Z,l 1£',135,152)-13-гидроперокси-(9,11,15)-октадекатриеновой кислоты (13-ГПОТ) - с экстрактом листьев льна [Chechetkin et al., 2008]. Однако до выполнения настоящей работы у льна был известен единственный представитель семейства CYP74 - алленоксидсинтаза LuAOS (GenBank: ААА03353.1), продуктом реакции которого является окись аллена, но не дивиниловый эфир [Song et al., 1993].

К настоящему времени изучено несколько десятков гидропероксидлиаз и алленоксидсинтаз. В то же время, клонировано только четыре гена, кодирующих дивинилэфирсинтазы [Itoh, Howe, 2001; Stumpe et al., 2001; Fammartino et al., 2007; Stumpe et al., 2008; Gullner et al., 2010]. Существует мнение, что ферменты этого класса не имеют широкого распространения в природе. Исследованные до сих пор рекомбинантные ДЭС синтезируют дивиниловые эфиры, имеющие транс-двойные связи по обе стороны от эфирного мостика. Ни один из ферментов, синтезирующих дивиниловые эфиры с г/г/с-двойной связью по одну сторону от эфирной связи, до сих пор изучен не был.

Цель и задачи исследования. Целью наших исследований явилось выявление и структурно-функциональнай характеристика фермента, ответственного за синтез (со52)-этероленовой кислоты в листьях льна-долгунца. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявление, характеристика и клонирование открытой рамки считывания гена, кодирующего фермент, ответственный за биосинтез (со5 Z)-этероленовой кислоты у льна-долгунца.

2. Получение очищенного препарата функционально активного рекомби-нантного фермента, ответственного за биосинтез (ю52)-этероленовой кислоты в растениях льна-долгунца.

3. Выяснение особенностей каталитического действия исследуемого фермента льна-долгунца. Определение субстратной специфичности и кинетических параметров катализа для данного фермента.

4. Характеристика структуры каталитически значимых доменов целевого фермента.

5. Определение вклада отдельных аминокислотных остатков в формирование типа катализа целевого фермента методом сайт-направленного мутагенеза: получение мутантных форм фермента и сравнение особенностей каталитического действия фермента дикого типа и его мутантных форм.

Научная новизна работы. Впервые выявлен ген дивинилэфирсинтазы LuDES льна-долгунца (Linum usitatissimiim L.) и клонирована его открытая рам-

ка считывания. Получен очищенный препарат функционально активного ре-комбинантного фермента. Предпочтительными субстратами фермента являются 13-гидроперекиси жирных кислот, что отличает его от ранее изученных ди-винилэфирсинтаз.

1лЮЕ8 идентифицирована как первый фермент СУР74В, гомологичный 13-гидропероксидлиазам подсемейства СУР74В и, вместе с тем, являющийся дивинилэфирсинтазой.

Впервые получена мутантная форма дивинилэфирсинтазы ЬиОЕБ Е292С. В отличие от ЬиЭЕБ дикого типа, мутантная форма Е292в проявляла активность алленоксидсинтазы, а не дивинилэфирсинтазы. Тем самым продемонстрировано, что для определения типа катализа критически важным является не гомология ферментов СУР74, определяемая по общему сходству аминокислотных последовательностей, а тонкое строение отдельных консервативных доменов.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные расширяют знания о ферментах семейства СУР74 и вносят вклад в понимание функционирования одной из ключевых сигнальных систем растений, способствующей их адаптации к неблагоприятным условиям.

Применение разработанной технологии получения и очистки цитохромов растений, основанной на использовании различных систем экспрессии реком-бинантных генов, дает возможность получения препаративных количеств ре-комбинантных белков для последующего использования в промышленности, часто ограниченного низкой доступностью природных ферментов. Новые ре-комбинантные ферменты с измененными каталитическими свойствами могут быть использованы для создания генетически модифицированных растений, удовлетворяющих требованиям современного сельскохозяйственного производства и стать основой инновационных технологий переработки сырья с использованием биокатализаторов, в том числе иммобилизованных ферментов.

Расширение сведений о генах и белках одного семейства облегчает идентификацию и характеристику новых представителей; кроме того, это позволяет

усовершенствовать классификацию и проясняет эволюционное происхождение и значение при первоначальном появлении семейств ферментов и структурных белков. Полученные знания приближают нас к ответам на многие фундаментальные вопросы эволюции и экологии.

Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут использоваться в учреждениях медицинского, сельскохозяйственного, биологического и биотехнологического профилей, занимающихся получением рекомбинантных ферментов, исследованием взаимосвязи структуры и функций белков, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, физиологии растений, биотехнологии и молекулярной биологии в ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась с 2009 по 2013 гг. в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Липоксигеназы и цито-хромы семейства СУР74: структура и роль в катализе биосинтеза оксилипинов - эндогенных биорегуляторов растений» (гос. регистрационный номер: 01200901959). Исследования автора частично поддержаны грантами РФФИ № 09-04-00915-а, № 11-04-01601-а, МК-1439.2011.4, АНТ № 14-33/2011, государственными контрактами № 16.740.11.0197 и № 14.740.11.0797, а также грантом ведущей научной школы НШ-825.2012.4. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Положения, выносимые на защиту:

1. ЬиОЕБ является единственной дивинилзфирсинтазой, классифицируемой по критериям молекулярной филогении как член подсемейства СУР74В цито-хромов Р450, до сих пор включавшего исключительно 13-гидропероксид-специфичные гидропероксидлиазы.

2. Дивинилэфирсинтаза ЬцБЕБ льна обладает строгой 13-региоспецифичностыо к субстрату; предпочтительным субстратом для нее является 13-гидроперекись а-линоленовой кислоты; основным продуктом является (со52)-этероленовая кислота.

3. Конверсия дивинилэфирсинтазы в алленоксидсинтазу возможна в результате минорных изменений первичной структуры, в том числе единичной замены аминокислотного остатка в каталитически важном домене.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на

I

13-ом ежегодном симпозиуме студентов-биологов Европы «SymBioSE 2009» (Казань, 2009); на 13-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009); на II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); на Российской школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии» (Казань, 2010); на V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010); на 36-ом конгрессе FEBS «Biochemistry for Tomorrow's Medicine» (Италия, Турин, 2011); на VII Съезде общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011); на V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011); на 3-ем Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011); на конгрессе FESPB и EPSO «Plant Biology Congress Freiburg 2012» (Германия, Фрейбург, 2012); а также на итоговых конференциях Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2010, 2013).

По результатам работы опубликовано три статьи в отечественных и зарубежных рецензируемых изданиях. >

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1 Л. Оксилипнны как элементы защиты и развития растения

Растения за свою продолжительную эволюционную историю развили особые системы защиты, связанные с прикрепленным образом жизни. Они снабдили себя физическими барьерами, такими как шипы, волоски и кутикула. Кроме того, многие вторичные метаболиты растений являются мощным химическим оружием. По разным оценкам, существует более 500000 вторичных метаболитов растений.

i

Большинство клеток растений способны не только воспринимать физические и химические сигналы, поступающие из окружающей среды, но и продуцировать эндогенные сигналы, которые распознаются другими клетками организма и соседними растениями и свидетельствуют о происходящих событиях и возможных угрозах. Так, в результате контакта с патогеном образуются элиси-торы - химические усилители сигнала опасности. В результате в отдельных клетках, тканях, целых организмах или их популяциях могут происходить транскриптомные, протеомные и метаболомные изменения, обеспечивающие выполнение адекватной физиологической программы [Wu, Baldwin, 2010]. К патогенам (в широком смысле) относятся не только вирусы, бактерии и грибы, но и паразитирующие на растениях нематоды и насекомые. Как правило, ответные реакции растений регулируются не одной цепочкой сигналов, а сложной сетью сигнальных систем, таких как МАР-киназная, аденилатцикла�