Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика свободнорадикальных процессов и продуктов азотистого катаболизма в тканях системы крови при гипероксии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Динамика свободнорадикальных процессов и продуктов азотистого катаболизма в тканях системы крови при гипероксии"

ГОСКОМИТЕТ РСФСР ПО ДЕЛАМ НАУКИ И ВЫСШЕЙ ШКОЛЫ

РОСТОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Специализированный совет К 063.52.09

На правах рукописи

КЕНИЯ Михаил Викторович

ДИНАМИКА СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ И ПРОДУКТОВ АЗОТИСТОГО КАТАБОЛИЗМА В ТКАНЯХ СИСТЕМЫ КРОВИ ПРИ ГИПЕРОКСИИ

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 1991

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии и НИИ Биологии Ростовского ордена Трудового Красного Знамени государственного университета.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

А.И.Лукаш (г.Ростов-на-Дону)

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Е.П.Гуськов (г.Ростов-на-Дону)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Т.Н.Погорелова (г.Ростов-на-Дону; НИИ акушерства и педиатрии)

доктор медицинских наук, профессор Э.Я.Каплан (г.Москва; ИХФ АН СССР)

Ведущая организация: Центр гипербарической оксигенации

ВНЦХ АМН СССР г.Москва

Защита состоится "27" июня 1991 г. на заседании специализированного совета К 063.52.09 в Ростовском государственном

по

университете (г.Ростов-на-Дону, ул.Энгельса,105, ауд.304, в 10 ) С диссертацией монно ознакомиться в библиотеке РГУ.

Автореферат разослан "/г?" citéis? 1991 г.

Ученый секретарь

специализированного совета,

доктор биологических наук В.Н.Кирой

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы внимание исследователей привлекают проблемы окислительного стресса (ОС). Под этим состоянием понимают сдвиг тканевого баланса антиоксидантов и прооксидантов в сторону последних. Следствием является срыв функционирования защитных систем и развитие окислительного повреждения ткани. (Sies, 1985).

В настоящее время деятельность человека все чаще зависит от разнообразных факторов среды, способных индуцировать ОС. Ключевую роль в развитии окислительного повреждения играют активные формы кислорода (АФК) (102, Oj, HgOg, НО-, органические радикалы и перекиси) - соединения радикальной и нерадикальной природы, образующиеся в кислородзависшых реакциях и обладающие высокой реакштопноспособностью (Urslni et al., 1989). Наибольший вклад в этот процесс вносит перекисное окисление липидов, в результате которого повышается проницаемость мембран с последующими патологическими последствиями для клетки. Важным медиатором в окислительном повреждении биоструктур при ОС являются металлы переменной валентности медь Cu+I? и железо Fe+n.

Особое место в ряду активаторов ОС занимают гипероксические ■ условия. С ними человек сталкивается при проведении кессонных работ, освоении воздушного и космического пространства. Гиперок-сическая коррекция гипоксических состояний, возникающих при различных патологиях,находит широкое применение в качестве терапевтической процедуры (Ефуни, 1981; Баркова, 1981) .Как экстремальный фактор, гшероксия способна вызвать физиологическую стресс-реакцию организма. В этих кв случаях может проявляться токсичность гипербарического кислорода.

Хотя повышенное парциальное давление кислорода в тканях при гитероксии является прямым источником АФК, влияние ГБО на окислительное повреждение тканей носит в определенных случаях опосредованный характер.

Важное место в развитии гипероксических повреждений принадлежит тканям системы крови. При достаточной обеспеченности кислородом в них происходит активный обмен различных форм келеза. В этих тканях находится основной пул фагоцитов,' ответственных за респираторный взрыв в ответ на стимулирующий агент (Меньшикова,. Зснков, 19Э0). В костном мозге показана низкая, по. сравнению с-

другими органами, активность ферментов антирадикальной защиты (Богданова и др., 1987). Имеются многочисленна, свидетельства того, что кроветворная ткань серьезно повреждается при окислительном стрессе (Горизонтов, 1980; Гуськов и др., 1990; Zima, Vodlcka, 1987).

Токсичность гипербарического кислорода делает актуальной задачу исследования в этих тканях динамики эндогенных продуктов азотистого катаболизма, способных к модификации активности СРП -мочевой кислоты, мочевины и тиоловых соединений (Кричевская и др., 1983; Davles et al., 1986; Rougee et al., 1988). Мочевина и GSH являются также и антигипероксйческими протекторами (Шугалей, 1980; Мухин и др., 1985).

Костный мозг и селезенка - гетерогенные системы, .которые содержат клеточные линии, различающиеся по устойчивости к повреждающему фактору и по ответной реакции на него, выражающейся в активации про- или антиоксидантных систем (Adama et al., 1985).«

На основании цитогонетических исследований костного мозга и других тканей крыс в последействии гипероксии высказано предположение о функционировании механизма антиоксидантной защиты в кроветворной ткани посредством программируемой гибели неустойчивых клеточных линий и обеспечении катаболитакШ-протекторами ткани в целом (Гуськов, Лукаш, 1987; Гуськов и др., 1989). Настоящая работа выполнена в контексте оценки этих положений биохимическими методами.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось установление значения взаимосвязи уровня свободнорадикальных процессов и содержания низкомолекулярных продуктов азотистого катаболизма в тканях системы крови крыс при гипероксии. .Для достижения этой цели были»сформулированы следующие задачи:

1) Изучение уровня СРП при воздействие на животных токсического режима гипероксии (0,7 МПв 02, до судорог) и в последействии в сыворотке крови, гомогенате селезенки, суспензии костного мозга и ее фракциях по светосумме I^Og-индуцированной ХЛ в присутствии люминола, и интенсивности ПОЛ по содержанию малонового диальдегида.

2) Определение в модельном эксперименте окислительной резистентности суспензии цельного костного мгзга и ее фракций по накоплению малонового диальдегида.

3) Изучение содержания продуктов азотистого катаболизма -антигипероксического протектора мочевины и антиоксиданта мочевой кислоты, а также небелковых тиоловых компонентов в тканях системы крови крыс при гипероксии и в последействии.

4) Определение частоты хромосомных перестроек при анафазном анализе клеток костного мозга и селезенки и присутствия остаточного хроматина в эритроцитах периферической крови в зависимости от времени последействия гипероксии и тканевого содержания мочо-вой кислоты.

Научная новизна результатов. 8 настоящей работе впервые проведен анализ биохимических показателей СРО в костном мозге и селезенке крыс на судорожной стадии кислородной интоксикации (0,7 МПа 02) и в'последействии. Определен тканевой уровень мочевины, мочевой кислоты и небелковых тиоловых соединений в тканях системы крови крыс при воздействии гипероксии. Прослежена корреляционная связь между СРО, содержанием тканевых антиоксидантов и хромосомными нарушениями в кроветворной ткани. Показана специфичность тканей систем крови крыс в реакции на окислительный стресс, обусловленная путем и временем накопления тканевых азотистых метаболитов и их защитной ролью.

Теретическая и практическая значимость работы. Данные, полученные в настоящей работе представляют существенный интерес с точки зрения выяснения механизмов повреждающего действия токсических режимов ГБО на кроветворную ткань.

Заслуживает внимания интерпретация результатов исследований в свете концепции адаптогенной роли программируемой гибели неустойчивых к экстремальному воздействию клеток с последующим накоплением катаболитов обладающих аятиоксидантными свойствами.

Практическая ценность проведенных исследований определяется возможностью на основе знания стадий и факторов развития гиперо-ксического повреждения тканей системы крови выбрать сроки и пути коррекции антиоксидантного статуса ткани введением протекторов извне или активированием эндогенных антиоксидантных систем, избирательным подавлением таких составляющих СРО,как ПОЛ, респираторный взрыв, ксантиноксидазная генерация АФК, использованием антистрэссорных препаратов.

Материалы, полученные в работе, используются на большом практикуме по биохимии, в преподавании курса биофизики на кафед-

ре биохимии и биотехнологии РТУ.

Апробация работы. Материалы диссертации ч задавались на III всесоюзной,конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 1989), на III всесоюзном совещании по хемилюминесценции (Рига, 1990), на 6й Ростовской научно-практической школе-семинаре (Ростов-на-Дону, 1990).

Публикации. По материалам данного исследования опубликовано Б работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация выполнена на //$ страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов-и библиографического указателя, включающего ß/ отечественнных и зарубежных источников. Работа иллюстрирована f рисунками и^ таблицами.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводили па белых беспородных'крысах обоего пола весом 120-180 г, содержавшихся на стандартном рационе вивария.* Крыс подвергали действию 0,7 МПа чистого кислорода в специальной барокамере с щелочным поглотителем углекислоты при времени компрессии и декомпрессии 4 минуты. После«наступления первого генерализованного судорожного приступа (30*10 минут) животных дека-питировали в зависимости от постановки опыта сразу, через I, 3 'или 24 часа параллельно с контрольными. Кровь собирали для получения Сыворотки. Селезенку гомогашзировали для биохимических исследований или фиксировали раствором Карнуа для анафэзного анализа. Костшй мозг из бедренных, борцовых и плечевых костей фиксировали'или гомогенизировали в суспензию цельного костного мозга (СЦМ;. СИМ также разделяли на плеточную составляющую (ККМ) и супэрнатант (СУП), клетки отмывали физиологическим раствором для получения суспензии отмытых клеток костного мозга (СОК).

Содержание белка определяли по методу Лоури . в кодификации (Shac^erler, Pollack, 1973). В сыворотке крот, гомогенате селезенки определяли уровень ПОЛ по содержанию малонового диальдеги-да (Гаврилов и др.,1987), а в СЦМ и ее фракциях, кроме того, и окислительную резистентность по накоплению ЭДЛ при 90 минутной инкубации при 37°с. Содержание мочвеой кислоты исслодовали колориметрическим методом (Shuetal., 1978). содержание мочевшш определял! диацетилмонооксикным методом С'Вио-Тест Laoherca" ЧССР). Количественное определение небелковых сульфгидрилышх

групп с использованием реактива Эллмана проводили по Веревкшой с соавт. (1977), Содержание негеминового железа определяли орто-фенантролиновой процедурой (Колб, Камышников 1986). Интенсивность свободнорадинальных процессов оценивали по светосумме ^(^-индуцированной хемилюминесценции с лкминолом (Шестаков и др., 1979) на установке для регистрации индуцированной ХЛ , собранной в нашей лаборатории (Левин, 1988). Базовым прибором служил сцинтилляционный спектрометр 22028 ДОТ, ГДР), в качестве детектора использовали ФЭУ-37. В последействии гипероксии был проведен анафазный анализ количества клеток костного мозга и селезенки с хромосомными перестройками и- эритроцитов периферической крови содержащих остаточный хроматин.

Анализ полученных в экспериментах рядов данных на резко отклоняющиеся варианты осуществляли по критерию Шовене (Кокунин, 1975). Численно степень взаимосвязи между исследуемыми характеристиками определяли по линейному коэффициенту корреляции Пирсона в совокупности с графическим анализом диаграмм рассеивания. Сравнение средних величин рядов проводили согласно формулам расчета ^критерия Стыодента для независимых коррелированных выборок (Владимирский, 1983).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Интенсивность СРП тканей системы крови крыс при гипероксии и в последействии исследовалась двумя дополняющими друг друга методами - ХЛ и определением уровня УДА (табл *1).

В сыворотке крови интактных животных содержание МДА составило 3,28 М , что согласуется с донными литературы (УозМкатеа а1., 1982). Контрольные значения в селезенке - 752 М-9 МДА/г белка. Этот же порядок значений сохраняется для костного мозга -511 !.Гэ/г белка, хотя уровни № в двух тканях отличались достоверно (р<0,001). В литературе имеются сходные данные по МДА костного мозга кур - 760 М /г бежа (0!тсз{1 ег а1., 198Т).

В судорсяюй стадии кислородной интоксикации содержание '¿ДА в сыворотке крови возрастает на 23% (р<0,05), а через сутки [тосле воздействия на 25% (р<0,05) по отношению к исходному уров-[¡ю. Выявленный прирост складывается из МДА, поступающего из ткачей и собственного ПОЛ крови. На стадии судорог и в последейст-в:ш в кроветворных тканях концентрация молонового диальдегида зстявалась неизменной, за исключением выявленной в костном мозге

/энденции к достоверному снижению (-8Ж, 0,05<р<0,1) уровня ЦЦА через сутки после ГБО. Подобное снижение монет происходить в результате активной деструкции МДА неспецифической альдегидде-гидрогеназой, а также взаимодействия с веществами, содержащими амино- и сульфгидрильные группы (Slu, Draper, 1982).

Для того, чтобы выделить вклад клеток и внеклеточного компонента костного мозга в уровень ПОЛ и резистентность ткани при окислительном стрессе, была проведена специальная серия экспериментов с разделением цельного костного мозга на фракции и инкубацией образцов. В пересчете на белок содержание МДА в цельном костном мозге и трех его компонентах оказалось Слизким. Только суспензия отмытых клеток имела тенденцию к достоверному превышению уровня К5ДЛ цельного костного мозга на 15% (0,05<р<р,1). В то же время значения прироста содержания малонового диальдегида в исследуемых образцах различались существенно. В наименьшей степени процессы ПОЛ активизировались в СОК - прирост МДА пр» инкубации в этом-случае был на 30% нюке, чем в СЦМ (р<0,001) и в 1,2 раза ниже значений для неотмытых клеток костного мозга. Самый эффективный прирост был зафиксирован в супернатанте - на 89% выше, чем в цельной суспензии. Полученные результаты отражают различия антирксидантного статуса и количества субстратов окисления во фракциях костного мозга. •

Ори гипероксии и в последействии достоверных изменений прироста малонового диальдегида в СЦМ обнаружено не было. В СОК при неизменном исходном уровне ВДА на судорожной стадии, в случае инкубации выявляется 8%-ный (р<0,05) прирост МДА. Это может говорить о- вкладе ингибиторов ПОЛ цельного костного мозга в его антиоксидантный статус. Возможно такие, что- межклеточная среда маскирует начавшееся свободнорадикалыюе повреждение клеток.

Корреляционный анализ содержания МДА во фракциях костного мозга показал тесную связь в парах клетки костного мозга - СЩ.1 и отмытыи клетки - СЦМ (г= 0,76 и 0,84) и ее полное отсутствие в парах ККМ - СУП и СОК - СУ11, что указывает -на вероятное участие клеточного компонента костного мозга в регуляции интенсивности ПОЛ в ткани. В норме процессы ПОЛ взаимосвязаны в обеих кроветворных тканях (г=0,74), причем тесная ко^реляцгя уровня МДА отмытых клеток с цельним костным мозгом м с селезенкой подтверждает, что в интактных кроветворных, тканях интенсивность

ОЛ определяется исключительно клетками. В контроле процессы на-опления малонового диальдегида в костном мозге и селезенке не вязаны с его уровнем в крови.

Инея картина наблюдается на стадии судорог. Появляется за-исимость между продуктами ПОЛ в сыворотке крови и СИМ (г=0,6Э), эторая реализуется не через клетки (г пары сыворотка крови:С0К 0,24) и носит, по видимому, нерегуляторный характер. В то же ремя, процессы ПОЛ в кроветворных тканях оказываются рассогла-эванными. В ткани костного мозга сохраняется корреляция между ЭЛ клеток костного мозга и цельной ткани' (г=0,94), в то время вк в селезенке нет связи ни с костным мозгом, ни с сывороткой, эпуская клеточную природу регуляции ПОЛ в селезенке, необходимо ризнать за спленоцитами специфические регуляторные механизмы ри окислительном стрессе.

На сутках последействия выраженное несоответствие корре-яциокных взаимосвязей контрольным остается в паре костный мозг сыворотка крови. Очевидно, причиной в данном случае служит азличие в динамике ПОЛ в этих объектах. Накопление ВДА в сыво-этке и снижение в СЦМ дает картину обратной зависимости г=-0,46).'

Результаты исследования позволяют высказать предположение наличии в кроветворных тканях не только специфических механиз-эв регуляции СРП при экстремальном воздействии, но и гистогема-яческих барьеров, защищающих ткань как от повышенной кокцентра-ни кислорода, так и от токсических продуктов, накапливающихся в рови при окислительном стрессе.

Необходимость изучения интенсивности СРП и окислительной ззистентности тканей системы крови крыс поставила перед нами эдачу проведения хемилкминесцентного исследования.

Полученные результаты отраканы в таблице Л1. В сыворотке рови на стада! судорог наблюдается существенное (36 %) подав-эние СРО. Это согласуется с результатами проведенных раьэе <спариментов (Дудкин, 1983;, Дмитриев, 1985). Очевидно,это со-гветствует стадии ингибирования ХЛ плазмы крови животных при эздействии ГБО, показанной в ряде работ (Гаспарян и др. 1970; аплан и др., 1933). В суспензии костного мозга и гомогенате се-эзенки на судорожной стадии мы наблюдали сопоставимое с выяв-энным для сыворотки крови падение СРО - на 41% и 5035 соответст-

венно. В то же время ХЛ отмытых клеток костного мозга не отличалась от контрольного уровня.

На сутках после воздействия в сыворотке крови свечение превышает исходное на 63%, в тканях системы крови ХЛ близка к контролю, а в отмытых клетках костного мозга превосходит его на 2Ъ% (0,05<р<0,1).

Корреляционным анализом установлено, что у интактшх животных процессы СРО тесно связаны только в паре селезенка - клетки костного мозга (г=0,74). Это свидетельствует в пользу того, что в норме баланс СРП'в клетках регулируется едиными механизмами, возмогою, на организменном уровне. С развитием гипероксического повреждения связь между СРП в кроветворных тканях исчезает, что отражает различие путей противостояния повреждающему фактору и разную устойчивость тканей к окислительному стрессу.

К суткам последействия ситуация меняется. В паре клетки -костный мозг появляется положительная корреляция (г=0,54), что вкупе с возросшим свечением отмытых iuiotok костного мозга говорит об их начавшемся повреждении, связанном общими*механизмами с уровнем СРП ткани в целом. Отрицательная корреляция кровь - СЦМ, появившаяся уже на судорожной стадии (г=-0,50), становится темной (г=-0,82), что подтверждает предположение о различных механизмах антиоксидантной защиты в этих тканях.

В развитии СРО при кислородиндуцированном окислительном стрессе основная прооксидьнтная роль отводится негемшовому железу (Дудкин, 1983, Левин, 1988; Buettner, 1987). Обнаруженное нами в последействии гшороксии подавление СРО в СЦМ на фоне его активации .в крови позволяет высказать предположение о существовании механизмов эффективного связывания неге?.йшового железа в кроветворной ткани. Для проверки этой "илотозн мы провели серию модельных экспериментов по выявлению жолезосвязывающей способности суспензии костного мозга. В пересчете на белок ЖСС в обоих случагк была 6,4 И-6 Fe/r белка СЦМ, что на порядок выше фэрри-тинового резерва сыворотки крови (Колб, Камышников, 1982). Снижение концентрации определяемого в орто-фенантролиновой процедуре железа происходит, очевидно, в розультате перегода свободного и части связанного трансфоррином Fe -в менее активную форму.

X'" чилюминесцентное исследование тканой системы крови крыс позволяет сделать следующие выьода. На стадии судорог у животных

развивается компенсаторная стресс-реакция, проявляющаяся в инги-бировашш СРП в крови и кроветворных органах. На сутках последействия возросшее свечение сыворотки крови отражает истощение пула антиоксидантов крови и развитие патологичэеких процессов в тканях - мишенях кислородной токсичности.

Уровень свободнорадикальннх процессов в исследованных тканях может в существенной степени зависеть от динамики эндогенных низкомолекулярных модификаторов активности.

Концентрация урата в сыворотке крови аивотшк контрольной серии составила 73-78 М-6, а в CUM 10-18 Jf 6/г белка, что более чем на порядок больше сывороточных значений в пересчете на белок и в 1,7-2 раза превышает уровень урата в селезенке - 6-9 М~6/г белка. Высокая по сравнению с другими тканями системы крови концентрация МК в костном мозге моаот объясняться активными катабо-литичоскими процессами, сопровождающими нормзлышй эритрспоэз (Козинец, Быкова, 1983).

На судорожной стадии ¡отслородаой интоксикации (табл.Ш) в сыворотке крови уровень МК превысил контролыше значения на 392", к часу последействия превышал их. на 29$, а к 3 часам приблизился к исходному уровню. Через сутки значения опытной серии боли на 21% пике контрольных. В селезенке в момент судорог наблюдалось возрастание уровня ЫК на 68% к контролю, к часу последействия - снижение на 28Ж, затем новое повышение на 43% к 3 часам последействия п нормализация через сутки. В костном мозге на стадии судорог содержание Ш оставалось неизменным, максимальное прэвтаишв контрольных значений зафиксировано к I часу после еоздэйствия - 30S, через 3 часа - 23%, а к суткам уровень МК не отличался от кормы.

Результата корреляционного анализа содераанзшя MEt в тканях систеш крови отрагкэш в таблице YZ. В норме уровень .'Ж в селе-ззйко связан с таковым в снворотко крови и CIM. Зависимость меп-ду сывороткой и СЩ-1 появляется на стадии судорог, а к часу последействия, в то время как концентрация МК з костном мозге достигает максимальных величин, возрастает до сильной. К трем часам последействия, когда содергание урата в сыворотке крови нормализуется, корреляция СШ - сыворотка крови нзчезает. К суткам в этой парз вновь появляется тесная связь по МК, что, очевидно, отражает подавление о о образования а костном Мозго а рзаультато

клеточного опустошения и одновременное снижение содержания урата в крови. В селезенке уже на стадии судорог теряется зависимость по урату с сывороткой крови при сохранении корреляции о костным мозгом. В этой фазе воздействия, вероятно, происходит переключение существующей в норме регуляторной адаптогенной связи крови с селезенкой на костный мозг. В последействии гипероксии механизмы, обусловливаюцие накопление и распад МК в селезенке, оказываются отличными от таковых в костном мозге, при этом содержание Щ{ в селезенке находится во всех постановках опыта вне зависимости от резко меняющейся концентрации урата в крови.

таблица I

Интенсивность свободнорадикалышх процессов и содержание мочевой кислоты в тканях системы крови крыс при галероксических судорогах и в последействии, (в % к контролю)

объект М Д А X Л мочевая кислота

ГБО сутки ГБО сутки ГБО I час 3 часа сутки

сыворотка крови •* 23% ** 25% ** -36% *• 63% »» 392% * 29% 10% *• 21%

селезенка 9% -3% -50% иж *е 68% « 28% 43% 3%

С ДМ 9* * -5% ** -41% -8Z 4% * 30% 23% 5%

Примечания: * - тенденция к достоверным различиям (0,05<р<0,1) ** - достоверные различия (р<0,05)

Содержание низкомолекуляршх тиоловых компонентов в костном мозгу и селезенке составило соответственно 18,4 и 20,2 М"ь/г белка. В исследованных постановках опыта, только в селезенке на стадии гипероксяческих судорог нами обнаружен прирост SH- групп на 14% (р<0,001). Имеются обширные данные литературы, в которых адаптивный ответ на окислительный стресс выражается в возрастании тканевого уровня GSH {Allans et al., 1985; Sohal, 1988). В то ке время, процессы синтеза GSH могут компенсироваться возросшей скоростью его окисления до дисульфида, который в качестве защитной реакции или экспортируется клеткой вовне, или связывается с белками (Thayer, 1988).

Корреляция между содержащим урата я тиолоеых комлонэнтов в костном мозге и селезенке отсутствовала в контроле и при гипв-роксических судорогах, тогда как через сутки послэ воздействия, в обеих тканях возникала тесная связь (г соответственно 0,90 и 0,73). В качестве объяснения полученных: результатов можно предположить потребление указанных веществ в общих для них реакциях с АФК в зависимости от интенсивности процессов СРО в данном организме. Однако причиной монет быть и синхронизация функционирования антиоксидантных систем ткани.

Таблица 2

Корреляция (г) содержания мочевой кислоты в тканях системы крови крыс при гапероксии (0,7 МПа 02, судороги) и в последействии

реким пары контроль судороги последействие!]

I час 3 часа сутки й

костный мозг сыворотка крови 0,29 (13) в 0,66 (7) 0,85 (7) 0,10 (Ю) «* 1 0,87 | (7)

селезенка сыворотка крови а 0,52 (Ю) 0,06 (7) 0,03 (9) -0,10 (II) 1 0,32 1 (7)

костный мозг селезенка « 0,66 Р) 0 0,58 {V -0,39 (Ю) 0,12 (12) 0,38 | (в?

Примечания: » - умеренная взаимосвязь

- сильная взаимосвязь В скобках указано число пар сравнения

Концентрация мочевины - продукта азотистого катаболизма, кодвфщируЕцего интенсивность ПОЛ, в сыворотке крови составила 7,67 кМ, что согласуется с данными литературы (Герзюнович и др., 1870). содерзаппэ мочевины в цельной суспензии костного мозга -31 кШ/г бежа, в то по время ее уровень в отмытых клетках в 7 раз пгаэ - 4,Б М~б/г белка. Ввиду того, что мочевина способно легко диффундировать через клеточную мембрану, очевидно, что указанная концентрация з СОК в основном отражает пул связанной мочевины. Гомогенат селезенки содержал 21 М-6 мочевины на грамм белка.

При ггагороксии 'и в последействии содержание мочевины в

тканях системы крови остается на контрольном уровне, за исключением 24%-ного возрастания в селезенке на стадии судорог.

Корреляционный анализ показывает, что в контроле уровни мочевины в селезенке и костном мозге имеют положительную связь с таковым в сыворотке крови и между собой (табл .43). Это свидетельствует в пользу активного обмена мочевиной мекду кроветворными тканями и кровью. О клеточном происхождении мочевины в СИМ говорит очень высокая (г=0,94) корреляционная зависимость между клетками костного мозга и цельным костным мозгом. При гипероксичес-ких судорогах связь мекду сывороткой и кроветворными тканями становится еще теснее, что, возможно, отражает донорную функцию последних. На сутках последействия, в то время как в селезенке корреляция с сывороткой приближается к контрольным знач01шям, в случае костного мозга такая связь пропадает. Это говорит в пользу серьезных изменений в продукции мочевины костным мозгом. Отрицательная корреляция мекду содержанием мочевины в костном мозге и селезенке (г=-0,51) свидетельствует о разнонаправленном влиянии скстремального фактора на азотистый обмен двух кроветворных тканей. Очевидно, с увеличением силы повреждающего воздействия в последействии количество разрушающихся клеток в селезенке будет возрастать, а клеточность костного мозга - падать.

Для выявления возможного протекторного действия урата наш был проведен анализ доли клеток с хромосомными перестройками в кроветворных тканях и эритроцитов периферической крови, содержащих остаточный хроматин в последействии судорожной стадии ГБО, в связи с тканевым уровнем мочевой кислоты. Анафазные аберрации хромосом отражают повреждения в делящихся клетках любого типа, в то время как остаточный хроматин в эритроцитах свидетельствует о предыдущим повреаде!ши ядерного материала клеток красного' ростка.

Клетки с хромосомными перестройками в костном мозге интак-тшх крыс составили в наших экспериментах 7,9%. Ранее полученные значения контроля по этому показателю варьировал« в диапазоне 1,9-3,1% (Гуськов, 1983; Гуськов в др., 1990). В селезенке наблюдали сходный уровень аберраций, - 2.4%.

В костном мозге через 3 часа после воздействия кислорода уровень аберраций превышал контроль в 3„7 раза <}к0,01), аналогичный прирост на сутках последействия - в 3,3 ря?о из за вы со-

кой дисперсии данных представлял тенденцию к достоверным отличиям (0,05<р<0,1). В селезенке уровень энафаз с поре стройка?.® через 3 часа - увеличился в 2,5 раза к контролю (р<0,05), через сутки после воздействия в 2,3 раза (р<0,05). В крови крыс в норме уровень эритроцитов с микроядреми был незначителен - 0,04%. Высокие значения достоверного прироста содержания дефектных эритроцитов в крови в последействии - в 4,8 а 3,8 раза к контролю в абсолютном выражении невелики "0,2% от общего числа эритроцитов.

Таблица 3

Корреляция (г) содержания мочевины в тканях систем! крови крыс при гипероксии а в последействии

пары сывор. сывор. сывор. СЦМ СЦМ солез.!

резям СЦМ СОК сэлез. сок солэз. сок

л* #» **

контроль 0,63 0,84 0,65 0,94 0,66 0,02 |

(19) (7) (19) (6) (19) (6)

»» 5.» то ■»» |

гиперонсия 0,87 0,43 0,88 0,90 0,84 0.79 |

(8) (5) (Ю) (6) (И) (6)

сутки последействия 0,25 ** 0,59 (6) * -0,51 (6)

Примечания: * - умеренная взаимосвязь

- сильная взаимосвязь В скобках указано число пар сравнения

Несмотря па сходство реакции кроветворных тканей на гипер-сксив по псслодованному показателю, корреляционный анализ выявил г'овду гсги существенные различия. В нормэ, через I и 3 часа после воздействия в паро костный мозг - селезенка псблюдпотся тос-ная обратная зависимость по клеткам с хромосомными нарушениями (г=-0„64; -0,84; -0,84). В контроле и ближнем последействии зафиксирована у?'эрэ1шая положительная корреляция костного мозга с кровью (г^-0,55 и 0,54), а.уровень повреждений в спленоцятах и и количество эритроцитов с минроядрамя связаны не были.

При анализе корреляционной зависимости хромосомные повреждения - содержание урата (рис..'Я) отмечалось либо отсутствие за-

висимости между показателями в ткани, либо высокая отрицательная корреляция, которую можно охарактеризовать как защиту уратом клеток от повреждения. Степень такой защиты, согласно полученным нами результатам, не связана с тканевой концентрацией урата, а зависит от исследуемой ткани и стадии воздействия.

Сравнивая костный мозг и селезенку по степени защиты уратом можно отметить, что как и в случае корреляции уровней перестроек, кроветворные ткани во всех исследованных режимах оказываются диаметрально противоположными. Тесная связь урат : хромосомные нарушения в селезенке в контроле и до Зх часов последействия сменяется полной ее утратой к суткам, с костным мозгом -обратная ситуация.

Корреляция между содержанием урата и хромосомными повреждениями в тканях системы крови крас при гипероксии и в последействии

У - умеренная связь |г|>0,5 * - костный мозг

Т - тесная связь |г|>0,6 • - селезенка

Рис.1

Результаты, полученные в настоящей работе, позволяют глубже понять специфику реакции кроветворных тканей на действие ГБО и могут Сыть полезны при выборе средств коррекции токсических состояний возникающих при воздействии гипероксии. Теоретическая и практическая важность решения поставленных проблем требует дальнейшего изучения патогенетических цитодинамических и сяободнора-дикалышх процессов в тканях системы крови в ответ на воздействие окислительного стресса.

ВЫВОДЫ

1. При развитии у белых крыс гипероксических судорог (0,7 МПа 02) интенсивность СРП, определяемая по светосумме ХЛ в сыворотке крови, костном мозге и селезенке была подавлена по отношению к контролю на 36% 41% и 50% соответственно. Через сутки после воздействия ХЛ сыворотки крови превышала исходный уровень на 63%, фракции отмытых клеток костного мозга на 27%. Корреляционный анализ показал тесную прямую зависимость между ХЛ гомогената селезенки и отмытых клеток костного мозга (г=0,74). Умеренная отрицательная корреляция мезду сывороткой крови и СЦМ (г-—0,50) переходит в тесную на сутках последействия (г=-0,82). На этой стадии появляется умеренная положительная связь в паре С-ЦМ:С0К (г=0,54).

2. Содержание продукта перекисного окислекия лишдов МДА п сыворотке крови на стадии судорог и через сутки после воздействия увеличивалось на 23% и 25%. Б гомогенате селезенки и в СИМ значительных изменений не было. При 80 минутной инкубации контрольных образцов CUM при 37°С прирост МДА к нвинкубированной пробе составил 16%. Во Фракции отмытых клеток костного мозга при инкубации уровень МДА прирастал на 11%, в неотмытых клетках -34Í5, в супернатанте - 300S. Между уровнями ПОЛ во фракциях костного мозга обнаружена тесная связь СЦМ:СОК (г-0,84) и СШ:ККМ (г--0,76). В контроле показана тесная зависимость МДА селезенки с CUJÍ (г=0,74) и СОК (г=0,95). ПОЛ в CUM связан с отмытыми клетками в контроле и при гипероксии (г=0,84 и 0,94). На стадии судорог возникает корреляция между СЦМ и сывороткой крови (г-0,6Э).

3. Содержание мочевины увеличивалось только в селезенке крыс при гипероксическж судорогах ~ на 24%. У интактшх живот-.¡шх и при воздействии ГБО кроветворные ткани были коррелированы по содержанию мочевины между собой я с сывороткой крови. Через сутки после воздействия связь СИМ с сыЕороткой крови пропадает, а с селезенкой меняется на обратную (г=-0,51).

4. Содержание мочевой кислоты возрастало на стадии судорог в сыворотке крови на 392% и в гомогенате селезенки на 68% к исходному уровню и оставалось повышенны?,i до Зх часов последействия. Через час и 3 часа после воздействия концентрация уратэ превышала исходные значения, в СЦМ на 30% и 23%. К суткам в сыворотке крови содержание МК снижалось на' 21% к контролю, а в ícpo-

ветворных тканях, приходило к норма. В контроле обнаружена умеренная корреляционная связь между МК селезенки и сыворотки крови (г=0,52) и тесная в паре СЦМ:селезенка (г=0,66), которая сохранялась на стадии судорог (г=0,58). СЦМ с сывороткой крови был связан по уровню урата при гипероксш (г=0,56), через I час и сутки после воздействия (г=0,85 и 0,87).

5. Содержание небелковых тиолових соединений повышалось в гомогенате селезенки на стадии судорог. На сутках после воздействия ■в селезенке и СЦМ концентрация SH-групп коррелировала с тканеЕЫм уровнем -урата (г=0,73 и 0,90).

6. В последействии гипэроксии в селезенке выявлено увеличение % анафаз с хромосомными аберрациями к трем часам после воздействия в 2,5 раза (р<0,05), к суткам - в 2,3 раза (р<0,05). В костном мозге на этих решмзх процент перестроек превышал исходный в 3,8 (р<0,05) и 3,3 (0,05<р<0,1) раза соответственно. Процент эритроцитов периферической крови, содержащих остаточный хромапш,был выше контрольного через 3 часа в 4,8 , а через сутки - в 3,8 раза (р<0,05).Обнаружена тесная обратная корреляция между долей клеток с хромосомными нарушениями и содержанием мочевой кислоты в селезенке в контроле (г=-0,84) и на Зх часах последействия. Аналогичная зависимость в костном мозге (г=-0,93) и периферической крови (г=-0,76) наблюдалась на сутках после воздействия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТВ,Ж ДИССЕРТАЦИИ

1. Связывание нешяшового железа суспензией клеток костного мозга крас In vitro (Е.П.Гуськов, А.И.Лукаа), - // Изв. СКНЦ ВШ. Естоств. науки.- 1989.- * I.- С. II5-II7.

2. Определение уровня пзрекисного окисления липидов в сыворотке крови, костном мозге и селезенке крыс при действии гипер-барачоской оксигеяации // Нет. III Всес. кокфер. "Биоантиокси-дант".- M., 1969.- I,- С. 138.

3. Влияние гипероксии на содержание МДА в тканях системы крови крыс (А.И.Лукаа, Н.С.Сидоренко). - / И., 1950.- 9 с. Деп. в ВИНИТИ 20.0G.90 » 353&-В90.

4. Хемилшинесценция ткьней системы 1фови крыс при галерок-сии (К.С.Сидоренко). - // Мат. III Всес. совеп;. по ХЛ.- Рига, 1990,- С. IC3.

5. Адаптивные свойства азотсодержащих катаболитов тканей системы крови крыс при гипероксии (Н.С.Сидоренко). - // Тез. 6Я Ростовской обл. научно-практ. школы-семинара. - Ростов-на-Дону, 1990.- 2.- С. 8-9.

Список использованных сокращений

АФК - активные формы кислорода ГБО - гипербарическая оксигенация КСС - железосвязыващая способность МДА - малоновый диальдегид МК - мочевая кислота ОС - окислительный стресс ПОЛ - перекисное окисление липидов СРО - свободнорадикальное окисление СРП - свободнорадикальныэ процессы ХЛ - хемилюминесценция

Подписано к печати 8.05.91г. Объем I п.л. Тираж 120 экз. Заказ 509. Офсетная печать ГКП ПГО "Южгеология".