Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетико-биохимические особенности преадаптации млекопитающих к окислительному стрессу

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Генетико-биохимические особенности преадаптации млекопитающих к окислительному стрессу"

«5Г О

На правах рукописи

cv \

БРЕНЬ АНЖЕЛИКА БОРИСОВНА

ГЕНЕТИКО - БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРЕАДАПТАЦИИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ К 01ШСЛИТЕЛЬН0МУ СТРЕССУ

03.00.G4 - биохимия 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНШ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ HAW

Ростов - на - Дону 1997

Работа выполнена в НИИ Биологии Ростовск государственного университета

Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор

Е.П. Гуськов

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

A.M. Менджерицкий

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: Нижегородский государственный университ

им. Лобачевского

Защита диссертации состоится "S-" декабря 1997 г. на - заседа диссертационного совета Д.063.52.08. по биологическим наука Ростовском государственном университете, 344006. г. Р тов-на-Дону, ул.Б. Садовая, 105. ауд. 203, 9.00 час.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГУ

Автореферат разослан ноября 1997 г.

Ученый секретарь диссертацинного совета доктор биологических наук,

Ю.А. Ревазова (Институт экологии челов г. Москва)

доктор биологических наук, профессор Н.Г. Волжина (Ростовский государственн педагогический университет)

профессор

Т.И. Бондаренко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Широкое применение гипербарического кислорода в медицине и при подводных погружениях обусловило интенсивные исследования биохимических и биофизических эффектов, индуцируемых гипербарической оксигенацией (ГБО), однако, генетические механизмы влияния повышенного парциального давления кислорода на организм по-прежнему остаются практически вне поля зрения специалистов.

Известно, что повышенное давление кислорода вызывает перестройки хромосом в культуре тканей, проростках семян растений и костном мозге животных /Erenberg, 1957; Moutchen-Dahmen, 1959; Moutchen-Dahmen, 1962; Phillips. 1983; Sophum, Ishidate, 1984/. В литературе широко обсуждаются положения об общности механизмов первичного поражения ГБО и ионизирующей радиацией /Gerschman е. а. 1954/, ГБО и мутагенами химической природы /Kissling, Speck. 1971/. Многочисленными исследованиями установлено, что токсическое действие на организм разнообразных физических, химических и биологических факторов, приводящее к появлению мутаций и клеточной гибели, может быть снижено предварительным воздействием малых доз токсического агента. Этот феномен получил в литературе название адаптивного ответа /Samson, Cairns, 1977/.

В настоящее время накоплен большой экспериментальный материал, свидетельствующий о широком спектре биологических объектов, в котором малые дозы агентов самой различной природы (в том числе, ионизирующей радиации, химических мутагенов, теплового шока, гипоксии) инициируют реакции адаптивного ответа у клеток и целостных организмов. В качестве критериев повреждения клетки и цельного организма используют выживаемость, уровень- аберраций хромосом, микроядер и генных мутаций /Rieger е.а., 1992/. Снижение уровня аберраций хромосом после воздействия токсической дозы агента у организмов, предварительно обработанных низкими дозами мутагена, составляет суть явления кластогенной адаптации /Heindorff et al., 1987; Rieger et al., 1990/ и неотъемлемую часть реакции адаптивного ответа.

Многие авторы отмечали неспецифичность феномена адаптивного

ответа в отношении природы повреждающего агента. Таким образом речь идет о явлениях, инициация которых обусловлена каким-то об щим механизмом, присущим всем живым клеткам /Эйдус, 1994/.

Данные литературы свидетельствуют о том, что преэкспозицн организма малыми дозами ГБО повышает его устойчивость к боле высоким давлениям. Такие данные получены на дрозофиле /КЮск Winkle , 1979/,крысах /Kravets е.а.,1980; Коробова 1984/. Однако генетические аспекты повышения устойчивости к ГБО до настоящег времени были недостаточно изучены, поэтому вопрос о клеточнь; механизмах повышения резистентности к экстремальным дозам ГЕ организмов, предварительно обработанных малыми дозами кислорол под давлением, остается открытым.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью настоящей работы явилось исследование реакции сомати ческих клеток и плазмы крови млекопитающих на токсическое воз действие ГБО, выделение генетических и биохимических параметров адекватно отражающих степень адаптивной реакции организма и окислительный стресс после различных режимов предобработки ГБО.

Для достижения этой цели нами были сформулированы следувщи задачи:

1. Оценить уровень изменения аберраций хромосом после воэ действия различных режимов гипербарической оксигенации.

2. Определить в костном мозге уровень адреналина и други катехоламинов, отражающих степень стрессорного воздействия.

3. Определить в крови животных уровень перекисного окисле ния липидов и активность ферментов антиоксидантной защиты.

4. Исследовать в костном мозге и плазме крови степень дег радации нуклеопротеидов по динамике молекул средней массы.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. У крыс и мышей, обработанных 0,2 МПа кислорода в течени 1 часа (5 сеансов) после воздействия 0,7 МПа 02 снижается урс вень аберраций хромосом в роговице глаза и костном мозге, г сравнению с уровнем аберраций, индуцированным однократным воэ действием 0,7 МПа кислорода.

2. Биохимические показатели окислительного стресса у животных, обработанных 0,2 МПа кислорода в течение 1 часа (5 сеансов), отражают повышение резистентности к повышенному парциальному давлению кислорода.

3. Уровень перекисного окисления липидов в клетках костного мозга животных коррелирует с цитогенетическим эффектом ГБО.

' НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

В данной работе впервые у двух видах животных - мышей и крыс - исследованы цитогенетические и биохимические показатели после воздействия судорожных режимов после предобработки низкими дозами ГБО, а также выявлены оптимальные режимы предобработки. Обнаружена высокая степень корреляции между биохимическими показателями окислительного стресса, уровнем перекисного окисления липидов и уровнем аберраций хромосом в костном мозге животных.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Полученные в работе данные представляют существенный интерес с точки зрения поиска генетических и биохимических механизмов повышения резистентности животных к окислительному стрессу. Взаимосвязь между чувствительностью генетического аппарата клеток костного мозга к стрессорным воздействиям, и такими биохимическими показателями, как содержание диеновых конъюгатов и шиф-фовых оснований, позволят в дальнейшем создать простые чувствительные экспресс - методы, на основе которых можно превентивно оценивать степень устойчивости организма к окислительному стрессу.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации доложены на научной сессии биолого-почвенного факультета РГУ (1989, 1994, 1996), на III Международной конференции "Экология города" (Ростов-на-Дону, октябрь 1994), на IV Международном конгрессе "Адаптационная медицина" (Хандигарг (Индия), 1995).

ПУБЛИКАЦИИ.

По материалам данного исследования опубликовано 4 работы.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация выполнена на /УУ. страницах машинописного текс та и состоит из введения, четырех глав, выводов и библиографи ческого указателя, включающего отечественных и зарубежнь источника. Работа иллюстрирована 29 таблицами, 20 рисунками и схемой.

МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперимент проводили на белых беспородных крысах и мышах самцах. Животных подвергали действию кислорода под давлением специальных барокамерах со щелочным поглотителем углекислот Компрессию и декомпрессию проводили со скоростью 0,1 МПа минуту.

Были исследованы следующие режимы предобработки ГБО:

-0,2 МПа в течение 1 часа ;

-0,2 МПа в течение 5 часов ;

~ 2, 3 или 5 сеансов 0,2 МПа/1 час с интервалом 12ч ш 24ч.

Дли установления направленности действия вышеисследованнь режимов . животные каждой группы подвергались через 24 часа пос! окончания последнего сеанса предобработки однократному воздейс твию 0,7 МПа 02 ДО судорог.

Животных декапитировали сразу после окончания воздействи кислорода, а также через 12 часов или через сутки после гиперок сии для биохимических и цитогенетических исследований.

0 влиянии предобработки низкими дозами ГБО судили по следу ющим показателям:

1. Летальность животных в течение 24 часов после действи гипероксии.

2. Уровень аберраций хромосом в костном мозге и роговице.

3. Содержание катехоламинов в костном мозге.

4. Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ в мембранах эритроцитов.

5. Активность антиокислительных ферментов в плазме крови эритроцитах.

6. Степень деградации нуклеопротеидов в плазме крови

костном мозге.

После забоя у животных собирали кровь, плазму центрифугированием отделяли от эритроцитов. В плазме крови и эритроцитах определяли активность супероксиддисмутазы /Winterborn е. а., 1975/ и каталазы /Королюк и др., 1988/. Выделяли мембраны эритроцитов /Колчинская и др., 1976/, из них экстрагировали липиды /Bligh, Dyer, 1959/ и определяли уровень продуктов ПОЛ - диеновых конъ-югатов /Владимиров, Арчаков, 1972/ и шиффовых оснований /Bid-lack, Tappel, 1973/, содержание которых расчитывали в отношении к содержанию общих липидов /Колб, Камышников, 1982/.

Костный мозг вымывали из трубчатых костей физиологическим раствором. В костном мозге определяли содержание катехоламинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии флюориметри-ческим детектором /Хеншен и др., 1988/. В костном мозге и плазме крови изучали динамику молекул средней массы (Габриэлян, Липатова, 1989); поглощение образцов исследовали в ультрафиолете при длинах волн 210, 254 и 280 нм. При >=280 нм расположен максимум поглощения ароматических аминокислот, что соответствует фракции мелкодисперсных белковых фрагментов, т.е. среднемолекулярных пептидов з составе общего пула средних молекул. При >.=254 нм находится максимум поглощения средних молекул, не содержащих ароматических аминокислотных компонентов, возможно, фрагментов нуклеиновых кислот. При х=210 нм находится максимум поглощения средних молекул, имеющих пептидную связь.

Для цитогенетических исследований готовили постоянные препараты костного мозга. Глазные яблоки фиксировали в ацеталкоголе в течение 24 часов, затем готовили временные давленые препараты роговицы по стандартной методике /Гостимский, 1974/. В препаратах костного мозга и роговицы проводили анафазный анализ, в ходе которого учитывали хромосомные фрагменты, хроматидные фрагменты, хромосомные и хроматидные мосты. В каждом варианте анализировали не менее 1500 анафаз.

Достоверность полученных различий оценивали согласно t-кри-терия Стьюдента для средних арифметических из независимых выборок /Лакин, 1990/.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Поскольку большинство экспериментов, посвященных изучении кластогенной адаптации, проведено на растительных объектах и, главным образом, на клетках меристемы корешков /Riegeг е1 а1., 1985; 1990; 1993/ нами был поставлен эксперимент, целью которой было выявить возможности кластогенной адаптации к окислительному стрессу у млекопитающих.

В качестве основных критериев развития адаптивного ответг обычно используют выживаемость животных и изменение уровня аберраций хромосом. Следовательно, если предварительное воздействш кислорода под низким давлением увеличит устойчивость к повторному воздействию кислорода под высоким давлением, можно говорить < развитии адаптивного ответа на ГБО.

Влияние предварительного действия низкими давлениями кислорода на летальность после воздействия судорожного режима гипе-роксии.

Как видно из таблицы 1. предварительное воздействие на мышей 1, 3 и 5 сеансов 0,2МПа/1 час снижало летальность при 0,' МПа до судорог на 30-50%. У предобработанных низкими дозами ГБ! крыс после действия судорожного режима гипероксии наблюдалоа

Таблица 1

Летальность у мышей после предварительной обработки низкими дозами ГБО (п=20)

1 1 Вариант Время в кисло- 1 Летальность |

1 эксперимента 1 родной среде (в %) |

1 1 1 > ! 0 ч | 24 ч ! 1 |

1 10, 7 МПа 42 мин 1 1 50 | - |

[0, 2 МПа/1час(1 сеанс)+ 0,7 МПа 42 мин 1 - 1

10,2 МПа/1час(3 сеанса)+ 0,7 МПа 35 мин 1 - 1

|0,2 МПа/1час(5 ( сеансов)+ 0, 7 ЫПа 35 мин 1 20 [ I 1

Таблица 2.

Летальность у крыс после предварительной обработки низкими дозами ГБО (п=10)

1 | Вариант 1 1 Время в 1 1 |Летальность(в%)|

1 эксперимента I кислородной 1

1 1 1 среде 1 1 0 ч 1 24 ч I

1 |0,7 МПа 1 1 1 ч 07 МИН 1 1 50 50 1

|0,2 МПа/1час(5 сеансов)+ 0,7 МПа| 54 мин ! 75 |

|0,2 МПа/1час(5 | часов)+ 0,7 МПа | 44 мин [ I 25 | 35 | 1

снижение летальности на 25-40% по сравнению с контролем (табл.2).

Влияние предварительного действия низкими давлениями кислорода на уровень аберраций хратосоя после воздействия судорожного режима гипероксии.

Количество клеток с хромосомными перестройками в костном мозге интактных мышей варьировало в наших экспериментах в пределах 1,1 ± 0,26%. У мышей после действия 5 сеансов предобработки по 0,2 МПа с интервалом 24 ч уровень аберраций хромосом в клетках костного мозга увеличивается и достигает 11,1 ± 1,38 %. Судорожный режим гипероксии также приводит к значительному увеличению количества клеток с поврежденными анафазами - до 7,9 ± 0,70 %.

Предобработка малыми дозами ГБО во всех вариантах (1, 2, 3 или 5 сеансов 0,2 МПа/1 час) снижала выход аберраций хромосом в костном мозге мышей по сравнению с уровнем хромосомных перестроек, индуцированным однократным воздействием судорожного режима ГБО. В случае, когда был использован вариант предобработки 0,2 МПа/1час-5 сеансов, уровень хромосомных перестроек после воздействия токсического режима 0,7 МПа не превышал контрольных значений. Более того, через 5 суток после действия судорожного режима ГБО на предварительно обработанных в варианте (5 сеансов 0,2 МПа/1 час) процент аберрантных анафаз у животных этой группы

Таблица 3

Уровень аберраций* хромосом в клетках костного мозга мышей после предварительной обработки низкими дозами ГБО (в % от общего числа проанализированных анафаз)

1 |Постановка (эксперимента Время после действия ГБО 1 1 | Уровень АХр | I М + т 1 1 |

I Контроль I0,2 МПа 02,5 сеансов . 1 Р 24 ч 1 ! 1 1,1 ± 0,26 | |11.1 ± 1.38 | |< 0,001 | 1 |

10,7 МПа 02.судороги 1 Р 24 Ч 1 1 I 7,9 ± 0,70 | !< 0,001 ! 1 1

|0,2 МПа 02.5 сеансов + 1+0,7 МПа 0г,судороги ! Р 24 Ч I 1 1 1 I 1,2 ± 0,25 | ] > 0, 1 ' |

I0,2 МПа 02,5 сеансов + 1+ 0,7 МПа 02, судороги 1 Р 1 5 суток 1 1 1 1,2 ± 0,34 | 1 > 0, 1 | 1 1

практически не отличался от контроля. .

Таким образом, среди различных использованных нами вариантов предобработки мышей низкими дозами, для развития адаптивного ответа по критерию хромосомных аберраций вариант 0,2 МПа / 5 сеансов оказался более эффективным, нежели иные варианты - 1, 2 или 3 сеанса 0,2 МПа.

Исследование тех же вариантов предобработки, проведенное на крысах, показало лишь тенденцию кластогенной адаптации (табл.4). Различия между вариантами 0,2 МПа/5 сеансов и 0,2 МПа/5 сеансов +0,7 МПа находятся на нижней границе достоверности. Однако, уже сам факт,что воздействие 0,7 МПа до судорог на животных, подвергавшихся предварительному действию низких доз ГБО, не увеличивает уровень аберраций хромосом, свидетельствует о возникновении

и

Таблица 4

Уровень аберраций хромосом в клетках костного мозга крыс после предварительной обработки низкими дозами ГБО {в % от общего числа проанализированных анафаз)

1 [Постановка 1 1 1 Уровень АХр 1

1 эксперимента 1 I I М ± ш |

I Контроль 1 1 3,7 ± 0,54 |

| 0,2 МПа 02, 5 сеансов | 16,1 ± 1,38 |

1 Р 1 1 <0,01 |

|0,7 МПа 02, 1 судороги | 29,6 ±1,56 |

1 Р 1 <0,01 |

10, 2 МПа 02. 5 сеансов +|

|+ 0,7 МПа С 2, судороги | 13, 1 ± 1,03 |

1 Р 1 -------- г 1 <0,01 | |

некоторой устойчивости животных к экстремальному воздействию.

Таким образом, мы получили подтверждение возможности повышения устойчивости экспериментальных животных к ГБО, используя основные критерии развития адаптивного ответа - снижение летальности и уменьшение уровня аберраций Хромосом после воздействия токсической дозы агента, если ему предшествует воздействие низких доз /Филиппович, 1991; Ригер, 1988/.

Различия в степени адаптивной устойчивости крыс и мышей, наблюдаемые в наших экспериментах, возможно, являются проявлением различной видовой чувствительности к повышенному парциальному давлению кислорода, которая Определяется генетически детерминированными свойствами клеточных мембран и функциональным-состоянием про- и антиоксидантных систем.

Сравнение влияния предварительного действия малыми дозами ГБО на индуцируемый токсической дозой уровень аберраций хромосом в костном мозге и роговице, свидетельствует о различной чувствительности этих тканей к кислороду. Роговица в наших эксперимен-

тах как у мышей, так и у крыс показала более низкую чувствительность к ГБО по сравнению с костным мозгом. Это может быть связано с особенностями пролиферации данной ткани - протяженным мито-тическим циклом и топологическими особенностями замещения стареющих клеток эпителия роговицы. Однако, необходимо отметить, что факт снижения уровня аберраций хромосом, индуцируемых токсической дозой ГБО, после предварительной обработки малыми дозами ги-пероксии, зафиксирован нами и в этой ткани, которая, в отличие от костного мозга, непосредственно контактирует с гипероксичес-кой средой.

Таким образом, на основании полученных данных нами был сделан вывод о том, что, несмотря на некоторые различия в проявлении у двух исследованных групп лабораторных животных, и в двух исследованных тканях, возможность развития адаптивного ответа на ГБО по цитогенетическим показателям у млекопитающих вполне реальна.

Динамика некоторых биохимических показателей может дать существенную информацию о процессах, определяющих возможности адаптации животных к экстремальным воздействиям ГБО. В этой связи были поставлены эксперименты, результаты которых позволяют оценить показатели стрессорного состояния организма и защитную роль катаболитических процессов.

Влияние предварительного действия низкими давлениями кислорода тсодержание моноаминов в костном мозге крыс после воздействия судорожного режима гипероксии.

Учитывая ражную роль гормонов и нейромедиаторов в адаптационных реакциях организма при экстремальных воздействиях, представлялось важным исследовать уровень адреналина и других катехо-ламинов в костном мозге животных, предварительно обработанных низкими давлениями кислорода. Были вычислены коэффициенты, характеризующие относительную активность процессов синтеза и метаболизма ,катехоламинов.

Проведенные исследования выявили следующее. Воздействие на животных токсической дозой кислорода 0,7 МПа характеризовалось снижением относительной активности синтеза адреналина на фоне повышения его содержания по сравнению с исходными величинами.

Предварительное воздействие 0,2 МПа/1ч характеризовалось после окончания 5-го сеанса незначительным снижением содержания всех исследуемых показателей, при этом отношение ДА/ДОФА возрастает с О,42 (контрольное значение) до 6,76. Через 24 ч после предварительного воздействия наблюдается значительное повышение содержания норадреналина в костном мозге крыс, происходящее за счет усиления относительной активности его синтеза (соотношение НА/ДА составило 13). Описанные изменения свидетельствуют об активации медиаторного звена симпатико-адреналовой системы после пяти сеансов 0,2 МПа/1час. Воздействие 0,7 МПа кислорода на предобрабо-танных животных не выявило усиления относительной активности синтеза адреналина, что может свидетельствовать об определенной адаптации к стрессорному фактору. В то же время содержание норадреналина и дофамина у этих животных резко возросло; через 24 ч активация медиаторного звена сохранялась, что свидетельствует о больших адаптационных возможностях симпатико - адреналовой системы у животных данной группы /Тигранян, 1990/.

Влияние предварительного действия низкими давления/,га кислорода на уровень свободнорадикального окисления после воздействия судорожного режима гипероксии.

Резкое увеличение напряженности кислорода в тканях при гипероксии обусловливает усиленное образование активных интермеди-атов восстановленного кислорода. Эти соединения неизбежно инициируют цепной процесс перекисного окисления лйпидов в липидной фазе биомембран, который рассматривается как пусковой и усиливающий механизм кислородной интоксикации (Фридович, 1979; Кричевс-кая. 1980): сами продукты перекисного окисления могут поражать различные структуры клетки, в том числе, нуклеиновые кислоты (Seto, 1983; Joenje, 1989). В связи с этим исследовали характер ПОЛ в организме по динамике его молекулярных продуктов у животных, предварительно обработанных низкими давлениями кислорода.

Действие токсического режима ГБО (0,7 МПа, судороги) приводит к резкой активации перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов мышей: уровень диеновых конъюгатов увеличивается на 124%, содержание шиффовых оснований- на 569 % (рис.1 и 2). Многократное действие низких режимов ГБО (0,2 МПа,5 сеансов) также

Рис.1. Содержание диеновых конъюгатов в меморгнах оритрсцкттсв мышей сразу после ГЕО и через 24 часа.

1 - 0,7МПа кислорода, судороги

2 - 0,2МПа кислорода, 5 сеансов

3 - 0,2МПа кислорода, 5 сеансов + 0,7МПа кислорода, судороги

вариант эксперимента

Рис.2. Содержание шиффовых оснований в мембранах эритроцитов мышей сразу после ГБО й через 24 часа.

1 - 0,7№Па кислорода, судороги

2 - 0.2МПа кислорода, 5 сеансов

3 - 0,2МПа кислорода, 5 сеансов + 0,7№Па кислорода, судороги

способствует значительной активации свободнорадикального окисления - уровень первичных и конечных продуктов ПОЛ возрастает на 80 % и 429 % соответственно. При последовательном действии 5 сеансов ГБО (0,2 МПа,1ч) и 0,7 МПа кислорода содержание диеновых конъюгатов остается в пределах нормы, а уровень шиффовых оснований превышает контроль на 396%. Вместе с тем, через 24 ч после исследованных режимов ГБО и их совместного последовательного действия уровень диеновых конъюгатов снижается на 71-72%, содержание шиффовых оснований не отличается от контроля, что может указывать на активацию антиокислительных механизмов.

При этом предварительное воздействие 5 сеансов ГБО (0,2 МПа) не предотвращает ингибирования антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы и каталазы при последовательном действии низких и высокого режимов ГБО. По-видимому, ингибирование ПОЛ в мембранах эритроцитов предадаптированных животных может быть связано со стимуляцией глутатион-зависимых антиоксидантных ферментов, регулирующих ПОЛ на стадии продолжения и развития цепи, а также не исключено повышение уровня низкомолекулярных антиок-сидантов.

В том случае, когда после 5 сеансов низких давлений организм подвергается воздействию 0.7 МПа кислорода, наряду с резким снижением общего уровня аберраций хромосом до значений, близких к контролю, активность антиоксидантных ферментов также снижается. Эти данные могут служить подтверждением полученных ранее свидетельств о несущественном вкладе антиоксидантных ферментов в защиту генома соматических клеток от окислительного стресса.

Итак, предварительное многократное действие низких режимов ГБО (0,2 МПа/1ч, 5 сеансов) способствует меньшей активации пере-кисного окисления липидов при токсическом режиме гипероксии. Можно полагать, что снижение скорости свободнорадикальных процессов в результате предобработки низкими дозами ГБО свидетельствует о повышении резистентности организма к стрессорным факторам гипероксии и активации компенсаторных процессов.

Большинство авторов, исследующих генетику окислительного стресса, считают причиной мутагенного эффекта непосредственно увеличение концентрации активных форм кислорода, контакт с кото-

рыми вызывает деструкцию хроматина и , следовательно, все тип мутаций /Brown е. а., 1977; Bruynickx е. а., 1978; Baiin е. а. 1977/. Однако, в течение последних лет появился ряд работ, в кс торых было показано, что собственно активные формы кислорода н являются эффективным индуктором мутационных событий. Так. в мо дельных экспериментах показано, что двунитевая ДНК в высоко степени устойчива к кислороду под давлением, а индукция активны интермедиатов кислорода добавлением металла с переменной валент ностью вызывает весьма незначительное количество разрывов п сравнению с однонитевой ДНК или РНК /Водолазкин и др., 1987/.

С этой точки зрения, представление об опосредованном эффек те ГБО, изложенное ранее в виде гипотез /Гуськов, 1989; Halli well, 1990/, исходя из результатов представленных нами экспери ментов, кажется более реальным. В этой связи весьма перспектив ным может оказаться возможность прогнозирования уровня аберраци: хромосом после стрессорных воздействий по оценке уровня ПОЛ ана лизируемых тканей.

Влияние предварительного действия низкими давлениями кисло рода на уровень деградации нуклеопротеидос после воздействия судорожного режима гипероксии, оцениваемый по содержанию молеку, средней массы.

В ответ на действие гипероксии способствовать адаптации ] ГБО может усиление азотистого катаболизма, продукты которого, возможно, играют модулирующую роль /Гуськов, Лукаш, 1987/. Промежуточные продукты катаболизма белков и нуклеиновых кислот, определяемые как молекулы средней массы (МСМ), накапливаются t крови при различных патологиях /Чаленко, 1991/. Высокая биологическая активность МСМ подтверждена рядом исследований /Туликова, 1983: Вальдман, 1991/; в частности, как одного из эндогенных регуляторов уровня ПОЛ в тканях. Выявлено, что организм способен реагировать на нарушения кислородного гомеостаза изменениями уровня молекул средней массы в крови /Виноградов, 1994/. В связи с этим была исследована оптическая активность МСМ в плазме и костном мозге крыс, предварительно обработанных низкими давлениями кислорода.

Среднее содержание молекул средней массы в костном мозге

крыс в норме составило 0,06 ± 0,004 усл. ед. (Е2ю нм). 0,02 ± 0,04 усл. ед. (Е254 нм) и 0,01 ± 0,003 усл. ед.(Е280 нм>- Действие токсической дозы ГБО 0,7 МПа до судорог привело к резкому росту всех показателей: на 138%, 179% и 231% соответственно. Предварительное воздействие на животных 0,2МПа/1час - 5сеансов не выявило достоверных изменений какого-либо из исследуемых показателей. В варианте (0.2 МПа/1ч-5сеансов +0.7 МПа) зафиксированы промежуточные значения между результатами, полученными при экстремальном воздействии и индуцированными пятью сеансами действия малых доз ГБО. Через 24ч на всех трех длинах волн обнаружено, что в варианте 0.7 МПа сохранялись значения на уровне, несколько превышающем контроль, в то время как у предобработанных животных эти показатели соответствовали контролю или были несколько ниже.

В плазме крови крыс среднее содержание молекул средней массы в норме составило 7,99 ± 0,356 усл. ед. (Е2ю нм). 0,95 ± 0,053 усл. ед (Е254 ни) и 1,61 ± 0,055 усл. ед. (Е230 Нм)- После воздействия 0.7 МПа зафиксировано на просмотренных длинах волн незначительное увеличение содержания МСМ. После воздействия токсической дозы ГБО на предобработанных животных нами обнаружено достоверное увеличение в плазме крови всех исследуемых показателей по сравнению с контролем: на 20%, 65% и 74% соответственно; через сутки содержание МСМ не отличается от контроля. Обобщая полученные данные, мы можем сделать вывод, что в наших экспериментах уровень МСМ отражал развитие некоторых адаптивных изменений у животных, подвершихся предварительному воздействию малых доз ГБО, проявившееся в снижении летальности, уровня аберраций хромосом и скорости процессов свободнорадикального окисления.

К настоящему времени установлено, что свободнорадикальные процессы и другие процессы тканевого и клеточного метаболизма взаимосвязаны. С одной стороны свободнорадикальные повреждения усиливают катаболизм, с другой - многие продукты катаболизма способны модифицировать интенсивность свободнорадикальных процессов. Так, продукты липолиза и фосфолиполиза, внеэритроцитар-ный гемоглобин и его железосодержащие дериваты обладают проокси-дантным действием /Лукаш, Внуков, 1981/. Предложена концепция

протекторного катаболизма, суть которой состоит в том, что генетически запрограммированная гибель неустойчивых к действию гипе-роксии клеточных линий в тканях системы крови способствует накоплению низкомолекулярных азотистых катаболитов - антиоксидан-тов, защите других клеток и тканей от окислительного повреждения и предсавляет собой один из возможных механизмов адаптации к условиям ГБО /Гуськов, Лукаш, 1987/.

Уровень свободнорадикальных процессов у живых организмов контролируется различными системами антиоксидантной защиты, как ферментативными, так и неферментативными. После кратковременных режимов преадаптации процессы синтеза ферментов антиоксидантной защиты не играют ведущей роли для повышения резистентности организма к последующему воздействию экстремальной дозы кислорода, о чем свидетельствует низкий уровень активности исследованных антиокислительных ферментов у преадаптированных животных. Вполне вероятно, что повышение резистентности обеспечивают именно продукты усиливающегося в результате ГБО катаболизма, которые регистрируются как увеличение содержания молекул средней массы.

Таким образом, наши исследования показали, что некоторые режимы предобработки низкими дозами крыс и мышей к экстремальному воздействию 0,7 МПа 02 снижают летальность, уровень аберраций хромосом в роговице и костном мозге, стабилизируют процессы пе-рекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов. Выбор режимов, способствующих повышению устойчивости к экстремальным воздействиям, видоспецифичен, более того, связан не только с видовыми особенностями генетико-биохимических систем, ответственных за увеличение резистентности, но и с индивидуальными особенностями организма. Дальнейшие исследования генетико-биохимических механизмов повышения резистентности к экстремальным формам окислительного стресса может позволить выделить ключевые параметры, ответственные за адаптацию.

ВЫВОДЫ

1. Предобработка 5-ю сеансами ГБО в режиме 0,2 МПа/1час с интервалом 24часа снизила летальность после воздействия экстремальной дозы 0,7 МПа 02 на 30% у мышей и на 25% у крыс по сравнению однократным действием 0,7 МПа кислорода.

2. Предобработка 5-ю сеансами ГБО в режиме 0,2 МПа/1час с интервалом 24часа снизила уровень аберраций хромосом после воздействия экстремальной дозы 0,7 МПа по сравнению с уровнем аберраций, индуцированных однократным воздействием 0,7 МПа кислорода.

3. Динамика моноаминов, в частности, адреналина, в костном мозге крыс указывает на повышение резистентности к действию 0,7МПа кислорода после предварительного воздействия малых доз ГБО.

4. Пятикратное воздействие низких доз ГБО сопровождалось снижением накопления первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюга-тов в мембранах эритроцитов: сразу после воздействия токсической дозы 0,7 МПа - до контрольных значений, через 24 часа последействия - на 72% по сравнению с контролем.

5. Пятикратное воздействие низких доз ГБО сопровождалось снижением накопления конечных продуктов ПОЛ - шиффовых оснований в мембранах эритроцитов: сразу после воздействия токсической дозы 0,7 МПа - от 569% /у животных, подвергшихся однократному воздействию ГБО в режиме 0,7 МПа/ до 396%, через 24 часа последействия - до контрольных значений.

6. Предварительное воздействие на животных малых доз ГБО не предотвращало ингибирования антиоксидантных ферментов СОД и ка-талазы в эритроцитах животных при действии 0,7 МПа 02.

7. Содержание МСМ в плазме крови предобработанных 5-ю сеансами ГБО крыс после действия токсической дозы кислорода было достоверно выше, чем у интактных.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. 0 механизмах клеточной преадаптации мышей к повышенному давлению кислорода // Цитология. - 1991. - т.33. - N5. - С. 90-91 (соавт. Гуськов Е.П.).

2. Предобработка низкими дозами мутагена повышает устойчивость к экстремальным факторам среды // В: Сб. статей асп. РГУ.

- Ростов-на-Дону: изд. РГУ. 1994. - с.62-64.

3. Цитогенетические и биохимические аспекты адаптации организма к экстремальным факторам окружающей среды // В: Тез. докл. III Межд. конф. "Экология города".- Ростов-на-Дону, 1994. -с.87 (соавт. Кения М.В.).

4. Antimutagenic effect of adaptation to hyperbaroxygenati-on // In: IV World congress of adaptive medicine. - India, 1995.

- P.23.

ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ. ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

А - адреналин

АХр - аберрации хромосом

ГБО - гипербарооксигенация

ДА - дофамин

ДОФА - диоксифенилаланин

МПа - мегапаскаль

МСМ - молекулы средней массы

НА - норадреналин

ПОЛ - перекисное окисление липидов