Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиолого-биохимические особенности синтеза белков теплового шока в клетках спирулины

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимические особенности синтеза белков теплового шока в клетках спирулины"

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ РАСТЕНИЙ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУВЛИКИ ТАДЖИКИСТАН

На правах рукописи УДК — 581.1 : 582.232 ; 275.11

РАХМАТУЛЛОЕВА Мамлакат Негматуллоевна

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СИНТЕЗА БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА В КЛЕТКАХ СПИРУЛИНЫ

03. 00. 12 — физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ДУШАНБЕ— 1993

Работа выполнена на кафедре биохимии Таджикского государственного университета

Научный руководитель—член-корреспондент АН Республики

Таджикистан, доктор биологических наук, профессор М. М. ЯКУБОВА

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор К. А. АЛИЕВ,

кандидат биологических наук, доцент X. X. ХИСОРИЕВ

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, г. Москва.

Защита состоится « ^ » ]993 г. в</^;час на заседании

Специализированного совета Д. 013. 08.01 в Институте физиологии и биофизики растений АН Республики Таджикистан (734063), г. Душанбе, ул. Айни, 299/2).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. И. Ганди АН Республики Таджикистан.

Автореферат разослан « Р » 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

доктор биологических наук /Члу^Л В.В.ИВАНЩЕВ

0Б1цАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Цианобактерии,или синезеленые водоросли, являясь объектом индустриального фотосинтеза,привлекают всё большее внимание исследователей.Высокое содержание в клетках белка при искусственном выращивании и наличие в его составе всех незаменимых аминокислот делаот перспективным массовое культивирование этих микроорганизмов в качестве эффективного продуцента белково-витаминного комплекса.

К настоящему времени проведены разносторонние физиолого-генетическйе и биохимические исследования микроводорослей , как объектов культивирования,что составляет основу биотехнологии получения различных биологически активных соединений ( Clement ( Landeghea ,1971; Сиренко, 19Ь7,Тол-лербах,1Ш7;Кшдратьева и др.,1991 )./1зучена биофизика по -пуляций синезеленых водорослей как фотосинтезирующих систем, способы и техника их интенсивного культивированияССэкенен -ко (19В7).Для разработки оптимальных условий промышленного культивирования важное значение имеет исследование устойчивости этих организмов к действию неблагоприятных факторов среды:супероптшальной температуры,отсутствию освещения , СО^ .В связи с этим изучение синтеза белков при гипертермии имеет теоретическое и прикладное значение для получения устойчивых к неблагоприятным факторам среды ютаммов синезеленых водорослей.

Работы в данном направлении не>.исгочислены и их расширение и углубление даст ключ к пониманию физиологических принципов резистентности цианобактерий к супероптимальным факторам среды,что будет иметь большое практическое значение для самых разнообразных биологических объектов и , в том числе, некоторых штаммов микроорганизмов.Производственное выращивание микроводорослей предполагает использование технических устройств »нарушение нормального функционирования которых может привести к существенному нарушении оптимальных условий культивирования.Поэтому решающее значение приобретает способность используемых объектов к перенесению неблагоприятных ситуаций и реактивации после выведения па -

раметров вирацивзния на оптимальные уровни.

Во флоре Таджикистана богато представлены синезеленые водоросли - сто видов,две разновидности и одиннадцать форм. Все они пригодны для хозяйственного использования (Батури -на,1987 ), поэтому возникает необходимость изучения физиоло-го-биохшических механизмов их устойчивости к неблагоприятным внешним условиям,в частности, к повышенной температуре.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось изучение закономерностей синтеза белков теплового шока (БГШ) в клетках цианобактерии спирулины. Дтя достижения поставленной цели решались следующие экспериментальные задачи:

- установить динамику накопления белка в зависимости от плотности суспензии с I по 14 день культивированияj

- исследовать жизнеспособность и последующий рост спирулины при различных режимах теплового шока,определить, при какгс режимах происходит синтез БШ ;

- определить, в какой период культивирования происходит синтез БШ ;

- изучить действие хлорамфеникола-шгибитора синтеза бел • ка на 70 s рибосомах-на синтез НГШ в клетках спирулины;

- установить количество синтезированных novo белков .

Научная новизна и практическое значение работы. Впервые проведено изучение влияния супероптимальной температуры на белковый синтез в клетках спирулины.Проведено сравнительное биохимическое и физиологическое исследование влияния высо -кой температуры на синтез полипептидов в различные периоды культивирования микроводоросли с I по 14 день.Установлено, что синтез БТШ у спирулины зависит от стадии культивирований и соответствует 3-му периоду (12 дням ),когда происходит синтез белков &в novo в ответ на сдвиг температуры . Шоковой (супероптимальной) является температура 4&°С.№ак -сииальная индукция синтеза стрессовых белков имела место через 15 минут воздействия супероптиыальной температурой.

Установлено,что при нормальном режиме культивирования (30~35°С) характерными для спирулины являются полипептиды со следующими ¿»пекулярными массами; ей , 72 , 7b ,82,5 ,

ЬЬ и 90 кДа. Впервые обнаружены в клетках спирулины БГ111 с молекулярными массами: 7о , 73,1/ , и 94 кДа .

Показано, что БТШ спирулины 8^,5 кДа аналогичен БТШ высших растений, это свидетельствует об эволюционной связи прокариот и эукариот в биосинтезе высокомолекулярных ЕГШ, Полученные результаты указывает на возможность культивиро -вания спирулины при супероптимальных температурах .

Разработан простой и эффективный метод экстрагирования белков из клеток спирулины, который учитывает специфическое строение клеточной оболочки этсй микроводоросли..Данный метод может быть использзезя при работе с любыми одноклеточными организмами.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на Республиканских конференциях молодых ученых и спецка -листов(Душалбе,19ь9,* Худаанд ,1990 ),на Всесоюзном съезде физиологов растений (кинск,1990 ), Айодународной конференции " Фотосинтез и фотобиотехнология " ( Пуцино,1991 ), У конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Тша-кент ,1991 ).й законченном виде работа доложена и обсуядена на заседании кафедры биохимии Таджикского Госуниверситеяа и совместном семинаре лабораторий физиологических основ интенсивного растениеводства и молекулярной энзиыологии Института физиологии к биофизики растений АН Республики Таджикистан.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 работ .

Структура и объем диссетяации..Диссертационная работа состоит из введения,обзора литературы,описания объектов м методов, изложения результатов исследования и их обсуждения.списка литературы. Работа иллюстрирована 17 рисунками,& таблицами . Список цитируемой литературы содержит 85 наименований ,из которых 60 зарубежных авторов .Общий объем диссертации страниц?машинописного текста .

объект и жгода исследования

В качестве объекта исследования использовали цианобактерио (сдаезеленую водоросль )3р1ги11.па р1аг-епа 1<ь>Рогласно 000 " ременньш систематическим данным этот вид относится к

классу Horaogoniophyceae ,порядку Oscillatoriales ,

семейству OscillacoTiacsae , рода- Spirulina .Штамм был получен из института ''Биотехника " ( г;Москва ). Синхрон и -

зацию культуры проводили попеременным выдерживанием на свету и в темноте , центрифугируя и путем фильтрации,а также согласно методам,принятым в БиНИк ЛГУ ( г.Садкт - Петербург) ( Громов ,I9ôb ).

Клетки водоросли имеют форму спирали,размер клеток достигает 250 - 300 М2 . Трихомы без гетероцист , способны к вращательным и поступательным движениям .Размножаются фрагментами трихом .Суспензионную культуру цианобактерии выращивали на модифицированной среде Заррука ( Zarrouic , I9ôo ) в лабораторных условиях .Влияние экстремальных температур изучали при культивировании спирулины в сосудах объемом 30 мл при освещенности 3 ООО люкс . Для подсчета числа клегок в суспензии микроводоросли использовали камеру Нажжет а ( Киселев ,1969 ). Содержание белка определяли по методу Лоури ( Lowry et al. , IS5I ) и с помощью препарата ■ Bio га& protein assay- " û y e " (ФРГ ). Спектры погло -щения регистрировали на спектрофотометре Sainadzu UV - 250 ( Япония ). Клетки всех вариантов экспериментов до начала действия высокой температуры инкубировали в течение I ча -са в присутствии меченой аминокислоты s - ыетионина ( 400 МБК / мл) и хлорамфеникола ( Ь мг / л .). Определение скорости включения S - метионина в белок проводили методом Кеннела ( 1970 ). Радиоактивность белка регистрировали на сцинтшшционном счетчике KAllAC - К17 ( 1KB , Швеция ) и определяли включение метки в белок по методу Манса и Новели ( Mans , Kovelli ,I9ÔI-). Суммарный бе -лок фракционировали с использованием метода электрофореза в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия по методу Дэмли ( Laealli , 1970 ) , на приборе для вертикального гель - электрофореза ( 1KB „Швеция ). Градиент концентрации полиакриламида соответствовал 7,5 - . 20 % . Ь качестве маркеров использовались белки следукндих

молекулярных масс : фосфорилаэа А - 94 к ¿Ja ,бычкй сывороточный альбумин - 67 кДа. , о в альбумин - 43 кДд , трипсин - ингибитор - 20,1 кДа С Serva ). Дзнситометрко окрашенных гелей проводили на денситометрах " взсю'АИ " и " isco " ( США ).

Получение суммарного препарата белка проводили разработанным нами методом, учитывая специфическое строение клеточной оболочки цианобактерий. Суспензии всех вариантов опыта ,под-веркенних действии " шоковой " температуры , а также конт -рольные образцы в объеме 10 мл центрифугировали ( 10 тыс.об./ мин,10 мин Sorval ). К осадку добавляли буферный раствор следующего состава : ( реактивы serva , ФЕТ' ) , рН - 6,8 0,05 М трис HCI , 0,5 Г» этилендиамиитетраацетат натрия ,

1 мМ фенилметансульфонилхлорид . После чего строго на холоду клетки подвергачи воздействию ультразвуком ( 10-12 ыГ) в течение 30 секунд 3 р?.за .Центрифугировали ( 10 тыс.об./мин, 3 №,). Супернатант растворяли в буферном расти о ре, с оде рда-щем : 0,Ь М трис HCI , 0,5 М этилендиамкнтетраацетат натрия,

2 % меркаптоэтанол , 20 % додецилсульфат натрия , 10 % глицерин , 0,001 % бромфеноловый синий.При нагревании на водяной бане в течение 3 мин пробы наносили на гель .

Статистическую обработку полученных данных проводили по стандартным формулам ( Рзкицкий ,1973 ) с вычислением средней арифметической и стандартной ошибки на компьютере Электроника Д В К - '3 М . Данные , представленные на рисунках и таблицах , получены по результатам 3-4 опытов .

результаты исследований й их 0бот#же

I. Подбор питательной среды для культивирования спирулины

Подбор питательной среды проводили, модифицируя коыпо -ненты* классической среды Заррука ( Zawcw ,I9óó ) ,т.е . культивируя спирулину на средах с различным составом макро-п микроэлементов .Было установлено, что выращивание клеток на среде Заррука с уменьшенным в два и более раз

- о

минеральным составом дает больший прирост биомассы за весь период культивирования (ркс.1 (¿,3)).Проведенные эксперименты показали,что данная среда является экономной и практич -ной для массового культивирования,а её состав не способсг -вует бактериологическому и альгологическому заражению культуры. Эта среда использовалась нами в дальнейших экспери -ментах .

2. Накопление белка в клетках спирулины в зависимости

от плотности суспензии Для определения плотности суспензии в течение Есего периода культивирования проводили ежесуточный подсчет числа клеток в суспензии.Было установлено, что максимальная плотность суспензии соответствовала 14 млн.ил/мл на ъ-й день культиви-рованкя.Ьсли в начальный период культивирования наблюдали увеличение плотности суспензии от 2,9 млн.кл/мл до 13,6 млн, кл/мл,затем выход на плато (7-й ,о-й и 9-й дни ) , то с 9 по 14 день отмечалось постепенное её снижение до 9,4 млн.кл/мл ( рис.1 (1,3 )).Данные показатели изменения плотности суспензии позволили разделить весь период культивирования спирулины (14 дней) на 3 этапа: I - период накопления биомассы, 2--выход на плато,3 - период уменьшения биомассы и последую -щая гибель культуры за счет прекращения роста.

Содержание белка определяли ежедневно,по мере роста культуры с I по 14 день культивирования.Сопоставляя данные рис.1, можно наблюдать корреляцию двух параметров ( содержания белка и плотности суспензии),из чего следует,что динамику накопления Селка также можно разделить на 3 периода : I - увеличение содержания белка от 0,64 до 1,о мг/мл (1-4 день ) ,

2 - выход на плато 4,о - Ь,2 - 4,6 мг/мл (7-Ь-9 дни ) ,

3 - снижение содержания белка до 0,1 мг/мл ( к 14 дню ).

Для определения физиологического состояния водоросли вакно знать абсолютное содержание белка в одной клетке суспензии (табл.1).Ькдно, что биосинтез белка заметно уве -лкчивается до Ь-го дня культивирования,когда он соответст -вует 0,оо мг/Юьклеток.К 9-му дню при илотнссти„суспензии 15,2 ылккл/мл содержание бедка равно 0,34 мг/10° клеток , уже к 14 дн.0 при плотности суспензии 9,4 млн. кл/мл содер-

Таблица I

Содержание белка в клетках и суспензии спирулины с I по 14 день культивирования

та ку-«, - • , льтиви- ■ ' рования! мг/10иклеток ! Белок", мг/мл Плотность суспензии,' ! о.-мл/ I0Ó

I. ! 0,2206696 ! 0,64+0,03 ! 2,9+0,02

2. ! 0,2702702 ! 1,01+0,05 ! 3,7+0,01

3. ! 0,2669565 ! 1,32+0,03 ! 4,6+0,02

4. ! 0,3070923 ! 1,60+0,02 • ! 5,2+0,04

5. ! 0,3169169 Г 2,3o+G,G2 Г 7,4+0,04

б. ! 0,3264403 ! 3,56+0,02 ! 10,9+0,02

7, ! 0,3529411 ! 4,60+0,03 ! 13,о+0,03

8. ! 0,3601971 ? 5,20+0,03 ! 14,2+0,02

9. ! 0,3464843 ! 4,60+0,02 ! 13,2+0,03

10. ! 0,3196721 ! 3,90+0,03 ! 12,2+0,03

II. ! 0,2689075 ! 3,20+0,02 ! II, 9_т0,02

16.. ! 0,2155172 ! 2,50+0,03 ! 11,1+0,02

13. ! 0,1782I76 ! 1,60+0,02 ! 10,1+0,02

14. ! 0,1170212 ! I,I0_+u,02 ! 9,4+0,02

- в -

жание белка соответствует лишь 0,11 мг/Ю^клеток. Графически это изображено на рис.2.

Вероятно, такое уменьшение содержания белка связано с тем, что к концу культивирования плотность суспензии мало изменялась,за счет того, что число клеток в единице объема суспензии таюке не менялось и при микроскопировании наблюдалось, что это,в основном,мертвые клетки,которые не способны синтезировать белок.

&ожно предположить,что весь процесс биосинтеза белка в клетках спирулины идет по схеме :

1-й период - Ь0)5 на 50/„ синтеза белка,

2-й период - 100% синтез,

3-Й период - 6С% на 20% синтеза белка, где 80/о отмершие

клетки суспензии.

1-й период характеризуется интенсивным ростом молодых клеток.Синтез белка идет за счет вновь образовавшихся молодых клеток и "матричных" старых клеток суспензии.Доля синтеза белка между молодыми и "матричными" клетками распределена равномерно,поэтоку здесь наблюдается корреляция между накоплением белка и плотностью суспензии.Этот период соответствует 1-6 дню культивирования.Во 2-м периоде синтез идет за счет вновь образовавшихся молодых клеток.Наблюдается выход на плато по двум показателям-содержанию белка и плотности суспензии.Количество клеток в суспензии остаётся неизменным в течение нескольких суток(7-9 день).Это происходит или из-за прекращения роста культуры,или за счет того,что количество отмерших клеток оказывается равным количеству вновь образовавшихся клеток .3-й период характеризуется тем, что процесс новообразования прекрал{ается и биосинтез белка идет за счет имеющихся в суспензии полноценных клеток(20/ь клеток способны синтезировать белок).Около ВОЙ суспензии представлено мертвыми клетками к 14 дню культивирования.Р^/льтура стареет и отмирает.По-видимому,это связано с тем,что к концу культивирования истощается и питательная среда,которая расходуется на биосинтетические процессы в 1-й период культивирования .

■II

§9

к о

о 7

>4

3!

83

>

Г ч

"I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 П 12 1з 14 Дни Рис.1 . Содержание белка (I) я плотность суспензии клеток спирулинн,культивируемых на среде Заррука (2)н на модифицированной среде ( 3 ).

~3г

-2--5-3-Г~~ё-9' "10' '71—Дни

Рис.2. Содержание белка в клетках спирулинн с I по 14 день культивирования

Второй причиной уменьшения содержания белка в 3-й период культивирования,на наш взгляд, является то,что плотность суспензии в данный период не полностью отражает количество полноценных клеток в суспензии.К 12-му дню разрушается струк -тура спирали спирулины ( за счет истощения питательной среды ) и отделяются части трихома,в связи с чем количество белка на клетку в этот период (10-14 дней ) является явно заниженным .

3. Подбор температурного реяама для индукции синтеза БТШ

Исходя из современных представлений о роли BTü в формировании термоустойчивомк С Key at al . ,1981 ; Mover , 1984 ; Simpel et бЗ.,19Ы,- йойников,I9o9; Кулаева , 1991 ), прежде всего необходимо было определить оптимальный темпе -ратурный режим для индукции BIuLУстановлено, что экспрессия генов белков теплового шока происходит при повышении оптимальных дня развития данного организма температур на Ö-IG°C ( liß et al . Linguist ,ИЬо ).Для спирули-

ны,являющейся термофильны:.; организмом,нормальней для роста и накопления биомассы является температура + 30-30° О ( Михайлов и др. ,197,; ).В ещзк с этим в наших исследованиях в качестве, экстремальных испояьзсЕадк температуры : + 40°С , + 4i/C'C, + 4Ь°С , + '.;0°С. время действия высокой температуры во всех вариантах в этой серии экспериментов 5 минут.Эксперименты выполнялись в 3-х повторностях .

Таблица 2

Действие суперолткмалькых температур на кизнеспо-собность клеток спирулины

Температура , °С 'Время экспозиции,¡жизнеспособность ! мин ! клеток

40 5 нормальный рост

4Ь 5 нормальный рост

48 5 нормальный рост

50 3 ' нормальный рост

50 ь пожелтение суспен-'зии , гибель

Дрнные таблицы показывают,что клетки спирулины выдерживает прогрев суспензии до 4Ъ°С без каких либо изменений и нарушений в накоплении биомассы.Б варианте с температурой Ь0°0 исследуемые клетки выдерживали прогрев только до 3 мин,после чего наступала их гибель. О прекращающемся росте епкрулик*; судила по визуальным признакам :пожелте-

нию суспензии,появлению мути и коричневого осадка.Полученкые данные (табл.2) показывают, что прогрев клеток при 10~4В°С модао использовать для индукции синтеза БГШ. С этой целью применима и температура ЬО °С,но продолжительность её воз -действия должна быть уменьшена до нескольких минут или даяе ' секунд.

В следующей серии экспериментов изучали действие высокой температуры на жизнеспособность клеток цианобактерии,предварительно подвергнутых преадаптации с последующим культивированием в нормальных условиях.Цреодаптацию клеток спирулины проводили при 40°С в течение 15 минут.

Таблица 3

Варианты режима теплового шока с предварительной преадалтацией клеток спирулины>.

Преадаптация Î Нормальные условия ! культивирования ! 1 Перегрев

40°С ( 15 мин ) 30°0 ( 2 часа ) 40°С ( I нас )

40°С ( 15 мин ) 3ü°C ( 2 часа ) 45°С ( I час )

40°С ( 15 мин ) 30°0 ( 2 часа ) 4b°C ( I час )

В этой серии экспериментов установлено, что преадаптиро-ванные клетки могут выдерживать нагрев при температуре,близкой к летальной СЬ0°С ),в течение I часа после преадаптации в течение 15 мин при 40°С, с последующим культивированием в нормальных условиях в течение 2 часов.На высших растениях аналогичный результат был получен Jim с соавторами,показавшими влияние преадаптации на развитие проростков сои,подвергнутых действию высокой температуры ( Lin et al . ,I9d4 ). Полученные нами данные свидетельствуют о том,что гены,кодирующие БТШ,при повторном воздействии высокой температуры уже экспрессированы ,т.е. находятся в активном состоянии , в результате чего клетки цианобактерии приобретают резистентное структурно-функциональное состояние и способны выдержать близкие к летальным температуры в течение сравнительно про -

дсдасительного времени .Исходя из полученных выше данных, в последующих экспериментах была выбрана и использована температура теплового шока 48°С.

Так как было установлено, что преадаптированные клетки водоросли могут выдерживать температуру,близкую к летальной, в течение I часа (табл.3),данная экспозиция считалась мак -симальным временем воздействия шоковой температуры.Известно, что существует зависимость синтеза ЕМ от продолжительности теплового шока ( Айтхожин,19Ь9;Ьойников ,1569; Чианова, 19с>9; Кулаева,1991 ).Минимальный временной предел действия шоковой температуры,используемый в последующих экспериментах, был равен 5 мин.Б качестве промежуточных использовались экспозиции 1Ь и 30 мин.

4. Зависимость индукции ЕМ от стадии развития культуры ыикроводсросли

Учитывая то, что весь период культивирования спирулины соответствовал 14 дням и был условно разделен на три периода (глава 2),представляло интерес исследовать влияние супероптимальной температуры на всех трех периодах культивирования и установить(существует ли зависимость синтеза БТш от стадии развития культуры микроводоросли,или этот синтез может про -исходить в течение всего периода культивирования.В связи с этим далее рассмотрены результаты влияния шоковой температуры (46°С ) на суспензию клеток спирулины на 4-м, 6-м и 12-м днях культивирования и дана характеристика белкового состава клеток.

Электрофоретический анализ суммарной белковой фракции клеток спирулины в различные периода культивирования пред -ставлен на рис. 3 . Обнаружен широкий спектр низко- и высокомолекулярных полипептидов во всех исследуемых перио-' дах культивирования.Дм выявления различий в белковом спектре между опытом и контролем проводили денситометрию окра -шенных гелей.Анализируя спектры белков,выяснили,что в зависимости от стадии развития культуры в контрольных вариантах обнаружено наличие белков ,- находящихся в различном состоянии (рис.4 ).

кф )

94

67 43

20,1

I

Рис.3 .

¿34 А

Белкоицй состав

------

> ¿ 3 4 5 2 3 4

Б Б

клеток спирулины . А - '1-й день культивирования,

Б - 8-й день культивирования, В - 12-й день культивирования .

I - белки маркеры, 2 - контрольные образцы, 3 - экспозиция 5 мин ,

4 - экспозиция 15 мин , 5 - экспозиция 30 мин.

■X-1--1-

70 80 90 к Да

I - 4-й день культивирования- Ь-й день культивирования; 3 - 12-й день культивирования .

Так,на денситограммах электрофоретического профиля бел -ков из клеток контроля 4-го и о-го дней культивирования особенно отчетливо наблюдались белки высокомолекулярной зоны,чего нельзя било сказать о суспензии клеток на 12 -й день культивирования, где пики белков проявлялись незначительно лишь в низкомолекулярной зоне (рис.3 А,Б,Б -2*4) .По-видимо-му,это связано с общей картиной биосинтеза белка за весь период культивирования спирулкны,описанной в главе ¿.Так как биосинтез белка и увеличение плотности суспензии клеток спи-рулины отмечались дс, 9-го дня культивирования (выход на плато ), на денситограммах 4-го и Ь-го дней культивирования обнаружен набор полипептидов .характерных для нормального режима культивирования (30-35°С) (рис.4,1-2 ).Прекращение роста культуры и её неоднородность ( приблизительно 20% -синтезирующие белок клетки и 80 % мертвые) в 3-й период культивирования не дают картины синтеза белковых спектров в высокомолекулярной зоне и лишь незначительно отмечаются в низкомолекулярной области на электрофорегракме (рис.ЗБ-2,4-3 ). .фнный фактор подтверждает то,что культура стареет и отмирает к концу культивирования (12 день ).

Сопоставление данных рис.4, позволяет выявить набор полипептидов,характерных для спирулины в нормальных условиях культивирования при 30-35°С и синтезируемых до 9-го дня культивирования.Оки соответствуют следующим молекулярным массам: 66 ,74 ,5 , ь2:5 , ЬЬ и ЬЗ кДа.

При воздействии шоковой температуры в течение Ь мин (рис.3 А,Б -3 ) наблюдается следуддая картина.На 4-й и Ь~й дни культивирования в клетках сг.ируликы нет заметных изме -нений в белковом спектре в сравнен и V! с контролем. Ь связи с этим можно допустить, что имеющиеся во всех живых организмах запасные формы мНт не успевал? активизироваться за столь короткий промежуток времени.Но данное г.редпелехекие не подтверждается при увеличении времени везде ,.„твкя 'локоесЯ температуры до 15 и 30 в этем случае наблюдаемые и в контроле белки частично '/.зменяятся к& 4-й день культивиревгкия и начинаю? деградировать на 6-й день культиг-игезакия (рис. 3 А.,Б -3 ).Эго говорит о том, чте культура водсросли е

вшеперечисленные периоды культивирования не реагирует на столь кратковременный стресс.

При lb-минутном воздействии шоковой температуры на 4-й и 6-й дни культивирования (рис.3 А,Б,-4 ) было отчетливо видно на электрофорегракмах,что синтез de novo не наблюдается. Имеющиеся пики белков при 12 - дневном культивировании заметно увеличились (рис.3 В -4 ).

30 - минутный прогрев заметно не изменял состав белка для первого периода культивирования (4-й день ) (рис.3 А - 5 ). Во втором периоде культивирования (Ь-й день ) пики белков, имеющиеся в зоне ь5-9Ь кДа, деградировали (рис.3 Б -4,5 ). Это окончательно убеждало в том,что культура не реагировала на стрессовое воздействие синтезом новых белков,реакция характеризовалась прекращением нормального роста культуры и синтеза белка.

Уменьшение интенсивности пиков новосинтезированных белков наблюдалось и в третий период культивирования (12-й день) (рис.3 В -5).Ьзроятно, это связано с тем, ото ыРНК белков синтезированных при стрессе,могут обеспечить белковый синтез лишь на незначительное время.Следовательно, в связи с наиболее заметным увеличением синтеза ЕГЩ при 15 минутах данная экспозиция является оптимальным временным режимом для синтеза белков теплового шока в клетках спирулины (рис.5 ).

Таким образом, обобщая вышеизложенное и анализируя дан -ные рис.3,4 , можно заключить, что синтез БТШ в клетках спиру-лины зависит от стадии развития культуры и соответствует 3-му периоду 1$гльтивирования,т.е. 12 дню.Оказалось, что именно в этот период,когда в контрольном варианте эксперимента пики белков слабо выражены (рис.4-3 ) в сравнении с 4-м и &-м днями культивирования (рис.4 -1,2), в связи с прекращением биосинтеза белка и .следовательно, отмиранием культуры, а также в связи с тем,что происходит расход питательной среды и возникает недостаток в ней некоторых элементов (т.е. возникает вероятность голода ).воздействие супероптимальной температуры оказывает влияние на клетки спирулины,которые реагируют на это синтезом белков теплового шока.Возможно.клетки микроводоросли являются подготовленными (преадаптированными)

к температурному стрессу за счет того , что :

-синтез нормальных белков прекращается к культура в данный период культивирования,для того чтобы выжить,реагирует на повышение температура синтезом БТШ ;

-истошение питательной среда к 12 дню культивирования можно считать своего рода шоковой преадаптацией и подготовкой клеток водоросли к температурному стрессу.Известно,что в клетках растений существует система саморегуляция,т.е присутствует так называемый убиквиткн-вксококонсервативнкй,низкомолекулярный белок эукариог,который присоединяет к себе денатурированные иле иные аномальные белки клетка (Kunro , Pelham Д935 ).Мокко предположить,что после стресса возникает большое количество денатурированных белков в клетке , тогда зная, что ген,кодирующий убиквитин,входит в число генов БТШ и функционирует,следовательно,при действии стрессовых факторов,можно допустить,что в 3-м периоде кулътивиро -вания спирулины срабатывает система, предложенная ЭДунро и Пелхемом .основанная на далных о связг. БИС с убиквитином (Munro ( Pelham дэ85

Если синтез убиквитина индуцирован преадаптацией растений в результате солевого стресса,то клетка готова к встрече с большим количеством денатурированных белков и немоди -фицированный Heat shock transcription factor . присоедини -егся к регуляторной зоне генов БТШ и активизирует их транскрипцию при последующем действии шоковой температуры (48°С), в результате чего индуцируется синтез БТШ ( рис.5 ).

Данное предположение монет быть допустимо,если учесть,что-различные стрессовые условия могут индуцировать в растениях специфические ответы,выралашяеся в синтезе стрессовых белков. Появление стрессовых белков было отмечено у эукариот при различных воздействиях (Hover Д934 ),при осмотическом шоке протопластов табака (Flack .Durr ,1982 ),у растений в условиях анаэробиоза и разобщения окислительного фосфорилиро -вания (Mcard . 1986;Barnett' ,1980),в результате солево -го' стресса в суспензии клеток табака (егЦс^од ,1984),при инфицировании патогенами (ohasht »sbiaoaiura ,1386),в голодавших вследствие отсутствия в питательной среде сахарозы клетках

70 Ь2,Ь

94

кДа

Контроль

5 мин

15 мин

30 мин

Рис.Ь. Дрнситограмма электрофоретического профиля белков из клеток спирулины на 12-й день культивированш7

I - БИ1 94кДа , 2 - БТШ 62,5 кДа , 3 - ЕШ 79,5 кДа, 4 - БТШ 78 кДа .

меристемы изолированных корней гороха (w<зЪsteг ,1980).

5.Белки теплового шока спирулины Исследования показали,что подобно другим организмам,клетки спирулины реагируют на тепловой иск синтезом белков,о чем свидетельствует электрофореграмма суммарного белка выделен -ного из клеток спирулины на 12-й день культивирования микроводоросли Срис.5).0грессовые белки образуются уже через 15 мин воздействия шоковой температурой.

Представляло интерес выяснить,существует ли зависимость скорости синтеза белка от продолжительности теплового шока. Как видно из рис.6 , в течение 5 мин с момента повышения температуры происходит ингибирование синтеза белка.Уже через 15 и 30 мин интенсивность включения метки в белок восстанавливается и увеличивается в сравнении с контролем,а затем начина -ет снижаться к I час экспозиции.По -видимому,это связано с тем, что при инкубировании суспензии микроводоросли в стрессовых условиях происходит изменение интенсивности синтеза белка,подавление которого является следствием деградации полирибосом. Через 15 мин интенсивность включения метки в белок и его синтез достигает максимального уровня и снижается к 30 мин и I час.

11ри исследовании влияния хлораыфениколаСингибитора синтеза белка на 70 э рибосомах) было определено,что хлоршл^ени-кол (ХАФ) не оказывал воздействия на общее поглощение в-метионина и это не зависит от времени экспозиции шоковой температурой,что хорошо видно из таблицы 4.

ос. * Таблица 4 •

Поглощение д - метионина в клетках спирулины

Вариант ! Время воздействия шоковой температурой

опыта > с о мин ! 15 мин ! 30 мин ! I час

Контроль 93,4+0,02 101,2+0,03 59,7+0,03 88,0+0,02

X А Ф 76,140,03 140,6+0,04 101,9+0,02 59,4+0,04 '

Наряду с этим ХА§ оказывает ингибирующее действие на синтез белков спирулины. Как показано на рйсТт",действие"ХАФ на

12

10

8

6 4

о о

с

X г

ж о к

Е-| О)

N

25°С

46°С

Рис.6.

о

20

18

16

14 12

10

8 . 6 4

2

К 5 ыин 15 им 30 мин I час

Зависимость скорости общего синтеза белка от продолжительности теплового шока в клетках спирулшы

§

з: о к ь

ю 2

СО

ю

СО 43

к а:

ш р*

к ад

К 5 мин 15 ыин 30 ыин I час

Рис.7. Влияние хлорамфеникола на включение Б- мети-

онина в белки слирулкны

включение ^ 3 - метионина в белок спирулины зависит от продолжительности теплового шока.Наибольшее ингибирование синтеза белка происходит при 5 мин и I час экспозиции С до 70% ).Эго связано, вероятно, с эффектом шокового состояния клетки и происходит в результате перестройки трансляционной системы водоросли в ответ на повышение температуры.Слабое ингибирование при 15 и 20 мин экспозиции является нормальным состоянием трансляционного аппарата спирулины.Таким образом, эти данные демонстрируют типичную схему синтеза белков в клетках спирулины как прокариотического трансляционного аппарата.

В результате проведенных экспериментов было установлено, что в клетках спирулины под действием теплового шока синтезируется четыре ЬТШ с молекулярной массой: 76 ,79,5 ,82,5 и 94 (рис.5).Это высокомолекулярные белки,содержание которых в два и более раз превышает контроль (табл.5 ).

Таблица Ь

Содержание БТШ в клетках спирулины на 12-й день культивирования

! Бремя экспо4- Б1и1 ( % от общего белка )

! зиции ! 78 кДа • ! 79,5 кДа !Ь2,5 к,Да ! 94кДа

Контроль 2,0+0,03 1,8+0,03 3,2+0,07 1,^0,06

5 мин 2,7+0,03 2,8+0,05 4,9+0,03 2,1+0,07

15 мин 3,8+0,03 3,2+0,03 6,9+_0,03 5,1+0,05

30 мин 3,3+0,03 2,7+0,03 6,3+0,05 2,8+0,03

Ранее было установлено, что стрессовые болки эукарист делятся на группы ( к<лгег ,1984 ).Одной из основных является высокомолекулярная группа БШ 83 к Да, которая характера для,, большинства эукарист. Имея в белксвсм спектре спирулины БТЫ 82,5 кДа,можно заключить, что БЫ ЬР 5 кДа спирулины по молекулярной массе аналогичен ЬТШ высних растений ( ЬоозЗ а , 1980; ноуег ,1984;Костюк ,1991 ).Это свидетельствует об эволюционной связи эукарио? и прокариот в биосинтезе высокомолекулярных белков теплового шока.

Тот факт, что синтез БТШ происходит на 12-й день культивирования, когда нормальный синтез белка прекращается и культура подвержена отшранш,сведетельствует о том,что данные белки в клетках спирулины выполняют,вероятно,защитные функции, как и в клетках других организмов,обеспечивая на молекулярном уровне' адаптацию устойчивости к действия теплового и других форм стресса.Для такого предположения существует ряд оснований:

-известно,что выключение синтеза белка на время теплового шока приводит к гибели клеток в дальнейшем (Лозовская и др., I9B2; Котах ,1964);

-другие агенты,вызывающие синтез БГй,увеличивают терморезистентность клеток (Лозовская и др.,1382; ximpal ,I9Ü5).

Совокупность представленных аргументов достаточно убедительно говорит в пользу представлений о защитной роли БТШ при тепловом шоке,однако в литературе нет единого мнения о функциях ЕГШ м есть факты,противоречащие oTctíy представлению.Например, пыльца традесканции,кукурузы не синтезирует БТШ ,но способна приобретать закалку к нагреву (йслгаг ,1984 ;Kinpel , Key , 1985).Поэтому необходимы дальнейшие исследования для понимания других,альтернативных путей увеличения устойчивости клеток к нагреву,не включ&ощие в себя синтез БТШ (Кулаева,199Х).

заключение

Огрессовые белки индуцируются в фотосинтезирующих организмах в ответ на воздействие различных физических,химических и биологических факторов (Ьузнецов и др.,198?;Бурханов и др., IS86;lío-ver ,Не11тил<1 jc^Shachs et al.,I9gó). Необходимо подчеркнуть,что каждый из этих факторов вызывает синтез характерных для данных воздействий комплексов белков.Вместе с тем,имеются белки,синтез которых индуцируется при различных факторах.К таким белкам относится БТШ 70 KÍ^(sllfichs> 1986). Результаты нашей работы согласуются с существующими представлениями, полученными на различных фотосштезиругащих организмах, о том, что белки теплового шока участвуют в развитии термо -толерантности С Mover tI984;£impel, 1585;Бойников, IS89; Кулаева, 1991 ) *

¡Методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях были

обнаружены £Тй] э клетках спирулюш(в составе высокомолеку -лярных белковых комплексов).спектр которых меняется в зави- ' симости от продолжительности температурного воздействия.Состав высокомолекулярного комплекса соответствовал ЕГШ с молекулярной массой Ь2,5 кДр.

При оптимальном режиме культивирования (48°С) и времени воздействия шоковой температуры (15мин ) наблюдался синтез стрессовых белков,соответствующих следующим молекулярным массам :78, 79,5, 82,5 и 94 кДа.Дшшй синтез зависит от стадии развития культуры микроводоросли и соответствует 12-му дню культивирования.Следовательно,при сдвиге температуры в сторону повышения от оптимального режима наблюдалось количественное накопление новосинтезированных белков в высокомолекуляр -ной зоне. Это хорошо согласуется с литературными данными (Айтхокин;1969;Войников,1989;Кулаева,1992 ).

Полученные результаты позволяют определить дальнейшее развитие изучения функциональной активности белковых комплексов, содержащих БГШ,а сами клетки в период усиленного накопления белков можно использовать для получения белковых концентратов.

ВЫВОДЫ

-I.Установлена взаимосвязь мездау максимальным накоплением белков и плотностью суспензии в клетках спирулины.

2.Показано,что при нормальном режиме культивирования(30-35°С) характерными для спирулины являются полипептиды со следующими молекулярными массаш:68;74,5;82,5;8Ь и 89кДа.

3.Выявлено, что синтез стрессовых белковав пото для спяру* лины соответствует четырем белкам с молекулярной массой ;

76 , 79,5, 82,5 и 94 кДа,обеспечивающим устойчивое (функционирование клеток при стрессовых температурных воздействиях»

4.ЕГШ 82,5 спирулины аналогичен БТы высших растений (ЕГШ 8 Зк Да.), что свидетельствует об эволюционной связи эука-

рио^ и прокариот в биосинтезе высокомолекулярных ЕМ.

Практические рекоыендации

1.При культивированчн спирулины для бистехнологдогазюсс целей " можно" использовать модифицированную среду Заррука с уыеньшениыи в два п более раз содержанием ¿шлтхЯ- и никроэле-ггентов и больший« показателями плотнссти суспензии а сравнения с контролен» ' '

2Л1ри культивировании спирулины для биотехнологических целей в качестве продуцента белковой биомассы необходимо культивировать спирулину не весь период (14 дней),а лишь Ь-9 дней, до достижения максимального значения содержания белка и плотности суспензии.

Список опубликованных работ:

1.Ы.Н.Рахматуллаева, Синтез ЬТШ в условиях гипертермии в клетках цианобактерий/ыат.Взсп.науч.теор.конф.мол.учен.и специал. Тадж.ССР.,тез.докл., ,%и:анбе,1§64,-С.34 .

2. Yakubova М.М.,Kholmatova M.D.,Rahmatullaeva М.Н» Induction of"Heat shot proteins" in stress condition in cyanobacteria cells// FEBS 1ETTERS .abstracts of 19th. FEBS Meeting,Нота , Italy,1989,r.25o,i I , -P. 15.

3. Kholmatova M.D.,Takubova M.M..Rahmatullaeva M.H. Influense of different stress factors on the protein synthesis in cells of cyanobacteria Spirulina // Abst.of 7th Congress of FESPP, Diaea,Sweden,1990 //Physiol. Hantarum, 1990, v.79,p.2,-P.l2. Takubova M.M..Kholmatova M.D..Kahmatullaeva M.N.-Effect of superoptimal temperature on higher-molecular-weight poll -peptides synthesis in cyanobacteria cells//FEBS LETTERS ,

2oth FEBS Meeting,Budapest, I990,r.270,tf I.-P.27.

5.Холматова to. Д,Якубова Ы.М. .Рахматуллаева fc.H. ,11ыльнов В. A. ^йствие гипертермии на синтез белков в клетках Spirulina//

Вестник ТГУ (серия биолог.),Душанбе,1990,-C.43-5I.

6. }«.Н. Рахматуллаева. Получение чистых культур, синезеленых водорослей, распространенных в Таджикистане//Вестник ТГУ (серия биолог.),1990,-С.73-7?.

7.М.Н.Рахматуллаева,М.М.Якубова,В.А.Пыльнов -ВодоросльSpirulina rafidloides как объект биотехнологического производства в Таджикиетане//&атер.межд.конф."Фотосинтез и фотобиотехнология", Пухцино., 1991,-С. 118.

й.Яа.Н.Рахматуллаева.М.Д,.Холматова. Влияние высокой температуры на синтез полшептндов в клетках спирулины//Тез.докл.У конф. биох.респ.Ср.Азии и Назахет..Ташкент,19&1,~С.й19._

ТГУ. Заказ 43. Тираж ЮО экз.