Динамика образования и элиминации фосфорилированного гистона Н2АХ в клетках млекопитающих после рентгеновского облучения

Фирсанов, Денис Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Динамика образования и элиминации фосфорилированного гистона Н2АХ в клетках млекопитающих после рентгеновского облучения
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Динамика образования и элиминации фосфорилированного гистона Н2АХ в клетках млекопитающих после рентгеновского облучения"

На правах рукописи

ФИРСАНОВ Деннс Владимирович

ДИНАМИКА ОБРАЗОВАНИЯ И ЭЛИМИНАЦИИ ФОСФОРИЛИРОВАННОГО ГИСТОНА Н2АХ В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПОСЛЕ РЕНТГЕНОВСКОГО

ОБЛУЧЕНИЯ

03.03.04 — Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 онтт

Санкт-Петербург 2012

005053077

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук

Научные руководители: кандидат биологических наук

Кропотов Андрей Владимирович Институт цитологии РАН

доктор биологических наук, профессор Михайлов Вячеслав Михайлович Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: кандидат биологических наук, доцент

Спивак Ирина Михайловна, Институт цитологии РАН

доктор медицинских наук, профессор Александров Виктор Николаевич, Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова

Ведущая организация: ФГБУ ПИЯФ им. Б.П. Константинова

Защита состоится «26» октября 2012 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4. Сайт института: http://ww4v.cytspb.rssi.ru: адрес электронной почты института: eellbio@roai 1.cytspb.rssi ,ru: факс института: (812) 297-03-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан » сентября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Репарация ДНК является фундаментальным клеточным процессом, обеспечивающим стабильность генома. Считается, что ДР ДНК наиболее опасны для дальнейшей судьбы клеток, так как они могут привести к клеточной гибели или неопластической трансформации (Томилин, 2002).

Долгое время оставалось неясным, какие именно факторы обеспечивают правильность воссоединения ДР ДНК. В конце 20-го века было выяснено, что одним из ранних этапов ответа клетки на возникновение ДР после ИО является фосфорилирование гистона Н2АХ по серину 139, которое происходит в мегабазных доменах хроматина вокруг ДР ДНК. Такая фосфорилированная форма Н2АХ носит название уН2АХ, и образующиеся после облучения компактные скопления у112АХ (фокусы) можно визуализировать в ядрах клеток с помощью специфических антител к фосфорилированному С концу белка (Rogakou et al., 1998, 1999). Фокусы yl 12АХ обнаруживаются также в клетках, обработанных радиомиметиком блеомицином, который используется в противоопухолевой терапии (Tomilin et al., 2001). Фокусы ylI2AX выявляются в клетках уже в первые минуты после ИО. Их количество достигает максимального значения через 30-60 мин и коррелирует с количеством ДР в геноме. Показано, что за фосфорилирование Н2АХ ответственны, по крайней мере, три протеинкиназы: ATM, DNA-PK и ATR (Motoyama, Naka, 2004; Stiff et al., 2004). Затем происходит медленная элиминация этих фокусов, коррелирующая с динамикой репарации ДР ДНК (Nazarov et al., 2003; Svetlova et al., 2007). Время, в течение которого элиминируется 50 % фокусов уН2АХ, образовавшихся после воздействия ИО, прямо пропорционально радиочувствительности клеток, что говорит о возможности использования динамики появления и элиминации у112АХ как маркера клеточной радиочувствительности (Olive, Banath, 2004). В литературе есть данные, что образование фокусов у!12ЛХ и их элиминация в клетках крови после прохождения человеком медицинских обследований с использованием рентгеновского излучения может являться полезным биомаркером в определении радиочувствительности пациентов после облучения в дозах порядка ~10 мЗв (Rothkam et al., 2007). При изучении фокусов уН2АХ в лимфоцитах человека после ИО ex vivo было показано, что динамика их элиминации не зависит от возраста испытуемых, что в целом

Список основных сокращений

ДР ДНК — двунитсвой разрыв ДНК, PO — рсипсновскос облучение. ИО — ионизирующее облучение, НАДФ — никотинамидадсниндннуклеотид фоефат. BSA - бычин сывороточный альбумин, PARP — нолн-АДФ-рибоча нолпмераза, PBS— фосфатно-солсвой буфер, ХП — хромосомная перестройка, Гр — rpîii, Зв — шверт, ЭФЧ — эмбриональные фибробласты человека, KT — комнатная температура.

говорит о стабильности кинетики репарации ДР ДНК (Sedelnikova et al., 2008). Однако динамика образования уН2АХ в начальные моменты времени после ИО ex vivo, которая может служить показателем эффективности клеточного ответа на повреждение генома у испытуемых, изучена не была.

В некоторых органах млекопитающих (тимус, семенники) наблюдается быстрое появление (через 1 ч) и исчезновение уН2АХ (через 24 ч), в других (например, в эпителиальных клетках тонкого кишечника) фосфорилирование проходит дольше, как предполагается из-за различной активности протеинкиназ (Yoshida et al., 2003). В исследованиях на клетках мозга эмбрионов мышей показано быстрое фосфорилирование Н2АХ через 1 ч после ИО, через 24 ч уН2АХ полностью исчезал в нейронах, одновременно наблюдалась апоптотическая гибель клеток-предшественников нейронов (Nowak et al., 2006). У мышей были показаны различия в уровне образования уН2АХ после ИО между ухом, печенью и почкой, что говорит о тканеспецифичности ответа на повреждения ДНК (Koike et al., 2008). Однако в целом на фоне большого количества исследований образования и элиминации уН2АХ после ИО в клетках, растущих в культуре, данные о динамике уН2АХ в отдельных тканях млекопитающих не достаточно полны.

Известно, что в местах повреждений ДНК активируется PARP, которая рибозилирует белки хроматина вокруг повреждений, используя в качестве субстрата НАД+ (Surjyana et al., 2010). Гиперактивация PARP может привести к значительному уменьшению содержания внутриклеточного НАД+ и гибели клетки путем некроза (Carson et al., 1986), то есть энергетические процессы в клетках могут играть одну из ключевых ролей в ответе на повреждения ДНК и в репарации ДР.

Таким образом, изучение динамики образования и элиминации гистона уН2АХ после ИО в различных модельных системах (культуры клеток, не стимулированные к делению лимфоциты человека, различные органы грызунов) представляется актуальной задачей, как для фундаментальных исследований, так и для практической медицины.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в изучении динамики образования и элиминации фосфорилированной формы гистона ШАХ (уН2АХ) после рентгеновского облучения и способов регуляции этих процессов на моделях культивируемых клеток, лимфоцитов здоровых людей и терминально дифференцированных клетках мышей и сирийских хомячков. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику образования и элиминации уН2АХ в облученных клетках после рентгеновского облучения культуры клеток в дозе 1 Гр;

2. Изучить влияние на динамику образования и элиминации уН2АХ после рентгеновского облучения культуры клеток пищевой добавки форсколина, который

активирует аденилатциклазу, приводя к увеличению внутриклеточного содержания цАМФ;

3. Изучить влияние возраста человека на динамику образования фокусов уШАХ в начальные моменты времени после рентгеновского облучения ex vivo;

4. Исследовать динамику образования и элиминации уН2АХ в сердце, почке, печени и мозге взрослых мышей и сирийских хомячков после тотального рентгеновского облучения животных в дозах 3 и 5 Гр;

5. Изучить влияние на эффективность фосфорилирования гистона ШАХ в сердце мышей внутрибрюшинного введения НАДФ+ (как одного из способов поддержания внутриклеточного содержания НАД1" после возникновения повреждений ДНК) сразу же после рентгеновского облучения животных в дозе 3 Гр.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Максимальный ответ различных популяций клеток на рентгеновское облучение, выраженный в образовании фосфорилированной формы гистона ШАХ, происходит через 20-60 мин после воздействия как в системах in vitro и ex vivo, так и in vivo;

2. Предобработка культуры клеток форсколином приводит к снижению уровня фосфорилирования ШАХ после рентгеновского облучения в дозах 1 и 10 Гр;

3. Между тканями млекопитающих, имеющих низкий уровень пролиферации (сердце, почка, печень, мозг), после рентгеновского облучения в дозах 3 и 5 Гр наблюдаются значимые различия как по уровню образования уШАХ, так и по эффективности элиминации уН2АХ из хроматина.

Научная новизна работы. Впервые показано, что добавление к клеточной среде за несколько часов до рентгеновского облучения в дозе 1 и 10 Гр форсколина снижает количество фосфорилированного ШАХ в культивируемых клетках, но не влияет на количество фокусов уШАХ и частоту хромосомных аберраций, что свидетельствует о неизменности индукции и репарации двунитевых разрывов ДНК. Впервые показано, что возраст человека не влияет на динамику образования фокусов уШАХ в лимфоцитах периферической крови в первый час после рентгеновского облучения. Впервые показано, что между различными тканями млекопитающих (сердце, почка, печень, мозг) после рентгеновского облучения в дозах 3 и 5 Гр существуют значимые различия как по количеству образованного уН2АХ, так и по эффективности элиминации уШАХ из хроматина. Впервые показано, что однократное внутрибрюшинное введение НАДФ+ сразу же после рентгеновского облучения в дозе 3 Гр приводит к увеличению количества уН2АХ в сердце мышей. Таким образом, сердце как популяция клеток со сниженной реакцией на рентгеновское облучение может быть стимулировано к более эффективному ответу на облучение.

Личный вклад автора. Все экспериментальные процедуры, описанные в работе, были проведены автором лично. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научными руководителями.

Финансовая поддержка работы. Работа проводилась при поддержке РФФИ (гранты № 07-04-00315-а по теме «Эпигенетические модификации гистонов и их роль в контроле репарации, транскрипции и репликации гетерохроматина в клетках млекопитающих», № 10-04-00807-а по теме «Индуцированное ионизирующей радиацией фосфорилирование гистона Н2АХ в хроматине клеток млекопитающих и его функциональная роль в ответе клеток на повреждение ДНК») и Президиума РАН (Программа «Молекулярно-клеточная биология»),

Научио-практическое значение работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание участия уН2АХ в ответе клеток на рентгеновское облучение. Данные о влиянии форсколина и НАДФ на уровень образования и элиминации уН2АХ могут служить платформой для дальнейших исследований, направленных на изучение уровня распределения уН2АХ в местах двунитевых разрывов ДНК, динамики восстановления структуры хроматина и репарации двунитевых разрывов ДНК. Эти процессы, безусловно, играют важную роль в реакции организма на противоопухолевую терапию. Данные о межтканевых вариациях в эффективности образования и элиминации уН2АХ в различных клеточных популяциях ¡n vivo должны быть приняты во внимание при анализе ответа организма на облучение и могут служить основой для клинических исследований с прогностической целью перед проведением радиотерапии, а также для экспресс-скрининга клеточных популяций на радиорезистентность.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на II Съезде общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007), на Всероссийском симпозиуме по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2009), на II Конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2010), на Российско-Швейцарском симпозиуме «Регуляция стабильности генома с помощью репликации и репарации ДНК» (Санкт-Петербург, 2010), на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», посвященной 120-летию со дня основания Института экспериментальной медицины (Санкт-Петербург, 2010), на Международном съезде Немецкого сообщества репарации ДНК (Германия, 2010), на III Конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2012). Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научных семинарах лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии и группы генетики клеточных популяций Института цитологии РАН.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего»^ ^ссылок. Диссертация изложена на /¿^страницах и иллюстрирована /^"рисунками и //таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Линии клеток. Клетки ЭФЧ и фибробласты легких китайского хомячка линии V-79 были получены из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург).

Клетки ЭФЧ выращивали в пластиковых флаконах при 37 °С в среде MEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), клетки V-79 выращивали в пластиковых флаконах при 37 °С в среде RPMH640 с 10% FBS в атмосфере С02. После образования монослоя во флаконах клетки пересевали в чашки Петри и выращивали на покровных стеклах 24x24 мм при 37 °С в атмосфере СО2.

Пациенты. Забор крови из локтевой вены осуществляли у 12 здоровых доноров в возрасте 31-72 лет, проходивших диспансеризацию в Санкт-Петербургской клинической больнице РАН. Пациенты были разделены на две возрастные группы: группа 1 — пациенты в возрасте 31^45 лет (5 человек), группа 2 — пациенты в возрасте 50-72 лет (7 человек). Кровь помещали в пробирку с цитратом натрия.

Выделение лимфоцитов из периферической крови человека. Кровь в объеме 2 мл смешивали с равным объемом PBS и наслаивали на 2 мл фиколла (плотность 1.077) (Биолот, Россия). После этого центрифугировали при 400 g в течение 30-40 мин при 18-20 °С. После центрифугирования сначала отбирали с помощью пипетки верхний слой (плазму), а затем новой пипеткой отбирали лимфоциты. К клеткам добавляли 3 объема PBS, после чего их ресуспендировали и осаждали центрифугированием при 100 g в течение 10 мин при 1820 "С. Такую отмывку клеток проводили дважды. После этого ресуспедировали лимфоциты в среде RPMI-1640 (со стрептомицином и L-глутамином) с 10% эмбриональной бычьей сывороткой и инкубировали в ССЬ-термостатс при 37 °С.

Работа с материалом от экспериментальных животных. Эксперименты проводили на самцах мышей линии С57В1/6 весом около 20 г, а также на самцах сирийских хомячков весом около 150 г. Криостатные срезы приготавливали на аппарате Bright Со LTD (Великобритания). Раствор кофермента НАДФ на PBS (концентрация 37.5; 3.8; 0.4; 0.04 мг/кг) готовили перед каждым экспериментом, разводя порошок НАДФ Na (Reanal, Венгрия) в PBS. Введение НАДФ животным осуществляли внутрибрюшинно сразу же после РО из расчета веса животного. Для каждой временной точки исследовали 3-5 животных.

Рентгеновское облучение. Рентгеновское облучение культивируемых клеток,

лимфоцитов периферической крови и животных проводили на аппарате РУМ-17 (200 кВ, 13 мА, фильтр 0.5 мм Си + 1 мм Al, фокусное расстояние 50 см) при мощности дозы 0.45 Гр/мин.

Непрямой иммупофлуоресцентпый анализ. Клетки, выращенные на покровных стеклах, дважды промывали в фосфатно-солевом буфере (PBS) и обрабатывали в течение 3 мин 0.1 %-ным Triton Х-100 при KT.

Лимфоциты смешивали с PBS 1:10 и центрифугировали половину этого объема на цитоспине, специально сконструированном нами на основе центрифуги К23, в течение 10 мин при 2500 об/мин, прикрепляя таким образом взвешенные клетки к предметному стеклу.

Далее препараты фиксировали 2 %-ным раствором формальдегида в PBS в течение 10 мин и инкубировали в 70 %-ном этаноле при +4 "С в течение ночи. Фиксированные клетки отмывали в PBS, обрабатывали 0.5 %-ным Triton Х-100 в PBS в течение 15 мин и ополаскивали в PBS. Далее для блокирования неспецифического связывания антител покровные стекла инкубировали в 5 %-ном растворе BSA (Sigma, США) в PBS в течение 30 мин при 37 °С. Антитела растворяли в 1 %-ном растворе BSA, содержащий 0.1 %-ный Tween20. Инкубацию с антителами проводили при 37 "С, между инкубациями стекла отмывали в течение 30 мин в PBS, содержащий 0.1 %-ный Tween20. Клетки инкубировали в смеси мышиных моноклональных антител против уН2АХ (Abeam, США, 1:200) и кроличьих поликлональных антител против PCNA (Santa Cruz, США, 1:50) в течение 1 ч. Вторые поликлональные антитела (козьи против мыши, конъюгированные с Alexa Fluor-568 — Molecular Probes, США, 1:200) смешивали с поликлональными козьими антителами против кролика, конъюгированкыми с FITC (Molecular Probes, США, 1:200), и инкубировали с клетками в течение 40 мин. Ядра клеток визуализировали при помощи красителя DAPI (0.05 мкг/мл, 10 мин) или SybrGreen (1:500000, 5 мин).

Непрямой иммуногистохимический анализ. Криостатные срезы фиксировали в метанол-этаноле (1:1) в течение 3 мин при -20 "С и подсушивали их 5-15 мин при KT.

Для перокисидазного-анти-пераксидазного метода стекла отмывали 3 раза по 5 мин в PBS. После этого стекла инкубировали в 30 %-ном метаноле, содержащем 0.03 %-ную IЬСЬ, в течение 30 мин при KT. Далее стекла отмывали 3 раза по 5 мин в PBS и блокировали в 1 %-ном бычьем сывороточном альбумине в течение 30 мин. После отмывки в PBS стекла инкубировали с первичными поликлональными кроличьими антителами против уН2АХ (1:200, Abeam, США) при +4 °С в течение ночи. Локализацию антител выявляли с помощью кроличьих антипероксидазных антител и пероксидазы (комплекс PAP, Sigma, США) по описанной ранее схеме (Полак, Ван Норден, 1987).

Для авидин-биотиновой системы стекла инкубировали в течение 5 мин в 1 %-ном растворе Тритон Х-100. Далее препараты отмывали 2 раза по 5 мин в PBS. После этого стекла инкубировали в 70 %-ном метаноле, содержащего 0.3 %-ную Н2СЬ, в течение 30 мин при КТ. Далее стекла отмывали 3 раза по 5 мин в PBS и блокировали в 8 %-ном бычьем сывороточном альбумине (Sigma, США) в течение 30 мин. Для уменьшения неспецифического связывания стрептоавидина с эндогенным биотином на срезы наносили реагенты Avidin/Biotin Blocking Kit (Zymed Laboratories Inc., Invitrogen, США) согласно предложенной фирмой прописи. После отмывки в PBS стекла инкубировали с первичными поликлональными кроличьими антителами против уН2АХ (1:200, Abeam, США) при +4 °С в течение ночи. Затем наносили вторичные анти-кроличьи антитела, меченные биотином в разведении 1:100 (Sigma, США), на 1 ч. На срезы наносили стрептоавидин, конъюгированный с пероксидазой, в разведении 1:50 (Sigma, США), на 30 мин. После каждого описанного этапа срезы промывали в PBS 3 раза по 5 мин.

Затем наносили диаминобензидин (10 мг диаминобензидина растворяли в 10 мл PBS и смешивали с 0.5 мл 0.1 %-ного раствора Н202 в PBS) на 5 мин. Затем промывали в проточной воде. При слабой реакции срезы дополнительно инкубировали в диаминобензидине с ацетатом кобальта в течение 5 мин и далее отмывали в проточной воде. Ядра докрашивали гематоксилином. Далее срезы обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации, проводили через 3 порции ксилола и заключали в канадский бальзам.

Приготовление отпечатков тканей, фиксация и иммуногистохимия для конфокальной микроскопии. После забора органов (мозг и печень) с помощью острой бритвы производили срезы и на предметных стеклах, обработанных полилизином, получали отпечатки тканей. После этого препараты подсушивали 15 мин при КТ.

Далее препараты фиксировали раствором 2 %-ного формальдегида в PBS в течение 20 мин. Затем проводили пермеабилизацию клеток 70 %-ным этанолом, охлажденным до -20 °С, в течение 5 мин. На этом этапе препараты помещали в 70 %-ный этанол на +4 °С на несколько дней.

Криостатные срезы сердца фиксировали раствором 2 %-ого формальдегида в PBS в течение 20 мин. Затем проводили пермеабилизацию клеток 1 %-ным Triton Х-100 в течение 5 мин при КТ.

После этанола или Triton Х-100 препараты дважды промывали в PBS по 5 мин. После отмывок, для предотвращения неспецифического связывания антител, препараты инкубировали в 8 %-ном растворе бычьего альбумина (BSA) в PBS в течение 30 мин при 37 °С. Далее препараты отмывали 5 мин в PBS. Затем клетки инкубировали с первичными поликлональными кроличьими антителами против уН2АХ, растворенными в 1 %-ном

растворе BSA (1:200) 1 ч при 37 °С. После этого препараты дважды промывали в PBS по 5 мин. Далее клетки инкубировали с козьими антителами против кролика, конъюгированными с FITC (1:200), или с козьими антителами против кролика, конъюгированными с Су2 (1:400), растворенными в 1 %-ном растворе BSA в течение 40 мин при 37 °С. После этого препараты трижды промывали в PBS по 5 мин. Ядра клеток окрашивали DAPI (0.05 мкг/мл). Далее клетки заключали в среду CITIFLUOR, препятствующую выгоранию флуоресценции (glycerol/PBS solution, UKS Chemical Laboratories, UK).

Иммуноблоттинг. Органы животных помещали в керамическую ступку и заливали жидким азотом для гомогенизации. После гомогенизации к 5 мг ткани добавляли 300 мкл 4-кратного буфера для электрофореза и кипятили 10 мин при 95 °С.

К культивируемым клеткам добавляли 200 мкл двухкратного буфера для электрофореза и инкубировали в нем клетки 10 мин при 95 °С.

Лимфоциты лизировали в буферном растворе RIPA (20 мМ Трис, рН 7.8, 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 0.5 % Triton Х-100). Измерения концентрации белка осуществляли методом Брэдфорда.

После центрифугирования пробы разделяли в 15 %-ном полиакриламидном геле (ПААГ) и осуществляли перенос белков на мембраны Hybond-C (Amersham, Швеция) с помощью электроблоттинга. Неспецифическое связывание антител блокировали 5 %-ным сухим молоком в течение ночи при +4 "С. Далее мембраны отмывали в PBS, содержащем 0.1% Tween-20 (PBST), 2 раза по 10 мин. После этого мембраны инкубировали с первичными моноклональными мышиными антителами против уН2АХ (1:1500, Abeam, США) или первичными поликлональными кроличьими антителами против бета-актина (1:4000, Abeam, США), разведенными в PBST, в течение 2 ч при комнатной температуре. После трех отмывок по 10 мин в PBST мембраны инкубировали с соответствующими вторичными антителами против IgG мыши или кролика, конъюгированными с пероксидазой (1:15000, Zymax, США), в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее мембраны отмывали 3 раза в PBST по 10 мин и инкубировали с хемилюминесцентным субстратом (Millipore, США). Интенсивность свечения полос уН2АХ количественно оценивали на иммуноблотах с помощью программы ImageJ.

Приготовление метафазных пластинок хромосом. К культуральной среде добавляли демиколцин в концентрации 1 мкг/мл (Sigma) на 3 ч, после чего клетки снимали 0.25 %-ным раствором трипсин/ЭДТА (Life Technologies). Далее клетки обрабатывали гипотоническим раствором в течение 22 мин (0.075 M КС1/1 % цитрат Na, 1:1) при 37 °С и фиксировали охлажденной до -20 "С смесью метанол/уксусная кислота (3:1) в течение 40 мин

при +4 °С. После этого клетки раскапывали на чистые предметные стекла и высушивали. Метафазные пластинки окрашивали раствором Гимза (Merck) в PBS. Для каждой временной точки анализировали не менее 100 пластинок.

ПЦР в реальном времени. Реакцию ПЦР в реальном времени проводили на аппаратуре Applied Biosystems 7500. РНК органов сердца, печени и почки мышей выделяли с помощью набора реагентов РИБОЗОЛЬ (AmpliSens, Москва). Обратную транскрипцию проводили при помощи набора Fermentas (К 1621) с использованием Oligo-dT праймера в соответствии с инструкцией производителя. Амплификацию мышиной кДНК на Н2АХ проводили с использованием праймеров 5'-TGCTTCAGCTTGGTGCTTAG-3' и 5'-CGACAGGGTCAACTGGTATG-3', мышиной кДНК на DNA-PK с использованием праймеров 5'-CTTGCCTCCCGATGTTCTC-3' и 5'-TCCCAAAACTCCTTCTCAGC-3\ мышиной кДНК на ATM с использованием праймеров 5'-GGAATTTCTGAGTGGCATTTGG-3' и 5'-ACCTTCACCGCCTTTTCTAG -3', контрольная кДНК на бета-актин с использованием праймеров 5-CATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3' и 5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTG-3' кДНК на GAPDH 5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3' и 5'-CTCCTGCGACTTCAACAGCAA—3'. Амплификацию в реальном времени проводили с использованием набора фирмы Syntol, содержащего SYBR Green и ROX. Концентрации праймеров были оптимизированы для получения высокой эффективности реакции (наклон кривой для всех праймеров в пределах -3.3 и -3.6, значение R2 более 0.98) и исключения амплификации димеров праймеров.

Микроскопический анализ. Конфокальные изображения клеток получали с помощью конфокальной лазерной сканирующей системы LSM 5 Pascal и Leica SP5. На каждом препарате анализировали 100 ядер клеток. Подсчет фокусов уН2АХ и определение средней площади, занимаемой фокусом в ядре, осуществляли с помощью программы IpLab (Scananalytics, Inc.)

Статистическую обработку (вычисление среднего значения, стандартного отклонения, ошибки среднего, t-тест) проводили с помощью программы Excel и Statistica 6.0. Принят 5 %-ный уровень значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исследование фокусов у112АХ в клеточных культурах после рентгеновского облучения. С помощью специфических антител была исследована динамика образования и элиминации фокусов уН2АХ в различных клеточных культурах. В клетках ЭФЧ и линии V-79 фокусы уН2АХ можно было обнаружить уже через 10 мин после облучения в дозе 1 Гр; количество фокусов, а также площадь, занимаемая фокусами, и средняя интенсивность свечения фокусов возрастали в период от 15 до 60 мин; после чего начиналась их элиминация

(рис.1). Максимум числа фокусов был зафиксирован через 1 ч после облучения. Фокусы были обнаружены и через 5 ч после облучения, и их количество оставалось выше, чем в необлученных клетках. В клетках обеих линий элиминация половины фокусов уН2АХ происходит через 3 ч после достижения их максимального значения, как это видно на рис. 1.

Рис.1. Зависимость количества фокусов уН2АХ от времени после рентгеновского облучения в клетках линии V—79 и ЭФЧ.

Форсколин снижает уровень фосфорилирования гистона Н2А.Х в клетках человека после ионизирующего облучения. После обсчета изображений клеток ЭФЧ после РО в программе 1гт^е.1 мы обнаружили, что добавление форсколина в концентрации перед РО в дозе 1 Гр приводит к уменьшению интенсивности свечения уН2АХ через 1 ч после облучения, однако не изменяет ее относительное уменьшение к 3 ч после облучения (рис.2).

А Б

Рис 2. Фокусы уШАХ в облученных клетках ЭФЧ через 1 и 3 ч после облучения в дозе 1 Гр А: без обработки форсколином; Б: обработка I (Г1 М форсколином за 3 ч до облучения. Масштабная линейка 15 мкм.

Для подтверждения этих данных мы изучили формирование уН2АХ в клетках ЭФЧ с помощью методики иммуноблоттинга. Обработка клеток форсколином за 24 ч до облучения проводила к заметному подавлению образования уН2АХ. Такой же эффект, хотя и в меньшей степени, наблюдали при обработке форсколином за 3 ч до облучения (рис.3).

ф (-} ф (+) I 2

Ф(-)

Ф(+)

Ф{->

Ф(+) 6

Ф(-) 1

ф(

ф (+

Рис.3. Индукция уН2АХ в клетках ЭФЧ после облучения в дозе 5 Гр и обработки форсколином. Форсколин (Ф) добавляли в среду с клетками в концентрации 10"4 М за 3 ч (А) или за 24 ч (Б) до облучения, и оставляли их в той же среде после облучения. Клетки инкубировали в течение 1 ч (А— 3,4; Б -2,3) или 3 ч после облучения (А— 5, 6). Необлученный контроль показан на полосах А— 1,2 и Б — 1.

На рис.4 представлены данные анализа площади, занимаемой фокусами уН2АХ, и их количества через I и 3 ч после облучения. Видно, что предобработка клеток форсколином приводит к уменьшению площади, занимаемой фокусами уН2АХ, однако не влияет на количество фокусов. Эти наблюдения говорят о том, что форсколин, вероятно, влияет на количество молекул ШАХ фосфорилированного вокруг ДР, но не влияет на изменение количества ДР.

у. =

Б 2 =

зїг"

£ З V 3

1ч ФН 1чФ{+) ЗчФ(-} ЗчФ(+) Время после облучения

1чФ(.) 14 (&(♦> 34 Ф(-) Время после обпучения

Рис.4. Количество уН2АХ в клетках ЭФЧ через 1 и 3 ч после РО при добавлении к клеточной среде форсколина (Ф) в концентрации 10"* IV!.

Мы предположили, что интенсивность фосфорилирования 112АХ вокруг каждого ДР может влиять на точность репарации ДР. Однако мы обнаружили, что форсколин не влияет на количество хромосомных аберраций, вызванных радиацией (табл.1).

Изучаемая группа Клетки с аберрациями, % Среднее число хромосомных разрывов на метафазу ± стандартное отклонение

Необлученный контроль 3 0.04 ±0.02

Пеоблученный контроль+Форсколин 2 0.02 ±0.01

Облучение 1 Гр 19 0.24 ±0.05

Облучение 1 Гр + Форсколин 20 0.27 ± 0.06

В каждом варианте было проанализировано 100 метафазных пластинок. Различия между контролем (без предварительной обработки форсколином) и опытом (предобработка форсколином) статистически не достоверны.

Форсколин активирует протеинкиназу А (РКА), которая в свою очередь может фосфорилировать и активировать протеинфосфатазу 2А (РР2А) (Ahn et al., 2007). Эта фосфатаза колокализуется с фокусами уН2АХ и вовлечена в дефосфорилирование уН2АХ (Chowdhury et al., 2005). Стимулирование форсколином РР2А может увеличивать уровень дефосфорилирования уШАХ после репарации ДР и, следовательно, уменьшать количество уН2АХ в ядрах.

Фосфорилирование гистона Н2АХ в лимфоцитах человека. Методом иммунофлуоресценции мы исследовали динамику образования фокусов уН2АХ в лимфоцитах, выделенных из периферической крови доноров, после облучения in vitro в дозе 1 Гр. Количество фокусов уН2АХ через 15, 60 и 120 мин после РО в обеих возрастных группах не различалось. Максимальное количество фокусов уН2АХ наблюдали через 1 ч после облучения в обеих группах (рис. 5).

Рис.5. Фокусы уН2АХ после рентгеновского облучения в дозе 1 Гр в лимфоцитах доноров двух различных возрастных групп.

При исследовании количества фосфорилированного гистона Н2АХ, наблюдаемого

после облучения лимфоцитов в дозе 10 Гр, с помощью иммуноблоттинга было обнаружено, что максимальное его количество фиксировалось через 1 ч и не зависело от возраста доноров (рис. 6). Однако через 15 мин после РО интенсивность полос уН2АХ, относящихся к донорам разного возраста (2 и 6), сильно различалась.

I 2 3 4 5 б 7 $

Рис.6. уН2АХ в лимфоцитах индивидуумов различного возраста через 15 (2,6), 60

(3,7) и 120 (4,8) мин после РО Донор А, 31 год (дорожки 1-4) и донор В, 68 лет (дорожки 5-8).

В настоящее время многие исследователи связывают радиоустойчивость клеток с динамикой элиминации уН2АХ, но мы полагаем, что не менее важным критерием в определении радиочувствительности является скорость ответа клетки на возникновение ДР ДНК — активность фосфорилирования ШАХ после воздействий, повреждающих ДНК .

Межтканевые вариации в эффективности фосфорилирования гистона Н2АХ у мышей С57В1 после рентгеновского облучения. В нашей работе мы сравнивали динамику образования и исчезновения фосфорилированного гистона ШАХ после РО в ядрах терминально дифференцированных клеток животных, перенесших РО в дозе 3 Гр (табл. 2). Было обнаружено, что клетки миокарда левого желудочка по сравнению с клетками эпителия извитых почечных канальцев характеризуются как более интенсивным уровнем образования уН2АХ, так и более медленным процессом элиминации гистона уН2АХ после РО.

Таблица 2. Динамика образования и исчезновения уН2АХ после РО в ядрах терминально дифференцированных клеток мышей, перенесших РО в дозе 3 Гр

Тип клеток Количество клеток, %

Время после облучения

контроль 20' 40' 60' 6ч 23 ч

Клетки миокарда 3.1±0.7 47.Ü4.6* 42.6±3.9* 30.5±7.0* 29.0±3.4* 24.8±1.5*

Эпителий извитых почечных канальцев 5.3±0.8 15.3±4.6* 34.6±2.3* 27.3±4.0* 22.4±4.4* 4.3±2.2

Приведены средние результаты но 5 опытам, ± ошибка средней; * — статистически значимые различия в сравнении с контролем (Р<0.05).

Так как популяция клеток сердца гетерогенна и кроме кардиомиоцитов в ней содержатся и другие типы клеток, возникла необходимость дифференцировать мышечные клетки миокарда от немышечных, чтобы определить, в каких именно клетках наблюдается

медленная элиминация уН2АХ. Для дискриминации мышечных и немышечных клеток была применена одновременная окраска срезов антителами против уН2АХ и а-актина. Результаты показали, что через 23 ч после облучения в 86 % уН2АХ-позитивных клеток выявились и белки сократительного аппарата, т.е. они являлись кардиомиоцитами (рис. 7).

Рис.7. уН2АХ и а-актин-положительные клетки в миокарде мышей через 24 ч после РО. Объектив 60х.

/ /

Методом иммуноблоттинга тотальных лизатов белков из сердца, мозга, печени и почки мы показали, что через 1, 3 и 5 ч после облучения животных в дозе 3 Гр уровень сигнала уН2АХ в сердце и мозге был значительно меньше, чем в почке (рис.8).

Сердце Почка Печень Мозг

Часы после

кон 1 3 5 кон 1 3 Б КОН 1 3 5 кон 1 3 5

■J.1 „„.„ _ . шаг +т* -п— ■

ШИ щф ЛШ

vH2AX

Рис.8. уН2АХ в органах мыши после рентгеновского облучения. В качестве контроля (кон) нанесения тотальных лизатов белков использовался бета-актин.

Для определения причины этих различий методом ПЦР в реальном времени был определен уровень экспрессии Н2АХ, киназ ATM, и DNA-PK и показано, что у необлученных мышей в почке уровень экспрессии киназ достоверно выше, чем в сердце и мозге (рис.9). Интересно, что в печени уровень экспрессии киназ сильно понижен, что может указывать на альтернативный механизм фосфорилирования Н2АХ в печени (рис.9).

Рис.9. Экспрессия генов ШАХ,

С €>рдцй-*ою роль Ш Сердце» писав РО По»ни»-кокт|к>пь 35 Псчт поел« РО Ш П»«»иь'*с«?ропь Щ П«ч<!«& псигло РО & Мо.гг-контрот»

DNA-PK и ATM в тканях сердца, почки, мозге и печени определенная методом ПЦР в реальном времени.

В каждом случае уровень экспрессии соответствующего гена был нормирован к уровню экспрессии в сердце. *— статистически значимые различия в сравнении с контролем сердца (Р<0.05).

По всей видимости, различные типы клеток, представленные в одном органе, по-разному отвечают на РО. С помощью иммуноблоттинга мы наблюдаем общий ответ органа от всех типов клеток, не дифференцируя клеточную популяцию. Можно предположить, что в

сердце такой ответ отражает неэффективное образование уН2АХ в местах ДР. Однако по данным иммуногистохимического анализа в миокарде процент уН2АХ-положительных клеток значительно выше, чем в клетках извитых канальцев через 20 мин после РО, что указывает на эффективный ответ клеток миокарда на образование ДР ДНК. Тем не менее нельзя исключить, что количество молекул уН2АХ, образующихся в местах ДР в клетках миокарда значительно меньше в связи с низкой активностью ферментов. Исходя из наших данных, можно предположить, что заниженный уровень экспрессии киназы DNA-PK в сердце может быть причиной как неэффективного образования уН2АХ, так и его замедленной элиминации в миокарде после РО, что коррелирует с данными литературы (Koike et al., 2008).

Динамика образования и элиминации уН2АХ в тканях сирийского хомячка после рентгеновского облучения. Мы определяли динамику элиминации фокусов уН2АХ в сердце, мозге и печени, анализируя долю ядер, содержащих фокусы уН2АХ, на модели сирийских хомячков (табл. 3). В клетках миокарда хомячков элиминация фокусов уН2АХ была сильно замедленной по сравнению с клетками печени и в меньшей мере с клетками головного мозга.

Таблица 3. Динамика образования и исчезновения уН2АХ после РО в ядрах терминально дифференцированных клеток хомячков, перенесших РО в дозе 5 Гр

Тип клеток Количество клеток, %

Время после облучения, часы

контроль 1 24

Клетки миокарда 5.2 %±0.7 46%t3.3* 23.8%±1.4*

Клетки мозга 2.2 %±0.6 34.1%±3.7* 7.4%±0.5*

Клетки печени 4.6 %±0.9 25.8%±4.1* 4.7% ±0.6

Приведены средние результаты по 3 опытам, ± ошибка средней; * — статистически значимые различия в сравнении с контролем (Р<0.05).

При одновременной окраске антителами против уН2АХ и 53ВР1 было показано, что в миокарде хомячков через 24 ч после РО в дозе 5 Гр фокусы уН2АХ колокализуются с репарационным белком 53ВР1, что подтверждает представление о том, что остаточные фокусы уН2АХ в клетках сердца через 24 ч после облучения локализуются в местах персистирующих ДР ДНК (рис.10).

А Б В

г' _ / ■ /

', * Vi* 1 / . /

* /

Рис.10. уН2АХ и 53ВР1 на срезах сердца сирийских хомячков. Необлученный контроль (А), через 1 ч (Б) и 24 ч (В) после РО в дозе 5 Гр соответственно. уН2АХ — зеленый, 53ВР1— красный, ядра окрашены DAPI (синий). Стрелками показана колокализация двух белков. Масштабная линейка 2.5 мкм.

Непролиферирующие ткани (сердце и мозг) содержат клетки (кардиомиоциты и нейроны), которые не вступают в митоз в постнатальном периоде. Митотическое деление кардиомиоцитов также не реактивируется при регенерации (Rumyantsev, 1963). Пролиферация кардиомиоцитов мышей постепенно снижается во время позднего пренатального развития и в конце концов останавливается через 3 нед после рождения (Ерохина, 1968). Клетки почки и печени также имеют низкий уровень пролиферации, однако клетки этих тканей способны к делению при регенерации. Показано, что клетки эпителия почечных канальцев здоровых крыс могут вступать в пролиферацию (Vogetseder et al., 2005). Была также показана высокая пролиферативная активность гепатоцитов после гепатэктомии у крыс (Fabrikant, 1968). По нашим данным, наиболее выраженный ответ на РО наблюдается в печени и почке, где гистон Н2АХ фосфорилируется (а уН2АХ дефосфорилируется) более эффективно, чем в сердце и мозге. Наши результаты позволяют предположить, что эффективность образования и элиминации уН2АХ в тканях млекопитающих коррелирует с их пролиферативным потенциалом. Точность репарации ДР очень важна, так как неправильная репарация может привести к генетическим дефектам или гибели клетки (Lobrich et al., 2000). Возможно, что медленная репарация ДР в клетках сердца и мозга отражает точность репаративных процессов. Радиорезистентность этих органов согласуется с этой точкой зрения. Однако для подтверждения этой гипотезы требуются дополнительные исследования.

Однократное внутрибрюшинное введение мышам НАДФ+ приводит к увеличению уровня уН2АХ в сердце после рентгеновского облучения животных. Было обнаружено, что однократное внутрибрюшинное введение НАДФ+ в дозе 37.5 мг/кг сразу же после РО в дозе 3 Гр приводит через 20 мин к достоверному увеличению количества уН2АХ в сердце (~ в 2.3 раза) по сравнению с контрольной группой облученных мышей (рис.11). Доза 0.4 мг/кг достоверно увеличивала количество уН2АХ ~ в 2 раза. Исследовав дозу

0.04 мг/кг, мы не получили сколь-либо гистона Н2АХ в сердце мышей после РО.

PÖ 4- *

НДДФ +

■-тт: уН2АХ 11МЮР*Щ|У''РЗД бета-актин

лых изменений в уровне фосфорилирования

Рис.П. Уровень накопления уН2АХ в сердце мышей через 20 мни после РО при введении НАДФ+ в дозе 37.5 мг/кг сразу же после РО.

На рис. 11 видно, что введение НАДФ+ в дозе 37.5 мг/кг приводит к увеличению уровня уН2АХ в сердце мышей через 20 мин после РО в сравнении с контрольными. Окрашивание криостатных срезов сердец мышей показало, что после РО и введения НАДФ+ в дозе 37.5 мг/кг сразу же после РО в дозе 3 Гр через 20 мин после воздействия наблюдается образование —82% уН2АХ—положительных ядер, в облученном контроле —42%. Сопоставляя данные, полученные разными методами, можно предположить, что однократное внутрибрюшинное введение НАДФ+ в широком диапазоне доз сразу же после РО приводит к повышенному уровню фосфорилирования гистона Н2АХ в клетках миокарда мышей в местах ДР ДНК.

Можно предположить, что увеличение уровня уН2АХ происходит из-за повышенной активности участвующей в репарации ДР протеинкиназы ОЫА-РК, которая образует макромолекулярный комплекс с сиртуином ЭШТб, принимающим активное участие в репарации ДНК и использующий НАД+ в качестве субстрата (МсСогё е1 а1., 2009). Для уточнения механизма действия НАДФ на уровень образования уН2АХ необходимы дальнейшие исследования. Остается пока не ясным, влияет ли повышение уровня уН2АХ на эффективность репарации ДР ДНК в кардиомиоцитах и связан ли уровень уН2АХ с их гибелью после облучения.

По результатам вышеизложенного можно сделать заключение, что между тканями млекопитающих, имеющих низкий уровень пролиферации (сердце, почка, печень, мозг), после рентгеновского облучения в дозах 3 и 5 Гр наблюдаются значимые различия как по уровню образования уН2АХ, так и по эффективности элиминации уН2АХ из хроматина. Элиминация фокусов уН2АХ в клетках миокарда сильно замедлена по сравнению с клетками других органов. Максимум фосфорилирования гистона Н2АХ в ответ на рентгеновское облучение в различных популяциях клеток отмечается в пределах 1 ч после воздействия. Предобработка культуры клеток форсколином приводит к снижению уровня фосфорилирования Н2АХ после рентгеновского облучения в дозах 1 и 10 Гр.

выводы

1. Максимальный ответ различных популяций клеток на рентгеновское облучение, выраженный в образовании фосфорилированной формы гистона Н2АХ (уН2АХ), наблюдается через 20-60 мин после воздействия как в системах in vitro и ex vivo, так и in vivo.

2. Предобработка культуры клеток форсколином приводит к снижению уровня фосфорилирования Н2АХ после рентгеновского облучения в дозах 1 и 10 Гр.

3. Добавление к клеткам форсколина до облучения не влияет на количество фокусов у112АХ и частоту хромосомных аберраций после рентгеновского облучения в дозе 1 Гр.

4. Возраст доноров, не влияет на динамику образования фокусов у 112 АХ в лимфоцитах, облученных ex vivo.

5. Между различными тканями млекопитающих (сердце, почка, печень, мозг) после рентгеновского облучения в дозах 3 и 5 Гр наблюдаются значимые различия как по уровню образования уН2АХ, так и по эффективности элиминации уН2АХ из хроматина;

6. При однократном внутрибрюшинном введении мышам НАДФ+ после облучения в дозе 3 Гр наблюдается увеличение уровня уН2АХ в сердце.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фирсанов Д.В., Гаврилов Б.А. 2006. Динамика фосфорилирования гистона Н2АХ как ответ клеток на ионизирующее облучение. XXXIV неделя науки СПбГПУ 28 ноября - 3 декабря 2005 года. Материалы Всероссийской межвузовой научно-технической конференции студентов и аспирантов. 16-17.

2. Gavrilov В., Vezhenkova I., Firsanov D., Solovjeva L., Svetlova M., Mikhailov V., Tomilin N. 2006. Slow elimination of phosphorylated histone gamma-H2AX from DNA of terminally differentiated mouse heart cells in situ. Biochem. Biophys. Res. Commun. 347(4): 1048— 1052.

3. Гаврилов Б.А., Фирсанов Д.В., Веженкова И.В., Соловьева Л.В., Михайлов В.М., Томилин Н.В. 2007. Выявление фосфорилированного гистона Н2АХ в дифференцированных клетках после рентгеновского облучения. Доклады Академии наук. 414(1): 123-125.

4. Фирсанов Д.В., Гаврилов Б.А., Михайлов В.М., Томилин Н.В. 2007. Динамика элиминации фосфорилированного гистона у-Н2АХ из ДНК в дифференцированных клетках мозга и печени золотистого хомячка in situ. Тезисы докладов II Съезда Общества клеточной биологии совместно с Юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН, 17-19 октября. Цитология. 49(9): 801.

5. Svetlova М.Р., Solovyeva L.V., Firsanov D.V., Tomilin N.V. 2008. y-H2AX foci do not

colocalize with repressive histone modifications and transcription sites in X-irradiated mammalian cells. DNA Repair 2008 10,h Biennial Meeting of the DGDR September 2-5, Berlin, Germany. Abstract Book. 100.

6. Solovjeva L.V., Pleskach N.M., Kirsanov D.V., Svetlova M.P., Serikov V.B., Tomilin N.V. 2009. Forskolin decreases phosphorylation of histone H2AX in human cells induced by ionizing radiation. Radiat. Res. 171(4): 419-424.

7. Svetlova M.P., Solovyeva L.V., Pleskach N.M., Firsanov D.V., Serikov V.B., Tomilin N.V. 2009. Forskolin affects y-H2AX foci formation after the action of ionizing radiation on mammalian cells. International Simposium «DNA Damage Response and Repair Mechanism» April 20-23, Crete, Greece. Abstract Book. 46.

8. Фирсанов Д.В., Михайлов B.M., Томилин H.В. 2009. Межтканевые вариации в эффективности элиминации гистона гамма-Н2АХ в тканях после рентгеновского облучения. Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» 12-14 октября. Цитология 51 (9): 789.

9. Фирсанов Д.В., Михайлов В.М. Возможное участие никотинамидаадениндинуклеотида (НАД) в репарации ДНК. 2010. Тезисы докладов и сообщений, представленных на II Конференцию молодых ученых Института цитологии РАН 15-16 февраля. Цитология. 52(6): 510.

10. Firsanov D.V., Mikhailov V.M. 2010. Exogenous injection of nicotinamidadenindinucleotide changes the levels of histone H2AX phosphorylation/dephosphorylation in mouse heart cells after ionizing radiation. Russian-Swish Workshop «Regulation of genome stability by DNA replication and repair» July 5-9, Saint-Petersburg. 50.

11. Firsanov D., Kropotov A., Mikhailov V. 2010. Exogenous nicotinamide adenine dinucleotide changes the kinetics of histone H2AX phosphorylation in mouse heart cells after ionizing radiation. 11th biannual international meeting of DGDR September 7-10, Jena, Germany. Abstract book.

12. Фирсанов Д.В., Михайлов В.М. Никотинамид аденин динуклеотид как возможный регулятор репарации ДНК. 2010. Медицинский Академический журнал. 10(5): 221.

13. Фирсаиов Д.В., Кропотов А.В., Михайлов В.М. 2011. НАДФ увеличивает уровень фосфорилированного гистона Н2АХ в сердце мышей после рентгеновского облучения. Цитология. 53(4): 355-358.

И.Фирсанов Д.В., Кропотов А.В., Томилин Н.В. 2011. Фосфорилирование гистона Н2АХ в лимфоцитах человека как возможный показатель эффективности клеточного ответа на радиационное повреждение генома. Цитология. 53(7): 586-590.

15. Firsanov D.V., Solovjeva L.V., Svetlova M.P. 2011. П2АХ phosphorylation at the sites of DNA double-strand breaks in cultivated mammalian cells and tissues. Clinical Epigenetics. 2: 283-297.

16. Фирсанов Д.В., Кропотов А.В., Михайлов В.M. 2012. Динамика образования и элиминации гистона у Н2ЛХ в клетках млекопитающих после рентгеновского облучения. Тезисы докладов и сообщений, представленных на III Конференцию молодых ученых Института цитологии РАН 15-16 мая. Цитология. 54(4): 360-361.

17. Firsanov D., Vasilishina A., Kropotov A., Mikhailov V. 2012. Dynamics of yH2AX formation and elimination in mammalian cells after X-irradiation. Biochimie. 94: 2415-2421.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Ерохина И.Л. 1968. Динамика пролиферации клеточных элементов дифференцируещегося миокарда мыши. Цитология 10 (11): 1391-1409.

Полак Д., Ван Норден С. 1987. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. М., Мир, 78 с.

Томилин Н.В. 2002. Репарация двунитевых разрывов ДНК и стабильность хромосом в клетках высших эукариот. В кн.: Бреслеровские чтения. СПб: Наука. 70-84.

Ahn J.H., McAvoy Т., Rakhilin S.V., Nishi A., Greengard P., Nairn A.C. 2007. Protein kinase A activates protein phosphatase 2A by phosphorylation of the B56delta subunit. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 104(8): 2979-2984.

Carson D.A., Seto S., Wasson D.B., Carrera C.J. 1986. DNA strand beaks, NAD metabolism, and programmed cell death. Exp. Cell Res. 164: 273-281.

Chowdhury D., Keogh M.C., Ishii H., Peterson C.L., Buratowski S., Lieberman J. 2005. gamma-H2AX dephosphorylation by protein phosphatase 2A facilitates DNA double-strand break repair. Mol. Cell 20(5): 801-809.

Fabrikant J.I. 1968. The kinetics of cellular proliferation in regenerating liver. J. Cell Biol. 36(3): 551-565.

Koike M., Mashino M., Sugasawa J., Koike A. 2008. Histone H2AX phosphorylation independent of ATM after X-irradiation in mouse liver and kidney in situ. J. Radiat. Res. (Tokyo) 49(4): 445-449.

Löbrich M., Kühne К., Rothkamm К. 2000. Joining of correct and incorrect DNA double strand break ends in normal human and ataxia telangiectasia fibroblasts. Genes. Chromosomes and Cancer 27: 59-68.

McCord R.A., Michishita E., Hong Т., Berber E., Boxer L.D., Kusumoto R., Guan S., Shi X., Gozani O., Bwlingame A.L., Bohr V.A., Chua K.F. 2009. SIRT6 stabilizes DNA-dependent protein kinase at chromatin for DNA double-strand break repair. Aging (Albany NY), 1, 109-121.

Motoyama N. and Naka K. 2004. DNA damage tumor suppressor genes and genomic instability. Curr. Opin. Genet. Dev. 14: 11-16.

Nazarov I.В., Smimova A.N., Krutilina R.I., Svetlova M.P., Solovjeva L.V., Nikiforov A.A., Oei S.L., Zalenskaya I.A., Yau P.M. and Tomilin N.V. 2003. Dephosphorylation of histone gamma-H2AX during repair of DNA double-strand breaks in mammalian cells and its inhibition by calyculin A. Radiat. Res. 160, 309-317.

Nowak E., Etienne О., Millet P., Lages C.S., Mathieu C., Mouthon M.A., Boussin F.D. 2006. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat. Res. 165(2): 155-164.

Olive P.G and Banath J.P. 2004. Phosphorylation of histone H2AX as a measure of radiosensitivity. Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., 58 (2): 331-335.

Rogakou E.P., Boon C., Redon C., Bonner W.M. 1999. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146(5):905-916.

Rogakou E.P., Pilch D.R., Orr A.M., Ivanova V.S., Bonner W.M. 1998. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273(10): 5858-5868.

Rothkamm K., Balroop S„ Shekhdar J., Fernie P., Goh V. 2007. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242(1): 244-251.

Rumyantsev P.P. 1963. A morphological and autoradiographical study of the peculiarities of differentiation rate, DNA synthesis and nuclear division in the embryonal and postnatal histogenesis of cardiac muscles of white rats. Folia Histochem. Cytochem. 1: 463.

Sedelnikova O.A., Horikawa I., Redon C., Nakamura A., Zimonjic D.B., Popescu N.C., Bonner W.M. 2008. Delayed kinetics of DNA double-strand break processing in normal and pathological aging. Aging Cell 7(1):89-100.

Stiff, T., O'Driscoll, M., Rief, N., Iwabuchi, K., Lobrich, M., and Jeggo, P. A. 2004. ATM and DNA-PK function redundantly to phosphorylate H2AX after exposure to ionizing radiation. Cancer Res. 64: 2390-2396.

Surjana D., Halliday GM., Damian D.L. 2010. Role of nicotinamide in DNA damage, mutagenesis, and DNA repair. J. Nucleic Acids. 1-13.

Svetlova M., Solovjeva L., Nishi K., Nazarov I., Siino J., Tomilin N. 2007. Elimination of radiation-induced gamma-H2AX foci in mammalian nucleus can occur by histone exchange. Biochem. Biophys. Res. Commun. 358(2): 650-654.

Tomilin N.V., Solovjeva L.V., Svetlova M.P., Pleskach N.M., Zalenskaya I.A., Yau P.M., Bradbury E.M. 2001. Visualization of focal nuclear sites of DNA repair synthesis induced by bleomycin in human cells. Radiat. Res. 156(4): 347-354.

Vogetseder A., Karadeniz A., Kaissling B., Le Hir M. 2005. Tubular cell proliferation in the healthy rat kidney. Histochem. Cell Biol. 124 (2): 97-104.

Yoshida K., Yoshida S.II., Shimoda C., Morita T. 2003. Expression and radiation-induced phosphorylation ofhistone H2AX in mammalian cells. J. Radiat. Res. (Tokyo) 44(1): 47-51.

Подписано в печать 24.09.2012. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 9712Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.:(812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фирсанов, Денис Владимирович

Список сокращений.

Введение.

I. Обзор итературы.

1. Индукция и репарация двунитевых разрывов ДНК.

1.1. Сложные повреждения ДНК.

1.2. Двунитевые разрывы ДНК: простой случай сложных повреждений.

1.3. Репарация путем гомологичной рекомбинации.

1.4. Негомологичное воссоединение концов.

2. Динамика хроматина и репарация двунитевых разрывов ДНК.

2.1. Структура хроматина.

2.2. Структура хроматина и репарация двунитевых разрывов ДНК.

2.3. Дестабилизация хромосом способствует убикитинированию хроматина.

3. Фосфорилирование Н2АХ в сайтах двунитевых разрывов ДНК в культивируемых клетках млекопитающих и тканях.

3.1. Протеин киназы, вовлеченные в фосфорилирование Н2АХ.

3.2. Механизмы индукции и дефосфорширования у-Н2АХ во время репарации двунитевых разрывов ДНК.

3.3. Локализация фокусов у-Н2АХв контексте хроматина.

3.4. Кинетика фосфорилирования/дефосфорилирования Н2АХ в культивируемых клетках млекопитающих.

3.5. Фосфорилирование Н2АХ после малых доз ионизирующего облучения.

3.6. «Эффект свидетеля» после облучения.

3.7. Фосфорилирование Н2АХ в тканях мышей после генотоксических стрессов.

II. Материалы и методы.

1. Линии клеток.

2. Пациенты.

3. Выделение лимфоцитов из периферической крови человека.

4. Работа с материалом от экспериментальных животных.

5. Рентгеновское облучение.

6. Иммунофлуоресцентный и иммуногистохимический анализ.

6.1. Не прямой гшмунофлуоресценцентный анализ.

6.2. Не прямой иммуногистохимический анализ.

6.3. Приготовление отпечатков тканей, фиксация и гшмуногистохимиядляконфокалъноймикроскопии.

7. Иммуноблоттинг.

8. Приготовление метафазных пластинок хромосом.

9. ПЦР в реальном времени.

10. Микроскопический анализ.

III. Результаты и обсуждения.

1. Исследование фокусов уН2АХ в клеточных культурах после рентгеновского облучения.

2. Форсколин снижает уровень фосфорилирования гистона Н2АХ в клетках человека после ионизирующего облучения.

3. Фосфорилирование гистона ШАХ в лимфоцитах человека.

4. Межтканевые вариации в эффективности фосфорилирования гистона Н2АХ у мышей С57В1 после рентгеновского облучения.

5. Динамика образования и элиминации уН2АХ в тканях сирийского хомячка после рентгеновского облучения.

6. Однократное внутрибрюшинное введение мышам НАДФ+ приводит к увеличению уровня уН2АХ в сердце после рентгеновского облучения животных.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Динамика образования и элиминации фосфорилированного гистона Н2АХ в клетках млекопитающих после рентгеновского облучения"

Долгое время оставалось неясным, какие именно факторы обеспечивают правильность воссоединения ДР ДНК. В конце 20-го века было выяснено, что одним из ранних этапов ответа клетки на возникновение ДР после ИО является фосфорилирование гистона ШАХ по серину 139, которое происходит в мегабазных доменах хроматина вокруг ДР ДНК. Такая фосфорилированная форма Н2АХ носит название уН2АХ, и образующиеся после облучения компактные скопления уН2АХ (фокусы) можно визуализировать в ядрах клеток с помощью специфических антител к фосфорилированному С-концу белка (Rogakou et al., 1998, 1999). Фокусы уН2АХ обнаруживаются также в клетках, обработанных радиомиметиком блеомицином, который используется в противоопухолевой терапии (Tomilin et al., 2001). Фокусы уН2АХ выявляются в клетках уже в первые минуты после ИО. Их количество достигает максимального значения через 3060 мин и коррелирует с количеством ДР в геноме. Показано, что за фосфорилирование Н2АХ ответственны, по крайней мере, три протеинкиназы: ATM, DNA-PK и ATR (Motoyama, Naka, 2004; Stiff et al., 2004). Затем происходит медленная элиминация этих фокусов, коррелирующая с динамикой репарации ДР ДНК (Nazarov et al., 2003; Svetlova et al., 2007). Время, в течение которого элиминируется 50 % фокусов уН2АХ, образовавшихся после воздействия ИО, прямо пропорционально радиочувствительности клеток, что говорит о возможности использования динамики появления и элиминации уН2АХ как маркера клеточной радиочувствительности (Olive, Banath, 2004). В литературе есть данные, что образование фокусов уН2АХ и их элиминация в клетках крови после прохождения человеком медицинских обследований с использованием рентгеновского излучения может являться полезным биомаркером в определении радиочувствительности пациентов после облучения в дозах порядка ~10мЗв (Rothkam et al., 2007). При изучении фокусов уН2АХ в лимфоцитах человека после ИО ex vivo было показано, что динамика их элиминации не зависит от возраста испытуемых, что в целом говорит о стабильности кинетики репарации ДР ДНК (Sedelnikova et al., 2008). Однако динамика образования уН2АХ в начальные моменты времени после ИО ех vivo, которая может служить показателем эффективности клеточного ответа на повреждение генома у испытуемых, изучена не была.

В некоторых органах млекопитающих (тимус, семенники) наблюдается быстрое появление (через 1 ч) и исчезновение уН2АХ (через 24 ч), в других (например, в эпителиальных клетках тонкого кишечника) фосфорилирование проходит дольше, как предполагается из-за различной активности протеинкиназ (Yoshida et al., 2003). В исследованиях на клетках мозга эмбрионов мышей показано быстрое фосфорилирование ШАХ через 1 ч после ИО, через 24 ч уН2АХ полностью исчезал в нейронах, одновременно наблюдалась апоптотическая гибель клеток-предшественников нейронов (Nowak et al., 2006). У мышей были показаны различия в уровне образования уН2АХ после ИО между ухом, печенью и почкой, что говорит о тканеспецифичности ответа на повреждения ДНК (Koike et al., 2008). Однако в целом на фоне большого количества исследований образования и элиминации уН2АХ после ИО в клетках, растущих в культуре, данные о динамике уН2АХ в отдельных тканях млекопитающих не достаточно полны.

Известно, что в местах повреждений ДНК активируется PARP, которая рибозилирует белки хроматина вокруг повреждений, используя в качестве субстрата НАД* (Surjyana et al., 2010). Гиперактивация PARP может привести к значительному уменьшению содержания внутриклеточного НАД* и гибели клетки путем некроза (Carson et al., 1986), то есть энергетические процессы в клетках могут играть одну из ключевых ролей в ответе на повреждения ДНК и в репарации ДР.

2. Изучить влияние на динамику образования и элиминации уН2АХ после рентгеновского облучения культуры клеток пищевой добавки форсколина, который активирует аденилатциклазу, приводя к увеличению внутриклеточного содержания цАМФ;

3. Изучить влияние возраста человека на динамику образования фокусов уН2АХ в начальные моменты времени после рентгеновского облучения ex vivo;

5. Изучить влияние на эффективность фосфорилирования гистона ШАХ в сердце мышей внутрибрюшинного введения НАДФ+ (как одного из способов поддержания внутриклеточного содержания НАД+ после возникновения повреждений ДНК) сразу же после рентгеновского облучения животных в дозе 3 Гр.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Максимальный ответ различных популяций клеток на рентгеновское облучение, выраженный в образовании фосфорилированной формы гистона Н2АХ, происходит через 20-60 мин после воздействия как в системах in vitro и ex vivo, так и in vivo;

Научная новизна работы. Впервые показано, что добавление к клеточной среде за несколько часов до рентгеновского облучения в дозе 1 и 10 Гр форсколина снижает количество фосфорилированного ШАХ в культивируемых клетках, но не влияет на количество фокусов уШАХ и частоту хромосомных аберраций, что свидетельствует о неизменности индукции и репарации двунитевых разрывов ДНК. Впервые показано, что возраст человека не влияет на динамику образования фокусов уН2АХ в лимфоцитах периферической крови в первый час после рентгеновского облучения. Впервые показано, что между непролиферирующими тканями млекопитающих (сердце, почка, печень, мозг) после рентгеновского облучения в дозах 3 и 5 Гр существуют значимые различия как по количеству образованного уШАХ, так и по эффективности элиминации уН2АХ из хроматина. Впервые показано, что однократное внутрибрюшинное введение НАДФ+ сразу же после рентгеновского облучения в дозе 3 Гр приводит к увеличению количества уН2АХ в сердце мышей. Таким образом, сердце как популяция клеток со сниженной реакцией на рентгеновское облучение может быть стимулировано к более эффективному ответу на облучение.

Научно-практическое значение работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание участия уН2АХ в ответе клеток на рентгеновское облучение. Данные о влиянии форсколина и НАДФ на уровень образования и элиминации уН2АХ могут служить платформой для дальнейших исследований, направленных на изучение уровня распределения уН2АХ в местах двунитевых разрывов ДНК, динамики восстановления структуры хроматина и репарации двунитевых разрывов ДНК. Эти процессы, безусловно, играют важную роль в реакции организма на противоопухолевую терапию. Данные о межтканевых вариациях в эффективности образования и элиминации уН2АХ в различных клеточных популяциях in vivo должны быть приняты во внимание при анализе ответа организма на облучение и могут служить основой для клинических исследований с прогностической целью перед проведением радиотерапии, а также для экспресс-скрининга клеточных популяций на радиорезистентность.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Фирсанов, Денис Владимирович

Выводы

1. Максимальный ответ различных популяций клеток на рентгеновское облучение, выраженный в образовании фосфорилированной формы гистона ШАХ (уШАХ), наблюдается через 20-60 мин после воздействия как в системах in vitro и ex vivo, так и in vivo.

2. Предобработка культуры клеток форсколином приводит к снижению уровня фосфорилирования ШАХ после рентгеновского облучения в дозах 1 и 10 Гр.

3. Добавление к клеткам форсколина до облучения не влияет на количество фокусов уШАХ и частоту хромосомных аберраций после рентгеновского облучения в дозе 1 Гр.

4. Возраст доноров, не влияет на динамику образования фокусов уШАХ (их количества) в лимфоцитах, облученных ex vivo.

5. Между различными тканями млекопитающих (сердце, почка, печень, мозг) после рентгеновского облучения в дозах 3 и 5 Гр наблюдаются значимые различия как по уровню образования уШАХ, так и по эффективности элиминации уШАХ из хроматина;

Заключение

По результатам вышеизложенного можно сделать заключение, что между тканями млекопитающих, имеющих низкий уровень пролиферации сердце, почка, печень, мозг), после рентгеновского облучения в дозах 3 и 5 Гр наблюдаются значимые различия как по уровню образования уН2АХ, так и по эффективности элиминации уН2АХ из хроматина. Элиминация фокусов уН2АХ в клетках миокарда сильно замедлена по сравнению с клетками других органов. Максимум фосфорилирования гистона Н2АХ в ответ на рентгеновское облучение в различных популяциях клеток отмечается в пределах 1 ч после воздействия. Предобработка культуры клеток форсколином приводит к снижению уровня фосфорилирования Н2АХ после рентгеновского облучения в дозах 1 и 10 Гр.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фирсанов, Денис Владимирович, Санкт-Петербург

1. Гаврилов Б.А., Фирсанов Д.В., Веженкова И.В., Соловьева Л.В., Михайлов В.М., Томилин Н.В. 2007. Выявление фосфорилированного гистона ШАХ в дифференцированных клетках после рентгеновского облучения. Доклады Академии Наук. 414(1): 123-125.

2. Ерохина И. Л. 1968. Динамика пролиферации клеточных элементов дифференцируещегося миокарда мыши. Цитология 10 (11): 1391— 1409.

3. Томилин Н.В. 1983. Генетическая стабильность клетки. Л.:Наука156 с.

4. Томилин Н.В. 2002. Репарация двунитевых разрывов ДНК и стабильность хромосом в клетках высших эукариот. В кн.: Бреслеровские чтения. СПб: Наука. 70-84.

5. Томилин Н.В. 2005. Репарация ДНК и ее роль в канцерогенезе. В кн.: IX Российский онкологический конгресс. М.: Изд-во Рос. Акад. Гос. Службы при Презеденте РФ. 72-75.

6. Томилин Н.В., Светлова М.П., Соловьева Л.В. 2007. Репарация двойных разрывов ДНК и модификации гистонов в хроматине. В сборнике: Бреслеровские чтения. СПб: 19.

7. Фирсанов Д.В., Кропотов A.B., Михайлов В.М. 2011. НАДФ увеличивает уровень фосфорилированного гистона ШАХ в сердце мышей после рентгеновского облучения. Цитология. 53(4): 355-358.

8. Фирсанов Д.В., Кропотов A.B., Томилин Н.В. 2011. Фосфорилирование гистона ШАХ в лимфоцитах человека как возможный показатель эффективности клеточного ответа на радиационное повреждение генома. Цитология. 53(7): 586-590.

9. Adiga S.K., Toyoshima М., Shimura Т., Takeda J., Uematsu N., Niwa O. 2007. Delayed and stage specific phosphorylation of ШАХ duringpreimplantation development of y-irradiated mouse embryos. Reproduction 133(2):415^422.

10. Agadzhanian A.V., Suskov I.I. 2010. Genomic instability in chidren born after the Chernobyl nuclear accident (in vivo and in vitro studies). Genetika 46(6):834-843.

11. Ahn J.H., McAvoy Т., Rakhilin S.V., Nishi A., Greengard P., Nairn A.C. 2007. Protein kinase A activates protein phosphatase 2A by phosphorylation of the B56delta subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104(8): 2979-2984.

12. Ahnesorg P., Smith P., Jackson S.P. 2006. XLF interacts with the XRCC4-DNA ligase IV complex to promote DNA nonhomologous end-joining. Cell 124:301-313.

13. Allen D.O., Ahmed B. and Naseer K. 1986. Relationships between cyclic AMP levels and lipolysis in fat cells after isoproterenol and Forskolin stimulation. J. Pharmacol. Exp. Ther. 238 (2): 659-664.

14. Altaf M., Auger A., Covic M., Cote J. 2009. Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes. Biochem Cell Biol. 87:35-50.

15. An J., Huang Y.C., Xu Q.Z., Zhou L.J., Shang Z.F., Huang В., Wang Y., Liu X.D., Wu D.C., Zhou P.K. 2010. DNA-PKcs plays a dominant role in the regulation of H2AX phosphorylation in response to DNA damage and cell cycle progression. BMC Mol Biol 11:18.

16. Asaithamby A., Chen D.J. 2009. Cellular responses to DNA doublestrand breaks after low-dose gamma-irradiation.Nucleic Acids Res 37(12):3912-3923.

17. Auger A., Galarneau L., Altaf M., Nourani A., Doyon Y., Utley R.T. 2008. Eafl is the platform for NuA4 molecular assembly that evolutionary links chromatin acetylation to ATP-dependent exchange of histone H2A variants. Mol Cell Biol. 28:2257-70.

18. Ayoub N., Jeyasekharan A.D., Bernal J.A., Venkitaraman A.R. 2008. HP 1-beta mobilization promotes chromatin changes that initiate the DNA damage response. Nature 453:682-6.

19. Azzam E.I., de Toledo S.M., Little J.B. 2003. Oxidative metabolism, gap junctions and the ionizing radiation-induced bystander effect. Oncogene 22(45):7050-7057.

20. Banäth J.P., Klokov D., MacPhail S.H., Banuelos C.A., Olive P.L. 2010. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer 10:4.

21. Banäth J.P., Macphail S.H., Olive P.L. 2004. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res 64(19):7144-7149.

22. Barski A., Cuddapah S., Cui K., Roh T.Y., Schönes D.E., Wang Z. 2007. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell 129:823-37.

23. Bassing C.H., Alt F.W. 2004. H2AX may function as an anchor to hold broken chromosomal DNA ends in close proximity. Cell Cycle 3(2): 149-153.

24. Beels L., Werbrouck J., Thierens H. 2010. Dose response and repair kinetics of gamma-H2AX foci induced by in vitro irradiation of whole blood and T-lymphocytes with X- and gamma-radiation. Int J Radiat Biol 86(9):760-768.

25. Berkovich E., Monnat RJ. Jr, Kastan M.B. 2007. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat Cell Biol 9(6):683-690.

26. Bird A.W., Yu D.Y., Pray-Grant M.G., Qiu Q., Harmon K.E., Megee P.C. 2002. Acetylation of histone H4 by Esal is required for DNA double-strand break repair. Nature 419:411-5.

27. Birger Y., West K.L., Postnikov Y.V., Lim J.H., Furusawa T., Wagner J.P. 2003. Chromosomal protein HMGN1 enhances the rate of DNA repair in chromatin. EMBO J. 22:1665-75.

28. Blakely W.F., Dodgen D.P., Holwittz E., Dizdaroglu M. 1987. Chemical characterization of DNA damaged by hydrogen peroxide. Annu. Rad. Res. Soc. Meet. 1.

29. Bonner W.M. 2003. Low-dose radiation: Thresholds, bystander effects, and adaptive responses. Proc Natl Acad Sei U S A 100(9):4973-4975.

30. Bonner W.M., Redon C.E., Dickey J.S., Nakamura A.J., Sedelnikova O.A., Solier S., Pommier Y. 2008. yffiAX and cancer. Nat. Rev. Cancer 8(12): 957-967.

31. Botuyan M.V., Lee J., Ward I.M., Kim J.E., Thompson J.R., Chen J. 2006. Structural basis for the methylation statespecific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell 127:1361-73.

32. Brower-Toland B., Wacker D.A., Fulbright R.M., Lis J.T., Kraus W.L., Wang M.D. 2005. Specific contributions of histone tails and their acetylation to the mechanical stability of nucleosomes. J Mol Biol. 346:135^16.

33. Burma S., Chen B.P., Murphy M., Kurimasa A., Chen D.J. 2001. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. J Biol Chem 276(45):42462^12467.

34. Cairns B.R. 2005. Chromatin remodeling complexes: strength in diversity, precision through specialization. Curr Opin Genet Dev. 15:185-90.

35. Carrier F., Georgel P.T., Pourquier P., Blake M., Kontny H.U., Antinore M.J. 1999. Gadd45, a p53-responsive stress protein, modifies DNA accessibility on damaged chromatin. Mol Cell Biol. 19:1673-85.

36. Carson D.A., Seto S., Wasson D.B., Carrera C.J. 1986. DNA strand beaks, NAD metabolism, and programmed cell death. Exp. Cell Res.164: 273-281.

37. Chan H.M., Narita M., Lowe S.W., Livingston D.M. 2005. The p400 ElA-associated protein is a novel component of the p53—>p21 senescence pathway. Genes Dev. 19:196-201.

38. Chanoux R.A., Yin В., Urtishak K.A., Asare A., Bassing C.H., Brown E.J. 2009. ATR and H2AX cooperate in maintaining genome stability under replication stress. J Biol Chem 284(9):5994-6003.

39. Chen L., Trujillo K., Sung P., Tomkinson A.E. 2000. Interactions of the DNA ligase IV-XRCC4 complex with DNA ends and the DNA-dependent protein kinase. J. Biol. Chem. 275: 26196-26205.

40. Chodaparambil J.V., Barbera A.J., Lu X., Kaye K.M., Hansen J.C., Luger K. 2007. A charged and contoured surface on the nucleosome regulates chromatin compaction. Nat Struct Mol Biol. 14:1105-7.

41. Choi J.K., Howe L.J. 2009. Histone acetylation: truth of consequences? Biochem Cell Biol. 87:139-50.

42. Chowdhury D., Keogh M.C., Ishii H., Peterson C.L., Buratowski S., Lieberman J. 2005. gamma-H2AX dephosphorylation by protein phosphatase 2A facilitates DNA double-strand break repair. Mol. Cell 20(5): 801-809.

43. Chowdhury D., Xu X., Zhong X., Ahmed F., Zhong J., Liao J., Dykxhoorn DM., Weinstock D.M., Pfeifer G.P., Lieberman J. 2008. A PP4-phosphatase complex dephosphorylates gamma-H2AX generated during DNA replication. Mol Cell 31(l):33—46.

44. Clapier C.R., Cairns B.R. 2009. The biology of chromatin remodeling complexes. Annu Rev Biochem. 78:273-304.

45. Cruet-Hennequart S., Glynn M.T., Murillo L.S., Coyne S., Carty M.P. 2008. Enhanced DNA-PK-mediated RPA2 hyperphosphorylation in DNA polymerase eta.-deficient human cells treated with cisplatin and oxaliptatin. DNA Rep. (Amst.). 7: 582- 596.

46. Dahle J., Kaalhus O., Stokke T., Kvam E. 2005. Bystander effects may modulate ultraviolet A and B radiation-induced delayed mutagenesis. Radiat Res 163(3): 289-295.

47. Dickey J.S., Baird B.J., Redon C.E., Sokolov M.V., Sedelnikova O.A., Bonner W.M. 2009. Intercellular communication of cellular stress monitored by gamma-H2AX induction. Carcinogenesis 30(10): 1686-1695.

48. Dinant C., de Jager M., Essers J., van Cappellen W.A., Kanaar R., Houtsmuller A.B., Vermeulen W.J. 2007. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. J Cell Sci 120(15):2731-2740.

49. Doil C., Mailand N., Bekker-Jensen S., Menard P., Larsen D.H., Pepperkok R. 2009. RNF168 binds and amplifies ubiquitin conjugates on damaged chromosomes to allow accumulations of repair proteins. Cell 136:435-46.

50. Douglas P., Moorhead G.B., Ye R., Lees-Miller S.P. 2001. Protein phosphatases regulate DNA-dependent protein kinase activity. J Biol Chem 276(22): 18992-18998.

51. Douglas P., Zhong J., Ye R., Moorhead G.B., Xu X., Lees-Miller S.P. 2010. Protein phosphatase 6 interacts with the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit and dephosphoiylates gamma-H2AX. Mol Cell Biol 30(6): 13681381.

52. Downs J.A., Allard S., Jobin-Robitaille O., Javaheri A., Auger A., Bouchard N. 2004. Binding of Chromatin-Modifying Activities to Phosphorylated Histone H2A at DNA Damage Sites. Mol Cell 16:979-90.

53. Doyon Y., Cote J. 2004. The highly conserved and multifunctional NuA4 HAT complex. Curr Opin Genet Dev. 14:147-54.

54. Doyon Y., Selleck W., Lane W.S., Tan S., Cote J. 2004. Structural and functional conservation of the NuA4 histone acetyltransferase complex from yeast to humans. Mol Cell Biol. 24:1884-96.

55. Endt H., Sprung C.N., Keller U., Gaipl U., Fietkau R., Distel L.V. 2010. Detailed Analysis of DNA Repair and Senescence Marker Kinetics Over the Life Span of a Human Fibroblast Cell Line. J Gerontol A Biol Sei Med Sei.

56. Englander E.W. Wilson S.H. 1992. DNA damage response of cloned DNA beta-polymerase promoter is blocked in mutant cell lines deficient in protein kinase A. Nucleic Acids Res. 20(21): 5527-5531.

57. Fabrikant J.I. 1968. The kinetics of cellular proliferation in regenerating liver. J. Cell Biol. 36(3): 551-565.

58. Fernandez-Capetillo O., Celeste A., Nussenzweig A. 2003. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell Cycle 2(5):426-427.

59. Fernandez-Capetillo O., Lee M., Nussenzweig A. 2004. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA Repair. 3: 959-967.

60. Ferreira H., Somers J., Webster R., Flaus A., Owen-Hughes T. 2007. Histone tails and the H3 alphaN helix regulate nucleosome mobility and stability. Mol Cell Biol. 27:4037-48.

61. Firsanov D., Vasilishina A., Kropotov A., Mikhailov V. 2012. Dynamics of yH2AX formation and elimination in mammalian cells after X-irradiation. Biochimie. 94 (11): 24162422.

62. Fuchs M., Gerber J., Drapkin R., Sif S., Ikura Т., Ogryzko V. 2001. The p400 complex is an essential El A transformation target. Cell 106:297-307.

63. Gagou M.E., Zuazua-Villar P., Meuth M. 2010. Enhanced H2AX phosphorylation, DNA replication fork arrest, and cell death in the absence of Chkl. Mol Biol Cell 21(5):739-752.

64. Galanty Y., Belotserkovskaya R., Coates J., Polo S., Miller K.M., Jackson S.P. 2009. Mammalian SUMO E3-ligases PIAS1 and PIAS4 promote responses to DNA double-strand breaks. Nature 462:935-9.

65. Galleani J., Miranda C., Pierotti M.A., Greco A. 2009. H2AX phosphorylation and kinetics of radiation-induced DNA double strand break repair in human primary thyrocytes.Thyroid 19(3):257-264.

66. Georgakilas A.G. 2008. Processing of DNA damage clusters in human cells: current status of knowledge. Mol. BioSyst. 4: 30-35.

67. Gevry N., Chan H.M., Laflamme L., Livingston D.M., Gaudreau L.2007. p21 transcription is regulated by differential localization of histone H2A.Z. Genes Dev. 21:1869-81.

68. Goodarzi A.A., Noon A.T., Deckbar D., Ziv Y., Shiloh Y., Lobrich M.2008. ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin. Mol Cell 31:167-77.

69. Goodarzi A.A., Noon A.T., Jeggo P.A. 2009. The impact of heterochromatin on DSB repair. Biochem Soc Trans. 37:569-76.

70. Groth A., Rocha W., Verreault A., Almouzni G. 2007. Chromatin challenges during DNA replication and repair. Cell 128:721-33.

71. Grudzenski S., Raths A., Conrad S., Rübe C.E., Löbrich M. 2010. Inducible response required for repair of low-dose radiation damage in human fibroblasts. Proc Natl Acad Sei U S A 107(32): 14205-1410.

72. Guenther M.G., Levine S.S., Boyer L.A., Jaenisch R., Young R.A. 2007. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell 130:77-88.

73. Heyer W.D. 1994. The search for the right partner: homologous pairing and DNA strand exchange proteins in eukaryotes. Experientia. 50: 223233.

74. Hooker A.M., Bhat M., Day T.K., Lane J.M., Swinburne S.J., Morley A.A., Sykes P J. 2004. The linear no-threshold model does not hold for low-dose ionizing radiation. Radiat Res 162(4):447-452.

75. Huen M.S., Grant R., Manke I., Minn K., Yu X., Yaffe M.B. 2007. RNF8 transduces the DNA-damage signal via histone ubiquitylation and checkpoint protein assembly. Cell 131:901-14.

76. Huyen Y., Zgheib O., Ditullio R.A. Jr, Gorgoulis V.G., Zacharatos P., Petty T.J. 2004. Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature 432:406-11.

77. Iijima K., Ohara M., Seki R., Tauchi H. 2008. Dancing on damaged chromatin: functions of ATM and the RAD50/MRE11/NBS1 complex in cellular responses to DNA damage. J Radiat Res (Tokyo) 49(5):451-464.

78. Ikura T., Tashiro S., Kakino A., Shima H., Jacob N., Amunugama R., Yoder K., Izumi S., Kuraoka I., Tanaka K., Kimura H., Ikura M., Nishikubo S., Ito T., Muto A., Miyagawa K., Takeda S., Fishel R., Igarashi K., Kamiya K. 2007.

79. DNA damage-dependent acetylation and ubiquitination of H2AX enhances chromatin dynamics. Mol Cell Biol 27(20):7028-7040.

80. Iliakis G. 2009. Backup pathways of NHEJ in cells of higher eukaryotes: cell cycle dependence. Radiother Oncol 92(3):310—315.

81. Ionizing radiation: levels and effects (1972) A report of the United Nations Scientific Committee on the effects of atomic radiation to the general assembly with annexes, v. I, N. Y.

82. Ishii K., Misonoh J. 1996. Induction of radio-adaptive response by low-dose X-irradiation on chromosome aberrations in human embryonic fibroblasts. Physiol Chem Phys Med NMR 28(2):83-90.

83. Jackson S.P. 2002. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23(5): 687-696.

84. Jazayeri A., Falck J., Lukas C., Bartek J., Smith G.C., Lukas J., Jackson S.P. 2006. ATM- and cell cycle-dependent regulation of ATR in response to DNA double-strand breaks. Nat Cell Biol 8(1): 37-45.

85. Jeggo P.A., Lobrich M. 2005. Artemis links ATM to double-strand breaks rejoining. Cell Cycle. 4: 42-44.

86. Jha S., Shibata E., Dutta A. 2008. Human Rvbl/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol 28(8):2690-2700.

87. Jiang X., Xu Y., Price B.D. 2010. Acetylation of H2AX on lysine 36 plays a key role in the DNA double-strand break repair pathway. FEBS Lett. 584:2926-30.

88. Kalocsay M., Hiller N.J., Jentsch S. 2009. Chromosome-wide Rad51 spreading and SUMO-H2A.Z-dependent chromosome fixation in response to a persistent DNA double-strand break. Mol Cell 33(3):335-343.

89. Karlsson K.H., Radulescu I., Rydberg В., Stenerlow B. 2008. Repair of radiation-induced heat-labile sites is independent of DNA-PKcs, XRCC1 and PARP. Radiat. Res. 169: 506-512.

90. Kashiwaba S., Kitahashi K., Watanabe Т., Onoda F., Ohtsu M., Murakami Y. 2010. The mammalian IN080 complex is recruited to DNA damage sites in an ARP8 dependent manner. Biochem Biophys Res Commun 402(4):619-625.

91. Kastan M.B. 2008. DNA damage responses: mechanisms and roles in human disease. 2007 G.H.A. clowes memorial award lecture, Mol. Cancer Res. 6: 517-524.

92. Kim H., Chen J., Yu X. 2007. Ubiquitin-binding protein RAP80 mediates BRCAl-dependent DNA damage response. Science 316:1202-5.

93. Koike M., Mashino M., Sugasawa J., Koike A. 2007. Dynamic change of histone H2AX phosphorylation independent of ATM and DNA-PK in mouse skin in situ. Biochem Biophys Res Commun 363(4):1009-1012.

94. Koike M., Mashino M., Sugasawa J., Koike A. 2008a. Histone H2AX phosphorylation independent of ATM after X-irradiation in mouse liver and kidney in situ. J. Radiat. Res. (Tokyo) 49(4): 445-449.

95. Koike M., Sugasawa J., Yasuda M., Koike A. 2008b. Tissue-specific DNA-PK-dependent H2AX phosphorylation and gamma-H2AX elimination after X-irradiation in vivo. Biochem Biophys Res Commun 376(l):52-55.

96. Kolas N.K., Chapman J.R., Nakada S., Ylanko J., Chahwan R., Sweeney F.D. 2007. Orchestration of the DNAdamage response by the RNF8 ubiquitin ligase. Science 318:1637-40.

97. Kruhlak M.J., Celeste A., Dellaire G., Fernandez-Capetillo O., Muller W.G., McNally J.G. 2006. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 172:823-34.

98. Kuikka J.T. 2009. Low-dose radiation risk and the linear no-threshold model. Int J of Low Radiation 6(2): 157-163.

99. Kurz E., Lees-Miller S. 2004. DNA damage-induced activation of ATM and ATM-dependent signaling pathways. DNA Repair 3(8-9):889-900.

100. Kusch T., Florens L., Macdonald W.H., Swanson S.K., Glaser R.L., Yates J.R. 3rd, Abmayr S.M., Washburn M.P., Workman J.L. 2004. Acetylation by Tip60 is required for selective histone variant exchange at DNA lesions. Science 306(5704):2084-2087.

101. Laurenza A., Sutkowski E.M. and Seamon K.B. 1989. Forskolin: A specific stimulator of adenylyl cyclase or a diterpene with multiple sites of action? TIPS. 101.442-446.

102. Lavin M.E. 2007. ATM and the Mrel 1 complex combine to recognize and signal DNA double-strand breaks. Oncogene 26: 7749-58.

103. Li X., Lee Y.K., Jeng J.C., Yen Y., Schultz D.C., Shih H.M. 2007. Role for KAP1 serine 824 phosphorylation and sumoylation/desumoylation switch in regulating KAPl-mediated transcriptional repression. J Biol Chem. 282:3617789.

104. Li X., Lin H.H., Chen H., Xu X., Shih H.M., Ann D.K. 2010. SUMOylation of the transcriptional co-repressor KAP1 is regulated by the serine and threonine phosphatase PP1. Sei Signal 3:32.

105. Lieber M.R. 2010. The mechanism of double-strand DNA break repair by the non-homologous DNA end-joining pathway. 2010. Annu. Rev. Biochem. 1-1: 1-31.

106. Lieber M.R., Grawunder U., Wu X., Yaneva M. 1997. Tying loose ends: roles of Ku and DNA-dependent protein kinase in the repair of doublestrand breaks. Curr. Opin. Genet. Dev. 7: 99-104.

107. Löblich M., Kühne K., Rothkamm K. 2000. Joining of correct and incorrect DNA double strand break ends in normal human and ataxia telangiectasia fibroblasts. Genes. Chromosomes and Cancer 27: 59-68.

108. Löbrich M., Rief N., Kühne M., Heckmann M., Fleckenstein J., Rübe C., Uder M. 2005. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sei U S A 102(25):8984-8989.

109. Löbrich M., Shibata A., Beucher A., Fisher A., Ensminger M., Goodarzi A.A., Barton O., Jeggo P.A. 2010. gammaH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: strengths, limitations and optimization. Cell Cycle 9(4):662-669.

110. Luger K., Mader A.W., Richmond R.K., Sargent D.F., Richmond T.J. 1997. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature 389:251-60.

111. Luijsterburg M.S., Dinant C., Lans H., Stap J., Wiernasz E., Lagerwerf S. 2009. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185:577-86.

112. Ma Y., Pannicke U., Lu H., Niewolik D., Schwarz K., Lieber M.R. 2005. The DNA-dependent protein kinase catalytic subunit phosphorylation sites in human artemis. J. Biol. Chem. 280 : 33839-33846.

113. Macürek L., Lindqvist A., Voets O., Kool J., Vos H.R., Medema R.H. 2010. Wipl phosphatase is associated with chromatin and dephosphorylates gammaH2AX to promote checkpoint inhibition. Oncogene 29(15):2281-2291.

114. Mailand N., Bekker-Jensen S., Faustrup H., Melander F., Bartek J., Lukas C. 2007. RNF8 ubiquitylates histones at DNA double-strand breaks and promotes assembly of repair proteins. Cell 131:887-900.

115. Mao Z., Bozzella M., Seluanov A., Gorbunova V. 2008. DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells. Cell Cycle 7(18): 2902-2906.

116. Meek K. 2009. New targets to translate DNA-PK signals. Cell Cycle. 8: 3809.

117. Meek K., Gupta S., Ramsden D.A., Lees-Miller S.P. 2004. The DNA-dependent protein kinase: the director at the end. Immunol Rev. 200: 132141.

118. Meyn R.E., Jenkins W.T. 1983. Variation in normal and tumor tissue sensitivity of mice to ionizing radiation-induced DNA strand breaks in vivo. Cancer Res 43 (12 Pt l):5668-5673.

119. Moon S.H., Nguyen T.A., Darlington Y., Lu X., Donehower L.A.2010. Dephosphorylation of gammaH2AX by WIP1: An important homeostatic regulatory event in DNA repair and cell cycle control. Cell Cycle 9(11).

120. Morris J.R., Boutell C., Keppler M., Densham R., Weekes D., Alamshah A., 2009. The SUMO modification pathway is involved in the BRCA1 response to genotoxic stress. Nature 462:886-90.

121. Morrison A.J., Highland J., Krogan N.J., Arbel-Eden A., Greenblatt J.F., Haber J.E., Shen X. 2004. IN080 and gamma-H2AX interaction links ATP-dependent chromatin remodeling to DNA damage repair. Cell 119(6):767-775.

122. Motoyama N., Naka K. 2004. DNA damage tumor suppressor genes and genomic instability. Curr Opin Genet Dev. 14(1): 11-16.

123. Moysich K.B., Menezes R.J., Michalek A.M. 2002. Chernobyl-related ionising radiation exposure and cancer risk: an epidemiological review. Lancet Oncol 3(5):269-279.

124. Murga M., Jaco I., Fan Y., Soria R., Martinez-Pastor B., Cuadrado M. 2007. Global chromatin compaction limits the strength of the DNA damage response. J Cell Biol. 178: 1101-8.

125. Murr R., Loizou J.I., Yang Y.G., Cuenin C., Li H., Wang Z.Q. 2006. Histone acetylation by Trrap-Tip60 modulates loading of repair proteins and repair of DNA double-strand breaks. Nat Cell Biol. 8: 91-99.

126. Musa L.N., Ramakrishnan M., Li J., Kartha S., Liu P., Pesteil RG and Hershenson M.B. 1999. Forskolin inhibits cyclin D1 expression in cultured airway smooth-muscle cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 20. 352-358.

127. Nakada S., Chen G.I., Gingras A.C., Durocher D. 2008. PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint. EMBO Rep 9(10): 1019-1026.

128. National Council on Radiation Protection. 2001. Evaluation of the Linear-Nonthreshold Dose-Response Model for Ionizing Radiation (NCRP Report No 136).

129. Nikjoo H., Khvostunov I.K. 2003. Biophysical model of the radiation-induced bystander effect. Int. J. Radiat. Biol. 79(1): 43-52.

130. Nikjoo H., O'Neill P., Wilson W.E., Goodhead D.T. 2001. Computational approach for determining the spectrum of DNA damage induced by ionizing radiation. Radiat Res 156(5 Pt 2):577-583.

131. Noon A.T., Shibata A., Rief N., Lobrich M., Stewart G.S., Jeggo P.A. 2010. 53BPl-dependent robust localized KAP-1 phosphorylation is essential for heterochromatic DNA double-strand break repair. Nat Cell Biol. 12:177-84.

132. Nowak E., Etienne О., Millet P., Lages С.S., Mathieu C., Mouthon M.A., Boussin F.D. 2006. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat. Res. 165(2): 155-164.

133. Nuta О., Darroudi F. 2008. The impact of the bystander effect on the low-dose hypersensitivity phenomenon. Radiat Environ Biophys 47(2):265-274.

134. Olive P.L., Banath J.P. 2004. Phosphorylation of histone H2AX as a measure of radiosensitivity. Int J Radiat Oncol Biol Phys 58(2):331-335.

135. Otsuki M., Seki M., Kawabe Y.-i., Inoue E., Dong Y.P., Abe Т., Kato G., Yoshimura A., Tada S., Enomoto T. 2007. WRN counteracts the NHEJ pathway upon camptothecin exposure. Biochem. Biophys. Res. Commun. 355: 477-482.

136. Paull T.T., Rogakou E.P., Yamazaki V., Kirchgessner C.U., Gellert M., Bonner W.M. 2000. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Curr Biol 10(15):886—895.

137. Peng J.C., Karpen G.H. 2008. Epigenetic regulation of heterochromatic DNA stability. Curr Opin Genet Dev. 18:204-11.

138. Perrpotti D. and Neviani P. 2008. Protein phosphatase 2A (PP2A), a drugable tumor suppressor in Phl(+) leukemias. Cancer Metastasis Rev. 27. 159— 168.

139. Pokholok D.K., Harbison C.T., Levine S., Cole M., Hannett N.M., Lee T.I. 2005. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell 122:517-27.

140. Pospelova T.V., Demidenko Z.N., Bukreeva E.I., Pospelov V.A., Gudkov A.V., Blagosklonny M.V. 2009. Pseudo-DNA damage response in senescent cells. Cell Cycle 8(24):4112-4118.

141. Povirk L.F., Zhou Т., Zhou R., Cowan M.J., Yannone S.M. 2007. Processing of З'-phosphoglycolate-terminated DNA double-strand breaks by artemis nuclease. J. Biol. Chem. 282: 3547-3558.

142. Redon C., Pilch D., Rogakou E., Sedelnikova O., Newrock K., Bonner W. 2002. Histone H2A variants H2AX and H2AZ. Curr Opin Genet Dev 12(2): 162-169.

143. Robinson P.J., An W., Routh A., Martino F., Chapman L., Roeder R.G. 2008. 30 nm chromatin fibre decompaction requires both H4-K16 acetylation and linker histone eviction. J Mol Biol. 381:816—25.

144. Rogakou E.P., Boon C., Redon C., Bonner W.M. 1999. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146(5):905-916.

145. Rogakou E.P., Pilch D.R., Orr A.H., Ivanova V.S., Bonner W.M. 1998. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273(10):5858-5868.

146. Rothkamm К., Balroop S., Shekhdar J., Fernie P., Goh V. 2007. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242(1): 244-251.

147. Rothkamm К., Löbrich M. 2003. Evidence for a lack of DNA doublestrand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sei U S A 100(9):5057-5062.

148. Rubbi C.P., Milner J. 2003. p53 is a chromatin accessibility factor for nucleotide excision repair of DNA damage. EMBO J. 22:975-86.

149. Rübe C.E., Fricke A., Wendorf J., Stützel A., Kühne M., Ong M.F., Lipp P., Rübe С. 2010. Accumulation of DNA double-strand breaks in normaltissues after fractionated irradiation. Int J Radiat Oncol Biol Phys 76(4): 1206— 1213.

150. Rübe C.E., Zhang S., Miebach N., Fricke A., Rübe C. 2011. Protecting the heritable genome: DNA damage response mechanisms in spermatogonial stem cells. DNA Repair 10(2):159—168.

151. Rydberg B. 2000. Radiation-induced heat-labile sites that convert into DNA double-strand breaks. Radiat. Res. 153: 805-812.

152. Sak A., Stueben G., Groneberg M., Böcker W., Stuschke M. 2005. Targeting of Rad51-dependent homologous recombination: implications for the radiation sensitivity of human lung cancer cell lines. Br J Cancer 92(6): 1089-1097.

153. Sancar A., Lindsey-Boltz L.A., Unsal-Kacmaz K., Linn S. 2004. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Annu. Rev. Biochem. 73: 39-85.

154. Sanders S.L., Portoso M., Mata J., Bahler J., Allshire R.C., Kouzarides T. 2004. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell 119:603-14.

155. Seamon K.B., Padgett W. and Daly W. 1981. Forskolin: Unique diterpene activator of adenylate cyclaser in membranes and in intact cells. Proc Natl Acad Sei USA. 78. 3363-3367.

156. Sewing A., Burger C., Brusselbach S., Schalk C., Lucibello FC and Muller R. 1993. Human cyclin D1 encodes a labile nuclear protein whose synthesisis directly induced by growth factors and suppressed by cyclic AMP. J. Cell Sci. 104. 545-555.

157. Schultz L.B., Chehab N.H., Malikzay A., Halazonetis T.D. 2000. p53 binding protein 1(53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol 151(7): 1381-1390.

158. Sedelnikova O.A., Bonner W.M. 2006. y-H2AX in Cancer Cells. Cell Cycle 5(24):2909-2913.

159. Sedelnikova O.A., Horikawa I., Redon C., Nakamura A., Zimonjic D.B., Popescu N.C., Bonner W.M. 2008. Delayed kinetics of DNA double-strand break processing in normal and pathological aging. Aging Cell 7(1):89-100.

160. Sedelnikova O.A., Pilch D.R., Redon C., Bonner W.M. 2003. Histone H2AX in DNA damage and repair. Cancer Biol Ther 2(3):233-235.

161. Shao C., Lyng F.M., Folkard M., Prise K.M. 2006. Calcium fluxes modulate the radiation-induced bystander responses in targeted glioma and fibroblast cells. Radiat Res. 166(3): 479-487.

162. Shiotani B., Zou L. 2009. Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks. Mol Cell 33(5):547-558.

163. Shogren-Knaak M., Ishii H., Sun J.M., Pazin M.J., Davie J.R., Peterson C.L. 2006. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science 311:844-7.

164. Shrivastav M., De Haro L.P., Nickoloff J.A. 2008. Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice. Cell Res 18(1): 134-147.

165. Shroff R., Arbel-Eden A., Pilch D., Ira G., Bonner W.M., Petrini J.H. 2004. Distribution and dynamics of chromatin modification induced by a defined DNA double-strand break. Curr Biol. 14:1703-11.

166. Sinha M., Peterson C.L. 2009. Chromatin dynamic during repair of chromosomal DNA double-strand breaks. Epigenomics 1: 371-85.

167. Sobhian В., Shao G., Lilli D.R., Culhane A.C., Moreau L.A., Xia B. 2007. RAP80 targets BRCA1 to specific ubiquitin structures at DNA damage sites. Science 316:1198-202.

168. Sokolov M.V., Dickey J.S., Bonner W.M., Sedelnikova O.A. 2007. gamma-H2AX in bystander cells: not just a radiation-triggered event, a cellular response to stress mediated by intercellular communication. Cell Cycle 6(18):2210-2212.

169. Solovjeva L.V., Pleskach N.M., Firsanov D.V., Svetlova M.P., Serikov V.B., Tomilin N.V. 2009. Forskolin decreases phosphorylation of histone H2AX in human cells induced by ionizing radiation. Radiat Res 171(4):419-424.

170. Soubeyrand S., Pope L., De Chasseval R., Gosselin D., Dong F., de Villartay J-P., Hache R.J.G. 2006. Artemis phosphorylated by DNA-dependent protein kinase associates preferentially with discrete regions of chromatin. J. Mol. Biol. 358: 1200-1211.

171. Squatrito M., Gorrini C., Amati B. 2006. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol 16(9):433—442.

172. Stenerlow В., Karlsson K.H., Cooper В., Rydberg B. 2003. Measurement of prompt DNA double-strand breaks in mammalian cells without including heat-labile sites : results for cell deficient in nonhomologous end joining. Radiat. Res. 159: 502-510.

173. Stewart G.S., Panier S., Townsend K., Al-Hakim A.K., Kolas N.K., Miller E.S. 2009. The RIDDLE syndrome protein mediates a ubiquitin-dependent signaling cascade at sites of DNA damage. Cell 136:420-34.

174. Stewart G.S., Wang B., Bignell C.R., Taylor A.M., Elledge S.J. 2003. MDC1 is a mediator of the mammalian DNA damage checkpoint. Nature 421(6926):961-966.

175. Stiff T., O'Driscoll M., Rief N., Iwabuchi K., Lobrich M., Jeggo P.A. 2004. ATM and DNA-PK function redundantly to phosphorylate H2AX after exposure to ionizing radiation. Cancer Res 64(7) :2390-2396.

176. Stucki M., Jackson S.P. 2006. gammaH2AX and MDC1: anchoring the DNA-damage-response machinery to broken chromosomes. DNA Repair 5(5):534-543.

177. Sun Y., Jiang X., Chen S., Fernandes N., Price B.D. 2005. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci USA 102:13182-7.

178. Sun Y., Jiang X., Price B.D. 2010. Tip60: Connecting chromatin to DNA damage signaling. Cell Cycle 9.

179. Sun Y., Jiang X., Xu Y., Ayrapetov M.K., Moreau L.A., Whetstine J.R. 2009. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat Cell Biol. 11:1376-82.

180. Sun Y., Xu Y., Roy K., Price B.D. 2007. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27:8502-9.

181. Svetlova M., Solovjeva L., Nishi K., Nazarov I., Siino J., Tomilin N. 2007. Elimination of radiation-induced gamma-H2AX foci in mammalian nucleuscan occur by histone exchange. Biochem. Biophys. Res. Commun. 358(2):650-654.

182. Tarsounas M., Davies D., West S.C. 2003. BRCA-2-dependent and independent formation of RAD51 nuclear foci. Oncogene. 22: 1115-1123.

183. Taucher-Scholz K., Kraft G. 1999. Influence of radiation quality on the yield of DNA strand breaks in SV40 DNA irradiated in solution. Radiat. Res. 151(5): 595-604.

184. Telford D.J., Stewart B.W. 1989. Micrococcal nuclease: its specificity and use for chromatin analysis. Int J Biochem. 21:127-37.

185. Tomilin N.V., Solovjeva L.V., Svetlova M.P., Pleskach N.M., Zalenskaya I.A., Yau P.M., Bradbury E.M. 2001. Visualization of focal nuclear sites of DNA repair synthesis induced by bleomycin in human cells. Radiat. Res. 156(4): 347-354.

186. Toth K., Brun N., Langowski J. 2006. Chromatin compaction at the mononucleosome level. Biochemistry 45:1591-8.

187. Tsukuda T., Fleming A.B., Nickoloff J.A., Osley M.A. 2005. Chromatin remodelling at a DNA double-strand break site in Saccharomyces cerevisiae. Nature 438:379-83.

188. Tubiana M., Feinendegen L.E., Yang С., Kaminski J.M. 2009. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology 251(1): 13-22.

189. Vakoc C.R., Sachdeva M.M., Wang H., Blobel G.A. 2006. Profile of histone lysine methylation across transcribed mammalian chromatin. Mol Cell Biol. 26:9185-95.

190. Vens C., Hofland I., Begg A.C. 2007. Involvement of DNA polymerase beta in repair of ionizing radiation damage as measured by in vitro plasmid assays. Radiat. Res. 168(3): 281-291.

191. Wang В., Elledge S.J. 2007. Ubcl3/Rnf8 ubiquitin ligases control foci formation of the Rap80/Abraxas/Brcal/Brcc36 complex in response to DNA damage. Proc Natl Acad Sci USA 104:20759-63.

192. Wang C., Jurk D., Maddick M., Nelson G., Martin-Ruiz C., von Zglinicki T. 2009. DNA damage response and cellular senescence in tissues of aging mice. Aging Cell 8(3):311-323.

193. Wang H., Wang M., Wang H., Bocker W., Iliakis G. 2005. Complex H2AX phosphorylation patterns by multiple kinases including ATM and DNA-PK in human cells exposed to ionizing radiation and treated with kinase inhibitors. J Cell Physiol 202(2):492-502.

194. Wang X., Hayes J.J. 2008. Acetylation mimics within individual core histone tail domains indicate distinct roles in regulating the stability of higherorder chromatin structure. Mol Cell Biol. 28:227-36.

195. Ward I.M., Chen J. 2001. Histone H2AX is phosphorylated in an ATR-dependent manner in response to replicational stress. J Biol Chem 276(51):47759-47762.

196. Ward I.M., Minn K., Chen J. 2004. UV-induced ataxia-telangiectasia-mutated and Rad3-related (ATR) activation requires replication stress. J Biol Chem 279(11):9677-9680.

197. Ward J.F. 1990. The yield of DNA double-strand breaks produced intracellularly by ionizing radiation. A review Int. J. Radiat. Biol. 57: 1141-1150.

198. Ward J.F. 1994. The complexity of DNA damage: relevance to biological consequences. Int. J. Radiat. Biol. 66: 427-432.

199. Ward J.F. 2000. Complexity of damage produced by ionizing radiation. Cold Spring Harb. Simp. Quant. Biol. 65: 377-382.

200. Ward J.F., Kuo I. 1976. Strand breaks, base release, and postirradiation changes in DNA y-irradiated in dilute 02-saturated aqueous solution. Radiat. Res. 66: 485^198.

201. Wei F., Xie Y., He L., Tao L., Tang D. 2011. ERK1 and ERK2 kinases activate hydroxyurea-induced S-phase checkpoint in MCF7 cells by mediating ATR activation. Cell Signal 23(l):259-268.

202. Wu P.-Y., Frit P., Malivert L., Revy P., Biard D., Salles В., Calsou P. 2007. Interplay between cernunnos-XLF and nonhomologous end-joining proteins at DNA ends in the cell. J. Biol. Chem. 282: 31937-31943.

203. Wyman C., Kanaar R. 2006. DNA double-strand break repair: all's well that ends well. Annu. Rev. Genet. 40: 363-383.

204. Xu Y., Sun Y., Jiang X., Ayrapetov M.K., Moskwa P., Yang S., Weinstock D.M., Price B.D. 2010b. The p400 ATPase regulates nucleosome stability and chromatin ubiquitination during DNA repair. J Cell Biol 191(1):31-43.

205. Yajima H., Lee K.J., Zhang S., Kobayashi J., Chen B.P. 2009. DNA double-strand break formation upon UV-induced replication stress activates ATM and DNA-PKcs kinases. J Mol Biol 385(3):800-810.

206. Yan C., Lu J., Zhang G., Gan Т., Zeng Q., Shao Zh., Duerksen-Hughes P.J. and Yang J. 2011. Benzoa.pyrene induces complex H2AX phosphorylation patterns by multiple kinases including ATM, ATR, and DNA-PK. Toxicol In Vitro 25(1):91—99.

207. Yang J., Yu Y., Hamrick H.E., Duerksen-Hughes P.J. 2003. ATM, ATR and DNA-PK: initiators of the cellular genotoxic stress responses. Carcinogenesis 24(10): 1571-1580.

208. Yano K.-i., Morotomi-Yano K., Akiyama H. 2009. Cernunnos/XLF: a new player in DNA double-strand break repair. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41: 1237-1240.

209. Yatagai F., Suzuki M., Ishioka N., Ohmori H., Honma M. 2008. Repair of I-Scel induced DSB at a specific site of chromosome in human cells: influence of low-dose, low-dose-rate gamma-rays. Radiat Environ Biophys 47(4):439-444.125 )h

210. Ye J., Ai X., Eugeni E.E., Zhang L., Carpenter L.R., Jelinek M.A.2005. Histone H4 lysine 91 acetylation a core domain modification associated with chromatin assembly. Mol Cell 18:123-30.

211. Yoshida K., Yoshida S.H., Shimoda C., Morita T. 2003. Expression and radiation-induced phosphorylation of histone H2AX in mammalian cells. J. Radiat. Res. (Tokyo) 44(1): 47-51.

212. Yu Т., MacPhail S.H., Banath J.P., Klokov D., Olive P.L. 2006. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair 5(8):935-946.

213. Yu Y., Mahaney B.L., Yano K.-I., Ye R., Fang S., Douglas P., Chen D.J., Lees-Miller S.P. 2008. DNA-PK and ATM phosphorylation sites in XLF/Cernuimos are not required for repair of DNA double-strand breaks. DNA Rep. (Amst.). 7: 1680-1692.

214. Yuan J., Chen J. 2010. MRE11-RAD50-NBS1 complex dictates DNA repair independent of H2AX. J Biol Chem 285(2): 1097-1104.

215. Zeng L., Yap K.L., Ivanov A.V., Wang X., Mujtaba S., Plotnikova O. 2008. Structural insights into human KAP1 PHD finger-bromodomain and its role in gene silencing. Nat Struct Mol Biol. 15:626-33.

216. Ziv Y., Bielopolski D., Galanty Y., Lukas C., Taya Y., Schultz D.C.2006. Chromatin relaxation in response to DNA double-strand breaks is modulated by a novel ATM- and KAP-1 dependent pathway. Nat Cell Biol. 8:870-6.

Информация о работе

Фирсанов, Денис Владимирович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2012
ВАК 03.03.04

Диссертация

Динамика образования и элиминации фосфорилированного гистона Н2АХ в клетках млекопитающих после рентгеновского облучения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Динамика образования и элиминации фосфорилированного гистона Н2АХ в клетках млекопитающих после рентгеновского облучения - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы