Диссертации » Биологические науки » Гистология, цитология, клеточная биология

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Преждевременное старение и радиочувствительность клеток у больных атаксией-телеангиэктазией
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Преждевременное старение и радиочувствительность клеток у больных атаксией-телеангиэктазией"

0034/3

На правах рукописи

ПОЛУБОТКО ОН Евгения Анатольевна

а

ПРЕЖДЕВРЕМЕННОЕ СТАРЕНИЕ И РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТОК У БОЛЬНЫХ АТАКСИЕЙ-ТЕЛЕАНГИЭКТАЗИЕЙ

03.00.25 Гистология, цитология, клеточная биология

- 8 ОКТ 2009

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2009

003479123

Работа выполнена в Лаборатории радиационной цитологии

Учреждения Российской академии наук Ипсггшута цитологии РАН, Санкт-

Петербург

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент

Спивак Ирина Михайловна Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Поспелова Татьяна Викторовна Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Воробцооа Ирина Евгеньевна Российский научный центр радиологии и хирургических технологий Федерального агентства по высокотехнологической медицине

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук

Ведущая организация:

НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова Росмедтехнологии

Защита состоится "30 "октября 2009 года в ч на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4. Факс: +7(812)297 9341

Сайт: www.cvtspb.rssi.rii

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института цитологии РАН

Реферат разослан сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Каминская Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Функциональный анализ генов, вовлеченных d процессы репарации ДНК, является основой для понимания природы генетической нестабильности и повышенной радиочувствительности клеток у человека, приводящих к опухолевой трансформации, раку и старению (Sanear et al., 2004; Thaker, Zdzienicka, 2005). Важный прогресс в этой области в течение последнего десятилетия, за время которого было клонировало и секвенировано большинство репарационных генов и подробно охарактеризованы кодируемые ими белки (Hoeijmakers, 2001; Hanawalt, 2001; Iliakis et al., 2003), значительно расширил наши представления о механизмах, позволяющих всем живым организмам сохранять собственную генетическую целостность после повреждающих воздействий. Важнейшие достижения в этой области были связаны с описанием редких наследственных заболеваний человека, возникающих при наличии мутаций в генах, вовлеченных в процессы репарации ДНК (Спивак, 1999; Christmann et al., 2003). Эти заболевания являются естественной моделью для изучения процессов репарации ДНК и канцерогенеза, причем одновременно в семьях больных прослеживается предрасположенность к повышенной частоте возникновения раковых заболеваний, связанная с гетерозиготным носительством мутаций в тех же генах (Nakayama, 2002; Pulverer, 2003). Клеточные линии и штаммы, полученные от таких больных, являются моделью для изучения таких процессов, как репарация, репликация и рекомбинация ДНК, старение и канцерогенез (Михельсон, 1996; Наседкина и др., 1997; Спивак и др., 1997; Спивак, 1999; Barenfeld et al., 1998; Mikhelson, 2001).

Изучение репарации ДНК шло параллельно с исследованиями действия различных повреждающих агентов на молекулярном уровне. Особое место среди повреждающих воздействий занимают ионизирующая радиация и химические мутагены, действие которых приводит к сходным последствиям, в первую очередь—возникновению двушггевых разрывов ДНК (Kolman et al., 1997; Chovanec et al., 1998; Huang et al., 2003). Появление в ДНК двушггевых разрывов (DSBs) запускает каскад внутриклеточных реакций, опосредуемых различными сигнальными путями, и приводит к развитию глобального клеточного ответа на повреждение, включающего активацию специфических чекпошггов (мест сшивок), возникающих в ответ на повреждение ДНК. Следствием этого является

остановка клеточного цикла, усиление репарационных процессов и изменение конформации хроматина (Belayev et al., 1996; Fei, El-Deiry, 2003; Iliakis et al., 2003; Zhou, Bartek, 2004). Ключевым белком глобального клеточного ответа принято в настоящее время считать протеинкиназу ATM (ataxia-telangiectasia mutated), способную к автофосфорилировангао и активации в ответ на возникновение конформационных изменений хроматина после появления DSBs и быстрому последующему фосфорилированию различных белков-мишеней, среди которых Р53, СНК2, BRCAl, NBS1, Н2АХ и многие другие (Kim et al., 2002;Westphal et al., 1997; Shiloh, 2003; Lavin, 2008).

При наличии мутаций в обеих аллелях гена atm развивается тяжелое заболевание со сложным плейотропным фенотипом—атаксия-телеаигиэктазия (AT), или синдром Луи-Бара, характеризующееся множественными нейрологическими аномалиями, высокой предрасположенностью к опухолевым заболеваниям, ускорешшм старением и крайней чувствительностью к действию ионизирующей радиации (Спивак, 1999; Landsdorp, 2000; Shiloh, 2003; Lavin, 2008). При отсутствии ATM ее функции частично берет на себя ATR (ataxia-telangiectasia related), сходная с пей по структуре, но хуже изученная (Abraham, 2001). Ген ATM находится на 11 хромосоме - llq23, имеет размер примерно 150 т.п.н. и содержит 66 экзонов (Uziel et al., 1996; Platzer et al., 1997). Хотя к настоящему времени он полностью секвенирован, оказалось, что каждая детально исследованная АТ-семья несет свою собственную мутацию, что требует полного сиквенса исследуемого гена и существенно осложняет диагностику (Sandoval et al., 1999).

Несмотря на имеющиеся к настоящему времени многочисленные данные о роли белка ATM в клеточном ответе на радиационные повреждения, остается недостаточно ясной картина в каждом отдельном случае, с которым сталкиваются клиницисты и ученые. К тому же гетерозиготное носительство этого заболевания гораздо шире, чем можно предположить, исходя из его частоты, и составляет по разным данным от 2 до 10 % в различных популяциях. Носители, как правило, имеют предрасположенность к развитию ранних опухолей различной этиологии. Действие небольших случайных доз ионизирующей радиации или мутагенов может служить в таких случаях триггером для развития опухолевого процесса. Поиск быстрого метода определения потенциального носительства мутаций в гене ATM и других, отвечающих за процессы репарации ДНК в клетке, является,

таким образом, одной из важных научно-практических задач радиобиологии и радиационной гигиены.

К настоящему времени накоплены многочисленные экспериментальные данные, указывающие на то, что для репарации DSBs необходимо ремоделирование хроматина, происходящее при строго ассоциированном с образованием DSB специфическом фосфорилировании С-концевого серина-139 вариантного гистона Н2АХ, получившего название у-Н2АХ (Ward et al., 2001; Goodarzí et al., 200B; Kuo, Yang, 2008). Мегабазные участки хроматина, покрывающие DSB, можно легко визуализировать с помощью специфических антител на фосфорилированный короткий пептид, соответствующий С-концу у-Н2АХ. Эти фокусы могут служить маркерами DSBs и способствовать изучению их индукции и пропессинга (Karlson, Stenerlow, 2004; Tanaka et al., 2006). В клетках высших эукариот гистон Н2АХ фосфорнлируется протеинкиназой ATM в первые же минуты после образования DSB, и инактивация ATM приводит к нарушению этого фосфорплирования.

Еще одной прямой мишенью ATM является белок Р53, фосфорилируемый ею по серину в 15 положении. Это фосфоршшрование приводит к высвобождению Р53 из комплекса с MDM2 (который ATM также фосфорилирует по серину в положении 395) и его стабилизации и накоплению в ядре. Благодаря стабилизации белка Р53 и его последующей, относительно более медленной, работе как фактора транскрипции, включающего синтез соответствующих белков, например белка Р21, в клетке генерируется длительная остановка в фазе Gl, опосредуемая инактивацией комплекса циклин E/CDK2 (Sanear et al., 2004). Одновременно происходит взаимодействие белка Р53 с белком 53ВР1, его перемещение и формирование фокусов репарации. Другой важнейший фактор транскрипции, играющий ключевую роль в контроле клеточного цикла—белок E2F1, он также фосфорилируегся и стабилизируется ATM-зависимым способом (Lin et al., 2001). В то же время давно показана и многократно подтверждена независимыми исследователями радиорезистентность клеточного цикла в клетках больных AT (Jeggo et al., 1998). Спорным остается вопрос о том, как изменятся параметры клеточного цикла в клетках гетерозиготных носителей AT и будет ли другим характер формирования в них чекпойнтов в ответ на повреждение ДНК.

Повреждения ДНК, безусловно, вовлечены в появление и развитие такой возрастной патологии, как опухолеобразование, а гетерозиготное носительство

мутаций в генах репарации ДНК и глобального клеточного ответа, вероятно, является причиной раннего возникновения опухолей различной локализации. Эти же мутации могут приводить и к более раннему появлению других заболеваний, характерных для пациентов старшего возраста, например, диабета и сердечнососудистой патологии (Sano et al., 2007), то есть ускоренному старению. Это соответствует современным представлениям о природе возникновения болезней старения и их индивидуальной генетической детерминированности (Анисимов, 2003).

Таким образом, сейчас возникла ситуация, когда для прикладной медицины крайне важно иметь возможность быстро и достоверно оценить повышенную радиочувствительность каждого конкретного пациента на клеточном уровне. Такая оценка может быть основой как для показаний к диспансеризации, так и к выработке соответствующих медицинских рекомендаций для диагностики и профилактики патологий, в первую очередь, ранних опухолей, у лиц группы риска. Разработка методов быстрого определения степени радиочувствительности и ускоренного старения на клеточном уровне (вне зависимости от генетического дефекта) крайне необходима для пациентов, которым рекомендован курс радиотерапии и для лиц, связанных с риском радиационного или химического поражения в силу своей профессиональной деятельности

Цель и задачи работы

Целью данной работы являлось исследование преждевременного старения и радиочувствительности на клеточном уровне в семьях больных атаксией-телеангиэктазией (АТ).

Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить репаративный потенциал клеток больных АТ и их кровных родственников методом электрофореза индивидуальных клеток (методом "ДНК-комет").

2. Описать маркеры ускоренного старения в клетках больных АТ и их кровных родственников.

3 Изучить особенности клеточного цикла в ответ на действие рентгеновского облучения ' в клетках больных АТ и их кровных родственников.

4. Сравнить уровень преждевременного старения и

радиочувствительности на клеточном уровне в различных семьях, в которых была диагностирована АТ.

Научная новизна работы

1. Впервые на примере двух семей доказано существование связи между признаками радиочувствительности и признаками ускоренного старения на клеточном уровне при атаксии-телеангиэктазии.

2. Впервые предложен быстрый адекватный метод дискриминации гетерозиготного носигельства в семьях, в которых была диагностирована АТ.

Теоретическая и практическая значимость работы

Показано, что при клеточной радиочувствительности различной этиологии одновременно выявляются маркеры ускоренного старения. На примере двух семей АТ доказана связь радиочувствительности и проявления признаков ускоренного старения на клеточном уровне. На основе полученных результатов выявлены молекулярные механизмы, лежащие в основе радиоиндуцированного старения.

Показана эффективность использования клеточных культур для дискриминации гетерозиготного носительства АТ. Выявление гетерозиготного носительсгва АТ в семьях с выработкой последующих клишиеских рекомендаций будет способствовать улучшению качества жизни пациентов за счет оценки рисков, своевременного и адекватного назначения терапии сопутствующих заболеваний.

Положения, выносимые на защиту

1. Атаксия-телеангиэктазия является не только синдромом повышенной радиочувствительности, но и синдромом преждевременного старения на клеточном уровне.

2. Гетерозиготные носители мутации гена а№ демонстрируют черты преждевременного старения и повышенной радиочувствительности на клеточном уровне.

3. Гетерозиготное носительство мутации в гене аш может быть выявлено как по повышенной радиочувствительности клеток, так и по наличию у носителя маркеров старения на клеточном уровне.

4. Повышенная радиочувствительность на клеточном уровне сопряжена с риском развития опухолевых заболеваний.

Апробация диссертации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. Материалы диссертации были представлены на III Международной конференции молодых ученых (Харьков, 2008), конференции "Фундаментальные науки - медицине" (Москва, 2008, 2007гг), а также на научных семинарах Лаборатории радиационной цитологии Учреждения Российской академии наук Института цитологии РАН.

Финансовая поддержка работы

Рабата выполнена при финансовой поддержке программы Президиума РАН "Биологические науки - медицине" 2006-2009гг.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на /^страницах машинописного текста, содержит гистограмм, таблиц, иллюстрирована рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Список использованной литературы включает ¿£3 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные штаммы и их культивирование

В работе были использованы клеточные культуры диплоидных фибробластов, полученные от больных АТ, гетерозиготных носителей мутации в гене аПп, процедура проведена в Лаборатории радиационной цитологии Института цитологии РАН в ходе стандартного протокола из эксплантата кожи предплечья.

Штаммы диплоидных фибробластов, полученные от членов первой семьи (АТ6) - девушки 16 лег с АТ и ее фенотипически здоровых матери (М) и отца (Г), были обозначены соответственно: АТбБР, АТ(М)6БР и АТ(Р)68Р. Штаммы диплоидных фибробластов, полученные от членов второй семьи (АТ8) - девочки 11 лет с АТ, ее фенотипически здоровых матери (М) и отца (Р) были обозначены соответственно: АТ85Р, АТ(М)88Р и АТ(Р)85Р. Диплоидные фибробласгы, полученные от больной с атаксией, возникшей в результате опухоли мозжечка, были обозначены АТ7БР. В качестве контроля были использованы диплоидные фибробласгы крайней плоти мальчика 11 лет—УН 10

(Nygren et al., 1994; Kolman et al., 1997), любезно предоставленные проф. Адой Кольман (A. Kolman, Стокгольмский университет, Швеция).

Клетки культивировали в питательной среде DMEM (Gibco, США) с добавлением 12 % фетальной сыворотки телят (Hyclone, США) и антибиотиков (100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, Sigma, США). Клетки выращивали в пластиковых флаконах, на чашках Петри (Nunclon, США), а также на предметных стеклах, помещенных в чашку Петри, в С02-инкубаторе при 37"С, 5-7% С02 в атмосфере повышенной влажности.

Для выяснения степени радиочувствительности фибробласты облучали на рентгеновской установке РУМ-17 в дозе 2 Гр.

Иммунофлуоресцентный анализ

Клетки выращивали на поверхности предметных стекол, помещенных в чашки Петри. После достижения клетками субконфлюэнтного состояния их подвергали рентгеновскому облучению и инкубировали в течение различных промежутков времени, в качестве контроля использовали интактные образцы. Отмытые от культуральной среды раствором PBS (Биолот, Россия) клетки фиксировали 10 мин в 3.7 %-ном растворе формальдегида в PBS на льду, затем продолжали фиксацию в течение 24 ч в 70 %-ном этаноле и промывали раствором PBS в течение 30 мин. Для перфорации цитоплазматической мембраны препараты инкубировали 5 мин в 3 %-ном растворе Тритон Х-100 (Хеликон, Россия) на PBS. Для блокирования мест неспецифического связывания препараты инкубировали от 30 мин до 1 сут в 1 %-ном растворе BSA (Sigma, США) на PBS, затем промывали.

В качестве первых антител использовали IgG кролика против: белка НР1-у (Abeam, Англия), фосфорилированного по серину в 139-м положении гистона Н2АХ, (Cell Signaling, США), белка 53ВР1 (Abeam, Англия), моноклоноальные антитела к белку p21 Wafl (Abeam, Англия), в разведении 1:150. В качестве вторых антител использовали козьи антикроличьи IgG, козьи антимышиные IgG, коныогированные с флуоресцеина изотиоцианатом (FITC), в разведении 1:150 (Sigma-Aldrich Co., США). Антитела разводили в PBS с 0.1 %-ным BSA (Sigma, США). После инкубации с антителами стекла промывали по 30 мин в 0.1 %-ном растворе Tween-20 (Хеликон, Россия) в PBS. В качестве контроля специфичности иммунной реакции использовали препараты клеток,

инкубированные только со вторыми антителами. После окрашивания препараты помещали в раствор пропилгаллата в 90 %-ном глицерине для предотвращения «выгорания» флуоресцентной метки. Для анализа воспроизводимости полученных результатов все тесты проводили в 2-3 повторах.

Метод "ДНК- комет"

Метод включал в себя следующие этапы: приготовление гель-слайда, лизис клеток, щелочную инкубацию, электрофорез, нейтрализацию, окраску слайдов, анализ и обработку данных. Все этапы (кроме последнего), проводились в условиях минимального попадашм света, при 4 °С. Для получения гель-слайдов использовали предметные стекла, предварительно покрытые 1 %-ным водным раствором агарозы (Биолот, Россия). Далее 50 мкл клеточной суспензии смешивали с 150 мкл агарозы с низкой точкой плавления (Agarose-prep. Ultra low-gelling and melting point LKB, Швеция) (1 %-ный раствор в PBS), имеющей температуру 37 °С, и быстро наносили на подготовленное предметное стекло примерно по 100 мкл на каждый слайд, сверху накрывали покровным стеклом и оставляли на 5 мин при 4 °С. Затем снимали покровное стекло и приступали к этапу лизиса. Непосредственно перед процедурой лизиса к лизирующему буферу (2.5 мМ NaCl, ЮОмМ Na2EDTA, ЮмМ Tris рНЮ) добавляли детергент Тритон Х-100 (Хеликон, Россия) до конечной концентрации 1 %. Лизис проводился в течение 1 ч при 4 "С. Затем слайды подсушивали и подвергали дальнейшей процедуре щелочной обработки. Для щелочной инкубации и электрофореза использовали один и тот же буфер (1 мМ Na2EDTA, 300 мМ NaOH, pH 13) и, следовательно, первая процедура проводилась сразу в электрофорезном танке для избежания лишних манипуляций со слайдами, которые могли бы привести к потере геля с поверхности предметного стекла. Длительность щелочной инкубации составляла 40 мин при температуре 4 °С. Электрофорез проводили в течение 40 мин (4 °С, напряжение 5 В/см). После извлечения слайдов избыток электрофоретического буфера удаляли фильтровальной бумагой, слайды подсушивали 5-7 мин и нейтрализовали 3-кратной промывкой в 0.4 М Tris pH 7,5 по 5 мин. Для окраски слайдов использовали SYBR® Green 1 (Sigma, США) в 90%-ном глицерине (Биолот, Россия) в разведении 1.5 мкл на 10 мл буфера ТЕ (Tris-EDTA, pH 7.5)(Sigma, США). Затем слайды помещали во влажную камеру и оставляли в холодильнике при 4 "С до момента визуального анализа.

Микроскопия и анализ изображений

После иммунофлуоресцентного окрашивания препараты анализировали с помощью лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа Zeiss LSM 5 PASCAL. Для визуализации флуорофоров были использованы аргоновый (488 нм) и гелиево-неоновый (543 нм) лазеры. Для получения изображений использовали сканирующий модуль микроскопа, управляемый с помощью компьютера и соответствующего программного обеспечения LSM 5 PASCAL. Для анализа полученных изображений (определение уровня интенсивности флуоресценции) использовали программы LSM 5 PASCAL и «WCIF ImageJ 1.37т» (National Institute of Health, Maryland, США).

После электрофореза отдельно взятых клеток визуализацию "комет" проводили на флуоресцентном микроскопе Zeiss LSM 5 PASCAL (источник света-ртутная лампа, 250 ватт) длина волны возбуждающего света задавалась фильтром 516-560 нм, барьерный фильтр 590 нм, увеличение 40 х). Ввиду отсутствия специально адаптированной для метода компьютерной программы оценку "комет" проводили визуально. Для характеристики каждой линии проводили по три эксперимента, в ходе которых оценивали содержание клеток каждого типа: клетки без повреждений ДНК, клетки с некоторыми повреждениями ДНК, клетки со значительными повреждениями ДНК. Далее высчитывали площадь "комет" (S) по формуле S=N0+N1*0.5+N2*1, где N-количество клеток, относящихся к типу а, N2 - количество клеток, относящихся к типу Ь, N2 - количество клеток, относящихся к типу с (рис. 1).

Рис.1. Гель-электрофорез первичных фибробластов человека после у-облучения в дозе 2Гр (увеличение 40х, окраска SYBR Green I).

а- клетки без повреждений ДНК, b - клетки с некоторыми повреждениями ДНК, с - клетки со значительными повреждениями ДНК.

Метод проточной цитометрии

В опыт брали все клетки с чашки Петри, ресуспендировали в PBS, добавляли РНКазу (0.25 мг/мл), PI ( пропидий йодид) - 50 мкг/мл и сапонин -200 мкг/мл или 0.1% Тритон. Анализ производили на цитометре Odam (Brucker, Франши).

Обработка результатов

Обработку результатов проводили с помощью программы MS Excel 2007 общепринятыми для медико-биологических исследований методами: расчет средней арифметической величины, среднего квадратичного отклонения, ошибки репрезентативности для каждого параметра в исследуемых группах клеток, сравнение средних значений по критерию Стъюдента с определением достоверности различий.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Определение гетерохроматинового маркера HPl-y.

Окраска непрямым иммунофлуоресцентным методом с использованием антител к маркеру старения белку HPI-7 выявила существенные различия между интактными клетками всех исследованных штаммов. В табл. 1 приведены значения интенсивности флуоресценции ядер фибробласгов кожи, полученных от членов двух изученных семей. Интенсивность флуоресценции почти в два раза снижена в ядрах клеток больных AT (AT6SP и AT8SP) по сравнению с ядрами клеток здорового донора, а в клетках их кровных родственников -гетерозиготных носителей заболевания - это снижение также достоверно, хотя и менее выражено. Следует отметить тот факт, что фибробласты больной с атаксией, возникшей в результате опухоли мозжечка (клетки AT7SP), обнаруживают более низкую интенсивность флуоресценции по сравнению с клетками гетерозиготных носителей мутации гена aim. Вероятно, данная больная имеет наследственную радиочувствительность на клеточном уровне.

Название штамма клеток Интенсивность флуоресценции, Хер ± Sx

VH10 170.71 ± 1.91

AT8SP 103.72 ±5.27'

AT(F)8SP 142.44 ± 3.22'

AT(M)8SP 149.54 ±1.78'

AT6SP 93.01 ± 3.55'

AT(F)6SP 134.45 ±4.95'

AT(M)6SP 142.52 ±2.64'

AT7SP 124.13 ±2.09'

Табл.1. Интенсивность флуоресценции белка НР1-у в диплоидных фнбробластаж человека 1 Статистически достоверные отличия от контроля при р<0.001, где п-100 клеток.

Количество фосфорилированной формы гистона Н2АХ определяли иммунофлуоресцеитным методом как в интакгных клетках, так и в клетках всех исследованных штаммов после рентгеновского облучения. Интенсивность флуоресценции была измерена так же, как и в случае с белком НР1-у. Показано, что количество фосфорилированной формы гистона у-Н2АХ в ядрах шггактных клеток больных с AT превышает таковое в ядрах клеток здорового донора, а для гетерозиготных носителей мутантного aim характерно промежуточное состояние. Обнаружены различия в клетках в отношении активности репарационных процессов. Через 24 ч после облучения в клетках больных с AT происходит восстановление лишь половины повреждений ДНК (рис.2, а, кривая 4; рис.2, б, кривая 4), в то время как в клетках здорового донора этот процесс практически завершается (рис.2, а, кривая 1; рис.2, б, кривая 1). В клетках гетерозиготных носителей мутантного гена aim репарация проходит быстрее, чем у больных, но динамика этого процесса существенно отличается от таковой в клетках здорового донора (рис.2, а, кривые 2, 3; рис.2, б, кривые 2, 3). Количественные изменения фосфорилированной формы гистона у-Н2АХ в ядрах клеток больных с атаксией после облучения представлены на рис. 4, а.

«80 « 70

5 60

к 5"

а- 40

| 30

« 20 О.

|10-е о

30 мин 2.5 ч

24 ч

Рис. 2. Интенсивность флуоресценции фосфорилированной формы гистона у - Н2ЛХ в ядрах фнбробластов до и после рентгеновского облучения.

а - штаммы, полученные от членов семьи АТ6; б - штаммы, полученные от членов семьи АТ8; / - УНЮ, 2- АТ6(Р)5Р, АТ8(Р)5Р, 3 - АТ6(М)ЗР, АТ8(М)5Р, 4 - АТбБР, АТ83Р.

Определение количества белка 53ВР1.

Еще одним традиционным маркером репарационных процессов является белок 53ВР1 (ЬуаЬисЫ е: а!., 2008; Ьес е! а1., 2008). Обычно при окрашивании антителами к белку 53ВР1 в интактных клетках наблюдается его диффузное расположение, а при повреждении ДНК белок концентрируется в зоне репарации, образуя фокусы.Фокусы белка 53ВР1 в ответ на повреждение ДНК обычно совпадают с фокусами фосфорилированного гистона у-Н2АХ, так как они часто колокализуются в зоне двунитевого разрыва ДНК. В интактных клетках, полученных от больных с АТ (штаммы АТбБР и АТ8ЯР), фокусы белка 53ВР1 наблюдаются в 16 % и 18 % клеток соответственно, в то время как в

контрольной линии VH10 таких клеток всего 6 %. На рис. 3, а и б приведены графики, описывающие динамику формирования и элиминации фокусов белка 53ВР1 в штаммах фибробластов, полученных от членов обеих семей, а на рис. 4, б - от больных с атаксией.

Известно, что белок 53ВР1 связывается с фосфорилированным белком р53, накапливаясь в местах повреждения ДНК. Так как фосфорилирование белка р53 в ответ на повреждение ДНК в клетке осуществляет протеинкиназа ATM, то повышение количества фокусов белка 53ВР1 в клетках, полученных от больных с AT задерживается по сравнению с клетками здорового донора (рис.3, а, кривая 4; рис.3, б, кривая 4). Через 2.5 ч после облучения (в то время как в клетках здорового донора уже начинается процесс элиминации фокусов белка 53ВР1) их количество несколько возрастает, но не достигает уровня репарационного ответа, как в клетках здорового донора, и сохраняется на стабильно высоком уровне через 24 ч после облучения. В это время в клетках здорового донора подавляющее число фокусов уже элиминируется (рис.3, а, кривая 1; б, кривая 1). В клетках гетерозиготных носителей мутантного гена данного заболевания уровень репарационного ответа почти совпадает с контрольным уровнем здорового донора, но количеств о фокусов, сохраняющихся через 24 ч, существенно выше, чем в контроле (рис.3, а, кривые 2 и 5; рис.3, б, кривые 2 и 3). Неспособность полностью элиминировать фокусы белка 53ВР1 свидетельствует о персистировании в этих клетках повреждений ДНК и сопряженных с ними изменений конформации хроматина. Изменения количества белка в штамме клеток AT7SP, полученных от больной с атаксией, возникшей в результате опухоли мозжечка, носят промежуточный характер, сходный с таковым в штаммах, полученных от гетерозиготных носителей мутантного гена aim (рис.4, б, кривая 2).

55 80 Н

g 60 01

I*

Ч 20 Н

I

ct

100 80 60 40

20 -

ИНТ

30 мин

2.5 ч

24 ч

Ряс. 3. Формирование фокусов 53ВР1 в ядрах фибробластов до и после рентгеновского облучении.

а - штаммы фибробластов, полученные от членов семьи АТб; б - штаммы фибробластов, полученные от членов семьи АТ8; / - VHI0 . 2 - AT6(F)SP, ATS(FjSP, 3 -AT6(M)SP, AT3(M)SP, 4 - AT6SP, AT8SP.

а

П- on _

6

SS 100 -I i 80S 60 -5 40 -I 20 -

инт

30 мин

2.5 ч

24 ч

Рис. 4. Интенсивность флуоресценции фосфорилированной формы гистона у - II2AX (а) и формирование фокусов 53ВР1 (б) в ядрах фибробластов больных с атаксией до и после рентгеновского облучения.

1 - штамм VH10,2 - штамм AT7SP, 3 - штамм AT6SP, 4 - штамм AT8SP.

Определение р;^*"^1 . ингибитора циклинзависимых кииаз иммупофлуоресценгным методом в штаммах фибробластов, полученных от членов семьи АТ8 после рентгеновского облучения, показало, что данный белок появляется в клетках больных AT в ответ на повреждение ДНК с существенной задержкой. В клетках гетерозиготных носителей мутантного гена atm образование белка p21Wan,Cl?l также запаздывает в отличие от контроля (Рис.5), но крайне незначительно.

100

50 ■

о

24 ч

|-a-AT8SP —♦—AT(F)8SP —*-AT(M)8SP -♦—VH10 |

Рис. 5. Интенсивность флуоресценции p21 1 ip в вдрах фибробластов до и после рентгеновского облучения

W»n/Cipl

Рис. 6. Имсмунофлуоресцентное окрашивание клеток НР1-у, где а - УН10, Ь - АТ88Р, АТ8(Р)8Р, (I - АТ78Р (увеличение 40*).

Рис. 7. Нммунофлуоресцентиое окрашивание клеток у-Н2АХ, где а с-АТ8(Р)5Р (увеличение 40 ").

- УНЮ, А-АТвБР,

Оценка репаративной способности клеток методом "ДНК - комет" Площади "комет" были определены как в клетках без повреждающего воздействия, так и в различное время после рентгеновского облучения в дозе 2 Гр. Суммарная площадь "комет" соответствует степени повреждения ДНК исследуемых клеток. Анализ результатов выявил существенные различия между клетками всех исследованных штаммов. Средние суммарные площади "комет" по результатам трех независимых опытов приведены в табл.2. Было показано, что интактные клетки штаммов, полученных от больных АТ (клетки АТбБР и АТ85Р) содержат достоверно большее количество повреждений ДНК. Особенно существенно это выражено в клетках АТвБР. Через 30 мин после рентгеновского облучения суммарная площадь "комет" резко возрастала во всех изученных штаммах, что соответствовало появлению в ДНК клеток большого количества разрывов. При этом количество разрывов в клетках больных АТ незначительно (в среднем на 10%), но достоверно превышало таковое как в клетках здорового донора, так и в штаммах, полученных от гетерозиготных носителей заболевания. Способность клеток к воссоединению разрывов ДНК после облучения определялась суммарными площадями "комет" через 2.5 часа после облучения. За этот период времени в клетках больных АТ происходила репарация лишь трети повреждений ДНК, в то время как в клетках здорового донора этот процесс практически завершался. В то же время в клетках гетерозиготных носителей заболевания воссоединение разрывов ДНК проходило быстрее, чем у больных АТ, но не достигал уровня репарации ДНК в клетках здорового донора. Следует отметить, что фибробласты, полученные от больной с клинической формой атаксии, возникшей в результате опухоли мозжечка (клетки АТ78Р), демонстрируют также сниженный репаративный потенциал по сравнению с клетками здорового донора и по этому показателю сходны с клетками гетерозиготных носителей АТ.

Название штамма клеток Площадь комет ( Б )

без облучения. 30 мин после облучения. 2.5 ч после облучения,

УН10 3.00±0.86 83.00i3.90 13.83±5.83

АТ68Р 9.50±5.00' 94.50±1.80' 72.16±2.56'

АТ(Р)63Р 9.50±2.18' 81.16±6.71 22.66i2.56'

АТ(М)6БР 8.66±4.31' 78.16±6.80 20.00i0.86

АТ85Р i8.83i2.93' 93.33i0.l7' 74.16± 1.611

АТ(М)85Р 6.66±0.76 83.50±1.00 38.16±1.6Г

АТ(Р)83Р 4.50±0.86 85.83±2.84 28.S3i2.02'

АТ75Р 9.66±1.23' 85.50±2.92 32.66i3.131

Табл, 2. Средние значения площадей комет ($) до и после рентгеновского облучения в дозе 2Гр.

1 Статистически достоверные отличия от контроля при р<0.05.

На тех же препаратах были подсчитаны апоптозные клетки, которые отличаются от обычных "комет" тем, что у них практически отсутствует «ядро кометы», а вся ДНК сосредоточена в "хвосте". Эти клетки мы не учитывали при подсчете суммарных площадей "комет", так как считали их нежизнеспособными. На рис. 8 представлена динамика доли таких клеток в различных исследованных штаммах в интактном состоянии и после рентгеновского облучения. В клетках штаммов больных АТ уровень спонтанного апоптоза существенно выше, чем в клетках здорового донора, и несколько выше, чем в клетках гетерозиготных носителей заболевания. Количество апоптозных клеток после облучения также существеннее возрастает в клетках больных АТ, чем в клетках здорового донора, клетках гетерозиготных носителей заболевания мы наблюдаем промежуточный результат.

Рнс. 8. Анализ изменения доли клеток в апоптозе до и после рентгеновского облучения в

дозе 2 Гр.

/ - АТ8$Р, 2 - УН 10, 3 - АТ8{Р)5Р, 4 - АТ8(М)БР.

Анализ клеточного никла методом проточной цитометрии.

В табл.3 и на рис. 9 мы приводим результаты, полученные при

исследовании параметров клеточного цикла как при обычном росте клеточных культур, так и после рентгеновского облучения в дозе 5 Гр для штаммов фибробласгов больной АТ85Р и членов ее семьи, а также больной АТ75Р, страдающей атаксией, возникшей в результате опухоли мозжечка. Показано, что клетки здорового донора УН 10 имеют ненарушенную систему блокирования клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК, что приводит к накоплению этих клеток в фазе в 1 и 02 в течение 3 сут после рентгеновского облучения. Клетки больной АТ (АТ85Р), напротив, демонстрируют полную радиорезистентность и не изменяют параметров клеточного цикла в течение всего эксперимента. Клетки гетерозиготных носителей мутантного гена аш демонстрируют менее выраженную и длительную остановку клеточного цикла, нежели клетки здорового донора. Сходная картина наблюдается и в клетках больной АТ75Р. При сравнении динамики роста клеток исследованных пггаммов видно, что клетки здорового допора гораздо сильнее зависят от ростовых факторов среды и быстрее снижают уровень синтеза ДНК, чем клетки

больных АТ и гетерозиготных носителей заболевания.

Название Фаза Чис Исход Без 24 ч 2 сут 48 ч 3 сут 72 ч 4 сут

штамма клеток клеточи ло ная облуче после роста, после роста. после роста,%

ого кле культу няя, 1 облуче % облучен % облуче

цикла ток ра, % сут ния, % ия.% ния, %

роста%

УН10 во 95.66 47.11 73.56 82.83 81.24 90.72 82.31 90.99

Б 100 0.00 17.69 9.42 9.86 2.44 3.24 2.43 2.71

С2-М 4.34 35.20 17.02 7.31 16.32 6.04 15.26 6.30

АТ8БР йО 54.88 39.15 44.38 55.72 48.33 52.48 44.96 52.22

Б 100 14.36 26.01 27.74 12.82 21.97 15.02 24.03 30.00

С2-М 30.76 34.84 27.88 31.46 29.70 32.50 31.01 17.78

АТ(М)8БР СО 80.70 74.20 71.70 75.20 68.76 77.70 66.73 82.70

Б 100 4.70 7.40 4.80 15.40 4.60 8.80 7.58 4.84

С2-М 14.60 18.40 23.50 9.40 26.64 13.50 25.69 12.46

АТ(Р)88Р СО 80.50 65.80 69.57 80.10 64.48 74.20 68.82 64.60

100 5.10 16.70 6.50 12.65 11.74 14.50 10.75 8.21

14.40 17.50 23.93 7.25 23.78 11.30 20.43 27.19

АТ73Р во 85.70 75.70 70.40 70.40 68.35 64.50 68.90 71.30

Б 100 4.93 20.04 2.94 14.70 11.70 17.00 15.30 11.00

02-М 9.37 4.26 26.66 14.90 19.95 18.50 15.80 17.70

Табл. 3. Распределение клеток по фазам клеточного цикла в течение 4 сут до н после рентгеновского облучения в дозе 5 Гр.

Исх.культура 2 сут роста 3 сут роста 2 сут/обл 3 сут/обл

14.36

12.82

21.97

24.03

5.10

12.65

14.50

11.74

10.75

2с 4с

2с 4с

2с 4с

2с 4с

2.43

2с 4с

Рис. 9. Зависимость распределения клеток штаммов АТ85Р (а), АТ(Г)85Р (4), УН10 (с) по фазам клеточного цикла до и после рентгеновского облучении в дозе 5 Гр.

По горизонтали - содержание ДНК, ел плоидиоста (с); по вертикали- число клеток. На каждой гистограмме указана доля клеток (%), находящихся в фазе Б.

ОБСУЖДЕНИЕ

Уменьшение количества гамма-изоформы белка гетерохроматина НР1 является одним из надежных маркеров старения, пригодным для выявления возрастных изменений как в фибробластах, полученных от пожилых доноров, так и в клетках больных прогерией (Scaffidi, Misteli, 2006; Смирнова и др., 2008а, 20086). По этому маркеру атаксия-телеангиэктазия является, безусловно, болезнью преждевременного старения, а гетерозиготное носительство гена данного заболевания ведет к появлению признаков преждевременного старения на клеточном уровне.

Фосфорилированная форма гистона Н2АХ (у-Н2АХ) традиционно используется в качестве маркера двунитевых разрывов ДНК. Также было отмечено накопление фосфорилированной формы гистона у-Н2АХ в ядрах стареющих клеток в культуре, клетках пожилых доноров или больных прогериями (Sedelnikova et al., 2004; Scaffidi, Misteli, 2006). Это явление может быть связано как с накоплением нерепарированных DSBs или модификаций хроматина, воспринимаемых как DSBs стресс-киназами ATM и ДНК-зависимой протеинкиназой (DNA-PK) при повреждении ДНК (Stiff et al., 2004), или протеинкиназой ATR при остановке репликации (Takahashi, Ohnishi, 2005), так и с появлением незащищенных коротких теломер (Нао et al., 2004). Таким образом, накопление фосфорилированной формы гистона у-Н2АХ в культуре клеток, в ядрах которых они появляются без действия повреждающих агентов, может быть одним из объективных критериев старения на клеточном уровне (Ayoub et al., 2008: Scaffidi, Misteli, 2006).

Сопоставляя все полученные нами данные с данными литературы, можно сделать вывод, что в соответствии с динамикой выявления фосфорилированной формы гистона у-ШАХ как в интактных клетках, так и после повреждения ДНК все штаммы больных с AT демонстрируют признаки ускоренного старения и снижения активности репарационных процессов. В клетках гетерозиготных носителей мутаятного гена atm выявляется промежуточный между нормой и патологией фенотип.

Белок 53ВР1 является традиционным маркером репарационных процессов (Wilson, Stern, 2008). Его динамика в ответ на повреждение ДНК обычно совпадает с динамикой у-Н2АХ, так как они часто колокализуются в

зоне конформашюнных изменений хроматина (двунитевых разрывов ДНК). Белок 53ВР1 после ионизирующего облучения фосфорилируется по серину-1219 (Lee et al., 2008). Этот белок играет также важную роль в остановке клеточного цикла в контрольной точке в ответ на повреждающие воздействия (Iwabuclii et al., 2008; Eliezer et al., 2009). При сравнении рис. 3, a и б видно, что в разных семьях мы, вероятно, имеем дело с различными мутациями в гене aim. В фибробласгах больной AT6SP через 24 ч после облучения сохраняется достоверно большее количество фокусов 53ВР1, хотя через 2.5 ч его количество почти не отличалось от такового в контроле (рис.3, а, кривая 4). В штамме AT8SP основные различия, напротив, отмечаются через 2.5 ч после облучения, а к 24 ч различия практически нивелируются (рис.3, б, кривая 4). Эти данные говорят о нарушении процессов репарации двунитевых разрывов ДНК, но в случае штамма AT6SP скорее всего эти нарушения затрагивают репарацию с участием гомологической рекомбинации, в случае штамма AT8SP -негомологичное воссоединение концов ДНК.

Анализ параметров клеточного цикла методом проточной цигометрип позволяет выявить способность клеток к формированию блоков Gi/S и G2/M после облучения (Iwabuchi et al., 2008). Данные литературы показывают, что клетки больных AT демонстрируют радиорезистентность клеточного цикла (Houldsworth, Lavin, 1980; Beamish, Lavin, 1994; Beamish et al., 1996; Hannan et al., 2002) и описан сигнальный путь, необходимый для ее проявления (Bai, Murnane, 2003). Полученные нами результаты об отсутствии блоков клеточного цикла после рентгеновского облучения подтверждают диагноз атаксии-телангиэктазии у больных AT6SP и AT8SP и показывают влияние гетерозиготного носительства заболевания на способность формировать блоки клеточного цикла в ответ на облучение.

Исследование белка p21WaaiC,pl в клеточных линиях AT и гетерозиготных носителей мутации в гене aim является еще одним важным этапом в понимании механизма радиочувствительности клеток и решении вопроса о том, является ли данный белок маркером преждевременного старения. Идентифицировано более сотни генов, являющихся мишенями транскрипционной активности р53. Среди них гены, продукты которых регулируют клеточный цикл. Важнейшим из них является белок р21 WrfE/C!P' . ингибитор циклин-зависимых киназ из семейства Cip/Kip (Shi et al., 2008). Повышение его экспрессии вызывает остановку

клеточного цикла в поздней 01 фазе, что обусловливается связыванием им комплексов циклин E/Cdk2, подавлением их способности фосфорилировать белки семейства pRb и высвобождать транскрипционные факторы E2F (Копнин, 2000; Radhakrishnan et al., 2006, Hill et al., 2008). В клетках больных AT многие процессы, наблюдаемые в клетках здорового донора после рентгеновского облучения, либо происходят с существенной временной задержкой, например, стабилизация белка р53, либо вовсе полностью подавлены, например, остановка клеточного цикла (Спивак и др., 2005). Таким образом, уменьшенное количество Р21 в клетках больных AT соответствует снижению количества фосфорилированного Р53 в этих клетках, с этим же связана и радиорезистентность клеточного цикла при AT. Тот факт, что у гетерозиготных носителей данного заболевания достоверные отличия не выявляются в отличие от клеток здорового донора, это не позволяет выявлять гетерозиготное носительство мутантного гена aim с помощью белка Р21, но дает возможность анализировать процессы повышенной радиочувствительности и преждевременного старения на клеточном уровне. Вероятно, одного здорового аллеля гена достаточно для появления детектируемого количества белка Р21, но недостаточно для нормальной регуляции клеточного цикла. Вероятно, такое нарушение регуляции клеточного цикла связано в первую очередь не с Р21, а с какими-то другими АТМ-зависимыми факторами, например, с E2F.

Анализ количества повреждений ДНК, в первую очередь - двунитевых разрывов (DSBs), после действия генотоксических агентов является одним из наиболее распространенных подходов для изучения способности клеток к репарации. Методом "ДНК-комет" было показано, что количество образующихся разрывов ДНК зависит от дозы и природы повреждающего агента, а способность различных типов клеток воссоединять разрывы - от активности их систем репарации и от времени (Kolman et al., 1997; Chovanec et al., 1998).

Под действием ионизирующей радиации двунитевые разрывы ДНК (DSBs) в диплоидных фйбробяастах, полученных от здорового донора, формируются в первые минуты после повреждения и репарируются на 90 % менее чем за 4 ч (Mirzayans et al., 2006), что соответствует данным, полученным нами для штамма нормальных фибробластов человека VH10. Клетки больных AT демонстрируют существенную задержку репарации, через 2.5 ч после

облучения соединяются лишь 20-30 % разрывов. Это подтверждают данные о снижении активности процессов репарации в клетках больных AT, полученные ранее в нашей лаборатории с использованием других методов (Хамасуридзе и др., 1999, Спивак и др., 2005, Смирнова и др., 2008). Динамика воссоединения разрывов после рентгеновского облучения, описанная нами с использованием метода "ДНК - комет", соответствует той, что мы наблюдали, применяя метод непрямой иммунофлуоресценции для определения количества фокусов белка у-Н2АХ и белка 53ВР1 (Полуботко и др., 2009). Восстановление поврежденной ДНК, о котором мы можем судить по элиминации фокусов белка у-Н2АХ и белка 53ВР1 в ядрах клеток, у больных AT за 24 ч происходит лишь наполовину, в то время как в клетках здорового донора репарация ДНК к этому времени практически завершается. В клетках гетерозиготных носителей мутантного гена atm процессы репарации ДНК были достоверно замедлены, но не так резко, как у больных AT.

В литературе было описано, что количество спонтанных повреждений ДНК в клетках увеличивается с возрастом (Sirota, Kuznetsova, 2008). Также известно, что при обработке повреждающими агентами фибробласты более старых животных чаще уходят в апоптоз (Анисимов и др., 2003). Наши данные показывают, что уровень спонтанных нарушений ДНК и апоптоза в шггакгаых клетках AT превышает уровень таковых в контроле в 3 раза (клетки AT6SP) и в 6 раз (клетки AT8SP). В то же время шггактные клетки гетерозиготных носителей мутантного гена также демонстрируют повышенный, но менее выраженный, чем у больных AT, уровень спонтанных повреждений ДНК. Ранее при исследовании клеток, полученных от больных AT и их кровных родственников - гетерозиготных носителей заболевания - нами было показано, что клеточные маркеры старения выявляются с более высокой частотой как в клетках самих больных AT, так и в клетках гетерозиготных носителей заболевания (Полуботко и др., 2009). Сопоставляя полученные нами данные с данными литературы, можно отметить, что штаммы больных AT демонстрируют признаки ускоренного старения и снижения активности репарационных процессов на клеточном уровне, а в клетках гетерозиготных носителей данного заболевания выявляется промежуточный фенотип. Все это в совокупности подтверждает наше представление об атаксии-телеангиэктазии

как о синдроме преждевременного старения, а не только повышенной радиочувствительности.

Крайне интересным представляется анализ клеток больной AT7SP, у которой атаксия является результатом опухоли мозжечка. В то же время у этой больной по сравнению с клетками здорового донора понижена способность к репарации разрывов ДНК и выявляется повышешюе количество маркеров старения, так же как у гетерозиготных носителей AT. Способность к формированию блоков клеточного цикла в ответ на рентгеновское облучение у больной AT7SP также снижена. При анализе этого клинического случая нужно учитывать, что уровень радиочувствительности клеток больных AT столь широк, что позволил выделить особую группу больных, диагностированных как АТ-вариант (Gilad et al., 1998). У таких пациентов наблюдались явные признаки заболевания, но чувствительность клеток к ионизирующей радиации по ряду признаков была выражена слабее, чем при классической форме AT (Taylor et al., 1987). Ранее в нашей лаборатории были описаны клетки, отнесенные нами к АТ-варианту (клетки AT1SP, AT2SP) (Спивак и др., 2005). К сожалению, подробный анализ этих клеток методом проточной цитометрии и "ДНК-комет" не проводился, как и анализ этих штаммов на наличие маркеров старения. Совместный анализ всех этих данных позволяет предположить, что штамм AT7SP может являться как гетерозиготным носителем AT или больной АТ-вариант, так и гетерозиготным носителем дефекта какого-либо другого гена, вовлеченного в репарацию двунигевых разрывов ДНК (напрмер, ATR или liglV). В любом случае, у этой больной есть повышенная предрасположенность к развитию опухолей и преждевременному старению, что необходимо учитывать при терапии. ВЫВОДЫ

1. Атаксия-телеангиэктазия является прогероидпым синдромом, а гетерозиготы имеют черты преждевременного старения на клеточном уровне.

2. Способность к репарации двунитевых разрывов, определяемая методом "ДНК-комет" и выявлением фокусов у-ЮАХ и 53ВР1, достоверно снижена в клетках больных AT и гетерозиготных носителей заболевания.

3. Клетки больных AT не способны формировать остановку клеточного цикла после облучения. У гетерозиготных носителей формирование блоков клеточного цикла после облучения нарушено.

4. Р21 не может служить маркером для определения гетерозиготного носительства А Т.

5. Клетки больной AT7SP обладают повышенной радиочувствительностью неясной этиологии, что может являться причиной развития у нее опухоли в раннем возрасте.

Публикации по теме диссертации

Полуботко Е.А., Смирнова Н.В. , Плескан Н.М., Михельсон В.М., Спивак И.М. 2009. Особешюсти преждевременного старения при атаксии-телеангиэктазии. Цитология. 51 (8): 712-718.

Полуботко Е.А., Шатрова А.Н., Плескач Н.М., Михельсон В.М., Спивак И.М. 2009. Клеточный рспаративный потенциал в семьях больных атаксией-телеангиэкгазией. Цитология. (12): 1036 - 1041.

Полуботко Е.А. 2008. Определение наследствешюй радиочувствительности при атаксии-телеангиэктазии и немедуллярном раке щитовидной железы. Тезисы конференции "Биология: от молекулы до биосферы". Харьков: 125. Полуботко Е.А., Шатрова А.Н., Зимарина Т. В., Спивак И.М., Михельсон В.Н. 2008. Определение наследственной радиочувствительности в семьях больных с синдромом атаксия-тслеангиэктазия и в семьях больных немедуллярным раком щитовидной железы. Тезисы конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". Москва: 115.

Михельсон В.М., Полуботко Е.А., Шатрова А.Н., Смирнова Н.В., Плескач Н.М., Спивак И.М. 2007. Наследственная радиочувствительность и преждевременное старение в семьях больных атаксиеи-телеангиэктазией и немедуллярным раком щитовидной железы. Тезисы конференции "Фундаментальные науки-медицине", Москва: 186.

Михельсон В.М., Спивак И.М., Зимарина Т.В., Полуботко Е.А., Томилин Н.В. 2007. Выявление повышенной наследствешюй радиочувствительности с помощью оценки репаративного потенциала на клеточном уровне. Тезисы докладов конференции "Фундаментальные науки-медищше". Москва: 158.

Список цитируемой литературы

Анисимов В.Н. 2003. СПб.: Наука. Кольман А. 1997. . Цитология. 39 (6): 420434. Копнин Б.П. 2000. Биохимия. 65 (1): 5-33. Михельсон В. М. 1996. Клиническая геронтология. (4): 29-35. Наседкина Т.В., Кузминова А.Е., Сурков

СЛ., Плескач Н.М., Прокофьева В.В., Спивак И.М., Михельсон В.М., Полетаев

A.И. 1997. Цитология. 39: 809-821. Полуботко Е.А., Смирнова Н.В. , Плескач Н.М., Михельсон В.М., Спивак ИМ. 2009. Цитология. 51 (8): 712-718. Смирнова Н.В., Спивак И.М., Плескач Н.М., Жеребцов С.В., Аксенов Н.Л., Михельсон В.М. 2008а. Цитология. 50 (10); 868 - 877. Смирнова Н.В., Спивак И.М., Плескач Н.М., Михельсон В.М. 20086. Цитология. 50 (9): 780-788. Спивак И. М„ Плескач Н. М., Боотсма Д., Кольман А. 1997. Цитология 39(6): 420-434.Спивак И.М. 1999. Цитология. 41 (5): 338-380. Спивак ИМ., Смирнова Н.В., Плескач U.M., Ледащева Т.А., Михельсон В.М. 2005. Цитология. 47 (10): 898-906. Спивак ИМ., Плескач Н.М., Смирнова Н.В., Шатрова А.Н., Михельсон В.М. 2007. Технологии живых систем. 4(5-6):39-54Хомасуридзе М. М., Спивак И. М., Плескач Н. М„ Михельсон В. М. 1999. Цитология.41 (5): 412-419.

Abraham R. Т. 2001. Genes Dev. 15: 2\11~2ШЯуоиЪ N., Jeyasekharan A.D., Bernal J.A., Venkitaraman A.R. 2008. Nature. 453: 682-686.Яш Y„ Mwnane J.P. 2003. Mol Cancer Res. 1(14):1058-69.5агат/ёИ L. S„ Nergadze S. G„ Pleskach N. M„ Prokoßeva V. V., Mikhelson V. M. 1998. Mutat. Res. 408(3):219-226. Beamish H„ Lavin M.F. 1994. Int J Radiat Biol 65:175-184.Beamish H„ Williams R., Chen P., Lavin M. 1996. J Biol Chem 271:20486-20493.Belyayev I. Y„ Spivak I. M„ Kolman A., Harms-Ringdahl M. 1996. Mutat. Res. 358 : 223-230. Chovanec M„ NaslundM., Spivakl., DusinskaM., Cedervall B. and A. Kolman. 1998. Environment. Mol. Mut. 32 (3):223-228. Chrisimann M„ Tomicic M.T., Roos W.P., Ката В. 200S. Toxicology. 193: 3-34.Eliezer Y., Argaman L., Rhie A., Doherty A.J., Goldberg M. 2009. J. Biol. Chem. 284: 426-435.Fei P. and El-Deiry W.S. 2003. Oncogene. 22(37): 5774-5783.GitadS., ChessaL., KhosraviR., Russell P., Galanty Y., Piane M„ Gatti RA., Jorgensen T.J., Shiloh Y„ Bar-Shira A. 1998. Am J Hum Genet. 62(3):551-61.Goodarzi A.A., Noon A.T., Deckbar D„ Ziv Y„ Shiloh Y„ Löbrich M„ Jeggo P.A. 2008. Mol. Cell. 31: 167-177.Hanawalt P.S. 2001. Nature. 485: 3-13.Hannan MA, Hellani A, Al-Khodairy FM, Kunhi M, Siddiqui Y, Al-Yussef N, Pangue-Cruz N, Siewertsen M, Al-Ahdal MN, Aboussekhra A. 2002. Carcinogenesis. 23(10):1617-24. Hao L.Y., Strong M.A., Greider C.W. 2004. J. Biol. Chem. 279: 45148-45154.Я/7/Л, Bodzak E, Blough M.D., Lee P.W. 2008. Cell Cycle. 7: 25352543. Hoeijmakers J.H. 2001. Nature. 411: 366-374.Houldsworth J„ Lavin M.F. 1980. Nucleic Acids Res Huang L„ Shyder A.R., Morgan W.F. 2003

Oncogene. 22 (37): 5848-5854i//ate, G„ Wang, Y„ Guan, J„ Wang, H. 2003. Oncogene 22:5834-5847Jwabuchi K., Matsui Т., Hashimoto M., Matsumoto Y., Kurihara Т., Date Т. 2008. Biochem. Biophys. Res. Commun. 376: 509-513 Jeggo P. A., CarrA. M„ Lehmann А. Я 1998. Trends Genet. 14: 312-316.A'anWi K.H., Stenerlow B. 2004. Radiat. Res. 161: 517-527.A'/rn S.T., Xu В., Kastan M.B. 2002. Genes Dev. 16(5):560-70. KolmanA„ Spivakl., NaslundM., DusinskaM., Cedervall

B. 1997. Enviroment. Mol. Mutagen. 30: 40-46.ЛГио L.J., Yang L.X. 2008. In Vivo. 22: 305-9. Lansdorp PM. 2000. Mech Ageing Dev. 118(l-2):23-34. Lavin M.F. 2008. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9: 759-69.Lee H„ Kwak IL, Cho LT., Park S.H., Lee C.H. 2008. Biochem Biophys Res Commun. 378: 32-6. Lin W.C., Lin FT., Nevins J.R. 2001. Genes Dev. 15(14): 1833-44. Mikhelson V. M. 2001. Mechanisms of Ageing and Development. 122 (13): 1361-1365.Mir2a)>ans R„ Severin D„ Murray D. 2006. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 66(5):\491-Ш.Макауата H. 2002. Oncogene. 21(58):9008-21. Nygren J., Cedervall В., Ericksson M., Dusinska M„ Kolman A. 1994. Envir. Mol. Mutagen. 24: ШАЫ.Platzer M„ Rotman G„ Bauer D„ Uziel Т., Savitsky K„ Bar-Shira A., Gilad S„ Shiloh Y„ Rosenthal A. 1997. Genome Res.

7(6):592-605.Pulverer B. 2003. Nature Cell Biol. 5:96.Radhakrishnan S.K., Cierut J., Gartel A.L. 2006. Oncogene. 25: m2-m5.SancarA„ Lindsey-boltzL.A., Unsal-Kagmaz K., Linn S. 2004. Annu.Rev.Biochem. 73: 39-3,5.Sandoval N„ Platzer M, Rosenthal A., Doerk T., Bendix R., Skawran B., Stuhrmann A/., Wegner R.-D., Sperling K., Banin S., Shiloh Y., Batuner A., Bernthaler U., Sennefelder H., Brohm M„ Weber B„ Schindler D. 1999. Hum. Mol. Genetics. 8 (1): 69-79.Sano M, Minamino T., Toko H„ Miyauchi H„ Orimo M., Qin Y., Akazawa H„ Tateno K., Kayama K, Harada M, Shimizu /, Asahara T., Hamada H., Tomita S., Molkentin J.D., Zou Y„ Komuro /. 2007. Nature. 446(7134):444-8.S,ca#Wi P., Misteli T. 2006. Science. 312: 1059 - 1063.Sedelnikova O.A., Horikawa /., Zimonjic D.B., Popescu N.C., Boner W.U., Barrett J.C. 2004. Nat. Cell Biol. 6: 168-170.Shi Q„ Wang X., Ren J. 2008. Biophys. Chem. 138: №-43.Shiloh Y. 2003. Nature Rev. 3: 155-168.S7rota N.P., Kuznetsova E.A. 2008. Bull Exp Biol Med. 145(2): 194-1.Stiff T., O'Driscall M„ RiefN., Iwabuchi K„ Lobrich M„ Jeggo P.A. 2004. Cancer Res. 64: 2390-2396.Takahashi A., Ohnishi T. 2005. Cancer Lett. 229: \l\-\19.Tanaka T„ Halicka H.D., Huang X., Traganos F., DarzynkiemchZ. 2006. Cell cycle. 5: 1940-WS.Taylor A.M., Flude E„ Laher Ä, Stacey M„ McKay E„ Watt J., Green S.H., Harding A.E. 1987. J Med Genet. 24(ll):669-77.77fcjiter J., Zdzienicka M.Z. 2005. DNA Repair. 4 (2): 303-314.LWe/ T.. Savitsky K„ Platzer M„ Ziv Y„ Helbitz T., Nehls M„ Boehm T., Rosenthal A., Shiloh Y„ Rotman G. 1996. Genomics. 2: 317-320. Ward J.M., Chen J. 2001. J.BioLChem. 276 : 42462-42467.Westphal C., Rowan S., Schmaltz C„ Elson A., Fisher D„ Leder P. 1997. Nat. Genet. 16 : 397-40I.Wilson K.A., Stern D.F. 2008. Cell Cycle. 7: 3584-3594. Zhou B.-B.S., Barte/c, J. 2004. Nature Reviews. 4: 216-225.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии «Питер-Полиграф» Заказ №107. подписано в печать 14.09.2009 г. Бумага офсетная 80г/ма, 30x42 У* объем 4.0 леч. л. Тираж 100 эта. Телефакс: 740-79-06

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Полуботко, Евгения Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 .Роль апоптоза.

1.2.Молекулярно-геиетические механизмы возникновения рака.

1.3.Механизмы активации чекпойнтов и белков, вовлеченных в разные стадии процесса репарации.

1.4.Атаксия-телеангиэктазия. Белок ATM.

1.5.Маркер двунитевых разрывов. Фосфорилированный гистон

Н2АХ.

1.6.Эпигенетические маркеры старения в клетках.

1.7.Роль белка Р53 и его субстратов в репарации клеток.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1.Клеточные линии и их культивирование.

2.2.Иммунофлуоресцентный анализ.

2.3.Метод "ДНК- комет".

2.4.Микроскопия и анализ изображений.

2.5.Метод проточной цитометрии.

2.6.Статистическая обработка результатов исследования.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3 Л .Определение гетерохроматинового маркера НР1-у.

3.2.Выявление эпигенетического маркера МеЗ-НЗ-К27.

3.3.Выявление эпигенетического маркера МеЗ-НЗ-К9.

3.4.Выявление фосфорилированой формы гистона Н2АХ.

3.5.Определение количества белка 53ВР1.

З.б.Оценка репаративной способности клеток методом "ДНК-комет".

3.7 .Определение p2iWafl/ciP ингибитора циклинзависимых проточной киназ.

3.8. Анализ клеточного цикла методом цитометрии.

ГЛАВА 4.ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Преждевременное старение и радиочувствительность клеток у больных атаксией-телеангиэктазией"

Актуальность проблемы. Функциональный анализ генов, вовлеченных в процессы репарации ДНК, является основой для понимания природы генетической нестабильности и повышенной радиочувствительности клеток у человека, приводящих к опухолевой трансформации, раку и старению (Sancar et al., 2004; Thaker, Zdzienicka, 2005). Яркий прогресс в этой области в течение последнего десятилетия, за время которого было клонировано и секвенировано большинство репарационных генов и подробно охарактеризованы кодируемые ими белки (Hoeijmakers, 2001; Hanawalt, 2001; Iliakis et al., 2003), значительно расширил наши представления о механизмах, позволяющих всем живым организмам сохранять собственную генетическую целостность после повреждающих воздействий. Важнейшие достижения в этой области были связаны с обнаружением и подробным описанием редких наследственных заболеваний человека, возникающих при наличии мутаций в генах, вовлеченных в процессы репарации ДНК (Спивак, 1999; Christmann et al., 2003). Эти заболевания являются природной естественной моделью для изучения процессов репарации ДНК и канцерогенеза. Именно поэтому изучение процессов репарации ДНК у человека не только не отставало, а часто и опережало исследования, проводимые на модельных организмах. При многих из этих заболеваний одновременно с появлением тяжелых генетически детерминированных синдромов прослеживается семейная предрасположенность к повышенной частоте возникновения раковых заболеваний, связанная с гетерозиготным носительством мутаций в тех же генах (Nakayama, 2002; Pulverer, 2003). Клеточные линии и штаммы, полученные от таких больных, являются моделью для изучения различных процессов, таких как репарация, репликация и рекомбинация ДНК, старение и канцерогенез (Михельсон, 1996; Наседкина и др., 1997; Спивак и др., 1997; Спивак 1999; Barenfeld et al., 1998; Mikhelson, 2001).

Изучение процессов репарации ДНК шло параллельно с исследованиями действия различных повреждающих агентов на молекулярном уровне. Подробное описание повреждений—таких, к примеру, как пиримидиновые димеры или двунитевые разрывы ДНК, позволяло существенно ускорить исследования динамики их репарации в клетке. Особое место среди повреждающих воздействий занимают ионизирующая радиация и химические мутагены, действие которых приводит к сходным последствиям, в первую очередь— возникновению двунитевых разрывов ДНК (Kolman et al., 1997; Chovanec et al., 1998; Huang et al., 2003). Появление в ДНК двунитевых разрывов (DSBs) запускает каскад внутриклеточных реакций, опосредуемых различными сигнальными путями, и приводит к развитию глобального клеточного ответа на повреждение, включающего активацию специфических чекпойнтов, возникающих в ответ на повреждение ДНК. Следствием этого является возможная остановка клеточного цикла, усиление репарационных процессов и изменение конформации хроматина (Belayev et al., 1996; Fei, El-Deiry, 2003; Iliakis et al., 2003; Zhou, Bartek, 2004). Ключевым белком глобального клеточного ответа принято в настоящее время считать протеинкиназу ATM (ataxia-telangiectasia mutated), способную к автофосфорилированию и активированию своей киназной активности в ответ на возникновение конформационных изменений хроматина после появления двунитевых разрывов ДНК и быстрому последующему фосфорилированию различных белков мишеней (Westphal et al., 1997; Shiloh, 2003; Lavin, 2008). Среди этих белковмишеней - Р53, СНК2, BRCA1, NBS1, H2AX и многие другие (Kim et al., 2002).

При наличии мутаций в обеих аллелях гена atm развивается тяжелое заболевание со сложным плейотропным фенотипом— атаксия-телеангиэктазия (AT), или синдром Луи-Бар, характеризующееся множественными нейрологическими аномалиями, высокой предрасположенностью к опухолевым заболеваниям, ускоренным старением и крайней чувствительностью к действию ионизирующей радиации (Спивак, 1999; Landsdorp, 2000; Shiloh, 2003; Lavin, 2008). При отсутствии ATM ее функции частично берет на себя ATR (ataxia-telangiectasia related), сходная с ней по структуре, но хуже изученная, так как нокаутные по этому гену мыши гибнут в эмбриогенезе (Abraham, 2001). Только в 2003 году было показано, что нарушение репарации ДНК у больных с синдромом Секеля, характеризующегося, как и AT, повышенной чувствительностью к ионизирующей радиации, связано с мутацией, инактивирующей ген ATR. Ген ATM находится на 11 хромосоме - llq23, имеет размер примерно 150 т.п.н. и содержит 66 экзонов (Gatti et al., 1988; Uziel et al., 1996; Platzer et al., 1997). Хотя к настоящему времени он полностью секвенирован, оказалось, что каждая детально исследованная АТ-семья несет свою собственную мутацию, что требует полного сиквенса исследуемого гена и существенно осложняет диагностику (Sandoval et al., 1999).

Несмотря на имеющиеся к настоящему времени многочисленные данные о роли белка ATM в клеточном ответе на радиационные повреждения, остается недостаточно ясной картина в каждом отдельном случае, с которым сталкиваются клиницисты и ученые. К тому же гетерозиготное носительство этого заболевания гораздо шире, чем можно предположить, исходя из его частоты, и составляет по разным данным от 2 до 10 % в различных популяциях (Chen et al., 1978; Swift et al., 1986). Носители, как правило, имеют предрасположенность к развитию ранних опухолей различной этиологии. Действие небольших случайных доз ионизирующей радиации или мутагенов может служить в таких случаях триггером для развития опухолевого процесса. Поиск быстрого метода определения потенциального носительства мутаций в генах, отвечающих за процессы репарации ДНК в клетке, является, таким образом, одной из важных научно-практических задач радиобиологии и радиационной гигиены.

К настоящему времени накоплены многочисленные экспериментальные данные, указывающие на то, что для репарации DSBs необходимо ремоделирование хроматина, которое происходит при строго ассоциированном с образованием DSB специфическом фосфорилировании С-концевого серина-139 вариантного гистона Н2АХ (Ward et al., 2001; Goodarzi et al., 2008; Kuo, Yang, 2008). Мегабазные участки хроматина, покрывающие DSB, можно легко визуализировать в ядрах или экстрактах облученных клеток как фокусы фосфорилированного по серину-139 гистона Н2АХ (названного у-Н2АХ) с помощью специфических антител на фосфорилированный короткий пептид, соответствующий С-концу Н2АХ. Эти фокусы могут служить маркерами DSBs и способствовать изучению их индукции и процессинга (Karlson, Stenerlow, 2004; Tanaka et al., 2006). В клетках высших эукариот гистон Н2АХ фосфорилируется протеинкиназой ATM в первые же минуты после образования DSB, и инактивация ATM приводит к нарушению этого фосфорилирования. Но в радиочувствительных клетках больных AT, дефектных по киназе ATM, фокусы у-Н2АХ после облучения все же выявляются. По-видимому, эти фокусы ассоциированы с сайтами репликации ДНК, так как в остановившихся в местах повреждения ДНК репликативных вилках фосфорилирование гистона Н2АХ проводит другая протеинкиназа — DNA-PK, но не ATR (Stiff et al., 2004).

Еще одной прямой мишенью ATM является белок Р53, фосфорилируемый ею по серину в 15 положении. Это фосфорилирование приводит к высвобождению Р53 из комплекса с MDM2 (который ATM также фосфорилирует по серину в положении 395) и его стабилизации и накоплению в ядре. Благодаря стабилизации белка Р53 и его последующей — относительно более медленной — работе как фактора транскрипции, включающего синтез соответствующих белков, например белка Р21, в клетке генерируется длительный и глубокий G1-арест, опосредуемый инактивацией комплекса циклин E/CDK2 (Sancar et al., 2004). Одновременно происходит взаимодействие белка Р53 с белком 53ВР1, его Q перемещение и формирование фокусов репарации. Другой важнейший фактор транскрипции, играющий ключевую роль в контроле клеточного цикла— белок E2F1 - также фосфорилируется и стабилизурутся ATM-зависимым способом (Lin et al., 2001). В тоже время давно показана и многократно подтверждена независимыми исследователями радиорезистентность клеточного цикла в клетках больных AT (Jeggo et al., 1998). Спорным остается вопрос о том, как изменятся параметры клеточного цикла в клетках гетерозиготных носителей AT и будет ли другим характер формирования в них чекпойнтов в ответ на повреждение ДНК.

Повреждения ДНК, безусловно, вовлечены в появление и развитие такой возрастной патологии, как опухолеобразование, а гетерозиготное носительство мутаций генов репарации ДНК и глобального клеточного ответа, вероятно, является причиной раннего возникновения опухолей различной локализации. Эти же мутации могут приводить и к более раннему появлению других заболеваний, характерных для пациентов старшего возраста, например, диабета и сердечно-сосудистой патологии (Sano et al., 2007),то есть ускоренному старению. Это соответствует современным представлениям о природе возникновения болезней старения и их индивидуальной генетической детерминированности (Анисимов, 2003).

Таким образом, возникла ситуация, когда для прикладной медицины крайне важно иметь возможность быстро и достоверно оценить повышенную радиочувствительность каждого конкретного пациента на клеточном уровне, так как генетическая оценка крайне затруднена из-за количества вовлеченных в природу этого явления генов. Такая оценка может быть основой как для показаний к диспансеризации, так и к выработке соответствующих медицинских рекомендаций для диагностики и профилактики патологий, в первую очередь - ранних опухолей — у лиц группы риска. Разработка методов быстрого определения степени радиочувствительности и ускоренного старения на клеточном уровне (вне зависимости от генетического дефекта) крайне необходима для пациентов, которым рекомендован курс радиотерапии и для лиц, связанных с риском радиационного/химического поражения в силу своей профессиональной деятельности.

Цель исследования

Целью настоящей работы является исследование преждевременного старения и радиочувствительности на клеточном уровне в семьях больных атаксией-телеангиэктазией (AT). и

Задачи исследования

Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить репаративный потенциал клеток больных AT и их кровных родственников методом электрофореза индивидуальных клеток (методом "ДНК-комет").

2. Описать маркеры ускоренного старения в клетках больных AT и их кровных родственников.

3. Изучить особенности клеточного цикла в ответ на действие рентгеновского облучения в клетках больных AT и их кровных родственников.

4. Сравнить уровень преждевременного старения и радиочувствительности на клеточном уровне в различных семьях, в которых была диагностирована AT.

Научная новизна

1. Впервые на примере двух семей доказано существование связи между признаками радиочувствительности и признаками ускоренного старения на клеточном уровне при атаксии-телеангиэктазии.

2. Впервые предложен быстрый адекватный метод дискриминации гетерозиготного носительства в семьях, в которых была диагностирована AT. J

Теоретическая и практическая значимость работы

Показано, что при клеточной радиочувствительности различной этиологии одновременно выявляются маркеры ускоренного старения.

На примере двух семей AT доказана связь радиочувствительности и проявления признаков ускоренного старения на клеточном уровне.

На основе полученных результатов выявлены молекулярные механизмы, лежащие в основе радиоиндуцированного старения.

Показана эффективность использования клеточных культур для дискриминации гетерозиготного носительства AT. Выявление гетерозиготного носительства AT в семьях с выработкой последующих клинических рекомендаций будет способствовать улучшению качества жизни пациентов за счет оценки рисков, своевременного и адекватного назначения терапии сопутствующих заболеваний.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Полуботко, Евгения Анатольевна

ВЫВОДЫ

1. Атаксия-телеангиэктазия является прогероидным синдромом, а гетерозиготы имеют черты преждевременного старения на клеточном уровне.

2. Способность к репарации двунитевых разрывов, определяемая методом "ДНК-комет" и выявлением фокусов у-Н2АХ и 53ВР1 достоверно снижена в клетках больных AT и гетерозиготных носителей заболевания .

3. Клетки больных AT не способны формировать блоки клеточного цикла после облучения. У гетерозиготных носителей формирование блоков клеточного цикла после облучения нарушено.

4. Р21 не может служить маркером для определения гетерозиготного носительства AT.

5. Клетки больной AT7SP обладают повышенной радиочувствительностью неясной этиологии, что может являться причиной развития у нее опухоли в раннем возрасте.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Полуботко, Евгения Анатольевна, Санкт-Петербург

1. Анисгшов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. СПб.: Наука, 2003.

2. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия. 2000. - Vol. 65. - Р. 5-33.

3. Михельсон В. М. Наследственное преждевременное старение человека. Клиническая геронтология // -1996. № 4.- С. 29-35.

4. Полуботко Е.А., Смирнова Н.В. , Плескач Н.М., Михельсон В.М., Спивак И.М. Особенности преждевременного старения при атаксии-телеангиэктазии // Цитология. 2009.- Т.51 ,№ 8. - С. 712-718.

5. Смирнова Н.В., Спивак И.М., Плескач Н.М., Жеребцов С.В., Аксенов Н.Л., Михельсон В.М. Атипический синдром Вернера: нарушения эпигенетической регуляции и ответа на повреждения РНК // Цитология. 2008а,- Т.50,№ 10. - С. 868 - 877.

6. Смирнова Н.В., Спивак И.М., Плескач Н.М., Михельсон В.М. Атипический случай синдрома Вернера: эффект ламинопатии // Цитология. 20086.- Т.50,№ 9. - С. 780-788.

7. Спивак И. М., Плескач Н. М., Боотсма Д., Колъман А. Пониженная выживаемость и дефект репарации ДНК в клетках больных пигментной ксеродермой и синдромом Коккейна при действии лучевых и химических мутагенов // Цитология 1997. - Т.39, № 6. -С. 420-434.

8. Спивак ИМ. Наследственные болезни с первичными и вторичными дефектами репарации ДНК // Цитология 1999. - Т. 41. - Р. 338-380.

9. Спивак И.М., Смирнова Н.В., Плескач Н.М., Ледащева Т.А., Михелъсон В.М. Особенности стабилизации белка р53 в клетках больных атаксией-телеангиэктазией // Цитология. 2005. - Т.47,№10. -С. 898-906.

10. Спивак ИМ. Экология. Повреждение и репарация ДНК // Учебное пособие. 2006.

11. Хомасуридзе М. М., Спивак И. М., Плескач Н. М., Михелъсон В. М. Особенности радиочувствительности клеток больных атаксией-телеангиэктазией //Цитология. 1999-Т.41,№ 5.- С. 412-419.

12. Чумаков ПМ. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью // Биохимия 2000. - Т. 65,№ 1. - С. 34-47.

13. Abraham R. T. Cell cycle checkpoint signaling through the ATM and ATR kinases // Genes Dev. 2001.- Vol.15. - P. 2177-2196.

14. Abukhdeir A.M., Park B.H. P21 and p27: roles in carcinogenesis and drug resistance I I Expert Rev Mol Med. 2008. - Vol. 10. - P. 19.

15. Adams C.J., Graham A.L., Jansson M., Coutts A.S., Edelmann M., Smith L., Kessler В.,La Thangue N.B. ATM and Chk2 kinase target the p53 cofactor Strap // EMBO Rep. 2008. - Vol. 9, № 12. - P. 1222-9.

16. Ainsztein A. M., Kandels-Lewis S. E., Mackay A. M., Earnshaw W. C. INCENP centromere and spindle targeting: identification of essential conserved motifs and involvement of heterochromatin protein HP1 // J. Cell Biol. 1998. - Vol.143. - P. 1763 - 1774.

17. Amundson S.A., Myers T.G. andFornace A.J.Jr. Roles forp53 in growth arrest and apoptosis: putting on the brakes after genotoxic stress. // Oncogene. 1998. - Vol.17. - P. 3287-3299.

18. Ayoub N., Jeyasekharan A.D., Bernal J.A., Venkitaraman A.R. HP1-beta mobilization promotes chromatin changes that initiate the DNA damage response // Nature. 2008. - Vol. 453, № 7195. - P. 682-6.

19. Bai Y., Murnane J.P. Telomere instability in a human tumor cell line expressing NBS1 with mutations at sites phosphorylatcd by ATM // Mol Cancer Res. 2003. - Vol.14. - P. 1058-69.

20. Beamish H., Lavin M.F. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: anomalies in radiation-induced cell cycle delay // Int J Radiat Biol. 1994. -Vol. 65.-P.l 75-184.

21. Beamish H., Williams R., Chen P., Lavin M. Defect in multiple cell cycle checkpoints in ataxia-tclangiectasia postirradiation // J Biol Chem. — 1996. Vol.271. - P. 20486-20493.

22. Bekker-Jensen S., Lukas C., Kitagawa R., Melander F., Kastan M.B., Bartek J., Lukas J. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks // J.Cell Biol. -2006. Vol. 173, № 2. - P.195 - 206.

23. Belyayev I. Ya., Spivak I. M, Kolman A., Harms-Ringdahl M. Relatioship between radiation induced adaptive response in human fibroblasts and changes in chromatin conformation // Mutat. Res. 1996. -Vol. 358. - P. 223-230.

24. Bergoglio V., Magnaldo T. Nucleotide excision repair and related human diseases // Genome Dyn. 2006. - Vol. 1. - P. 35-52.

25. Bernard P., Maure J. F., Partridge J. F., Genier S., Javerzat J. P., Allshire R.C. Requirement of heterochromatin for cohesion at centromeres // Science. 2001. Vol. 294. - P. 2539 - 2542.

26. Bornman D. M., Mathew S., Alsruhe J., Herman J. G., Gabrielson E. Methylation of the E-cadherin gene in bladder neoplasia and in normal urothelial epithelium from elderly individuals // Am. J. Pathol. 2001. -Vol.159. - P. 831 - 835.

27. Bras M., Queenan В., Susiin S.A. Programmed cell death via mitochondria: different modes of dying // Biochemistry. 2005. - Vol. 70. -P. 231-239.

28. Brown E.J., Baltimore D. Essential and dispensable roles of ATR cell cycle arrest and genome maintenance // Genes Dev. 2003. - Vol. 1 №5.-P. 615-28.

29. Campisi J. Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors // Cell. 2005. - Vol. 120, № 4. - P. 51 3 — 522.

30. Cao R., Zhang Y The functions of E(Z)/EZH21 -mediated methylaLion of lysine 27 in histone H3 // Curr. Opin. Genet. Dev. 2004.- Vol.14. — P-155 -164.

31. Carson D.A., Lois A. Cancer progression and p53 // Lancet. — 1995. — Vol. 346, № 8981. - P. 1009-11.

32. Casillas M.A. Jr., Lopatina N., Andrews L. G., Tollefsbol T. Transcriptional control of the DNA methyltransferases is altered in agini=5 and neoplastically-transformed human fibroblasts // Mol. Cell. Biochem- —" 2003.- Vol.252. P. 33 - 43.

33. Cenci G., Ciapponi L., Gatti M. The mechanism of telomere protection: a comparison between Drosophila and humans // Chromosome 2005. - Vol. 114. - P. 135 - 145.

34. Chapman M. S., Verma I. M. Transcriptional activation by BRCA1 /У Nature. 1996. - Vol. 382. - P. 678-679.

35. Chen P.C., Lavin M.F., Kidson C., Moss D. Identification of ataxia-teleangiectasia heterozigotes, a cancer prone population // Nature. — 1978. — Vol. 247.-P. 484-486.

36. Collins A.R. 2009. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681(l):24-32.

37. Chondhuri Т., Verma S.C., Lan K., Murakami M, Robertson E.S. The ATM/ATR signaling effector Chk2 is targeted by Epstein-Barr virus nuclear antigen 3C to release the G2/M cell cycle block // J Virol. 2007. - Vol. 81, № 12.-P. 6718-30.

38. Chovanec M., M. Naslund I. Spivak M. Dusinska B. Cedervall and A. Kolman. Rejoing of DNA strand breaks induced by propylene oxide and epichlorohydrin in human diploid fibroblasts // Environment. Mol. Mut. — 1998. Vol. 32. - P. 223-228.

39. Christmann, M., Tomicic, M.T., Roos, W.P., Kaina, B. Mechanisms of human DNA repair: an update // Toxicology 2003. - Vol. 193. - P. 3-34.

40. Edinger A.L. and Thompson C. Death by design: apoptosis, ne^^10515 and autophagy // Curr. Opin. Cell Biol. 2004. - Vol. 16. - P.663-6^^

41. Eissenberg J. C., Elgin S. C. The HP1 protein family: getting a ^cip on chromatin // Curr. Opin. Genet. Dev. 2000. - Vol. 10. - P. 204 -21053) Ekwall K., Javerzat J. P, Lorentz A., Schmidt H., Cranston G.,1. AZZsbire

42. R. The chromodomain protein Swi6: a key component at fission 3/east centromeres // Science. 1995. - Vol. 269. - P. 1429 - 1431.

43. Eliezer Y., Argaman L., Rhie A., Doherty A.J., Goldberg M. Thedirectinteraction between 53BP1 and MDC1 is required for the recruitment 53PB1 to sites of damage // J Biol Chem. 2008. - Vol. 284, № 1. - ^• 426-35.

44. Emmert S., Ueda Т., Zumsteg U, Weber P., Khan S.G., Oh K.S.,

45. Eugene D.W., Jos hi К D. Xeroderma pigmentosa—a disfiguring

46. Kathmandu Univ Med J (KUMJ). 2006. - Vol. 4, № 1. - P. 78-81.

47. Evan G., Littlewood T. A matter of life and cell death // ScieiK^^42* 1998. Vol. 281, № 5381. - P. 1317-22.

48. Ewald В., Sampath D., Plunkett W. ATM and the Mrell-Rad50-complex respond to nucleoside analogue-induced stalled replication and contribute to drug resistance // Cancer Res. 2008. - Vol. 68, № L P. 7947-55.

49. Fei P. and El-Deiry. P53 and radiation responses // Oncogene. 2003.- Vol. 22, № 37. p. 5774-5783.

50. Foray N., Marot D., Gabriel A., Randrianarison V., Carr A.M., Perricaudet M., Ashworth A., Jeggo P. A subset of ATM- and ATR-dependent phosphorylation events requires the BRCA1 protein // EMBO J.- 2003. Vol. 22, № 11. - P. 2860-71.

51. Ford D., Easton D.F., Bishop D.T., Narod S.A., Goldgar D.E. Risks of cancer in BRCA1 mutation carriers I I Lancet. 1994. - Vol. 343. - P. 6925.

52. Ford J., Baron E., Hanawalt F. Human fibroblasts expressing the human papillomavirus E6 gene are deficient in global genomic nucleotide excision repair in UV-irradiated human fibroblasts // Cancer Res. 1998. -Vol. 58.-P. 599-603.

53. Ford J., Hanawalt F. Expression of wide-type p53 is reguired for efficient global genomic nucleotide excision repair in UV-irradiated human fibroblasts // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272. - P. - 28073-28080.

54. Gatti R.A., Berkel I., Boder E., Braedt G., Charmley P., Concannon P., Ersoy F., Foroud Т., Jaspers N. G., Lange K., et al. Localization of an ataxia-telangiectasia gene to chromosome 1 lq22-23 // Nature. — 1988. — Vol. 336, № 6199. P. 577-80.

55. ChadwickB.P., Willard H.F. Multiple spatially distinct types of facultative heterochromatin on the human inactive X chromosome // Proc Natl Acad Sci USA. 2004. - Vol. 101. - P. 17450-17455.

56. Gilad S., Chessa L., Khosravi R., Russell P., Galanty Y., Plane M., Gatti R.A., Jorgensen T.J., Shiloh Y., Bar-Shira A. Genotype-phenotype relationships in ataxia-telangiectasia and variants // Am J Hum Genet. -1998. Vol. 62,№ 3. - P. 551-61.

57. Girard P.M., Riballo E„ Begg A.C., Waugh A., Jeggo P.A. Nbsl promotes ATM dependent phosphorylation events including those required for Gl/S arrest // Oncogene. 2002. - Vol. 21, № 27. - P. 4191-9.

58. Goodarzi A.A., Block W.D., Lees-Miller S.P. The role of ATM and ATR in DNA damage-induced cell cycle control // Prog Cell Cycle Res. -2003. Vol. 5. - P. 393-411.

59. Goodarzi A.A., Noon А. Т., Deckbar D., Ziv Y., Shiloh Y, Lobrich M., Jeggo P.A. ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin // Mol Cell. 2008 - Vol. 31, № 2. - P. 167-77.

60. Grewal S. /., Rice J. C. Regulation of heterochromatin by histone methylation and small RNAs // Curr. Opin. Cell Biol. 2004. - Vol. 16. -P. 230-238.

61. Hammond E.M., Freiberg R.A., Giaccia A.J. The roles of Chk 1 and Chk 2 in hypoxia and reoxygenation // Cancer Lett. 2006. - Vol. 238, № 2. - P. 161-7.

62. Hanawalt P.S. DNA repair. The bases for Cockayne syndrome // Nature. 2000. - Vol. 405. - P. 415-416.

63. Hanawalt P.S. Controlling the efficiency of excision repair // Nature.-2001.- Vol. 485.-P. 3-13.

64. Hao L.Y., Strong М.А., Greider C.W. Phosphorylation of H2AX at short telomeres in T cells and fibroblasts // J Biol Chem. 2004. Vol. 279, №43.-P. 45148-54.

65. Harris S.L., Levine A.J. The p53 pathway: positive and negative feedback loops // Oncogene. 2005. - Vol. 24, № 17. - P. 2899-2908.

66. Hartkamp J., Roberts S.G. The role of the Wilms' tumour-suppressor protein WT1 in apoptosis // Biochem Soc Trans. 2008. - Vol. 36, № 4. -P. 629-31.

67. Hickson I.D. RecQ helicases: caretakers of the genome // Nature Rev. Cancer. 2003. - Vol. 3. - P. 169-178.

68. Hill R., BodzakE., Blough M.D, Lee P. W. p53 Binding to the p21 promoter is dependent on the nature of DNA damage // Cell Cycle. 2008. -Vol. 7, №16.-P. 2535-43.

69. Hoeijmakers J.H. Genome maintenance Mechanisms for preventing cancer // Nature. 2001. - Vol. 411. - P. 366-374.

70. Houldsworth J., Lavin M.F. Effect of ionizing radiation on DNA synthesis in ataxia telangiectasia cells // Nucleic Acids Res. — 1980. Vol. 8. - P.3709-3720.

71. Huang L., Shyder, A.R.,Morgan, W.F. Radiation-induced genomic instability and its implications for radiation carcinogenesis // Oncogene. — 2003. Vol. 22, № 37. - P. 5848-5854.

72. Iliakis G., Wang, K, Guan, J., Wang, H. DNA damage checkpoint control in cells exposed to ionizing radiation // Oncogene 2003. - Vol. 22, №37.-P. 5834-5847.

73. Issa J. P. Age-related epigenetic changes and the immune system // Clin. Immunol. 2003. Vol.109. P. 103 - 108.

74. Jatoi I., Anderson W.F. Management of women who have a genetic predisposition for breast cancer // Surg Clin North Am. 2008. - Vol. 88, №4.-P. 845-61.

75. Jenuwein Т., Allis C. D. Translating the histone code I I Science. 2001. - Vol. 293. - P. 1074 - 1080.

76. Jeggo P. A., Carr A. M., Lehmann A. R. Splitting the ATM:distinct repair and checkpoint defects in ataxia-telangiectasia // Trends Genet. — 1998.-Vol.14. P. 312-316.

77. Jenuwein Т., Allis C. D. Translating the histone code // Science. 2001. -Vol. 293.-P. 1074-1080.

78. Jhanwar-Uniyal M. BRCA1 in cancer, cell cycle and genomic stability // Front Biosci. 2003. - Vol. 8. - P. 1107-17.

79. Jones P. A., Baylin S. B. The fundamental role of epigenetic events in cancer // Nature Rev. Genet. 2002. - Vol. 3. - P. 415 - 428.

80. Karlsson K.H., Stenerlow B. Focus formation of DNA repair proteins in normal and repair-deficient cells irradiated with high-LET ions // Radiat.Res. 2004. - Vol. 161. - P. 517-527.

81. Kedar P.S., Stefanick D.F., Horton J.K., Wilson S.H. Interaction between PARP-1 and ATR in mouse fibroblasts is blocked by PARP inhibition // DNA Repair (Amst). 2008. - Vol. 7, № И. - P. 1787-98.

82. Kerr J.F., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics // Br J Cancer. 1972. - Vol. 26. - P. 239-257.

83. Khosravi R., Maya R., Gottlieb Т., Oren M., Shiloh Y., Shkedy D. Rapid ATM-dependent phosphorylation of MDM2 precedes p53 accumulation in response to DNA damage // Proc Natl Acad Sci USA.- 1999. Vol. 96, №26.-P. 14973-7.

84. Kim M.J., Lee J.Y., Lee S.J. Transient suppression of nuclear Cdc2 activity in response to ionizing radiation // Oncol Rep. 2008. - Vol. 19, № 5. - P. 1323-9.

85. Kim S.T., Xu В., Kastan M.B. Involvement of the cohesin protein, Smcl, in Atm-dependent and independent responses to DNA damage // Genes Dev. 2002. - Vol. 16,№ 5. - P. 560-70.

86. Kinzler К W., Vogelstein B. Cancer-susceptibility genes. Gatekeepers and caretakcrs // Nature. 1997. - Vol. 386, № 6627. - P. 761 - 763.

87. Knudson A. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma // PNASA. -1971. Vol. 68. - P. 820-823.

88. Kolman A., Spivak I., Naslund M., Dusinska M. and Cedervall B. Propylene Oxide and Epichlorohydrin induce DNA strand Breaks in human diploid fibroblasts // Enviroment. Mol. Mutagen. 1997. - Vol. 30. - P. 40-46.

89. Kouzarides T. Chromatin modifications and their function // Cell. — 2007. Vol. 128, № 4. - P. 693-705.

90. Kuo L.J., Yang L.X. Gamma-H2AX a novel biomarker for DNA double-strand breaks // In Vivo. - 2008. - Vol. 22, № 3. - P. 305-9.

91. Lachner M., O'Sullivan R. J., Jenuwein T. An epigenetic road map for histone lysine methylation 11 J. Cell Sci.- 2003. Vol. 116. - P. 2117 -2124.

92. Lansdorp P.M. Repair of telomeric DNA prior to replicative senescence // Mech Ageing Dev. 2000. - Vol. 118, № 1 -2. - P. 23-34.

93. Lavin M.F. Ataxia-telangiectasia: from a rare disorder to a paradigm for cell signalling and cancer // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2008. - Vol. 9. - P. 759-69.

94. Lavin M. F., Shiloh Y. The genetic defect in ataxiatelangiectasia // Annu. Rev. Immunol. 1997. - Vol.15. - P. 177-202.

95. Lee H., KwakK, Cho I.T., Park S.H., Lee C.H. S1219 residue of 53BP1 is phosphorylated by ATM kinase upon DNA damage and requiredfor proper execution of DNA damage response // Biochem Biophys Res Commun. 2009. - Vol. 378, № 1. - P. 32-6.

96. Lengauer C., Kinzler K. W., Vogelstein B. Genetic instabilities in human cancers // Nature. 1998. - Vol. 396, № 6712. - P. 643-649.

97. Levitt N.C., Hickson I.D. Caretaker tumour suppressor genes that defend genome integrity // Trends Mol Med. 2002. - Vol. 8, № 4. - P. 179-186.

98. Li F.P. Identification and management of inherited cancer susceptibility // Environ Health Perspect. 1995. - Vol. 103, № 8. - P. 297-300.

99. Li Y., Kirschmann D.A., Wallrath L.L. Does heterochromatin protein 1 always follow code? // Proc. Natl. Acad. Sc. USA. 2002. - Vol. 99. - P. 16462-16469.

100. Lin W.C., Lin F.T., Nevins J.R. Selective induction of E2F1 in response to DNA damage, mediated by ATM-dependent phosphorylation // Genes Dev. 2001. - Vol. 15, № 14. - P. 1833-44.

101. Manke I.A., Lowery D.M., Nguyen A., Yaffe M.B. BRCT Repeats As Phosphopeptide-Binding Modules Involved in Protein Targeting // Science. 2003. - Vol.302. - P. 636-639.

102. Martin C., Zhang Y. The diverse functions of histone lysine methylation // Nat Rev Mol Cell Biol. 2005. - Vol. 6, № 11. - P. 838-49.

103. Marx J. Possible function found for breast cancer genes // Science. 1997. -Vol. 276.-P. 531-532.

104. Mclnnes C. Progress in the evaluation of CDK inhibitors as antitumor agents // Drug Discov Today. 2008. - Vol. 13, № 19-20. - P. 87581.

105. McKinnon P. J. ATM and ataxia telangiectasia // EMBO Rep. 2004. -Vol. 5.-P. 112-116.

106. MengX., Dong Y., Sun Z. Mechanism of p53 downstream effectors p21 and Gadd45 in DNA damage surveillance // Sci China С Life Sci. — 1999. Vol. 42, № 4. - P. 427-34.

107. Mikhelson V. M. Replicative mosaicism might explain seeming contradictions in telomere theory of aging // Mechanisms of Ageing and Development.-2001.-Vol. 122, № 13.-P. 1361-1365.

108. Milner J, Ponder B, Iiughes-Davies L, Seltmann M, Kouzarides T. Transcriptional activation functions in BRCA2 // Nature. 1997. - Vol. 386.-P. 772-773.

109. Mocquet V., Laine J.P., Riedl Т., Yajin Z, Lee M.Y., Egly J.M. Sequential recruitment of the repair factors during NER: the role of XPG in initialing the resynthesis step // EMBO J. 2008. - Vol. 27, № 1. - P. 15567.

110. Nakamura T.M., Du,. L.L., Redon C., Russel P. Histone H2A phosphorylation controls Crb2 rcruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fisson yeast // Mol. Cell Biol. 2004. - Vol. 14. - P. 6215-6230.

111. Nakayama H. RecQ family helicases: roles as tumor suppressor proteins // Oncogene. 2002. - Vol. 21, № 58. - P. 9008-21.130. 1Vatarajan A.T., Palitti F. DNA repair and chromosomal alterations // Mutat Res. 2008. - Vol. 657, № 1. - p. 3-7.

112. Neganova I., Zhang X., Atkinson S., Lako M. Expression and functional analysis of G1 to S regulatory components reveals an importantrole for CDK2 in cell cycle regulation in human embryonic stem cells // Oncogene. 2009. Vol. 28, № 1. - P. 20-30.

113. Nigg E.A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? // Nature Rev. 2002. - Vol. 2. - P. 1-11.

114. Nightingale K.P., O'Neill L.P., Turner B.M. Histone modifications: signalling receptors and potential elements of a heritable epigenetic code // Curr Opin Genet Dev. 2006. - Vol. 16, № 2. - P. 125-36.

115. Nonaka N., Kitajima Т., Yokobayashi S., Xiao G., Yamamoto M., Grewal S. L, Watanabe Y. Recruitment of cohesin to heterochromatic regions by Swi6/HPl in fission yeast // Nat. Cell Biol. 2002. - Vol. 4. -P. 89-93.

116. Nygren J., Cedervall В., Ericksson M., Dusinska M., Kolman A. Induction of DNA strsnd breaks by ethylene oxide in human diploid fibroblasts // Envir.Mol.Mutagen. 1994. - Vol. 24. - P. 161-167

117. Obuse C., Iwasaki O., Kiyomitsu Т., Goshima G., Toyoda Y., Yanagida M. A conserved Misl2 centromere complex is linked to hetcrochromatic HP1 and outer kinetochore protein Zwint-1 I I Nat. Cell Biol. 2004. - Vol. 6. - P. 1135 - 1141.

118. Painter R.B., Young B.R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation // Proc Natl Acad Sci USA.- 1980. Vol. 77, № 12. -P. 7315-7.

119. Park M.S., KoffA. Overview of the cell cycle // Curr Protoc Cell Biol. -2001.-Vol. 8.-P. 8.1.

120. Perona R., Moncho-Amor V., Machado-Pinilla R., Belda-Iniesta C., Sanchez Perez /. Role of CHK2 in cancer development // Clin Transl Oncol. 2008. - Vol. 10, № 9. - P. 538-42.

121. Petronis A. Epigenetics and twins: three variations on the theme // Trends Genet. 2006. - Vol. 22. - P. 347 - 350.

122. Powell S.N., Kachnic L.A. Therapeutic exploitation of tumor cell defects in homologous recombination // Anticancer Agents Med Chem. -2008. Vol. 8, № 4. - P. 448-60.

123. Pulverer B. ATMachine // Nature Cell Biol. -2003. Vol. 5. - P. 96.

124. Radhakrishnan S.K., Gierut J., Gartel A.L. Multiple alternate p21 transcripts are regulated by p53 in human cells // Oncogene. 2006. - Vol. 25.-P. 1812-1815.

125. Rice J.C., Briggs S.D., Ueberheide В., Barber C.M., Shabanowith J., Hunt D.F., Shinkai Y., Allis C.D. Histone methyltransferases direct different degrees of methylation to define distinct chromatin domains // Mol.Cell. 2003.- Vol. 12. - P. 1591-1598.

126. Sabado Alvarez C. Molecular biology of retinoblastoma // Clin Transl Oncol. 2008. - .Vol. 10, № 7. - P.389-94.

127. Sauna К., Reinberg D. Histone variants meet their match // Nat Rev Mol Cell Biol. 2005. - Vol. 6, № 2. - P. 139-49.

128. Sancar A., Lindsey-boltz L.A., Unsal-Kaqmaz K., Linn S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints // Annu.Rev.Biochem. 2004. - Vol. 73. - P. 39-85.

129. Sandoval N., Platzer M., Rosenthal A., Doerk Т., Bendix R., Skawran

130. Savill J., Fadok V., Henson P., Haslett C. Phagocyte recognition of cells undergoing apoptosis // Immunol. Today. 1993. - Vol. 14. - P. 131136.

131. C. F., Miki Т., Weissman S. M., Lovett M., Collins F. S., Shiloh Y. A single ataxia telangiectasia gene with a product similar to PI-3 kinase // Science. -1995. Vol. 268. - P. 1749—1753.

132. Scaffidi P., Misteli T. Reversal of the cellular phenotype in the premature aging disease Hutchinson-Gilford progeria syndrome // Nat Med. 2005. - Vol. 11, № 4. - P. 440-5.

133. Scaffidi P., Misteli T. Lamin A-Dependenl Nuclear Defects in Human Aging // Science. 2006. - Vol. 312, № 5776. - P. 1059-63

134. Sedelnikova O. A., Horikawa /., Zimonjic D. В., Popescu N. C., Bonner W. M., Barrett J. C. Senescing human cells and ageing mice accumulate DNA lesions with unrepairable double-strand breaks // Nat. Cell Biol. 2004. - Vol. 6. - P. 168 - 170.

135. Sharan S.K., Morimatsu M., Albrecht U., Lim D.S., Regel E., Dinh C., Sands A., Eichele G., Hasty P., Bradley A. Embryonic lethality and radiation hypersensitivity mediated by RAD51in mice lacking BRCA2 11 Nature. 1997. - Vol.386. - P. 804-810.

136. Sherr C.J., Roberts J.M. CDK inhibitors: positive and negative regulators of Gl-phase progression // Genes Dev. 1999. - Vol.13, № 12. -P. 1501-12.

137. Sherr C.J., McCormick F.Mc. The pRb and p53 pathways in cancer 11 Cancer Cell. 2002. - Vol. 2. - P. 103-112.

138. Shi O., WangX., Ren J. Biophysical characterization of the interaction of p21 with calmodulin: a mechanistic study // Biophys Chem. 2008. -Vol. 138, №3.-P. 138-43.

139. Shiloh Y ATM and related protein kinases: safeguarding genome integrity // Nature Reviews. 2003. - Vol. 3. - P. 155-168.

140. Sirota N.P., Kuznetsova E.A. Spontaneous DNA damage in peripheral blood leukocytes from donors of different age // Bull Exp Biol Med. -2008. Vol. 145, № 2. - P. 194-7.

141. Smardova J., Grochova D., Fabian P., Moulis M., Smarda J., Falkova L, Ravcukova В., Vankova J., Vasova I. An unusual p53 mutation detected in Burkitt's lymphoma: 30 bp duplication // Oncol Rep. .2008. - Vol. 20, № 4. - P. 773-8.

142. So K., Tamura G., Honda Т., Homma N., Waki Т., Togawa N., Nishizuka S., Motoyama T. Multiple tumor suppressor genes are increasingly methylated with age in non-neoplastic gastric epithelia // Cancer Sci. 2006. - Vol. 97. - 1155-1158.

143. Song K., Jung Y., Jung D., Lee /. Human Ku70 interacts with heterochromatin protein lalpha // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 8321 - 8327.

144. Spivak G., Itoh Т., Matsunaga Т., Nikado O., Hanawalt P., Yamaizumi M. Ultraviolet-sensitive syndrome cells are defective in transcription-coupled repair of cyclobutane pyrimidine dimmers // DNA repair. 2002. -Vol. l.-P. 629-643.

145. Steegenga W.T., Shvarts A., Riteco N., BosJ.L., JochemsenA.G. Distinct Regulation of p53 and p73 Activity by Adenovirus El A, E1B, and E4orf6 Proteins // Molecular and Cellular Biology. 1999. - Vol. 19. - P. 3885-3894.

146. Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide // Science. -1995. Vol. 267. - P.1445-1449.

147. Stiff Т., O'Driscoll M., RiefN., Iwabuchi K., Lobrich M., Jeggo P. A. ATM and DNA-PK function redundantly to phosphorylate H2AX after exposure to ionizing radiation // Cancer Res. 2004. - Vol. 64. - P. 2390 -2396.

148. Strahl B.D., Allis C.D. The language of covalent histone modifications // Nature. 2000. - Vol. 403, № 6765. - P. 41-5.

149. Swift M., Morell D., Cromartie E., Chamberlin A.R., Skolnick M.N., Bishop D.H. The incidence and gene frequency of ataxia-tclangiectasia in the United States // Amer.J.Hum.Genet. 1986. - Vol. 39. - P. 573-583.

150. Takahashi A., Ohnishi T. Does gammaH2AX foci formation depend on the presence of DNA double strand breaks? // Cancer Lett. 2005. -Vol. 229. - P. 171-9.

151. Takatsu M., Uyeno S., Komura J., Watanabe M., Ono T. Age-dependent alterations in mRNA level and promoter methylation of collagen alphal(I) gene in human periodontal ligament // Mech. Ageing Dev. -1999.-Vol. 110.-P. 37-48.

152. Tanaka Т., Halicka H.D., Huang X., Traganos F., Darzynkiewich.Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation and ATM activation, the reporters of DNA damage by endogenous oxidants // Cell cycle. 2006.-Vol.5.-P. 1940-1945.

153. Tang L., Zhang J., Xiong Y. Clone of human xeroderma pigmentosum group D cDNA and analysis of its expression and function // Sheng W11 Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. 2008. - Vol. 25, № 3. - P. 668-72.

154. Taylor A.M., Elude E., Laher В., StaceyM., McKay E., Watt J., Green S.H., Harding A.E. Variant forms of ataxia telangiectasia // J Med Genet. — 1987. Vol. 24, № 11. - P. 669-77.t

155. Thaker J., Zdzienicka M.Z. The XRCC genes: explanding roles in DNA double-strand break repair // DNA Repair. -2005. Vol. 4, № 2. - P. 303-314.

156. Tomita M., Morohoshi F., Matsumoto Y., Otsuka K., Sakai K. Role of DNA double-strand break repair genes in cell proliferation under low dose-rate irradiation conditions // J Radiat Res. 2008. - Vol. 49, № 5. - P. 55764.

157. Uziel Т., Savitsky K„ Platzer M., Ziv Y, Helbitz Т., Nehls M, Boehm Т., Rosenthal A., Shiloh Y, Rotman G. Genomic organization of the ATM gene // Genomics. -1996. Vol. 2. - P. 317-320.

158. Vagnarelli P. В., Earnshaw W. C. INCENP loss from an inactive centromere correlates with the loss of sister chromatid cohesion // Chromosoma 2001. - Vol.110. - P. 393 - 401.

159. Vakoc C. R., Mandat S. A., Olenchock B. A., Blobel G. A. Histone H3 lysine 9 methylation and HPlgamma are associated with transcription elongation through mammalian chromatin // Mol. Cell. 2005. - Vol. 19. -P. 381 -391.

160. Vaquero A., Loyola A., Reinberg D. The constantly changing face of chromatin // Sci. Aging Knowledge Environ. 2003. - Vol. 14. - P. 1 - 16.

161. Wang G., Ma A., Chow С. M, Horsley D., Brown N. R., Cowell I. G., Singh P. B. Conservation of heterochromatin protein 1 function // Mol. Cell Biol. 2000. - Vol. 20. - P. 6970 - 6983.

162. Ward I.M., Chen J. Histone H2AX is phosphorylated in ATM-dependent manner in response to replicational stress // J.Biol.Chem. — 2001. Vol. 276. - P. 42462-42467.

163. Weinberg R.A. The retinoblastoma protein and cell cyclc control // Cell. 1995. - Vol. 81. - P. 323-330.

164. Westphal C., S.Rowan, C. Schmaltz, A.Elson, D.Fisher, P.Leder. Atm and p53 cooperate in apoptosis and supression ot tumorigcnesis, but not in resistence to acute radiation toxicity // Nat. Genet. 1997. - Vol. 16. - P. 397-401.

165. Wilson K.A., Stern D.F. NFBD1/MDC1, 53BP1 and BRCA1 have both redundant and unique roles in the ATM pathway I I Cell Cycle. 2008.- Vol. 7, № 22. P. 3584-94.

166. Wilson V. L., Jones, P. A. DNA methylation decreases in aging but not in immortal cells // Science. 1983. - Vol. 220. - P. 1055 - 1057.

167. Wiwanitkit V. Structure of human BRCA2-RAD51 by molecular docking study // Arch Gynecol Obstet. 2007. - Vol. 276, № 6. - P. 625-7.

168. Wu L.C., Wang Z.W., Tsan J.T., Spillman M.A., Phung A., Xu X.L., Yang M.C., Hwang L.Y., Bowcock A.M., Baer R. Identification of a RING protein that can interact in vivo with the BRCA1 gene product // Nat Genet.- 1996. Vol.14. - P. 430—440.

169. Yang Q., Manicone A., Coursen J.D., Linke S.P., Nagashima M., Forgues M., Wang X.W. Identification of a functional domain in a GADD45-mediated G2/M checkpoint // J Biol Chcm. 2000. - Vol. 275, № 47. - P. 36892-36898.

170. Yu X., Chini C.C., He M., Mer G., Chen J. The BRCT Domain Is a Phospho-Protein Binding Domain I I Science. 2003. - Vol. 302. - P. 639642.

171. Zhang R., Chen W, Adams P. D. Molecular dissection of formation of senescent associated heterochromatin foci // Mol.Cell Biol. 2007. - Vol. 27. - P. 2343 - 2358.

172. Zhou B.-B.S. and Barte J. Targeting the checkpoint kinases: chemosensitization versus chemoprotection I I Nature Reviews. 2004. -Vol. 4. - P. 216-225.

Информация о работе
  • Полуботко, Евгения Анатольевна
  • кандидата биологических наук
  • Санкт-Петербург, 2009
  • ВАК 03.00.25
Диссертация
Преждевременное старение и радиочувствительность клеток у больных атаксией-телеангиэктазией - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Преждевременное старение и радиочувствительность клеток у больных атаксией-телеангиэктазией - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы