Клеточные маркеры старения при прогериях

Смирнова, Наталья Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клеточные маркеры старения при прогериях
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Клеточные маркеры старения при прогериях"

На правах рукописи

СМИРНОВА

и03456025

Наталья Владимировна ^''

Клеточные маркеры старения при прогернях

03.00.25 Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург г'

2008

003456025

Работа выполнена в Лаборатории радиационной цитологии Института цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцен

Спивак Ирина Михайлов)! Институт цитологии РАН, Санкт-Петсрбур

Официальные оппоненты: доктор биологических пау

Хайтлина Софья Юрьевп: Институт цитологии РАН, Санкт-Петербур

кандидат биологических нау Оловников Алексей Матвеевич Институт биохимической физики РАН, Москн;

Ведущая организация - Научно-исследовательский институт онкологш

им. проф. H.H. Петрова Росмедтехнологии, Санкт-Петербур|

Зашита состоится 19 декабря 2008 года в 12 ч на заседании

Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН

по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

Факс:+7(812)297 9341

Электронная почта: nvsmirnoff@yandex.ru

Сайт: www.cytspb.rssi.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Реферат разослан <у^> ноября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совет кандидат биологических наук

Каминская E.B

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Данные о редких в человеческой популяции случаях синдромов преждевременного старения, или прогерий, были опубликованы еще на рубеже XIX - XX веков. Именно к этому времени относятся первые систематические описания симптомов прогерии детей, опубликованные Хатчинсоном и Гилфордом (Hutchinson, 1886; Gilford, 1904), и прогерии взрослых, исследованной Вернером (Werner, 1904). При прогерии детей ускоренное старение развивается с самого рождения, в случае прогерии взрослых - после наступления полового созревания. Первое полное описание атаксии-телеангиэктазии было опубликовано Луи-Бар в 1941 г. (Louis-Bar, 1941). Позже признаки ускоренного старения были обнаружены в гетерогенном комплексе симптомов, характерных для клинического фенотипа больных этим синдромом.

Уже при описании фенотипов таких больных возникли первые представления о потенциальной возможности изучения закономерностей естественного старения на примере прогерий.

Новый этап в изучении синдромов преждевременного старения был начат с клонирования генов, мутации в которых лежат в основе заболеваний. Было обнаружено, что все изученные прогерии имеют моногенную природу (см. обзор Михельсон, 1996). К концу XX века они были условно разделены на три группы по характеру вызывающих их генетических дефектов. Синдром Вернера - наиболее часто встречающаяся и хорошо изученная прогерия взрослых - был отнесен к группе с генетическими дефектами репарационных факторов. Было выявлено, что в его основе лежат мутации в гене WRN (8р12-р11.2), который кодирует геликазу из семейства RECQ (Yu et al., 1996; Yu et al., 1997).

Вторую группу составляют случаи прогерии детей - синдрома Хатчинсона-Гилфорда, ассоциированные с нарушениями структуры ядерной ламины, в основе которых лежат мутации гена LNMA (1 q21.2), кодирующего ламин А/С (De Sandre-Giovannoli et al., 2003; Eriksson et al., 2003). Также к этой группе относят более редкие и хуже изученные случаи мутаций гена FACE-1/7.MPSTE24 (1р34), кодирующего металлопротеазу, принимающую участие в посттрансляционных модификациях ламина А/С (Shackleton et al., 2005).

В третью группу прогерий были выделены те, при которых нарушена передача сигнала о повреждениях ДНК, как это происходит при атаксии-телеангиэктазии,

причиной которой являются мутации в гене ATM(1 lq23.1) (Savitsky et al., 1995), который кодирует протсинкиназу из семейства фосфатидилннозитол-3-киназ (PI3K) (Lavin, Shiloli, 1997; McKinnon et al., 2004).

Исследования последних десятилетий показали, что клеточное старение следует рассматривать как комплекс гетерогенных, но взаимосвязанных механизмов, в которых прямо или опосредованно задействованы продукты генов, дефектных при прогериях, таких как WRN, LMNA и ATM. К этим механизмам относится дисфункция теломерных комплексов и укорочение теломер. Также с клеточным старением ассоциировано снижение эффективности репарации ДНК, сопровождающееся накоплением различных типов повреждений. Были описаны и специфические для клеточного старения изменения хроматина, оказывающие влияющие на транскрипционную активность и эффективность репарации ДНК (Ramirez et al., 2007).

В ходе исследования клеток больных синдромом Хатчинсона-Гилфорда, а также клеточных культур, полученных от престарелых доноров, были показаны структурные трансформации ядерной ламины, наступающие в результате аккумуляции аберрантного продукта гена LMNA, прогерина (Scaffidi, Misteli, 2006). Результатом исследований последних лет стало расширение представлений о функциях ядерной ламины, было показано ее участие в организации хроматина (Goldman et al., 2002), репликации ДНК, зависимой от РНК полимеразы II транскрипции, стабилизации теломерных комплексов, регуляции ядерных поровых комплексов (Goldman et al., 2004), а также в апоптозе (Earnshaw, 1995). Кроме того компоненты ядерной ламины задействованы в регуляции положения ядра в клетке (Starr, Han, 2002) и его сборки после митоза (Lopez-Soler et al., 2001), интеграции с цитоскелетом (Malone et al., 2003). Таким образом, в комплексе с современными данными об участии компонентов ядерной ламины и, в частности, ламина А в исключительно широком спектре клеточных процессов результаты, полученные Скафиди и Мистели, позволяют считать структурные изменения ядерной ламины базовым процессом для индукции маркеров старения, ассоциированных с различными уровнями клеточной регуляции (Scaffidi, Misteli, 2006).

Комплексный анализ морфофункциональных особенностей клеток, полученных от больных с различными прогериями, и их ассоциация с маркерами старения являются крайне актуальными задачами, так как позволяют судить о динамике развития клеточного и, как следствие, организменного старения. Такие клеточные линии дают возможность выявить роль отдельных генов в детерминировании процессов клеточного старения. Изучение различных маркеров старения на клеточных культурах больных прогериями

позволяет провести адекватное их сравнение с данными, полученными на клетках престарелых доноров и стареющих клетках в культуре (Михельсон, 1984).

Таким образом, при изучении культур клеток больных прогериями появляется возможность отделить генетически детерминированные особенности клеточного старения от тех, в которых главную роль играет действие среды на организм.

Цель и задами работы

Целью данной работы являлось комплексное изучение молекулярных механизмов старения на материале клеточных культур, полученных от больных синдромами преждевременного старения.

Для достижения этих целей были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить пролиферативные особенности клеток больных прогериями в комплексе со структурными изменениями актинового цитоскелета.

2. Изучить структурно-функциональные особенности клеток больных прогериями, ассоциированные с характером локализации ламина А/С.

3. Проанализировать уровень специфических гетерохроматиновых маркеров старения в клетках больных прогериями на примере ковалентных модификации Тп-Ме-К9 и Тп-Ме-К27 гистона 113 и у-изоформы белка НР1.

4. На основе полученных при исследовании клеточных культур данных уточнить диагноз больного прогерией А. Г.

Научная новизна работы

1. Впервые показана роль структуры ядерной ламины и актинового цитоскелета как маркеров старения при прогериях различной этиологии.

2. Впервые показано, что именно состояние ядерной ламины и актинового цитоскелета лежит в основе ламинопатии при атипичной форме синдрома Вернера. Полученные данные могут быть использованы для уточнения диагноза и сопряженных с ними клинических рекомендаций при различных формах прогерий, в частности для пациента А.Г.

3. Впервые показано, что в клетках больных прогериями, возникающими при нарушении передачи сигнала о повреждении ДНК, некоторые гетерохроматиновые маркеры старения не выявляются.

Теоретическая и практическая значимость работы

Показана роль ядерной ламины и актинового цитоскелета в процессах клеточного старения в норме и при прогериях различной этиологии. Обоснована возможность использования морфологии ядерной ламины как надежного маркера старения клеток в культуре.

Подробное описание клеточного штамма 1609 позволяет расширить базу имеющихся в Лаборатории радиационной цитологии экспериментальных объектов для геронтологических исследований.

На основе полученных результатов выработана совокупность тестов для определения реального биологического возраста донора при исследовании его первичных фибробластов. Показана возможность использования штаммов диплоидных фибробластов для оценки эффективности потенциальных геропротекторов.

Показана эффективность использования тестов клеточных культур для уточнения диагноза в случаях прогерий неясной этиологии с выработкой последующих клинических рекомендаций, что будет способствовать улучшению качества жизни пациентов за счет оценки рисков и своевременному и адекватному назначению терапии сопутствующих заболеваний.

Положения, выносимые на защиту

1. Структурная организация ядерной ламины является надежным показателем старения на клеточном уровне для всех исследованных типов прогерий.

2. В основе клинического фенотипа больного прогерией взрослых — атипического синдрома Вернера - лежат выраженные изменения ядерной ламины и актинового цитоскелета клеток.

3. Прогерии различной этиологии различаются по степени выраженности маркеров клеточного старения.

4. Сочетание и количество различных маркеров старения является основой для уточнения клинического диагноза при прогериях неясной этиологии.

Апробация диссертации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. Материалы диссертации были представлены на VI Европейском конгрессе Международной ассоциации геронтологии и гериатрии (Санкт-Петербург, 2007), IV съезде Российского общества

биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), а также на научных семинарах Лаборатории радиационной цитологии Института цитологии РАН.

Финансовая поддержка работы

Работа выполнена при финансовой поддержке программы «Фундаментальные науки - медицине», 2005 - 2007 гг.

Структура и объем диссертации

__. л

Диссертация изложена на /О) страницах машинописного текста, содержит Г~ гистограмм, таблиц, иллюстрирована /^рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, глав собственных

исследований, обсуждения и выводов. Список использованной литературы включает /// источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клинический фенотип доноров и клеточные штаммы

Больной прогерией взрослых А.Г. был исследован в возрасте 26 лет. Данных о наличии в семейной истории наследственных заболеваний получено не было. В 20-летнем возрасте проходил терапию преднизолоном с диагнозом "аутоиммунный гепатит". В начале третьей декады жизни за короткий промежуток времени его организм претерпел комплекс быстро прогрессирующих изменений, сравнимых по фенотипическим и клиническим показателям с изменениями пожилых людей.

Пациент А.Г невысокого роста, пропорции лицевой части черепа изменены (сужение основания носовой перегородки, глаза близко поставленные). В течение срока наблюдения было описано развитие глубоких морщин лица, прекращение роста волос на лицевой зоне. Отмечались признаки липодистрофических изменений, выражавшихся в потере веса, истончении слоя подкожной жировой клетчатки, в связи с чем, кожа тела подверглась провисаниям, изменились пропорции тела (тонкие конечности). На биопсии кожи была обнаружена атрофия волосяных фолликулов, а также сальных и потовых желез. При клиническом обследовании был выявлен остеопороз суставов пальцев и коленных суставов. Показано значительное уменьшение размеров надпочечников, инволюция тимуса. Первоначальный диагноз, поставленный при анализе фенотипических особенностей донора А.Г. - синдром Вернера.

Штамм фибробластов 1609 был получен от больного А.Г. в Лаборатории радиационной цитологии ИНЦ РАН в ходе стандартной процедуры из эксплантата кожи предплечья. При первоначальных исследованях было обнаружено, что фибробласты 1609 демонстрируют сниженный по сравнению с фибробластами здорового донора потенциал удвоения популяции. Кроме того, для клеточного штамма 1609 была показана низкая скорость пролиферации. Для клеток больного А.Г. характерны высокая скорость накопления стабильных хромосомных аберраций (СХА). Уровень СХА в фибробластах 1609 был сравним с показателями по этому критерию, свойственными 60-летнему человеку (Ковина и др., 2002).

Больные атаксией-телеаигижтазией

Клинический фенотип атаксии-телеангиэктазии был обнаружен у двух пациентов, мальчика 4 лет (П. К.) и девочки 12 лет (В. С.).

При нормальном умственном развитии речь больных была затрудненной. Наблюдалось нарушение координации движений: больные испытывали затруднения при выполнении классических тестов - хождение по прямой линии и касание указательным пальцем носа при закрытых глазах. Данные изменения были связаны с неврологическими патологиями разной степени тяжести. Во всех случаях диагностировалась мозжечковая атаксия. Пациенты характеризовались сниженным иммунным статусом, были в большей степени подвержены инфекционным заболеваниям (особенно легочным инфекциям). Характерной особенностью было наличие телеангиэктаз (очаговой дилятации сосудов с истончением их стенки). Телеангиэктазы особенно хорошо заметны у пациентов на слизистой оболочке глаз, но их локализация может включать участки под глазами, губы, края носа, наружную и внутреннюю поверхность щек, десен, а также слизистую носа, зева, гортани и др. Кожа пациентов была сухой, предрасположенной к различным поражениям, особенно в участках, где кожные пласты естественно источены.

Штамм фибробластов АТ28Р был получен от больного атаксией-телеангиэктазией П. К. в Лаборатории радиационной цитологии ИНЦ РАН в ходе стандартной процедуры из эксплантата кожи предплечья. При первоначальных исследованиях было показано, что клетки данного штамма демонстрируют повышенный по сравнению с контролем уровень чувствительности к действию у-облучения (Хамасуридзе и др., 1999). Для штамма АТ2ЭР была также продемонстрирована замедленная динамика стабилизации в ядре белка Р53 после воздействия сублетальной дозы у-облучения (Смирнова и др., 1999; Спивак и др., 2005).

Штамм фибробластов A T8SP был получен от больной атаксней-телеангиэктазией В. С. в Лаборатории радиационной цитологии ИНЦ РАН в ходе стандартной процедуры из эксплантата кожи предплечья.

В качестве справочных материалов при анализе клинических и фенотипических особенностей пациентов и для сопоставления с данными международных реестров были использованы специализированные Интернет ресурсы: http://wfvw.genetests.org littp://mvw. nebi. ni т. it Hi. go v

В качестве контрольного был использован штамм фибробластов VH-10, который был получен из эксплантата кожи условно здорового донора. Штамм был предоставлен проф. А. Кольман (Стокгольмский университет, Швеция) (Nygren et al., 1994; Kolman et al., 1997).

Клетки культивировали в питательной среде DMEM (Gibco, США) с добавлением 12 % фетальной сыворотки телят (Hyclone, США) и антибиотиков (100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, Sigma, США). Клетки выращивали в пластиковых флаконах, на чашках Петри (Nunclon, США), а также на предметных стеклах, помещенных в чашку

Петри, в СОг-инкубаторе при 37 °С, 5-7 % ССЬ в атмосфере повышенной влажности.

Иммунофлуоресцентный анализ

Клетки выращивали на поверхности предметных стекол, помещенных в чашки Петри. После достижения клетками субконфлюэнтного состояния осуществляли воздействие на них с помощью экспериментальных агентов и инкубировали в течение различных промежутков времени (или использовали интактные образцы). Далее отмывали ростовую питательную среду раствором PBS (Биолот, РФ). После промывки PBS клетки фиксировали 10 мин в 3,7 %-ном растворе формальдегида в PBS на льду, продолжали фиксацию PN в 70 %-ном этаноле. Отмывали от фиксатора раствором PBS ЗХ быстро и в течение 30 мин на качалке. Далее для перфорации плазматической мембраны инкубировали в течение 5 мин с 3 %-ным раствором Triton Х-100 (Helicon, Россия) на PBS. Проводили отмывку аналогично предыдущим. Препараты инкубировали от 30 мин до PN в 1 %-ном растворе BSA (Sigma, США) на PBS, который также отмывали. Для визуализации различных клеточных структур образцы инкубировали последовательно с первыми антителами против клеточных белков и вторыми антилами против IgG первых антител. Использовали вторые антитела, помеченные различными флуорофорами.

Первые антитела: a-beta Actin (AC-15), mouse monoclonal IgG (ab6276 Abeam), a-

Lamin A/C (N-18), goat polyclonal IgG (sc-6215 Santa Cruz Biotechnology, Inc), rabbit

polyclonal IgG (abl 1174 Abeam), Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys9), rabbit polyclonal IgG (07442 Upstate), a-trimethyl-Histone H3 (Lys27), rabbit polyclonal IgG (07-449 Upstate), a-HPl gamma, rabbit polyclonal IgG (abl0480 Abeam).

Вторые антитела: Anti-Goat IgG (whole molecule)-FITC antibody produced in rabbit (F9012 Sigma-Aldrich Co.), Alexa Fluor® 488 F(ab')2 fragment of goat anti-mouse IgG (H+L) (A11017 Invitrogen), Rhodamine Red™-X goat anti-rabbit IgG (H+L) (R6394 Invitrogen).

Антитела разводили в 0,1 %-ном растворе BSA (Sigma, США) в PBS. Между инкубациями с антителами стекла промывали 30 мин в 0,1 %-ном растворе Tween-20 (Хеликон, РФ) в PBS.

Актиновый цитоскелет выявляли окраской клеток родамин-фаллоидином (R415 Invitrogen). Для этого после обработки первыми и вторыми антителами родамин-фаллоидин добавляли на 15 мин с последующей отмывкой PBS.

После обработки препараты заключали в Mounting Medium (sc-24941, Santa Cruz) для замедления выгорания флуорофоров.

Все тесты проводили в 2-3 повторениях для анализа воспроизводимости полученных результатов. Во всех экспериментах использовали в качестве контроля специфичности окраски препараты, инкубированные только со вторыми антителами.

Микроскопия и анализ изображений

Анализировали препараты с помощью лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа Zeiss LSM 5 PASCAL. Для визуализации флуорофоров были использованы аргоновый (488 нм) и гелиево-неоновый (543 нм) лазеры. Для получения изображений использовали сканирующий модуль микроскопа, управляемый с помощью компьютера и соответствующего программного обеспечения LSM 5 PASCAL. Для анализа полученных изображений (морфометрические характеристики, определение уровней интенсивности флуоресценции) использовали программы LSM 5 PASCAL и «WCIF ImageJ 1.37т» (National Institute of Health, Maryland, USA).

Изображения клеток в фазовом контрасте были получены с использованием комплекта оборудования, включающего окулярный адаптер (Аконд, РФ), цифровую фотокамеру Canon Power Shot А640 и персональный компьютер. В качестве программы для управления съемкой использовалась inPhoto Capture.

Определение числа прикрепившихся к субстрату фибробластов Подсчет числа клеток, прикрепившихся за определенное время к субстрату, проводили с помощью модифицированного метода Karecla (Karecla et al., 1994). Использовали 96-луночные платы (Nunc, США) для иммуноферментного анализа. Снятые с культуральной

подложки клетки промывали трижды средой DMEM без сыворотки с последующим их осаждением при 1000 g в течение 5 мин. Затем клетки в среде без сыворотки высевали в 96-луночные платы по 3 тыс. клеток на лунку. После инкубации в течение определенного времени неприкрепивщиеся клетки удаляли, а прикрепившиеся фиксировали в течение 10 мин при комнатной температуре 4 %-ным раствором формальдегида в PBS и окрашивали 20 мин 0,1 %-ным раствором генциан-виолета. Краситель растворяли 10 %-ной уксусной кислотой. Оптическую плотность раствора измеряли при длине волны 570 нм на приборе Multiskan. Была построена калибровочная кривая, с помощью которой по величине оптической плотности растворов в лунках при длине волны 570 нм судили о количестве клеток, адгезировавших к субстрату. В отдельных случаях количество прикрепившихся клеток подсчитывали с помощью камеры Горяева.

Определение миграционной активности клеток

Для определения миграционной активности фибробластов использовали модель миграции клеток в рану. Фибробласты культивировали до образования плотного монослоя. Перед манипуляцией клетки культивировали в течение суток в ростовой среде без сыворотки для предотвращения закрытия будущей раны за счет пролиферации клеток. Пластиковым наконечником с использованием вакуумного насоса моделировали рану на поверхности монослоя. Культивировали клетки в ростовой среде без сыворотки. Через 24 ч анализировали степень закрытия раны мигрировавшими в нее клетками.

Обработка результатов

Обработку результатов проводили с использованием электронных таблиц MS Excel 2007. Она была проведена общепринятыми для медико-биологических исследований методами (расчет средней арифметической величины, среднего квадратичного отклонения, ошибки репрезентативности для каждого параметра в исследуемых группах клеток, сравнение средних значений по критерию Стьюдента с определением достоверности различий).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Пролиферативные особенности клеток больных прогериями

При параллельном культивировании фибробластов штаммов 1609, AT2SP, AT8SP и VH-10 было установлено:

1. Фибробласты больных прогериями имеют отличную от контроля динамику прикрепления к культуральной подложке (рис. 1). При культивировании на поверхности пластиковой культуральной платы без специальной обработки через 30 мин фибробласты

штамма 1609 прикрепились к культуральной подложке в количестве, сходном с показателями контрольного штамма (31, 08 % клеток). Через 1 ч культивирования штамм 1609, как и штамм VI1-10, достигал своего максимума по количеству прикрепленных клеток (86,20 %). Но на следующей временной точке (1 ч 30 мин) было обнаружено, что способность клеток штамма 1609 к адгезии нестабильна, и доля прикрепленных клеток падает до уровня, соответствующего 38,65 % прикрепленных клеток. В то время как показатели контрольного штамма уже существенно не меняются в этот период времени.

К особенностям прикрепления клеток штаммов АТ28Р и АТ8ЭР следует отнести низкий уровень прикрепления через 30 мин (12,03 %, 8,33 %, соответственно). К временной точке I ч 30 мин процент прикрепившихся клеток постепенно увеличивается и становится сравнимым с контролем 92, 21 % и 90,34 % для штаммов АТ28Р и АТ88Р, соотвественно.

Рис. 1 Доля клеток (в % ог общего числа) штаммов \ H-10, 1609. .\T2.SI' и ЛТ88Р. прикрепившихся к необработанной поверхности культуральной платы через различные промежутки времени .

У11-10 Штамм 1609 А'ГСБР АТ8БР

При использовании в качестве культуральной подложки поверхности пластиковой платы, на которой в течение 48 ч культивировали фибробласты контрольного штамма УН-10, количество прикрепленных на раннем сроке (30 мин) клеток достоверно увеличивается по сравнению с показателями прикрепления к необработанной подложке в штаммах УН-10, АТ28Р и АТ88Р. Особенно значительное увеличение количества клеток, прикрепленных к обработанной поверхности, на раннем сроке показано для штаммов АТ2ЭР и АТ88Р (21,07 % и 18,65 %, соответственно). Влияние обработки поверхности предкультивированием на эффективность прикрепления клеток штамма 1609 на стадии 1 ч 30 мин оказалось незначительным (42,34 %) (рис. 2).

Рис. 2 Доля клеток (в % от общего числа) штаммов V Н10, 1609, АТ2БР и \T8SP, прикрепившихся к поверхности, обработанной предварительным культивированием клеток, через различные промежутки времени.

2. Рост фибробластов штамма 1609 осуществлялся с нарушением параллельной ориентации клеток при образовании монослоя, которая характерна для нормальных фибробластов человека в культуре. Также регистрировались многочисленные случаи крисс-кросс ориентированности клеток (рис. 3, б).

Рис. 3 Рост фибробластов в культуре: (а) штамм УН-10, (б) штамм 1609 (увеличен.: объектив - 40Х).

При культивировании фибробластов штаммов АТ2БР и АТ8ЭР нарушений структуры и плотности монослоя выявлено не было. Пространственная ориентация клеток этих штаммов была сравнима с контролем.

3. Фибробласты штамма 1609 имеют значительные отличия от контроля по показателю плотности монослоя. Так, если фибробласты УН-10 в конфлюэнтном состоянии насчитывали 141±3,53о.95 кл./1 мм2, то плотность монослоя фибробластов штамма 1609 не превышала 81±2.49о,95 кл./1 мм2. Фибробласты штаммов АТ28Р и АТ88Р по показателю

плотности монослоя были сравнимы с контролем - насчитывали 134±] 1,70о,95 кл./1 мм2 и 140±3,85о,95 кл./1 мм2, соотвественно.

4. При искусственном создании раневых поверхностей в конфлюэнтном слое клеток было отмечено, что фибробласты здорового донора штамма УН-10 через 24 ч после манипуляции демонстрируют эффективный выход в раневое пространство (рис.4, а). Заполнение раны клетками контрольного штамма регистрировалось через 36 ч после проведения манипуляции. Для фибробластов штамма 1609 была характерна низкая динамика выхода клеток в рану (рис.4, б), заполнение раневой поверхности было зарегистрировано через 3 сут, мигрировавшие клетки демонстрировали более низкий показатель плотности в 1мм2, чем клетки в контроле (табл. 1).

Фибробласты штамма АТ25Р и АТ85Р так же демонстрировали более низкую динамику выхода в раневое пространство, чем клетки контрольного штамма. Среди особенностей клеточной подвижности фибробластов этих штаммов - отличная от контроля и клеток штамма 1609 траектория движения (рис.4, в, г). Заполнение раневой поверхности было зарегистрировано на 3 суг. наблюдения для штамма АТ8БР и 4 сут. -для штамма АТ25Р. Мигрировавшие клетки демонстрировали более низкий показатель плотности в 1мм2, чем клетки в контроле (табл. 1).

Табл. 1 Количество клеток штаммов УН-10,1609, АТ2вР и АТ88Р

Кл./1 мм2 УН-10 1609 АТ28Р АТ88Р

Интактн. монослой 141,00±3,530>95 81,ОО±2.490,95 134,00±11,70о,95 140,00±3,85о.95

Раневое пр-во через 24 ч 94,ОО±5,770,95 16, ОО±3,330,95 17,66±3,730,95 18,00±3,33о,95

Заполн. раневое пр-во 131,33±2,330.95 55,00±5,54О,95 Ю7,33±14,820,95 113,00±4,23о,95

Рис. 4 Выход в раневое пространство фибробластов штаммов УН-Ю (а), 1609 (б), АТ28Р (в) и АТ88Р (г) через 24 ч после моделирования рапы, белыми линиями отмечены границы рапы (увеличен.: объектив - 5Х, окулярн. адат. -5Х).

,.;■ «»яаащди; ИШШ

Исследование структуры актинового иитоскелета

в фибробластах больных прогериями

Морфологические и пролиферативные особенности фибробластов больных прогериями позволили нам предположить наличие структурных изменений в организации актинового цитоскелета.

При иммуноцитохимическом окрашивании клеток с использованием антител к р-актину и родамин-фаллоидина было показано, что пространственная организация актинового цитоскелета фибробластов штамма 1609 имеет значительные отличия по сравнению с фибробластами здорового донора (рис. 6, а). К таким отличиям относится дефицит в центральной области цитоплазмы сформированных актиновых филаментов. Вся клеточная популяция фибробластов штамма 1609 делится по структуре актинового цитоскелета на два типа клеток. К первому типу относятся клетки вытянутой формы, с низкой способностью к распластыванию, в цитоплазме которых с помощью окраски родамин-фаллоидином в субъядерной области выявляются гранулярные актиновые структуры, а актиновые филаменты регистрируются в незначительном количестве только в терминальных зонах отростков и в кортикальной области цитоплазмы (рис. 6, б).

Вторая субпопуляция фибробластов штамма 1609 имеет более распластанную форму с аберрантно многочисленными филоподиями. Центральная область цитоплазмы этих клеток также лишена актиновых филаментов, в основе филоподий и в кортикальных зонах актиновые филаменты регистрируются, но их количество незначительно по сравнению со структурой актинового цитоскелета фибробластов здорового донора (рис. 6,

в).

К структурным особенностям актинового цитоскелета фибробластов больных атаксией-телеангиэктазией следует отнести высокую степень колокализации окраски при использовании антител к Р-актину и родамин-фаллоидина, которая наблюдается в клетках штамма АТ88Р. В субъядерной области цитоплазмы так же, как и в клетках штамма 1609, регистрируются гранулярные актиновые структуры. Дефицит актиновых филаментов не выражен, но по сравнению с клетками здорового донора наблюдается асимметрия в формировании стеес-фибрилл. Фибробласты больных атаксией-телеангиэктазией имеют специфическую, асимметричную форму, в большинстве клеток ядро смещается относительно центральной оси клетки (рис. 6, г).

Рис. 6 Иммуноцитохимичеекое окрашивание актинового цитоскелета: I - красный -родамин-фаллоидин, зеленый - ß-актин, II - реплики кадров с использованием режима «рейнбоу», III - окрашивание родамин-фаллоидином (фотографии в режиме «глоу») клеток штаммов а -. VH-10, б, в - 1609, г - AT8SP (шкала на всех фото- 20 мкм).

Структурно-функциональные особенности клеток больных прогериями.

ассоциированные с характером организации ядерной ламины

Путем непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания ламина А/С нами был проведен анализ структурных особенностей ядерной ламины фибробластов штаммов 1609, AT2SP, AT8SP, в качестве контрольного были использованы фибробласты здорового донора штамма VH-10.

Большая часть фибробластов контрольного штамма VH-10 имеет классическую эллипсоидную форму ядра (рис. 7, а), в то время как значительная часть фибробластов 1609 демонстрирует измененный по сравнению с контролем характер стабилизации ламина А и, как следствие, имеет аберрантную морфологию ядерной оболочки. Как крайняя степень изменений нами была отмечена фестончатая форма ядерной оболочки, сформированная многочисленными инвагинациями различной локализации и глубины, а также структурами, которые в англоязычной литературе обозначаются термином «ЫеЬ» (англ.), т.е. грибовидный нарост (рис. 7, б).

Дополнительно было отмечено, что при окрашивании антителами к ламину А/С клетки штамма 1609 демонстрируют низкий уровень сигнала в интронуклеарном пространстве, в то время как для штамма VH-10 типична локализация ламина А/С внутри ядра.

В ходе исследования фибробластов 1609 на более позднем пассаже (28 PD) было обнаружено, что часть клеток демонстрирует наличие цитоплазматических агрегатов, которые специфически окрашивались антителами к ламину А/С (рис. 8, б).

Кроме того, в штамме 1609 были обнаружены интерфазные клетки, демонстрировавшие при иммунофлуоресцентном окрашивании ламина А/С не только аберрантную морфологию ядерной оболочки, но и нарушение ее целостности (рис. 9).

В фибробластах здорового донора VH-10 и фибробластах больных атаксией-телеангиэктазией штаммов AT2SP и AT8SP ядер с множественными аномалиями, характерной фестончатой формы, клеток с разрывами ядерной оболочки, а также цитоплазматических агрегатов, окрашенных антителами к ламину А/С обнаружено не было.

Рис. 7 Иммунофлуоресцентное окрашивание ламина А/С в фибробластах здорового донора УН-10 (а) и в фибробластах 1609 (б) (шкала - 10 мкм).

{ Л

Рис. 8 Иммунофлуоресцентное окрашивание ламина А/С в фибробластах штаммов УН-Ю (а) и 1609 (б); в цитоплазме фибробластов штамма 1609 регистрируются многочисленные окрашенные агрегаты (шкала -10 мкм).

Рис. 9 Ядерная оболочка фибробластов штамма 1609 при иммунофлуоресцентном окрашивании ламина А/С: примеры аберрантных образований и разрывов (шкала -5 мкм).

Накопление аномалий морфологии ядерной оболочки при культивировании

Одним из надежных маркеров клеточного старения по представлениям Скафиди и Мистели является не только абсолютное количество клеток с аберрациями ядерной оболочки, но и скорость их накопления в процессе культивирования (8са5йсП, РуШеИ, 2006). С увеличением количества пройденных пассажей для фибробластов контрольного штамма УН-10 и штаммов АТ28Р и АТ88Р, как и штамма 1609, тоже было характерно накопление клеток с изменениями формы ядерной оболочки. Сравнение проводилось на на 12 и 25-м пассажах.

При поклеточном анализе все проанализированные ядра были разделены на три группы: с нормальной эллипсоидной формой (1), с наличием инвагинаций (2), несущие «блеб»-структуры (3).

С увеличением числа пассажей от 12 до 25-го в контрольных фибробластах УН-10 происходит рост количества клеток с аномалиями ядерной оболочки, были зарегистрированы, как инвагинации, так и блеб-структуры (рис. 10). Количество клеток с аномалиями ядерной оболочки достоверно возрастает к 25-му пассажу, причем количество клеток с инвагинациями и блеб-структурами становится практически одинаковым.

Рис. 10 Доля фибробластов (в % от общего чис^а) штамма \ 11-10 без

аномалий морфологии ядерной оболочки (1), с инвагинациями (2), с

блеб-структурами (3) на 12 и 25-м пассажах .

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 О

1 2 3

Исследование штамма АТ28Р показало, что рост количества клеток с инвагинациями и блеб-структурами происходил быстрее, чем в контроле. Кроме того, в отличие от контрольного штамма на 12 и на 25-м пассажах процентная доля клеток с

инвагинациями достоверно превышала процентную долю клеток с блеб-структурами (рис. 11).

Рис. 11 Доля фибробластов (в % 01 общею числа) штамма ЛТ2М' бе 1 аномалий морфологии ядерной оболочки (1), с инвагинациями (2),

с блеб-сфукчурами (3) на 12 и 25-м пассажах.

100 :

90 I.........................................................................................................................................................................

80 \ ■ ----г—---------

70 -|...........{ВКВ..............................................................................................................................................

При сравнении по данному критерию фибробластов больных атаксией-телеангиэктазией штаммов АТ2БР и АТ85Р, исследованных на уровне 12-го пассажа, не было установлено достоверных отличий в динамике накопления штаммами клеток с инвагинациями и блеб-структурами (рис. 12).

Рис. 12 Доля фибробластов (в % от общего числа) штаммов АТ28Р и \ISSI' бсч аномалий морфологии ядерной оболочки (I), с инвагинациями (2), с блеб-структурами (3) на уровне 12-го пассажа.

80 70 60 50 40 30 20 10 0

ЯА'гаР пат88р

При сравнении всех исследованных штаммов на уровне 25-го пассажа было установлено, что штамм 1609 содержит значительно большее количество клеток с аномалиями ядерной оболочки, чем контрольные фибробласты УН-10, и достоверно больше, чем штамм АТ28Р (рис. 13). Как и в случае штамма АТ25Р, в штамме 1609 на уровне 25-го пассажа доля клеток с инвагинациями достоверно превышает долю клеток с блеб-структурами, но по сравнению с штаммом АТ2БР эффект менее выражен. Таким образом, оба штамма, полученные от больных прогериями, имеют достоверные отличия от контроля УН-10, для которого на уровне 25-го пассажа не показано достоверных различий между процентной долей клеток с инвагинациями и процентной долей клеток с блеб-структурами.

Рис. 13 Доля клеток (в % от общего числа) штаммов УН-10, АТ28Р и 1609 без аберраций ядерной оболочки, с инвагинациями, с блеб-структурами, с сочетанием обоих типов аберраций.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Отличительной чертой штамма 1609 от штаммов АТ2БР и УН-10 была колокализация инвагинаций и блеб-структур в значительном проценте клеток (10,5 %), в то время как в других исследованных штаммах эти дефекты морфологии ядерной оболочки практически не колокализовались в одной и той же клетке.

Исследование хроматиновых маркеров старения в фибробластах больных прогериями

При иммунофлуоресцентном анализе специфических хроматиновых маркеров, к

которым относятся ковалентные модификации НЗ гистона (маркер конститутивного

гетерохроматина МеЗ-НЗ-К9 и маркер факультатутивного гетерохроматина МеЗ-НЗ-К27)

----------------------------

¿1

УН-10

АТ25Р

ЕЗ без абсрр. Ее инвагинац.

□ с блсб-стр.

□ с инвагинац и блсб-стр.

и у-изоформа белка НР1 (Heterochromatin protein 1), в клетках больных прогериями были выявлены значительные отличия от контроля.

Было показано, что клетки штамма 1609 демонстрируют значительное по сравнению с контрольными фибробластами увеличение доли клеток с низкими, допороговыми значениями интенсивности флуоресценции при иммунофлуоресцентном выявлении всех исследованных маркеров. Так, при окрашивании МеЗ-НЗ-К9 фибробласты штамма 1609 демонстрируют низкий уровень флуоресценции (15 - 75 ед.) в 60 % клеток, в то время как для штамма VH-10 этот уровень сигнала был показан только в 12 % клеток, а максимум частоты клеток контрольного штамма приходится на диапазон 105 - 165 ед. интенсивности флуоресценции (рис. 14, а). При окрашивании МеЗ-НЗ-К27 низкие значения интенсивности флуоресценции (15-45 ед.) были показаны в 53 % клеток штамма 1609 и лишь 10 % клеток штамма VH-10, а максимум частоты клеток контрольного штамма приходится на диапазон 45 - 105 ед. интенсивности флуоресценции (рис. 14, б). При окрашивании у-изоформы НР1 низкие значения интенсивности флуоресценции были выявлены в 50 % клеток штамма 1609 и 10 % клеток штамма VH-10 (рис. 14, в).

При исследовании фибробластов больной атаксией-телеангиэктазией штамма AT8SP было выявлено, что маркеры МеЗ-НЗ-К9, МеЗ-НЗ-К27 и НР1у детектируются во всех клетках, причем для МеЗ-НЗ-К.9 и МеЗ-НЗ-К27 показана их гиперэкспрессия. Так, при окрашивании МеЗ-НЗ-К9 во всех клетках детектировался сигнал с максимальным уровнем интенсивности флуоресценции (195 - 225 ед.), в то время как в контроле этому уровню сигнала соответствует 11 % клеток, и только 3 % клеток штамма 1609 (рис. 14, а). При окрашивании МеЗ-НЗ-К27 максимальное количество клеток штамма AT8SP (70 %) демонстрирует интенсивность флуоресценции в диапазоне 75-105 ед. Для штамма VH-10 данный уровень сигнала был показан в 27 % клеток, ив 17 % клеток штамма 1609 (рис. 14, б). При окрашивании у-изоформы НР1 в клетках штамма AT8SP был показано, что большинству клеток (70 %) соответствует интенсивность флуоресценции 45 - 75 ед. В контроле этому диапазону соответствует 50 % клеток. Но в отличие от контроля в штамме AT8SP не регистрируются клетки с низкой (15 - 45 ед.) и высокой (105 - 135 ед.) интенсивностью флуоресценции (рис. 14, в).

Рис. 15 Распределение клеток штаммов УН-10, 1609 и АТ88Р по диапазонам интенсивности флуоресценции при окрашивании МеЗ-НЗ-К9 (а), МеЗ-НЗ-К27 (б) и НР1у (в).

100

УН-10 Усредн. интенс. флуоресц. (отн.ед.)

1609

АТ85Р

□ 30 1360 СЭ90 □ 120 0150 □ 180 О210

УН-10 Усредн. интенс. флуоресц. (отн.ед.)

УН-10 Усредн. интенс, флуоресц. (отн.ед.)

1609 АТ88Р

□ 30 П60 П90 В120 □ 150 180 210

1609 АТ88Р

□ 30 О60 П90 0120 «150 180 210

ОБСУЖДЕНИЕ

Прогерии чрезвычайно редки в человеческой популяции, изучение каждого отдельного случая является важным как для практической медицины, так и для проведения фундаментальных исследований в рамках экспериментальной геронтологии. Так как клинический фенотип синдромов различной молекулярной природы зачастую схож то, для правильного диагностирования необходимы исследования, проводимые на клеточных культурах доноров.

При первоначальном исследовании больного А.Г. этот случай был атрибутирован как синдром Вернера с атипическим течением заболевания (Ковина и др., 2002). При последующем анализе клинического фенотипа больного было установлено, что он включает ряд нехарактерных для классического синдрома Вернера проявлений (липодистрофические изменения, поражение печени и др.). В комплексе с особенностями культуры первичных фибробластов донора А.Г. эти данные позволили нам сопоставить случай больного А.Г., с описанными Ченом и соавторами случаями атипического синдрома Вернера (Chen et al., 2003). Мы предположили, что в основе прогероидных и липодистрофических изменений лежит развитие ламинопатии в результате мутации в гене LMNA, кодирующем ламин А/С (Смирнова и др., 2008, а).

Анализ аномалий морфологии ядерной оболочки при окрашивании ламина А/С и регистрация их частоты, а также выявление отличий в характере локализации ламина А/С в исследуемой культуре клеток являются эффективным методом диагностики ламинопатических изменений. Полученные нами данные о значительных отличиях от контроля морфологии ядерной оболочки в клетках штамма 1609 (множественные инвагинации и блеб-структуры, колокализованные в одной клетке) позволяют нам говорить о сходствах с аномалиями, наблюдаемыми в клетках больных синдромом Хатчинсона-Гилфорда (прогерия детей) и атипическим синдромом Вернера. В то же время известно, что при классическом синдроме Вернера подобных деформаций ядерной оболочки не выявлено (Adelfalk et al., 2005).

В ходе исследований последних лет было установлено, что схожие структурные трансформации ядерной ламины, наступающие в результате аккумуляции аберрантного продукта гена LMNA - прогерина, были обнаружены и в клетках престарелых доноров (Scaffidi, Misteli, 2006). Было показано, что прогерин может аккумулироваться в ходе старения организма (McClintock et al., 2007). Накопление аномалий морфологии ядерной оболочки прослеживается также в культуре клеток с увеличением числа удвоений популяции (Cao et al. 2007), что было подтверждено нами на примере фибробластов

здорового донора штамма УН-10, а также фибробластов больного атаксией-телеангиэктазией штамма АТ28Р. Штаммы больных прогерией отличает более высокий уровень клеток с аберрациями ядерной оболочки, а также соотношение различных типов повреждений (Смирнова и др., 2008, а).

Кроме того, при иммунофлуоресцентном исследовани в клетках штамма 1609 были обнаружены аномальные цитоплазматические агрегаты, окрашиваемые антителами к ламину А/С. В клетках штамма 1609 позднего пассажа (29 пассаж) при окраске ламина А/С были выявлены морфологические дефекты и разрывы (Смирнова и др., 2008, а), которые можно было связать с нарушением динамики организации ядерной оболочки в процессе митоза или со снижением ее механической прочности (Сао й а1., 2007).

Накопление в цитоплазме структур, окрашиваемых антителами против ламина А/С, было описано и при исследовании клеток больных синдромом Хатчинсона-Гилфорда фесИа! е1 а1., 2007). В норме ламин А в ходе митоза диссоциирован в цитоплазме и не связан с фрагментами ядерной оболочки. В работе Дечета с соавторами установлено, что продукты аберрантного процессинга преламина А, будучи перманентно фарнезилированными, остаются связанным с фрагментами ядерной оболочки в течение митоза. Это приводит к задержке вступления в цитокенез и к замедлению его прогрессии, неэффективному перераспределению компонентов ядерной оболочки между ядрами дочерних клеток. Нарушения пагубно влияют также на пространственно-временные характеристики клеточного цикла в целом.

Подобная дерегуляция цитокенеза, сборки ядерной оболочки и динамики клеточного цикла, обусловленная стабилизацией прогерина, обнаруживается и в клетках престарелых доноров, т.е. характерна и для естественного старения (Сао е! а1., 2007).

Известно, что ламин А/С не только предопределяет размер, форму и прочность ядерной оболочки, но и задействован в процессах интеграции нуклео- и цитоскелета. Для реализации перечисленных функций ламин А/С взаимодействует с представителями семейства ЯиЫ-доменных белков и белками подсемейства Ыеярпп, которые пронизывают наружную и внутреннюю ядерные мембраны и связывают ядерную ламину с актиковьгми филаментами цитоскелета (Тгиг й а1., 2006).

В этой связи полученные нами данные о дефиците актиновых филаментов в клетках штамма 1609 в сочетании с показанным в них высоким уровнем нуклеоскелетных аберраций могут быть ассоциированы с возможным нарушением интеграции нуклео- и актинового цитоскелета. Мутации гена ЬМИА, выявленные при атипическом синдроме Вернера, оказывают влияние на строение сайтов белок-белковых взаимодействий ламина

A (Bonne, Levy, 2003; Vigoureux et al., 2003), что может сказаться на уровне сродства ламина А и N-концевого домена белка SUN.

Ma мышиных клеточных культурах с нокаутным LMNA'1' было показано, что формирование актииовых филамснтов в субъядерной области цитоплазмы зависит от взаимодействия с ядерной ламиной. В условиях нарушения интеграции актиновые филаменты неразвиты, а в примыкающей к ядру области наблюдаются скопления точечных агрегатов, окрашиваемых родамин-фаллоидином (Broers et al., 2004). Схожие изменения были продемонстрированы нами у фибробластов штамма.

Актиновый цитоскелет является обязательным участником адгезии, способствуя стабилизации множественных взаимодействий и определяя форму клетки (Geiger et al., 2001). Последствиями структурных изменений актинового цитоскелета могут стать многочисленные нарушения адгезии к субстрату и клеточной подвижности (Lee et al., 2007). Так, нами было показано снижение стабильности адгезии с культуральной подложкой, ограничение двигательной активности, а также вероятный дефект межклеточных контактов (на основании данных о нарушении ориентации и ограниченной плотности монослоя) фибробластов штамма 1609. Адгезия клеток к белкам внеклеточного матрикса (ВКМ) является одним из пусковых механизмов внутриклеточной сигнализации. В контексте ослабления взаимодействия с субстратом фибробластов штамма 1609 можно дать объяснение низкой скорости пролиферации и высокому проценту апоптотической гибели, которые показаны для этих клеток (Ковина и др., 2002).

При исследовании фибробластов престарелых доноров было установлено, что их пониженная способность к миграции связана в первую очередь со структурными нарушениями актинового цитоскелета, а не с изменениями в уровне экспрессии а2 интегрина и металлопротеаз матрикса (Reed et al., 2001).

Взаимодействие ламина А/С с хроматином и роль ядерной ламины в регуляции архитектоники хроматина были показаны во многочисленных исследованиях последних лет. Было установлено, что контакт с хроматином может осуществляться через связывание не-а-спирального терминального домена на С-конце ламинов с терминальными доменами на N- и С-конце коровых гистонов (Mattout et al., 2007). Другим способом взаимодействия ламинов с хроматином и ДНК является контакт, опосредованный ядерными белками, имеющими сродство к ламинам с одной стороны, а с другой - принимающим участие в позиционировании и регуляции конденсации хроматина. Примером такого белка является НР1 (Schirmer, Foisner, 2007).

Важность подобных регуляторных взаимодействий была продемонстрирована на примере клеточных культур больных ламинопатиями и престарелых доноров. В данных исследованиях было показано уменьшение количества клеток, позитивных по маркеру конститутивного гетерохроматина - МеЗ-К9 модификации гистона НЗ, маркеру факультативного гетерохроматина - МеЗ-К27 модификации гистона НЗ, а также клеток, в которых выявляется у-изоформа белка НР1, в клеточных культурах с генетическими и спорадическими дефектами ламина А/С (ScafTidi, Misteli, 2006).

Хотя многие детали взаимодействия ламинов с гетерохроматином еще требуют изучения, продемонстрирован ряд эффектов при его нарушении в клеточных культурах с дефектами ламина А. На примере клеток, полученных от больного синдромом Хатчинсона-Гилфорда, было показано, что дефицит МеЗ-НЗ-К9 приводит к активации таких традиционно молчащих в норме участков, как sat III 9 хромосомы (Shumaker et al., 2006).

Было установлено, что с уменьшением количества МеЗ-НЗ-К9 также может быть ассоциирована дестабилизация теломерного комплекса и ускоренное укорочение теломер в клетках больных сидромом Хатчинсона-Гилфорда (Hofer et al., 2005).

Показано, что ламины не только взаимодействуют с коровыми гистонами, но и способны влиять на статус их метилирования, так как могут непосредственно взаимодействовать с гистонметилтрансферазами и гистондеметилазами. В клетках с дефектами ламина А эти взаимодействия и соответственно характер метилирования гистонов могут быть дерегулированы (Dechat et al., 2007).

Полученные нами результаты свидетельствуют о нарушениях регуляции гетерохроматина в клетках штамма 1609. Значительное увеличение клеточного пула с допорогоговыми низкими значениями интенсивности флуоресценции при окрашивании специфических маркеров конститутивного и факультативного гетерохроматина, а также HPly, продемонстрированные для штамма 1609 (Смирнова и др., 2008, б), сравнимы с данными, полученными при анализе по этим критериям культур клеток больных синдромом Хатчинсона-Гилфорда и престарелых здоровых доноров (Scaffidi, Misteli, 2006; Shumaker et al., 2006). Снижение уровня данных маркеров может быть ассоциировано с нарушением репрессии транскрипции генов, вызывающим целый спектр прогероидных изменений на клеточном и на организменном уровне (Shaklai et al., 2007).

При анализе специфических гетерохроматиновых маркеров в клетках больной атаксией-телеангиэктазией штамма AT8SP нами была показана гиперстабилизация МеЗ-НЗ-К27 маркера. Высокий уровень стабилизации этого типа ковалентной модификации

НЗ гистона характерен и для клеток опухолей; кроме того, показано, что МеЗ-НЗ-К27 ассоциирован с транскрипционной репрессией генов опухолевых супрессоров в CpG-островках ДНК путем метилирования промотера de novo (Schlesinger et al., 2006). Также получены данные, свидетельствующие о том, что с помощью подобного типа репрессии в различных типах опухолей инактивируется транскрипция гена LMNA (Agrelo et al., 2005). В связи с этим мы можем предположить, что инактивация гена LMNA может лежать в основе повышенного по сравнению с контролем уровня аберраций ядерной оболочки, зарегистрированного нами при окрашивании ламина А/С в клетках больных атаксией-телеангиэктазией.

Исходя из полученных нами данных можно заключить, что в основе пониженной адгезии к субстрату фибробластов больных атаксией-телеангиэктазией, а также низкой миграционной активности этих клеточных штаммов изначально лежит не модификация актинового цитоскелета. Одной из вероятных причин данных пролиферативных особенностей может быть пониженный уровень экспрессии фибронектина, который был зарегистрирован при исследовании клеток больных атаксией-телеангиэктазией (Becker et al., 1989). Известно, что этот гликопротеин является основным компонентом временного, постраневого внеклеточного матрикса, а взаимодействие с матриксом является определяющим фактором для клеточной миграции (Briggs, 2005). Кроме того фибронектин в составе клеточных мембран обеспечивает адгезию грамположительной микрофлоры ротоглотки на эпителиальных клетках. Дефект его экспрессии наряду с ослаблением иммунного статуса может быть ассоциирован с высоким риском легочных инфекций у больных атаксией-телеаигиэктазий и смертностью от пневмонии.

Можно предположить, что отличия в пространственной организации актинового цитоскелета, которые были продемонстрированы для фибробластов больных атаксией телеангиэктазией, связаны с нарушениями взаимодействия с компонентами внеклеточного матрикса.

ВЫВОДЫ

1. В клетках штамма 1609 выявлено повышенное количество аберраций ядерной оболочки при сравнении, как с клетками здорового донора, так и с клетками штаммов, полученных от больных другими формами прогерий.

2. В клетках штамма 1609 показаны структурные изменения актинового цитоскелета, а также снижение адгезии к субстрату и способности к миграции

при сравнении, как с клетками здорового донора, так и с клетками штаммов, полученных от больных другими формами прогерий.

3. Состояние ядерной ламины и структуры актинового цитоскелета являются достоверными маркерами старения для всех исследованных случаев прогерий.

4. Больной А.Г. страдает атипичной формой синдрома Вернера, при которой наблюдается выраженная ламинопатия.

5. В фибробластах штамма 1609 выявляется резкое снижение уровня специфических гетерохроматиновых маркеров старения МеЗ-НЗ-К9, МеЗ-НЗ-К27 и НР1у при сравнении, как клетками здорового донора, так и с клетками больных атаксией-телеангиэктазией.

6. В клетках больных атаксией-телеангиэктазией повышен уровень специфических гетерохроматиновых маркеров старения МеЗ-НЗ-К9, МеЗ-НЗ-К27 и снижен уровень НР1у.

7. В случаях прогерий, развивающихся при нарушении внутриклеточных сигналов о повреждении ДНК, количество МеЗ-НЗ-К9 и МеЗ-НЗ-К27 не является адекватным маркером старения.

Публикации по теме диссертации Смирнова И. В., Спивак И. М., Михельсон В.М. 1999. Исследование Р53-статуса клеток больных прогерией и атаксией-телеангиэктазией после действия ионизирующей радиации. Цитология 41 (В): 721 - 728.

Смирнова И. В., Спивак И. М„ Плескач Н. М„ Михельсон В. М. 2008. Атипический случай синдрома Вернера: эффект ламинопатии. Цитология. 50 (9): 780-787. Смирнова Н. В., Спивак И. М„ Плескач Н.М., Михельсон В.М., Жеребцов С. В., Аксенов Н. Л. 2008. Атипический случай синдрома Вернера: нарушения эпигенетической регуляции и ответа на повреждения ДИК. Цитология 50 (10): 868 - 876.

Спивак И. М„ Смирнова Н. В., Плескач Н. М., Ледащева И. А., Михельсон В. М. 2005. Особенности стабилизации белка Р53 в клетках больных атаксией-телеангиэктазией после гамма-облучения. Цитология 47 (10): 898 - 906.

Михельсон В.М., Спивак И.М., Плескач Н.М., Сотников А.Г., Прокофьева В.В., Смирнова Н.В. 2005. Новые молекулярно-генетические подходы к механизмам повышенной радиочувствительности у человека. Тезисы конференции Фундаментальные науки -медицине. Москва: 197.

Smirnova N. V., Pleskach N.M., Mikhelson V.M. 2007. Ageing markers in the segmental progeria cells. Abstract book. VI European Congress of the International Association of Gerontology and Geriatrics. St-Petersburg: 72.

Смирнова H.B. 2008. Эпигенетические маркеры старения в клетках больных сегментарными прогериями. Тезисы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск: 221.

Список цитируемой литературы

Ковина М. В., Хавинсон В. X., Стрекалов Д. Л., Соловьева Д. В., Воробцова И. Е., Терехов С. М„ Плескач II. М., Прококофьева В. В., Стшак И. Л/., Тимонина Г. А., Михельсон В. М. 2002. Цитологические и молекулярные изменения при нетипичном случае ускоренного старения человека. Цитология. 44 : 930 - 935. Михельсон В.М. ¡996. Наследственное преждевременное старение человека. Клин, геронтол. 4 : 4 - 10. Михельсон В.М. ¡984. Старение клеточных культур. Сборник статен «Биология клетки в культуре» Ленинград, Наука, с. 235. Смирнова Н. В., Спивак И. М, Михельсон В.М.¡999. Исследование Р53-статуса клеток больных прогерией и атаксией-телеангиэктазией после действия ионизирующей радиации. Цитология 41 : 721 - 728. Смирнова II. В., Спивак И. М., Плескач И. М., Михельсон В. М. 2008. Атипический случай синдрома Вернера: эффект ламинопатии. Цитология. 50 (9): 780 - 787. Смирнова Н. В., Спивак И. М„ Плескач Н.М., Михельсон В.М., Жеребцов С. В., Аксенов Н.Л. 2008. Атипический случай синдрома Вернера: нарушения эпигенетической регуляции и ответа на повреждения ДНК. Цитология 50 (10) : 868 - 876. Спивак И. М, Смирнова П. В., Плескач П. М„ Ледащева И. А., Михельсон В. М. 2005. Особенности стабилизации белка Р53 в клетках больных атаксией-телеангиэктазией после гамма-облучения. Цитология 47 (10): 898 - 906.

Adelfalk С., Scherthan П., Hirsch-Kauffmann М„ Schweiger М. 200J.Nuclear deformation characterizes Werner syndrome cells. Cell Biol Int. 29 : 1032 - 1037. Bonne G, Levy N. 2003. LMNA mutations in atypical Werner's syndrome. Lancet 362 : 1585 - 1586. Agrelo R., Selien F., EspadaJ., Artiga M. J., Rodriguez M., Perez-Rosado A., Sanchez-Aguilera A., Fraga M. F., Piris M. A., Esteller M. 2005. Inactivation of the lamin A/C gene by CpG island promoter hypermethylation in hematologic malignancies, and its association with poor survival in nodal diffuse large B-cell lymphoma. J. Clin. Oncol. 23 : 3940 - 3947. Becker Y., Tabor E„ Asher Y 1989. Ataxia-telangiectasia fibroblasts have less fibronectin mRNA than control cells but have the same levels of integrin and beta-actin mRNA. Hum Genet. 8 : 165 - 170. Briggs S-L. 2005. The role of fibronectin in fibroblast migration during tissue repair. Journal of Wound Care. 14 : 284 - 287. Broers J. L„ Peelers E. A., Kuijpers H. J., Endert J., Bouten С. V., Oomens C. W., Baaijens F. P., Ramaekers F. C. 2004. Decreased mechanical stiffness in LMNA-/- cells is caused by defective nucleo-cytoskeletal integrity: implications for the development of laminopathies. Hum Mol Genet. 13 : 2567 - 2580. Cao K„ Capell B. C„ Erdos M. R„ Djabali K., Collins F. S. 2007. A lamin A protein isoform overexpressed in Hutchinson-Gilford progeria syndrome interferes with mitosis in progeria and normal cells. PNAS 104 : 4949 - 4954. Chen, L„ Lee L„ Kudlo B. A., Dos Santos H. G„ Sletvold O., Shafeghati Y„ Botha E. G„ Gar A., Hanson N. В., Martin G. M„ Mianb I. S., Kenned В. К., Oshima J. 2003. LMNA mutations in atypical Werner's syndrome. Lancet 362 : 440-445. De Sandre-Giovannoli A., Bernard R., Cati P., Navarro C„ Amiel J., Boccaccio I., Lyonnet S., Stewart C. L. Munnich A., Le Merrer M., Levy N. 2003. Lamin A truncation in Hutchison-Gilford progeria. Science 300 : 2055. Dechat Т., Shimi Т., Adam S. A., Rusinol A. E., Andres D. A., Spielmann H. P., Sinensky M. S., Goldman

R. D. 2007. Alterations in mitosis and cell cycle progression caused by a mutant lamin A known to accelerate human aging. Proc Natl Acad Sci U S A 104 : 4955 - 4960. Eamshaw W.C. 1995. Nuclear changes in apoptosis. Curr. Opin. Cell Biol. 7 : 337 - 343. Eriksson M, Brown W. T.. Gordon L. B., Glvnn M. W„ Singer J., Scott L„ Erdos M. /?., Robbins C. M, Moses T. Y. Berglund P., DntraA., Pak E., Durkin S., Csoka A. B., Boehnke M, Glover T. IV.. Collins F. S. 2003. Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Nature 423 : 293-298. Geiger B., Bershadsky A., Pankov R„ Yamada K. M. 2001. Transmembrane extracellular matrix-cytoskeleton crosstalk.Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2: 793 -805. Gilford, H. 1904. Ateleiosis and progeria: continuous youth and premature old age. Brit. Med. J. 2 : 914-918. Goldman, R. D., Grnenbaum, Y„ Moir, R. D., Shumaker, D. K. and Spann, T. P. 2002. Nuclear lamins: building blocks of nuclear architecture. Genes Dev. 16 : 533 - 547. Hofer A. C., Tran R. T„ Aziz O. Z„ Wright W„ Novelli G„ Shay J., Lewis M. 2005. Shared phenotypes among segmental progeroid syndromes suggest underlying pathways of aging. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 60 : 10 - 20. Hutchinson, J. 1886. Case of congenital absence of hair, with atrophic condition of the skin and its appendages, in a boy whose mother had been almost wholly bald from alopecia areata from the age of six. Lancet 1: 92i.Karecla P. L., Timpl R., Watt F. 1994. Adhesion of human epidermal keratinocytes to laminin. Cell adhesion and Communication 2 : 309 - 318. Lavin M. F., Shiloh Y. 1997. The genetic defect in ataxiatelangiectasia. Annu. Rev. Immunol. 15 : 177-202. Lee J. S., Hale C. M., Panorchan P., Khatau S. B„ George J. P., Tseng Y„ Stewart C. L„ Hodzic D„ Wirtz D. 2007. Nuclear lamin A/C deficiency induces defects in cell mechanics, polarization, and migration. Biophys J. 93 : 2542 - 2552. Lopez-Soler R.I., Moir R.D., Spann T.P., Stick R„ Goldman, R.D. 2001. A role for nuclear lamins in nuclear envelope assembly. J. Cell Biol. 154 : 61 - 70. Louis-Bar D. 1941. Sur un syndromeprogressif comprenant des telangieactasies capillaries cutanees et conjonctivales symetrique a disposition naevoide et des rtoubles cerebelleuse. Confin. Neurol. 4 : 32 - 40. Mattout A., Goldberg M„ Tzur Y.. Margalit A., Grnenbaum Y. 2007. Specific and conserved sequences in D. melanogaster and C. elegans lamins and histone H2A mediate the attachment of lamins to chromosomes. J Cell Sci. 120 : 77 - 85. McClintock D., Ratner D., Lokuge M., Owens D. M., Gordon L. B„ Collins F. S., Djabali K. 2007.The mutant form of lamin A that causes Hutchinson-Gilford progeria is a biomarker of cellular aging in human skin. PLoS ONE 2 : el269. McKinnon, P. J. 2004. ATM and ataxia telangiectasia. EMBO Rep. 5 : 112-116. Melaragno M. I., Pagni D., Smith M. A. 1995. Cytogenetic aspects of Werner's syndrome lymphocyte cultures. Mech. Ageing Dev. 78 : 117 - 122. Ramirez C. L., Cadinanos J., Varela I., Freije J. M. P., Lopez-Otin C. 2007. Human progeroid syndromes, aging and cancer: new genetic and epigenetic insights into old questions. Cell. Mol. Life Sci. 64 : 155 - 170. Reed M. J., Feraraa N. S., Vernonb R. D. 2001. Impaired migration, integrin function, and actin cytoskeletal organization in dermal fibroblasts from a subset of aged human donors. Mechanisms of Ageing and Development 122 : 1203 - 1220. Savitsky K., Bar-Shira A., Gilad S., Rotman G., Ziv Y., Vanagaite L., Tagle D., Smith S., Uziel T., Sfez S., Ashkenazi S., Pecker!., Frydman M., Harnik R., Patanjali S. A., Simmons A., Clines G. A., Sartiel A., Gatti R. A., Chessa L., Sanal O., Lavin M. F., Jaspers N. G. J., Taylor A. M. R., Arlett C. F., Miki T., Weissman S. M., Lovett M., Collins F. S., Shiloh Y. 1995. A single ataxia telangiectasia gene with a product similar to PI-3 kinase. Science. 268 : 1749—1753. Scaffidi P., Misteli T. 2006. Lamin A-Dependent Nuclear Defects in Human Aging. Science 312 : 1059 - 1063. Schirmer EC, Foisner R. 2007. Proteins that associate with lamins: many faces, many functions. Exp. Cell Res. 313 : 2167 - 2179. Schlesinger Y, Straussman R., Keshet I., Farkash S., Hecht M., Zimmerman J., Eden E., Yakhini Z., Ben-Shushan E., Reubinoff B. E„ Bergman Y„ Simon I., Cedar H. 2007. Polycomb-mediated methylation on Lys27 of histone H3 pre-marks genes for de novo methylation in cancer. Nat. Genet. 39 : 232 - 236. Shackleton S., Smallwood D. T„ Clayton P., Wilson L. C„ Agarwal A. K., GargA., Trembath R. C. 2005. Compound heterozygous ZMPSTE24 mutations reduce prelamin A processing and result in a severe progeroid phenotype. J. Med. Genet. 42 : e36. Shaklai S.,

Amariglio N.. Rechavi G., Simon A. J. 2007. Gene silencing at the nuclear periphery. FEBS J. 274 : 1383 - 1392. Shu maker D. K„ Dechat T„ Kohlmaier A., Adam S. A., Bozovsky M. R„ Erdos M. R., Eriksson M., Goldman A. E., Khuon S., Collins F. S., Jenuwein T., Goldman R. D. 2006. Mutant nuclear lamin A leads to progressive alterations of epigenetic control in premature aging. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 : 8703 - 8708. Starr D.A., Han M. 2002. Role of ANC-1 in tethering nuclei to the actin cytoskeleton. Science 11 : 406 - 409. Tznr Y. B., Wilson K. L., Gnienbaum Y. 2006. SUN-domain proteins: 'Velcro' that links the nucleoskeleton to the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 : 782 - 788. Vigouroux C„ Caux F„ Capeau J., Christin-Maitre S„ Cohen A. 2003. LMNA mutations in atypical Werner's syndrome. Lancet 362 : 1585. Werner C. W. O. 1904. Uber Katarakt in Verbindung mit Sklerodermie. PhD thesis. University of Kiel. Schmidt and Klaunig, Kiel. Yu C. E., OshimaJ., Fu Y. fl, Wijsman E. M., Hisama F., Alisch R., Matthews S., Nakura J., Miki T., Ouais S., Martin G. M., Mulligan J., Schellenberg G. D. 1996. Positional cloning of the Werner's syndrome gene. Science 272 : 258-262. Yu C. E., Oshima J., Wijsman E. M., Nakura J., Miki T., Pitissan C., Matthews S., Fit Y. H„ Mulligan J., Martin G. M., Schellenberg G. D. 1997. Mutations in the consensus helicase domains of the Werner syndrome gene. Werner's Syndrome. Collaborative Group. Am. J. Hum. Genet. 60 : 330-341.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 17.11.2008. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 3689Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смирнова, Наталья Владимировна

Список сокращений.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Синдромы преждевременного старения.

2.1.1 Синдром Вернера.

2.1.2 Атипический синдром Вернера.

2.1.3 Атаксия-телеангиэктазия (синдром Луи-Бар).

2.2 Яденая ламина и ламинопатии.

2.3 Цитологические эффекты ламинопатий и клеточные маркеры старения.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Клинический фенотип доноров и клеточные штаммы.

3.2 Иммунофлуоресцентный анализ.

3.3 Микроскопия и анализ изображений.

3.4 Определение числа прикрепившихся к субстрату фибробластов.

3.4 Определение миграционной активности клеток.

3.5 Обработка результатов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1 Пролиферативные особенности клеток больных прогериями.

4.2 Исследование структуры актинового цитоскелета в фибробластах больных прогериями.

4.3 Структурно-функциональные особенности клеток больных прогериями, ассоциированные с характером организации ядерной ламины.

4.4 Накопление аномалий морфологии ядерной оболочки при культивировании.

4.5 Исследование хроматиновых маркеров старения в фибробластах больных прогериями.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клеточные маркеры старения при прогериях"

Вторую группу составляют случаи прогерии детей - синдрома Хатчинсона-Гилфорда, ассоциированные с нарушениями структуры ядерной ламины, в основе которых лежат мутации гена LNMA (lq21.2), кодирующего ламин А/С (De Sandre-Giovannoli et al., 2003; Eriksson et al., 2003). Также к этой группе относят более редкие и хуже изученные случаи мутаций гена FACE-1/ZMPSTE24 (1р34), кодирующего металлопротеазу, принимающую участие в посттрансляционных модификациях ламина А/С (Shackleton et al., 2005).

В третью группу прогерий были выделены те, при которых нарушена передача сигнала о повреждениях ДНК, как это происходит при атаксии-телеангиэктазии, причиной которой являются мутации в гене ATM {llq23.1) (Savitsky et al., 1995), который кодирует протеинкиназу из семейства фосфатидилинозитол-3-киназ (PI3K) (Lavin, Shiloh, 1997; McKinnon et al., 2004).

Исследования последних десятилетий показали, что клеточное старение следует рассматривать как комплекс гетерогенных, но взаимосвязанных механизмов, в которых прямо или опосредовано задействованы продукты генов, дефектных при прогериях, таких как WRN, LMNA и ATM. К этим механизмам относится дисфункция теломерных комплексов и укорочение теломер. Также с клеточным старением ассоциировано снижение эффективности репарации ДНК, сопровождающееся накоплением различных типов повреждений. Были описаны и специфические для клеточного старения изменения хроматина, оказывающие влияющие на транскрипционную активность и эффективность репарации ДНК (Ramirez et al., 2007).

В ходе исследования клеток больных синдромом Хатчинсона-Гилфорда, а также клеточных культур, полученных от престарелых доноров, были показаны структурные трансформации ядерной ламины, наступающие в результате аккумуляции аберрантного продукта гена LMNA, прогерина (Scaffldi, Misteli, 2006). Результатом исследований последних лет стало расширение представлений о функциях ядерной ламины, было показано ее участие в организации хроматина (Goldman et al., 2002), репликации ДНК, зависимой от РНК полимеразы II транскрипции, стабилизации теломерных комплексов, регуляции ядерных поровых комплексов (Goldman et al., 2004), а также в апоптозе (Earnshaw, 1995). Кроме того компоненты ядерной ламины задействованы в регуляции положения ядра в клетке (Starr, Han, 2002) и его сборки после митоза (Lopez-Soler et al., 2001), интеграции с цитоскелетом (Malone et al., 2003). Таким образом, в комплексе с современными данными об участии компонентов ядерной ламины и, в частности, ламина А в исключительно широком спектре клеточных процессов результаты, полученные Скафиди и Мистели, позволяют считать структурные изменения ядерной ламины базовым процессом для индукции маркеров старения, ассоциированных с различными уровнями клеточной регуляции (Scaffldi, Misteli, 2006).

Цель и задачи работы

Для достижения этих целей были сформулированы следующие задачи:

3. Проанализировать уровень специфических хроматиновых маркеров старения в клетках больных прогериями на примере ковалентных модификации Tri-Ме-К9 и Tri-Me-K27 гистона НЗ и у-изоформы белка НР1.

4. На основе полученных при исследовании клеточных культур данных уточнить диагноз больного прогерией А.Г.

Научная новизна работы

Теоретическая и практическая значимость работы

Положения, выносимые на защиту

3. Прогерии различной этиологии различаются по степени выраженности маркеров клеточного старения.

Апробация диссертации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ. Материалы диссертации были представлены на конференции «Фундаментальные науки -медицине» (Москва, 2005), VI Европейском конгрессе Международной ассоциации геронтологии и гериатрии (Санкт-Петербург, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), а также на научных семинарах Лаборатории радиационной цитологии Института цитологии РАН.

Финансовая поддержка работы

Работа выполнена при финансовой поддержке по программе «Фундаментальные науки - медицине», 2005 - 2007 гг.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 7 гистограмм, 1 таблицу, иллюстрирована 13 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 5 глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Список использованной литературы включает 196 источников.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Смирнова, Наталья Владимировна

6. выводы

2. В клетках штамма 1609 показаны структурные изменения актинового цитоскелета, а также снижение адгезии к субстрату и способности к миграции при сравнении, как с фибробластами здорового донора, так и со штаммами фибробластов, полученными от больных другими формами прогерий.

4. Больной А.Г. страдает атипичной формой синдрома Вернера, при которой наблюдается выраженная ламинопатия.

5. В фибробластах штамма 1609 выявляется резкое снижение уровня специфических гетерохроматиновых маркеров старения МеЗ-НЗ-К9, МеЗ-НЗ-К27 и HPly при сравнении, как фибробластами здорового донора, так и с фибробластами больных атаксией-телеангиэктазией.

6. В клетках больных атаксией-телеангиэктазией повышен уровень специфических гетерохроматиновых маркеров старения МеЗ-НЗ-К9, МеЗ-НЗ-К27 и снижен уровень HP 1 у.

Публикации по теме диссертации Смирнова Н. В., Спивак И. М., Михельсон В.М. 1999. Исследование Р53-статуса клеток больных прогерией и атаксией-телеангиэктазией после действия ионизирующей радиации. Цитология 41 (8) : 721 - 728.

Смирнова Н. В., Спивак И. М., Плескач Н. М., Михельсон В. М. 2008. Атипический случай синдрома Вернера: эффект ламинопатии. Цитология. 50 (9): 780-787. Смирнова Н. В., Спивак И. М., Плескач Н.М., Михельсон В.М., Жеребцов С. В., Аксенов Н. JI. 2008. Атипический случай синдрома Вернера: нарушения эпигенетической регуляции и ответа на повреждения ДНК. Цитология 50 (10) : 868 -876.

Спивак И. М, Смирнова Н. В., Плескач Н. М., Ледащева И. А., Михельсон В. М. 2005. Особенности стабилизации белка Р53 в клетках больных атаксией-телеангиэктазией после гамма-облучения. Цитология 47 (10) : 898 - 906. Михельсон В.М., Спивак И.М., Плескач Н.М., Сотников А.Г., Прокофьева В.В., Смирнова Н.В. 2005. Новые молекулярно-генетические подходы к механизмам повышенной радиочувствительности у человека. Тезисы конференции Фундаментальные науки - медицине. Москва: 197.

Smirnova N. V., Pleskach N.M., Mikhelson KM. 2007. Ageing markers in the segmental progeria cells. Abstract book., VI European Congress of the International Association of Gerontology and Geriatrics. St-Petersburg: 72.

Смирнова Н.В. 2008. Эпигенетические маркеры старения в клетках больных сегментарными прогериями. Тезисы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск: 221.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смирнова, Наталья Владимировна, Санкт-Петербург

1. Михелъсон В.М. 1984. Старение клеточных культур. Сборник статей «Биология клетки в культуре» Ленинград, Наука, с. 235.

2. Смирнова Н. В., Спивак И. М., Михелъсон В.М. 1999. Исследование Р53-статуса клеток больных прогерией и атаксией-телеангиэктазией после действия ионизирующей радиации. Цитология 41 : 721 728.

3. Ahn В., Harrigan J. A., Indig F. E., Wilson D. M. 3rd, Bohr V. A. 2004. Regulation of WRN helicase activity in human base excision repair. J. Biol. Chem. 279 : 53465 -53474.

4. Becker Y., Tabor E., Asher Y. 1989. Ataxia-telangiectasia fibroblasts have less fibronectin mRNA than control cells but have the same levels of integrin and beta-actin mRNA. Hum Genet. 8 : 165 170.

5. Bornman D. M., Mathew S., Alsruhe J., Herman J. G., Gabrielson E. 2001. Methylation of the E-cadherin gene in bladder neoplasia and in normal urothelial epithelium from elderly individuals. Am. J. Pathol. 159 : 831 835.

6. Brosh R. M. Jr., Opresko P. L., Bohr V. A. 2006. Enzymatic mechanism of the WRN helicase/nuclease. Methods Enzymol. 409: 52 85.

7. Cadinanos J., Varela I., Lopez-Otin, C., Freije, J. M. 2005. From immature lamin to premature aging: molecular pathways and thera peutic opportunities. Cell Cycle 4 : 1732 1735.

8. Cao R., Zhang Y. 2004. The functions of E(Z)/EZH21-mediated methylation of lysine 27 in histone H3. Curr. Opin. Genet. Dev. 14 : 155 164.

9. Casillas M. A. Jr., Lopatina N., Andrews L. G., Tollefsbol Т. O. 2003. Transcriptional control of the DNA methyltransferases is altered in aging and neoplastically-transformed human fibroblasts. Mol. Cell. Biochem. 252 : 33 43.

10. Celeste A., Petersen S., Romanienko P. J., Fernandez-Capetillo O., Chen H. Т.,

11. Sedelnikova O. A., Reina-San-Martin В., Coppola V., Meffre E., Dijilippantonio M. J.,

12. Redon C., Pilch D. R., Olaru A., Eckhaus M., Camerini-Otero R. D., Tessarollo L., Livak

13. F., Manova K., Bonner W. M., Nussenzweig M. C., Nussenzweig A. 2002. Genomicinstability in mice lacking histone H2AX. Science 296 : 922 927.

14. Cenci G., Ciapponi L., Gatti M. 2005. The mechanism of telomere protection: acomparison between Drosophila and humans. Chromosoma 114 : 135 145.

15. Chen L., Huang S., Lee L., Davalos A., Schiestl R. H., Campisi J., Oshima J. 2003.

16. WRN, the protein deficient in Werner syndrome, plays a critical structural role inoptimizing DNA repair. Aging Cell 2 : 191 199.

17. Columbaro M., Capanni C., Mattioli E., Novelli G., Parnaik V. K., Squarzoni S., Maraldi N. M., Lattanzi G. 2005. Rescue of heterochromatin organization in Hutchinson-Gilford progeria by drug treatment. Cell Mol. Life Sci. 62 : 2669 2678.

18. De Sandre-Giovannoli A., Bernard R., Can P., Navarro C., Amiel J., Boccaccio I., Lyonnet, S., Stewart C. L., Munnich A., Le Merre M., Levy N. 2003. Lamin A truncation in Hutchinson-Gilford progeria. Science 300 : 2055.

19. Dechat Т., Pfleghaar К., Sengupta К., Shimi Т., Shumaker D. К., Solimando L., Goldman R. D. 20OS.Nuclear lamins: major factors in the structural organization and function of the nucleus and chromatin. Genes Dev. 22 : 832 853.

20. Dhe-Paganon S., Werner E.D., Chi Y-I., Shoelson S. E. 2002. Structure of the globular tail of nuclear lamin. J. Biol. Chem. 277 : 17381 17384.

21. Earnshaw W.C. 1995. Nuclear changes in apoptosis. Curr. Opin. Cell Biol. 7 : 337 -343.

22. Eissenberg J. C., Elgin S. C. 2000. The HP1 protein family: getting a grip on chromatin. Curr. Opin. Genet. Dev. 10 : 204 210.

23. Ekwall K., Javerzat J. P, Lorentz A., Schmidt H., Cranston G., Allshire R. 1995. The chromodomain protein Swi6: a key component at fission yeast centromeres. Science 269 : 1429- 1431.

24. Ford J. M., Baron E. L., Hanawalt P. C. 1998. Human fibroblasts expressing the human papillomavirus E6 gene are deficient in global genomic nucleotide excision repair and sensitive to ultraviolet irradiation. Cancer Res. 58 : 599 603.

25. Ford J. M., Hanawalt P. C. 1997. Expression of wild-type p53 is required for efficient global genomic nucleotide excision repair in UV-irradiated human fibroblasts. J. Biol. Chem. 272 : 28073 28080.

26. Fukuchi К., Martin G. M., Monnat R. J. Jr. 1989. Mutator phenotype of Werner syndrome is characterized by extensive deletions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 5893 -5897.

27. Furuichi Y. 2001. Premature aging and predisposition to cancers caused by mutations in RccQ family helicases. Ann. N Y Acad. Sci. 928 : 121 131.

28. Garg A., Speckman R. A., BowcockA. M. 2002. Multisystem dystrophy syndrome due to novel missense mutations in the amino-terminal head and -helical rod domains of the lamin A/C gene. Am. J. Med. 112 : 549 555.

29. Goto M. 1997. Hierarchical deterioration of body systems in Werner's syndrome: implications for normal ageing. Mech Ageing Dev. 98 : 239 254.

30. Hanawalt P. C. 1994. Transcription-coupled repair and human disease. Science 266 : 1957- 1958.

31. Hanawalt P. C. 2000. DNA repair. The bases for Cockayne syndrome. Nature 405 : 415 -416.

32. Heald R., McKeon F. 1990. Mutations of phosphorylation sites in lamin A that prevent nuclear lamina disassembly in mitosis. Cell 61 : 579-589.

33. Hegele R. A. 2003 Drawing the line in progeria syndromes. Lancet 362 : 416 -417.

34. Hickson I. D. 2003. RecQ helicases: caretakers of the genome. Nat. Rev. Cancer. 3 : 169 178.

35. Hisama F. M, Bohr V. A., Oshima J. 2006. WRN's tenth anniversary. Sci. Aging Knowledge Environ. 2006 : pel8.

36. Hoeijmakers J. H. J. 2001. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature 411 : 366-374.

37. Hofer A. C., Tran R. Т., Aziz O. Z„ Wright W., Novelli G., Shay J., Lewis M. 2005. Shared phenotypes among segmental progeroid syndromes suggest underlying pathways of aging. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 60 : 10 20.

38. Jones P. A., Baylin S. B. 2002. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nature Rev. Genet. 3:415 428.

39. Karecla P. L., Timpl R., Watt F. 1994. Adhesion of human epidermal keratinocytes to laminin. Cell adhesion and Communication 2 : 309 318.

40. Karlsson К. H., Stenerlow B. 2004. Focus formation of DNA repair proteins in normal and repair-deficient cells irradiated with high-LET ions. Radiation Research 161 : 517 -527.

41. Malone C.J., Misner L., Le Bot N., Tsai M.C., Campbell J.M., Ahringer J., White J.G. 2003. The C.elegans Hook protein, ZYG-12, mediates the essential attachment between the centrosome and nucleus. Cell 115 : 825 836.

42. Martin C., Zhang Y. 2005.The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 : 838 849.

43. Mattout A., Goldberg M., Tzur Y, Margalit A., Gruenbaum Y. 2007. Specific andconserved sequences in D. melanogaster and C. elegans lamins and histone H2A mediatethe attachment of lamins to chromosomes. J Cell Sci. 120 : 77 85.

44. McClintock D., Ratner D., Lokuge M., Owens D. M., Gordon L. В., Collins F. S., Djabali

45. K. 2007.The mutant form of lamin A that causes Hutchinson-Gilford progeria is abiomarker of cellular aging in human skin. PLoS ONE 2 : el269.

46. McKinnon, P. J. 2004. ATM and ataxia telangiectasia. EMBO Rep. 5 :112-116.

47. Melaragno M. I., Pagni D., Smith M. A. 1995. Cytogenetic aspects of Werner's syndromelymphocyte cultures. Mech. Ageing Dev. 78: 117-122.

48. Meyn M. S. 1995. Ataxia-telangiectasia and cellular responses to DNA damage. Cancer Res. 55 : 5991 6001.

49. Nigg E. A. 1992. Assembly and cell cycle dynamics of the nuclear lamina. Semin. Cell Biol. 3 : 245 253.

50. Nonaka N., Kitajima Т., Yokobayashi S., Xiao G., Yamamoto M., Grewal S. I., Watanabe Y. 2002. Recruitment of cohesin to heterochromatic regions by Swi6/HPl in fission yeast. Nat. Cell Biol. 4:89-93.

51. Nowak-Wegrzyn A., Crawford Т. O., Winkelstein J. A., Carson K. A., Lederman H. M. 2004. Immunodeficiency and infections in ataxia-telangiectasia. J. Pediatr. 144 : 505 -511.

52. Nygren J., Cedervall В., Eriksson S., Dusinska M., Kolman A. 1994. Induction of DNA strand breaks by ethylene oxide in human diploid fibroblasts. Environ. Mol. Mutagen. 24 : 161—167.

53. Obuse C., Iwasaki O., Kiyomitsu Т., Goshima G., Toyoda Y., Yanagida M. 2004. A conserved Mis 12 centromere complex is linked to heterochromatic HP1 and outer kinetochore protein Zwint-1. Nat. Cell Biol. 6 : 1135 1141.

54. Okada M., Goto M., Furuichi Y, Sugimoto M. 1998. Differential effects of cytotoxic drugs on mortal and immortalized B-lymphoblastoid cell lines from normal and Werner's syndrome patients. Biol. Pharm. Bull. 21 : 235 239.

55. Ozgenc A., Loeb L. A. 2005. Current advances in unraveling the function of the Werner syndrome protein. Mutat. Res. 577 : 237 251.

56. Ozgenc A., Loeb L. A. 2005. Current advances in unraveling the function of the Werner syndrome protein. Mutat Res. 577 : 237 251.

57. Peeters E. A. G. 2004. Biomechanics of single cells under compression. Technische Universiteit Eindhoven.

58. Petronis A. 2006. Epigenetics and twins: three variations on the theme. Trends Genet. 22 : 347-350.

59. Rotman G, Shiloh Y. 1998. ATM: from gene to function. Hum. Mol. Genet. 7 : 1555 1563. SalkD., AuK., Hoehn H., Martin G. M. 1985. Cytogenetic aspects of Werner syndrome. Adv. Exp. Med. Biol. 190 : 541 - 546.

60. Satoh M., Imai M., Sugimoto M, Goto M., Furuichi Y. 1999. Prevalence of Werner's syndrome heterozygotes in Japan. Lancet 353: 1766.

61. Schirmer E.C., Guan Т., Gerace L. 2001. Involvement of the lamin rod domain in heterotopic lamin interactions important for nuclear organization. J. Cell Biol. 153 : 479 -490.

62. Schirmer EC, Foisner R. 2007. Proteins that associate with lamins: many faces, many functions. Exp. Cell Res. 313 : 2167-2179.

63. Shumaker D. K., Dechat Т., Kohlmaier A., Adam S. A., Bozovsky M. R., Erdos M. R., Eriksson M., Goldman A. E., Khuon S., Collins F. S., Jenuwein Т., Goldman R. D. 2006.

64. Mutant nuclear lamin A leads to progressive alterations of epigenetic control in premature aging. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 : 8703 8708.

65. Sinensky M., Fantle K., Trujillo M., McLain Т., Kupfer A., Dalton M. 1994. The processing pathway of prelamin A. J. Cell Sci. 107 : 61 -67.

66. So K., Tamura G., Honda Т., Homma N. Waki Т., Togawa N., Nishizuka S., Motoyama T. 2006. Multiple tumor suppressor genes are increasingly methylated with age in nonneoplastic gastric epithelia. Cancer Sci. 97 : 1155-1158.

67. Sommers J. A., Sharma S., Doherty К. M., Karmakar P., Yang Q., Kenny M. K., Harris С. C., Brosh R.M. Jr. 2005. p53 modulates RPA-dependent and RPA-independent WRN helicase activity. Cancer Res. 65 : 1223 1233.

68. Song K., Jung Y, Jung D., Lee I. 2001. Human Ku70 interacts with heterochromatin protein 1 alpha. J. Biol. Chem. 276 : 8321 8327.

69. Spann T.P., Goldman A. E., Wang C., Huang S., Goldman R. D. 2002. Alteration of nuclear lamin organization inhibits RNA polymerase II dependent transcription. J. Cell Biol. 156 : 603 -608.

70. Spann T.P., Moir R.D., Goldman A.E., Stick R., Goldman, R.D. 1997. Disruption of nuclear lamin organization alters the distribution of replication factors and inhibits DNA synthesis. J. Cell Biol. 136 : 1201 1212.

71. Spillare E. A., Robles A. I., WangX. W, Shen J. C., Yu С. E., Schellenberg G. D., Harris С. C. 1999. p53-mediated apoptosis is attenuated in Werner syndrome cells. Genes Dev. 13 1355 1360.

72. Starr D.A., Han M. 2002. Role of ANC-1 in tethering nuclei to the actin cytoskeleton. Science 11 : 406 409.

73. Starr D.A., Hermann G.J., Malone C.J., Fixsen W.D., Priess J.R., Horvitz H.R., Han M. 2001. Unc-83 encodes a novel component of the nuclear envelope and is essential for proper nuclear migration. Development 128 : 5039 5050.

74. Stiff Т., O'Driscoll M., RiefN., Iwabuchi K., Lobrich M., Jeggo P. A. 2004. ATM and DNA-PK function redundantly to phosphorylate H2AX after exposure to ionizing radiation. Cancer Res. 64 : 2390 2396.

75. Stuurman N., Heins S., Aebi U. 1998. Nuclear lamins: their structure, assembly and interactions. J. Struct. Biol. 122 : 42 66.

76. Sullivan Т., Escalante-Alcalde D., Bhatt H., Anver M., Bhat N., Nagashima K., Stewart

77. C. L., Burke B. 1999. Loss of A-type lamin expression compromises nuclear envelopeintegrity leading to muscular dystrophy. J. Cell Biol. 147: 913-920.

78. Sun X, Becker-Catania S. G., Chun H. H., Hwang M. J., Huo Y., Wang Z, Mitui M.,

79. Sanal O., Chessa L., Crandall В., Gatti R. A. 2002. Early diagnosis of ataxiatelangiectasia using radiosensitivity testing. J. Pediatr. 140 : 724 731.

80. Szekely A. M., Chen Y. H., Zhang C., Oshima J., Weissman S. M. 2000. Werner proteinrecruits DNA polymerase delta to the nucleolus. Proc. Natl .Acad. Sci. USA 97 : 11365 11370.

81. Takatsu M., Uyeno S., Komura J., Watanabe M., Ono T. 1999. Age-dependent alterations in mRNA level and promoter methylation of collagen alphal(I) gene in human periodontal ligament. Mech. Ageing Dev. 110 : 37 48.

82. Tanaka Т., Kurose A., HuangX., Dai W, Darzynkiewicz Z. 2006. ATM activation and histone H2AX phosphorylation as indicators of DNA damage by DNA topoisomerase I inhibitor topotecan and during apoptosis. Cell Prolif. 39 : 49 60.

83. Tang J. Y., Hwang B. J., Ford J. M., Hanawalt P. C., Chu G. 2000. Xeroderma pigmentosum p48 gene enhances global genomic repair and suppresses UV-induced mutagenesis. Mol. Cell. 5 : 737 744.

84. Tollefsbol Т. O., Cohen H. J. 1984. Werner's syndrome: an underdiagnosed disorder resembling premature aging. Age 7 : 75 88.

85. Vaquero A., Loyola A., Reinberg D. 2003. The constantly changing face of chromatin. Sci. Aging Knowledge Environ. 14 : 1-16.

86. Vergnes L., Peterjy M., Bergo M. O., Young S. G., Reue K. 2004. Lamin B1 is required for mouse development and nuclear integrity. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 : 10428 -10433.

87. Werner C. W. O. 1904. Uber Katarakt in Verbindung mit Sklerodermie. PhD thesis. University of Kiel. Schmidt and Klaunig, Kiel.

88. Wilson V. L., Jones, P. A. 1983. DNA methylation decreases in aging but not in immortal cells. Science 220 : 1055 1057.

89. Wydner K. L., McNeil J. A., Lin F., Worman H. J., Lawrence J. B. 1996. Chromosomal assignment of human nuclear envelope protein genes LMNA, LMNB1, and LBR by fluorescence in situ hybridization. Genomics 32 : 474 478.

90. Yamamoto К, Imakiire A., Miyagawa N., Kasahara T. 2003. A report of two cases of Werner's syndrome and review of the literature. J. Orthop Surg. (Hong Kong) 11 : 224233.

91. Yannone S. M., Roy S., Chan D. W., Murphy M. В., Huang S., Campisi J., Chen D. J. 2001. Werner syndrome protein is regulated and phosphorylated by DNA- dependent protein kinase. J. Biol. Chem. 276 : 38242 38248.

92. Yu С. E., Oshima J., Fu Y. H., Wijsman E. M., Hisama F., Alisch R., Matthews S., Nakura J., Miki Т., Ouais S., Martin G. M., Mulligan J., Schellenberg G. D. 1996. Positional cloning of the Werner's syndrome gene. Science 272 : 258-262.

93. Zhang R., Chen W., Adams P. D. 2007. Molecular dissection of formation of senescent associated heterochromatin foci. Mol.Cell Biol. 27 : 2343 2358.

94. Zhen Y.Y., Libotte Т., Munck M., Noegel A.A., Korenbaum E. 2002. NUANCE, a giant-protein connecting the nucleus and actin cytoskeleton. J. Cell. Sci. 115: 3207 3222.

Информация о работе

Смирнова, Наталья Владимировна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2008
ВАК 03.00.25

Диссертация

Клеточные маркеры старения при прогериях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы