Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Математическое моделирование процессов индукции и репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках млекопитающих при действии редкоионизирующего излучения с различной мощностью дозы

ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Математическое моделирование процессов индукции и репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках млекопитающих при действии редкоионизирующего излучения с различной мощностью дозы"

На правах рукописи

Озеров Иван Витальевич

МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ИНДУКЦИИ И РЕПАРАЦИИ ДВУНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ ДНК В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПРИ ДЕЙСТВИИ РЕДКОИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ С РАЗЛИЧНОЙ МОЩНОСТЬЮ дозы

Специальность 03.01.01. - "радиобиология"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

11 ПАР 2т

Москва 2015

005560451

005560451

Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения "Государственный научный центр Российской Федерации - Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна" Федерального медико-биологического агенства России

Научные руководители: Кудряшов Юрий Борисович,

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией радиационной биофизики кафедры биофизики Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Осипов Андреян Николаевич,

доктор биологических наук, заведующий лабораторией радиационной биофизики ФГБУ "Государственный научный центр Российской Федерации - Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна" ФМБА России

Официальные оппоненты: Хвостунов Игорь Константинович,

кандидат физико-математических наук, доктор биологических наук, заведующий лабораторией радиационной цитогенетики,

Медицинский радиологический научный центр им. А.Ф. Цыба - филиал ФГБУ «ФМИЦ им. П.А. Герцена» Министерства здравоохранения РФ

Боженко Владимир Константинович,

кандидат биологических наук, доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом патоморфологии и лабораторной диагностики,

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения РФ

Ведущая организация:

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Защита диссертации состоится «16» апреля 2015 года в /4 °° часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.65 Биологического факультета Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.73, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «¿?тг» 2015 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т.В. Веселова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Двунитевые разрывы ДНК (ДР) составляют относительно небольшую часть радиадионно-индуцированных повреждений ДНК, но именно они являются основным триггером, определяющим дальнейшую судьбу поврежденной клетки [Ноеутакегз, 2001; \Vyman е1 а1., 2006]. Число ДР ДНК в конкретной клетке, как и среднее значение этого параметра в целом по клеточной популяции, является принципиальным показателем, знание которого позволяет оценить текущее состояние повреждённых клеток и сделать прогноз развития радиационно-индуцированного ответа и выживаемости клеток в клеточной популяции, подвергшейся воздействию ионизирующего излучения (ИИ).

С развитием индустрии флуоресцентно меченых антител широкое распространение получили методы оценки числа ДР, основанные на анализе изображений ядер клеток с флуоресцентными метками, закрепленными на антителах к различным белкам-маркерам ДР ДНК. В качестве таких маркеров, как правило, используют белки, участвующие в репарации ДНК (Ки70/80, ДНК-ПКкс, 53ВР, 11а(151 и др.), или гистоновые белки, претерпевающие определённые модификации в зоне непосредственной близости от двунитевого разрыва ДНК, среди которых наиболее изученным является гистон Н2АХ [Б^акои е! а1., 1999; БЬаппа й а1., 2012]. Флуоресцирующие скопления флуоресцентно меченых антител к исследуемым белкам на полученных изображениях принято называть фокусами соответствующих белков. При использовании таких методов требуется анализ большого числа изображений, который является весьма нетривиальной задачей. Поскольку ручной подсчёт параметров флуоресценции фокусов занимает неприемлемо много времени, в настоящее время активно развиваются алгоритмы автоматического анализа флуоресцентных изображений. Однако, точность оценки числа ДР и анализа параметров фокусов белков репарации, проведенных с помощью таких алгоритмов, оставляет желать лучшего [\Viesmann й а1., 2014].

Принципиальные механизмы индукции и репарации ДР ДНК, образованных в результате воздействия острого облучения с мощностью более 200 мГр/мин, подробно изучены в широком диапазоне доз [Огис^епзк! е1 а1., 2010; М1а<1епоу с1 а1., 2011]. В то же время данные, касающиеся индукции и репарации ДНК при воздействии пролонгированного излучения с малой мощностью дозы, весьма противоречивы и требуют дальнейшего изучения. В частности, важнейшим вопросом является выявление

отличий в механизмах и кинетике накопления и репарации ДР ДНК в случае пролонгированного облучения по сравнению с острым. Большинство работ в этой области по-прежнему сконцентрировано на исследовании зависимостей от дозы и энергии редкоионизирующих излучений, в то время как такой важный фактор, как мощность дозы, в большинстве случаев остаётся за кадром.

В связи со стремительным накоплением численных данных по кинетике индукции и репарации ДР ДНК, а также по кинетике формирования отдельных белковых комплексов, участвующих в этом процессе, в последнее время стали появляться работы по математическому моделированию процессов репарации ДР. Как правило, такие модели представляют собой системы дифференциальных уравнений различной сложности [СисшоИа й а1., 2008; Та1ее1 й а1., 2013]. Подавляющее большинство моделей индукции и репарации ДР ДНК учитывают зависимость кинетики этих процессов от накопленной дозы излучения. Тем не менее, ни одна из существующих на данный момент моделей не учитывает зависимость процессов репарации от мощности дозы излучения и не может быть использована для прогноза последствий действия пролонгированного облучения.

Цели и задачи работы. Целью диссертационной работы является проведение сравнительного исследования особенностей репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках млекопитающих, подверженных воздействию редкоионизирующего излучения, в зависимости от мощности дозы излучения с использованием метода кинетического моделирования. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) разработать эффективный алгоритм автоматического анализа фокусов белков репарации на флуоресцентных изображениях ядер клеток, подверженных действию редкоионизирующего излучения с различной мощностью дозы;

2) получить экспериментальные данные по кинетике формирования и деградации фокусов белков репарации уН2АХ и 11ас151 в клетках линии У79 фибробластов лёгкого китайского хомяка и первичных фибробластах кожи человека при воздействии у- и рентгеновских лучей в зависимости от мощности дозы;

3) на основе полученных экспериментальных данных и данных из литературы построить статистически достоверную кинетическую модель индукции и репарации ДР ДНК в условиях действия редкоионизирующего излучения в широком диапазоне доз (0,25 - 5 Гр) и мощностей доз (1 - 400 мГр/мин);

4) исследовать дозовые кривые интенсивности флуоресценции белков уН2АХ и Ка(151 в зависимости от мощности поглощенной дозы;

5) используя данные моделирования, оценить вклад репарации ДР ДНК по путям негомологичного соединения концов и гомологической рекомбинации в клетках млекопитающих в зависимости от накопленной дозы и мощности дозы редкоионизирующего излучения.

Положения, выносимые на защиту:

1) Кинетика образования и деградации фокусов белков репарации ДР ДНК имеет принципиальные различия в случае пролонгированного и острого режимов облучения клеток млекопитающих.

2) Вклады основных механизмов репарации ДР ДНК, гомологической рекомбинации и негомологичного соединения концов, нелинейным образом зависят от мощности дозы излучения.

Научная новизна и ппактнческая значимость работы. В ходе работы создан новый алгоритм автоматического учёта числа и параметров фокусов белков репарации ДР ДНК в ядрах клеток с удобным графическим интерфейсом взаимодействия с пользователем. В отличие от предшествующих алгоритмов, составленный алгоритм пригоден для анализа флуоресцентных изображений с высокой степенью шума и неравномерным фоном без дополнительного предпроцессинга. Кроме того, указанный алгоритм молено легко адаптировать для решения задач из других областей биологии, связанных с анализом флуоресцентных изображений.

Впервые получены кинетики образования и деградации фокусов белков репарации ДР ДНК уН2АХ и 11ас151 в клетках млекопитающих в течение суток после окончания не только для острого, но и пролонгированного воздействия редкоионизирующего излучения, проанализирована колокализация фокусов белков уН2АХ и 11ас151. Продемонстрированы различия в кинетике образования фокусов белков уН2АХ и ЯасШ при различных значениях мощности дозы (1 -400 мГр/мин).

Впервые построена кинетическая модель индукции и репарации ДР ДНК редкоионизирующим ИИ, которая, в отличие от моделей других авторов, может быть использована для исследования эффектов пролонгированного облучения. С помощью модели исследованы различия в характере дозовых зависимостей накопления и деградации фокусов уШАХ и ДР ДНК при различной мощности дозы, показан нелинейный характер изменения вклада гомологической рекомбинации в репарацию ДР ДНК при переходе от острого облучения к пролонгированному с наличием максимума в диапазоне 5-20 мГр/мин.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы представлялись и докладывались на следующих научно-практических конференциях:

V Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», Ростов-на-Дону, октябрь 2013.

VI Международная школа молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и системная биология», Москва - Звенигород, ноябрь 2014. Доклад диссертанта на тему «Моделирование процессов репарации двунитевых разрывов ДНК» был удостоен награды в номинации «лучший устный доклад».

XXII Международная конференция «Математика. Компьютер. Образование», Пущино, январь 2015.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, включая 3 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 4х глав, заключения, выводов, списка использованных источников и благодарностей. Содержит 121 страницу машинописного текста, 31 рисунок и 2 таблицы. Библиография включает 189 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. Обзор литературы. В главе I представлен обзор литературы, в котором освещены следующие вопросы: 1) роль и место ДР в ряду радиационно-индуцированных повреждений ДНК; 2) основные молекулярные механизмы репарации ДР; 3) флуоресцентные методы исследования репарации ДР; 4) предшествующие модели репарации ДР ДНК.

В обзоре литературы показано, что двунитевые разрывы ДНК являются ключевым видом повреждений ДНК, определяющим судьбу облученной клетки, а основными механизмами репарации ДР ДНК являются негомологичное соединение концов (НГСК) и гомологическая рекомбинация (ГР). В главе I подробно изложены молекулярные основы использования фосфорилированной формы гистона Н2АХ (уН2АХ) в качестве специфического маркера ДР и белка Rad51 в качестве маркера тех ДР, репарация которых идет по пути ГР.

Из анализа литературы следует, что несмотря на стремительное развитие флуоресцентных методов исследования репарации ДР в клетках, методы

автоматического анализа получаемых микроскопических изображений являются несовершенными.

В главе I показано, что в то время как существует целый ряд кинетических моделей, описывающих процессы репарации ДР ДНК по основным механизмам при воздействии острого облучения, до сих пор не было создано моделей, описывающих эффекты пролонгированного излучения на молекулярном уровне.

Глава II. Разработка алгоритма автоматического анализа флуоресцентных изображений с фокусами белков репарации ДНК. Глава II посвящена разработке и валидации алгоритма автоматического анализа флуоресцентных изображений с ядрами клеток и фокусами маркеров повреждений ДНК внутри них. Составленный алгоритм включает несколько последовательных фаз: детекцию ядер (бинаризацию и ; сегментацию изображения ядер) и детекцию фокусов (рис. 1).

Рисунок 1. Последовательность обработки изображений, а - исходное изображение с ядрами клеток, окрашенных красителем DAPI; б - результат бинаризации изображения с ядрами клеток. Белым показан фон. черным - ядра клеток: в - результат сегментации клеточных ядер. Обнаруженные ядра показаны цветом; г - исходное изображение с фокусами гистона уН2АХ: д - результат контрастирования исходного изображения с фокусами уН2АХ; е - совмещенное изображение с обнаруженными в результате работы

алгоритма ядрами и фокусами.

Под бинаризацией исходного изображения с ядрами клеток подразумевается разделение всех точек этого изображения на два множества — ядра и фон. На полученном бинарном изображении точки, принадлежащие нескольким соседним ядрам, могут образовывать связный кластер, поэтому следующим этапом алгоритма является сегментация бинарного изображения, в результате которой всё множество точек, не принадлежащих фону, оказывается разделено на подмножества, соответствующие отдельным ядрам клеток. Далее, точки, принадлежащие ядрам клеток, участвуют в алгоритме детекции фокусов на изображениях с флуоресцентно мечеными белками репарации ДНК. Перед применением алгоритма детекции фокусов происходит дополнительное контрастирование и нормировка на фон изображений с фокусами. Таким образом, для каждого из ядер, найденных на первом изображении, происходит независимый подсчёт параметров фокусов, обнаруженных на втором изображении.

Для идентификации границ клеток нами был использован алгоритм Кэнни, а для сегментации скоплений клеток на отдельные клетки — алгоритм водораздела. Для идентификации фокусов был использован алгоритм, основанный на последовательном применении оператора Лапласа к результатам применения Гауссова фильтра с различными значениями дисперсии к исходному изображению (ЛОГ алгоритм). Исходно, данный алгоритм был использован для поиска объектов на телескопических изображениях, однако он как нельзя лучше подходит и для анализа изображений, полученных с помощью флуоресцентного микроскопа. Для реализации указанных алгоритмов в разработанном программном обеспечении был использован язык программирования Python и открытый код из программных пакетов SciPy и scikit-image.

Для валидации алгоритма детекции ядер был использован тестовый набор из 400 изображений ядер клеток первичных фибробластов кожи человека, окрашенных флуоресцирующим красителем DAPI. Всего этот набор содержал 6813 отдельных клеточных ядер. В результате применения составленного алгоритма детекции ядер к данному набору изображений границы 6581 ядра были идентифицированы корректно, что составило чуть более 96,5 % от числа всех клеточных ядер. Такой результат является достаточно высоким в сравнении с другими алгоритмами. Другим важным преимуществом составленного алгоритма по сравнению с аналогами является возможность подсчета не только числа, но и целого ряда других параметров фокусов, включая их площадь и интенсивность флуоресценции. В ходе настоящей работы было разработано специальное программное приложение с графическим интерфейсом, позволяющее быстро настраивать и запускать обработку больших наборов изображений с помощью созданного алгоритма, а также визуально оценивать результат такой

обработки. Указанное программное обеспечение доступно для скачивания в сети интернете по адресу hnpsr/ygithiiKcpni/varnivev/darfi.

Глава III. Получение экспериментальных данных по кинетике формирования и деградации фокусов белков уН2АХ и Rad51. В главе III представлены экспериментальные данные по кинетике формирования и деградации фокусов белков уН2АХ и Rad51 в клетках млекопитающих при действии редкоионизирующего излучения с различной мощностью, необходимые для составления кинетической модели репарации ДР ДНК.

III.1. Материалы и методы. В работе использовали культуру клеток линии V79 (фибробласты легких китайского хомяка). Клетки культивировали в стандартной полной среде DMEM, содержащей 10 % фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 1 % L-глутамина и антибиотики (пенициллин и стрептомицин) в условиях стандартного ССЬ-инкубатора при 37°С в атмосфере с 5 %-м содержанием СО?. Также были использованы клетки первичных фибробластов кожи человека (ПФЧ), взятые у здоровых доноров в возрасте 20-30 лет. Условия культивирования ПФЧ были аналогичными таковым для клеток линии V79. У всех доноров было получено согласие на проведение данного исследования. Для проведения экспериментов были использованы клетки Зго пассажа.

Облучение клеток проводили в чашках Петри при соблюдении условий постоянной температуры, равной 37°С. Все клетки были высажены на чашки не позже, чем за 24 ч до начала облучения, а в момент облучения находились в фазе экспоненциального роста и имели концентрацию 2x103 клеток на см3 среды с плотностью заполнения поверхности чашек в диапазоне 60 - 80 %. Для облучения клеток были использованы:

1) установка «Луч» (Россия), источник гамма-излучения 60Со. Общие накопленные дозы излучения для клеток составляли 0,36; 1,44; 2,88 и 4,32 Гр. Мощность дозы излучения варьировали путем изменения расстояния до источника излучения (высоты столика, на котором располагались чашки с клетками). Были использованы следующие режимы мощности дозы с соответствующими временами облучения: 400 мГр/мин (0,9; 3,6; 7,2 и 10,8 мин), 10 мГр/мин (0,6; 2,4; 4,8 и 7,2 ч) и 1 мГр/мин (6; 24; 48 и 72 ч).

2) рентгеновская биологическая установка РУСТ-MI (Россия). Общие накопленные дозы излучения для клеток составляли 0,25; 0,5 и 1,0 Гр. Мощность дозы излучения варьировали с помощью изменения силы тока и анодного напряжения. Были

7

использованы следующие режимы мощности дозы с соответствующими значениями силы тока, напряжения и временами облучения: 400 мГр/мин (2,4 мА; 200 кВ; 0,72; 1,33 и 2,55 мин), 40 мГр/мин (0,8 мА; 100 кВ; 6,5; 13 и 26 мин) и 4 мГр/мин (0,4 мА; 50кВ; 56, 112 и 224 мин).

Для анализа флуоресценции фокусов белков уН2АХ и Rad51 была использована методика, описанная в работе. Клетки на покровных стеклах фиксировали параформальдегидом (2 % в трис-буфере, рН 7,4), промывали трис-буфером, пермеабилизировали холодным (-20°С) метанолом в течение 1 мин и помещали на 20 мин в трис-буфер, содержащий 4% фетальной сыворотки крупного рогатого скота и 0,1% раствора Triton Х-100. Слайды инкубировали с кроличьими моноклональными антителами к белку уН2АХ (Merck-Millipore) или смесью мышиных моноклональных антител к белку уН2АХ (Merck-Millipore) и кроличьих антител к белку Rad51 (Merck-Millipore) при 4°С в течение ночи, после чего промывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч со вторичными антителами (козьи антитела к кроличьему или мышиному иммуноглобулинам G (H+L), соответственно, конъюгированные с флуорохромами родамином (Merck-Millipore), А1еха488 (Merck-Millipore) или А1еха555 (Life Technologies)). ДНК окрашивали флуоресцентным красителем DAPI (0,5 мкг/мл, 5 мин). Визуализацию, документирование и обработку иммуноцитохимических микроизображений осуществляли на люминесцентном микроскопе Nikon Eclipse Ni-U (Nikon), оснащенным видеокамерой высокого разрешения ProgRes CFcool (Jenoptik AG). Для каждой экспериментальной точки была проанализирована флуоресценция белков в ядрах не менее 100 клеток.

Для подсчета числа и интеграла плотности интенсивности фокусов уН2АХ и Rad51 был использован программный пакет, описанный в главе И. Все настройки программного пакета, кроме чувствительности алгоритма детекции клеток, сохранялись постоянными в ходе анализа одного эксперимента. Расчет уровня колокализации между фокусами белков проводился вручную с использованием метода двойного слепого контроля. Статистическую обработку результатов экспериментов и расчет доверительных интервалов проводили стандартными статистическими методами (t-критерий Стьюдента) с использованием алгоритмов, реализованных в открытом программном обеспечении SciPy. Все доверительные интервалы соответствуют распределениям значений, полученным по набору исследованных клеток, а не по набору экспериментов. Однако, все представленные данные являются результатом обсчета не менее трех независимых экспериментов.

Ш.2. Анализ флуоресценции гистона уН2АХ в клетках линии У79. В ходе работы были проанализированы изменения числа фокусов уН2АХ в клетках У79 при действии гамма-излучения с различной мощностью дозы. На рис. 2 представлены результаты сравнительных исследований изменения среднего числа фокусов гистона уН2АХ в ядрах клеток при остром (400 мГр/'мин) и пролонгированном (1 и 10 мГр/мин) облучении клеток китайского хомяка в диапазоне доз 0,36-4,32 Гр.

<100 гм

> 80 03

и 60 >

I40

° 20 и я т

О 1 мГр/мин А 10 мГр/мин - X 400 мГр/мин

з>

,'Т

, ■ А"

Ф

ф

ф

.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Доза излучения, Гр

Рисунок 2. Число фокусов уН2АХ в клетках китайского хомяка линии У79 при облучении с высокой (400 мГр/мин), умеренной (10 мГр/мин) и низкой (1 мГр/мин)

мощностью дозы у-излучения.

Анализ числа фокусов в случае острого облучения проводили через 30 мин после окончания облучения. Было показано, что при остром облучении зависимость числа фокусов уН2АХ от дозы излучения близка к линейной. Зависимость доза-эффект для остро облученных клеток хорошо аппроксимируется линейной функцией 3' = 1,2 +19,7л- (Я2 =0,98), где «у» - среднее число фокусов уН2АХ в клеточном ядре, а «х» - доза излучения в Гр. Таким образом, исходя из предположения, что один фокус соответствуют одному ДР, можно полагать, что острое облучение клеток линии У79 индуцирует в клетках в среднем ~ 20 ДР на ядро одной клетки на Гр. Полученное значение соответствует литературным данным для редкоионизируюшего излучения [АБаШттЬу е1 а!., 2009]. В то же время показано, что при малой мощности излучения (1 мГр/мин) наблюдается лишь незначительное (до 7 фокусов), практически не зависящее от накопленной дозы увеличение числа фокусов уН2АХ.

9

Ш.З. Анализ флуоресценции гистона уН2АХ в клетках ПФЧ. В разделе III.3 представлены данные по кинетике формирования и деградации фокусов уН2АХ при трех различных значениях интегральной накопленной дозы излучения - 0,25; 0,5 и 1 Гр. При этом мощность 400 мГр/мин соответствовала острому режиму облучения, 4 мГр/мин - пролонгированному, а 40 мГр/мин - промежуточному. При всех трех исследованных значениях мощности дозы происходит уменьшение числа фокусов уН2АХ в облученных клетках с уменьшением интегральной накопленной дозы. Однако, этот эффект является более выраженным в случае острого и промежуточного режимов облучения (400 и 40 мГр/мин), где с уменьшением дозы от 1 до 0,25 Гр происходит падение пиковой интенсивности почти в 3 раза, в то время как в случае пролонгированного (4 мГр/мин) - менее, чем в полтора (рис. За и 36).

200

и

х СС £ ф

<и п. о

= 150

-е- Йюо

-с X

ь %

о ю £ 8 50

«и -8-

А

О 4 мГр/мин • X 400 мГр/мин

0,25 Гр

а

Ж'

600-

0.25 0.5 1 2 4 6 8 24

Время после облучения, ч

50-

ш

40

ё х

ё- 5

>•^-30

£ 5 20

х >-10

= I

ш -в-

£ 0

О 4 мГр/мин ■ Д 40 мГр/мин • К 400 мГр/мин

£ Я

в

■4' .¿-Ф^.Лл

.4»*' ! '-'к

| Ш500

а = :

§■ О400

■е- Йзоо

! О 4 мГр/мин •X 400 мГр/мин

ё ш200

х о

ю £

5 *чоо

X О

ш -В-

£ о;

1,0 Гр б

Ф о

Ф

6.......О ;

>8-

0,25 Гр

180

0.25 0.5 1 2 4 6 8 24 Время после облучения, ч

а> =1 и ш о. о

1- сс

и -о

^140

&120

-«100! 1г>

"5 80

60

0.25 0.5 1 2 4 6 8 24

Время после облучения, ч

| 3 40 £ о 20

г-8" о

О 4 мГр/мин Д 40 мГр/мин . ■ X 400 мГр/мин 1,0 Гр ,-фФ г А

О

Ф ь ¥ Ж

в , А _ * • ^

0.25 0.5 1 2 4 6 8 24

Время после облучения, ч

Рисунок 3. Изменение интенсивности флуоресценции фокусов уН2АХ (а,б) и Яаё51 (в,г) в клетках культуры ПФЧ, облученных рентгеновским излучением в дозах 0,25 (а,в) и 1 (б,г) Гр с мощностью дозы 4, 40 и 400 мГр/мин, в течение суток после облучения. По горизонтальной оси использован логарифмический масштаб.

Помимо дозовой зависимости также наблюдается выраженная зависимость числа фокусов от мощности дозы. При переходе от острого (400 мГр/мин) к пролонгированному режиму облучения (4 мГр/мин) пиковая интенсивность флуоресценции фокусов снижается в 1,5 - 2 раза. При этом, описанные различия заметны только в течение первых двух часов после окончания облучения. Начиная с 4 ч после окончания облучения, различия в интенсивности фокусов клеток, облученных в одной и той же интегральной накопленной дозе, но с разной мощностью становятся статистически неразличимыми. Кроме того, при уменьшении общей накопленной дозы степень зависимости интенсивности флуоресценции фокусов у ШАХ от мощности дозы уменьшается.

III.4. Анализ флуоресценции белка Rad51. С целью исследовать активность гомологической рекомбинации в клетках ПФЧ, облученных с различными значениями интегральной накопленной дозы и мощности дозы, были получены кинетики образования фокусов Rad51, ключевого белка ГР (рис. Зв и Зг).

Отличительной особенностью фокусов Rad51 от фокусов уН2АХ является то, что они присутствуют не во всех клетках. В нашем случае доля клеток с выраженными фокусами Rad51 варьировала в интервале между 5 и 30 %, достигая максимума через 46 ч после облучения. Полученные результаты соответствуют результатам других авторов, которые показывают, что ГР идет преимущественно в клетках, находящихся в G2 фазе клеточного цикла, с использованием гомологии сестринских хроматид [Johnson et al., 2000]. Таким образом, в отличие от кинетик изменения интенсивности флуоресценции уН2АХ, аналогичные кинетики для белка Rad51 отражают не только изменение интенсивности флуоресценции фокусов Rad51 внутри клеток, но и долю клеток, в которых в принципе есть фокусы. Максимум флуоресценции фокусов Rad51 при всех исследованных значениях накопленной дозы и мощности дозы приходится на временной интервал 4 - 8 ч после окончания облучения. Уровень флуоресценции фокусов Rad51 через 24 ч после окончания облучения снижается, но, в отличие от фокусов уН2АХ, не опускается до контрольного уровня. Пиковая интенсивность фокусов Rad51 убывает с уменьшением дозы излучения. Неожиданным, ранее не показанным результатом является увеличение максимальной интенсивности флуоресценции Rad51 с уменьшением мощности дозы. На его основе можно сделать предварительный вывод о более высокой активности репарации по пути ГР в случае пролонгированного облучения по сравнению с острым.

Помимо интенсивности флуоресценции фокусов Rad51 при различных значениях интегральной накопленной дозы и мощности дозы излучения была проанализирована

11

колокализация фокусов Rad51 с фокусами уН2АХ. Уровень колокализации фокусов был максимальным через 4 ч после облучения. В этот момент значения интенсивности флуоресценции как уН2АХ, так и Rad51 имеют достаточную величину. Доля фокусов уН2АХ, колокализованных с фокусами Rad51, изменялась в пределах от 2 до 9 %, с тенденцией к увеличению при понижении мощности дозы, что отражает уже упомянутую закономерность по увеличению роли ГР с уменьшением мощности дозы. Доля фокусов Rad51 колебалась в интервале от 30 до 50 % без ярко выраженной зависимости. Колокализация фокусов Rad51 и уН2АХ наблюдалась другими авторами и ранее [Pauli et al., 2000; Fernandez-Capetillo, 2003]. Интересным наблюдением в данном случае является то, что далеко не все фокусы Rad51 колокализованы с фокусами уН2АХ. Это указывает на то, что процесс дефосфорилирования гистона уН2АХ в области ДР может происходить до окончания его репарации по пути ГР.

Глава IV. Построение кинетической модели индукции и репарации ДР ДНК.

IV.l. Общий вид кинетической модели. При составлении модели были использованы представления о наличии двух типов двунитевых повреждений ДНК: простых и сложных двунитевых разрывов [Michalik et al., 1994]. В то время как простые разрывы могут быть немедленно устранены с помощью одного из механизмов репарации ДР ДНК, сложные требуют специального предпроцессинга, поскольку их формирование сопровождается появлением дополнительных повреждений, таких как образование пиримидиновых димеров, неэнзиматическое метилирование оснований и др. Кроме того, различные механизмы репарации, НГСК и ГР так же имеют значительно различающуюся кинетику, что было отражено при составлении модели.

Принципиальная схема составленной кинетической модели репарации приведена на рис. 4, а первоначальный вид использованных дифференциальных уравнений приведён в формулах IV. 1 - IV. 17. Модель основана на представлении о последовательном образовании ряда комплексов ДНК-белок в процессе репарации ДР. Каждое из уравнений системы описывает изменение концентрации одного из компонентов системы во времени. При составлении модели были использованы уравнения закона действующих масс и уравнения кинетики Михаэлиса-Ментен.

Первые два уравнения системы (формулы IV. 1 и IV.2) описывают изменение концентрации вновь образованных свободных простых Со и сложных Со ДР соответственно.

^- = a—-k.C0[Ku70/80], (IV. 1) dt di

= a—-*,C0'[Jü/70/80], (IV.2) dt dt

Сложные разрывы

Повреждение a' —t ДНК

Простые разрывы

® - ^ sCjV&'c,

кг) ЩР

Ь» » * 1Í

íJj ípv,c.c4 к5}

Репарация с6^6 J ДНК j ,

Гомологическая рекомбинация

Белковые комплексы

О KU70/80

[ ДНК-ПКкс

• Фосфат

fe MRN комплекс

CD ФРА

Rad51

Ш 1.' XRCC4/ Лигаза IV

О Гистон Н2АХ

Негомологичное соединение концов

Рисунок 4. Общая схема составленной кинетической модели репарации ДР ДНК. Стрелками показаны химические реакции, буквами обозначены концентрации комплексов ДНК-белок и константы скорости реакций.

Концентрация образованных разрывов пропорциональна мощности дозы

излучения, воздействующего на клеточную популяцию в данный момент времени — с

di

коэффициентами а и а' соответственно. Вскоре после образования разрывов обоих типов, происходит их первичная рецепция путем связывания с белком Ки70/80. Этот процесс имеет константу скорости к\. Здесь и далее в уравнениях концентрация свободных белков в системе обозначена названием соответствующего белка, взятого в квадратные скобки.

На следующем этапе с комплексами простых и сложных ДР ДНК с Ки70/80 (С, и С,) соединяется каталитическая субъединица ДНК протеинкиназы (формулы IV.3 и IV.4). Скорость этого процесса определяется константой к,. Комплекс ДНК-ПКкс и Ки70/80 собственно и составляет ДНК-ПК.

= к,Си [КиЮ/Щ-к2С. [ДНКПКкс], (IV.3)

dt

= А-,С0'[А'ы70/80]-LC\ [ДНКПКкс], (IV.4)

dt

Далее происходит двухступенчатое автофосфорилирование комплексов ДР ДНК и ДНК-ПК (С, и С2) с образованием активированных форм этих комплексов, фосфорилированных по одному (С3 и С3), а затем по двум остаткам серина (С4и С4). Существуют различные гипотезы о порядке реакций автофосфорилирования ДНК-ПК. Если каждая активированная молекула ДНК-ПК фосфорилирует собственный остаток серина, то реакция автофосфорилирования имеет первый порядок, в то время как если фосфорилирование одной молекулы ДНК-ПК происходит с использованием каталитического центра другой - второй порядок. Точного ответа на вопрос о том, какой из этих сценариев соответствует действительности, пока нет. В описываемой модели было использовано представление о том, что обе реакции имеют первый порядок с константами скорости кз и кц соответственно.

= КС, [ДНКПККС]-к,С,, (IV.5)

dt

^f- = к2С; [ДНКПКкс] - к,а (IV.6)

dt

(IV.7)

dt dC'

= -k4Q (IV.8)

)

В процессинге сложных двунитевых разрывов может участвовать целый ряд белков и их комплексов, таких как MRN-комплекс, Artemis, ДНК-полимераза S и др. Очевидно, что процессинг разных типов повреждений, сопутствующих ДР, в частности аддуктов оксо-гуа, пиримидиновых димеров, модификаций отдельных оснований, может иметь различную кинетику. Тем не менее, чтобы сократить число свободных параметров системы, мы использовали представление об универсальном механизме

процессинга таких модификаций с участием МКЫ-комплекса. Образование процессингого комплекса ДР ДНК - ДНК-ПК - МЯК' (С5) происходит с константой скорости к5.

^ = А'4С; -А-5СЛМ&У], (IV.9)

ш

После окончания процессинга дополнительных повреждений МШ\т-комплексом происходит его диссоциация от комплекса с ДР и, таким образом, с этого момента различие между кинетикой репарации простых и сложных разрывов исчезает, а комплексы бывших сложных ДР пополняют пул активированных комплексов ДНК-ПК с простыми ДР (С4).

^ = А-5С4'[М^]-А-4'С„ (IV. 10)

ш

Дальнейшая репарация двунитевых разрывов происходит по одному из двух основных путей: НГСК и ГР. Ключевым белковым комплексом, осуществляющим лигирование концов ДНК по механизму НГСК, является комплекс Х11СС4/Лигаза IV. Скорость образования комплексов ДР - ХЯСС4/Лигаза IV (С6) из активированных комплексов ДР - ДНК-ПКкс определяется константой А>„ а скорость их деградации -константой /су. В результате все белки комплекса диссоциируют, а двунитевой разрыв исчезает.

= -к6С,[ХЯСС4/Ыё1¥\-к,С^ (IV.! 1)

Iи

= к6С4[ХЛСС4/Лигаза1Г]-кХ\, (IV. 12)

Л

В случае репарации ДР по пути гомологической рекомбинации в начале происходит связывание поврежденного участка ДНК с множеством единиц белка фактора репликации А. Поскольку ФРА находится в большом избытке, в построенной модели реакция образования комплекса ДР - ФРА имеет первый порядок с константой скорости к-х.

Следующим этапом гомологической рекомбинации является самая медленная реакция представленной модели, в процессе которой образуется комплекс участка ДР ДНК с гомологичной хромосомой и ключевым белком, участвующим в ГР, Яас151 (С9). В построенной модели эта реакция имеет второй порядок и её кинетика описывается константой скорости к9.

-2- = А'8С4 -k9Cs[Rad51], (IV. 13)

at

= к,C\[Rad 51]-ki0C9, (IV. 14)

at

Процесс деградации комплекса ДР ДНК - Rad51 имеет первый порядок и константу скорости £10. В результате этого процесса все белки комплекса диссоциируют, а двунитевой разрыв исчезает.

Число двунитевых разрывов, репарация которых завершена и протекала по путям НГСК и ГР, соответствует концентрациям С7 и С10.

dC, , „

^ = (IV. 15)

= (IV. 16)

at

Общее число всех успешно репарированных ДР равно сумме ДР, репарация которых шла по путям НГСК и ГР (С, + С10).

Фосфорилирование гистона Н2АХ происходит в широкой окрестности от непосредственного места образования двунитевого разрыва, величина которой может достигать двух мегабаз. В реальности в этом процессе участвуют как минимум два белка семейства ФИСК: ATM и ДНК-ПК. Тем не менее, они имеют схожие механизмы активации и кинетику фосфорилирования, поэтому в ходе составления описываемой модели принято допущение, что за весь процесс фосфорилирования ШАХ отвечает активированная форма ДНК-ПК. Для описания этого процесса была использована кинетика Михаэлиса-Ментен с константой скорости к7 и константой Михаэлиса км . Механизмы, лежащие в основе процесса дефосфорилирования гистона уН2АХ, в данный момент изучены недостаточно,, поэтому в модели была использована простая кинетика первого порядка с константой скорости kj.

dy_ _ ^у [ДНКПКОКт ] [Н2АХ] _ ^

dt ки+[ДНКПКакт] d >

В этом уравнении у соответствует концентрации фосфорилированного белка уН2АХ, а ЩНКПКа„„] - это сумма концентраций всех комплексов ДР ДНК - ДНК-ПК, где ДНК-ПК фосфорилирована по одному или двум остаткам серина.

1ДШШКт2 = ^С„ (IV. 17а)

1-3

IV.2. Замена переменных, подбор коэффициентов и валидация модели. Для того, чтобы упростить представленную модель и уменьшить число неизвестных в системе,

16

была произведена замена переменных. Поскольку в модели напрямую не учитывалась возможность экспрессии рассматриваемых белков, было введено понятие квазипостоянного пула для каждого из белков (/>), который складывается из концентрации свободного белка ([£,]) и суммы концентраций всех комплексов, включающих этот белок в связанном виде.

/?=[£;.] += const, (IV. 18)

В результате была сделана следующая замена переменных:

xt гдеР = РЬ (IV. 19)

Р,= (IV.20)

(IV.21)

Таким образом, постоянные пулы всех белков, кроме первого (Ки70/80), были включены в новые масштабированные константы скоростей соответствующих реакций (А',). Единственный, оставшийся в системе параметр Р - является масштабирующим коэффициентом, определяющим размерность всех концентраций, участвующих в системе.

В результате была получена система из 17 уравнений, содержащая 17 свободных параметров. Подбор коэффициентов проводился последовательно с помощью модифицированного алгоритма Левенберга-Марквардта с добавлением теплового шума. В качестве функции для минимизации была использована взвешенная сумма квадратов отклонений модельных значений от экспериментальных. Для тренировки и подтверждения статистической достоверности модели были использованы литературные данные по времени жизни комплексов ДНК-Ки70/80 и ДНК-Ки70/80-ДНКПКкс в клетках линии V79, полученные методом гашения флуоресценции [Mari et al., 2006]. Также были использованы данные по кинетике репарации двунитевых разрывов ДНК, полученные методом электрофореза в пульсгеле [Kysela et al., 1993; Lobrich et al., 1998; Belli et al., 2000], и данные по образованию фокусов yffiAX и Rad51 в местах репарации двунитевых разрывов ДНК в ответ на облучение с различными мощностями доз, полученные нашим коллективом (глава III) и другими авторами [Leatherbarrow et al., 2006; Bee et al., 2013]. Все использованные данные были получены на клетках фибробластов млекопитающих линий V79, CCD34 и первичных фибробластах человека при известных параметрах облучения: накопленной дозе, мощности дозы излучения и источнике излучения.

Всего для построения модели и подбора последних 12 свободных параметров были использованы 182 экспериментальных значения. Для статистической валидации модели 29 из них не были использованы в тренировочном наборе и были выделены в отдельный тестовый набор. Кроме того, был использован метод перекрёстной оценки устойчивости модели к небольшим модификациям тренировочной выборки путём исключения по тридцать точек (д2 =0,83). Средняя квадратичная ошибка данных, полученных из модели, по сравнению с экспериментальными составила 8,31 % для тренировочного и 9,78 % для тестового наборов соответственно, что является близким к погрешности экспериментальных данных. Для проверки асимптотической устойчивости модель была линеаризована, а затем исследована с помощью критерия Рауса-Гурвица. Учитывая всё, сказанное выше, можно заключить, что построенная модель является статистически достоверной, объем данных для тренировочной и тестовой выборок является достаточным, а выбранная форма уравнений хорошо подходит для описания исследуемых процессов индукции и репарации ДР ДНК. Область возможного применения модели ограничена значениями мощности дозы и интегральной накопленной дозы в экспериментах, использованных для тренировки модели (1 - 1000 мГр/мин, 0,25 - 5 Гр).

1У.З. Результаты моделирования. На рис. 5а приведены данные моделирования кинетики накопления и деградации фокусов уН2АХ в течение нескольких часов после окончания облучения при различной мощности дозы. Из рисунка видно, что в случае острого облучения (400 мГр/мин) системы репарации не успевают полностью активироваться во время периода кратковременного облучения, и максимум числа фокусов репарации приходится на 30-40 минут после окончания облучения. В случае пролонгированного облучения (1,10 мГр/мин) баланс между образованием новых ДР и активностью систем репарации ДР наступает задолго до окончания облучения. Поэтому в ходе облучения число фокусов репарации выходит на плато, держится на этом плато ещё некоторое время (~ 40 мин) после окончания облучения, а затем плавно спадает.

На рис. 56 показано полученное с помощью модели соответствие между числом двунитевых разрывов и числом фокусов уН2АХ через 30 минут после окончания облучения в клетках, облученных в дозе 0,5 Гр. Рисунок демонстрирует наличие похожей линейной зависимости между этими величинами, как для острого (400 мГр/мин), так и для пролонгированного (1 мГр/мин) режимов облучения. Существенные отклонения от прямой наблюдаются только в области очень малого и пикового числа фокусов. Это связано с высокой скоростью изменения числа ДР в обеих областях. Процесс фосфорилирования гистона Н2АХ запаздывает по сравнению с

18

процессом образования ДР и достигает наибольшей скорости в момент, когда начинается снижение числа ДР. Этим же объясняется тот факт, что пиковое значение числа фокусов уН2АХ, которое наступает спустя 30-40 мин после начала облучения, соответствует лишь 80 % от пикового значения числа ДР. которое приходится на

момент окончания облучения.

ж 140

| 5120

си =100 ° °

>-><80 -я- **

^^ гч__

л I 60

§ § 40 т о

I о 20

ш -в-

3 8.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 40 400

Доза излучения, Гр Мощность дозы, мГр/мин

Рисунок 5. а - кинетика образования и деградации фокусов уН2АХ после окончания

облучения с различной мощностью дозы (доза 1 Гр); б - зависимость между числом ДР

и числом фокусов уН2АХ в клетках фибробластов млекопитающих, облученных с

различной мощностью дозы с интегральной накопленной дозой 0,5 Гр. через 30 минут

после окончания облучения: в - дозовые зависимости интенсивности флуоресценции

фокусов уН2АХ через полчаса после окончания облучения ири различной мощности

дозы; г - зависимость интенсивности флуоресценции фокусов Яас151 в облученных

клетках от мощности дозы при различных дозах излучения.

Сам по себе этот результат представляет определенный интерес, поскольку демонстрирует, что представление о том. что одному фокусу гистона уН2АХ

Предел — 400 мГр/мин ••■• 10 мГр/мин ....... 1 мГр/мин В

£250 §200

-в-¡5 150

-а т

У- сс

£ т 100

5 I.

ш -е-

!= п

4 Г / * * >... * * *...... * '' •. * ' * •. Л' Г ....... 0,5 Гр •••• 1,5 Гр 2,5 Гр 4 *

соответствует один ДР [Яо§акои е! а!., 1998], является не вполне корректным в том смысле, что общее число возникших в процессе облучения ДР, как минимум, на 20 % больше числа наблюдаемых через полчаса после облучения фокусов уН2АХ. Тем не менее, полученные данные подтверждают показанную ранее возможность использования числа и интенсивности флуоресценции фокусов уН2АХ в качестве оценки числа ДР, индуцированных редкоионизирующим излучением, как в случае острого, так и пролонгированного режимов облучения.

11---Л-------1- —5.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

Поглощенная доза, Гр

Рисунок 6. Зависимость доли ДР, репарация которых идет по пути гомологической рекомбинации, от дозы излучения и мощности дозы. Уровень ГР в облученных клетках показан цветом в соответствии со шкалой в правой части рисунка.

С помощью построенной модели может быть показан различный характер дозовой зависимости числа фокусов уН2АХ через полчаса после окончания облучения при различной мощности дозы (рис. 5в). В случае пролонгированного режима

облучения с малой мощностью дозы увеличение накопленной дозы выше определенного порогового значения (порядка 0,4 Гр для облучения с мощностью 1 мГр/мин) не приводит к увеличению числа фокусов уН2АХ, а значит и числа ДР. Такой вид дозовой зависимости легко объяснить следующим образом: в случае облучения клеток с малой мощностью дозы скорость образования ДР такова, что возможностей систем репарации оказывается достаточно для установления динамического равновесия между процессами индукции и репарации ДР. Однако, в случае облучения с высокой мощностью дозы этих возможностей уже не хватает, и происходит постепенно замедляющееся накопление фокусов уН2АХ и ДР с увеличением накопленной дозы.

Традиционной является линейная аппроксимация дозовой зависимости числа ДР и фокусов уН2АХ при остром облучении клеток. Действительно, полученная из построенной модели кривая для острого облучения (400 мГр/мин) может быть аппроксимирована прямой. Более того, предельный вид этой кривой, соответствующий случаю очень высокой мощности дозы, когда скорость процессов репарации ДР пренебрежимо мала по сравнению со скоростью их образования, представляет собой прямую (на рис. 5в показана серым пунктиром). Такой результат соответствует экспериментальным данным, и похож на аналогичный график, полученный с помощью модели Куцинотты [СиапоПа И а1., 2008].

Более интересной выглядит зависимость пикового по времени уровня флуоресценции 11ас151 от мощности дозы излучения. В то время как с увеличением дозы происходит монотонное увеличение интенсивности флуоресценции фокусов 11ас151, зависимость их числа от мощности дозы имеет максимум (рис. 5г). При различных значениях накопленной дозы (0,25 - 5 Гр) максимум флуоресценции фокусов 11ас151 соответствует значениям мощности дозы в диапазоне 1,5-20 мГр/мин.

Поскольку интенсивность флуоресценции белка 11ас151 напрямую связана с активностью репарации по пути ГР, можно было ожидать существование определенного оптимума значений дозы излучения и мощности дозы, при котором доля гомологической рекомбинации была бы максимальна. Для демонстрации факта наличия такого оптимума была построена тепловая диаграмма, демонстрирующая долю ДР, репарация которых протекает по пути ГР, в зависимости от величины накопленной клетками дозы излучения и мощности дозы (рис. 6).

Бьио показано, что соотношение доли репарации по путям ГР и НГСК может меняться в диапазоне 2—40 % в зависимости от дозы и энергии квантов используемого ИИ [№к]оо е1 а1., 2001]. Данные, полученные с помощью построенной в ходе настоящей работы модели, показывают, что мощность дозы так же является принципиально

важным фактором, влияющим на вклад ГР в процесс репарации ДР. Максимум вклада ГР при использовании терапевтически релевантных доз наблюдается на границе малых и средних мощностей дозы (5 - 20 мГр/мин). При этом, так же как и для значения флуоресценции фокусов Rad51, существует тенденция к увеличению максимума вклада ГР по мощности дозы с увеличением накопленной дозы излучения. В целом, согласно полученным данным доля вклада ГР в диапазоне доз 0,25 - 2,5 Гр и мощности дозы 1 -400 мГр/мин изменяется от 5 до 20 %.

Существуют представления о том, что ГР является более точным по сравнению с НГСК механизмом репарации ДР, в процессе которого образуется меньшее число как точечных мутаций, так и хромосомных аберраций [Takata et al., 1998; Sasaki et al., 2004]. С учетом этого, уменьшение доли ГР при увеличении мощности дозы и переходе от пролонгированого к острому режиму облучения может быть объяснено следующим образом: в случае острого облучения и быстрого накопления ДР в клетке, преобладает более быстрый, но менее точный путь репарации ДР - НГСК. Тем не менее, как было показано выше, даже в этом случае возможностей систем репарации может быть недостаточно для устранения всех образующихся ДР. В случае действия облучения с малой мощностью дозы (до 40 мГр/мин) клетки используют более длительный, но и более надежный путь репарации - ГР.

Полученные данные могут представлять большой практический интерес. В свете последних данных, показывающих связь между некоторыми отдаленными последствиями облучения, такими как число мутаций, хромосомных аберраций и рядом эпигенетических эффектов, включая метилирование ДНК и деацетшгарование гистонов, и соотношением вкладов путей НГСК и ГР в репарацию ДНК, можно говорить о принципиальных различиях последствий действия острого и пролонгированного режимов облучения [Botrugno et al., 2012; Strozyk et al., 2013]. Большие перспективы открывает возможность модулирования соотношения вкладов ГР и НГСК путем изменения мощности дозы. Более того, недавно была показана положительная корреляция между уменьшением вклада ГР в репарацию радиационно-индуцированных ДР и увеличением уровня автофагии в облученных клетках [Alessio et al., 2014]. В большинстве случаев автофагия является крайне нежелательным эффектом в случае радиотерапии опухолей. Активность этого процесса напрямую связана с вероятностью возникновения рецидивов после окончания терапии [Kuwahara et al., 2011]. Таким образом, можно предположить, что использование оптимальных режимов облучения с малой и средней мощностями дозы в радиотерапии, максимизирующих вклад репарации по пути ГР, может оказаться наиболее эффективным с точки зрения

минимизации вероятности рецидива опухолей. Однако, следует иметь ввиду, что регуляция репарации ДР ДНК в линиях опухолевых клеток бывает нарушена [Henning et al., 2003], поэтому вопрос влияния мощности дозы излучения на соотношение вкладов путей репарации в этих клетках требует дополнительного исследования.

ВЫВОДЫ

1) Разработан программный пакет для автоматического анализа числа, площади и интенсивности флуоресценции фокусов белков репарации ДНК. Показана статистическая достоверность получаемых результатов по сравнению с подсчётом вручную (R2 > 0,9) при ускорении процесса обработки изображений в 10-20 раз. Показано увеличение числа корректно обрабатываемых клеток, точности и скорости расчётов параметров фокусов по сравнению с другими доступными программами обработки флуоресцентных изображений;

2) Проведены сравнительные исследования изменений количественного выхода фокусов фосфорилированного гистона уН2АХ в клетках линии V79 фибробластов лёгкого китайского хомяка, подверженных действию у-излучения в дозах 0,36 -4,32 Гр, в зависимости от мощности дозы. Показано, что при пролонгированном облучении с низкой мощностью дозы (1 мГр/мин) число фокусов практически не зависит от накопленной дозы, в то время как при остром облучении с высокой мощностью дозы (400 мГр/мин) - линейно возрастает с увеличением дозы излучения;

3) Изучены кинетики формирования и деградации фокусов фосфорилированного гистона уН2АХ и ключевого белка гомологической рекомбинации Rad51 в клетках первичных фибробластов кожи человека, подверженных воздействию высокоэнергетического рентгеновского излучения (50*- 200 кэВ) с интегральной накопленной дозой 0,25 - 1 Гр и мощностью дозы 4 - 400 мГр/мин. Показано, что интенсивность флуоресценции фокусов уН2АХ убывает с уменьшением мощности дозы, в то время как интенсивность флуоресценции Rad51 наоборот возрастает;

4) На основе полученных данных по кинетике образован™ фокусов белков уН2АХ и Rad51 составлена кинетическая модель репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках фибробластов млекопитающих, впервые учитывающая .влияние мощности дозы излучения. С помощью модели продемонстрировано, что максимум активности систем репарации в случае острого облучения приходится на 30-40 минут после

окончания облучения, в то время как в случае пролонгированного облучения пик активности репарационных процессов наступает ещё в процессе облучения;

5) С помощью составленной модели репарации ДНК показано, что характерное время репарации по пути негомологичного соединения концов составляет примерно 1-2 часа, в то время как по пути гомологической рекомбинации - порядка 11-12 часов. Показано, что в исследованном диапазоне дозы и мощности дозы вклад гомологической рекомбинации варьирует от 5 до 20 % от общего числа разрывов, и достигает максимума на границе средних и малых значений мощности дозы (5 - 20 мГр/мин).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, включенных в перечень ВАК:

1) Kotenko К.V., Bushmanov A.Y., Ozerov I.V.. Guiyev D.V., Anchishkina N.A., Smetanina N.M., Arkhangelskaya E.Y., Vorobyeva N.Y., Osipov A.N. Changes in the number of double-strand DNA breaks in Chinese hamster V79 cells exposed to y-radiation with different dose rates. // International Journal of Molecular Sciences. 2013. V. 14(7). P. 1371913726. doi:10.3390/ijms 140713719.

2) Озеров И.В.. Пустовалова M.В., Осипов А.Н. Индукция и репарация двунитевых разрывов ДНК в клетках линии V79 при длительном воздествии низкоинтенсивного у-излучения. // Саратовский научно-медицинский журнал. 2013. Т. 9. №4. С. 787-791.

3) Озеров И.В.. Осипов А.Н. Кинетическая модель репарации двунитевых разрывов ДНК в первичных фибробластах человека при действии редкоионизирующего излучения с различной мощностью дозы. // Компьютерные исследования и моделирование. 2015. Т.7. № 1. С. 159-176.

Тезисы докладов на конференциях:

3 ) Озеров И.В. Моделирование индукции и репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках млекопитающих при воздействии гамма-излучения с различными мощностями доз. // Материалы V международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», 3-5 октября 2013 г. Ростов-на-Дону. С. 36-37.

2) Озеров И.В.. Осипов А.Н. Моделирование процессов репарации двунитевых разрывов ДНК. // Тезисы докладов VI Международной школы молодых учёных по молекулярной генетике «Геномика и системная биология», 16-21 ноября 2014 г. Москва - Звенигород. С. 7.

3) Цветкова А.Д., Гусева С.С., Озеров И.В. Исследование кинетики репарации двунитевых разрывов ДНК в первичных фибробластах человека. // Тезисы докладов XXII международной конференции «Математика. Компьютер. Образование», 26-31 января 2015 г. Пущино. С. 57.

4) Озеров И.В. Моделирование процессов репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках млекопитающих при различных режимах облучения рентгеновскими лучами. // Тезисы докладов XXII международной конференции «Математика. Компьютер. Образование», 26 - 31 января 2015 г. Пущино. С. 46.

Контактные данные:

Телефон: +7 (926) 914-62-51, E-mail: varnivev@mai1.ru

Отзывы просим направлять по адресу: Веселовой Т.В., 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, Биологический факультет МГУ.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ИИ

ДНК

ДРДНК

ДНК-ПК

ДНК-ПКкс

НГСК

ГР

ФРА

ПФЧ

V79

ФИСК

ЛОГ

уН2АХ

Rad51

MRN

Ионизирующее излучение

Дезоксирибонуклеиновая кислота

Двунитевые разрывы ДНК

ДНК-зависимая протеинкиназа

Каталитическая субъединица ДНК-ПК

Негомологичное соединение концов

Гомологическая рекомбинация

Фактор репликации А

Первичные фибробласты человека

Линия фибробластов легкого китайского хомяка

Родственное фосфоинозитол-3 киназам семейство киназ

Лапласиан от Гауссиана

Фософорилированная форма коровою гистона ШАХ Ключевой белок ГР, продукт гена RAD51 Комплекс белков Mrel 1-Rad50-Nbsl

г

Подписано в печать 13.02.2015г.

Усл.пл. - 1.5 Заказ № 25712 Тираж: 100 экз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 ivww.chertez.ru