Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика образования антител к структурным белкам ВИЧ-1 и ДНК у больных ВИЧ-инфекцией

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Динамика образования антител к структурным белкам ВИЧ-1 и ДНК у больных ВИЧ-инфекцией"

На правах рукописи

РЯЗАНОВА ГАЛИНА АНАТОЛЬЕВНА

ДИНАМИКА ОБРАЗОВАНИЯ АНТИТЕЛ К СТРУКТУРНЫМ БЕЛКАМ ВИЧ-1И ДНК У БОЛЬНЫХ ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ

03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань 2005

Работа выполнена в Республиканском центре по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями МЗ РТ.

Научный руководитель доктор биологических наук, старший научный

сотрудник Коксин Владимир Петрович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Хазипов Нариман Залилович (Казанская государственная академия ветеринарной медицины)

доктор биологических наук, профессор Шарипова Маргарита Рашидовна (Казанский государственный университет)

Ведущая организация Казанский институт биохимии и биофизики

КНЦРАН

Защита состоится «27» октября 2005 г. в 13°° часов на заседании Диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова - Ленина по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета.

Автореферат разослан _ 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук, Л

доцент

А.Н. Аскарова

о

миме

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Инфекция, вызываемая вирусом иммунодефицита человека, в финале которой развивается смертельный синдром приобретенного иммунного дефицита, является одним из опаснейших заболеваний. Ведущий фактор, обеспечивающий биологическое «процветание» ВИЧ-инфекции — многолетнее малосимптомное вирусоносительство с недоказанной и, безусловно, крайне редкой возможностью спонтанной санации биологического хозяина [Покровский В.В., Ермак Т.Н. и др., 2000].

В последнее время был достигнут значительный прогресс в области фундаментальных и клинических исследований ВИЧ-инфекции, что в огромной степени изменило перспективы для больных, клиницистов и ученых. Между тем, если клинико-иммунологические особенности протекания заболевания достаточно хорошо изучены, то вопросы, связанные с формированием гуморального иммунного ответа к индивидуальным белкам ВИЧ-1 на ранних этапах вирусоносительства, еще далеки от окончательного решения. Как известно, в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), выделенных из сыворотки крови больных ВИЧ-инфекцией, обнаруживаются «скрытые» противовирусные антитела, которые могут играть важную роль как в контролировании инфекционного процесса, так и в ранней диагностике заболевания [Абэлян A.B., 1997; Subbramanian R.A. et al., 2002; Ройт А., 2000], в связи с этим становится очевидной необходимость исследования иммунных комплексов на наличие антител к структурным белкам вируса, кодируемым генами env, gag и pol, в период формирования гуморального иммунного ответа и на стадии бессимптомного вирусоносительства.

Установлено, что у больных ВИЧ-инфекцией кроме вирусоспецифических антител присутствуют антитела к нативной ДНК (нДНК), кардиолштину, эритропоэтину, миозину и тд. [Zandman-Goddard G. and Shoenfeld Y., 2002].

Одной из причин

антител

является стимуляция аутореактивных клонов B-лимфоцитов ВИЧ-1 и, как результат, поликлональная активация этих клеток. Следовательно, существует тесная патогенетическая связь между формированием аутоиммунного компонента у больных ВИЧ-инфекцией и активной репликацией вируса иммунодефицита человека первого типа [Muller S., Richalet Р. et al., 1993]. Однако сведения, имеющиеся на сегодняшний день в литературе, касаются в основном только изучения уровня содержания аутоантител у больных на поздних стадиях заболевания [Zandman-Goddard G. and Shoenfeld Y., 2002; Savige J.A. et al., 1994; Gentric A. et al., 1991], тогда как в период раннего вирусоносительства этот вопрос остается до сих пор открытым и требует дальнейших исследований, поскольку этот этап является критически важным для развития ВИЧ-инфекции.

Целью настоящей работы явилось исследование динамики образования «свободных» и «связанных» в иммунные комплексы антител к структурным белкам вируса и изучение уровня содержания антител к нДНК в сыворотке крови больных ВИЧ-инфекцией.

Были поставлены следующие задачи:

• оптимизировать метод выделения циркулирующих иммунных комплексов из сыворотки крови больных ВИЧ-инфекцией.

• исследовать частоту встречаемости «свободных» и «связанных» в иммунные комплексы антител к вирусным белкам генов env, gag, pol в сыворотке крови больных ВИЧ-инфекцией в ранний период заболевания и на стадии бессимптомного вирусоносительства.

• провести сравнительный анализ показателей содержания антител к нДНК в сыворотке крови доноров и ВИЧ-инфицированных в ранний период заболевания и на стадиях ПБ, ПВ.

Научная новизна исследования. Показано, что при развитии гуморального иммунного ответа наблюдается определенная последовательность выработки антител к структурным белкам вируса

иммунодефицита человека первого типа, кодируемым генами env, gag и pol.

S 'Н •

Впервые установлено, что на стадии бессимптомного вирусоносительства (ПБ) в сыворотке крови больных ВИЧ-инфекцией с высокой степенью частоты встречаемости регистрируется весь спектр антител к белкам генов env, gag и pol, в то время как частота обнаружения противовирусных антител, находящихся в «связанном» состоянии в циркулирующих иммунных комплексах, существенно отличается. Выявлена определенная зависимость между более высоким уровнем присутствия антител к структурным белкам вируса в составе ЦИК и продолжительностью бессимптомного вирусоносительства у больных ВИЧ-инфекцией при дальнейшем диспансерном наблюдении.

Впервые проведено сравнительное исследование показателей содержания антител к нДНК в сыворотке крови больных ВИЧ-инфекцией в ранний период заболевания и на стадиях ПБ, IIB (по классификации Покровского В.И., 1989). Установлено, что достоверно высокое содержание антител к нДНК в период раннего вирусоносительства не сопровождается клиническими проявлениями аутоиммунной патологии у ВИЧ-инфицированных, а является следствием иммушшатогенетического воздействия вируса иммунодефицита человека первого типа.

Практическая значимость исследования. Оптимизирован метод выделения циркулирующих иммунных комплексов из сыворотки крови больных ВИЧ-инфекцией. Этот метод позволяет получить две фракции: «быстро» (18ч)- и «медленно» (72ч)- прецшштирующих ЦИК (ЦИК1 и ЦИК2), которые были представлены на электрофореграммах иммуноглобулиновой зоной и не содержали примесей белков сыворотки крови и «свободных» иммуноглобулинов. Антитела к структурным белкам ВИЧ-1, полученные путем диссоциации ЦИК1 и ЦИК2, отличаются по своему составу в иммунном блоттинге и суммарной серологической активности в ИФА. Результаты исследований могут быть использованы как при ранней диагностике заболевания, так и при мониторинге инфекционного процесса, в качестве маркеров прогрессирования заболевания, наряду с

клинической симптоматикой и определением количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих на поверхности рецепторы СР4+ / СБ8+.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались на: Ш съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Сочи, 2000); VI Международной конференции «Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика» (Санкт-Петербург, 2000); Ш съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); VI Российском съезде врачей-инфекционистов (Санкт-Петербург, 2003); 11-ой Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 2003); IX Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2004); VIII Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура диссертационной работы. Работа изложена на 113 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов. Список литературы включает 148 источников. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 8 рисунками.

Материалы и методы исследования. В работе были использованы образцы сывороток крови ВИЧ-инфицированных, проходивших плановые медицинские осмотры в Республиканском центре по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями МЗ РТ. Диагноз был установлен у всех больных на основании клинических данных и подтвержден лабораторными исследованиями (ИФА и иммунный блотгинг).

Осуществлено сравнительное изучение частоты встречаемости «свободных» антител и «связанных» в циркулирующие иммунные комплексы с белками вируса у 22 - х больных ВИЧ - инфекцией в ранний период заболевания. Общее количество проб - 46 сывороток крови. Кроме того, было проведено сравнительное исследование частоты встречаемости «свободных» анти-ВИЧ антител и «связанных» в ЦИК у 40 больных ВИЧ-инфекцией (42

сыворотки крови), находившихся на стадии бессимптомного вирусоносительства.

Для определения уровня содержания антител к нДНК было исследовано 169 сывороток крови, из которых 104 пробы получены от 43-х ВИЧ-инфицированных, состоявших на диспансерном наблюдении с сомнительными результатами в иммуноблоттинге, и в дальнейшем взятых на учет с диагнозом «ВИЧ-инфекция» и 65 проб - от 65-ти больных ВИЧ-инфекцией, находившихся на стадиях бессимптомного вирусоносительства (1ГБ) и персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПВ).

В контрольную группу вошли 85 сывороток крови здоровых доноров, серонегативных по ВИЧ, гепатитам В и С, для установления уровня содержания антител к нДНК в норме.

Серологическую активность противовирусных антител в сыворотках крови исследовали методом иммуноферментного анализа «ВИЧ-1, ВИЧ-2 - ИФА -Авиценна» фирмы «Авиценна» (Россия). Иммуноблоттинг проводили на тест-системе «NEW LAV BLOT 1» фирмы «Bio Rad» (Франция). Предварительно сыворотки крови разводили 1:100 буфером для промывания стрипов, а пробы диссоциированных ЦИК1 и ЦИК2 - 1:20. Присутствие антител к структурным белкам ВИЧ-1 определялось по наличию на нитроцеллюлозных стрипах специфических линий окрашивания (фиолетово-голубое). Молекулярные массы вирусных белков даны в соответствии с инструкцией, прилагаемой к набору «NEW LAV BLOT1». Денситометрию результатов постановки иммунного блоттинга проводили в отраженном свете на сканере «SHARP JX-330». В анализе денситограмм (количественный анализ сероактивных фракций) была использована программа «Image Master ID Prime» фирмы «Pharmacia Biotech».

Определение уровня содержания антител к нДНК проводили методом иммуноферментного анализа, оптимизированным ранее в нашей лаборатории. В качестве антигена использовали лиофилизированную нДНК, выделенную из эритроцитов цыплят. В качестве положительного стандарта

была взята сыворотка крови больного системной красной волчанкой (СКВ), дающая положительную реакцию в тест-системе латексагглютинации фирмы «Human» (Германия). Сыворотка больного СКВ в ИФА характеризовалась активностью с титром анти-нДНК антител 1:3200. Исследуемые образцы прогревали на водяной бане при 56°С в течение 40 минут. ИФА проводили по следующей схеме. В лунки планшетов вносили раствор ДНК (10 мкг/мл) на 0,1М фосфат-0,05М цитратном буфере рН5,0. Планшеты с сорбируемой ДНК инкубировали в течение ночи при комнатной температуре, после чего не связавшуюся ДНК триады отмывали фосфатно-солевым буфером с твином (ФСБ-Т). Далее в подготовленные планшеты вносили сыворотки крови больных ВИЧ-инфекцией (по 100 мкл в лунку в 3-х повторах), предварительно разведенные 1:100 ФСБ-Т, после чего планшеты инкубировали в течение 40 минут при 37°С. По окончании инкубации планшеты трижды промывали ФСБ-Т и на 30 минут вносили рабочий раствор конъюгата (антитела против IgG человека, конъюгированные с пероксидазой). В качестве хромогена использовали тетраметилбензидин и через 30 минут измеряли интенсивность цветной реакции ИФА на спектрофотометре «Multiskan» в единицах оптической плотности при длине волны 450нм (ОП450). Для сравнения воспроизводимости данных, полученных в разные дни и с конъюгатами разных серий, в качестве контроля использовали пул сывороток, произведенных фирмой «Bio Rad», серонегативных по ВИЧ, гепатитам В и С.

Характер распределения данных в полученных выборках индивидуальных значений уровня содержания антител к нДНК анализировали с применением коэффициента асимметрии (As) и медианы (Me). Так как числовые показатели содержания анти-нДНК антител не соответствовали закону нормального распределения, то для оценки различий между отдельными выборками использовали непараметрические ранговые критерии: Крускала-Уоллиса (для общей характеристики выборки) и Т-критерий Манна-Уитни (дам парных сравнений различных выборок).

Содержание антител к нДНК в исследуемых образцах сывороток крови выражали в относительных единицах (ш,), которые вычисляли по формуле:

ОП450 исследуемой сыворотки т, = , (отн.ед.)

*ОП450 (К-)срсЛ

*ОП45о(К-)сред - среднее значение оптической плотности отрицательного контроля, при длине волны X = 450нм.

Для оценки статистических различий между частотой встречаемости «свободных» и «связанных» в ЦИК антителами к структурным белкам вируса использовали непараметрический критерий знаков z [Лакин Г.Ф., 1990].

Результаты исследований и их обсуждение

1. Мониторинг активности «свободных» анти-ВИЧ антител в период формирования гуморального иммунного ответа

Длительный латентный период между инфицированием ВИЧ-1 и развитием СПИДа указывает на то, что специфический иммунный ответ на вирусные антигены должен играть важную роль в контролировании инфекции. Следовательно, изучение природы изменений и закономерностей динамики иммунохимических маркеров, в частности, спектра антител к индивидуальным вирусным белкам в ранний период заболевания, остается актуальным и на сегодняшний день. С учетом этого мы провели исследование относительной серологической активности антител к структурным белкам вируса, кодируемым генами env, gag и pol, в сыворотках крови больного ВИЧ-инфекцией в период формирования гуморального иммунного ответа (таб.1).

Итак, первыми были обнаружены антитела к р24/25 (99,8%), эта фракция антител являлась доминирующей среди антител к белкам гена gag. Наряду с антителами к основному ядерному белку, в незначительных количествах присутствовали антитела к белкам-предшественникам ВИЧ-1 - р55 и gpl60

Таблица 1. Относительная серологическая активность анти-ВИЧ антител к структурным белкам вируса у больного ВИЧ-инфекцией в период формирования гуморального иммунного ответа

Сроки исследования (дни) Титры анти-ВИЧ антител вИФА Относительная активность анти-ВИЧ антител в иммуноблотгинге к белкам генов (%)**

епу 84 ро1

gpl60 gpl20 8р41 г р55 р18 р25 р40 I Р68 р52 р34 I

начало 1:64 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 0,0 99,8 0,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0

21 день 1:1600 2,2 0,0 0,0 2,2 1,6 0,0 96,2 0,0 97,8 0,0 0,0 0,0 0,0

73 дня* 1:512 13,1 2,2 0,0 15,3 6,1 0,0 78,2 0,0 84,3 0,4 0,0 0,0 0,4

98 дней 1:512 11,1 2,9 0,0 14,0 6,7 0,0 76,1 0,0 82,8 0,8 0,0 2,4 3,2

172 дня 1:128 27,5 11Д 0,0 38,6 7,7 0,0 44,7 0,7 53,1 2,7 1,3 4,3 8,3

312 дней 1:256 19,6 12,6 10,9 43,1 11,1 0,2 24,6 4,4 40,3 5,9 4,5 6,2 16,6

Примечание: *- первый положительный результат в иммуноблотгинге

**- в % к общему числу сероактивных фракций антител в иммуноблотгинге

(1,6% и 2,2%), в дальнейшем концентрация этих антител увеличивалась и к концу исследования составила 11,1% и 19,6% соответственно (таб.1). Далее, по мере нарастания титра анти-ВИЧ антител, отмечались антитела к продуктам генов: env - gpl20, pol - р66/68, р51/52, р31/34 и gag - р39/40, а антитела к gp41 и р 17/18 регистрировались только на 312 день исследования. Полученные результаты свидетельствуют о дифференциальной регуляции гуморального иммунного ответа к отдельным структурным антигенам вируса иммунодефицита человека первого типа, которые по всей вероятности были экспрессированы на мембранах иммунокомпетентных клеток инфицированных ВИЧ-1.

2. Оптимизация метода получения циркулирующих иммунных комплексов из сыворотки крови больных ВИЧ-инфекцией

Существует несколько способов, которые наиболее часто используются для выявления «скрытых» противовирусных антител: гель-фильтрация и ионообменная хроматография на QAE А50-сефадексе [Орлова В.М., 1996], центрифугирование в градиенте плотности сахарозы [Carini S., Mezzaroma I. et al., 1987; под ред. Фримеля Г., 1987], ультразвуковая дезинтеграция белковых структур [Митин Ю.А., 1997] и преципитация полиэтиленгликолем [Stanojevic М. et al., 1996]. Нами был выбран последний способ, поскольку метод осаждения полиэтиленгликолем позволяет получить максимальное количество циркулирующих иммунных комплексов без примесей белков сыворотки крови и «свободных» иммуноглобулинов, кроме того, этот метод позволяет оценить состав иммунных комплексов без физического разрушения и денатурации белковых молекул.

При оптимизации метода получения ЦИК из пула сывороток крови 10-ти больных ВИЧ-инфекцией, которые находились на стадии бессимптомного вирусоносительства, использовали следующие концентрации полиэтиленгликоля с молекулярным весом 6000 (ПЭГ-6000): 7%, 14% и 21%. Учитывая то, что высокомолекулярные ЦИК оседают быстрее, чем иммунные комплексы с меньшей молекулярной массой, мы инкубировали пул сывороток крови с ПЭГ-6000 при +6±2°С в течение 18 и 72-х часов. Как

известно, действие полиэтиленгликоля на белковые растворы сходно с действием органических растворителей, которые могут вызвать осаждение наряду с иммунными комплексами и «свободных» иммуноглобулинов [Скоупс Р., 1985], поэтому мы провели исследование по определению титра анти-ВИЧ антител до и после обработки различивши концентрациями ПЭГ-6000. Было установлено, что только после осаждения ЦИК из пула сывороток крови 7% - ным раствором полиэтиленгликоля титры анти -ВИЧ антител в ИФА не изменялись и были равны титрам антител в исходной пробе, в отличие от ПЭГ-6000 в концентрациях 14% и 21%. Результаты электрофоретического разделения белков ЦИК в 7,5% растворе полиакриламидного геля (ПААГ) показали (рис.1), что ПЭГ - 6000 в концентрации 7% обеспечивал выделение двух фракций: «быстро» (18ч)- и

а Ь с с1 е f g

а - белки сыворотки крови; Ь - белки ЦИК-1, осажденные 7% ПЭГ-6000; с - белки ЦИК-2, осажденные 7% ПЭГ-6000; ё - белки ЦИК-1, осажденные 14% ПЭГ-6000; е - белки ЦИК-2, осажденные 14% ПЭГ-6000; f- белки ЦИК-1, осажденные 21% ПЭГ-6000; § - белки ЦИК-2, осажденные 21% ПЭГ-6000

Примечание: - зона иммуноглобулинов

Рисунок 1. Денситограммы электрофореграмм белков сыворотки крови и ЦИК, фракционированных в 7,5% ПААГ

«медленно» (72ч> прецишггиругощих ЦИК (ЦИК1 и ЦИК2), которые были представлены на электрофореграммах иммуноглобулиновой зоной и практически не содержали примесей белков (от а, ß-глобулинов до альбуминов сыворотки крови), что указывало на высокую степень очистки иммунных комплексов от свободных белков сыворотки крови. Тогда как, при использовании ПЭГ-6000 в концентрациях 14% и 21% выделялась только одна фракция ДИК-ЦИК 1 (рис.1).

Согласно данным, полученным Митиным Ю.А. 1997, циркулирующие иммунные комплексы, выделенные из сыворотки крови больных ВИЧ-инфекцией, обладают низкой температурной устойчивостью и могут разрушаться в диапазоне от +38°С до +40°С (время инкубации от 30 минут до 2-х часов). Следовательно, диссоциация иммунных комплексов, проведенная при температуре +60°С в течение 3-х часов, обеспечивала практически 100% выявление «скрытых» противовирусных антител, которые до этого находились в составе ЦИК.

Таким образом, за основу получения циркулирующих иммунных комплексов из сыворотки крови больных ВИЧ-инфекцией был взят метод преципитации 7%-ным раствором полиэтиленгликоля в 0,1М боратном буфере рН8,8 с последующей температурной диссоциацией ЦИК при +60°С в течение 3-х часов.

3. «Свободные» н «связанные» в ЦИК антитела к структурным белкам ВИЧ-1 в ранний период заболевания и на стадии бессимптомного вирусоносительства

После осаждения и диссоциации полученных фракций ЦИК нами была исследована частота встречаемости антител к структурным белкам вируса, кодируемым генами env, gag и pol, в период раннего вирусоносительства. По результатам интерпретации иммунного блоттинга были выделены две группы сывороток крови, полученных от больных ВИЧ-инфекцией с сомнительными (наличие антител к белкам генов gag, pol и/или одному вирусному гликопротеину гена env) и положительными результатами в иммунном блоттинге (обнаружение антител к двум гликопротеинам из

группы env с наличием или отсутствием антител к белкам генов gag и pol). При формировании гуморального иммунного ответа на ВИЧ-1, когда результаты иммунного блоттинга оценивались как сомнительные, в сыворотке крови и ЦИК1, главным образом, присутствовали антитела к gpl60, р55 и р24/25, а в ЦИК2 - к р17/18 (40%) (таб.2). Необходимо отметить, что при полном отсутствии «свободных» антител к gpl20 в сыворотке крови больных ВИЧ-инфекцией, в ЦИК1 в 10% случаев обнаруживались антитела к поверхностному гликопротеину (таб.2). Таким образом, полученные результаты по определению «связанных» в ЦИК противовирусных антител открывают возможность более ранней постановки диагноза «ВИЧ-инфекция».

Затем, во второй группе в сыворотке крови и ЦИК1 дополнительно регистрировались антитела к gpl20, gp41, а в ЦИК2 к gpl60, р55 и р31/34 (таб.3).

Используя непараметрический критерий знаков z, было показано, что в сыворотке крови с сомнительными результатами в иммунном блотгинге частота встречаемости «свободных» антител к gp!60 и р24/25 на 95%-ом уровне значимости была достоверно выше, чем в ЦИК2. Нами были обнаружены достоверные различия между частотой встречаемости «свободных» антител к gpl60, gpl20, р55, р24/25 и присутствием этих антител в ЦИК2 для сывороток крови с положительными результатами в иммуноблоттинге, кроме того, частота встречаемости «свободных» антител к

Таблица 2. Частота встречаемости антител в ЦИК и сыворотке крови больных ВИЧ-инфекцией с сомнительными результатами в иммуноблоттинге

количе ство проб объект исследо вания частота встречаемости антител к белкам генов (%)*

env gag pol

gpl60 gpl20 gp41 p55 pl8 p25 p40 p68 p52 p34

20 сыв-ка крови 80,0 0,0 0,0 55,0 25,0 90,0 15,0 10,0 10,0 10,0

ЦИК! 40,0 10,0 0,0 40,0 10,0 50,0 5,0 5,0 5,0 5,0

ЦИК2 0,0 0,0 0,0 0,0 40,0 5,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Таблица 3. Частота встречаемости антител в ЦИК и сыворотке крови больных

ВИЧ-инфекцией с положительными результатами в иммуноблоттинге

количе ство проб объект исследо ваняя частота встречаемости антител к белкам генов (%)*

env gag pol

gpl60 gpl20 gp41 p55 pi 8 p25 p40 p68 p52 p34

26 сыв-ка крови 100,0 100,0 15,4 84,6 26,9 100,0 26,9 50,0 50,0 34,6

ЦИК1 46,2 15,4 7,7 15,4 7,7 34,6 3,8 7,7 3,8 7,7

ЦИК2 193 0,0 0,0 3,8 11,5 23,1 0,0 0,0 0,0 3,8

Примечание * - в % к общему числу исследованных сывороток крови

gpl20 была достоверно выше, чем в ЦИК1.

Следовательно, в сыворотке крови и ЦИК1 первой группы в основном определялись антитела к белкам-предшественникам генов env (gpl60) и gag (р55), а антитела, направленные против gpl20 и gp41, обнаруживались в сыворотке крови и ЦИК1 второй группы только к концу формирования гуморального иммунного ответа. Отсюда можно сделать заключение, что антитела к gpl20 и gp41, которые могут обладать нейтрализующей активностью [Абэлян A.B., 1997; Moog С. et al., 1997], появляются достаточно поздно и, видимо, на ранних этапах инфицирования вирус может беспрепятственно проникнуть внутрь клетки, поскольку в этот период механизм гуморальной противовирусной защиты отсутствует. Раннее присутствие антител к ядерному белку в сыворотке крови и циркулирующих иммунных комплексах, вероятно, объясняется тем, что р24/25 составляет основную массу вирусной частицы и синтезируется в инфицированных клетках в большом количестве [Binley J.M., Klasse PJ. et al., 1997], с другой стороны это может быть связано с особой вирусной «стратегией», которая позволяет ему обходить иммунологический контроль на начальных этапах заболевания.

Таким образом, прослеживается определенная корреляция между данными мониторинга относительной серологической активности в период формирования гуморального иммунного ответа у больного ВИЧ-инфекцией и данными, полученными в результате исследования частоты встречаемости

анти-ВИЧ антител в сыворотке крови и ЦИК больных ВИЧ-инфекцией в ранний период заболевания.

На стадии бессимптомного вирусоносительства, которая следует сразу после «сероконверсии», в сыворотке крови больных ВИЧ-инфекцией с высокой степенью частоты встречаемости присутствовал весь спектр антител к структурным белкам вируса, кодируемым генами env, gag и pol, в то время как частота обнаружения противовирусных антител «связанных» в ЦИК отличалась. Так, у некоторых больных ВИЧ-инфекцией при наличии антител к трансмембранному гликопротеину в сыворотке крови, антитела к gp41 в ЦИК1 и ЦИК2 не определялись. Поэтому, по результатам интерпретации иммунного блотганга нами были выделены две группы, в первую вошли сыворотки крови, где в составе ЦИК не выявлялись антитела к gp41, а во вторую группу были включены пробы, у которых в циркулирующих иммунных комплексах обнаруживались антитела к gp41.

Из данных таблиц 4 и 5 следует, что частота встречаемости «связанных» в циркулирующие иммунные комплексы антител к структурным белкам вируса во второй группе была выше, чем в первой, где отсутствовали антитела к gp41 в ЦИК1 и ЦИК2. Используя непараметрический критерий знаков z, было показано, что в сыворотке крови больных первой группы частота встречаемости анти-ВИЧ антител к р55, р51/52, gp41,p31/34 на 95%-ом уровне значимости достоверно выше, чем в ЦИК1 и ЦИК2. Кроме того, нами были обнаружены достоверные различия между присутствием «свободных» антител к р24/25 и частотой встречаемости «связанных»

Таблица 4. Частота встречаемости «свободных» и «связанных» в иммунные комплексы анти-ВИЧ антител к белкам генов env, gag, pol в отсутствии антител к gp41 в ЦИК

количе ство проб объект исследо вания частота встречаемости антител к белкам генов (%)*

env gag pol

gpl60 gpl20 gp41 p55 pl8 p25 p40 p68 p52 p34

20 сыв-ка крови 100,0 100,0 85,0 95,0 55,0 100,0 65,0 85,0 95,0 95,0

ЦЙК1 55,0 50,0 0,0 10,0 10,0 30,0 5,0 30,0 15,0 15,0

ЦИК2 40,0 50,0 0,0 5,0 40,0 15,0 0,0 15,0 15,0 20,0

Таблица 5. Частота встречаемости «свободных» и «связанных» в иммунные комплексы анти-ВИЧ антител к белкам генов env, gag, pol в присутствии антител к gp41 в ЦИК

количе ство проб объект исследо вания частота встречаемости антител к белкам генов (%)*

env gag pol

gpl60 gpl20 gp41 p55 pi 8 p25 p40 p68 p52 p34

22 сыв-ка крови 100,0 100,0 100,0 100,0 55,0 90,9 95,5 59,1 100,0 100,0

ЦИК1 100,0 100,0 100,0 10,0 95,5 81,8 54,5 45,5 100,0 0,0

ЦИК2 86,4 50,0 40,9 5,0 63,6 59,1 27,3 27,3 54,5 54,5

Примечание * - в % к общему числу исследованных сывороток крови

антител в ЦИК2. Между тем, во второй группе не было выявлено достоверных различий между спектром «свободных» анти-ВИЧ антител и «связанных» в ЦИК1 и ЦИК2, кроме частоты встречаемости антител к р55 и р31/34 в сыворотке крови и ЦИК. При дальнейшем диспансерном наблюдении у семи больных ВИЧ-инфекцией (35%) первой группы были зарегистрированы следующие клинические проявления иммунодефицита: герпес Zoster, туберкулез легких, сливная серозная бронхопневмония, кандидоз слизистой полости рта, пиодермия и дисбактериоз.

В свете вышеизложенных фактов нами было сделано предположение, что на реакцию «антиген-антитело» существенное влияние оказывает аффинность антител, характеризующая прочность их связывания с антигеном. Поскольку, условия проведения эксперимента по выделению и освобождению циркулирующих иммунных комплексов от белков сыворотки крови и «свободных» иммуноглобулинов были стандартными, во второй группе при максимальной частоте встречаемости «свободных» антител, в 100% случаев в ЦИК1 выявлялись антитела к gpl20 и gp41, следовательно, эти антитела способны формировать стабильные иммунные комплексы. Тогда как, в ЦИК, выделенных из сыворотки крови больных ВИЧ-инфекцией первой группы, находились антитела, которые, по-видимому, обладают низкой аффинностью, поскольку частота встречаемости антител к gpl20 и gp41 в сыворотке крови была 100% и 85%, а в ЦИК1 - 50% и 0% соответственно (таб. 4 и 5). К тому же, эти результаты подтверждаются

данными клинического обследования, так как при дальнейшем диспансерном наблюдении у больных первой группы отмечали некоторые проявления иммунодефицита, а именно: вирусного, бактериального и грибкового происхождения.

В самом деле, в условиях in vitro с лабораторными штаммами ВИЧ-1 и клетками линии моноцитарного происхождения (U937) описана репликация вируса, попавшего в клетку в составе иммунного комплекса. Эффект начинает проявляться после значительного разведения исследуемой нейтрализующей сыворотки (от тысячи до миллиона раз). По-видимому, указанные разведения сыворотки крови, практически не содержащие высокоаффинных нейтрализующих антител, позволяют вирусу выходить из состава иммунного комплекса (возможно с потерей gpl20) уже внутри фагосомы. С точки зрения продуктивности инфекции такой «сценарий» даже предпочтительнее обычного, С04-опосредованного [Абэлян A.B., 1997].

4. Антитела к нДНК в сыворотке крови доноров и больных ВИЧ-инфекцией в ранний период заболевания н на стадиях ПБ, ПВ

Как известно, поликлональная активация В-лимфоцитов - это одно из первых иммунологических нарушений, вызванное вирусом иммунодефицита человека, которое наряду с синтезом специфических противовирусных антител индуцирует извращенную продукцию антител, направленных против собственных антигенов макроорганизма. Кроме того, высокий уровень айти-гистоновых и анти-нДНК антител, наблюдаемый у ВИЧ-инфицированных, может быть связан с высвобождением ядерного содержимого либо вследствие ошибочного инициирования апоптоза вирусными антигенами, либо в результате гибели инфицированных клеток [Muller W.E., Shoroder Н.С., 1992; Коэн П.Т., 2001; Попович A.M., 2004]. Однако, вопрос о роли антинуклеарных антител в инфекционном процессе, особенно на ранних этапах заболевания, остается одним из основных для выяснения механизмов патогенетического влияния вируса на иммунную систему «хозяина». Поэтому, следующим этапом работы было исследование методом иммуноферментного анализа уровня содержания антител к нДНК в период

формирования гуморального иммунного ответа и на стадиях бессимптомного вирусоносительства, персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПБиПВ).

Антитела к нДНК встречаются и у клинически здоровых лиц. Антинуклеарные антитела, присутствующие в сыворотке крови доноров, относятся в основном к классу 1§М, обладают перекрестной реактивностью к собственным и экзогенным антигенам. Эти антитела, как правило, являются низкоаффинными. Однако в незначительном количестве представлены субпопуляции высокоаффинных антител к нДНК с низкой перекрестной реактивностью, которые принадлежат к иммуноглобулинам класса в [Киселева В.И., Леках И.В., 2001]. Для того, чтобы определить уровень содержания анти-нДНК антител в норме, нами были изучены сыворотки крови здоровых доноров, серонегативных по ВИЧ, гепатитам В и С (рис. 2). Результаты наших исследований показали, что уровень содержания антител

20 18

0 I I I I I I I I I I

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 «0ЛИЧ6С1К проб

Рисунок 2. Характер распределения показателей содержания антител к нДНК у доноров, серонегативных по ВИЧ, гепатитам В и С

к нДНК варьировал в пределах - от 0,98 до 3,02 отн.ед., но 60% доноров

имели диапазон значений от 0,98 до 1,98 отн.ед. (рис.2). Поскольку

индивидуальные значения показателей содержания антител к нДНК в

сыворотке крови серонегативных доноров составляли компактную группу, то

нами была определена линия регрессии этих показателей, которая

находилась на уровне 2,0 отн. ед.

На стадиях бессимптомного вирусоносительства и персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПБ и IIB) уровень содержания антител к нДНК колебался в диапазоне от 0,91 до 8,94 отн.ед., причем основная часть значений (77%) находилась выше 2,0 отн.ед. (рис.3). При проведении сравнительного анализа нами было выявлено достоверно высокое содержание антител к нДНК у больных ВИЧ-инфекцией на стадиях ПБ и IIB, по сравнению с активностью антинуклеарных антител в группе доноров, серонегативных по ВИЧ, гепатитам В и С.

20 18 5 16

I«

I 12 ? 10

0 10 203040506070

количество проб

Рисунок 3. Характер распределения показателей содержания антител к нДНК у ВИЧ-инфицированных на стадиях ПБ и 11В

В период формирования гуморального иммунного ответа у наблюдаемых больных не было отмечено клинических проявлений аутоиммунной патологии, тем не менее, уровень содержания антител к нДНК в сыворотке крови изменялся в диапазоне от 0,94 до 19,87 отн.ед., что говорило о существенном увеличении размаха вариабельности индивидуальных показателей содержания антинуклеарных антител, наблюдаемом в ранний период заболевания. Как показано на рисунке 4, основная часть значений (88%) находится выше линии регрессии (2,0 отн.ед.).

Нами впервые было установлено, что в сыворотке крови больных ВИЧ -инфекцией в ранний период вирусоносительства на 95% уровне значимости наблюдается достоверно более высокий уровень содержания антител

201

16.

0 I I I I I I I I I I I I

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 количество проб

Рисунок 4. Характер распределения показателей содержания антител к нДНК у ВИЧ-инфицированных в ранний период заболевания

к нДНК, чем в группе доноров и на стадиях ПБ, ПВ ВИЧ-инфекции.

Таким образом, полученные данные позволяют констатировать тот факт, что появление специфических противовирусных антител и образование аутоиммунного компонента у больных ВИЧ-инфекцйей - это два процесса, которые тесно взаимосвязаны. Период острой ВИЧ-инфекции либо опережает «сероконверсию», либо совпадает с началом формирования гуморального иммунного ответа, то есть в это время усиливается репликация вируса иммунодефицита человека первого типа, который, в свою очередь, индуцирует процессы апоптоза и гибели инфицированных клеток, а также оказывает влияние на В-лимфоциты, вызывая их полетслональную активацию. По мере того, как возникает эффективный гуморальный иммунный ответ, снижается концентрация ВИЧ-1 и устанавливается стадия бессимптомного вирусоносительства, которая характеризуется отсутствием клинических проявлений ВИЧ-инфекции или оппортунистических заболеваний, развивающихся на фоне иммунодефицита. Эти факты подтверждаются нашими исследованиями, поскольку уровень антител к нДНК в период формирования гуморального иммунного ответа достоверно выше, чем на стадиях бессимптомного вирусоносительства и персистирующей генерализованной лимфаденопатии.

Следовательно, антитела к нДНК можно использовать и в качестве маркеров прогрессирования заболевания на более поздних стадиях ВИЧ-инфекции, и в ранней диагностике болезни, так как эти антитела могут являться индикаторами усиления репликации вируса иммунодефицита человека, наряду с клинической симптоматикой и определением количества Т-лимфоцитов CD4+/CD8+ у больных ВИЧ-инфекцией.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод выделения двух фракций циркулирующих иммунных комплексов из сыворотки крови больных ВИЧ-инфекцией: «быстро» (18ч)- и «медленно» (72ч)- преципитирующих ЦИК (ЦИК1 и ЦИК2).

2. Показано, что в начале «сероконверсии» в сыворотке крови и ЦИК1 обнаруживаются антитела к gpl20 (10%) при полном их отсутствии в спектре «свободных» антител. В ЦИК2 доминируют антитела к р 17/18 (40%), в то время как частота встречаемости этих антител в сыворотке крови составляет 25%. Полученные результаты позволяют ускорить постановку диагаоза «ВИЧ-инфекция»

3. Показано, что концу формирования гуморального иммунного ответа в сыворотке крови и ЦИК1 регистрируются антитела к белкам вируса, кодируемым генами env, gag и pol, а в ЦИК2 к gpl60, р55, рЗ 1/34, р24/25 и р17/18.

4. На стадии бессимптомного вирусоносительства обнаружение противовирусных антител в составе циркулирующих иммунных комплексов может иметь прогностическое значение, поскольку высокая степень частоты встречаемости антител «связанных» в ЦИК сопровождается в дальнейшем более благоприятным протеканием ВИЧ-инфекции.

5. Впервые установлено, что в период формирования гуморального иммунного ответа уровень содержания антител к нДНК в сыворотке крови больных ВИЧ-инфекцией достоверно превышает аналогичный показатель на стадиях IIB, IIB и в группе доноров, полученные данные

могут быть использованы в диагностике и прогнозировании динамики заболевания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Коксин В.П. Мониторинг некоторых иммунохимических показателей на различных стадиях ВИЧ-инфекции / В.П. Коксин, И.Г. Мустафин, Л.И. Бадриева, Н.В. Ткачева, И.М. Хаертынова, Г.А. Рязанова, О.М. Романенко // Материалы П1 съезда иммунологов и аллергологов СНГ. Сочи.-2000.-С.88-89.

2. Хаертынова И.М. Мониторинг активности анти-ВИЧ антител к белкам генов gag, pol и env ВИЧ-1 при антиретровирусной терапии больных ВИЧ-инфекцией / И.М. Хаертынова, Л.И. Бадриева, Д.К. Баширова, В.П. Коксин, И.Г. Мустафин, Г.А. Рязанова, О.М. Романенко И VI Росс.-Итальянская конференция «Инфекционные болезни диагностика, лечение, профилактика». Санкт-Петербург.-2000.-С.274.

3. Коксин В.П. Спектр анти-ВИЧ антител в циркулирующих иммунных комплексах сывороток крови больных ВИЧ-инфекцией при различных клинических статусах / В.П. Коксин, И.М. Хаертынова, Л.И. Бадриева, Г.А Рязанова, Д.К. Баширова, И.Г. Мустафин, Л.Н. Килина, О.М. Романенко // VI Росс.-Итальянская конференция «Инфекционные болезни диагностика, лечение, профилактика». Санкт-Петербург,-2000.-С.115-116.

4. Рязанова Г.А. Выявление скрытых анти-ВИЧ антител в циркулирующих иммунных комплексах сывороток крови при ВИЧ-инфекции / Г.А. Рязанова,

B.П. Коксин, И.Г. Мустафин, И.М. Хаертынова, Э.А. Замятина, О.М. Романенко // Ш съезд биохимического общества. Санкт-Петербург.-2002.-

C.211.

5. Рязанова Г.А. Активность антител к нДНК в сыворотках крови инфицированных ВИЧ в ранний период заболевания / Г.А. Рязанова, В.П. Коксин, Р.В. Хамзина, В.Г. Винтер, О.М. Романенко // Медицинская иммунология.-2003.-Т5.-№ 5-6.-С.625-628.

6. Мустафин И.Г. Изучение активности антител к нативной ДНК (нДНК) в сыворотках крови ВИЧ-инфицированных в процессе развития инфекции /

И.Г. Мустафин, В.П. Коксин, Г.А. Рязанова, И.М. Хаертынова, JI.H. Кялина // VI Российский съезд врачей-инфекционистов. Санкт-Петербург.-2003,-С.264.

7. Рязанова Г.А. Активность антител к нативной ДНК (нДНК) в сыворотках крови инфицированных ВИЧ в период формирования гуморального иммунного ответа / Г.А. Рязанова, Р.В. Хамзина, В.Г. Винтер, Г.И. Хабибуллина, О.М. Романенко // Материалы 11-й международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы». Санкт-Петербург.-2003.-С.75.

8. Рязанова Г.А. «Свободные» и «связанные» анти-ВИЧ антитела у больных ВИЧ-инфекцией в период первичного гуморального ответа / Г.А. Рязанова,

B.П. Коксин, Р.В. Хамзина // Материалы X Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». Казань.-2004.-

C.45.

9. Рязанова Г.А. Мониторинг активности антител к структурным белкам вируса у больного ВИЧ-инфекцией в период формирования гуморального иммунного ответа / Г.А. Рязанова, Г.И. Хабибуллина, О.М. Романенко // VIII Всероссийский научный форум с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». Санкт-Петербург.-2004.-С.332-333.

10. Рязанова Г.А. «Свободные» и «связанные» антитела к структурным белкам ВИЧ-1 в ранний период заболевания / Г.А. Рязанова, В.П. Коксин, Р.В. Хамзина // Медицинская иммунология.-2005.-Т7.-№ 1.-С.73-76.

Отпечатано с готового оригинал-макета

в ООО «АСТОРИЯ» 420111, г. Казань, ул. Пушкина, д. 29/34 тел. 260-44-40 Заказ № 133 от 22.09.2005 г. Формат 60x90 1/16. Бумага офсет 80 г. Печать ризографическая. Тираж 100.

«

* ^ 7s 85

РНБ Русский фонд

2006-4 14870

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рязанова, Галина Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИЧ-1 С

РАЗЛИЧНЫМИ ЗВЕНЬЯМИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ.

1.1. Характеристика возбудителя ВИЧ-инфекции.

1.1.1. Выявление ретровируса в качестве этиологического агента.

1.1.2. Морфология ВИЧ-1.

1.1.3. Механизм взаимодействия ВИЧ-1 с клеткой.

1.2. Особенности патогенеза и клиническое течение

ВИЧ-инфекции.

1.3. Клеточный и гуморальный иммунные ответы, индуцированные репликацией ВИЧ-1.

1.4. Циркулирующие иммунные комплексы у больных ВИЧ-инфекцией.

1.5. Современные методы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции.

1.6. Аутоиммунные процессы на фоне ВИЧ-инфекции.

1.6.1. Характеристика антител к ДНК.

1.6.2. Спектр природных антител у больных ВИЧ-инфекцией.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Динамика образования антител к структурным белкам ВИЧ-1 и ДНК у больных ВИЧ-инфекцией"

Инфекция, вызываемая вирусом иммунодефицита человека, в финале которой развивается смертельный синдром приобретённого иммунного дефицита, является одним из опаснейших заболеваний. Ведущий фактор, обеспечивающий биологическое «процветание» ВИЧ-инфекции — многолетнее малосимптомное вирусоносительство с недоказанной и, безусловно, крайне редкой возможностью спонтанной санации биологического хозяина [Покровский В.В., Ермак Т.Н. и др., 2000].

В последнее время был достигнут значительный прогресс в области фундаментальных и клинических исследований ВИЧ-инфекции, что в огромной степени изменило перспективы для больных, клиницистов и учёных. Между тем, если клинико-иммунологические особенности протекания заболевания достаточно хорошо изучены, то вопросы, связанные с формированием гуморального иммунного ответа к индивидуальным белкам ВИЧ-1 на ранних этапах вирусоносительства, ещё далеки от окончательного решения. Как известно, в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), выделенных из сыворотки крови больных ВИЧ-инфекцией, обнаруживаются «скрытые» противовирусные антитела, которые могут играть важную роль как в контролировании инфекционного процесса, так и в ранней диагностике заболевания [Абэлян А.В., 1997; Subbramanian R.A. et al., 2002; Ройт А., 2000], в связи с этим становится очевидной необходимость исследования иммунных комплексов на наличие антител к структурным белкам вируса, кодируемым генами env, gag и pol, в период формирования гуморального иммунного ответа и на стадии бессимптомного вирусоносительства.

Установлено, что у больных ВИЧ-инфекцией кроме вирусоспецифических антител присутствуют антитела к нДНК, кардиолипину, эритропоэтину, миозину и тд. [Zandman-Goddard G. and Shoenfeld Y., 2002]. Одной из причин образования широкого спектра природных антител является стимуляция аутореактивных клонов В-лимфоцитов ВИЧ-1 и, как результат, поликлональная активация этих клеток. Следовательно, существует тесная патогенетическая связь между формированием аутоиммунного компонента у больных ВИЧ-инфекцией и активной репликацией вируса иммунодефицита человека первого типа [Muller S., Richalet P. et al., 1993]. Однако сведения, имеющиеся на сегодняшний день в литературе, касаются в основном только изучения уровня содержания аутоантител у больных на поздних стадиях заболевания [Zandman-Goddard G. and Shoenfeld Y., 2002; Savige J.A. et al., 1994; Gentric A. et al., 1991], тогда как в период раннего вирусоносительства этот вопрос остаётся до сих пор открытым и требует дальнейших исследований, поскольку этот этап является критически важным для последующей динамики ВИЧ-инфекции.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось исследование динамики образования «свободных» и «связанных» в иммунные комплексы антител к структурным белкам вируса и изучение уровня содержания антител к нДНК в сыворотке крови больных ВИЧ-инфекцией. Были поставлены следующие задачи:

• оптимизировать метод выделения циркулирующих иммунных комплексов из сыворотки крови больных ВИЧ-инфекцией.

• исследовать частоту встречаемости «свободных» и «связанных» в иммунные комплексы антител к вирусным белкам генов env, gag, pol в сыворотке крови больных ВИЧ-инфекцией в ранний период заболевания и на стадии бессимптомного вирусоносительства.

• провести сравнительный анализ показателей содержания антител к нДНК в сыворотке крови доноров и ВИЧ-инфицированных в ранний период заболевания и на стадиях ПБ, IIB.

Научная новизна

Показано, что при развитии гуморального иммунного ответа наблюдается определённая последовательность выработки антител к структурным белкам вируса иммунодефицита человека первого типа, кодируемым генами env, gagnpol.

Впервые установлено, что на стадии бессимптомного вирусоносительства (ПБ) в сыворотке крови больных ВИЧ-инфекцией с высокой степенью частоты встречаемости регистрируется весь спектр антител к белкам генов env, gag и pol, в то время как частота обнаружения противовирусных антител, находящихся в «связанном» состоянии в циркулирующих иммунных комплексах, существенно отличается. Выявлена определённая зависимость между более высоким уровнем присутствия антител к структурным белкам вируса в составе ЦИК и продолжительностью бессимптомного вирусоносительства у больных ВИЧ-инфекцией при дальнейшем диспансерном наблюдении.

Впервые проведено сравнительное исследование показателей содержания антител к нДНК в сыворотке крови больных ВИЧ-инфекцией в ранний период заболевания и на стадиях ПБ, IIB (по классификации Покровского В.И., 1989). Установлено, что достоверно высокое содержание антител к нДНК в период раннего вирусоносительства не сопровождается клиническими проявлениями аутоиммунной патологии у ВИЧ-инфицированных, а является следствием иммунопатогенетического воздействия вируса иммунодефицита человека первого типа.

Практическая значимость

Оптимизирован метод выделения циркулирующих иммунных комплексов из сыворотки крови больных ВИЧ-инфекцией. Этот метод позволяет получить две фракции: «быстро» (18ч)- и «медленно» (72ч)преципитирующих ЦИК (ЦИК1 и ЦИК2), которые были представлены на электрофореграммах иммуноглобулиновой зоной и не содержали примесей белков сыворотки крови и «свободных» иммуноглобулинов. Антитела к структурным белкам ВИЧ-1, полученные путём диссоциации ЦИК1 и ЦИК2, отличаются по своему составу в иммунном блоттинге и суммарной серологической активности в ИФА. Результаты исследований могут быть использованы как при ранней диагностике заболевания, так и при мониторинге инфекционного процесса, в качестве маркёров прогрессирования заболевания, наряду с клинической симптоматикой и определением количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих на поверхности рецепторы CD4+, CD8+.

Апробация работы

Основные положения диссертации докладывались на: III съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Сочи, 2000); VI Международной конференции «Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика» (Санкт-Петербург, 2000); III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); VI Российском съезде врачей-инфекционистов (Санкт-Петербург, 2003); 11-ой Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 2003); IX Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2004); VIII Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004).

По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Рязанова, Галина Анатольевна

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод выделения двух фракций циркулирующих иммунных комплексов из сыворотки крови больных ВИЧ-инфекцией: «быстро» (18ч)- и «медленно» (72ч)- преципитирующих ЦИК (ЦИК1 и ЦИК2).

2. Показано, что в начале «сероконверсии» в сыворотке крови и ЦИК1 обнаруживаются антитела к gpl20 (10%) при полном их отсутствии в спектре «свободных» антител. В ЦИК2 доминируют антитела к р 17/18 (40%), в то время как частота встречаемости этих антител в сыворотке крови составляет 25%. Полученные результаты позволяют ускорить постановку диагноза «ВИЧ-инфекция».

3. Показано, что концу формирования гуморального иммунного ответа в сыворотке крови и ЦИК1 регистрируются антитела к белкам вируса, кодируемым генами env, gag и pol, а в ЦИК2 к gpl60, р55, рЗ 1/34, р24/25 и р 17/18.

4. На стадии бессимптомного вирусоносительства обнаружение противовирусных антител в составе циркулирующих иммунных комплексов может иметь прогностическое значение, поскольку высокая степень частоты встречаемости антител «связанных» в ЦИК сопровождается в дальнейшем более благоприятным протеканием ВИЧ-инфекции.

5. Впервые установлено, что в период формирования гуморального иммунного ответа уровень содержания антител к нДНК в сыворотке крови больных ВИЧ-инфекцией достоверно превышает аналогичный показатель на стадиях НБ, IIB и в группе доноров, полученные данные могут быть использованы в диагностике и прогнозировании динамики заболевания.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рязанова, Галина Анатольевна, Казань

1. Абэлян, А.В. Иммунологическая нейтрализация вируса иммунодефицита человека первого типа / А.В. Абэлян // Успехи современной биологии.-1997.- Т.117.-№5.-С.549-567.

2. Вершигора, А.Е. Общая иммунология: Учебное пособие / А.Е. Вершигора. Киев: Высшая школа, 1990. - 735 с.

3. Герасимов, И.Г. Оптимизация метода определения концентрации циркулирующих иммунных комплексов различной величины / И.Г. Герасимов, Е.В. Зоркова // Клиническая лабораторная диагностика.-2001.-№7.-С. 48-49.

4. Дранник, Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология: Учебное пособие / Г.Н. Дранник. Одесса: АстроГринт, 1999.- 603 с.

5. Зайцев, В.М. Прикладная медицинская статистика / В.М. Зайцев, В.Г. Лифляндский, В.И. Маринкин. СПб.: ООО «Издательство ФОЛИАНТ», 2003. - 432 с.

6. Ильинских, Н.Н. Нестабильность генома и иммунитет / Н.Н. Ильинских // Успехи современной биологии.-1986.-Т.102.-№4.-С.25-38.

7. Иммунологические методы / под ред. Г.Фримеля, пер. с нем. А.П. Тарасова. -М.: Медицина, 1987.-472 с.

8. Коэн, П.Т. Клиническая картина заболевания, вызываемого ВИЧ-инфекцией: обзор 2001: электронный ресурс. Режим доступа: http: // www.mif-ua.com., свободный.

9. Коротяев, А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология / А.И. Коротяев, С.А. Бабичева. СПб.: «Специальная литература», 1998.-592 с.

10. Кульберг, А.Я. Регуляция иммунного ответа / А. Я. Кульберг. М.: Медицина, 1986.-223с.

11. Киселева, В.И. Скрытые натуральные аутоантитела, реагирующие с ДНК и кардиолипином, перекрестно взаимодействуют с антигенами

12. ВИЧ / В.И. Киселева, И.В. Леках, Г.П. Безяева // Иммунология.-2001.-№ 2.-С.12-14.

13. Леках, И.В. Гетерогенность и авидность аутоантител, реагирующих с ДНК / И.В. Леках, Г.М. Ротт, A.M. Поверенный // Молекулярная биология.-1991.- Т.25. №5. - С.1391-1399.

14. Лакин, Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов 4-е изд.; перераб. и доп. / Г.Ф. Лакин. - М.: Высшая школа, 1990.- 352 с.

15. Ладная, Н.Н. Распространение субтипов ВИЧ-1 в России / Н.Н. Ладная, В.В. Покровский, А.Ф. Бобков // Эпидемиол. и инфекц. бол.-1998.-№5 .-С. 19-23.

16. Медицинская микробиология / гл. ред. В.И. Покровский, O.K. Поздеев. М.: ГЕОТАР МЕДИЦИНА, 1998. - 1200 с.

17. Молекулярная биология клетки / под ред. Б. Альберте, Д. Брей, Дж. Лыоис и др.- М.: Мир, 1986.-310 с.

18. Митин, 10.А. Иммунологические аспекты патогенеза и диагностики ВИЧ-инфекции: Автореф. дис. доктора мед. наук / Ю. А. Митин; С. Петербургская военная академия. СПб., 1997.- 40 с.

19. Покровский, В.В. ВИЧ-инфекция клиника, диагностика и лечение / В.В. Покровский, Т.Н. Ермак, В.В. Беляева, О.Г. Юрин М.: ГЕОТАР МЕДИЦИНА, 2000.-496 с.

20. Покровский, В.В. СПИД и генерализованная лимфаденопатия у лиц, серопозитивных к вирусу HTLV-III/LAV / В.В. Покровский, З.К. Янкина, В.И. Покровский и др. // Тер. Архив. 1987. - №7. - С.35-39.

21. Покровский, В.И. ВИЧ-инфекция или СПИД ? / В. И. Покровский. //

22. Тер. Архив 1987. -№11.- С.3-6.

23. Попович, A.M. Иммунотерапия при ВИЧ-инфекции рекомбинантным интерлейкином-2 / A.M. Попович. СПб.: Знаменитые универсанты, 2004. - 64с.

24. Роит, А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл. М.: Мир, 2000.-592 с.

25. Сучков, С.В. Аутоантитела различных уровней специфичности и их клиническое значение при системных и локализованных формах аутоиммунной патологии / С.В. Сучков, А.Г. Габибов // Аллергология и иммунология.-2001.- Т.2. № 1 .-С. 137-147.

26. Суворова, З.К. Серологическая диагностика инфекций, вызываемых ВИЧ, иммуноферментными методами / З.К. Суворова, Е.В. Буравцова, М.О. Деулина, В.В. Покровский // Мед. Помощь.-1993.-№5.-С.22-24.

27. Сперанский, А.И. Аутоиммунные болезни (Клинические и теоретические аспекты) / А.И. Сперанский, С.М. Иванова // Аллергология и иммунология.-2002.-ТЗ.-№1.-С.62-83.

28. Скоупс, Р. Методы очистки белков: пер. с англ. / Р. Скоупс. М.: Мир, 1985.-358 с.

29. Хаитов, P.M. СПИД / P.M. Хаитов, Г.А. Игнатьева. М.: Нар. акад. культуры и общечел. ценностей, 1992. - 420 с.

30. Хаитов, P.M. Обнаружение последовательностей генома ВИЧ субтипа А у пациента с неопределёнными результатами иммуноблотинга к ВИЧ-1 / P.M. Хаитов, Л.П. Трубченинова, Н.И. Ильина, Н.Ф. Трефильева и др. // Иммунология.-1999.-№3 С.9-12.

31. Хаитов, P.M. Соотношение уровня антител к прогностическим белкам ВИЧ-1 при титровании в иммуноблоте сывороток ВИЧ-инфицированных лиц / P.M. Хаитов, Л.Г. Трубченникова, Е.В. Ефремова// Иммунология-1992. №5 - С. 11-14.

32. Хаитов, P.M. К серодиагностике ВИЧ-инфекции / P.M. Хаитов, М.В. Глущенко // Иммунология. 1992. - №5 - С. 12-17.

33. Харитонова, М.Л. ДНК-гидролизующая и протеолитическая активность абзимов в динамике ВИЧ-инфекции / М.Л. Харитонова, Л.П. Сизякина, Г.А. Невинский // Иммунология. 2003.- №2 - С.68-69.

34. Шипулин, А.Г. Место полимеразной цепной реакции в диагностике ВИЧ-инфекции / А.Г. Шипулин, К.А. Саркисян, Е.В. Богословская и др. // Эпидемиол. и инф. бол.-1998.-№5.-С.59-63.

35. Эткин, А.Ф. Анализ специфичности серодиагностики СПИДа / А.Ф. Эткин, В.В. Покровский, З.К. Янкина // Журн. Микробиол.-1986.-№9.-С.73-76.

36. Юрин, Т.И. Клинические проявления и вопросы классификации ВИЧ-инфекции / Т.И. Юрин, Д.И. Ирова, Д.И. Габрилович и др. // Вестн. РАМН.-1992.-№ 9 (10).- С. 16-19.

37. Ashorn, P. An inhibitor of the protease blocks maturation of human immunodeficiency viruses and spread of infection / P. Ashorn, T.J. McQuade, S. Thaisrivongs et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1990.-V.87.- P.7472-7476.

38. Bach, J.F. Are there unique autoantigens triggering autoimmune diseases? J.F. Bach, S. Koutouzov, P.M. van Endert // Immunol. Rev.-1998 -V.139 P. 139-155.

39. Berden, J.H. Immunology in medical practice. Ill Disseminated lupus erythematosus: disturbed apoptosis? / J.H. Berden // Ned. Tijdschr. Geneeskd.-1997.-V. 141 .-№39.- P. 1848-1854.

40. Bruns, A. Nucleosomes are major T and В cell autoantigens in systemic lupus erythematosus / A. Bruns, S. Blass, G. Hausdorf, G.R. Burmester, F. Hicpe // Arthritis Rheum.-2000.- V.43.-№10.-P.2307-2315.

41. Bain, B.J. Lymphomas and reactive lymphoid lesions in HIV-infections / B.J. Bain//Blood. Rev.-1998.-V.12.-№3.-P.154-162.

42. Barre-Sinoussi, F. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS) / F. Barre-Sinoussi, J.C. Chermann, F. Rey et al. // Science.- 1983.-V.220.-P.868-871.

43. Biti, R. HIV-1 infection in an individual homozygous for the CCR5 deletion allele / R. Biti, R. French, J. Young et al. // Nature Medicine.1997.-V3.-№3.-P.252-253.

44. Blaak, H. In vitro replication kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) variants in relation to virus load in long-term survivors of HIV-1 infection / H. Blaak, M. Brouwer, L.J. Ran et al. // J.Infect. Dis.1998.-V. 177.-№3 .-P.600-610.

45. Binley, J.M. Differential regulation of the antibody responses to gag and env proteins of human immunodeficiency virus type 1 / J.M. Binley, P.J. Klasse, Y. Cao et al. // Journal of virology.-1997.-V.71.-№4.-P.2799-2809.

46. Bushman, F.D. Retroviral DNA integration directed by HIV integration protein in vitro / F.D. Bushman, T. Fujiwara, R. Craigie // Science.-1990.-V.249.-P. 1555-1558.

47. Cabral, A.R. Autoantibodies in systemic lupus erythematosus / A.R. Cabral, D. Alarcyn Segovia// Curr. Opin. Rheumatol.- 1997.-V.9.-№5.-P.387-392.

48. Calabrese, L.H. Autoimmune manifestation of human immunodeficiency virus (HIV) infection / L.H. Calabrese // Clin. lab. med.-1988.-V.8.-№2.-P.269-279.

49. Csillag, C. HIV-1 subtype С in Brazil / C. Csillag // Lancet.-1994. V.344.-P.1354-1359.

50. Capon, D. The CD4 gpl20 interaction in AIDS pathogenesis D. Capon, R. Ward //Annu. Rev. Immunol.-1991.-V.9.-P.649-678.

51. Carr, A. Primary HIV-infection / A. Carr, D. Cooper // The Clinical Management of AIDS / Eds. M.A. Sandre, A. Volberding.-Philadelphia: Sanders company, 1997.-515 p.

52. Cao, J. Effect of amino acid changes in the extracellular domain of the human immunodeficiency virus type 1 gp41 envelope glycoprotein / J. Cao, L. Bergeson, E. Helseth, M. Thali, H. Repke, J. Sodroski // J. Virol.-1993.-V.67.-№5.-P.2747-2755.

53. Cheng-Mayer, C. Identification of human immunodeficiency virus subtype with distinct patterns of sensitivity to serum neutralization / C. Cheng-Mayer, J. Homsy, L.A. Evans, J.A. Levy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1988.-V.85.-№8.- P. 2815-2819.

54. Carini, C. Characterization of specific immune complexes in HIV-related disorders / C. Carini, I. Mezzaroma, C. Scano, R. D'Amelio, P. Matricardi, F. Aiuti // Scand. J. Immunol.-1987.-V.26.-№1.-P.21-28.

55. Camerini, D. Л CD4 domain important for HIV-mediated syncytium formation lies outside the virus binding site / D. Camerini, B. Seed // Cell.-1990.-V.60.-P.747-754.

56. Dietzschold, B. New development in the pre- and post- exposure treatment rabies / B. Dietzschold, H.C. Ertl // Immunology.-1991.-V.10.-№5.-P.427-439.

57. Dean, M. Genetic restriction of HIV-1 infection and progression to AIDS by a deletion allele of the CKR5 structural gene / M. Dean, M. Carrington, C. Winkler et al. // Science.-1996.-V.273.- P.1856-1862.

58. Deacon, N.J. Genomic structure of an attenuated quasi species of HIV-1 from a blood transfusion donor and recipients / N.J. Deacon, A. Tsykin, A. Solomon et al. // Science.-1995.-V.270.- P.988-991.

59. Deng, H Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-1 / H. Deng, R. Liu, W. Ellmeier et al. //Nature.-1996.-V.381.-P.661-666.

60. Emini, E.A. Prevention of HIV-infection in chimpanzees by gpl20 V3 domain-specific monoclonal antibody / E.A. Emini, W.A. Scheif, J.H. Nunberg, A.J. Conley, Y. Eda, S. Tokiyoshi et. al. // Nature.-1992.-V.355.-P.728-730.

61. Forrester, J.V. Autoimmunity and autoimmune disease of the eye / J.V. Forrester // Developments in Ophthalmology.-1999.-V.30.-P. 167-186.

62. Fournier, A.M. Dynamics of spontaneous HIV-1 specific and non-specific B-cell responses in patients receiving antiretroviral therapy / A.M.

63. Fournier, V. Baillat, С. Alix-Panabieres, J.M. Fondere, C. Merle, M. Segondy, M.F. Huguet, J. Reynes, J.P. Vendrell // AIDS.-2002.-V.16.-№13.- P.1755-1760.

64. Franke, E.K. Inhibition of HIV-1 replication by cyclosporine A or related compounds correlated with the ability to disrupt the garg-cyclophilin A interaction / E.K. Franke, J. Luban // J. Virology.-1996.-V.222.-P.279-282.

65. Feng, Y. HIV-1 entry cofactor: Functional cDNA cloning of a seven-transmembrane, G protein-coupled receptor / Y. Feng, C.C. Broder, P.E. Kennedy et al. // Science.-1996.-V.272.- P.872-877.

66. Franke, E.R. Specific incorporation of cyclophilin A into HIV-1 virions / E.R. Franke, H.E. Yuan, J. Luban // Nature.-1994.-V.372.-P.359-362.

67. Gololobov, G.V. DNA-protein complexes. Natural targets for DNA-hydrolysing antibodies / G.V. Gololobov, S.V. Mikhalap, A.V. Starov, A.F. Kolesnicov, A.G. Gabibov // Appl. Biochem. Biotechnol.-1994.-V.47.-№ 2 (3).-P.305-314.

68. Gorny, M.K. Repertoire of neutralizing human monoclonal antibodies specific for the V3 domain of HIV-1 gpl20 / M.K. Gorny, J.Y. Xu, S. Karvvowska, A. Buchbinder, S. Zolla-Pozner // J.Immunol.-1993.-V. 150,-P.635-643.

69. Girard, M.B. Immunization of chimpanzees confers protection against challenge with human immunodeficiency virus / M.B. Girard, M.P. Kieny,

70. Л. Pinter, F. Barre-Sinoussi, P.L. Nara, H. Kolbe, K. Kuzumi et. al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1991.-V.88.-№2.-P.542-546.

71. Gains, H. Antibody response to primary HIV-infection / H. Gains, M.A. Sedow, A. Sannetburg et.al. //Lancet.-1987.-V.l.-P. 1249-1253.

72. Gallo, R.C. Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patient with AIDS and at risk for AIDS / R.C. Gallo, S.Z. Salahuddin, M. Popovic et.al. // Science.-1984.-V.224.-P.500-503.

73. Gallay, P. HIV nuclear import is governed by the phosphotyrosinemediated binding of matrix to the core domain of integrase / P. Gallay, S. Swingler, J. Song et al. //Cell.- 1995.-V.83.-P.569-576.

74. Garcia, J.A. Human immunodeficiency virus type 1 LTR TATA and TAR region sequences for transcriptional regulation / J.A. Garcia, D. Harrich, E. Soultanakis et al. //J. EMBO.-1989.-V.8.-P.765-778.

75. Hu, DJ. The emerging genetic diversity of HIV / D.J. Hu, T.J. Dondero, M.A. Rayfild et al. //JAMA.-1996.-V.275.-№3.-P.210-216.

76. Huang, Y. The role of a mutant CCR5 allele in HIV-1 transmission and disease progression / Y. Huang, W.A. Paxton, S.M. Wolinsky et al. // Nature Medicine.-1996.-V.2.-№ 11.-P. 1240-1243.

77. Jacks, T. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression / T. Jacks, M.D. Power, F.R. Masiarz et al. // Nature.-1988.-V.331.-P.280-283.

78. Kubota, T. Advances in systemic lupus erythematosus / T. Kubota // Nippon Rinsho.-1999.- V.57.-№2.-P.329-332.

79. Kirchoff, F. Brief report: absence of intact nef sequences in a long-term survivor with nonprogressive HIV-1 infection / F. Kirchoff, T.C. Greenough, D.B. Brettler et al. // N. Engl. J. Med.-1995.-V.332.-№4.-P.228-232.

80. Koup, R.A., Shutting down HIV / R.A. Koup, D.D. Ho // Nature. 1994. -V.370.-№ 6489.- P.416-428.

81. Kostrikis, L.G. A chemokine receptor CCR2 allele delays HIV-1 disease progression and is associated with a CCR5 promoter mutation / L.G. Kostrikis, Y.Huang, J.P. Moore et al. // Nature Medicine.-1998.-V.4.-№3.-P.350-355.

82. Kim, S.Y. Temporal aspects of DNA and RNA synthesis during human immunodeficiency virus infection: Evidence for differential gene expression / S.Y. Kim, R. Byrn, J. Groopman et al. // J. Virol.-1989.-V.63.-P.3708-3713.

83. Kao, S.Y. Anti-termination of transcription within the long terminal repeat of HIV-1 by tat gene product / S.Y. Kao, A.F. Caiman, P.A. Lucivv et al. //Nature.-1987.-V.330.-P.489-493.

84. Kobayashi, N. Effect of interleukin-1 on the augmentation of human immunodeficiency vims gene expression / N. Kobayashi, Y. Hamamoto, Y. Koyanagi et al. // Bioch. Biophys. Res. Commun.-1989.-V.165.-P.715-721.

85. Liversidge, J. Uveitogenic epitopes of retinal S-antigen are generated in vivo via an alternative antigen-presentation pathway / J. Liversidge, R. Dawson, A.D. Dick, J.V. Forrester // Immunology.-1998.-V.94.-№2.-P.271-278.

86. Levy, J.A. HIV: detection and pathogenesis / J.A. Levy // AIDS Pathogenesis and treatment.-N.Y.- 1989.-V.17.-P. 159-230.

87. Levy, J.A. Isolation of lymphocytopathic retroviruses from San Francisco patients with AIDS / J.A. Levy, A.D. Hoffman, S.M. Kramer et al. // Science.-1984.-V.225.-P.840-842.

88. Liu, R. Homozygous defect in HIV-1 coreceptor accounts for resistence of some multyply-exposed individuals to HIV-1 infection / W.A. Paxton, S. Choe et al. // Cell.-1996.- V.86.-№3.-P.367-377.

89. Levvis, P. Human immunodeficiency virus infection of cells arrested in the cell cycle / P. Lewis, M. Hensel, M. Emerman // J. EMBO.-1992.-V.il.-P.3053-3058.

90. Landau, N.R. The envelope glycoprotein of the human immunodeficiency virus binds to the immunoglobulin-like domain of CD4 / N.R. Landau, M. Warton, D.R. Littman //Nature.-1988.-V.334.-P. 159-162.

91. Montagnier, L. The virus of human immunodeficiency / L. Montagnier // Rev.Prat.-1987.-V.37.-№42.-P.2553-2558.

92. Moore, J.P. HIV-1 neutralizing antibodies: how full is the bottle? / J.P. Moore, D. R. Burton // Nat. Med.- 1999.- V.5.- P. 142-144.

93. Mason, L.J. Immunopathogenesis of SLE / L.J. Mason, D.A. Isenberg // Bailliers Clin. Rhumatol.-1998.-V.12.-№3.-P.385-403.

94. Morris, B.L. HIV-1 antigen-specific and -nonspecific В cell responses are sensitive to combination antiretroviral therapy / B.L. Morris, J.M. Binley, B.A. Clas et al. //J. Exp. Med.-1998.-V.188.-№2.-P.233-245.

95. Miller, M. Crystal structure of a retroviral protease proves relationship to protease family / M. Miller, M. Jaskolski, J.K. Rao et al. // Nature.-1989.-V.337.-P.576-579.

96. Nevinsky, G.A. Natural catalytic antibodies (abzymes) in normalcy and pathology / Bioprot Network, 2000 / G.A. Nevinsky, T.G. Kanyshkova, V.N.Buneva: электронный ресурс.- Режим доступа: http:// www.protein.bio.msu.su., свободный.

97. Perniok, A. High levels of circulating early apoptotic peripheral blood mononuclear cells in systemic lupus erythematosus / A. Perniok, F. Wedekind, M. Herrmann, C. Specker, M. Schneider // Lupus.-1998.-V.7.-№2.- P.l 13-118.

98. Pisetsky, D.S. Antibody responses to DNA in normal immunity and aberrant immunity / D.S. Pisetsky // Clinical and diagnostic laboratory immunology.-1998.-V.5.-№l.-P.l-6.

99. Paxton, W. Incorporation of Vpr into human immunogeficiency virus type 1 virions: Requirement for the рб region of gag and mutational analysis / W. Paxton, R.I. Connor, N.R. Landau // J. Virol.-1993.-V.67.-P.7229-7237.

100. Parkin, N.T. Human immunodeficiency virus type 1 gag -pol frameshifting is dependent on mRNA secondary structure: Demonstration by expression in vivo / N.T. Parkin, M. Chamorro, H. E. Varmus // J. Virol.-1992.-V.66.-P.5147-5151.

101. Rose, L.M. Apoptosis in peripheral lymphocytes in systemic lupus erythematosus: a review / L.M. Rose, D.S. Latchman, D.A. Isenberg // Br. J. Rheumatol.- 1997.-V.36.-№2.-P. 158-163.

102. Ranki, A. Long latency precedes overt seroconversion in sexually transmitted human-immunodeficiency-virus infection / A. Ranki, S. Valle, M. Krohn et al. // Lancet.-1987.-V.2.-P.589-593.

103. Ruben, S. Structural and functional characterization of human immunodeficiency virus tat protein / S. Ruben, A. Perkins, R. Purcell et al. //J. Virol.-1989.-V.63.-P.l-8.

104. Subbramanian, R.A. Comparison of human immunodeficiency virus (HIV) -specific infection enhancing and inhibiting antibodies in AIDS patients / R.A. Subbramanian, J. Xu, E. Toma, R. Morisset, E.A. Cohen, J. Menezes,

105. A. Ahmad //Journal of clinical microbiology.-2002.-V.40.-P.2141-2146. 128.Smith Franklin, B.A. Follicular dendritic cells and the persistence of HIVinfectivity: the role of antibodies and Fc receptors / B.A. Smith Franklin,

106. B.F. Keele, J.G. Tew, S. Gartner, A.K. Szakal, J.D. Ester, T.C. Thacker, G.F. Burton //The Journal of immunology.-2002.-V.168.-P.2408-2414.

107. Spatz, L Studies on the structure, regulation and pathogenic potential of anti-dsDNA antibodies / L. Spatz, V. Saenko, L. Jones, M. Irigoyen, A.

108. Schwartz, S. Cloning and functional analysis of multiply spliced mRNA species of human immunodeficiency virus type 1 / S. Schwartz, B.K. Felber, D.M. Benko et al. //J. Virol.-1990.-V.4.-P.2519-2529.

109. Sheridan, P.L. Activation of the HIV-1 enhancer by the LEF-1 HMG protein on nucleosome-assembled DNA in vitro / P.L. Sheridan, C.T. Sheline, K. Cannon et al. // Genes Dev.-1995.-V.9.-P.2090-2104.

110. Theodorou, I. HIV-1 infection in individual homozygous for CCR5 delta 32 / I. Theodorou, L. Meyer, M. Magierowska et al. // Lancet.-1997,-V.349.-P. 1219-1220.

111. Whittle, R.M. Human antiretinal antibodies in toxoplasma retinochoroiditis / R.M. Whittle, G.R. Wallace, R.A. Whiston, R.A. Dumonde, M.R. Stanford// Br. J. Ophthalmol.-1998.-V.82.-№9.-P. 1017-1021.

112. Winkler, C. Genetic restriction of AIDS pathogenesis by an SDF-1 chemokine gene variant / C. Winkler, W. Modi, M.W. Smith et al. // Science.-1998.-V.279.-P.389-393.

113. Zinkernagel, R.M. Что недостает иммунологии для понимания иммунитета? / R.M. Zinkernagel // Аллергология и иммунология.-2001.-№1.-С.7-15.

114. Zandman-Goddard, G. HIV and autoimmunity / G. Zandman-Goddard, Y. Shoenfeld // Autoimmun. Rev.-2002.-V.l.-№6.-P.329-337.

115. Zack, J.A. HIV-1 entry quiescent primary lymphocytes: Molecular analysis reveals a labile, latent viral structure / J.A. Zack, S.J. Arrigo, S.R. Weitsman et al. // Cell.-1990.-V.61 .-P.213-222.