Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Диагностика полиморфизма гена ТПМТ и наследственных мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Диагностика полиморфизма гена ТПМТ и наследственных мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2"

на правах рукописи

Громыко Ольга Евгеньевна

ДИАГНОСТИКА ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ТПМТ И НАСЛЕДСТВЕННЫХ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ ВКСА1/2 И СНЕК2

03.00 03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2008

003169077

Диссертация выполнена в Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Научный руководитель

кандидат биологических наук Т.В. Наседкина

Официальные оппоненты

доктор биологических наук,

профессор A.B. Карпухин

доктор медицинских наук М.Г. Якубовская

Ведущая организация Институт общей генетики им Н И Вавилова РАН

Защита диссертации состоится 2008 г в 1( ч.

на заседании Диссертационного совета Д 002 235 01 при Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г Москва, ул Вавилова, д 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Автореферат разослан «Ж» 2008 г

Ученый секретарь Диссертационного кандидат химических наук

цын

Список используемых сокращений

ПС Ж ЛЛ МЛ

мзн ЧР мж пж тм тк я

АПК

пмт

ЯСА1 ЯСА2 НЕК2 № вЭСР

дезоксирибонуклеиновая кислота молочная железа острый лимфобластный лейкоз острый миелобластный лейкоз

первично-множественные злокачественные новообразования

полимеразная цепная реакция

рак молочной железы

рак поджелудочной железы

рак тела матки

рак толстой кишки

рак яичников

универсальный аппаратно-программный комплекс

тиопурин-З-метшпрансфераза

ген 1, ассоциированный с риском развития РМЖ

ген 2, ассоциированный с риском развития РМЖ

ген 2 киназы контрольной точки клеточного цикла

однонуклеотидный полиморфизм

анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время молекулярно-генетический анализ находит все более широкое применение в клинической диагностике Помимо выявления мутаций, приводящих к развитию врожденных наследственных заболеваний, актуальным становится анализ полиморфизма генома человека Полиморфные варианты генов определяют индивидуальную чувствительность человека к различным лекарственным препаратам, а также предрасположенность к различным мультифакториальным заболеваниям, например онкологическим. Резкое увеличение числа анализируемых изменений в геноме, а также значительное расширение круга лиц, которым показаны подобные исследования, требует разработки и внедрения в клиническую практику новых методов анализа Одним из таких перспективных современных подходов является метод аллель-специфичной гибридизации с использованием олиго-нуклеотидных биочипов, разработанный в Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН (ИМБ РАН), позволяющий за короткое время проводить скрининг большого количества образцов с наименьшими затратами и отличающийся большой чувствительностью и специфичностью (Мирзабеков АД идр, 2002)

В настоящей работе на основе этого подхода созданы методы диагностики полиморфизма гена ТПМГ, связанного с недостаточностью фермента тиопу-рин-Б-метилтрансферазы (ТПМТ), и мутаций в генах ВВ.СА1, ВКСА2 и СНЕК2, ассоциированных с наследственными формами рака молочной железы (РМЖ) и рака яичников (РЯ)

Наследственная недостаточность фермента ТПМТ, обусловленная инак-тивирующими точечными полиморфными заменами в гене ТПМТ, приводит к плохой переносимости лекарственных препаратов тиопуриновой группы (6-меркаптопурин, 6-тиогуанин и азатиоприн) (Ьеппагё Ь е( а1, 1992) Стандартные дозы этих лекарств высоко токсичны для больных с недостаточностью этого фермента, причем токсический эффект может быть фатальным (Ьеппагс1 Ь е/ а/, 1987) Тиопурины составляют существенную долю от всех лекарственных средств, используемых для лечения острых лимфобластных и миелобластных лейкозов (ОЛЛ и ОМЛ), а также используются как иммуносупрессорные препараты при пересадке органов и в качестве вспомогательных препаратов для лечения многих хронических заболеваний (ревматоидный артрит, хронический гепатит и т д) Поэтому крайне важно перед проведением курса лечения определить чувствительность пациента к этой группе препаратов для коррекции их дозы

Наличие мутаций в высокопенетрантных генах-супрессорах ВЯСА1 и ВЯСА2 ассоциируется с повышенным риском развития РМЖ и РЯ у женщин (М1к1 У е1 а1, 1994, \УооБ1ег К et а1, 1995) Ранее проведенные исследования показали, что из всех случаев возникновения РМЖ и РЯ от 5 до 10% являются наследственными, 80% из которых обусловлены мутациями в генах ВЯСА1 и

BRCA2 Низкопенетрантные гены, такие как СНЕК2, PTEN, Р53, ATM, FANC, NBS1 и др, отвечают за развитие индивидуальной и семейной синдромальной патологии в 1-5% случаев (Claus ЕВ et al, 1996)

И та, и другая модель уже являются объектами генетического тестирования в странах Западной Европы и Америке. Поскольку, ранее полиморфизм гена ТПМТ в России не изучался, в настоящей работе с помощью разработанного ТПМТ-биочкпа было проведено широкомасштабное исследование частоты аллелей данного гена в популяции Европейской части России Что касается выявления наследственных форм РМЖ и РЯ, ассоциированных с мутациями в генах BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 у российских пациентов, то ранее был проведен ряд исследований на небольших выборках (40-300 чел) В основном, это были пациенты с отягощенным семейным анамнезом и другими признаками наследственного опухолевого фенотипа (ранний возраст манифестации заболевания, двухстороннее поражение парных органов и т д) (Gayther SA et al, 1997, Tere-schenko IV et al, 2002, Logmova AN et al, 2003, Sokolenko AP et al, 2007 ) Исследования, проведенные на выборках пациентов с диагнозом РМЖ, смешанных по возрасту и семейной истории заболевания (Sokolenko А Р et al, 2006 . Chekmareva Е V et al, 2006) были посвящены анализу частоты только двух мутаций - 5382msC в гене BRCA1 и llOOdelC в гене СНЕК2. Это вызывает необходимость проведения дополнительного исследования частоты различных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 у российских пациентов с диагнозом РМЖ и РЯ в смешанной по возрасту и семейной истории заболевания выборке для выявления доли наследственных форм в общей структуре заболеваемости

Цель работы разработка методов диагностики полиморфизма гена ТПМТ, связанного с недостаточностью фермента ТПМТ, и мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2, ассоциированных с наследственными формами РМЖ и РЯ, с использованием технологии олигонуклеотидных биочипов

В соответствии с поставленной целью в работе предполагалось решить следующие основные задачи

1 Разработать метод аллель-специфичной гибридизации на биочипе для анализа шести наиболее распространенных в мировых популяциях точечных полиморфных вариантов в гене 777MT(G238C, G292T, G460A, G644A, T681G, A719G)

2 Определить частоты генотипов и аллелей гена ТПМТ у детей с гемо-бластозами и здоровых доноров, жителей Европейской части России, используя разработанный ТПМТ-биочип, и сравнить их с таковыми в популяциях других стран

3 Разработать метод аллель-специфичной гибридизации на биочипе для анализа семи наиболее распространенных в популяциях Восточной Европы точечных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 (185delAG, 300T>G, 4153delA и 5382msC в гене BRCA1, 695msT и 6174delT в гене BRCA2, мутация llOOdelC в гене СНЕК2) и полиморфизма 4158A>G в гене BRCA1.

4 Провести исследование частот этих мутаций и полиморфизма 4158А>0 в смешанной по возрасту и семейной истории заболевания выборке пациентов, жителей Европейской части России, с диагнозом РМЖ, РЯ и ПМЗН и определить долю наследственных форм рака в общей структуре заболеваемости

5 Провести сравнение частоты наиболее распространенных мутаций в генахВЛСА1/2 и СНЕК2 у жителей Европейской части России и стран Европы

6 Проанализировать семейный анамнез пациентов-носителей мутаций в генах ВИСА 1/2 и СНЕК2.

Научная новизна. Разработан метод диагностики шести полиморфных вариантов (С238С, С292Т, С460А, С644А, Т68Ю, А7190) в гене ТПМТ человека Впервые, на большой выборке исследовано распределение аллелей и генотипов данного гена у детей с гемобластозами и здоровых индивидуумов, жителей Европейской части России Проведено сравнение этих данных с частотами аллелей и генотипов, полученными для других популяций. Показано, что самым частым полиморфным аллелем, связанным с ТПМТ-недостаточностью, является ТПМТ*ЗА (85,7%), а более редкими аллелями ТПМТ*ЗС (9,5%) и ТПМТ*2 (4,8%) Это согласуется с ранее полученными данными для популяций Европы и Америки

Разработан метод диагностики семи наиболее распространенных точечных мутаций в генах ВЯСА1/2 и СНЕК2 (185с1е1АО, 300Т>С, 4153сЗе1А и 53821ШС в гене В11СА1, б95тзТ и 6174ёе1Т в гене ВЯСЛ2, 110(ШС в гене СНЕК2) и полиморфизма 4158А>С в гене ВЯСА1 Впервые проведено расширенное исследование пациентов с диагнозом РМЖ, РЯ и ПМЗН с поражением молочных желез (МЖ) и яичников на наличие данных мутаций и выявлена доля наследственных форм РМЖ и РЯ, ассоциированных с мутациями в данных генах, в общей структуре заболеваемости для жителей Европейской части России Определены частоты наиболее распространенных мутаций в ВЯСА1/2 и СНЕК2 и полиморфизма 4158А>0 в гене ВЯСА1 у пациентов с РМЖ, РЯ и ПМЗН, что представляет интерес для сравнительной популяционной генетики Выявлена наиболее распространенная мутация в гене ВЯСА1 - 53821пбС во всех трех группах пациентов, частота которой в группе пациентов с диагнозом РМЖ составила 3,4%, РЯ - 10,3% и ПМЗН - 18,2%

Практическая значимость. Разработанные нами ТПМТ- и РМЖ-биочипы позволяют быстро и с высокой степенью достоверности диагностировать однонуклеотидные замены в исследуемых генах Следовательно, данные тест-системы можно с успехом применять в клинической практике и для проведения широкомасштабных исследований популяции с целью выявления среди населения лиц-носителей тех или иных полиморфных аллелей и мутаций В частности, это позволит в дальнейшем прогнозировать риск развития осложнений при лечении тиопуринами лиц с полиморфными вариантами гена ТПМТ, приводящими к дефициту фермента, а также подбирать индивидуальную схему терапии данньми препаратами в онкогематологии, при трансплантации органов и при лечении различных аутоиммунных заболеваний. Выявление носителей

мутаций в генах ВКСА1/2 и СНЕК2 поможет разработать наиболее эффективную стратегию лечения уже имеющегося онкозаболевания и профилактику других злокачественных новообразований У здоровых носителей это позволит подобрать тактику проведения клинического мониторинга за состоянием здоровья и профилактику онкозаболеваний

ТПМТ-биочип был включен в качестве составной части в тест-систему ПФ-биочип, предназначенную для выявления генетической предрасположенности к некоторым онкологическим заболеваниям и определения индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам (регистрационное удостоверение № ФС 01262006/5317-06 от 28 декабря 2006 г)

Апробация результатов работы. Основные результаты работы были представлены на 7-й Путинской конференции молодых ученых (Россия, Пу-щино, 2003), на 3-м Симпозиуме «Биологические основы терапии онкогемато-логических заболеваний у детей» (Россия, Москва, 2002), на 14-й Всемирной конференции по семейным формам РМЖ и РЯ (Испания, Мадрид, 2003), на Конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, посвященной 50-летию открытия двойной структуры ДНК (Украина, Киев, 2003), на Европейских конференциях по генетике человека (Англия, Бирмингем, 2003, Германия, Мюнхен, 2004, Нидерланды, Амстердам, 2006), на конференции Европейского совета по медицинской онкологии (Венгрия, Будапешт, 2005), на Международной конференции по геному человека (Финляндия, Хельсинки, 2006), на международной конференции «Генетика в России и в мире» (Россия, Москва, 2006) Отдельные фрагменты диссертационной работы докладывались на научных семинарах Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 12 тезисов конференций

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 3/¿^источников Работа изложена на № страницах машинописного текста, содержит рисунков и /¿таблиц

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пациенты. Отбор пациентов с гемобластозами (с диагнозом ОЛЛ, ОМЛ и неходжинская лимфома) и доноров, не имеющих онкологических заболеваний, был проведен в период с октября 2001 по июнь 2005 гг. на базе онкогема-тологических отделений Российской детской клинической больницы (РДКБ) МЗ РФ (Москва), Морозовской детской клинической больницы (Москва) и Московского областного онкологического диспансера (Балашиха) Диагноз устанавливали на основании клинического обследования, данных лабораторных и инструментальных методов У родителей (опекунов) каждого пациента было

получено информированное согласие об участии в исследовании В выборку вошли неродственные индивиды, жители Европейской части России Всего было обследовано 700 пациентов (из них - 280 пациентов с гемобластозами и 420 пациентов из группы сравнения (без онкологических заболеваний)) мужского и женского пола (в соотношении соответственно 1,5 1) Возраст пациентов из группы с гемобластозами был от 0 до 18 лет (средний возраст 7 лет) Возраст пациентов из группы сравнения находился в диапазоне от 0 до 73 лет (средний возраст - 20 лет) Контрольные образцы с известным генотипом (п=60) для проверки специфичности ТПМТ-биочипа были предоставлены Госпиталем Св Иуды (Мемфис, США)

Пациенты с онкологическими заболеваниями (с диагнозом РМЖ, РЯ, ПМЗН) для исследования на наличие мутаций в генах BRCAI/2 и СНЕК2 были отобраны в период с 2004 по 2006 гг в Российском онкологическом научном центре РАМН им НН Блохина (Москва) Диагноз устанавливали на основании клинического обследования, данных лабораторных и инструментальных методов У каждого пациента было получено информированное согласие об участии в исследовании В выборку вошли неродственные индивиды, жители Европейской части России Выборка была смешанной по возрасту и семейной истории заболевания С точки зрения клинических особенностей заболевания пациенты были разделены на три группы В первую группу входили женщины с диагнозом органоспецифический РМЖ (п=385, диапазон возраста от 23 до 85 лет, средний возраст - 53 года) Во вторую группу входили женщины с диагнозом органоспецифический РЯ (п=68, диапазон возраста от 31 до 76 лет, средний возраст - 55 лет) Третья группа состояла из женщин с диагнозом ПМЗН с поражением МЖ и яичников (п=33, возраст находился в диапазоне от 27 до 79 лет, средний возраст - 50 лет) Из них у 13 пациентов был диагноз РМЖ и РЯ, у семи - РМЖ и РТМ, у двух пациентов - РМЖ и лейомиома, у двух - РМЖ и РТК, у одной пациентки - РМЖ и рак шейки матки, у одной пациентки - РМЖ и рак желудка, у одной пациентки - РМЖ и меланома, у двух пациентов - РЯ и РТМ, и у четырех пациентов РЯ сочетался с меланомой, раком почки, раком щитовидной железы или гистиоцитомой средостения, соответственно Контрольные образцы с известным генотипом (п=37) для проверки специфичности РМЖ-биочипа были предоставлены Биомедицинским центром Латвийского университета (Рига)

Экстракция геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови. У каждого пациента было взято 2-3 мл периферической крови Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов крови с использованием стандартного фенол-хлороформного метода (Sambrook et al, 1989) или набора реагентов Wizard® Genomic DNA Purification Kit («Promega», США) в соответствии с рекомендациями производителя

Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР). Фрагменты ДНК, анализируемые на биочипе, были амплифицированы с использованием двух-

этапной мультиплексной ПЦР с флуоресцентно меченными праймерами (краситель СуЗ)

Нуклеотидные последовательности исследуемых фрагментов генов получали из Интернет-базы «Nucleotide» (http.//www ncbi.nlm nih gov/) Праймеры, необходимые для амплификации этих фрагментов, подбирали с использованием программы «Ohgo 6» (MBI, США) Специфичность праймеров проверяли с помощью программы «Nucleotide-nucleotide BLAST» («NCBI», США) Общие принципы выбора последовательностей праймеров и условий для аллель-специфичной ПЦР, и дальнейшей гибридизации продукта ПЦР на биочипе были сформулированы ранее (Глотов АС и др, 2005)

При разработке метода диагностики полиморфизма гена ТПМТ на первом этапе ПЦР проводили одновременную амплификацию трех участков 5, 7 и

10 экзонов данного гена Далее 1 мкл продукта первого этапа ПЦР вносили в смесь второго этапа, содержащую обратные праймеры, меченые флуоресцентным красителем СуЗ, и проводили ассиметричную реакцию

Амплификацию ДНК для анализа на РМЖ-биочипе проводили аналогичным образом При этом одновременно амплифицировали четыре участка гена BRCA1, два участка гена BRCA2 и один участок гена СНЕК2 На каждом этапе ПЦР использовали две реакционные смеси В первой смеси нарабатывали фрагменты 2, 5 и 20 экзонов гена BRCA1, во второй смеси происходила наработка фрагментов 11 экзона гена BRCA1, 5 и 11 экзона гена BRCA2 и фрагмента

11 экзона гена СНЕК2

Продукты ПЦР выявляли посредством электрофореза в 2% агарозном геле

Изготовление биочипов. Олигонуклеотиды для иммобилизации на биочипе синтезировали на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer («Applied Biosystems», США) с использованием стандартной фосфорамидитной процедуры 3'-конец олигонуклеотидов содержал спейсер со свободной аминогруппой, который вводили в состав олигонуклеотида при синтезе с использованием реактива 3 '-Ammo-Modifier С7 CPG 500 («Glen Research», США)

Биочипы изготовили методом фотоиндуцируемой совместной полимеризации олигонуклеотидов и компонентов акриламидного геля, как описано ранее (Rubina A.Yu et al, 2004)

Гибридизация, регистрация изображения и обработка полученных данных. Регистрацию и обработку изображения с биочипа выполняли на универсальном аппаратно-программном комплексе УАПК (ИМБ РАН) с помощью программы «ImaGeWare»™, разработанной в лаборатории Биологических Микрочипов ИМБ РАН (рис 1)

Рис. 1. Интерфейс программы «ImaGeWare»™ для РМЖ-биочипа.

Производилась визуальная оценка изображения биочипа, а также количественная оценка интенсивности флуоресцентного сигнала от каждой отдельной ячейки с помощью программы. Поскольку в конструкции биочипа применяли дублирование ячеек, в дальнейших расчетах использовали средние значения сигналов по двум ячейкам. Считали, что образец ДНК гомозиготен по предко-вому аллелю (аллелю дикого типа) или по тому или иному производному алле-лю, если интенсивность флуоресценции в ячейке, где образовался совершенный дуплекс, более чем в 5 раз превосходила интенсивность флуоресценции в ячейке, где образовался несовершенный дуплекс. Данная величина дискриминационного отношения была экспериментально установлена при тестировании контрольных образцов. Если совершенные дуплексы образовывались как в ячейках, содержащих последовательности дикого типа, так и в соответствующих им ячейках с мутантной последовательностью, а интенсивности флуоресценции с данных ячеек отличались друг от друга не более чем на 20%, то считали, что значимыми являются сигналы с ячеек обоих типов. Такой образец считали гетерозиготным по данной мутации.

Секвенироваяие ДНК проводили в Межинститутском центре коллективного пользования «Геном» при ИМБ РАН с помощью набора реактивов BigDye Terminator Version 3.1 Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems», США) с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвесторе ABl PRISM 3100-Avant («Applied Biosystems», США).

Анализ полученных результатов секвенирования осуществлялся с использованием компьютерной программы «Chromas» 1.45 (Conor McCarthy, School of Health Science, Australia).

Статистическая обработка результатов. Статистические оценки в расхождениях частот мутаций и оценки расхождений в среднем возрасте сравниваемых групп проводили с помощью t—критерия Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при /?<0,05.

Статистические вариации частоты оценивались по стандартной формуле для биноминального распределения

_/(!-/)

N

где, /- частота,

N— количество человек в выборке

(1)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка метода диагностики с использованием биочипов включала в себя следующие этапы выбор полиморфных вариантов и мутаций в генах ТПМТ, BRCA1/2 и СНЕК2 для дальнейшего анализа на биочипах и разработка схем биочипов, подготовка образцов для анализа (выделение ДНК из периферической крови, проведение ПЦР), гибридизация на биочипах и интерпретация полученных результатов

Часть 1. Диагностика полиморфизма гена ТПМТ.

Стратегия подбора полиморфных вариантов в гене ТПМТ для анализа на биочипе. Конструирование и принцип работы ТПМТ-биочипа. Известно, что в среднем у 1 из 300 человек имеется выраженная недостаточность ТПМТ, что приводит к миелотоксическому действию лекарственных препаратов, применяемых в стандартных дозах Около 10% людей, являются гетерози-готами, характеризующимися пониженной активностью ТПМТ, что также может привести к токсическому эффекту препаратов Около 90% популяции имеют нормальную активность ТПМТ (Krynetskiy Е Y et al, 1996, Schaeffeler Е et al, 2004)

На данный момент описано более 20 различных аллелей гена ТПМТ, которые кодируют фермент с нормальным (ТПМТ*1 и ТПМТ*IS) и измененным уровнем активности белка (ТПМТ*2-*23) (Weinshilboum R М et al ,1980, Evans WE et al, 2004, Schaeffeler E et al, 2006, Hamdan-Khahl R et al, 2004) Аллель ТПМТ*1 является предковым аллелем или аллелем дикого типа К самым распространенным минорным полиморфным аллелям относятся ТПМТ*2 (полиморфизм G238C), ТПМТ*ЗА (полиморфизмы G460A и A719G) и ТПМТ*ЗС (полиморфизм A719G), которые обнаружены в 85-95% случаев полиморфизма, приводящего к дефициту ТПМТ, в мировых популяциях

В настоящем исследовании на основании данных литературы для анализа были выбраны шесть наиболее распространенных в популяциях мира точечных полиморфных вариантов в гене ТПМТ (G238C, G292T, G460A, G644A, T681G, A719G) Таким образом, кроме аллеля дикого типа ТПМТ*1, биочип может детектировать восемь приводящих к дефициту ТПМТ аллелей, включая как самые распространенные (ТПМТ*2, *ЗА, *ЗС), так и редкие аллели, встречающиеся в единичных случаях в отдельных популяциях (*ЗВ, *3D, *5, *7, *8)

а

1 2 3 4 5 6

0238 0292 в460 0644 Т681 А719

0238 0292 0460 0644 Т681 А719

Ж 1 Цт^г

ня ¡¡¡Я1 ¡§¡§1 ИЙЯИ

О 9 0 Э • э О О 0 9 • %

• л

а

о ® в о 0 >

1,30 1,20 1,10 1,00 0,90

о,во

0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00

1,30 ---------------- ------------------------------------ Ё^ДИКИЙТИП

1 10 И полиморфизм

1,'00 ' ' " '

0,90 0,80

■ 0,70 0,60 0,50 0,40

. 0,30 0,20 ' 0,10

■ 0,00

1,30 1,20 1,10 1,00 0,90 , „ 0,80 ! 5 0,70

5 5 о,бо

> ® 0,50

- 8 оао

: 8. 0,30

9 0,20

5" 0,10

■8- 0,00

Рис. 2. (а) - схема расположения олигонуклеотидных проб на ТПМТ-биочипе. В двух верхних рядах иммобилизованы олигонуклеотиды, соответствующие последовательностям дикого типа, (белые прямоугольники). В двух нижних - олигонуклеотиды, соответствующие полиморфным последовательностям гена ТПМТ (серые прямоугольники). Гибридизационные картины, полученные при анализе образцов с различным генотипом {левый ряду, (б) - образец, не содержащий исследуемых полиморфных вариантов - генотип ТПМТ*]/*]; (в) - образец с генотипом ТПМТ*1/*ЗА\ (г) - образец с генотипом ТПМТ*2/*2, а также диаграммы усредненных значений относительных интен-сивностей флуоресценции с ячеек биочипа (правый ряд).

Схема расположения олигонуклеотидных проб на ТПМТ-биочипе показана на рис 2(а) Олигонуклеотидные пробы, расположенные в ячейках биочипа, представляют собой участки гена ТПМТ, выбранные таким образом, чтобы вариабельный нуклеотид находился в центральном положении. Каждая ячейка на биочипе продублирована с целью повышения воспроизводимости результатов

Для определения точности метода было протестировано 60 образцов ДНК с известным генотипом Результаты гибридизации на биочипе полностью совпали с данными, полученными другим методом (анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (ББСР) с последующим секвенированием)

Порог чувствительности анализа на биочипе был определен методом последовательных разведений Показано, что минимальным количеством ДНК, необходимым для однозначной и воспроизводимой идентификации мутаций, является 100 геном-эквивалентов

На рис (рис 2(б-г)) приведены примеры гибридизационных картин для образцов с различными генотипами

Генотипирование пациентов. После разработки ТПМТ-биочипа и проверки специфичности метода было проведено широкомасштабное исследование частот генотипов (рис 3) и аллечей гена ТПМТ у жителей Европейской части России

В результате из 700 обследуемых индивидов 44 (6,3%) были гетерозиготны по локусу гена ТПМТ, из них у 37 (5,3%) человек обнаружен генотип ТПМТ *1/*ЗА, у пяти (0,7%) - генотип ТПМТ*1/*ЗС и у двух (0,3%) - генотип ТПМТ*1/*2 Остальные 656 (93,7%) индивидов имели генотип ТПМТ*1/*1 (дикий тип)

Пациенты гомозиготные по ТПМТ*2, *ЗА, *ЗС аллелям, а также носители *ЗВ, *ЗД *7 и *8 аллелей в нашем исследовании обнаружены не были

Также исследованная выборка была разделена на группу пациентов с ге-мобластозами и группу доноров, не имеющих онкологических заболеваний, и в каждой группе определены частоты генотипов гена ТПМТ Статистически значимых расхождений найдено не было

Общая выборка была использована для определения частот аллелей гена ТПМТ Частота аллеля ТПМТ*1 в исследованной группе составила 96,8% (1356/1400), других полиморфных аллелей - 3,2% (44/1400). Из них аллель ТМПТ*ЗА встречался в 2,6% (37/1400), аллель ТПМТ*ЗС-в 0,4% (5/1400) и аллель ТМПТ*2 - в 0,1% (2/1400) случаев

При анализе литературных данных по частотам аллелей гена ТПМТ в популяциях США, Европы, Африки, Китая, Юго-Восточной Азии оказалось, что популяция жителей Европейской части России наиболее близка к популяциям Польши, Германии и белого населения Америки (рис 4)

0,6

0,4 Т

0,2 И

0 111111

ТПМГ1Г2

/

ТПМГ1/*1 ТПМТ*1/*ЗА ТПМПГЗС ТПМГ1Г2

Рис. 3. Частоты генотипов гена ТПМТу жителей Европейской части России.

я т

ТПМТ*ЗА

тпмгзс

ТПМТ* 2

Рис. 4. Частоты наиболее распространенных аллелей гена ТПМТ в популяциях мира и в Европейской части России.

Для выявления клинического значения полиморфизма гена ТПМТ врачами-гематологами было проведено ретроспективное сравнение продолжительности этапа консолидации, изменения дозы 6-МП и его гематологической токсичности у 59 больных ОЛЛ с разными генотипами. Восемь пациентов были гетерозиготами по полиморфным аллелям гена ТПМТ\ приводящим к недоста-

■ РОССИЯ Польша

□ Словения а Германия

И белое население Америки а Афро-Американцы

□ Юго-Восточная Азия И Кения

¡3 Китай

точности фермента, а остальные пациенты имели генотип дикого типа (Чупова HB и др, 2005)

Оказалось, что пациентам, носителям аллелей ТМПТ*ЗА, ТПМТ*ЗС и ТПМТ*2, необходимо было продлевать этап консолидации на две недели по сравнению с таковым для пациентов с генотипопом ТМПТ*1/*1 (р=0,045) Кроме того, эти пациенты толерировали достоверно более низкие дозы 6-МП (264 мг/м2 по сравнению с 312 мг/м2, р=0,04) У гетерозиготных пациентов в 2 раза чаще отменяли терапию 6-МП по сравнению с пациентами с генотипом ТМПТ*1/*1 (20% по сравнению с 11%; р=0,01) вследствие развития острой гематологической токсичности, что нарушало сроки проведения консолидации

Таким образом, проспективная диагностика полиморфных вариантов гена ТПМТ, приводящих к недостаточности фермента, позволит осуществлять индивидуальный подход к лечению пациентов Например, это может быть редукция дозы лекарственного препарата, позволяющая снизить токсичность терапии в рамках установленного протокола

Часть 2. Диагностика наследственных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2.

Стратегия подбора мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 для анализа на бночнпе. Конструирование и принцип работы РМЖ-биочипа. На данный момент описано свыше 1400 различных наследственных мутаций в гене BRCA1 и 1200 мутаций в гене BRCA2 (Breast Cancer Information Core - BIC date base online http //www nhgn nih gov/) Для каждой популяции имеется свой спектр и частота мутаций BRCA1/2 генов Существуют мутации, свойственные только определенным этническим группам В частности, в популяции евреев Ашкенази найдены две преобладающие мутации в гене BRCA1 - 185delAG и 5382insC, и мутация 6174delT в гене BRCA2, встречающиеся с суммарной частотой примерно 2,6% в общей популяции (Roa В В el al, 1996)

Основываясь на данных о спектре мутаций BRCA1/2 и СНЕК2 генов в популяциях сопредельных и этнически близких стран (Латвии, Литвы, Польши, Белоруссии), а также исследований, проведенных в России, мы выбрали семь наиболее частых мутаций в данных генах (185delAG, 300T>G, 4153delA, и 5382msC в гене BRCA1, 695insT и 6174delT в гене BRCA2, llOOdeiC в гене СНЕК2) и полиморфизм 4158A>G в гене BRCA1 для дальнейшего их анализа на биочипе Было доказано, что эти мутации (за исключением полиморфизма 4158A>G) приводят к частичной или полной потере активности белковых продуктов данных генов, участвующих в транскрипции, репарации ДНК, регуляции клеточного цикла, апоптозе и поддержании целостности генома

1 2 3 4 5 6 7 8

185АО зоот 4153А 4158А 5382С 695А 6174Т 1100С

185АО зоот 4153А 4158А 5382С 695А 6174Т ИООС

,.41.534е1А' 4Ш# :"382ое1С I 10Ме1(:

«вшвШжЯ | ИМЙА 4158« 53«2с1е1С 695н«Т ДШЙС:

ш 1,20 л Ё

¡5 5 1,00

о 0,90

£ 1 0.80

£ щ 0,60

е Я о,5о

Е ш 0,40

^ Й- 0,30

§. 0,20

£ 0,10 0,00

1,30 _________________________________________, И ДИКИЙ тип

И мутация

Рис. 5. (а) - схема расположения олигонуклеотидных проб на РМЖ--биочипе. Примеры гибридизационных картин (левый ряд), полученных для образца ДНК, не содержащего исследуемых мутаций (б), и несущих исследуемые мутации: 5382шбС в гене ВЯСА1 (в), 1100<Зе1С в гене СНЕК2 (г), а также диаграммы усредненных значений относительных интенсивностей флуоресценции с ячеек биочипа (правый ряд).

Потеря белками их функций приводит к нарушениям клеточных процессов и, как следствие, к возникновению опухоли

Схема расположения олигонуклеотидных проб на РМЖ-биочипе показана на рис 5(а) При разработке схемы РМЖ-биочипа применяли подход, аналогичный таковому в отношении ТПМТ-биочипа

Для определения точности метода было протестировано 37 контрольных образцов ДНК с известным генотипом. Результаты гибридизации на биочипе полностью совпали с данными, полученными другими методами (ББСР и прямое секвенирование)

Контрольных образцов с мутациями в гене ВЯСА2 не было в наличии, однако при тестировании пациентов эти варианты мутаций были обнаружены с помощью анализа на РМЖ-биочипе Полученные нами данные были подтверждены секвенированием

Порог чувствительности метода был определен методом последовательных разведений Показано, что минимальным количеством ДНК, необходимым для однозначной идентификации мутаций, является 100 геном-эквивалентов

На рис (рис 5(б-г)) приведены примеры гибридизационных картин для образцов с различньми генотипами

Анализ частоты мутаций в генах ВЯСА1/2 и СНЕК2 у больных РМЖ. РЯ и ПМЗН. Из 385 пациентов с диагнозом РМЖ у 17 пациентов (4,4%) были обнаружены мутации в гене ВЯСА1, у пяти (1,3%) - полиморфизм 4158А>0, у двух пациентов (0,5%) - мутации в гене ВЯСА2 и у пяти (1,3%) - мутация 1100(1е1С в гене СНЕК2 Из 68 больных РЯ у восьми (11,8%) были обнаружены мутации в гене ВИСА1, исследуемых мутаций в гене В КС А 2 и мутации 1100ёе1С в гене СНЕК2 обнаружено не было В группе пациентов с диагнозом ПМЗН у 11 пациентов (33,3%) были обнаружены мутации в гене В КС А1, и у двух пациентов (6,1%) была обнаружена мутация 1100сЗе1С в гене СНЕК2, исследуемых мутаций в гене ВЯСА2 найдено не было Частоты каждой конкретной мутации в трех группах пациентов показаны на рис 6

Наибольшая частота четырех исследуемых мутаций в гене ВЯСА1 (185с1е1АО, 300Т>С, 4153<1е1А, и 53821шС) найдена у больных ПМЗН с поражением МЖ и яичников При этом в группе больных ПМЗН из 11 пациентов-носителей мутаций в гене ВЯСА1 у восьми (72,7%) был сочетанный РМЖ и РЯ (у одного пациента была найдена мутация 185с1е1АО, у двух пациентов -300Т>6, у одного пациента - 4153с1е1А и у четырех пациентов - 5382тьС) Это позволяет сделать вывод о том, что наличие у пациента ПМЗН с поражением МЖ и/или яичников (и в особенности, сочетание РМЖ и РЯ) является маркером наличия у него мутаций в гене ВЯСА1 и, следовательно, наследственной формы злокачественных новообразований Полиморфизм 4158А>0 в гене ВКСА1 был обнаружен при изучении больных с диагнозом РМЖ и РЯ в Латвии (Т1с1ют1гоуа Ь а!, 2005) Его роль в возникновении опухоли еще до конца не выяснена В нашем исследовании данный полиморфизм был обнаружен только в выборке пациентов с диагнозом РМЖ у пяти человек (1,3%) Для выяснения

роли этого полиморфизма в развитии РМЖ требуется расширенное исследование популяции

30 i

25 -

г? 20

15

10

185<feIAG 300T>G (BRCA1) (BRCA1)

4153de!A (BRCA 1)

4158A>G (BRCA1)

5382msC (BRCA1)

695msT (BRCA2)

$174delT (BRCA2)

□ пациенты e диагнозом РМЖ (n=385) в пациенты с диагнозом РЯ (п-68) a пациенты с диагнозом ПМЗН (п=33)

0,3 1,5 3

0,3 0

9,1

0,6 0 3

1,3 0 0

3,4 10,3 18,2

0,3 О 0

0,3 0 0

1,3 0 6,1

Рис. 6. Частоты мутаций в генах BRCA 1/2 и СНЕК2 у больных РМЖ, РЯ и ПМЗН (с поражением МЖ и яичников)

Наиболее часто встречающейся мутацией в гене BRCA1 во всех трех группах пациентов была мутация 5382insC (доля от всех остальных изучаемых нами мутаций в гене BRCA1 составляла 56, 87 и 55% соответственно) (рис. 7), На рис. 8 показаны частоты данной мутации в Европейской части России и в других странах у больных РМЖ (смешанные по возрасту и семейной истории заболевания выборки) и в контрольной группе здоровых доноров Таким образом, в Европейской части России у больных РМЖ данная мутация встречается чаще, чем в других популяциях (Gorski В et al, 2005, Warner Е et al, 1999, Van der Loojj M et al, 2000, Backe J et al, 1999), при этом ее частота в общей популяции, по-видимому, крайне низка В частности, в недавно проведенном исследовании российских ученых ее частота была равна нулю (Sokolenko АР et al, 200 <о ), в отличие от значений ее частот в других популяциях (от 0,15 до 0,35%) (Roa В В et al, 1996, Gorski В et al, 2005, Van der Looij M et al, 2000) Исходя из того, что мутация 5382msC в гене BRCA1 является мажорной у всех трех групп пациентов, она в первую очередь должна быть включена в реестр генетического тестирования

Мутация 695insT в гене BRCA2 была впервые обнаружена в России (Теге-schenko IV et al, 2002) у пациентки с диагнозом РМЖ в возрасте 42 лет, у которой не прослеживалась семейная история заболевания В нашей работе дан-

ная мутация тоже была найдена только у одной пациентки (0,3%) с диагнозом РМЖ в возрасте 23 лет (к сожалению, мы не обладаем информацией о ее семейной истории), в двух других группах пациентов мутация не была обнаруже-

185с1е1АС

5% 300Т>в 5%

5382геС 56%

185с!е1АС

13%

4153с1е1А 10%

5382тзС 55%

5382теС 87%

4153с1е1А 9%

Рис. 7. Доля каждой мутации в гене ВЯСА1 от всех исследуемых мутаций в группах больных РМЖ (а), РЯ (б) и ПМЗН (в).

о

(Л

с ?5

1" 0.02

0

Россия Польша евреи Венгрия Германия Ашкенази

Рис.8. Частота мутации 5382шбС в гене ВЯСА1 в различных популяциях (в смешанной выборке больных РМЖ и в контрольной группе здоровых доноров), где п -количество человек в выборке; звездочкой (*) обозначены данные настоящего исследования.

Мутация 6174с1е1Т в гене ВЯСА2 впервые была обнаружена в популяции евреев Ашкенази (АЬеПоуюЬ О. еГ а!., 1997). В нашем исследовании эта мутация

была найдена у одной пациентки (0,3%) с диагнозом РМЖ, в двух других группах пациентов данная мутация не была выявлена В другом исследовании российских ученых она также была обнаружена с той же частотой в группе больных РМЖ (Sokolenko et al, 2007 )

Ранее была отмечена взаимосвязь мутации 1 lOOdelC с развитием РМЖ (у носителей данной мутации риск возникновения РМЖ в два раза выше) (Meyers-Heijboer Н et al, 2002) В нашем исследовании эта мутация была обнаружена у пяти пациентов (1,3%) с диагнозом РМЖ В другом исследовании российских ученых ее частота в смешанной выборке пациентов с диагнозом РМЖ примерно в 2 раза превышала найденную нами (2,1%) (Chekmareva Е V et al, 2006) В группе больных РЯ данный генетический вариант не был обнаружен В группе с ПМЗН эта мутация была найдена только у двух больных (6,1%) метахронным РМЖ и РТК Данные об ассоциации этой мутации с развитием ПМЗН с поражением МЖ и толстой кишки на данный момент остаются противоречивыми Так, при изучении семей с наследственным РМЖ в Дании, было обнаружено, что мутация 1 lOOdelC чаще встречается в семьях, где помимо РМЖ, есть случаи заболевания РТК Другие исследователи предположили, что эта мутация вместе с неизвестными пока генами предрасположенности обуславливает развитие наследственного РМЖ и РТК (Meyers-Heyboer Н et al, 2002) Однако при изучении семей с РМЖ и/или РТК в Финляндии достоверных ассоциаций выявлено не было (Kilpivaara et al, 2003) Другое исследование также не доказало связи данной мутации с развитием метахронного РМЖ и РТК (Ismger A et al, 2006) Поэтому для подтверждения роли мутации 11 OOdelC в развитии ПМЗН с поражением МЖ и толстой кишки у российских пациентов необходимы расширенные исследования

Взаимосвязь наличия мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 и возраста начала заболевания. Было проведено сравнение среднего возраста начала заболевания у пациентов-носителей мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2, и пациентов, у которых исследуемые мутации не были обнаружены (табл 1) Статистически значимые расхождения в среднем возрасте для пациентов без мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 и пациентов-носителей мутаций были найдены для больных РМЖ и ПМЗН (р = 0,0006 и 0,0003, соответственно)

У большинства больных РМЖ и ПМЗН носителей мутаций в гене BRCA1 заболевание возникло в возрасте до 40 лет включительно (53% и 64% соответственно), большинство пациентов с диагнозом РЯ заболели в возрасте от 40 до 50 лет (рис. 9) Это согласуется с данными других исследований, где показано, что ранний возраст манифестации заболевания является характерным признаком наследственной формы (Nomizu Т etal, 1997)

Табл.1, Сравнение среднего возраста пациентов-носителей мутаций в генах ВЯСА1/2 и СНЕК2 и пациентов, у которых исследуемые мутации обнаружены не были.

Пациенты Средний возраст, лет

РМЖ РЯ ПМЗН

Носители мутаций 44,9±13,2 48,3±10,0 41,6±4,9

Без мутаций 53,7±11,8 56,1±10,9 55,1±12,7

Р 0,0006 0,0518 0,0003

О 20 40 60 80 100

Доля пациентов-носителей мутаций в гене 8RCA1. %

Рис. 9. Доля пациентов-носителей мутаций в гене BRCA1 у больных РМЖ, РЯ и ПМЗН для различных возрастных групп (без полиморфизма 4l58A>G в гене BRCA1).

Мутации в гене BRCA2 были обнаружены у двух пациентов с диагнозом РМЖ, возраст которых был соответственно 24 года и 59 лет. У большинства носителей мутации HOOdelC в гене СНЕК2 (57%) возраст манифестации заболевания находился в диапазоне от 41 до 50 лет. При этом пик заболеваемости спорадическим РМЖ и РЯ у женщин приходится на 60 лет (Ferlay J. et al., 2006).

Взаимосвязь наличия мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 и семейной истории заболевания. После определения частоты мутаций в исследуемых выборках, женщины-носители мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 были приглашены на консультацию к клиническому генетику в РОНЦ им. В.В.Блохина.

Из всех 38 пациентов-носителей мутаций в генах BRCA1/2 семейный анамнез был доступен только для 28 человек У оставшейся части пациентов по тем или иным причинам (в частности, недоступность информации о настоящем месте жительства пациента) информация о семейном анамнезе отсутствовала

В результате у 26 (93%) из 28 носителей мутаций в генах BRCA1/2 был выявлен онкологически отягощенный семейный анамнез (один или более родственников первой степени родства имеет РМЖ и/или РЯ или другую локализацию опухоли в анамнезе) У остальных двух (7%) семейная история заболевания отсутствовала Это можно объяснить неполной пенетрантностью мутаций в гене BRCA1, наличие которых обуславливает от 60 до 80% риска возникновения РМЖ до 70 лет (Ford D etal, 1994) Только одна пациентка (14%) из семи носителей мутации HOOdelC в гене СНЕК2 была из онкологически отягощенной семьи (у матери пациентки был выявлен РМЖ), у остальных шести (86%) -онкологически отягощенный анамнез выявлен не был Таким образом, это подтверждает ранее полученные данные о низкой пенетрантности мутации 1 lOOdelC в гене СНЕК2 по отношению к развитию РМЖ

Пример онкологически отягощенной семьи, где у пробанда с помощью анализа на биочипах было установлено наличие мутации 5382msC в гене BRCA1, показан на рис 10

Рис. 10. Родословная пациента С

Таким образом, доля мутаций в генах BRCAl/2 и СНЕК2, ассоциированных с наследственными формами РМЖ, РЯ и ПМЗН, у пациентов, жителей Европейской части России, достаточно велика в общей структуре заболевания Это делает обоснованным применение методов молекулярно-генетического скрининга в клинической практике При этом особое внимание следует уделять

пациентам с ПМЗН, поскольку по нашим данным у этих больных наблюдалась самая высокая частота мутаций в гене ВКСА1 Также важными факторами являются манифестация заболевания в раннем возрасте (до 40 лет) и отягощенный семейный анамнез Наличие одного или более вышеперечисленных признаков наследственного заболевания могут быть решающими факторами для назначения пациенту генетического тестирования

Область применения. Разработанные подходы молекулярно-генетической диагностики ТПМТ-недостаточности и выявления наследственных форм РМЖ и РЛ и проведенные в настоящей работе исследования в перспективе позволят создать унифицированную систему для выявления среди населения лиц с непереносимостью лекарственных препаратов и/или высоким риском развития рака Последующий мониторинг «групп риска» будет направлен на индивидуализацию терапии и корректировку дозы лекарства, как в случае анализа гена ТПМТ, или на раннюю диагностику и профилактическое лекарственное и хирургическое лечение онкозаболеваний, как при исследовании генов ВЕСА 1/2 и СНЕК2

ВЫВОДЫ

1 Разработан метод диагностики шести точечных полиморфных вариантов в ТПМТ гене человека (G238C, G292T, G460A, G644A, T681G, A719G) на основании технологии олигонуклеотидных биочипов

2 Определены частоты аллельных вариантов гена ТПМТ у жителей Европейской части России Самым частым полиморфным алле-лем, ассоциированным с ТПМТ-недостаточностью, является ТПМТ*ЗА (85,7%), что согласуется с результатами, полученными для популяций Европы и белого населения Америки

3 Разработан метод диагностики семи точечных мутаций в BRCA1/2 и СНЕК2 генах человека (185delAG, 300T>G, 4153delA, и 5382insC в гене BRCA1, 695mcT и 6174delT в гене BRCA2, 1 lOOdelC в гене СНЕК2) и полиморфизма 4158A>G в гене BRCA1

4 Определены частоты данных мутаций у пациентов, жителей Европейской части России, с диагнозом РМЖ, РЯ и ПМЗН с поражением МЖ и яичников Показано, что наиболее распространенной является мутация 5382insC в гене BRCA1, что согласуется с ранее проведенными исследованиями

5 Разработанные методы диагностики полиморфизма гена ТПМТ и наследственных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 могут быть предложены для проведения популяционных исследований и для использования в клинической практике

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1 Чупова Н В , Самочатова Е В , Руднева А Е , Солопова Г. Г, Наседкина Т В , Федорова О. Е , Глотов А С , Землякова В В, Крынецкий Е Ю, Крынецкая Н Ф., Рибейро Р К, Эванс В Э , Румянцев А Г Генетический полиморфизм тиопурин-Б-метилтрансферазы в лечении детей с острым лимфоб-ластным лейкозом Гематология и трансфузиология, 2005 г, Т 50, №6, стр 3-9

2 Федорова О. Е., Синицка О Н, Тихомирова Л П, Вишневская Я В., Заседателев А С , Наседкина Т В Анализ точечных мутаций в гене BRCA1 методом гибридизации с гидрогелевыми микрочипами Молекулярная Биология, 2006, Т 40, №1, стр 1-6

3 Nasedkina Т V, Fedorova О.Е., Glotov A S , Chupova N V, Samochatova Е V , Maiorova О А, Zemlyakova V V, Roudneva А Е., Chudinov А V, Yurasov R А , Kozhekbaeva J M, Barsky V E, Krynetski E.Y, Krynetskaya N F , Cheng Cheng, Ribeiro R С , Evans W E, Roumyantsev A G, Zasedatelev A S Rapid geno-typing of common deficient thiopurine-S-methyltransferase (ТРМГ) alleles using the DNA-microchip technique European Journal Human Genetics, 2006, V 14, N 9, p 991-998

4. Федорова О. E., Любченко Л H, Паяниди Ю Г, Казубская Т П, Амо-сенко Ф А, Гаръкавцева Р Ф, Заседателев А. С, Наседкина Т. В Анализ распространенных мутаций в генах BRCA]/2 и СНЕК2 в российской популяции с использованием биочипов у больных органоспецифическим раком яичников и первично-множественными злокачественными новообразованиями с поражением яичников Молекулярная Биология, 2007, Т 41, №1, стр 1-7

5 Наседкина Т В , Гусева Н А, Митяева О Н., Гра О А , Федорова О.Е., Кожекбаева Ж.М, Глотов А.С , Паньков С В , Юрасов Р А, Чудинов А В , Заседателев А С Микрочипы в диагностике лимфопролиферативных заболеваний Молекулярная медицина, 2007, № 3, стр 54-60

Тезисы

1 Наседкина Т В , Жаринов В С, Исаева Е А., Митяева О Н, Федорова О.Е., Глотов А С., Мирзабеков А Д Молекулярно-генетический анализ онкологических заболеваний с использованием технологии биочипов //Материалы III симпозиума «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей», Москва, 6-7 февраля, 2002 г Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. Т 1 №2 Стр 83

2 Nasedkina T.V, Fedorova О.Е., Simcka О N, Tihomirova L P, Mirzabekov AD Analysis of mutations in the BRCA1 gene using gel-based microarrays// The Breast Cancer Linkage Consortium (BCLC) and International Collaborative Group on Familial Breast and Ovarian Cancer (ICG-FBOC) 14th General Meeting, Spam, Madrid, June 1Я-4Ш 2003 P 150

3 Fedorova O.E., Glotov A S , Krynetski E Y , Krynetskaya N F , Chupova N V, Nasedkma T V & Mirzabekov A D Analysis of mutations in Human Thio-purine-S-methyltransferase gene by hybridization with oligonucleotide microchips// Conference for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics, Kyiv, Ukraine, September 25-27,2003 P 240

4 Nasedkma T V, Zarinov V S , Isaeva E A, Fedorova O.E., Glotov A S , Mityeva О N, О Simcka, L Tihomirova Applications of gel-based microarrays for genodiagnostics of cancer //Eur J Hum Genetics -2003-V 11-Suppl 1-P 80

5 Федорова O.E , Глотов А С , Крынецкий E Ю , Крынецкая H Ф , Чу-пова Н В , Наседкина Т В Анализ точечных мутаций в гене тиопурин-S-метилтрансферазы (ТПМТ) человека с использованием технологии биочипов// 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука 21-го века», Пущино, 14-18 апреля 2003 г, Стр 134-135

6. Fedorova О.Е., Yakubovskay MG, Nasedkma TV Analysis of BRCA1 gene mutation in breast cancer patients in Moscow Region of Russia usmg biochips // Eur J Hum Genetics -2004-V 12-P 179

7 Nasedkma T V, Fedorova O.E., Glotov A S , Samochatova E V, Chupova N V, Barsky V E, Zasedatelev A S //Genetic polymorphism studies in Russian population using biochips //Eur J Hum Genetics -2004-V 12-Suppl -P 331

8 Fedorova O.E., Nasedkma T V , Zasedatelev A S Diagnostic biochip for analysis of mutations in BRCA1, BRCA2 and CHEK2 genes//Annals of Oncology-2005-V 16-P 272

9 Nasedkma T V, Fedorova O.E., Glotov A S , Samochatova E V, Chupova N V , Roudneva A E , Zemlyakova V V , Kozhekbaeva J M, Krynetski E Y, Krynetskaya N F, Ribeiro R С , Evans W E, Roumyantsev A G., Zasedatelev A S Rapid TPMT-genotypmg for clinical applications using the DNA-biochips // Eur J Hum Genetics-2005-V 12-P 249

10 Fedorova O.E., Lyubchenko LN, Amosenko FA, Portnoi SM, Garkavtseva R F, Zasedatelev A S, Nasedkma T V Mutation screening of В RCA 1/2 and CHEK2 in 480 unselected breast cancer patients from Russia // Eur J Hum Genet-2006-V 14-P 209

11. Кожекбаева Ж M, Глотов А С, Гра О А, Федорова О.Е , Самочатова Е В , Заседателев А С, Наседкина Т В Определение частот генотипов ТРМТ гена в российской популяции с применением биочипов //Международная конференция «Генетика в России и в мире» 28 июня - 2 июля 2006 г (Москва) Стр 91

12 Fedorova О.Е., Lyubchenko LN, Amosenko FA, Portnoi SM, Garkavtseva RF, Zasedatelev AS, Nasedkma TV Analysis of BRCA1/2 and CHEK2 mutations in breast cancer patients from Russia usmg oligonucleotide biochips// Human Genome Meeting (Helsinki, Finland, May 31st-June 3rd 2006) P 93

Подписано в печать 24 03 2008 Печать трафаретная

Заказ № 193 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495)975-78-56, (499)788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Громыко, Ольга Евгеньевна

Список использованных сокращений.

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

Раздел 1. Полиморфизм тиопурин-8-метилтрансферазы (ТПМТ).

1.1. Метаболизм тиопуриновых препаратов в организме человека.

1.2. Фермент ТПМТ, его основные свойства и функции в клетке.

1.3. Генетический полиморфизм гена ТПМГчеловека.

1.3.1. Структура и функции гена ТПМГ.

1.3.2. Полиморфные аллели гена ТПМТ.

Раздел 2. Мутации в генах ВЯСА1/2 и СНЕК2 и наследственный РМЖ иг

2.1. Эпидемиология РМЖ и РЯ.

2.1.1. Заболеваемость и смертность от РМЖ и РЯ в мире.

2.1.2. Факторы риска развития РМЖ и РЯ.

2.2. Наследственные синдромы предрасположенности к РМЖ и РЯ.

2.3. Гены предрасположенности к РМЖ и РЯ.

2.3.1. Высоко- и низкопенетрантные гены предрасположенности к

РМЖ и РЯ.

2.3.2. Гены ВЯСА1 и ВЯСА2, их структура и функции их белковых продуктов.

2.3.3. Ген СНЕК2, его структура и функции белкового продукта.

2.4. ВЯСА1, ВЯСА2 и СНЕК2 мутации.

2.4.1. Основные типы мутаций в генах ВЯСА1, ВЯСА2 и СНЕК2 ассоциированные с риском развития РМЖ и РЯ.

2.4.2. Спектр и частота мутаций ВЯСА1, ВЯСА2 и СНЕК2 генов в различных популяциях мира.

2.4.3. Риск развития РМЖ и РЯ для носителей мутаций в генах ВЯСА1, ВЯСА2 и СНЕК2.

2.4.4. Молекулярно-патологические особенности ВЯСА-ассоциированных опухолей МЖ и яичников.

2.4.5. Основные подходы к профилактике онкозаболеваний для носителей ВВ.СА1, ВЯСА2 и СНЕК2 мутаций.

Раздел 3. Молекулярно-генетические методы диагностики мутаций в генах человека.

3.1. Основные молекулярно-генетические методы, применяемые для диагностики мутаций в генах ВЯСА1/2 и СНЕК2.

3.2. ДНК-биочипы: история создания, типы, применение.

3.2.1 История создания и основные типы ДНК-биочипов, применяемых в настоящее время.

3.2.2. ДНК-биочипы на основе трехмерных ячеек геля и их основные

Введение Диссертация по биологии, на тему "Диагностика полиморфизма гена ТПМТ и наследственных мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2"

В настоящее время молекулярно-генетический анализ находит все более широкое применение в клинической диагностике. Помимо выявления мутаций, приводящих к развитию врожденных наследственных заболеваний, актуальным становится анализ полиморфизма генома человека.

Полиморфные участки в геноме человека, представляющие собой точечные мутации (замена одного нуклеотида, небольшие делеции и вставки) определяют биохимическую индивидуальность человека, а также индивидуальную реакцию на воздействие факторов внешней среды, действие различных ксенобиотиков, в том числе и лекарственных препаратов. В частности, полиморфные аллели часто обеспечивают формирование функционально неполноценных белков, что приводит к снижению или отсутствию их активности. Если данные белки участвуют в метаболизме лекарственных препаратов, это в свою очередь может быть причиной появления симптомов передозировки или токсического действия назначаемых препаратов. Одним из ярких примеров тому — наследственная недостаточность фермента тиопурин-Б-метилтрансферазы (ТПМТ), обусловленная инактивирующими точечными мутациями в гене ТПМГ. Недостаточность данного фермента приводит к непереносимости противоопухолевых и иммуносупрессорных лекарственных препаратов тиопуринового ряда.

Кроме этого, полиморфные варианты генов определяют предрасположенность к различным мультифакториальным заболеваниям, например, онкологическим. В этом смысле, одной из хорошо изученных моделей таких ассоциаций является, связь мутаций- в высокопенентрантных генах-супрессорах BRCA1 и BRCA2 с развитием наследственного рака молочной железы (РМЖ) и рака яичников (РЯ). Ранее проведенные исследования показали, что из всех случаев возникновения РМЖ и РЯ от 5 до 10% являются наследственными, 85% из которых обусловлены мутациями в генах BRCA1 и BRCA2. Низкопенентрантные гены, такие как PTEN, Р53, ATM,

СНЕК2, FANC, NBS1 и др. в 1-15% случаев отвечают за развитие индивидуальной и семейной синдромальной патологии.

Идентификация полиморфных вариантов и мутаций в генах человека является на сегодняшний момент актуальной проблемой генодиагностики, и одним из эффективных подходов в данном направлении — создание точного и быстрого метода диагностики. В частности, определение полиморфизма гена ТПМТ позволит в дальнейшем прогнозировать риск развития осложнений при лечении тиопуринами у лиц с полиморфизмами гена ТПМТ, а также подбирать индивидуальную схему терапии данными препаратами не только в онкогематологии, но и при трансплантации органов, и при лечении различных аутоиммунных заболеваний. Выявление носителей мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 поможет разработать наиболее эффективную стратегию лечения уже имеющегося онкозаболевания и профилактику других злокачественных новообразований.

Для анализа точечных полиморфизмов и мутаций в генах человека в ИМБ РАН им. В.А.Энгельгардта разработан метод, сочетающий мультиплексную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и гибридизацию с олигонуклеотидными биочипами. Данный метод достаточно прост и хорошо воспроизводим, что позволяет проводить анализ не только в научных лабораториях, но и в медицинских учреждениях.

И та, и другая модель уже являются объектами генетического тестирования в странах Западной Европы и Америке. Поскольку, ранее полиморфизм гена ТПМТ в России не изучался, в настоящей работе с помощью разработанного ТПМТ-биочипа было проведено широкомасштабное исследование частоты аллелей данного гена в популяции Европейской части России. Что касается выявления наследственных форм РМЖ и РЯ, ассоциированных с мутациями в генах BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 у российских пациентов, то ранее был проведен ряд исследований на небольших выборках (40-300 чел). В основном, это были пациенты с отягощенным семейным анамнезом и другими признаками наследственного опухолевого фенотипа (ранний возраст манифестации заболевания, двухстороннее поражение парных органов и т.д.). Исследования, проведенные на выборках пациентов с диагнозом РМЖ смешанных по возрасту и семейной истории заболевания, были посвящены анализу частоты только двух мутаций — 5382тБС в гене ВЯСА1 и 110(Ме1С в гене СНЕК2. Это вызывает необходимость проведения дополнительного исследования частоты различных мутаций в генах ВЯСА1/2 и СНЕК2 у российских пациентов с диагнозом РМЖ и РЯ в смешанной по возрасту и семейной истории заболевания выборке для выявления доли наследственных форм в общей-структуре заболеваемости.

Целью работы является разработка методов диагностики полиморфизма гена ТПМТ, связанного с недостаточностью фермента ТПМТ, и мутаций в генах ВЯСА1/2 и СНЕК2, ассоциированных с наследственными формами РМЖ и РЯ, с использованием технологии олигонуклеотидных биочипов.

В соответствии с поставленной целью предполагалось решить следующие основные задачи:

1. Разработать метод аллель-специфичной гибридизации на биочипе для анализа шести наиболее распространенных в мировых популяциях точечных полиморфных вариантов в гене ТПМТ (0238С, С292Т, С460А, в644А, Т68Ю, А7190).

2. Определить частоты генотипов и аллелей гена ТПМТ у детей с гемобластозами и здоровых доноров, жителей Европейской части России, используя разработанный ТПМТ-биочип, и сравнить их с таковыми в популяциях других стран.

3. Разработать метод аллель-специфичной гибридизации на биочипе для анализа семи наиболее распространенных в популяциях Восточной Европы точечных мутаций в генах ВЯСА1/2 и СНЕК2 (185ёе1АО, 300Т>С, 4153ёе1А и 5382тБС в гене ВЯСА1, 695тзТ и 6174с1е1Т в гене ВЯСА2, мутация 1100с1е1С в гене СНЕК2) и полиморфизма 4158А>С в гене ВЯСА1.

4. Провести исследование частот этих мутаций и полиморфизма 4158А>0 в смешанной по возрасту и семейной истории заболевания выборке пациентов, жителей Европейской части России, с диагнозом РМЖ, РЯ и ПМЗН и определить долю наследственных форм рака в общей структуре заболеваемости.

5. Провести сравнение частоты наиболее распространенных мутаций в генах ВЯСА1/2 и СНЕК2 у жителей Европейской части России и стран Европы.

6. Проанализировать семейный анамнез пациентов—носителей мутаций в генах ВЯСА1/2 и СНЕК2.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 310 источников. Работа изложена на 168 страницах машинописного текста, содержит 33 рисунка и 12 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Громыко, Ольга Евгеньевна

129 Выводы

1. Разработан метод диагностики шести точечных полиморфных вариантов в ТПМТ гене человека (С238С, С292Т, 0460А, С644А, Т68Ш, А719С) на основании технологии олигонуклеотидных биочипов.

2. Определены частоты аллельных вариантов гена ТПМТ у жителей Европейской части России. Самым частым полиморфным аллелем, ассоциированным с ТПМТ-недостаточностью, является ТПМГ*ЗА (85,7%), что согласуется с результатами, полученными для популяций Европы и белого населения Америки.

3. Разработан метод диагностики семи точечных мутаций в ВЯСА1/2 и СНЕК2 генах человека (185ёе1АО, 300Т>С, 4153ёе1А, и 53821пбС в гене ВКСА1, 695тсТ и 6174с1е1Т в гене ВЯСА2, 1100с1е1С в гене СНЕК2) и полиморфизма 4158А>0 в гене ВЯСА1.

4. Определены частоты данных мутаций у пациентов, жителей Европейской части России, с диагнозом РМЖ, РЯ и ПМЗН с поражением МЖ и яичников. Показано, что наиболее распространенной является мутация 5382тзС в гене ВЯСА1, что согласуется с ранее проведенными исследованиями.

5. Разработанные методы диагностики полиморфизма гена ТПМТ и наследственных мутаций в генах ВЯСА1/2 и СНЕК2 могут быть предложены для проведения популяционных исследований и для использования в клинической практике.

Заключение

Сейчас все более- широкое распространение в медицине приобретает индивидуальный подход к пациенту с учетом его фармакогенетического статуса. К молекулярно-генетическим методам, обеспечивающим реализацию программы персонализированной медицины, относится диагностика полиморфных вариантов и мутаций в генах, ассоциированных с непереносимостью различных ксенобиотиков, в т. ч., лекарственных средств, а также ассоциированных с предрасположенностью- к тому или иному заболеванию. Такие тесты могут предоставить важную информацию о состоянии пациента, в том числе о восприимчивости к заболеванию, а также наиболее вероятных реакциях на лекарственные средства. По результатам таких тестов; в силу их прогностических возможностей; можно планировать наиболее эффективные профилактические вмешательства. Более того, так как многие тесты предназначены для' выявления- наследуемых генетических параметров, их результаты, могут иметь значение не только для, самого пациента, но и для его близких родственников. Поэтому разработка быстрого, точного, недорогого и простого в использовании метода генетического анализа олигонуклеотидных полиморфизмов и мутаций в генах человека - это одна из важных задач для ее развития.

Разработанные нами методы идентификации точечных полиморфных вариантов и мутаций в генах ТПМТ, ВКСА1/2 и СНЕК2 с использованием технологии олигонуклеотидных биочипов отвечают этим требованиям. ТПМТ-и РМЖ-биочипы позволяют быстро и с высокой степенью достоверности диагностировать »точечные полиморфные варианты, и мутации в исследуемых генах. Следовательно, данные тест-системы можно с успехом применять в клинической практике и для проведения широкомасштабных исследований популяции с целью-выявления среди населения лиц-носителей тех или иных полиморфных аллелей и мутаций. В частности, это позволит в дальнейшем прогнозировать риск развития осложнений при лечении тиопуринами лиц с полиморфными вариантами гена ТПМТ, приводящими к дефициту фермента, а также подбирать индивидуальную схему терапии данными препаратами в онкогематологии, при трансплантации органов и при лечении различных аутоиммунных заболеваний. Выявление носителей мутаций в генах ВЯСА1/2 и СНЕК2 поможет разработать наиболее эффективную стратегию лечения уже имеющегося онкозаболевания и профилактику других злокачественных новообразований. У здоровых носителей это позволит подобрать тактику проведения клинического мониторинга за состоянием здоровья и профилактику онкозаболеваний, которая может заключаться в проведении профилактических осмотров не реже двух раз в год, профилактических хирургических вмешательствах и химиопрофилактике.

ТПМТ-биочип был включен в качестве составной части в тест-систему ПФ-биочип, предназначенную для выявления генетической предрасположенности к некоторым онкологическим заболеваниям и определения индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам (регистрационное удостоверение № ФС 01262006/5317-06 от 28 декабря 2006

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Громыко, Ольга Евгеньевна, Москва

1. Ahn J., Urist M., Prives C. The Chk2 protein kinase.//DNA Repair (Amst).-2004.-V.3—N.8-9. P.l039-47.

2. Albano W.A., Recabaren J.A., Lynch H.T., Campbell A.S., Mailliard J.A., Organ C.H., Lynch J.F., Kimberling W.J. Natural history of hereditary cancer of the breast and colon.//Cancer.- 1982.-V. 50.-N.2.-P.360-363.

3. Alves S., Amorim A., Ferreira F., Prata M.J. Influence of the variable number, of tandem repeats located in the promoter region of the thiopurine methyltransferase gene on enzymatic activity .//Clin Pharmacol Ther.-2000.-V.70.-N2.-P. 165-174.

4. Amos C.I., Struewing J.P. Genetic epidemiology of epithelial ovarian cancer.//Cancer.-1993.-V.71.-N.2.-P.566-572.

5. Andersen T.I., B?rresen A.L., M?ller P. A common BRCA1 mutation in Norwegian breast and ovarian cancer families.//Am J Hum Genet.-1996.- V.59.-N.2.-P.486-487.

6. Baglioni S., Genuardi M. Simple and complex genetics of colorectal cancer susceptibility.//Am J Med Genet С Semin Med Genet.-2004.- V.129.-N.1.-P.35-43.

7. Bartek J1., Falck J., Lukas J. CHK2 kinase~a busy messenger.//Nat Rev Mol Cell Biol. -2001.- V.2.-N.12.-P. 877-886.

8. Bartek J., Lukas J. Chkl and Chk2 kinases in checkpoint control and cancer.//Cancer Cell.- 2003.-V.3.-N.5.-P.421-429.

9. Baysal B.E., DeLoia j:A., Willett-Brozick J.E., Goodman M.T., Brady M'.F., Modugno F., Lynch H.T., Conley Y.P., Watson P., Gallion H.H. Analysis of CHEK2 gene for ovarian cancer susceptibility.//Gynecol 0ncol.-2004.- V.95.-N.1.-P.62-69.

10. Berney H., West J., Heefele E., Alderman J, Lane W.A., Collins JK.A DNA diagnostic biosensor:development, characterization and performance.//Sensors and Actuators B.-2000.-V.68.- N1.- P.IOO.

11. Boson' W.L., Romano-Silva M.A., Correa H., Falcao R.P., Teixeira-Vidigal P.V., De Marco L. Thiopurine mcthyltransferase polymorphisms in a Brazilian population.//PKarmacogenomics J.-2003.-V.3:-N.3.-P.178-182.

12. Bostrom B., Erdmann G. Cellular pharmacology of 6-mercaptopurine in acutc lymphoblastic leukemia^//Am JiPediatr Hematol.0ncol;-1993;-V.15.-N;l.-P:80-86.

13. Breast Canccr Information Core BIC date base online (http://www.nhgri.nih.gov/)

14. Brockmoller J., Tzvetkov M.V.Pharmacogenetics: data, concepts and tools to; improve drug discovery and drug treatment//Eur J Clin? Pharmacol.-2008.-V.64.-N.2.-P.133-157.

15. Brose M.S., Rebbcck T.R., Calzone K.A., Stopfer J.E., Nathanson K.E., Weber B.E. Cancer risk estimates for BRCA1 mutation carriers identified in a risk evaluation program.//J Natl Cancer Inst.-2002.-V.94.-N. 18.-P.1365-1372.

16. Calderon-Margalit R., Paltiel O. Prevention of breast cancer in women who carry BRCA1 or BRGA2 mutations: a critical review of the literature.//Int J Cancer.-2004.-V.112.-N.3.-P.357-364.li

17. Carlson K.J., Skates S.J., Singer D.E. Screening for ovarian cancer.// Ann. Intern. Med.-1994.-V. 121.-P. 124-132.

18. Case-Green S., Pritchard C., Southern E. Oligonucleotide arrays for genotyping: enzymatic methods for typing single nucleotide polymorphisms and short tandem repeats.//Methods Mol Biol.-2003.-V.226.-P.255-270.

19. Chehab N.H., Malikzay A., Appel M., Halazonetis T.D. Chk2/hCdsl functions as a DNA damage checkpoint in G(l) by stabilizing p53.//Genes Dev.-2000.-V. 14.-N.3 .-P.278-288.

20. Chekmariova E.V., Sokolenko A.P., Buslov K.G., Iyevleva A.G., Ulibina Y.M., Rozanov M:E., Mitiushkina N.V., Togo A.V., Matsko D.E., Voskresenskiy

21. D.A., Chagunava O.L., Devilee P., Cornelisse C., Semiglazov V.F., Imyanitov'

22. E.N. CHEK2 llOOdelC mutation is frequent among Russian breast cancer patients.//Breast Cancer Res Treat.-2006.-.V.100.-N.l.-P.99-102.

23. Chen A., Kleiman F.E., Manley J.L., Ouchi T., Pan Z.Q. Autoubiquitination of the BRCA1*BARD1 RING ubiquitin ligase.//J Biol Chem.-2002.-V.277.-N.24.-P.22085-22092.

24. Chen V.W., Ruiz B., Killeen J.L., Cote T.R., Wu X.C., CoiTea C.N. Pathology and classification of ovarian tumors//Cancer.-2003.-V.97.-N. 10.-P.2631-2642.

25. Chen Y., Farmer A.A., Chen C.F., Jones D.C., Chen P.L., Lee W.H. BRCA1 is a 220-kDa nuclear phosphoprotein that is expressed and phosphorylated in a cell cycle-dependent manner.//Cancer Res.-1996.-V.56.-N.14.-P.3168-3172.

26. Giernikova S.,. Tomka M., Kovac M:, Stevurkova V., Zajac V. Ashkenazi founder BRCA1/BRCA2 mutations in Slovak hereditary breast and/or ovarian cancer families.//Neoplasma.-2006.-V.53.-N.2.P:97-102.

27. Coulthard S.A., Hogarth L.A., Little M., Matheson E.C., Redfern C.P., Minto, L., Hall A.G. The effect of thiopurine methyltransferase expression on sensitivity to thiopurine dmgs./Mol Pharmacol:-2002.-V.62.-Nl .-P; 102-109:

28. Coupier I., Cousin P.Y., Hughes D., Legoix-Ne P., Trehin A., Sinilnikova O.M., Stoppa-Lyonnet D. BAP1 and breast cancer risk.//Fam Cancer.-2005.-V.4.-N;4.-P:273-277.

29. Csokay B., Tihomirova L., Stengrevics A., Sinicka O:, Olah E. Strong founder effects, in BRCAl mutation carrier breast cancer patients from Latvia.//Hum Mutat.-1999.V.14.-N.l.-P.92. '

30. Cuzick J. Ghemoprevention of breast cancer./ZBreast Cancer.-2008.-V. 15 .-N. 1 .P. 10-16.

31. Cybulski C., Gorski B., Huzarski T., Masojc B., Mierzejewski M., Debniak T., Teodorczyk U., Byrski T., Gronwald J., Matyjasik J., Zlowocka E., Lenner M.,

32. Grabowska E., Nej K., Castañeda J., Medrek K., Szymanska A., Szymanska J-,. Kurzawski G., Suchy J., Oszurek O., Witek A,. Narod S.A., Lubinski J. CHEK2 is a multiorgan cancer susceptibility gene//Am J Hum Genet.-2004.-V.75.-N.6.-P.l 131-1135.

33. Decaux G., Horsmans Y., Houssiau F., Desager J.P. High 6-thioguanine nucleotide levels and: low thiopurine methytransferase activity in patients with lupus erythematosus treated with azathioprine;//Am J Ther.-2001.-V.8.-N.3.r P. 147-150.

34. Delaval B i, Ferrando A., Conte N., .Larroque C.3 Hernandez-Verdun D;3 Prigent G., Bimbaum D. Aurora B TAGC1 protein complex in cytokinesis.//Oncogene:-2004.-V.23.-N.26.-P.4516-4522.

35. Dong X., Wang L.3 Taniguchi K.3 Wang X.3 Cunningham J.M., McDonnell

36. Drobyshev A1., Mologina N., Shick V., Pobedimskaya D., Yershov G. & Mirzabekov A. Sequence analysis by hybridization with oligonucleotide microchip: identification of beta-thalassemia mutations.//Gene.-1997.-V.188.-P.45-52.

37. Dulbecco R. A turning point in cancer research: sequencing the human; genome//Science.-1986.-V.231 .-N.4742.-P: 105 5-1056.

38. Easton D.F. The inherited component of cancer.//Br Med Bull.- 1994.-V.50.-N.3.-P.527-535.

39. Eccles D.M. Hereditary cancer: guidelines in clinical practice. Breast and ovarian cancer genetics.//Ann Oncol.-2004.V.15.-Suppl 4.-P.133-8.

40. Eerola H., Heikkila P., Tamminen A., Aittomaki K., Blomqvist C., Nevanlinna H. Histopathological features of breast tumours in BRCA1, BRCA2 and mutation-negative breast cancer families./ZBreast Cancer Res.-2005.-V.7.-N.l.-P.93-100.

41. Evans W.E. Comprehensive assessment of thiopurine S-methyltransferase (TPMT) alleles in three ethnic populations.//! Pediatr Hematol 0ncol.-2002.-V.24.-N.5.-P.335-336.

42. Evans W.E. Pharmacogenetics of thiopurine S-methyltransferase and thiopurine therapy .//Ther Drug Monit.-2004.-V.26.-N.2.-P. 186-191.

43. Falck J., Lukas C., Protopopova M., Lukas J., Selivanova G., Bartek J. Functional impact of concomitant versus alternative defects in the Chk2-p53 tumour suppressor pathway.//Oncogene.-2001.-V.20.-N. 39.-P.5503-5510.

44. Feki A., Jefford C.E., Berardi P., Wu J.Y., Cartier L., Krause K.H., Irminger-Finger I. BARD1 induces apoptosis by catalysing phosphorylation of p53 by DNA-damage response kinase.//Oncogene.-2005.-V.24.-N.23.-P.3726-3736.

45. Ferlay J., Autier P., Boniol M., Heanue M., Colombet M., Boyle P. Estimates of the cancer incidence and mortality in Europe in 2006.//Ann 0ncol.-2007.-V.18.-N.3.-P.581-592.

46. Fesenko D.O., Nasedkina T.V., Prokopenko D.V., Mirzabekov A.D. Biosensing and monitoring of cell populations using the hydrogel bacterial microchip .//Biosensors and Bioelectronics.-2005.-V.20.-N.9.- P.1860-1865.

47. Foretova L., Machackova E., Navratilova M., Pavlu H., Hruba Ml, Lukesova M., Valik D. BRCA1 and5i?C42 mutations in women with, familial or early-onset breast/ovarian cancer in the Czech Republic.//Hum Mutat.-2004.-V.23.-N.4.-P397-398.

48. Friedenson B. Is mammography indicated for women with defective BRCA genes? Implications of recent scientific advances for the diagnosis, treatment, andi prevention of hereditary breast cancer.// MedGenMed.-2000.-V.2.-N.l.-P.E9.

49. Friedrichsen D.M., Malone K.E., Doody D.R., Daling J.R., Ostrander E.A. Frequency of CHEK2 mutations in a population based, case-control study of breast cancer in young women.//Breast Cancer Res.-2004.-V.6.-N.6.-P.R629-635.

50. Fuks F., Milner J., Kouzarides T. BRCA2 associates with acetyltransferase activity when bound to P/CAF.//Oncogene.-1998.- V.17.-N.19.-P.253r-2534.

51. Gao Q., Neuhausen S., Cummings S., Luce M., Olopade O.I. Recurrent germline BRCA1 mutations in extended African American families with early-onset breast cancer.//Am J Hum Genet.-1997.-V.60.-N.5.-P.1233-1236.

52. Gatei M., Scott S.P., Filippovitch I., Soronika N., Lavin M.F., Weber B., ! Khanna K.K. Role for ATM1 in DNA damage-induced phosphorylation of

53. BRCA1.//Cancer Res.-2000.-V.60.-N.12.-P.3299-3304.

54. Gayther S.A., Harrington P., Russell P., Kharkevich G., Garkavtseva R.F., i ■ Ponder B.A. Frequently occurring germ-line mutations of the BRCA1 gene inovarian cancer families from Russia.//Am J Hum Genet.-1997.- V.60.-N.5.-| P. 1239-1242.

55. Goggins M., Schutte M. Lu J., Moskaluk C.A., Weinstein G.L., Petersen G.M.,i

56. Yeo C.J., Jackson C.E., Lynch H.T., Hruban R.H., Kern S.E. Germline BRCA2 gene mutations in patients with apparently sporadic pancreatic i carcinomas .//Cancer Res.-1996.-V.56.-N.23.-P.53 60-53 64.

57. Gronwald J., Elsakov P., Gorski B, Lubinski J. High incidence of 4153 del A

58. BRCA1 gene mutations in Lithuanian breast- and breast-ovarian cancer i families./ZBreast Cancer Res Treat.-2005.-V.94.-N.2.-P. 111-113.

59. Gryadunov D., Mikhailovich V., Lapa S., Roudinskii N., Donnikov M., Pan'kov

60. S., Markova O., Kuz'min A., L. Chernousova L., Skotnikova O., Moroz A.,i '

61. Zasedatelev A., Mirzabekov A. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide1.microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis.//Clinicalf

62. Microbiology and Iinfection.-2005.-V. 11 .-N.7.-P.531-539.

63. Grzybowska E., Sieminska M., Zientek H1., Kalinowska E., Michalska J.,s

64. Utracka-Hutka B., Rogozinska-Szczepka J., Kazmierczak-Maciejewska Ml

65. Germline mutations in the BRCA'l gene predisposing to breast and ovariancancers in Upper Silesia population.//Acta Biochim Pol.-2002.-V.49.-N.2.5 P.351-356.

66. Gudmundsdottir K., Lord C.J., Witt E., Tutt A.N., Ashworth A. DSS1 isi

67. Guerciolini R., Szumlanski C., Weinshilboum R.M. Human liver xanthine oxidase: nature and extent of individual variation.//Clin Pharmacol Ther.-1991.-V.50.-N6.-P.663-672.

68. Haglund S., Lindqvist M., Aimer S., Peterson C., Taipalensuu J. Pyrosequencing of TPMT alleles in a general Swedish population and in patients with inflammatory bowel disease.//Clin Chem.-2004.-V.50.-N.2.-P.288-295.

69. HallJ.M., Lee M.K., Newman B., Morrow J.E., Anderson L.A., Huey B., King-M.C. Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome 17q21 .//Science.-1990.- V.250.-N.4988.-P. 1684-1689.

70. Hamann U. Hereditary breast cancer: high risk genes, genetic testing and clinical implications.//Clin Lab.-2000.-V.46.-N.9-10.-P.447-461.

71. Hankinson S.E., Colditz G.A., Hunter D.J., Willett W.C., Stampfer M.J., Rosner B., Hennekens C.H., Speizer FE.A prospective study of reproductive factors and risk of epithelial ovarian cancer.//Cancer.-1995.-V.76.-N.2.-P.284-290.

72. Heyries K.A., Loughran M.G., Hoffmann D., Homsy A., Blum L.J., Marquette G.A. Microfluidic biochip for chemiluminescent detection of allergen-specific antibodies./ZBiosens Bioelectron.-2008(m press)

73. Hirao A., Kong-Y.Y., Matsuoka S., Wakeham A.,- Ruland J., Yoshida H., Liu D., Elledge S.J., Mak T.W. DNA damage-induced activation of p53 by the checkpoint kinase Chk2.//Science.-2000.-V.287.-N.5459:-P. 1824-1827.

74. Holmberg M., Kuhle A., Garnaes J., Boisen A. Hybridisation of short DNA molecules investigated with in situ atomic force microscopy .//Ultramicroscopy.-2003 .-V.97.-N. 1 -4.-P.257-261.

75. Hon Y.Y., Fessing M.Y., Pui C.H., Relling M.V., Krynetski E.Y., Evans W.E. Polymorphism of the thiopurine S-methyltransferase gene in African-Americans.//Hum Mol Genet.-1999.-V.8'.-N2.-P.371-376.

76. Hongeng S., Sasanakul W., Chuansumrit A., Pakakasama S., Chattananon. A., Hathirat P. Frequency of thiopurine S-methyltransferase genetic variation in Thai children with acute leukemia.//Med Pediatr Oncol.-2000:-V.35.-N4.-P.410-414.

77. Honrado. E., Benitez J., Palacios J. The molecular pathology of hereditary breast cancer: genetic testing and therapeutic implications.//Mod Pathol'.-2005.-V.18.-N. 10.-P.1305-1320.102. http: www.amershambiosciences.com

78. Hulka B.S., Moorman P.G. Breast cancer: hormones and other risk factors.//Maturitas.-2001 .-V.3 8.-N. 1 .-P. 103 -113.

79. Inoue R., Fukutomi T., Ushijima T., Matsumoto Y., Sugimura T., Nagao M. Germline mutation of BRCA1 in Japanese'breast cancer families.//Cancer Res.-1995.-V.55.-N.16.-P:3521-3524.

80. Isinger A., Bhat M., Borg A., Nilbert M. CHEK2 llOOdelC in patients * with metachronous cancers of the breast and the colorectum.// BMC Cancer.-2006.-V.6.-N.64.

81. Jensen R.A., Thompson M.E., Jetton T.L., Szabo C.I., van der Meer R., Helou B:, Tronick S.R., Page D.L., King; M.-C., Holt J.T. BRCA1 is secreted and-exhibits properties of a granin.//Nature Genet.- 1996.-V.12.-N.3.-P.303-308.

82. Johannsson O., Loman N., Moller T. et al. Incidence of malignant tumours in* relatives of BRCA1 and BRCA2 germline mutation carriers.// Eur J Cancer.-1999.-V.35.-N.8.-1248-1257.

83. Johnson-N.C., Dan H.C., Cheng J.Q:, Kruk P.A.BRCA1 185delAG mutation inhibits Akt-dependent, IAP-mediated caspase 3 inactivation in human* ovarian surface epithelial cells.//Exp Cell Res.-2004.-V.298.-N.l.-Pi9-16.

84. Jordan S.J., Webb P.M., Green A.C. Height, age at menarche, and risk of epithelial ovarian cancer.//Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.-2005.-V.14.-N.8.-P.2045-2048.

85. Kelsey J.L., Gammon M.D., John? E.M. Reproductive factors and! breast cancer.//Epidemiol;Rev.-1993.-V.15.-N.l.-P.36-47.

86. Kennedy R.D., Quinn J.E., Mullan P.B., Johnston P.G., Harkin D.P. The role of BRCA1 in the cellular response to-chemotherapy .//J Natl Cancer Inst.-2004.-V.96.-N.22.-P. 1659-1668.

87. King M.G., Marks J.H., Mandell J.B. New York Breast Cancer Study Group. Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and 5i?G42.//Science.-2003.-V.302.-N.5645.-P.643-646.

88. Kirk J., Brennan M., Houssami N., Ung O. An approach to the patient with a family history of breast cancer.//Aust Fam Physician.-2006.-V.35.-N.l-2.-P.43-47.

89. Kojic M., Yang H., Kostrub C.F., Pavletich N.P., Holloman W.K. The BRCA2-interacting protein DSS1 is vital for DNA repair, recombination, and genome stability in Ustilago maydis.//Mol Cell.-2003.-V.12.-N.4.-P.1043-1049.

90. Kolchinsky A. and Mirzabekov A. Analysis of SNPs and other genomic variations using gel-based chips.//Hum. Mutat.-2002.-V.19.-N.4.-P.343-360.

91. Krynetski E.Y., Evans W.E. Pharmacogenetics as a molecular basis forindividualized. drug therapy: the thiopurine S-methyltransferase paradigm.//Pharm Res.-1999.-V.16.-N.3.-P.342-349.

92. Krynetski E.Y., Krynetskaia N.F., Yanishevski Y., Evans W.E. Methylation of mercaptopurine, thioguanine, and their nucleotide metabolites by heterologously expressed human thiopurine S-methyltransferase.//Mol Pharmacol.-1995.-V.47.-N.6.-P.l 141-1147.

93. Krynetski E.Y., Schuetz J.D., Galpin A.J., Pui C.H., Relling M.V., Evans W.E. A single point mutation leading to loss of catalytic activity in-human thiopurine S-methyltransferase.//Proc Natl-Acad Sci U S A.-1995.-V.92.-N.4.-P.949-953.

94. Kumagai K., Hiyama K., Ishioka S., Sato H., Yamanishi Y., McLeod H.L., Konishi.F., Maeda H., Yamakido M. Allelotype frequency of the thiopurine methyltransferase (ZPMjT)*gene in Japanese.//Pharaiacogenetics.-2001.-V.ll.-N.3.-P.275-8.

95. Kunitzin A., Kochetkova S., Timofeev E. & Florentiev V. Partial thermodynamic parameters for prediction of stabilities and washing behavior of DNA duplexes immobilized on gel matrix. //J. Biomol. Structure & Dynamics.-1996.-V.14.-N.2.-P.239-244.

96. Kurzawski M., Gawronska-Szklarz B., Drozdzik M. Frequency distribution of thiopurine S-methyltransferase alleles in a polish population. //Ther Drug Monit.-2004.- V.26.-N.5.-P.541-545.

97. Lagerros Y.T., Hsieh S.F., Hsieh C.C. Physical activity in adolescence and young adulthood and breast cancer risk: a quantitative review.// Eur J Cancer Prev.-2004.-V. 13 .-N. 1 .-P.5-12.

98. Landegren U., Kaiser R., Sanders J., Hood L. A ligase-mediated gene detection technique.//Science.-1988.-V.241 .-N.4869.-P. 1077-1080.

99. Landi S., Gemignani F., Gioia-Patricola L., Chabrier A., Canzian F. Evaluation of a microarray for genotyping polymorphisms related to xenobiotic metabolism and DNA repair.//Biotechniques.-2003.-V.35.-N.4.-P.816-820, 822, 824-827.

100. Lane T.F., Deng C., Elson A., Lyu M.S., Kozak C.A., Leder P. Expression of Brcal is associated with terminal differentiation of ectodermally and mesodermally derived tissues in mice.//Genes Dev.-1995.- V.9.-N.21.-P.2712-2722.

101. Lennard L. The clinical pharmacology of 6-mercaptopurine.//Eur J Clin Pharmacol.-1992.-V.43.-N.4.-P.329-339.

102. Levine A.J., Finlay C.A., Hinds P.W. P53 is a tumor suppressor gene.//Cell.-2004.-V.116.-Suppl 2.-P.S67-69.

103. Li F.P., Fraumeni JF. Jr. Soft-tissue sarcomas, breast cancer, and other neoplasms. A familial syndrome?//Ann Intern Med.-1969.-V.71.-N.4.-P.747-752.

104. Lipozencic J., Wolf R. Atopic dermatitis: an update and review of theliterature.//Dermatol Clin.-2007.-V.25.-N.4.-P. 605-612.

105. Livshits M., Florentiev V. & Mirzabekov A. Dissociation of duplexes formed by hybridization of DNA with gel-immobilized oligonucleotides.//.!. Biomol. Structure & Dynamics.-1994.-V.11.-N.4.-P.783-795.

106. Ljubenovic M., Ljubenovic D., Binic I., Jovanovic D., Stanojevic M. Gorlin-Goltz syndrome.//Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat.-2007.-V.16.-N.4.-P.166-169.

107. Loman N., Johannsson O., Bendahl P.O., Borg A., Ferno M., Olsson H. Steroid-receptors in hereditary breast carcinomas associated with BRCA1 or BRCA2' mutations or unknown susceptibility genes.//Cancer.-1998.-V.83.-N.2.-P.310-319.

108. Lubin F., Chetrit A., Freedman L.S., Alfandary E., Fishier Y., Nitzan H., Zultan A., Modan B. Body mass index at age 18 years and during adult life and. ovarian cancer risk.//Am J Epidemiol.-2003.-V.157.-N.2.-P.l 13-120.

109. Mancinelli L., Cronin M., Sadee W. Pharmacogenomics: the promise of personalized medicine.//AAPS PharmSci.-2000.-V.2.-N.l.-P.E4.

110. Marcus J.N., Watson P., Page D.L., Narod S.A., Lenoir G.M., Tonin P., Linder

111. Stephenson L., Salerno G., Conway T.A., Lynch H;T. Hereditary breast cancer: pathobiology, prognosis, and BRCA1 and BRCA2 gene linkage.//Cancer.-1996.-V.77.-N.4.-P.697-709.

112. Matsuoka S., Huang M., Elledge S.J. Linkage of ATM to cell cycle regulation, . by the Chk2 protein kinase;//Science.rl998.-V.282.-N.5395.-P; 1893-1897.

113. Maybaum J., Mandel H.G. Unilateral chromatid damage:, a new basis for 6-thioguanine cytotoxicity .//Cancer Res.-1983.-V.43;-N.8.-P.3852-3856:

114. McPherson' M.J., Quirke P., Taylor G.R1 PGR: a practical' approach;, Oxford University Press. 1991.

115. Meijers-Heijboer H., van den Ouweland A., Klijn J!, Wasielewski Ml, de-Snoo A.,.©ldenburg R., Hollestelle A., Houben M., Crepin E., van Veghel-Plandsoen Mi, Elstrodt F., van Duijn C., Bartels C., Meijers C., Schutte M., McGuffog L.,

116. Memarzadeh S., Berek J.S. Advances in the management of epithelial ovarian cancer.//J Reprod Med.-2001.-V.46:-N.7.-P.621-629.

117. Miki Y., Swensen J, Shattuck-Eidens D, Futreal PA, Harshman K, Tavtigian S, Liu Q, Cochran C, Bennett LM, Ding W, et al. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1.//Science.-1994.-V.266.-N.5182.-P.66-71.

118. Milek M'., Murn J., Jaksic Z., Lukac Bajalo J., Jazbec J., Mlinaric Rascan .1. Thiopurine S-methytransferase pharmacogenetics: genotype to phenotype correlation in the Slovenian population.//Pharmacology.-2006.-V.77.-N.3.-P.105-114.

119. Milner J., Ponder B., Hughes-Davies L., Seltmann M., Kouzarides T. Transcriptional activation functions in BRCA2.//Nature.-1997.-V.386.-N.6627.-P.772-773.

120. Moscucci O., Clarke A. Prophylactic oophorectomy: a historical perspective.//! Epidemiol Community Health.-2007.-V.61.-N.3.-P.182-184.

121. Moynahan M.E., Chiu J.W., Koller B.H., Jasin M. Brcal controls homology-directed DNA repair.//Mol Cell.-l 999.-V.4.-N.4.-P.511-518.

122. Nagasubramanian R., Innocenti F., Ratain M.J. Pharmacogenetics in cancer treatment.//Annu Rev Med.-2003.-V.54'.-P:437-452.

123. NCBI: http://www.ncbi.nlminih.gov/)

124. Nebert D.W. Polymorphisms in drug-metabolizing enzymes: what- is their clinical» relevance and why do they exist?//Am J Hum Genet.-1997.-V.60.-N.2.-P.265-271.

125. Nelen M.R., Padberg G.W., Peeters E.A., Lin A.Y, van den Helm B., Frants

126. Newman B., Austin M.A., Lee M., King M.C. Inheritance of human breast cancer: evidence for autosomal dominant transmission in high-risk families.//Proc Natl Acad Sci USA.-1988.-V.85.-N.9.-P.3044-3048.

127. Newton C.R., Graham A., Heptinstall L.E., Powell S.J., Summers C., Kalsheker N., Smith J.C., Markham A.F. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS).//Nucleic Acids Res.-1989.-V. 17.-N.7.-P.2503-2516.

128. Nomizu T., Tsuchiya A., Kanno M., Katagata N., Watanabe F., Yamaki Y., Abe R., Miki Y. Clinicopathological Features of Hereditary Breast Cancer./ZBreast Cancer.-1997.- V.4.-N.4.-P.239-242.

129. Okamoto T., Suzuki T., Yamamoto N. Microarray fabrication with covalent attachment of DNA using bubble jet technology .//Nat Biotechnol.-2000.-V.18.-N.4.-P.438-441.

130. Otterness D.M., Szumlanski C.L., Wood T.C., Weinshilboum R.M. Human thiopurine methyltransferase pharmacogenetics. Kindred with a terminal exon splice junction mutation that results in loss of activity.//X Clin Invest.-1998.-V.101.-N.5.-P.1036-1044.

131. Pal T., Permuth-Wey J., Holtje T., Sutphen R. BRCA1 and BRCA2 mutations in a study of African American breast cancer patients.//Cancer Epidemiol

132. Park S., Lee M.R., Shin I. Fabrication of carbohydrate chips and1 their use to probe protein-carbohydrate interactions.//Nat Protoc.-2007.-V.2.-N.ll.-P.2747-2758.

133. Parkin D.M., Bray F., Ferlay J., Pisani P. Global cancer statistics, 2002.//CA Cancer J Clin.-2005.-V.55.-N.2.-P.74-108.

134. Parkin D.M., Pisani P., Ferlay J. Global cancer statistics.//CA Cancer J Clin.-1999.-V.49.-N. 1 .-P133-64.

135. Parks D.A., Granger D.N. Xanthine oxidase: biochemistry, distribution and. physiology .//Acta Physiol Scand Suppl.-1986.-V.548.-P.87-99.

136. Peelen T., van Vliet M., Bosch A., Bignell G., Vasen HiF., Klijn J.G., Meijers

137. Heijboer H., Stratton M., van Ommen G.J., Cornelisse C.J., Devilee P:

138. Screening for BRCA2 mutations in 81 Dutch breast-ovarian cancer families.//Br J Cancer.-2000.- V.82.-N.1.-P.151-156.

139. Phillips K.A., Andrulis I.L., Goodwin P.J. Breast carcinomas arising imcarriers of mutations in BRCA1 or BRCA2: are they prognostically different?//J Clin Oncol.-l 999.- V. 17.-N. 11 .-P.3653-3663.

140. Phillips K.A., Nichol K., Ozcelik H., Knight J., Done S.J., Goodwin P.J.,

141. Andrulis I.L. Frequency of p53 mutations in breast carcinomas from Ashkenazi Jewish carriers of BRCA1 mutations.//J Natl Cancer Inst.-1999.- V.91.-N.5.-P.469-473.

142. Piver M.S., Baker T.R., Piedmonte M., Sandecki A.M. Epidemiology and etiology of ovarian cancer//Cancer.Semin.Oncol.-1991.-V.18.-P.177-185

143. Plunkett W., Gandhi V. Pharmacology of purine nucleoside analogues.//Hematol Cell Ther.-1996.-V.38.-Suppl 2.-P.S67-74.

144. Proudnikov D., Mirzabekov A. Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling.//Nucleic Acids Res.-1996.- V.24.-N. 22.-P.4535-4542.

145. Ragge N.K., Salt A., Collin J.R., Michalski A., Farndon P.A. Gorlin syndrome: the PTCH gene links ocular developmental defects and tumour formation.//Br X Ophthalmol.-2005.-V.89.-N.8-P.988-991.

146. Ragoussis J., Elvidge G. Affymetrix GeneChip system: moving from research ' to the clinic.//Expert Rev Mol' Diagn.-2006.-V.6.-N.2.-P. 145-152.

147. Razandi M., Pedram A., Rosen E.M., Levin E.R. BRCA1 inhibits membrane estrogen and growth factor receptor signaling to cell proliferation in breast cancer.//Mol Cell Biol.-2004.-V.24.-N.13.-P.5900-5913.

148. Rim K.T., Park K.K., Kim Y.H., Lee Y.H., Han J.H., Chung Y.H., Yu I.J. Gene-expression profiling of human mononuclear cells from welders using cDNA microarray.//J Toxicol Environ Health A.-2007.-V.70.-N. 15-16.-P. 12641277.

149. Roa B.B., Boyd A.A., Volcik K., Richards C.S. Ashkenazi Jewish population frequencies for common mutations in BRCA1 and BRCA2.ltNat Genet.-1996.-V.14.-N.2.-P. 185-187.V

150. Robert S.A., Strombom I., Trentham-Dietz A., Hampton J.M., McElroy J.A., Newcomb P.A., Remington P.L.Socioeconomic risk factors for breast cancer: distinguishing individual- and community-level effects.//Epidemiology.-2004.-V. 1 .-N.4.-P.442-450.

151. Robson M.E. Clinical considerations in the management of individuals at risk for hereditary breast and ovarian cancer.//Cancer Control.-2002.-V.9.-N.6.-P.457-465.

152. Ross R.K., Paganini-Hill A., Wan P.C., Pike M.C. Effect of hormone replacement therapy on breast cancer risk: estrogen versus estrogen plus progestin.//J Natl Cancer Inst.-2000.- V.92.-N.4.-P.328-332.

153. Rubina A., Duykova V., Dementieva E., Stomakhin A., Nesmeyanov E., Grishin E., Zasedatelev A. Quantitative immunoassay of biotoxins on hydrogel-based protein microchips.//Anal. Biochem.-2005.-V.340.-N.2.-P.317-329.

154. Rudkin T.M., Hamel N., Galvez M., Hogervorst F., Gille J.J, Moller P., Apold J., Foulkes W.D. The frequent BRCA1 mutation 1135insA has multiple origins: a haplotype study in different populations.//BMC Med Genet.-2006.-V.7.-N.15.

155. Rumbo C., Emerick K.M., Emre S., Shneider B.L. Azathioprine metabolite measurements-inthe treatment of autoimmune hepatitis in pediatric patients: a preliminary report. //J Pediatr Gastroenterol Nutr.-2002.-V.35.-N3.-P:391-398.

156. Sambrook J., Fritsch E.P., Maniatis T. Molecular cloning: a Laboratory Coldspring Harbour Lab. Coldspring I Iarbour Laboratory Press. NY. 1989:

157. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.//Proc Natl Acad Sci USA.-1977.-V.74.-N.12.-P.5463-5467.

158. Schouten L.J:, Rivera C., Hunter DrJ., Spiegelman:D.,.Adami H.O., Arslan A., Beeson W.L., van den Brandt P.A., Buring J.E., Folsom A.R:, Fraser G.E., Freudenheim J.L., Goldbohm R.A., Hankinson S.E., Lacey JV. Jr., Leitzmann

159. Scully R., Chen J., Ochs R.L., Keegan K., Hoekstra M., Feunteun J., Livingston D.M. Dynamic changes of BRCA1 subnuclear location and phosphorylation state are initiated by DNA damage.//Cell.-1997/-V.90.-N.3.-P.425-435.

160. Seidman E.G., Furst D.E. Pharmacogenetics for the individualization of treatment of rheumatic disorders using azathi"oprine.//J Rheumatol.-2002.-V.29.-N. 12.P.2484-2487.

161. Seki T., Tanaka T.", Nakamura Y. Genomic structure and multiple single-nucleotide polymorphisms (SNPs) of the thiopurine S-methyltransferase (TPMT) gene.//J Hum Genet.- 2000.-V.45.-N5.P.299-302

162. Seppala E.H., Ikonen T., Mononen N., Autio V., Rokman A., Matikainen M;P., Tammela T.L., Schleutker J. CHEK2 variants associate with hereditary prostate cancer.//Br J Cancer.-2003.-V.89.-N. 10.-P.1966-1970.

163. Sherer D.W., Lebwohl M.G. 6-thioguanine in the treatment of psoriasis: a case report and literature review.// J Cutan Med Surg.- 2002.-V.6.-N6.-P.546-550.

164. Sidransky D. Two tracks but one race? Cancer genetics.//Curr Biol.-1996.-V.6.-N.5.-P.523-525.

165. Singletary K.W., Gapstur S.M. Alcohol and breast cancer: review of epidemiologic and experimental evidence and potential mechanisms.//JAMA.~ 2001.- V.286.-N.17.-P.2143-2151.

166. Sodha N., Williams R., Mangion J., Bullock S.L., Yuille M.R., Eeles R.A.

167. Screening hCHK2 for mutations.//Science.-2000.-V.289.-N. 5478.-P.359.

168. Southern E., Mir K., Shchepinov M. Molecular interactions on microarrays.//Nat Genet.-1999.-V.21.-Suppl 1.-P.5-9.

169. Southern E.M. Prospects for a complete molecular map of the human genome.//Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.-1988.-V.319.-N.1194.-P.299-307.

170. Spire-Vayron de la Moureyre C., Debuysere H., Sabbagh N., Marez D., Vinner

171. Struewing J.P., Abeliovich D., Peretz T., Avishai N., Kaback M.Mi,, Collinsti

172. Struewing J.P., Hartge P., Wacholder S., Baker S.M., Berlin M., McAdams M., Timmerman M.M., Brody L.C., Tucker M.A. The risk of cancer associated withIspecific mutations of BRCA1 and BRCA2 among Ashkenazi Jews.//N Engl J

173. Med.-1997.- V.336.-N.20.-P.1401-1408:

174. Sung P. Catalysis of ATP-dependent' homologous DNA pairing and strand i exchange by yeast RAD51 protein.//Science.-1994.-V.265.-N.5176.-P.1241-i 1243.H

175. Sarantaus L., Holli K., Blomqvist C., Kallioniemi O.P., Kainu T., Nevanlinnat