Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическое исследование наследственной предрасположенности к раку яичников

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое исследование наследственной предрасположенности к раку яичников"

На правах рукописи

0034-46850

Смирнова Татьяна Юрьевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАКУ ЯИЧНИКОВ

03 00 15 -генегика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 2 1Ш00В

Москва - 2008

003446850

Работа выполнена в ГУ Медико-генетический научный центр РАМЫ

Научный руководитель- доктор биологических наук, профессор

Карпухин Александр Васильевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Дадали Елена Леонидовна

доктор медицинских наук, профессор Журков Вячеслав Серафимович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский государственный медико-

стоматологический университет Росздрава

Защита диссертации состоится

.» часов на заседании

Диссертационного совета Д 001 016 01 в ГУ МГНЦ РАМН по адресу 115478, Москва, ул Москворечье, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ МГНЦ РАМН по адресу 115478, Москва, ул Москворечье, д 1

Автореферат разослан « Л. » /УМШЭ 2^008 г

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 001 016 0" доктор медицинских наук

Зинченко Р. А.

Актуальность темы

Проблема злокачественных новообразований яичников весьма актуальна вследствие высокой летальности и неуклонного роста его частоты Занимая 3-е место по заболеваемости среди злокачественных опухолей женских половых органов, рак яичников (РЯ) является лидирующей причиной смертельных исходов в онкогинекологии [Давыдов МИ с соавт, 2007] Основная причина высокой смертности больных РЯ заключается в бессимптомном течение заболевания на ранних стадиях, в результате чего около 80% случаев РЯ диагностируется на III-IV стадии болезни, когда эффективность лечения крайне низка [Jacobs IJ et al, 2004, Ozols R.F et al, 2005] Поэтому особенно актуальным представляется изучение возможности ранней диагностики РЯ на начальных этапах развития заболевания

Одним из эффективных подходов, способствующих раннему выявлению РЯ, является молекулярно-генетическое исследование его наследственной формы, которая в подавляющем числе случаев развивается вследствие наследуемых мутаций в генах-супрессорах опухоли BRCA1 и BRCA2 Для определения вклада наследственной формы РЯ в общую структуру заболевания проводится скрининг выборки больных РЯ, сформированной без учета семейной истории заболевания, на наличие мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 В выборках больных из разных популяций обнаруживают различную частоту мутаций - от 3% до 40% В России подобные исследования ранее проведены не были Восполнение этого пробела внесет существенный вклад в понимание особенностей мутационных процессов в разных популяциях Кроме того, определение характеристик мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 в выборке российских больных РЯ необходимо для разработки практической диагностики наследственной предрасположенности к данному заболеванию Выявление наследуемых мутаций, основанное на молекулярно-генетических данных об особенностях характеристик мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 в России, обеспечит объективный критерий для формирования групп повышенного риска развития РЯ

Поскольку мутации в генах BRCA1 и BRCA2 связаны с повышенным риском развития не только РЯ, но и рака молочной железы (РМЖ), весьма актуальным является изучение генетических причин модификации риска возникновения рака разной локализации Механизмом такой модификации может быть влияние аллелей умеренного риска рака той или иной локализации Полиморфные варианты в генах BRCA1 и BRCA2, мутации в которых обусловливают высокий риск развития РЯ и РМЖ, могут выступать в качестве таких аллелей [Baynes С et al, 2007] Несмотря на наличие ряда работ в этом направлении, исследование данного вопроса нельзя признать достаточным В частности, отсутствует сравнительный анализ влияния на риск вариантов в генах BRCA1/2 при спорадических формах рака и при мутациях в указанных генах Практически не изучено значение для модификации риска генетического взаимодействия ОНП в генах BRCA1/2 Выявление корреляции генотип-

фенотип существенно для углубления понимания молекулярных механизмов действия генов-супрессоров в злокачественной трансформации клеток и важно для разработки способов прогнозирования риска возникновения рака определенной локализации

Выявление наследственной предрасположенности к РЯ на основе ДНК-диагностики обеспечит базу для развития профилактики этого заболевания на принципиально новой основе

Целью данного исследования явился молекулярно-генетический анализ наследственной предрасположенности к РЯ в связи с особенностями первичной структуры генов BRCA1 и BRCA2

Задачи исследования:

1. Определить характеристики мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 в выборке российских больных РЯ, сформированной без учета семейной истории заболевания

2. Изучить частоты генотипов по однонуклеотидным полиморфизмам в генах BRCA1 и BRCA2 в выборке больных РЯ и в контрольной выборке

3. Провести сравнительный анализ частот генотипов по однонуклеотидным полиморфизмам генов BRCA1 и BRCA2 у больных с разной локализацией рака яичников и молочной железы

Научная новизна

Впервые на российской выборке изучен вклад наследственной формы, связанной с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2, в общую структуру заболеваемости РЯ Выявленная частота мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 относится к наиболее высоким среди изученных аналогичных выборок больных в европейских странах Основное число мутаций у российских больных РЯ наблюдается в гене BRCA1 Для выявления генетических факторов модификации риска рака различной локализации впервые проведен сравнительный анализ частот генотипов по однонуклеотидным полиморфизмам в генах BRCA1 и BRCA2 в четырех выборках больных РЯ с мутациями и без мутаций в гене BRCA1, РМЖ с мутациями и без мутаций в гене BRCA1 Впервые показано, что как при мутациях, так и без мутаций в гене BRCA1 одни и те же аллели ассоциированы с модификацией риска РЯ Аллели, ассоциированные с повышенным риском, различны для РЯ и спорадического РМЖ Изученные однонуклеотидные полиморфизмы не влияют на риск РМЖ при мутациях в гене BRCA1, что может указывать на отсутствие связи возникновения рака этой локализации с иными, кроме мутации, вариантами в генах BRCA1 я BRCA2

Научно-практическая значимость работы

Установленная в ходе данной работы высокая частота мутаций в генах BRCA1/2 указывает на важное практическое значение ДНК-диагностики наследственной

предрасположенности к РЯ Полученные результаты о преимущественной связи наследственной формы РЯ в России с мутациями в гене BRCA1 и характеристиках спектра, включающего несколько повторяющихся мутаций с преобладанием одной из них - 5382insC, определяют возможность проведения скрининговых исследований на предрасположенность к данному заболеванию для формирования групп повышенного риска Выявленные различия генотипов повышенного риска РЯ и РМЖ создают предпосылки для разработки способа идентификации предрасположенности к возникновению рака определенной локализации при наличии мутации в гене BRCA1

Внедрение в практику

Результаты исследования и практические рекомендации внедрены в работу ГУ Медико-генетического научного центра РАМН

Положения, выносимые на защиту :

1 Среди российских больных РЯ установлена частота индивидуумов с мутацией в гене BRCA1 или BRCA2 (16,8%, 95%ДИ 10,7-24,9%) Обнаруженные мутации преимущественно локализованы в гене BRCA1, с преобладанием в спектре мутации 5382insC

2 Генотипы по однонуклеотидным полиморфизмам в генах BRCA1/2, ассоциированные с модификацией риска, одни и те же при РЯ с мутациями и без мутаций в указанных генах

3 Генотипы, ассоциированные с увеличенным риском развития РЯ и спорадического РМЖ, различны Среди больных РМЖ с мутацией в гене BRCA1 генотипы по исследованным ОНП не ассоциированы с модификацией риска

4 Сниженный риск развития и РЯ, и спорадического РМЖ связан с одним и тем же генотипом

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации.

Все этапы молекулярно-генетического исследования (выделение ДНК, амплификация исследуемых фрагментов, электрофоретическая детекция), статистический анализ, обработка и обсуждение результатов выполнены автором лично

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на V съезде Российского общества медицинских генетиков (2005 г), VI Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток, Звенигород (2005 г), Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний возможности и перспективы» (2006 г), конференции European Human Genetics Conference 2007, European Human Genetics Conference 2008

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 научных публикаций, из них 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 101 странице машинописного текста, включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 7 глав собственных исследований и обсуждений результатов исследования, заключение, выводы, список использованной литературы Библиография содержит 12 отечественных и 111 зарубежных источника Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 15 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Группа больных РЯ была сформирована из 101 женщины только на основании соответствующего диагноза без учета семейной истории заболевания Сбор образцов крови пациентов и анализ семейной истории осуществлялись сотрудниками лаборатории онкологической генетики НИИ ГУ РОНЦ им Н Н Блохина РАМН (ст научн сотрудник, кмн JIН Любченко, зав лабораторией, проф , дмн РФ Гарькавцева) В гене BRCA1 исследовали первичную структуру всех 22 кодирующих экзонов В гене BRCA2 исследование ограничили 11 экзоном, который является участком локализации мутаций при РЯ, обозначаемый как ovarian cancer cluster region (OCCR) [Thompson D et al, 2002, Lubinski J. et al, 2004]

Для определения дополнительных генетических факторов, модифицирующих риск развития и локализации рака, был исследован набор ОНП (3232A>G[E1038G] в гене BRCA1, 203G>A, расположенный в 5'-[«транслируемой области гена BRCA2, и 1342A>C[N372H] в гене BRCA2) в выборках больных, отличающихся по локализации рака и наличию/отсутствию наследуемых мутаций в генах BRCA1/2 РЯ (спорадический и BRCA1-ассоциированный) и РМЖ (BRCA1-ассоциированный и спорадический)

В процессе анализа выполнялись следующие процедуры выделение геномной ДНК из образцов периферической крови пациентов, амплификация исследуемых фрагментов генов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), элеетрофоретический анализ продуктов амплификации, секвенирование фрагментов ДНК, идентифицированных в качестве мутантных при электрофоретическом анализе

Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови проводили при инкубации в среде, содержащей протеиназу К и додецилсульфат Na (0,5%, в течение 3 часов при 55°С) [Sambrook J et al, 1989] ПЦР исследуемых фрагментов ДНК проводили на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) с использованием олигонуклеотидных праймеров, синтезированных в НПО «SYNTOL»

Для выявления изменений нуклеотидной последовательности исследуемых генов использовался конформационно-чувствительный гель электрофорез (CSGE), проводимый на

аппарате 2010 MACROPHOR (LKB, Швеция) с последующим окрашиванием путем экспозиции в 0,2% растворе нитрата серебра и проявлении фракций ДНК в смеси 3% раствора карбоната натрия и 0,05% раствора формальдегида. Фрагменты ДНК, с электрофоретически обнаруженными вариациями структуры секвенировали согласно протоколу фирмы-производителя на приборе ABI Prism 3100 совместно с сотрудниками Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН. Анализ результатов секвенирования осуществляли с помощью программ Chromas и BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).

Статистический анализ выполняли с помощью стандартного пакета «Statistica» (версия 6.0, «Statsoft Inc.», США).

Частота мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 при раке яичников

В результате исследования у 17 из 101 больного РЯ обнаружили мутацию в гене BRCA1 или BRCA2 (16,8%; 95% ДИ 10,7^-24,9%). Установленное значение частоты мутаций в исследованных генах в выборке российских больных РЯ является одним из наиболее высоких среди европейских стран [Pal J. et al., 2005; Khoo U.S. et al., 2000; Zikan M. et al., 2005; Malander S. et al., 2004; Kim Y.T. et al., 2005; Risch H.A. et al., 2001]. Высокая частота мутаций является свидетельством важности и эффективности исследования всех больных РЯ на наличие наследственной предрасположенности к этому заболеванию. На рис. 1 приведен пример детекции мутации в гене BRCA1.

Рис.1. Определение изменений первичной структуры ДНК гена BRCA1.

Слева - электрофоретическое разделение методом CSGE амплифицированных фрагментов ДНК гена BRCA1 (20 экзон) у больных РЯ. Справа - фрагмент результата секвенирования 20 экзона гена BRCA1, обнаруживающий вставку нуклеотида С в положении 5382 нуклеотидной последовательности. Обозначения: N/N - норма, N/M - наличие мутации в одном из аллелей.

Наибольшее число мутаций в исследованной нами выборке было выявлено в гене BRCA1 - 15 мутаций (14,8%), в то время как в гене BRCA2 - 2 мутации (2%). Соотношение

Результаты и их обсуждение

частоты мутаций в гене ВЕ.СА1 к случаям мутаций в гене ВЯСА2 составило приблизительно 8 к 1. Этот результат хорошо соотносятся с данными многочисленных исследований, согласно которым частота мутаций в гене ВКСА1 превышает таковую в гене ВКСА2 независимо от этнической принадлежности индивидуумов в исследуемой выборке.

В гене ВВ.СА2 нами были обнаружены две известные миссенс-мутации - К169(Ш и К1888Я (2%). Первая приводит к замене кодируемой аминокислоты лизин на аспарагин, вторая - лизин на аргинин. Значительная доля миссенс-мутаций в спектре гена ВЯСА2 характерна для не отобранных по семейной истории выборок РЯ и из других популяций. В подобной выборке, изученной в США, миссенс-варианты в гене ВИСА2 составили более половины [Ра! Т., 2005]. В Польше - почти все найденные среди больных изменения структуры в гене ВЯСА2 являлись миссенс-вариантами [Ма]с5ак ЕЛ. е! а!., 2005]. Хотя точное значение таких вариантов, как правило, неизвестно, имеются основания рассматривать их в качестве аллелей риска [Ма1ап<!ег Б. е1 а1., 2004].

Спектр мутаций в гене ВЯСА1

Среди мутаций в гене ВЯСА1 преобладала мутация 5382твС с долей, составившей 60% (9/15). Остальную часть спектра составили 4 мутации - С6Ш, ШсЗеШЗ, 4154с!е1А, 2080<Зе1А (рис. 2). Таким образом, мутации преимущественно связаны с геном ВЯСА! и характеризуются узким спектром (до 60% составляет одна мутация 5382шзС). Полученные данные указывают на возможность определения нескольких мутаций в гене ВЯСА1 при формировании групп повышенного риска развития РЯ, что существенно упрощает исследование без уменьшения эффективности и предопределяет осуществимость скрининга.

185йе1А0 (2)

4154с1е1А (1)

2080йе!А (1)

Рис.2. Спектр мутаций в гене ВКСА1 при раке яичников.

С6Ю (2)

5382тгС (9)

С другой стороны, близкие характеристики спектра мутаций и высокую частоту мутации 5382шзС в российской выборке наблюдали ранее при изучении семейного рака молочной железы [Карпухин А В с соавт, 2006] Следовательно, один и тот же набор мутаций формирует предрасположенность и к РЯ, и к РМЖ, указывая на то, что иные, нежели положение мутации в гене, генотипические особенности влияют на локализацию ВЯСА-ассоциированного рака

Анализ семейной истории больных раком яичников с мутациями в генах ВЯСА1/2

Среди больных РЯ с мутацией в гене ВЯСА1 или ВЯСА2 выяснили наличие родственников, имевших диагноз РЯ и/или РМЖ Семейный анамнез одного больного был не доступен Было установлено, что 14 из 16 (88%) изученных больных В11СА-ассоциированным РЯ имели родственников с РЯ и/или РМЖ

Рассмотренные в ходе настоящей работы семьи пробандов отличались по соотношению случаев РЯ и РМЖ у родственников, что позволило распределить семьи на две группы Первую группу составили семьи, в которых среди родственников встречается только РЯ или РЯ является более частым, чем РМЖ, заболеванием (РЯ-семьи) Вторую группу составили семьи, в которых РМЖ является преобладающим над РЯ заболеванием (РМЖ -семьи) Мы наблюдали примерно одинаковое распределение семей между двумя группами 8 РЯ-семей и б РМЖ-семей Для каждой группы семей мы суммировали обнаруженные мутации Оказалось, что преобладающей мутацией среди двух групп семей была 53821шС среди РЯ-семей доля 5382т$С составила 63%, а среди РМЖ-семей - 50% Таким образом, как в РЯ-, так и в РМЖ-семьях преобладает мутация 5382тзС, что является дополнительным свидетельством о наличии иных, нежели положение мутации в гене, генотипических особенностях, влияющих на локализацию ВКСА-ассоциированного рака

Следовательно, характеристики спектра мутаций не позволяют связать локализацию рака с положением мутаций в гене Другим генетическим фактором, потенциально способным влиять на риск рака той или иной локализации, являются однонуклеотидные полиморфизмы в генах ВЯСА1/2

Исследование однонуклеотидных полиморфизмов

В данном разделе работы исследовали четыре выборки больных, отличающихся по локализации рака и наличию/отсутствию наследуемых мутаций в генах ВЯСА1/2 (табл 1) Во всех указанных выборках определяли частоты генотипов по трем полиморфным вариантам в генах В11СА1/2, которые сравнивали с частотами в контрольной выборке

Таблица 1

Характеристика исследованных выборок.

Номер выборки Характеристика выборки Размер выборки, человек Условное обозначение выборки

1 пациенты с диагнозом РЯ без обнаруженных мутаций в генах ВЯСЛ]/2, спорадический РЯ 84 СРЯ

2 пациенты с диагнозом РЯ с обнаруженной мутацией в гене ВКСА1 33 МРЯ

3 пациенты с диагнозом РМЖ с обнаруженной мутацией в гене В11СА1 41 МРМЖ

4 пациенты с Диагнозом РМЖ без обнаруженных мутаций в гене ВКСА1/2, спорадический РМЖ 94 СРМЖ

5 контрольная группа, сформированная из женщин, семьи которых и они сами не были отягощены ни РЯ, ни РМЖ. 109 к

Всего 353

На рис.3 представлен пример элекчрофоретического генотипирования методом CSGE некоторых пробандов по ОНП N372H в гене BRCA2.

ш

Ww-v.JBi**

NM N/H N/N N/N N/N N/H N/N N/N H/H N/H N/N

Рвс~5. Генотипирование по полиморфизму N372H в гене BRCA2 с помощью метода конформационно-чувствительного электрофореза. Под каждой дорожкой указан соответствующий генотип: N/N - N372N; N/H - N372H; H/H - Н372Н.

Изучение ОНП в выборке спорадического рака яичников

В выборке СРЯ нами было обнаружено отличие в распределении частот генотипов по полиморфизму 203G>A от частот, наблюдаемых в контрольной выборке (табл.2). Генотип 203А/А достоверно чаще встречался в выборке СРЯ по сравнению с контрольной выборкой, а генотип 203G/A, напротив - реже. Присутствие генотипа 203АУА по полиморфизму

203в>А было связано с увеличенным риском развития СРЯ (ОЯ = 5,9, р = 0,01), а генотипа 203С/А - напротив - с его уменьшением ((Ж = 0,5, р = 0,03)

Таблица 2.

Результаты генотяпирования по исследованным ОНП в выборке больных спорадическим РЯ

и в контрольной выборке

ген полиморфизм Генотип по полиморфизму Количество генотипов в контрольной выборке Количество генотипов в выборке СРЯ (Ж р

ВКСА1 Е10380 Е1038Е 49 44 1,3 0,30

ЕЮ380 42 28 0,8 0,45

010380 18 12 0,8 0,69

ВНСА2 203 6>А 203 О/б 58 48 1.2 0,66

203 О/А 48 24 0,5 0,03

203А/А 3 12 5,9 0,01

N37211 №72Ы 67 45 0,7 0,30

N37211 37 34 1,3 0,37

Н372Н 5 5 1,3 0,75

Примечания жирным шрифтом отмечены достоверно значимые значения СЖ

Изучение ОНП в выборке ВИСА-ассоциированного рака яичников

В выборке МРЯ нами было обнаружено аналогичное наблюдавшемуся в выборке СРЯ отличие частот генотипов по полиморфизму 2030>А от контрольной выборки генотип 203А/А чаще встречался в выборке МРЯ (011=4,9, р=0,05), а генотип 203С/А, напротив -реже (011=0,4, р=0,04) Единый характер отличий частот генотипов от контроля, наблюдаемый в выборках спорадического и ВЯСА1 -ассоциированного РЯ, свидетельствует о наличии общих механизмов модификации риска, свойственных данным формам РЯ Сравнение частот всех генотипов в выборках СРЯ и МРЯ не выявило достоверно значимых отличий (диапазон значений р от 0,14 до 0,83), что позволило объединить две данные выборки больных РЯ Характеристики распределения генотипов по ОНП в генах ВЕСА 1/2 были изучены в объединенной выборке РЯ Мы получили результаты, аналогичные таковым для отдельных выборок РЯ, при этом уровень значимости различий частот увеличился на порядок при генотипе 203А/А 011=5,8 (р=0,003), при генотипе 2030/А 011=0,5 (р=0,008) Таким образом, выявлены генотипы, модифицирующие риск развития РЯ, при этом их эффект проявляется независимо от присутствия или отсутствия мутации в гене ВЯСА1 Чтобы определить, связан ли модифицирующий эффект полиморфизма 203в>А на развитие рака именно данной локализации, были проанализированы выборки спорадического и ВЯСЛ-ассоциированного РМЖ

Изучение ОНИ в выборке BRCA-aj;couiiiipQBamioro, рака молочной железы

В выборке BRCA1-ассоциированного РМЖ'мы не-обнаружили достоверно значимых отличий в частотах генотипов по исследованным ОНП от частот в контрольной выборке Следовательно, в отличие от модификации риска РЯ, изученные варианты в генах BRCA1/2 не влияют на риск рака молочной железы при мутациях в гене BRCA1

! ----¡4

Изучение ОНП в выборке спорадического рака молочной железы

В выборке СРМЖ установили умйишён11уй'*-яо сравнению с контрольной выборкой частоту генотипа 203G/A (OR=0,5, p=p,Q2) и '/увеличенную частоту генотипа E1038G

(OR=2,l, р=0,01) Следовательно, в Выборкё~^СРМЖ наблюдаются как сходные с

t J „ , ~ * i

полученными при исследовании выборки РЯ.-характеристйки . (уменьшение риска при

I 1 .i'tV'.-i N-- : чг'„

генотипе 203G/A), так и отличающиеся (увеличение риска при^генотипе E1038G)

Суммарные данные по исследованным -. выббркам представлены в таблЗ Из

| f , - - К

приведенных результатов следует совпадецие генотипов,4 модифицирующих риск развития двух форм РЯ, как при мутациях, так и б<|з мутаций в гейах BRCA1/2, и отличия в профиле ассоциированных с риском ОНП между РЯ .и^РМЖ для выборок рака различной локализации характерны специфические генотипы риска по ОНП

Отдельные исследования показывают, что увеличенный риск развития РМЖ и РЯ

1ч 1-Н. , ' п I j

может быть связан с различными гедаотипаь^ ^указывая на особенности генотип-фенотипического проявления ОНП [Hughes Dal, 2005] Одно из направлений настоящего исследования заключалось в установлении суммарной картины влияния ОНП

генов BRCA1/2 на риск развития РМЖ и РЯ как прй Мутациях, так и без мутаций в указанных

г ■ im'rji-O' r I, j

генах

„ " . .>. 1. м > |

) I , jK)/ .М'Л'! I I I -> I

1Г ' >, II,

„с '41 и • .

) I И П )l!]f' >Г '

Г< '.¡''•--Л Л], ,

I-

5ч lit, "II , \t ) ' I I

^ I I - " -J vl I ' I

а MU"c.iqj nriiifiO" - , ■ ) l o-i ш i С гГчч) I ■ r i

(, |W ¡Л J'J'J', ' '

Таблица;

Результаты генотипирования по ОНП в выборах больных раком яичников и молочной железы

генотип СРЯ МРЯ МРМЖ СРМЖ 1 1 К 1

^параметры вариант\_ ОН Р ч,% ОН Р ч,% (Ж Р ч,% сж Р 1

с? Б1038Б 52,4 1,4 0,30 54,5 1,5 0,31 46,7 1,1 0,80 28,9 0,6 0,06 44,<•

эз Г" и. Е1038С 33,3 0,8 0,45 39,4 1,0 0,96 48,9 1,5 0,25 58,1 2,1 0,01 38 9

С1038С 14,3 0,8 0,69 6,1 0,3 0,13 4,4 0,2 0,06 12,2 0,7 0,42 16 7

203С/С 57,1 1,2 0,66 63,6 1,5 0,29 43,9 0,7 0,31 66,3 1,6 0,09 53,2 |

Л С 203С/А 28,6 0,5 0,03 24,3 0,4 0,04 53,7 1,5 0,29 26,1 0,5 0,02 44,0

203А/А 14,3 5,9 0,01 12,1 4,9 0,05 2,4 1,1 0,91 7,6 2,8 0,12 28

N372N 53,6 0,7 0,30 68,8 1,4 0,45 67,4 1,3 0,49 57,4 0,8 0,56 61,5

N37211 40,5 1,3 0,37 31,2 0,9 0,78 27,9 0,8 0,47 38,3 1,2 0,56 33,9

Н372Н 5,9 1,3 0,75 0 0,7 0,72 4,7 1,0 0,99 4,3 0,9 1,00 4,6

1 чечания Ч — частота, жирным шрифтом выделены статистически достоверные значения

На рис.4 продемонстрированы полученные для каждой исследованной выборки генотипы риска: для выборок ВЯСА-ассоциированного и спорадического РЯ генотип, увеличивающий риск развития РЯ - 203А/А. К повышенному риску спорадического РМЖ приводит генотип ЕЮ380.

СРЯ МРЯ МРМЖ СРМЖ

Рис.4. Генотипы риска для различных выборок: спорадического рака яичников (СРЯ), ВЯСА1-ассоциированного рака яичников (МРЯ), ВЛСА1 -ассоциированного рака молочной железы (МРМЖ) и спорадического рака молочной железы (СРМЖ).

Генотипы по исследованным ОНП не влияли на риск развития РМЖ при мутациях в гене ВЯСА1, т.е. присутствие мутации в этом гене не требует дополнительных генетических воздействий для возникновения рака молочной железы. Риск рака яичников при мутациях в гене ВЯСА1, напротив, может модифицироваться в присутствии низкопенетрантного аллеля.

Поскольку гомозиготный генотип 203А/А увеличивает риск развития РЯ, следовательно, аллель 203А является аллелем риска. В таком случае, логично было бы ожидать, что гетерозиготный генотип 2030/А, имеющий в своем составе один аллель 203А, также должен быть ассоциирован с увеличенным риском РЯ. Однако мы наблюдаем противоположный эффект: генотип 2030/А у здоровых индивидуумов встречается достоверно чаще. Мы предположили, что наблюдаемые противоречия могут быть связаны с генетическим взаимодействием генотипов по разным вариантам. Для проверки этой гипотезы провели сравнение частот комбинаций генотипов в объединенной выборке РЯ с контролем (табл.3). Было найдено, что генотип 2030/А в комбинации с генотипом Е1038Е в выборке РЯ встречался достоверно реже (011=0,5; р=0,04). Поскольку генотип 2030/А при РЯ встречался реже по сравнению с контролем также в сочетании с генотипом N37214

(01^=0,5, р=0,03), можно было предположить влияние на риск сочетания трех указанных генотипов Для проверки этого предположения были изучены частоты комбинаций генотипов по трем полиморфизмам Было найдено, что генотип 2030/А- Е1038Е в выборке РЯ встречался реже по сравнению с контролем только в присутствии генотипа N37211 То есть, комбинация генотипов по вариантам ОНП - Е1038Е-2030/А-Ы372Н - связана с пониженным риском РЯ и встречается реже, чем 203С/А- Е1038Е (СЖ=0,2, р=0,04) В то же время, сочетание генотипов 2030/А-№72К в присутствии генотипа 010380 встречалось реже при РЯ по сравнению с контролем, причем отношение шансов было в пять раз ниже (011=0,1, р=0,02), чем отношение шансов только при 2030/А-Ю72М (011=0,5, р=0,03)

Таблица 4.

Значения ОЯ при сочетании генотипов в объединенной выборке больных РЯ

Е10380-203С>А

ЕЮ380— 2аюю Р 2030/А Р 203А/А Р

Е1038Е 2,0 0,02 0,5 0,04 6,8 0,04

Е1038С 0,7 0,26 0,9 0,81 2,9 0,18

тозю 0,8 0,67 0,3 0,07 2,8 0,09

2030А-Ю72Н

---_^ 2030А 1М372Н ----__ 202в/а Р 203 С/А Р 203А/А Р

№72Ы 0,9 0,66 0,5 0,03 5,6 0,0003

№72Н 1,7 0,09 0,5 0,13 - -

Н372Н 0,7 0,66 0,9 0,96 - -

ЕЮ380-Ю72Н

—N37211 ЕЮ380— №72Ы Р Ы372Н Р Н372Н Р

Е1038Е 1,3 0,40 1,2 0,65 2,8 0,35

ЕЮ380 0,8 0,44 1,3 0,56 0,3 0,07

010380 0,6 0,25 0,8 0,66 0,8 0,60

Примечания жирным шрифтом отмечены достоверно значимые значения (Ж

При анализе влияния на увеличенный риск РЯ при 203А/А других генотипов, была установлена повышенная по отношению к контролю частота сочетания генотипов Е1038Е-203А/А-Ю72Ы (ОЙ=б,8, р=0,04) При изучении сочетания генотипа 203А/А с другими генотипами по изученным ОНП достоверных отличий от контроля не наблюдали, что может свидетельствовать о связи с риском развития РЯ генотипа 203А/А только в составе сочетания Е1038Е-203А/А-Ю72Ы

Полученные при анализе сочетаний генотипов по исследованным ОНП результаты объясняют причины противоречия в разнонаправленном действии на риск развития РЯ генотипов одного ОНП 203 й/А и 203А/А Оно связано с их влиянием в составе разных сочетаний генотипов Если генотип ЮЗй/А ассоциирован с уменьшением риска развития РЯ

в присутствии E1038E-N372H или G1038G-N372N, то генотип 203А/А приводит к возрастанию риска развития РЯ в присутствии N372N- Е1038Е

При сравнении частот сочетаний генотипов в выборке СРМЖ с контролем установили, что уменьшенный риск развития рака связан с теми же сочетаниями генотипов, что наблюдались в выборке РЯ, «вырожденными» по одному варианту E1038E-203G/A (OR=0,1, р=0,0001) и G1038G-N372N (OR=0,5, р=0,02) Генотип повышенного риска E1038G в гене BRCA1 оказался связанным с увеличенным риском только в присутствии генотипа N372H в гене BRCA2 (OR=2,l, р=0,04)

Отличие частот сочетаний некоторых генотипов при раке яичников или молочной железы от соответствующих частот в контроле могло быть связано с их неслучайными ассоциациями Таблицы сопряженности генотипов 3x3 могли быть проверены на независимость с использованием критерия %2 Однако при соответствующей статистической обработке во всех таблицах было выявлено наличие значений ожидаемых частот меньше 5 При этих условиях х2 неустойчив [Реброва О Ю, 2003] и получаемые результаты сложно интерпретировать В связи с этим, проверку независимости распределений генотипов по парам ОНП провели, объединяя часть строк и столбцов В контрольной выборке ассоциация была найдена только для генотипов по ОНП 203G>A и N372H (х2 = 4,97, р = 0,03) Поскольку указанные полиморфизмы находятся в гене BRCA2, полученный результат мог свидетельствовать о неравновесии по сцеплению между некоторыми вариантами Оценка частоты генотипов N372N-203G/G в предположении их случайных сочетаний показала, что наблюдаемая частота ниже, чем ожидаемая при случайном сочетании, в то время как частота генотипов, включающих 203А при N372N - выше Во всех изученных выборках гомозиготный генотип 203А/А встречался только в сочетании с генотипом N372N Среди всех 353 исследованных генотипов был зафиксирован только один явный случай совместного нахождения на одной хромосоме вариантов 203А и 372Н То есть, эти данные указывают на нахождение вариантов 203А и N372, как правило, на одной хромосоме Полученный нами результат коррелирует с данными других авторов Так, в исследовании [Hughes D J, 2005] оценка неравновесия по сцеплению показала, что аллели 203А и 372Н находятся в отрицательном неравновесии по сцеплению, и, следовательно, в геноме присутствуют в основном на разных хромосомах Следовательно, выявленная при анализе частот сочетаний генотипов в контроле ассоциация отражает, видимо, преимущественное нахождение N372 в составе одного гаплотипа с 203А, которое снижает, по сравнению с ожидаемым при случайном комбинировании, частоту сочетаний N372-203G Оценка ожидаемых частот N372-203G в предположении полного неравновесия по сцеплению N372 и 203А приводит также к более высокому, чем наблюдается в эксперименте, значению

Аналогичные выводы стедуют из результатов расчетов в соответствие с подходом, приведенном Фогелем и Мотульским [Фогель Ф с соавт, 1989]

Наиболее отчетливо описанные гаплотипические особенности проявились в выборке рака яичников В этом случае распределение частот генотипов по полиморфизму 2030>А при статистически значимо отличается от ожидаемого при случайном сочетании этих

генотипов (р < 0,01), при наибольшей значимости отличий наблюдаемой и ожидаемой частоты №72И-203А/А Такой же результат был получен для распределения частот генотипов по полиморфизму 2030>А при К372Н (р < 0,01), за исключением направления различий если для Ы372И-203А/А наблюдаемая частота была выше ожидаемой (16 и 9, соответственно), то для №72Н-203А/А ситуация была обратной (0 и 6, соответственно) Как следует из рассмотренных результатов, связь генотипа 203А/А с увеличенным риском рака яичников осуществляется в сочетании с генотипом N372N Это обстоятельство обусловлено, по крайней мере, в значительной степени, наличием гаплотипа N372-203А

Сочетание генотипов Е1038Е и 203в/А существенно реже встречалось в выборке СРМЖ по сравнению с контролем (011=0,1, р=0,0001) При анализе ассоциаций генотипа 203 в/А с другими генотипами по исследованным полиморфизмам, таковая была найдена только при спорадическом раке молочной железы с генотипом Е1038Е (х2 =6,87, р=0,009) При раке яичников ассоциации указанных генотипов обнаружено не было (р=0,29), хотя при данной локализации рака генотип 2030/А также, как при СМРЖ, был ассоциирован с пониженным риском заболевания По-видимому, это объясняется рассмотренным выше участием в характеристиках риска генотипа по третьему из исследованных ОНП, которое отсутствует при СМРЖ

При СМРЖ была обнаружена ассоциация гомозиготного генотипа по редкому варианту 010380 и генотипа №721М (р=0,005), встречавшаяся реже при СРМЖ, чем в контроле (011=0,2, р=0,021) Подобное снижение частоты встречаемости данной комбинации генотипов мы уже наблюдали на выборке РЯ, что свидетельствует о том, что индивидуумы с такой комбинацией генотипов имеют меньший риск развития как РЯ, так и СРМЖ Влияние генотипов по третьему из изученных ОНП - 203в/А - при СМРЖ выявлено не было

При СМРЖ повышенную по отношению к контролю частоту имел только генотип, включающий ЕЮ380 и №72Н (011=2,1, р=0,04) При этом частота генотипа ЕЮ380 -№72И в выборке СРМЖ не отличалась от частоты в контрольной выборке (р=0,11) Это может свидетельствовать о связи с риском СМРЖ аллеля 10380 гена ВЯСА1 в присутствии в геноме аллеля 372Н гена ВЯСА2 В пользу такого объяснения свидетельствует также более низкая, чем в контроле, частота гомозиготного генотипа 010380 в присутствии N37214 при СРМЖ Анализ частот генотипов, включающих одновременно хотя бы один аллельЮ380 в

17

гене BRCA1 и вариант 372Н в гене BRCA2, показал достоверную ассоциацию этих вариантов среди пациентов с раком молочной железы (р=0,033) и ее отсутствие в контрольной выборке (р=0,9б) Это указывает на неслучайность одновременного присутствия с увеличенной частотой рассматриваемых вариантов генов BRCA1 и BRCA2 в геноме пациентов при СРМЖ Суммарная частота всех генотипов, включающих аллели 1038G и 372Н при СРМЖ была выше, чем в контроле (OR=l ,9, р=0,039)

Проведенный анализ демонстрирует перспективность исследования сопряженности генотипов для выявления сочетаний, связанных с риском заболевания Вместе с тем, для эффективной статистической обработки данных в этом направлении желателен больший, чем в настоящем исследовании, объем выборок Тем не менее, полученные результаты свидетельствуют в пользу наличия ассоциаций генотипов, связанных с модификацией риска, среди больных

Многие авторы проводимых за последнее время исследований предполагают, что распространенные аллели низкой пенетрантности, индивидуальный эффект которых невелик, а иногда и не детектируем даже в обширных исследованиях, при сочетании с другими аллелями низкой пенетрантности существенно увеличивают риск развития рака [Nathanson KL et al, 2001, Antomou АС et al, 2002, Johnson N et al, 2007] Результаты генетических исследований предполагают, что в основе семейного РМЖ лежит полигенная модель, заключающаяся в ассоциированном воздействии на риск развития этого онкологического заболевания полиморфных вариантов ряда генов, чьи белковые продукты взаимодействуют друг с другом, выполняя взаимосвязанные функции Полиморфные варианты в генах-супрессорах опухоли BRCA1/2 являются кандидатами на роль низкопенетрантных аллелей риска РЯ и РМЖ [Janezic S А et al, 1999, Spurdle AB et al, 2002, Gmolhac S M et al, 2003, Chenevix-Trench G et al, 2007, Johnson N et al, 2007, Baynes С et al, 2007] Действительно, в нашем исследовании мы наблюдали существенное изменение риска развития РЯ и спорадического РМЖ при ассоциации распространенных вариантов двух генов, BRCA1 и BRCA2, белковые продукты которых совместно участвуют в процессе репарации повреждения ДНК, образуя белковые комплексы, что согласуется с нашими данными о совместном влиянии на риск генотипов по вариантам двух генов

выводы

1 Определена частота мутаций в генах ВЯСА1/2 в выборке случаев рака яичников, сформированной без учета семейной истории заболевания, среди российских больных, составившая 16,8% (95% ДИ 10,7-24,9%) Установленное значение относится к наиболее высоким среди подобных выборок из других европейских популяций Большинство больных с мутацией (88%) имели отягощенный семейный анамнез РЯ и/или РМЖ

2 Наибольшее число больных РЯ с мутациями имели мутацию в гене ИКСА 1 - 88% (15/17) В спектре преобладала мутация 5382тзС (9/15, 60%) Остальную часть спектра составили 4 другие мутации - С6Ю, 185ёе1АО, 4154с1е1А, 2080<1е1А

3 Частоты генотипов по трем ОНП в генах ВКСА1/2 в выборках РЯ с мутациями и без мутаций в указанных генах не отличались В объединенной выборке рака яичников показана ассоциация генотипа 203А/А в гене ВКСА2 с увеличенным риском развития рака яичников (011=5,8, р=0,003,95% ДИ 1,6-19)

4 В выборке больных РМЖ с мутацией в гене ВЯСА1 частоты генотипов по исследованным ОНП не отличались от контрольной группы Среди больных спорадическим РМЖ найдена ассоциация с увеличенным риском генотипа ЕЮ380 в гене ВКСА1 (011=2,1, р=0,011,95% ДИ 1,2-4)

5 Частота генотипа 2030/А была снижена относительно контроля как в случае рака яичников (011=0,5, р=0,008, 95% ДИ 0,3 - 0,9), так и при спорадическом раке молочной железы (011=2,1, р=0,011,95% ДИ 0,2 -0,8)

6 При анализе генотипов, образованных сочетаниями вариантов по всем изученным ОНП, установлено, что модифицирующее влияние на риск рака яичников генотипов 2030/А и 203А/А осуществляется в составе разных генотипов по другим ОНП

Практические рекомендации

1 Установленная высокая частота мутаций в генах В КС А1 и ВЯСА2 и наличие среди пациентов с обнаруженной мутацией в указанных генах индивидуумов без семейной истории заболевания РЯ/РМЖ позволяет рекомендовать молскулярно-генетичсскос исследование всех больных РЯ на наличие мутаций в указанных генах.

2 Учитывая, что доля больных РЯ с мутациями в гене В КС А 2 невелика, оправданно первоначальное молекулярно-генетическое исследование гена ВКСА1

3 Установлен узкий спектр мутаций в гене ВЯСА1 у российских больных, включающий пять основных мутаций (53821ПбС, С6Ш, 185с1е1АО, 4154<1е1А, 208(Ме1А), определение которых при проведении скрининга обеспечит выявление группы риска с наследственной предрасположенностью к РЯ

4 Для формирования групп риска РЯ при выявлении мутации в указанных генах у пробанда рекомендуется исследование его родственников на наличие данной мутации Динамическое наблюдение людей с мутациями обеспечит выявление рака яичников на ранней стадии и, следовательно, эффективное лечение

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1 Карпухин, А В Молекулярные особенности генов-супрессоров злокачественной трансформации клеток, связанные с возникновением и локализацией частых типов рака / Карпухин, А В , Поспехова Н И, Захаров С Ф, Музаффарова Т А , Цуканов А С Смирнова Т.Ю , Логинова А Н, Любченко Л Н, Сачков И Ю , Кузьминов А М, Гарькавцева Р Ф, Гинтер Е К // Материалы VI Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток - Звенигород - 2005,

2 Pospekhova NI BRCA2 variant associated with modification of ovarian cancer occurrence among Russian earners with BRCA1 mutations 1 Pospekhova NI, Smirnova T.Y., Lyubchenko LN, Garkavtseva RF, Ginter EK., Karpukhin AV// Eur J Hum Gen - 2006- V14-Suppl 1 - P 209

3 Smirnova T Y Analysis of BRCA1 and BRCA2 genes among unselected ovarian cancer cases m Russia / Smirnova T.Y , Pospekhova NI, Lyubchenko LN , Garkavtseva R F, Ginter E К, Karpukhin A V // Eur J Hum Gen - 2006 - V 14 - Suppl 1 - P 225

4 Поспехова НИ Исследование взаимосвязи генотипа и фенотипа при мутациях в гене BRCA1 / Поспехова Н И, Логинова А Н, Смирнова Т.Ю, Любченко Л Н , Гарькавцева Р Ф, Гинтер Е К, Карпухин А В // Медицинская генетика - 2005 -Т 4 - № 6 - С 254

5 Карпухин А В Молекулярная диагностика моногенных форм рака / Карпухин А В, Поспехова Н И , Музаффарова Т А, Захаров С Ф , Смирнова Т.Ю , Цуканов А С, Логинова А.Н, Любченко Л Н, Гончарова Е А, Апанович П В , Сачков И Ю , Шахматов Д Г, Кузьминов А М, Щелыгин Ю А, Гарькавцева Р Ф , Гинтер Е К // Медицинская генетика - 2006 - Т 5 - Прил 2 - С 2-7

6 Смирнова Т Ю Наследственная предрасположенность к раку яичников / Смирнова Т. Ю, Карпухин А В // Медицинская генетика - 2007 - Т 6 - № 5 -С 9-13

7 Smirnova Т Y Different profiles of BRCAI and BRCA2 SNPs association with breast/ovarian cancer nsk among sporadic cases and BRCAI mutation earners / Smirnova T.Y, Pospekhova NI, Loginova A N , Lubchenko L N, Garkavtseva R F, Ginter E К , Karpukhin A V // Eur J Hum Gen - 2007 - V 15 - Suppl 1 - P 166

8 Смирнова ТЮ Высокая частота мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 при раке яичников / Смирнова Т.Ю., Поспехова Н И , Любченко J1 Н, Тюляндин С А, Гарькавцева Р Ф, Гинтер Е К, Карпухин А В // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины -2007-Т 144-№7-С 93-95

9 Smimova Т Y The association of BRCAI and BRCA2 SNP with cancer localization/ Smirnova T.Y., Pospekhova NI, Logmova A N, Lubchenko L N, Ginter E К, Karpukhm A V // International Society for Applied Biological Sciences - 2007 - P 173

10 Смирнова ТЮ. Рак молочной железы и яичников Роль наследственных факторов/ Смирнова Т.Ю., Любченко Л Н, Поспехова Н И, Портной С М, Жорданиа К И , Гарькавцева РФ, Карпухин А В //Опухоли женской репродуктивной системы: маммология, онкогинекология - 2007 - №4 -С 90-96

11 Smirnova ТУ Complex BRCAI and BRCA2 combinations are associated with breast and ovarian cancer risk modification / Smimova T.Y., Pospekhova N1, Loginova A N, Lubchenko L N, Garkavtseva R F , Ginter E К, Karpukhm A V // Eur J Hum Gen - 2008 -V 16 - Suppl 2 - P 204

СОКРАЩЕНИЯ

ГУ МГНЦ РАМН - Государственное Учреждение Медико-Генетический Научный Центр

Российской Академии Медицинских Наук

ДИ - доверительный интервал

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

МРМЖ - рак молочной железы с мутациями в гене ВЯСЛУ

МРЯ - рак яичников с мутациями в гене BRCA1

ОНП - однонуклеотидный полиморфизм

П н - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РМЖ - рак молочной железы

РЯ - рак яичников

СРМЖ - спорадический рак молочной железы СРЯ - спорадический рак яичников

Подписано в печать 25 08 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 656 Тираж 100экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 www auioreferat ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Смирнова, Татьяна Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Особенности канцерогенеза при наследственной форме рака яичников

Ген ВЯСА1 и функции кодируемого им белка ВЯСА

Ген ВЯСА2 и функции кодируемого им белка ВЯСА

Клинические особенности наследственного рака яичников

Исследование наследственной формы рака яичников

Корреляция генотип-фенотип при мутациях в гене ВЯСА и ВКСА

Однонуклеотидные полиморфизмы в генах В КС А1 и ВКСА

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пациенты

Анализ первичной структуры генов ВКСА1 и ВЯСА

Выделение геномной ДНК

Полимеразная цепная реакция

Конформационно - чувствительный гель электрофорез

Автоматическое секвенирование

Статистический анализ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Частота мутаций в генах ВЯСА1 и ВЯСА2 при раке яичников

Спектр мутаций в гене ВЯСА

Анализ семейной истории больных раком яичников с мутациями в генах ВЯСА1 и ВЯСА

Исследование однонуклеотидных полиморфизмов

Изучение ОНП в выборке спорадического рака яичников

Изучение ОНП в выборке ВЯСА-ассоциированного рака яичников

Изучение ОНП в выборке ВЯСА-ассоциированного рака молочной железы

Изучение ОНП в выборке спорадического рака молочной железы

Исследование влияния на риск сочетаний генотипов по ОНП

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическое исследование наследственной предрасположенности к раку яичников"

Актуальность темы. Проблема злокачественных новообразований яичников весьма актуальна вследствие высокой летальности и неуклонного роста их частоты. Занимая 3-е место по заболеваемости среди злокачественных опухолей женских половых органов, рак яичников (РЯ) является лидирующей причиной смертельных исходов в онкогинекологии [Давыдов М.И. с соавт., 2007]. Эпидемиологические исследования показывают, что за последние 10 лет отмечен заметный прирост заболеваемости опухолями яичников в России - на 8,5% [Жорданиа, К.И., 2004]. Основной причиной высокой смертности больных РЯ заключается в бессимптомном течении заболевания на ранних стадиях, в результате чего около 80% случаев РЯ диагностируется на III-IV стадии болезни, когда эффективность лечения крайне низка [Jacobs I.J. et al., 2004; Ozols R.F. et al., 2005]. Поэтому особенно актуальным представляется изучение возможности ранней диагностики РЯ на начальных этапах развития заболевания.

Одним из эффективных подходов, способствующих раннему выявлению РЯ, является молекулярно-генетическое исследование его наследственной формы, которая в подавляющем числе случаев развивается вследствие наследуемых мутаций в генах-супрессорах опухоли BRCA1 и BRCA2. Для определения вклада наследственной формы РЯ в общую структуру заболевания проводится скрининг выборки больных РЯ, сформированной без учета семейной истории заболевания, на наличие мутаций в генах BRCA1 и BRCA2. В выборках больных РЯ из разных популяций обнаруживают различную частоту мутаций -от 3% до 40%. В России подобные исследования ранее проведены не были. Восполнение этого пробела внесет существенный вклад в пониманиеособенностей мутационных процессов в разных популяциях. Кроме того, определение характеристик мутаций в генах ВЯСА1 и ВКСА2 в выборке российских больных РЯ необходимо для разработки практической диагностики наследственной предрасположенности к данному заболеванию. Выявление наследуемых мутаций, основанное на молекулярно-генетических данных об особенностях характеристик мутаций в генах ВЯСА1 и ВЯСА2 в России, обеспечит объективный критерий для формирования групп повышенного риска развития РЯ.

Поскольку мутации в генах ВЯСА1 и ВЯСА2 связаны с повышенным риском развития не только РЯ, но и рака молочной железы (РМЖ), весьма актуальным является изучение генетических причин модификации риска возникновения рака разной локализации. Механизмом такой модификации может быть влияние аллелей умеренного риска рака той или иной локализации. Полиморфные варианты в генах ВЯСА1 и ВЯСА2, мутации в которых обусловливают высокий риск развития РЯ и РМЖ, могут выступать в качестве таких аллелей [ВаупеБ С. е1 а1., 2007]. Несмотря на наличие ряда работ в этом направлении, исследование данного вопроса нельзя признать достаточным. В частности, отсутствует сравнительный анализ влияния на риск вариантов в генах ВЯСА1/2 при спорадических формах рака и при мутациях в указанных генах. Практически не изучено значение для модификации риска генетического взаимодействия ОНП в генах ВКСА1 и ВКСА2. Выявление корреляции генотип-фенотип существенно для углубления понимания молекулярных механизмов действия генов-супрессоров в злокачественной трансформации клеток и важнодля разработки способов прогнозирования риска возникновения рака определенной локализации.

Выявление наследственной предрасположенности к РЯ на основе ДНК-диагностики обеспечит базу для развития профилактики этого заболевания на принципиально новой основе.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯЦелью настоящей работы явился молекулярно-гепетическое исследование наследственной предрасположенности к РЯ в связи с особенностями первичной структуры генов BRCA1 и BRCA2.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ1. Определить характеристики мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 в выборке российских больных РЯ, сформированной без учета семейной истории заболевания.

2. Изучить частоты генотипов по однонуклеотидным полиморфизмам в генах BRCA1 и BRCA2 в выборке больных РЯ и в контрольной выборке.

3. Провести сравнительный анализ частот генотипов по однонуклеотидным полиморфизмам генов BRCA1 и BRCA2 у больных с разной локализацией рака: яичников и молочной железы.

Научная новизна.

Впервые на российской выборке изучен вклад наследственной формы, связанной с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2, в общую структуру заболеваемости РЯ. Выявленная частота мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 относится к наиболее высоким среди изученных аналогичных выборок больныхв европейских странах. Основное число мутаций у российских больных РЯ наблюдается в гене ВЯСА1. Для выявления генетических факторов модификации риска рака различной локализации впервые проведен сравнительный анализ частот генотипов по однонуклеотидным полиморфизмам в генах ВЯСА1 и ВЯСА2 в четырех выборках больных: РЯ с мутациями и без мутаций в гене ВЯСА1, РМЖ с мутациями и без мутаций в гене ВЯСА1. Впервые показано, что как при мутациях, так и без мутаций в гене ВЯСА1 одни и те же аллели ассоциированы с модификацией риска РЯ. Аллели, ассоциированные с повышенным риском, различны для РЯ и спорадического РМЖ. Изученные однонуклеотидные полиморфизмы не влияют на риск РМЖ при мутациях в гене ВЯСА1, что может указывать па отсутствие связи возникновения рака этой локализации с иными, кроме мутации, вариантами в генах ВЯСА1 и ВЯСА2. Научно-практическая значимость работы.

Установленная в ходе данной работы высокая частота мутаций в генах ВЯСА1 и ВВ.СА2 указывает на важное практическое значение ДНК-диагностики наследственной предрасположенности к РЯ. Полученные результаты о преимущественной связи наследственной формы РЯ в России с мутациями в гене ВЛСА] и характеристиках спектра, включающего несколько повторяющихся мутаций с преобладанием одной из них - 5382тБС, определяют возможность проведения скрининговых исследований на предрасположенность к данному заболеванию для формирования групп повышенного риска. Выявленные различия генотипов повышенного риска РЯ и РМЖ создают предпосылки для разработки способа идентификации предрасположенности квозникновению рака определенной локализации при наличии мутации в гене ВЯСА1.

Положения, выносимые на защиту:1. Среди российских больных РЯ установлена частота индивидуумов с мутацией в гене ВЯСА1 или ВЯСА2 (16,8%, 95%ДИ 10,7-24,9%). Обнаруженные мутации преимущественно локализованы в гене ВКСА1, с преобладанием в спектре мутации 5382тзС.

2. Генотипы по однонуклеотидным полиморфизмам в генах ВЯСА1 и ВЯСА2, ассоциированные с модификацией риска, одни и те же при РЯ с мутациями и без мутаций в указанных генах.

3. Генотипы, ассоциированные с увеличенным риском развития РЯ и спорадического РМЖ, различны. Среди больных РМЖ с мутацией в гене ВЯСА1 генотипы по исследованным ОНП не ассоциированы с модификацией риска.

4. Сниженный риск развития и РЯ, и спорадического РМЖ связан с одним и тем же генотипом.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Смирнова, Татьяна Юрьевна

выводы

1. Определена частота мутаций в генах ВЯСА1 и ВЯСА2 в выборке случаев рака яичников, сформированной без учета семейной истории заболевания, среди российских больных, составившая 16,8% (95% ДИ 10,7-24,9%). Установленное значение относится к наиболее высоким среди подобных выборок из других европейских популяций. Большинство больных с мутацией (88%) имели отягощенный семейный анамнез РЯ и/или РМЖ.

2. Наибольшее число больных РЯ с мутациями имели мутацию в гене ВЯСА1 -88% (15/17). В спектре преобладала мутация 5382тзС (9/15, 60%). Остальную часть спектра составили 4 другие мутации - С6Ю, 185с1е1АО, 4154с1с1А, 2080ёе1А.

3. Частоты генотипов по трем ОНП в генах ВЯСА1 и ВЯСА2 в выборках РЯ с мутациями и без мутаций в указанных генах не отличались. В объединенной выборке рака яичников показана ассоциация генотипа 203А/А в гене ВЯСА2 с увеличенным риском развития рака яичников (011=5,8; р=0,003; 95% ДИ: 1,6-49).

4. В выборке больных РМЖ с мутацией в гене ВЯСА1 частоты генотипов по исследованным ОНП не отличались от контрольной группы. Среди больных спорадическим РМЖ найдена ассоциация с увеличенным риском генотипа Е10380 в гене ВЯСА1 (011=2,1; р=0,011; 95% ДИ 1,2-4).

5. Частота генотипа 203 С/А была снижена относительно контроля как в случае рака яичников (011=0,5; р=Ю,008; 95% ДИ 0,3+0,9), так и при спорадическом раке молочной железы (011=0,5; р=0,02; 95% ДИ 0,2 -0,8).

6. При анализе генотипов, образованных сочетаниями вариантов по всем изученным ОНП, установлено, что модифицирующее влияние на риск рака яичников генотипов 2030/А и 203А/А осуществляется в составе разных генотипов по другим ОНП.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Установленная высокая частота мутаций в генах ВЯСА1 и ВЯСА2 и наличие среди пациентов с обнаруженной мутацией в указанных генах индивидуумов без семейной истории заболевания РЯ/РМЖ позволяет рекомендовать молекулярно—генетическое исследование всех больных РЯ на наличие мутаций в указанных генах.

2. Учитывая, что доля больных РЯ с мутациями в гене ВЯСА2 невелика, оправданно первоначальное молекулярно-генетическое исследование гена ВЯСА1.

3. Установлен узкий спектр мутаций в гене ВКСА1 у российских больных, включающий пять основных мутаций (5382шзС; С6Ю, 185с1е1АО, 4154с1е1А, 2080с1е1А), определение которых при проведении скрининга обеспечит выявление группы риска с наследственной предрасположенностью к РЯ.

4. Для формирования групп риска РЯ при выявлении мутации в указанных генах у пробанда рекомендуется исследование его родственников на наличие данной мутации. Динамическое наблюдение людей с мутациями обеспечит выявление рака яичников на ранней стадии и, следовательно, эффективное лечение.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Смирнова, Татьяна Юрьевна, Москва

1. Давыдов, М.И. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2005 г./ М.И. Давыдов, Е.М. Аксель// Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. 2007. - Т. 18. - № 2. - Прил. 1. С.58.

2. Животовский, JI.A. Популяционная биометрия / JI.A. Животовский. Москва. -Наука.- 1991.-271 с.

3. Жорданиа, К.И. Злокачественные новообразования яичников / К.И. Жорданиа// Энциклопедия клинической онкологии. Москва. - 2004. - С. 427-442.

4. Карпухин, A.B. Частоты однонуклеотидных полиморфизмов и мутаций в гене BRCA1 при наследственно обусловленном раке молочной железы и яичников/ A.B. Карпухин, Н.И. Поспехова, JI.H. Любченко, и др.// Докл. А.II. 2002. -Т.383. - №5. - С. 706-709.

5. Копнин, Б.П. Молекулярные механизмы канцерогенеза/ Б.П. Копнин // Энциклопедия клинической онкологии. / Под ред. М.И. Давыдова. Москва. -РЛС - Пресс. - 2004. - С.34-53.

6. Копнин, Б.П. Нестабильность генома и онкогенез/ Б.П. Копнин// Молекулярная биология. 2007. - Т.41. - №2. - С.369-3 80.

7. Паниченко, И.В. Микроделеции в хромосомных локусах опухолей яичников: сопоставление с клинико-морфологическими факторами прогноза/ И.В. Паниченко, И.Б. Збровская, В.Н. Богатырев и др.// Российский онкологический журнал. 2006. - №2. - С.26-31.

8. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA/ О.Ю. Реброва. Москва.-МедиаСфера. - 2002. - 312 с.

9. Фогель Ф. Генетика человека. В трех томах. Перевод с англ./ Ф. Фогель, А. Мотульски.- Москва.- Мир.-1989.- 312 с.

10. M.Antoniou, A.C. A comprehensive model for familial breast cancer incorporating BRCA1, BRCA2 and other genes/ A.C. Antoniou, P.D.P. Pharoah, G. McMullan, et al. // British Journal of Cancer. 2002. - V.86. - P.76-83.

11. Armstrong, K. Hormone replacement therapy and life expectancy after prophylactic oophorectomy in women with BRCA1/2 mutations: a decision analysis/ K. Armstrong, J.S. Schwartz, T. Randall, et al. // J. Clin. Oncol.- 2004. V.22. -P.1045-1054.

12. Auranen, A. BRCA2 Arg372His polymorphism and epithelial ovarian cancer risk/ A. Auranen, A.B. Spurdle, X. Chen et al. // Int. J. Cancer. 2003. - V.103. - №3.-P.427-430.

13. Baynes, C. Common variants in the ATM, BRCA1, BRCA2, CHEK2 and TP53 cancer susceptibility genes are unlikely to increase breast cancer risk/ C. Baynes, C.S. Healey, K.A. Pooley et al.// Breast Cancer Res. 2007. - V.9.- № 2.

14. Baldeyron, C. A single mutated BRCA1 allele leads to impaired fidelity of double strand break end-joining/ C. Baldeyron, E. Jacquemin, J.Smith et al. // Oncogene. -2002.-№21.-P. 1401-1410.

15. Bewtra, C. Hereditary ovarian cancer/ C. Bewtra, P. Watson, T. Conway et al. // Int. J. Gynecol. Pathol.-1992.-V.-ll,- P.180- 187.

16. Boulton, S.J. Cellular functions of the BRCA tumour-suppressor proteins./ S.J. Boulton.- Biochem Soc Trans. 2006.- V.34.- P.633-645.

17. Boyd, J. Specific keynote: hereditary ovarian cancer: what we know/ J. Boyd // Gynecol. Oncol.- 2003.-V.-88.-P.8-10.

18. Boyd, J. Clinicopathologic features of BRCA-linked and sporadic ovarian cancer/ J. Boyd, Y. Sonoda, M.G. Federici et al. //JAMA.- 2001.-V.283.-P.2260 -2265.

19. Breast Cancer Information Core (BIC). Режим доступа: http://www.nhgri.nih.gov/Intramuralresearch/Labtransfer/Bic/

20. Cass, I. Improved survival in women with BRCA-associated ovarian carcinoma/ I. Cass, R.L. Baldwin, T. Varkey, R. Moslehi et al. // Cancer.- 2003.- V. 97.-P. 21272179.

21. Chai, Y.L. The second BRCT domain of BRCA1 proteins interacts with p53 and stimulates transcription from the p21WAFl/CIPl promoter/ Y.L. Chai, J. Cui, N. Shao et al. // Oncogene.- 1999.- V.18.- №1,- P.263-268.

22. Chen, P.L. The BRC repeats in BRCA2 are critical for RAD51 binding and resistance to methyl methanesulfonate treatment./ P.L. Chen, C.F. Chen, Y. Chen// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998,- V.95.-№9.- P.5287-5292.

23. Dang, C.V. Function of the c-Myc oncogenic transcription factor/ C.V. Dang, L.M. Resar, E. Emison et al.// Exp. Cel.l Res. 1999.- V.253.- №1.- P.63-77.

24. David, B.Y. Effcct of BRCA mutations on the length of survival in epithelial ovarian tumors/ B.Y. David, A. Chetrit, G. Hirsh-Yechezkel et al. // J. Clin. Oncol.- 2002.-V.20.- P.463- 466.

25. Davies, J.Y. Role of BRCA2 in control of the RAD51 recombination and DNA repair protein/ A.A. Davies, J.Y. Masson, M.J. Mcllwraith ct al. // Mo. Cell. 2001 V.7.-№2. P.273-282.

26. Deng, C.X. BRCA1: cell cycle checkpoint, genetic instability, DNA damage response and cancer evolution/ C.X. Deng// Nucleic Acids Res.-2006.- V.34.-№5. -P.1416-1426.

27. Dunning, A.M. Common BRCA1 variants and susceptibility to breast and ovarian cancer in the general population/ A.M. Dunning, M. Chiano, N.R. Smith et al. // Hum. Mol. Genet. 1997,- V.6.- №2.-P.285-289.

28. Easton, D.F. Genome-wide association study identifies novel breast cancer susceptibility loci/ D.F. Easton, K.A. Poolcy, A.M. Dunning et al.// Nature.- 2007.-V.447.- №7148.-P.1087-1093.

29. Elledge, S.J. The BRCA1 suppressor hypothesis: an explanation for the tissue-specific tumor development in BRCA1 patients./ S.J. Elledge, A. Amon// Cancer Cell. 2002.-V.I.- №2.- P.129-132.

30. Esashi, F. CDK-dependent phosphorylation of BRCA2 as a regulatory mechanism for recombinational repair/ F. Esashi, N. Christ, J. Gannon et al. // Nature.- 2005.-V.434.- №7033.-P.598-604.

31. Ford, D. Genetic heterogeneity and penetrance analysis of the BRCA1 and BRCA2 genes in breast cancer families/ D. Ford, D.F. Easton, M. Stratton et al. // Am. J. Hum. Genet. 1998. - V.62. - P.676-689.

32. Foster, K. Somatic and germline mutations of the BRCA2 gene in sporadic ovarian cancer/ K. Foster, P. Harrington, J. Kerr et al. //Cancer. Res.- 1996.-V.56.-P.3622-3625.

33. Friedman, L.S. The search for BRCA1/ L.S. Friedman, E.A. Ostermeyer, E.D Lynch et al.// Cancer Res.- 1994.- V.54.- №24,- P.6374-6382.

34. Fukasawa K. Centrosome amplification, chromosome instability and cancer development/ K. Fukasawa// Cancer Lett. 2005.- V.230.-№l.-P.6-19.

35. Fuks, F. BRCA2 associates with acetyltransferase activity when bound to P/CAF / F. Fuks, J. Milner, T. Kouzarides// Oncogene. 1998.- V.17.- №19,- P.2531-2534.

36. Garci'a, A. Loss of heterozygosity on chromosome 17q in epithelial ovarian tumors: association with carcinomas with serous differentiation/ A. Garci'a, E. Bussaglia, P. Machin et al. // Int. J. Gynecol. Pathol.- 2000.-V.19.- P. 152 -157.

37. Gayther, S.A. Germline mutations of the BRCA1 gene in breast and ovarian cancer families provide evidence for a genotype-phenotype correlation/ S.A. Gayther, W. Warren, S. Mazoyer et al. // Nature Genet. 1995. - V.l 1. - P.428-433.

38. Gayther, S.A. The contribution of germline BRCA1 and BRCA2 mutations to familial ovarian cancer: no evidence for other ovarian cancer-susceptibility genes/ S.A. Gayther,-P. Russell, P. Harrington et al.// Am J Hum Genet. 1999.- V.65.-№4.- P.1021-1029.

39. Gayther, S.A. Variation of risks of breast and ovarian cancer associated with different germline mutations of the BRCA2 gene/ S.A. Gayther, J. Mangion, P. Russell et al //Nat. Genet. -1997.-V. 15.- P.103-105.

40. Ginolhac, S.M. BRCA1 wild-type allele modifies risk of ovarian cancer in carriers of BRCA1 germ-line mutations/ S.M. Ginolhac, S. Gad, M. Corbex et al. // Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. -2003.- V.12.- P.90-95.

41. Godard, B. Risk factors for familial and sporadic ovarian cancer among French Canadians: a case-control study/ B. Godard, W.D. Foukes, D. Provencher et al.// Am. J. Obstet. Gynecol.- 1998.- V.179.- №2.-P.403-410.

42. Hanahan, D. The hallmarks of cancer/ D. Hanahan, RA. Weinberg // Cell.- 2000,-V.100.-№1P.57-70.

43. Hankinson, S.E. A quantitative assessment of oral contraceptive use and risk of ovarian cancer/ S.E. Hankinson, G.A. Colditz, D.J. Hunter et al.// Obstet Gynecol.-1992,- V.80.-P.708—714.

44. Healey, C.S. A common variant in BRCA2 is associated with both breast cancer risk and prenatal viability/ C.S. Healey, A.M. Dunning, M.D. Teare et al.// Nat. Genet.-2000.- V.26.-№3.-P.362-364.

45. Heintz, A.P. Carcinoma of the ovary/ A.P. Heintz, F. Odicino, P. Maisonneuve et al. J. Epidemiol. Biostat.- 2001.-V.6.-№1.-P.107-138.

46. Holt, J.T. Growth retardation and tumour inhibition by BRCA1/ J.T. Holt, M.E. Thompson, C. Szabo et al.//Nat. Genet.- 1996,- V.12.- P.298-302.

47. Hughes, D.J. Common BRCA2 variants and modification of breast and ovarian cancer risk in BRCA1 mutation earners/ D.J. Hughes, S.M. Ginolhac, I. Coupie et al.// Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.- 2005.- V.14.- №l.-P.265-267.

48. Jacobs, I.J. Progress and challenges in screening for early detection of ovarian cancer/ I.J. Jacobs, U. Menon// Mol. Cell Proteomics.- 2004.- V.3.- №4.-P.355-366.

49. Janezic, S.A. Germline BRCA1 alterations in a population-based series of ovarian cancer cases/ S.A. Janezic, A. Ziogas, L.M. Krumroy et. al. // Hum. Mol. Genet. -1999. -V.8. №5. -P.889-897.

50. Jasin, M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection/ M. Jasin.// Oncogene.- 2002.-V.21 ,-№58.-P.8981-8993.

51. Johannsson, O.T. Survival of BRCA1 breast and ovarian cancer patients: a population-based study from southern Sweden./ O.T. Johannsson, J. Ranstam, A. Borg//H. J. Clin. Oncol. -1998.-V.16.-P. 397-404.

52. Johnson, N. Counting potentially functional variants in BRCA1, BRCA2 and ATM predicts breast cancer susceptibility/ N. Johnson, O. Fletcher, C. Palles et al.// Hum. Mol. Genet.- 2007.-V.16.-№9.-P.1051-1057.

53. Johnson, N.C. BRCA1 zinc RING finger domain disruption alters caspase response in ovarian surface epithelial cells/ N.C. Johnson, P.A. Kruk// Cancer Cell Int. -2002.-V.2.- №1.- P.7.

54. Kauff, N.D. Risk-reducing salpingo-oophorectomy in women with BRCA-1 or BRCA-2 mutation/ N.D. Kauff, J.M. Satagopan, M.E. Robson et al. // N. Engl. Med.-2002.-V.346.-P.1609-1615.

55. Khoo, U.S. Mutational analysis of BRCA1 and BRCA2 genes in Chinese ovarian cancer identifies 6 novel germline mutations/ U.S. Khoo, H.Y. Ngan, A.N. Cheung, et al. //Hum. Mutat.-2000.-Vol.16.-P.88 89.

56. Kim, Y.T. Germline mutations of BRCA1 and BRCA2 in Korean sporadic ovarian carcinoma/ Y.T. Kim, E.J. Nam, B.S. Yoon et al.// Gynecol. Oncol.- 2005. V.99, № 3. - P.585-590.

57. Knudson, A.G. Mutation and cancer: neuroblastoma and pheochromocytoma/ A.G. Knudson, L.C. Strong // Am. J. Hum. Genet. 1972.-V.24.-№5.- P.514-532.

58. Lakhani, S.R. Pathology of ovarian cancers in BRCA1 and BRCA2 carriers/ S.R. Lakhani, S. Manek, F. Penault-Llorca et al. // Clin. Cancer Res.- 2004.- Vol.10.- P. 2473-2481.

59. Lavin, M.F. The complexity of p53 stabilization and activation/ M.F. Lavin, N. Gueven// Cell Death Differ.- 2006.-V.13.-№6.-P.941-950.

60. Levine, D.A. The androgen receptor and genetic susceptibility to ovarian cancer: results from a case series/D.A. Levine, J.Boyd//Cancer Res.-2001 .-V.61.-P.908-911.

61. Lubinski, J. Cancer variation associated with the position of the mutation in the BRCA2 gene/ J. Lubinski, C.M. Phelan, P. Ghadirian et al.// Fam. Cancer.-2004,-V.3.-P.1-10.

62. Majdak, E.J. Prognostic Impact of BRCA1 Pathogenic and BRCA1/BRCA2 Unclassified Variant Mutations in Patients with Ovarian Carcinoma/ E.J. Majdak, J. Debniak et al. // Cancer.- 2005,- Vol. 104.-P. 1004-1012.

63. Malander, S. One in 10 ovarian cancer patients cany germ line BRCAI or BRCA2 mutations: results of a prospective study in Southern Sweden/ S. Malander, M. Ridderheim, A. Masback et. al. // Eur. J. Cancer.- 2004,- Vol.40.- №3.-P.422-428.

64. Miki, Y. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCAI/ Y. Miki, J. Swensen, D. Shattuck-Eidens et al.// Science. 1994.- V.266.-№5182.-P.66-71.

65. Mizuta, R. RAB22 and RAB163/mouse BRCA2: proteins that specifically interact with the RAD51 protein/ R. Mizuta, J.M. LaSalle, H.L. Cheng et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.- 1997,- V.94.-№13.-P.6927-6932.

66. Monteiro, A.N. BRCAI: the enigma of tissue-specific tumor development/ A.N. Monteiro// Trends Genet.- 2003.- V.19.-№6.-P.312-315.

67. Moslehi, R. BRCAI and BRCA2 mutation analysis of 208 Ashkenazi Jewish women with ovarian cancer/ R. Moslehi, W. Chu, B. Karlan et al. // Am. J. Hum. Genet.-2000.-Vol.66.-P. 1259- 1272.

68. Narod, S.A. BRCAI and BRCA2: 1994 and beyond/ S.A .Narod, W.D. Foulkes// Nat. Rev. Cancer.- 2004.-V.4.-P.665-676.

69. Narod, S.A. Genetics of breast and ovarian cancer/ S.A. Narod// Br. Med .Bull. -1994.- V.50.- №3. P.656-676.

70. Narod, S.A. Oral contraceptives and the risk of hereditary ovarian cancer/ S.A. Narod, H. Risch, R. Moslehi et al. //N. Engl. J. Med. 1998.- V.339.-P.424-428.

71. Narod, S.A. Modifiers of risk of hereditary breast and ovarian cancer/ S.A. Narod// Nat. Rev. Cancer.- 2002.-V.2.- №2.- P.l 13-.123.

72. Narod, S.A. Ovarian cancer, oral contraceptives and BRCA mutations/ S.A. Narod, P. Sun, H.A. Risch // N. Engl. J. Med. 2001.-V.345.- P. 1706-1707.

73. Pal, T. BRCA1 and BRCA2 mutations account for a large proportion of ovarian carcinoma cases/ T. Pal, J. Permuth-Wey, J.A. Betts et al. // Cancer.- 2005,-Vol.104. P.2807-2816.

74. Pejovic, T. Genetic changes in ovarian cancer/T. Pejovic // Ann. Med. 1995.-V.27. -№1.- P.73-78.

75. Perkowska, M. BRCA1 and BRCA2 mutation analysis in breast-ovarian cancer families from northeastern Poland/ M. Perkowska, I. BroZek, B. Wysocka et al. // Hum. Mutat. -2003. V.21.-№5. -P.553-554.

76. Petalcorin, M.I. Stabilization of RAD-51-DNA filaments via an interaction domain in Caenorhabditis elegans BRCA2/ M.I. Petalcorin, V.E. Galkin, X. Yu , E.H. Egelman, S.J. Boulton // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2007.- V.104. №20.-P.8299-8304

77. Pharoah, P.D. The genetics of ovarian cancer/ P.D. Pharoah, B.A. Ponder // Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol.- 2002.- Vol.16.-P.449- 468.

78. Pharoah, P.D. Association between common variation in 120 candidate genes and breast cancer risk/ P.D. Pharoah, J. Tyrer, A.M. Dunning et al.// PLoS Genet. -2007.- V.3.- №3.- P.42.

79. Piver, M.S. Familial ovarian cancer. A report of 658 families from the Gilda Radner Familial Ovarian Cancer Registry 1981-1991/ M.S. Piver, T.R. Baker, M.F. Jishi et al. //Cancer. 1993.- V.71.-P.582-588.

80. Prat, J. Hereditary ovarian cancer/ J. Prat, A. Ribe, A. Gallardo //Human Pathology.2005.- Vol.36. P.861-870.

81. Rebbeck T.R. Prophylactic oophorectomy in earners of BRCA1 mutations/ T.R. Rebbeck, H.T. Lynch, S.L. Neuhausen et al. // N. Engl. J. Med.- 2002,- Vol.346.-P.1616- 1622.

82. Rebbeck, T.R. Modification of BRCA1-associated breast cancer risk by the polymorphic androgenreceptor CAG repeat/ T.R. Rebbeck, P.W. Kantoff, K. Krithivas et al.// Am. J. Hum. Genet. 1999.- V.64. - P. 1371-1377.

83. Risch H.A. Parity, contraception, infertility and the risk of pithelial ovarian cancer/ H.A. Risch, L.D. Marrett, G.R. Howe// Am. J. Epidemiol.-1994.-V.140.-P.585-597.

84. Risch, H.A. Prevalence and penetrance of germline BRCA1 and BRCA2 mutations in a population series of 649 women with ovarian cancer/ H.A. Risch, J. McLaughlin,

85. D. Cole et al. //Am. J. Hum. Genet.- 2001.- Vol.68.-P.700- 710.

86. Rosen, E.M. BRCA1 in hormonal carcinogenesis: basic and clinical research/ E.M. Rosen, S. Fan, C. Isaacs// Endocr. Relat. Cancer.- 2005,- V.12.- №3.- P.533-548.

87. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual 2nd edn. / Sambrook J., Fritch

88. E.F., Maniatis T. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 1989.

89. San Filippo, J. Recombination mediator and Rad51 targeting activities of a human BRCA2 polypeptide/ J. San Filippo, P. Chi, M.G. Sehorn et al. // J Biol Chem.2006. V.281. -№17. - 1649-1657.

90. Sankaran, S. Identification of domains of BRCA1 critical for the ubiquitin-dependent inhibition of centrosome function/ S. Sankaran, L.M. Starita, A.M. Simons et al. //Cancer Res. 2006.- V.66. - № 8. - P.4100-4107.

91. Sharan, S.K. Identification and characterization of a microsatellite marker within murine BRCA2 gene/ S.K. Sharan, A. Bradley // Mamm. Genome. 1997. - V.8. -№1. -P.79.

92. Shaw, P.A. Histopatologic feature of genetically determined ovarian canccr/ P.A. Shaw, J. McLaughlin, R.P. Zweemer et al. // Int. J Gynecol. Pathol.- 2002.- V.21.-P.407 411.

93. Shin, S. BRCA2 cooperates with histone acetyltransferases in androgen receptor-mediated transcription/ S. Shin, I.M. Verma// Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 2003. -V.100. -№12. P.7201-7206.

94. Sowter, H.M. BRCA1 and BRCA2 as ovarian cancer susceptibility genes/ H.M. Sowter, A. Ashworth// Carcinogenesis. 2005.- V.26.- №10. - P. 1651-1656.

95. Spurdle, A.B. The BRCA2 372 HH genotype is associated with risk of breast cancer in Australian women under age 60 years/ A.B. Spurdle, J.L. Hopper, X. Chen et al.// Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2002.- V. 11. - №4. - P.413-416.

96. Stoppa-Lyonnet, D. BRCA1 sequence variations in 160 individuals referred to a breast/ovarian family cancer clinic/ D. Stoppa-Lyonnet, P. Laurent-Puig, E. Laurent et al. // Am. J. Hum. Genet. 1997. - V.60. - P.1021-1030.

97. Tavtigian, S.V. The complete BRCA2 gene and mutations in chromosome 13q-linked kindreds/ S.V. Tavtigian, J. Simard, J. Rommens et al. // Nat Genet. 1996. -V.12. - №3. —P.333-337.

98. Thompson, D. Breast Cancer Linkage Consortium. Variation in BRCA1 cancer risks by mutation position/ D. Thompson, D. Easton //Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2002. - V.l 1. - № 4. - P. 329-336.

99. Turner, N. Targeting the DNA repair defect of BRCA tumours/ N. Turner, A. Tutt, A. Ashworth // Curr Opin Pharmacol.- 2005. V.5. - №4. - P.388-393.

100. Verhoog, L.C. Large regional differences in the frequency of distinct BRCA1/BRCA2 mutations in 517 Dutch breast and/or ovarian cancer families/ L.C. Verhoog, A.M.W. Van den Ouweland, E. Berns et. al. // Eur. J. of Can. 2001. -V.37. - P.2082-2090.

101. Vogelstein, B. Cancer genes and the pathways they control/ B. Vogelstein, K.W. Kinzler. Nat. Med. 2004. - V. 10. - №8. - P.789-799.

102. Wenham, R.M. Polymorphisms in BRCA1 and BRCA2 and risk of epithelial ovarian cancer/ R.M. Wenham, J.M. Schildkraut, K. McLean et al. // Clin Cancer Res. 2003. - V.9. -№12. - P.4396-4403.

103. Werness, B.A. Altered surface and cyst epithelium of ovaries removed prophylactically from women with a family history of ovarian cancer/ B.A. Werness, A.M. Afify, K.L. Bielat et al. // Hum. Pathol. 1999,- V.30.-P.151-157.

104. Werness, B.A. Familial ovarian cancer and early ovarian cancer: biologic, pathologic, and clinical features/ Werness B.A., Eltabbakh G.H. // Int. J. Gynecol. Pathol.- 2001,- V.20.-P.48 63.

105. Wilson, K. Localization of human BRCA1 and its loss in high-grade, non-inherited breast carcinomas/ K. Wilson, L. Ramos, M.R. Villasenor et al. // Nat. Genet.-1999.- V.21.-P.236- 240.

106. Wong, A.K. RAD51 interacts with the evolutionarily conserved BRC motifs in the human breast cancer susceptibility gene BRCA2.I A.K. Wong, R. Pero, P.A. Ormonde et al. J Biol Chem. 1997. - V.272. - №51. - P.31941 -31944.

107. Wooster, R. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2/ R. Wooster, G. Bignell, J. Lancaster et al.//Nature. -1995. -V.378.- №6559.-P.789-792

108. Wooster, R. Breast and ovarian cancer. Genomic medicine/ R. Wooster, B.L. Weber//N. Engl. J. Med.- 2003.- Vol.348.-P.2339 2347.

109. Wu, L.C. Identification of a RING protein that can interact in vivo with the BRCA1 gene product/ L.C. Wu, Z.W. Wang, J.T. Tsan ct al. // Nat Genet.- 1996 V.14. -№4. -P.430-440.

110. Yang, H. The BRCA2 homologue Brh2 nucleates RAD51 filament formation at a dsDNA-ssDNA junction/ H. Yang, Q. Li, J. Fan et al. // Nature. 2005. - V.433. -№7026. - P.653-657.

111. Yang, H. BRCA2 function in DNA binding and recombination from a BRCA2-DSSl-ssDNA structure / H. Yang, P.D. Jeffrey J. Miller et al. // Science. 2002. -13,-V.297. -№5588.-P. 1837-1848.

112. Zikan, M. Mutational analysis of the BRCA1 gene in 30 Czech ovarian cancer patients/ M. Zikan, P. Pohlreich, J. Stribrna // J. Genet.-2005.-V.84. № 1.- P.63-67.

113. Zweemer, R.P. Clinical and genetic evaluation of thirty ovarian cancer families/ R.P. Zweemer, R.H. Verheijen, J.J. Guille et al. // Am. J. Obstet. Gynecol.-1998.-V.178.-P.85-90.