Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие разных иммуномодификаторов в организме зараженных вирусом животных

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Действие разных иммуномодификаторов в организме зараженных вирусом животных"

РГБ Ой

1 г п^

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ

На правах рукописи

КАЛЕВДЕРОВ Алмазбея Калевдерович

ДЕЙСТВИЕ РАЗНЫХ ИШУНОМОДИФИКАТОРОВ В ОРГАНИЗМЕ ЗАРАЖЕННЫХ ВИРУСОМ ЖИВОТНЫХ

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1994

/А

Работа выполнена в Институте полиомиелита е вируснвх энцефалитов РАМН.

Научный руководитель - профессор, академик РАМН Б.Ф.СЕМЕНОВ

Официальные оппоненты - . " доктор биологических наук

А.В.САБИН

доктор медицинских наук Б.В.ХОЗИНСКИЙ

Ведущая организация - Московская медицинская академия . имени U.M.Сеченова

Защита диссертации состоится " ßPsfc1994 г. в Igt час. на заседании специализированного совета Д.001.27.01. при Институте полиомиелита ж вирусных энцефалитов РАМН по адресу: 142782, Московская область, п/о Институт" полиомиелита и вирусных энцефалитов.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН.

Автореферат разослан "¿f.?" H0/t^pS{ 1994 г.

Ученый се|фегарь Специализированного Совета

кандидат биологических наук • О.А.МШШЕЦКИНА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы! Анализ обширной литературы свздетелъ-. ствует, что все изученные до настоящего времени вирусы человека и ■ животных обладает способностью модулировать (модифицировать) от-, ват иммунной системы зараязнного организма на неродственные (по отношению к инфекционному агенту) антигены (von Pirquet 1908; Woodruff J.P., Woodruff J.J., 1975; MoChesney M.L., Oldstone И., 198?; Zsohusche w.L., Semenov B.P., 1987; Варгин B.B., Семенов Б.Ф., 1989, 1993). Возникающие при этом вторичные ишунологичес- . -—кие дефициты могут вести к возникновению разных ослознений (присоединение вторичной инфекции, возникновению онкологических заболеваний, пуск иммунопатологических процессов, в том числе" и патологических аутоиммунных реакций, формирование некоторых вак-цияоаесоциировашшх осложнений я т.д.). Для цройглактики и лечения вторичных вирусиндуцированных иммунодефицитов, в настоящее время кироко используют различные иммуномодуляторы природного и синтетического происходцения.

•■Вся опубликованная-до настоящего времени информация об основных закономерностях действия иммуномодуляторов базируется на экспериментальных данных, которые бшш получены при использовании гзшотннх с неизмененной иммунологической реактизностьи. Вместе с тем, известно что на современном этапе развития цивилизации иммунная система человека подвергается действию экзогенных факторов с выраженной вкмунсмодулирушцей активностью. Учитывая множественность и широкое распространение этих факторов, правомер-нш является предсказание таких ситуаций, когда на организм одновременно или последовательно воздействуют факторы, кодифадируи-.. щие имцунологическуп реактивность. Очевидно, что такие ситуации могут возникать достаточно часто, однако в доступной литературе мы не нашли данных, характеризующих эффекты, которые возникают

при суммацд: тг,^1скэдулируэщЕх сигналов нескольких экзогенных Факторов.

Недостаточно освещенным остается вопрос о саконо?лзрноемх деЁстЕия тауаомодулирувдих агентов в организме с временно подавленной иммунологической реактивностью, хоья актуальность такой инфоркаяшг ед вызывает самяеявя. Разработку рациональной схемы иммунотерапии затрудняет отсутствие информации о закоЕСжрносткх иымуномодулзрушцего действия вирусов в организме с измененной иммунологической реактивностью, особенно при проведении нклуно-терашш в экологически неблагоприятных районах.

Цель работы. Целы настоящей работы явилось изучение закономерности действия синтетического и природного иммуноанодудяторов в организме мышей, яммунологичеекая отвечземость которых была изменена под влияниам разных по своей природе факторов (латентная вирусная инфекция, стресс).

Основные эадачн .исследования: ..... .

1. Иссладовать Езадуномодулкрувщее действие синтетического препарата н-ацетилглюкозоамияш1( р 1-4)-я-ацетшура».шл-алашн-Д-изогдуталиш (ГМДП) в опытах с интактными мышами и мышами со стрессиБдупдрованной вторичной ищуносупрессяей.

2. Изучить влияние ГЭДП на иммунологическую отвачаеиосг ь мышей с-латентной инфекцией вирусом Тахлня.

3. Охарактеризовать жмуномодафидарувщее действие анатоксина

стафилококкового оче^енного (ACO) в опытах с пЕфпцЕровалщсли или

г

стресслндупзрованшдЕ: гавоткыии.

i

4. Исследовать, происходит ли суммация субпороговых щщуио-модулирукЕЕХ сигналов in vivo . И волг происходит, то как она проявляется у интактных или зараженных яивотшх.

Научная новизна результатов исследования.

Впервые показало, что разные по своей природе ш-иунмодпйика-торц - стафилококковый анатоксин п синтетический ГЗДП - предупреждает; развитие и исправляет вторичные иммунодефицита, ивдуцирован-ше как вирусом, так и стрессом гипокинезии.

Описаны сутлмация и изменение направленности имцунодадулнрув-щих сигналов (по-сравнении с интактшдз живогнкяи) ACO и ГМДП в организме зараженных шшей, получивших субпороговув дозу вируса, которая не изменяет (не модулирует) по данным стандартного определения, гммунологическую отвечаемосгь хозяина на неродственный антиген. Неиг.а!уношдулирущш1- доза ГЩД и адъювантная доза ACO (для : иптактпых мшей) вызывает у описанных выпэ янфицзрованшх гявот-ных вторичнуэ Екмуносупрессиа.

Продемонстрировано, что со вторичным ижунологичеслим дефектом, возникаогти),! при суг^ации сигналов субЕороговых концентраций разных ижуномодуляторов, ассоциируется повкшенная чувствительность К-гегерологэтшой вирусной инфекции (Лангат) и наблюдается ее отягощенное течение.

Установлено, что многократное введение змнтЕсглодулятора отгоняет бозмоеность обострения скрытой виру синдударованной ша^уно-супрессии е в то же врекя позволяет проявиться способности препарата предупреждать (или исправлять) зременнне жмглунолотяческие дефекта, формиру-оя^еся у зараазнной особи.

Сочэтакноэ однократное применение ACO и ГЩЩ для илиунокоррек-ции при ннфекцпп взрусс:.? Тахяня оказалось неперспективны. Комбинация адгавантных доз петуно.модуляторов приводила к развитии ш-цуносупрессни. Сочетание субпороговых доз не отменяло их способности переводить срсрктув вирусяздудирсваннув инфекции 3 явную.

Практическая значимость работы'. В целом материалы диссертации расшлрявг знания, лежаяре в основе соЕретгенной концеппжз имнуно-

коррекции ЕнрусиЕдуцировакннх вторичных ккяуводефицитов. Доказано, что эксперименты с интактиши тавотники не позволяют прогнозировать направленность активности иммуномода&жатора в зараженном вирусом организме. Обоснована перспективность применения для ш-мунокорреаии при вирусных инфекциях схегш, предполагавшей многократное введение ишуномодулятора.

Апробация. По материалам диссертации опубликованы четкие печатные работы:' три статьи в журналах "ИЭИ" и "ЙШШШГЙЯ", а также тезисы в трудах международной кок$еренцш:„ Диссертация апробировала на меккабораторной конферешка" Инсимута полиомиелита и вирусных энцефалитов.

Структура г объем работы. Диссертация лзлсгкна на /3 £/ стр. машинописного текста и иллюстрирована 20-ю таблицазаи и одним рисунком. Работа состоит из введения, 8 глав, вшшчадах обзор литературы, описание материалов и катодов, результатов собственник исследований, обсуждение, заключение, а также выводов ж списка литературы, содержащего 202-источника, в том числе 42 работы отечественных и 160 зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Животные. Использовали мышей инбредннх лиеий сна/И-2К) и ВАЛВ/С(Н-2® в возрасте от 7-8 до 28-30 недель.

Иммувот дийияат ота.

Вируса, в работе использовали член семейства ВшауатАг1<1ае - вирус Тагиш, штамм рт , полученный из Института вирусологии Словацкой АН (Братислава, Словакия), а также представителя рода ?1ат1тг1гиа - вирус Лаигат, шташ ТР-21, полученный из Института вирусолотаи им. Д.И.Ивановского РАМН. Вирусы культивировали в мозге мшей-сосунков 2-3 дневного возраста. Мозг мышей, взятый

на высоте заболевания, хранили при температуре -20°С. В ряде случаев вирус 1ангат выращивали в культуре клеток почет кгбриона свиньи (СПЭВ) согласно общепринятой методике. Титрованве вирусов проводили на 2-3-дневных' мышах-сосунках путем введения серийных разведений материала в головной мозг. Расчет титров вирусов проводили по методу Кербера (Апмарин и др., 1961).

g -адетялглпкоsоамчнил( $ 1-4)- К -ацетилмурамял-адавин-Д-изо-глутамкн (ГШЩ). ГВДП является синтетическим препарата из класса мурашлдипептадов. В настоящее время прогодятся широкий клинические испытания препарата по программе'Фармксмитета Минздранзрома РФ. Использовали образцы препарата, синтезированные по методу Т.М. Андроновой в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН. Препарат был передан нам в.виде дара, за что выражаем искреннаю благодарность Т.М.Андроновой. ГМДД вводили в виде растворов, содержащих разные концентрации препарата, перо-ральяо ш внуграбрашинно в объеме 0,5 или 0,3 ш ка шяь.

Анатоксин стафилококковый очищенный (ACO). ACO - препарат разрешенный для применения в клинической практике. Охарактеризован в условиях эксперимента как активный инмунокодулягор, способный на только изменять гуморальный и клеточный ответ на разнообразные антигены, по и исправлять вторичные иммунодефицзты, ассоциированные с действием толерогенной дозы эритроцитов, с развитием вирусной инфекции или влиянием стресса (Семенова И.Б. и др., IB9I, 1992, 1993). Оттагы проводили с сериями препарата, изготовленными предприятием по производству бактерийных препаратов Института эпидемиология и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН. ACO вводили внутрибршннно в дозах 0,0015-1,5 ЕС на миь.

Стресс гипокенезии. Исходя из ранее опубликованных данных, • для индукции шмуносупрессан использовали стресс гипокинезии (Ожерелков C.B., 1990). Стресс гипокинезии ивдуцзроваля следующим

образом. Б течение 10 суток (ежедневно по 12 часов) экспериментальных гзпзотных помещали в пластмассовые камеры размером 8,Бх х4х2 см. Каздое животное занимало отдельную камеру. Контрольных мышей сагалш в стандартные клетки размером 42x14,5x11,5 см. Во всех случаях развитие стресса подтверждали результатами исследования массы надпочечников, которые проводили по описанной Cristian J.J. et ai.(195?) методике, используя формулу:

X = масса надпочечника масса тела

Исследование иммунологической отвечаемости. Цри выборе методов экспериментальной оценки активности имнуномодифшсаторов руководствовались методическими материалаш со аксперименталзЕсму и фармакологическому испытанию иммуношдулирующего действия фармакологических средств (МЗ СССР, Москва, 1984). Изучали способность животных Армировать гуморальный и клеточный иммунный ответ на гетерологгчный тест-антиген, в качестве которого были выбраны эритроците барана. Гуморальный ответ оценивали у тавотных индивидуально, определяя число аятителообразуицих клеток (АОК) в селе- ' зенке к эритроцитам барана (ЭБ). Для определения числа АОК использовали методику локального гемолиза в геле агара по Jeme S.S., Kordin A.A., Henrua С. (19S3).

МодулЕцдаэ клеточного ответа исследовала с помоаью реакции гп-

перчувсгЕггельноста замедленного типа (ГЗТ) к ЭБ. Мзстпуи реакции

воспаление оценивала ло разнице объедав стона в опыте д контроле.

Результата вир акали в ввде индекса реакции (ИР), который подсчиты-Ьо ~ ьк

вали по срорцуле ИР =-jj-— х 100, где hQ и Ьд - толщина лапы в опыте в контроле соответственно.

Исследование антигеннеспецифической резистентности к вирусу. В качестве индикатора антягеннеспецифической резистентности мышзй

использовали вирус Лангат. Этот вирус патогенен при заражении в мозг, но при внутрибргпинном введении взрослым шишм знзывает гибель только 5-10% животных, фи развитии иммуносупрессии мши становятся высокочувствительными к экстраневральпой инокуляции вирусом Лангат и летальность таких гивотных достигает 31-42% (Варгин В.В., Семенов Б.Ф., 1989). Для характеристики антигеннеспецифи-ческой резистентности использовали два показателя - процент гибели и показатель средней продолжительности злзеи, который высчитывали по форг.1уле:

1 ч 12 гп

t ~ Я ■ '

где t1 , t2 , ... tn срок жизни кандого животного; я - число

животных о опыте, зараженных данной дозой. Оставшимся в яивых животным приписывается условное время выживания, равное - .. Величина является средней гармонической величиной времени шзнл для ' данной группы зиеотеых и'вклпчает в себя информации о всех особях (Шеничнов В.А., 1974).

Методы статистической обработки. Статистическую обработку проводили в соответствии с рекомендациями И.П.Ашмарина к А.А.Воробьева (1962). Достоверность различий меаду полученными результатами рассчитывали но критерию Стьадента с использованием компьютерного. анализа при программном обеспечении Statgraf .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Дополнительная характеристика ГВДЩ в опытах на интактннх мышах.

Несмотря на значительное число публикаций, характеризующие действие ГВДП in -rivo и in vitro (Андронова Т.М., Дозморов М.Н., Мустафазв М.И. и др., 1991), многие стороны его активности оставались неизученными или изученными недостаточно. Поэтому работа

была начата1 с уточнения ряда характеристик препарата в опытах на

ь

интактных кшах.

фи экспериментах с еивотныш линек СВА/Н (Н-2к) и ВАЛВ/С {Н-2Й) тизгаовддулируящув активность ЩЦП внявляли только при при- . менениа одной дозы препарата - I мкг/мьяпь. АдЕэзантпнй эффегл? наблюдали после введения иммуномодулятора как.чгрез рот, так я внутрибрюшинно. Аналогичная, проявляющаяся только в узком диапазоне доз, ккыуномодулирующая активность описана для скзсн природных глгкопенов и синтетического продукта - Е -аштзлцурамклаяа-еид-Д-изогдутамин (ИГО- Сходные результаты подучили при лсслэдо-ванзи активности ГВДП, вводимого внутрибрвшзшо ышаи ■.лнннн с57бь/6, сил, (сба з: с57вь/ б) , которые бше шатунлзероьс£ен ЭБ (Андронова Т.М., Иванов В.Т., 1991).

В нашх экспериментах показано, что ГВДП при одновременном введении с тест-антигеном, практически не влияет на афферентную фазу развития' ГЗТ. Приведенные результаты согласуются с наблвдо- . киями других авторов, не. зарегистрировавших, влияния на ГЗТ ГКЩИ в • физиологическом растворе (Шшко 7.м. ,е-; а!• ,1988). Однако мы полагаем, что говорить о полной неэффективности ГВДП в отношения ГЗТ, не правомерно. Во-первкх, в наших опытах был зафиксирован выраженный аффекк 10 мкг/мыщь при учете результатов на 7 день. Во-вторых, еде не получены данные о действии ГВДП на эфферентную фазу ГЗТ. С уверенностью можно констатировать, что экспериментальные условия, оптимальные для модуляции гуморального ответа на ЭБ под влиянием ГВДП, на являются таковыми для клеточных реакций.

Впервые в опытах на интактных животных продемонстрирована до-зозависимая'альтернативность ответа на ГВДП. Оказалось, что этот феномен выявляется на цыпах линии ВАЛВ/С, но не СВА. Если доза I мкг/мкгь стимулировала гуморальный ответ на ЭБ, то дозы 0,01 и 0,001 мкг/ккаь подавляли его, причем иммунодепрессивное действие

в первом случае развивалось после введения ЩП внутрябршзтзо, а во втором - только через рот. Направленность дозозаЕжимой альтернативности в опытах на мызах отличается от таковой в системе in .vitro . Для гивотных адъювантнкми оказались относительно больше и супрессивными относительно малые дозы. В культуре ткани супрессию вызывали больше, а усиление функции иммунокомпетеят-ных клеток - малые доз к (Дозморов И.М. и др., 1991). йззэтся по -крайней мере два объяснения выявленному противоречии. (I) Раз ли- ~ чпз эффектов обусловлено различием экспериментальных систем (в одном случае ответ целостного организма, в другом - отдельных популяций имкунокомпетентных клеток). (II) Разные представители класса цурзмшшептидов давт разный аффект. На гивотных испытывали ГВДП, в 'культуре иымунокогшзтентных клеток - смесь природных нептждоглккансз или ШЩ.

2. ГЩ1 как корректор втотжчных иммунологических деёектов при стрессе. Впервые описана способность ГЩЩ исправлять стресс-индуцироБаннуто имауносупрессию (табл. 1). йммунокорригирувдее -действие препарата продемонстрировано в опытах с мылами линии ВАЯВ/С, у которых под влиянием длительной (в течение 10 дней) гипокинезии была подавлена гуморальная отвечаемость на 35. Если число АОК в селезенке интактного гивотного равнялся 3200, то после воздействия стресса этот показатель снижался в 2,37 раза. Показано, что разике дозы ГЩЩ исправляют, сформировавшуюся в условиях стресса, игслуносупрессию. Восстановление иммунологической отЕечаекости зарегистрировали при двукратном введении- как 10 икг/особь, так и I миг на особь, имцуномодулятора. Анализ полученных нами данных показывает, что икаунокорригиругщим действием (способностью исправлять индуцированную иммуносупрессш)) обладает как та доза ГЩШ, которая модулирует гуморальный ответ иытэй на ЗБ (I мкг/мыаь), так и доза, не влшшцая на число АОК в селезенке

Таблица I

Демонстрация способности ГМДП исправлять супрессии гуморального ответа, Бознзшпув под влиянием стресса гипокинезии

-гг л» 1 групп} Стресс* 1 ! I ШЛ®* ! ) мкг/мшь I ЭБХ • .......... ! АОК533 *

I. - + 3200

2. + - + 1350

3. + 10 + 2470

4. + 1,0 + 2900

Примечание: х - Стресс индуцировали у мшей ВАЛВ/С мзтодоъ;

гипокинезии в течение 10дней. ЭБ вводили через 4 дня после прекращения действия стрзсс-• фактора (14 день опыта).

зое - ГЩЩ инокулировали через рот, дваядн, за I час до ЭБ, а затем через суч-ки. Использовали дозы 10 мкг/мышь и I ыкг/шшь соответственно, курсовая доза равнялась 20 мкг/шшь и 2 г.кгДиаь.

зва - Различия мегду значениями опытов I и 2; 2 и 3; 2 и-4 статистически достоверны (при Р'< 0,05).

особей линии ВАЛВ/С (10 мкг/мышь). фи оценке приведенного факта следует иметь в виду, что иммунокорригирувщуо активность ШШ наблюдали при двукратном введении, тогда как иммуношдулирующее действие при В-нокулящш только одной дозы препарата. Возможно при увеличении кратности инъекций ГВДП происходит кумуляция сигналов иммуномодифнкатора, что и приводит к исправлении иммун о супрессии. Принципиальная возможность сложения изаауномодулирущих сигналов показана ниже.

3. ИммуЕомодулируташе действие ГМДП при вирусной ивЬекгия. йкмунодадуларувде 6 действие ГЩП при вирусной инфекции исследовали, используя две экспериментальные модели: зараженных вируса,! Тахиня мышей с выраженной антигеннеспзцнфЕческой Еммуносулрессией

(угнетение гуморального ответа на ЭБ) к инфицированных вирусом Тахиня етвотЕЫх, иммунологическая отвечаемость которых на неродственный антиген (ЭБ) оставалась такой ае как и у контрольных 7 (интактных) особей.

В ходе работы было установлено, что ГШШ способен исправлять (полностьп или частично) гуморальный ответ на ЭБ у мышей, получивших 10.000 ДЦ/50/0,3 мл вируса Тахиня. Проявление инмунокорри-гирующзй активности ГМЦП зависело от времени применения препарата (по отноиению к моменту инокуляции тест-антигена) и от величины испытуемой дозы тмуномодулятора. В тех опытах, когда ГЗДП применяли за 72 часа до ЭБ, эффект иммунокоррекцпи наблюдали при использовании I мкг/мышь, а не 10 мкг/мшь. При сокращении интерва-

\

ла меаду инокуляцией ПИП и ЭБ до I дня или 1,5-2 часов (0 день эксперимента) обе указанные дозы, оказались способным нормализо-' вать вирусиндуцированнуи супрессию гуморального ответа на ЗБ. Весьма неожиданный вывод был сделан при сопоставлении данных определения величины икмуномодулирунцей дозы ПИП с. результатами определения иммунокорритарущей дозы этого препарата. Как и при нормализации с помощью ГЩЩ стрессиндуцарованной жммуносупрессии, значения этих величин не совпадали. Оказалось, что имаунокорриги-рущув активность демонстрирует более широкий дапазон доз ГМДП но сравнению с его иммуномодулирухщзм действием. Так, в зависимости от схемы эксперимента ассоциированный с вирусной инфекцией итлмуно-. логический дефект исправляли I мкг и 10 мкг/особь ГЩП. В то лз время только после введения Г мкг/шлиь (но не 10 шсг/мшь) наблюдали изменения отвечазкости хивотных на'ЭБ.

4. Способность неишдуномоуулирувдих (в опытах на иатактных мышах) доз ГЩП модийашровать имнунологическуа отвечаемость яи-вотннх, которые зарзденн разведением вируса, не индудируваим суд-

сессию. В предварительных экспериментах нами показано, что иэсле вцухрибргаинного введения мышам линии СВА 100 ДД/50/0,3 ыл гаруса Тахизя, гуморальный ответ на ЭБ у животных сохраняется на уровне неинфшщрованного контроля. С описанной модели были выполнены две серии экспериментов. В первой серии, неиммуномадулирувщуш дозу вируса вводили одновременно с ГВДП, через 4 дня икокулдювали тест-антиген. Во второй серии опытов зараженные мыля получали ГШ шесте с ЭБ.

Результаты описанных экспериментов оказались Еесьма неодинаковыми. В первой серии опытов, I ыкг/мшь ГМДП, усиливахдий иммунный ответ на ЭБ.у не зараженных тавотных вызывал аднозантный эффект и у инфицированных мышей. Доза иьаауномодулятора, неактивная згой введении контрольным особям (0,1 ыкг/мышь), не модифицировала икаунологгческую реактивность и у животных, получивших 100 Щ/50 дозы вируса Гахиня. Во второй серии экспериментов было., показано, что некюуномодулирующне дозы (при испытании на иЕтакт-ных мшах) ИЩП (0,1 мкг и I мкг/мышь) демонстрируют достаточно выраженную икмуномодайщирующуи активность (табл. 2). После инокуляции зараженным мышам I мкг/мыяеь. ГВДП и ЭБ иммунологическая отЕечаемость этих зевотных на тест-антиген уменьшалась на 30%. При использовании 0,1 мкг/особь ГВДП, выраженность супрессии го сравнении с контролем возрастала до 81-83%. Доза 0,01 мкг/мыаь ГВДП, иммуподепрессившш действием не обладала при испытании ка мышах, зараженных субпороговой дозой вируса.

Изложенные выаз материалы позволили высказать следующие предположения. (I) Вирус Тахпня способен вызывать у мышей не только выраженную, но и скрытую (латентную) иммувосупрессию, которая переходит в явную (определяемую стандартными методами) в тех с луча-' ях, когда на иммунную систему зараженного хозяина действуют субпороговые (не шглуномодулируюцие для интакпшх животных) дозы ш-

Таблица 2

Шкуномодулиругщий аффект при последовательном введении разных доз вируса Тахиня и ГВДП

--г- йй } Условия эксперимента* -г- ■ - ■■■ ! Число i

1 групп| Вирус ДЦ/50 { ГВДШ I (ккг/мышь) } ЭБ ! АОК I

I - - + 3345

2 100 - + 2601

3 1000 - + 1178®*

4. 5 10.000 1.0 + + 1119"® 4746**

6 , - 0,1 + ; 2980

7 - 0,01 + 2992

8 100 1.0 + 1392х®

9 100- / 0,1 + дз7хх

ю . 100 • 0,01 2735.

II 1000 1.0 + 225433

12 1000 0,1 + 2938^

13 10.000 1.0 + ЗОЗЭ305

14 10.000 0,1 + 2987®®

Примечание: ж - Опыты лрозодши на мыяах лиши СЗА. Вирус Тазиня вводили о 0-й день опыта, а 17ДЩ ж ЭБ инокулиро- • вали разными путя1я на 4-й день опыта.

зэЕ - Различия значимы при Р < 0,05 мезду группки I и 3; I ж 4; I и 8; I к 3; 3 и II; 3 и 12; 4 и 13; 4 з 14.

муномодулятора (в рассматриваемом случае ПЯЛ). (II) В зараженном организме, ГЩЩ демонстрирует разнонзлравленнуп активность. Он' • действует как иггмупокорргктор при применении гнвотшг! с выраженной иммуносупрессгей, индуцированной вирусом, и как иммунодепрессор.

когда вводится мышам, сохрашшшам (по данным стандартного определения) неизмененную иммунологическую отвечаемость, после инокуляции субпороговой дозы патогена.

Гипотезу о индукции вирусом Тахикя скрытой иммуносупрессии подтверждают в определенной степени, рассматриваемые ниже эксперименты. .' -

Установлено, что у мышей, получивших ЮО'ЛДзд вируса, мояно обнаружить иымуносупрессию, если вместо стандартной дозы теа-антигена (0,3 мл 3-Ю суспензии ЭБ) использовать дозу в 10 раз • меньшую (З'Ю6). Как известно, при использовании небольших доз

тест-антигена чувствительность метода существенно возрастает, од-

й 7

нако в большинстве экспериментов используют не 3-10 , а 3-10 концентрацию ЭБ.

Доказано, что неиммуномодулирушцая доза (при использовании стандартного метода определения) может при определенных условиях вызвать развитие выраженной иммуносуцресски.

Мышам линии СБА трехкратно с интервалом в 24 часа вводили вирус Тахивя в дозах, которых при однократном применении, ннтактным мышам, вызывали (1000 ДД/50) или не вызывали (10 и 100 ДД/50) ак-тггекспешЬиче скую иммуномодуляцию. Ери последовательном введении 1000 ДЦ/50 дозы вируса развивается состояние иммуносупрессии, которое не отличается по своей выраженности от вторичного иммунологического дефекта, возникающего при однократной инокуляции патогена. Иммунологическая отвечаемость первой и второй группы зевотных равнялась соответственно 55 и 65% от уровня ответа интакт-ных животных. При экспериментах с неиммунодадулирующей дозой вируса, равной 100 ЛД/50, наблюдали формирование четкого дефекта гуморального ответа на ЭБ. После третьей инъекции 100 ЛД/50 число А0К в селезенке снижалось до 897 у зараЕенннх особей по сравнению с 1442 в контроле. Однобитное введение суммарной дозы трех суб-

пороговых (неиммунсетдулируювдх) доз вируса на иммунологическую отеочяомссть мышей не влияло. Доза 10 ДД/50 вируса Тахиня нря выбранной схеме эксперимента иммуномодулирующей активности не проявили.

Мы полагаем, что приведенные данные позволяют высказать сле-дукзее предположение. Слабые шгауномодулирувщие сигналы вируса при определенных условиях способны индуцировать скрытую (не выявляемую стандартным методой) иммуносупрессив. Кроме того, эффект сигналов коевт' суммироваться. При достижении определенного (критического) уровня суммарный сигнал обусловливает переход скрытой иммуносупрессии в явную * -

5. ЗЗйект убого кратного введения субпороговой дозы ГМЗПГ на вкрраекную и скрытую вирусищгтагосзанную иммувосутгоессию. Нами _ показано, что изменение направленности имыуногодулирущего действия ЩЩ в зараженном организме не является абсолютным. Этот эффект, четко проявляющийся при одной инокуляции препарата, исчезает, когда увеличивают- кратность инъекций иммуномодифякатора. Так, после трех инокуляций 0,1 мкг/особь ГШЩ зараженным гладам с латентной иьглуносупрессией, иммунологическая отвечаемость этих ^цветных сохранялась на уровне интактных особей. После увеличения числа инъекций до четырех раз, регистрировали адъпвантный эффект. Многократное (3 или 4 инъекции) применение субпороговой дозы ГШШ предупреждает развитие явной иммуносупргссии под влиянием 1000 ДД/50 вируса Тахиня.

Цриведеннне данные являются доводом в пользу многократного применения ГЩЩ при коррекции вирусиндуцированных иммунодефацитов. Предлагаемая схема позволяет избегать нежелательного нмцунодеп-рессзвного действия субпороговых доз препарата з зараженном организме и обеспечивает предупреждение вырагенннх ззрусявдуцирован-ных вторичных ишунодефицатов.

6- Влияние сушациа иммувомодглирующих эффектов ГМЩ и вируса Тахиня на развитие гетерологичной инфзкши, вызванной вирусом Лангат. Из данных литературы хорошо известно, что возникающая под влиянием различных внешних стимулов (вирусов."стресса, дефицита питания и т.д.) нммуносупресскя, уменьшает резистентность организма к патогенам и обусловливает переход латентной ееФзкции в острую (Семенов Б.Ф., Варгин В.В., 1989). В связи с этим возник вопрос - какова роль в разштгга инфекционного процесса ишуж>-сулрессии, сформировавшейся в результате сумиация субпороговкх иммуншодулирующих сигналов вируса Тахиня и ГВДЩ? Для ответа на поставленный вопрос была поставлена специальная серия экспериментов (табл. 3). Мыши получали неиммукомодулируицую дозу вируса Тахиня (100 ДП/50), через 4 дня им вводили кеиммуномодулирукцуш дозу ГВДП (0,1 мкг/мышь), ЭБ и вирус Лангат. Животных наблюдали в течение 21 дня. В ходе описанных экспериментов установлено, что возникающий в результате сочетанного действия субпорогоЕых кшу-- номодулирующих доз вируса и ГМДП иммунологический дефект отягощает течение развивающейся на фоне этого дефекта инфекции, вызванной вирусом Лангат. В группе иммуносуцрессированннх завотных летальность возрастала до 53,3%, средняя продолжительность жизни умэнкгалась (СНЕ) до 14,2 дней (в контроле соответственно 33,3% к'29,4 дня). Показатели летальности и СПЖ оставались на уровне контроля, если мышей заражали вирусом Лангат на фоке инокуляции 100 ДД/50 вируса Тахиня или 0,1 мкг/мкзь ГВДП. Таким образом показано,-что с'выраженной иммуносуяресскей сформированной при' суыма-цин немодулирующзх доз вируса Тахжня и 1ВДП ассоциируется повышенная чувствительность к гетерологичвой вирусной инфекции (Лан-. гат). и наблюдается отягощенное ее течение.

7. Исследование активности природного та;уномодификатора ACO в опытах на мышах, иммунологическая отвечаемость которых изменена

Таблица 3

Влияние сукмации сигналов яешдулирущих доз ГЩП и вируса Тахиня на течение инфекции у мшеВ, зараженных вирусом Лангат

JES групп

Условия эксперимента

Результат'

jse

(О день)

(4 день)

! Тахиня . ГЩП ! Лангат ! CDS ¡Летальность

| (WZ 0) (ЬХГ/МНПЬ) i (ДД/50) ¡(в сутк.) | (в %)

. I - 1000 29,4 33,3

2 — ОД 1000 30,2 32^5

3 100 - 1000 29,4 33,3

4 100 ОД 1000 14,2 53,3

5 10.000=® - I00D 14,3 54,6

Примечание: х - ГШЩ и вирус Лангат вводили одновременно

(группы 2 и 4), вирус Тахиня (группы 3, 4, 5) ЕЕОкуларовали за 4 дня до шлиунсгадуляторов

jes - CDS - средняя продолжительность пзнл.

Различия мэеду группами 1-й 4; 2 и 4; 3 ж 4; -. .1 и 5; 2 и 5; 3 и 5 .> статистически достоверны (Р < 0,05) показателей СП2 и летальности.

зеэ - Доза вируса Тахиня, которая вызывает с 4 по 7 день после заражения вырагеннуа иммуносуп-рессив.

под влиянием вируса-или стресса. Суммируя результаты экспериментов с ГЭДЦП.мозно констатировать, что этот препарат при одногфат-нсм введении способен исправлять вторичныз иммунологические дефекты, ассоциированные с действием разных по своей природе факторов (вируса Тахиня и стресса); диапазон иммунокорригируших доз шире диапазона тщуномодулирующих; в инфицированном организме направленность шмуномодулирующей активности препарата отличается от таковой у иЕтактных животных; иыауноиодулзруяипе сигналы суб-порогозых доз Х7Д2Щ достаточны для того, чтобы перевести скрктуп

(не выявляемую стандартными методами) вирусинду дарованную имму-носупрессав в явную. Доказано, что при многократном введении зараженным животным субпороговых доз ТЭДП не происходят обострения

V

латентной шмуносупрессии и предупреждается развитие явных' вирус-индуцированных жммуЕолохяческжх дефектов.

Оставалось неясным - присущи ли описанные закономерности только конкретно^ синтетическому иммукомодулягору еж они могут быть выявлены и при экспериментальных с другими иммуномодифика-торами. Для ответа на поставленный вопрос были проведены эксперименты с анатоксином стафилококковым очищенным (ACO), который по своей природе существенно отличается от ГЩП' (продукт жизнедеятельности организма, химический состав молекулы, размер молекулы, ее биологическая активность и т.д.). Опыты проводили по плану, использовавшемуся при изучении ГВДП. Исследовали эффекты при инокуляции ACO зараженным мышам с неизмененной (по данным стандартного определения) иммунологической реактивностью; при многократном введении ACO инфицированным животным,'а таксе влияние анатоксина на стрессиндуцпрованную зшмуносупрессию.

7.1. Изменение направленности шмунсмолудирузощего действия ACO в организме мыиай, зараженных субпороговой (не иммуномодули-рудщей) дозой вируса Тахиня. Опыты с ACO продемонстрировали: те ив особенности проявления иммуномодуяирувдей .активности препарата в инфицированном оргавазш, что и эксперименты с ГВДП. Установлено, что направленность иммуномодулирухяцего действия анатоксина меняется,. если его вводят мышам, зараженным субпороговой дозой (100 ЛД/50) вируса Тахиня. Адъювантные для интактных животных дозы анатоксина (0,15 или 1,5 ЕС/особь) действовали как ингибиторы гуморального ответа на ЭБ у инфицированных животных. Продемонстрирована способность ненммуишодулирувшей (для интактных особей) дозы ACO (0,015 ЕС/шшь) вызывать переход скрытой вирусиндущро-

ванной иммуносупрессии в явную.

7.2. ЗФйект при Бирусной инсЬекши многократкого введения суб-порогознх доз ACO. На призере ACO подтверждена эффективность той cxe.'.f:' иммунотерапии ■ при вирусных инфекциях, • которая предполагает многократпсз введение субпороговых доз лммуномодификатора. Как и в случае с ГЭДШ, после 2-4 инокуляций неиммунсмодулирущей дозы анатоксина (0,013 ЕС/мкпь) мншам, получившим 100 ДД/50 дозы вируса, развития выявляемого стандартными методам вторичного иммунологического дефекта не наблюдали. Более того, при проведении иммунотерапии до заражения (-4, -2, 0 день) выявлено выраженное -усиление гуморального ответа на ЭБ как при использовании иммуно-супрессивной (0,15 ЕС/мышь), так и неиммунсшодулирующей (0,015 ЕС/мшь) дозы препарата. В обоих случаях речь идет об эффекте, вы-

_ являемом при однократном введении ACO мншам, зараженным субпороговой (100 М/50) дозой вируса Тахиня.

7.3. Исправление с помоимэ ACO стрвссдидущиованной иымуно-судрессии. Исследования, выполненные с ACÓ, свидетельствуют о тем, что этот иммунокодулятор подобно ГЩЩ исправляет вторичные иммунологические дефекты, возникающие под действием различных внешних факторов. Наин доказано, что дозы 1,5 и 15 ЕС/мшь ACO достаточно для исправления иммуносупрессии, которая возникает у мышей под влиянием стресса гипокинезии. Из литературы известно

о способности анатоксина предупреждать и (или) исправлять вторичные иммунологические дефициты, которые ассоциированы с заражением вирусом Тахиня или Коксакп В 3,' действием корпускулярной коклюшной вакцины, а также толерогенной дозы эритроцитов барана (Семенова И.Б., Акатов А.К., 1992, 1993).

7.4. Результат сочетанного применения при вирусной иийекпии ACQ и МШ. В экспериментах с интактныьш и зараженными животными исследовали эффект одновременного введения двух разных по свой

природе иммуномодуляторов - ГМДП и АС». Полученные в ходе зкспе-' римента данные говорят о том, что при указанных условиях происходит суммация иммуномодулирующих сигналов, генерируемых разными источниками.■ Эффект кумулятивного сигнала не является результатом арифметического сложения активности составляющих. Направленность эффекта различна как в организме натактных жиботеых, так ж животных, зараженных разными дозами вируса Тахиня, мышей. Tait, при инокуляции I мкг/особь ГМДП и 1,5 ЕС/оеобъ ACO (каждая доза обладала выраженным адызвантным действием для интактных мышей) у незараженных животных развивалась супрессия гуморального ответа на ЭБ, т.е. изменялась направленность иммуномодулирующего действия. Однако способность исправлять выраженные вярусивдуцарован-ные иммунологические дефекты у кумулятивного сигнала с иммуносуп-рессирующей активностью сохранилась. Б то же время этот суммарный сигнал не влиял на скрытые иммунологические дефекты у зараженных мышей. При испытании сочетания неиммуяоюдулирующих доз ГЩП (0,1 мкг/мышь) и анатоксина (0,015) также выявили развитие ншуносупрессии у интактных особей. Кроме того, применение этой комбинации препаратов приводило к обострению латентной иммуно-суцрессиж, но никак на влияло на вторичные иммунологические дефекты у зараженных животных. Следует подчеркнуть, что дозы 0,1 мкг/мышь ГВДП и 0,015 ЕС/шгшь AC0, каждая в отдельности обладала способностью индуцировать в ¡жженную иммуносупрессию у мышей, получивших су б пороговую (неиммуномодулирующув) концентрацию вируса. Переход латентной шцуносупрессии в В1фаженную' наблюдали и при сочетании полностью неактивной дозы ГЩЩ (0,01 мкг/мшь) с 0,015 ЕС/шшь AC0 (не модулирует гуморальный ответ, но потенцирует скрытый вторичный .иммунологический .дефект).. .

Анализ представленных данных позволяет заключить, что нам не удалось выявить преимуществ при сочетании AC0 и ГМДП, при

иммунотерапии экспериментальной' инфекции, возбудителем которой являлся вирус Тахиня. Применение комбинации тех доз препаратов, которые обладали адъювантной активностью, приводило к развитию тамуносупрсссзш у интактвнх' животных. Сочетание субпороговых концентраций ишуноюднфикатсров не отменяло их способности индуцировать вторичные иммунологические дефекты у тшей, зараженных не-иымуномодулируицей дозой (100 ДД/50) вируса."

Мы полагаем, что комбинированное использование иммуномодуля-торов в клинической практике правомерно только в тех случаях, когда исследован возможный эффект такой комбинации с использованием адекватной модзли, каковой при вирусной инфекции являются зараненнке еоответстзувдам патогеном хивотные.

В целом результаты, наших-исследований расширяют знания, ле-* жащие в основе современной концепции иммунокоррекции вторичных ишунодефяцтаов при вирусных инфекциях с помспко имиуномодифика-торов. Очевидно, что эксперименты с интактнкми гивотныма не позволяют с достаточной степенью надежности предсказывать активность ншуномодулятора в организме зивотннх. Субнороговне (неиммуномо-дулируэщие) концентрации тлмуномодкшикаторов могут вызывать переход латентной (не определяемой стандартными методами) иммуно-супрзссии в явную. Применение комбинации иммуномодулягоров (ACO и ЩЩ) не дает выраганного преимущества по сравнению с использованием одного препарата: Сочетание субпороговых доз не отменяет их способности активировать скрытую иммуносупрессиа у зараженных особей, одновременное введение адъювантных доз анатоксина и ГВДП приводят к развитию иммуносуцрессии. Представляется, что гаиболее оптимальные результаты иммунотерапии го гут быть получены при многократной схеме аппликации иммуномодулятора, так как при такой схеме отменяется вероятность обострения скрытой вирусиндуцирован-

кой алгиуносупрессли ж проявляется способность препарата предупреждать (ш исправлять) вторичные иммунологические дефекты у зараженных, особей.

■ ВЫВОДЫ _ .

1. Разные по своей природе иммуномодишикаторк - стафилококковый анатоксин к синтетический ГЬЩП - предупреждают развитие и исправляют вторичные иммунодефициты, индуцированные как вирусом Тахиня, так и стресса? гипокинезии.

2. Установлено, что ваправлевяссть действия тшуномодулято-ров ГВДП и ACO не одинакова в экспериментах с интактшаш и зараженными вирусом Тахинк животными. У интактных животных оба препарата вызывают усиление гуморального ответа на гетерологичный антиген. В организме животных с всаженной ишувосупрессией, кк-дупированной вирусом Тахиня, они вызывают коррекцию иммунодефицита. Эти шлмуношдулируюше вещества вызывают выраяешую'шслуко-сулрессию у животных инфицированных немодулзрувдей дозой вируса Тахидя. • • ..... - •

3. Продемонстрировано, что с всаженной иммуносупрессией, сформированной щш сукмадив некодулирующих (субпороговых) доз вируса Тахиня и ГМДП ассоциируется повышенная чувствительность к гетерологичной вирусной инфекции (Лангат) и наблюдается ее отягощенное течение.

4. Многократное применение малых (немоду лирующих) доз выше описанных иммуномодуляторов отменяет возможность возникновения варусивдуцированной иклувосупрессии (судаации сигналов субпороговых концентраций) и в то se время позволяет проявиться способности препарата исправлять сформированные временные иммунологические дефекты, у зараженных особей.

5. Показано, что у интактных животных комбинированное приме-

ненке Г'.ЩП ж ACO приводит к развитая) икмуносупрессни, тогда кал изолированное (раздельное) их использование у описанных выше гя-30TH12: вызывает усиление гуморального ответа на гетерологичный антиген,

6. Сочетанное однократное применение ACO и ГМДП для кммуно-коррекпдн вторичного Егдлунодефидита при инфекции вирусом Тахяня оказалось ке2$фектлЕ:а?5 по сравнении с использованием одного препарата.

Список работ, опубликованных го тепе диссертации

1. Семенов Б.Ф., Калэндеров А.К., Семенова И.Б. Биологические факторы, качественно к количественно изменяющие иммукомодулирую-щую активность хклтческого вещества. // Тезиса докладов. - Пермь. ' - IS93. - С.223-224.

2. Каледдеров А.д., Семенова К.Б. Особенности действия химического шмуномодулятора-при латентной вирусной инфекции. // НМЭИ. - IS93, й 6. - С.87-88.

3. Календеров А.К., Акатов А.К., Семенова И.Б. Изменение направленности иммувомодулирующеЗ активности анатоксина стафилококкового очищенного (ACO) при введения зараженным.вирусом ккшам. // Е.Ш. - 1994. - .4 6.

Приношу мои искреннюю признательность и благодарность научному руководителю диссертации - академику PUJE, профессору E.S>«, Семенову, а также доктору мед. наук Варгану В.В.', кандидату мед„ наук Окерелкову С»В. и кандидату мед.наук Семеновой 11.Б. за постоянную консультативную помощь в ходе выполнения данной работы.