Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Денсовирус рыжего таракана Blattella germanica

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Денсовирус рыжего таракана Blattella germanica"

На правах рукописи

Чумаченко Анастасия Геннадьевна

Деясовирус рыжего таракана Blattella germanica: генетический аспект взаимодействия вирус / хозяин

Специальность 03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2f)06

Работа выполнена в группе генетической инженерии животных Института Общей Генетика им. Н.И. Вавилова РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Муха Дмитрий Владимирович

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Засухина Галина Дмитриевна Доктор биологических наук, профессор Ким Александр Иннокентьевич

Ведущая организация: Институт Биологии Гена РАН

Защита состоится «_» _ 2006 года в «_» часов на

заседании Диссертационного совета Д 002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991 ГСП-1, Москва, ул. Губкина, д.З. Факс: (495) 132-89-62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан «_»_2006 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, Кандидат биологических наук

Полухина Г.Н.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

К настоящему времени описано около 25 денсовирусов различных видов беспозвоночных Денсовирусы содержат линейную однонитевую молекулу ДНК Размер вирионов денсовирусов составляет 18-25 нм. Длины геномов варьируются от 4000 до 6100 п.о. На флангах денсовирусов находятся концевые инвертированные повторы (КИПы), образующие вторичные структуры КИПы играют важную роль в автономной репликации вирусной ДНК.

Денсовирусы входят в семейство Раг\гсллпс1ае, которое состоит из двух подсемейств - Рал/оуМпае и Оепэоушпае. Парвовирусы инфицируют клетки млекопитающих животных, денсовирусы - клетки членистоногих, главным образом насекомых. Свое название они получили из-за содержания в ядрах зараженных клеток плотных, темных, Фульген-позитивных масс вирионов. Большинство денсовирусов вызывают летальные заболевания организма-хозяина

Клонированная в плазм и дном векторе ДНК денсовирусов после трансформации клеток соответствующего насекомого рекомбинантной ДНК способна «вырезаться« из плазмиды - при этом вирус начинает «самостоятельную» жизнь, то есть реплицируется, экспрессирует вирусные белки и формирует вирусные частицы [АТапаэ1еу е1 а!., 1999] Это является одной из особенностей денсовирусов и позволяет рассматривать данный тип вирусов в качестве уникального инструмента для генетических манипуляций с насекомыми Известно, что денсовирусы - эффективные переносчики генетической информации и могут быть использованы в качестве вектора в генетической инженерии, в частности, для экспрессии чужеродного генетического материала в клетках насекомых. В настоящее время несколько видов денсовирусов были успешно использованы для этих целей ^апазгеу й а1„ 1999].

Кроме того, описанная «особенность» позволяет на стадии клонированного в плазмидном векторе вируса осуществлять с его ДНК любые генно-инженерные манипуляции, а затем изучать, как внесенные изменения скажутся на фенотипе (свойствах) вируса.

В 2000 году Д В Муха и К Шал обнаружили новый денсовирус - денсовирус рыжего таракана (ВдОМУ) [Муха Д.В., Шал К., 2003] и приступили к его изучению Данный вирус на сегодняшний момент является единственным описанным денсовирусом рыжего таракана.

Можно надеяться, что создание векторных конструкций на основе BgDNV позволит на новом уровне изучать молекулярно-генетическую организацию данного вида насекомых и разработать новые экологически чистые методы регуляции численности этого синантропного паразита.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы было изучение взаимодействия мееду денсовирусом (BgDNV) и его хозяином (В. germanica).

Были поставлены следующие задачи:

1) Изучить распространенность денсовируса в популяциях рыжего таракана;

2) Исследовать динамику роста вируса BgDNV в культуре клеток,

3) Описать цитопатологические эффекты, вызываемые вирусной инфекцией;

4) Исследовать тканеспецифичностъ денсовирусной инфекции рыжего таракана;

5) Разработать метод поддержания вируса в лабораторных условиях;

6) Исследовать степень видоспецифичности BgDNV;

7) Исследовать изменения в геноме рыжего таракана, вызываемые вирусной инфекцией.

Научная новизна и практическая ценность работы

Данная работа пролила свет на отношения между недавно открытым денсовирусом BgDNV и его хозяином - рыжим тараканом.

Впервые проведено исследование распространенности денсовируса BgDNV в природе. Определена динамика развития денсовируса BgDNV в лабораторной линии Р6, хронически инфицированной изучаемым вирусом Показано, что вирус может находиться в двух формах «активной» и «неактивной» Методами электронной микроскопии описаны цитопатологические эффекты, обусловленные вирусной инфекцией Показано, что у инфицированных вирусом тараканов развитие вируса происходит не во всех тканях активное формирование вирусных частиц происходит в клетках пищеварительного тракта и жировом теле, при этом вирусных частиц не было выявлено в мышечной ткани и в мозге

Впервые исследована динамика роста денсовируса ßgONV в пересеваемой культуре клеток рыжего таракана.

Разработан новый метод поддержания изучаемого денсовируса в лабораторных условиях Метод основан на микроинъекции раствора, содержащего вирусные частицы, под кутикулу рыжего таракана.

Исследована видоспецифичностъ денсовируса ВдDNV. Показано, что близкородственные В. germanica виды тараканов невосприимчивы к исследованному вирусу.

Показано, что инфицирование рыжего таракана SgDNV приводит к активизации (увеличению числа копий) ряда ретроэлементов (ретротранспозонов и/или ретровирусов) клеток хозяина Клонированы и секвенированы протяженные фрагменты ДНК двух ретроэлементов, активизируемых инфекцией денсовируса SgDNV.

Можно заключить, что исследуемый денсовирус представляет собой многообещающий инструмент для исследования рыжего таракана методами генетической инженерии и разработки новаторских экологически чистых способов регуляции численности данного вида насекомых.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на конкурсе молодых ученых, Москва, 2003; конференции молодых ученых по молекулярной биологии и генетике, Киев, 2003, 8-й конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века», Пущино, 2004; 9-й конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века», Пущино, 2005.

Структура и объем диссертации. Публикации, Диссертация изложена 122 страницах и включает стандартные разделы' введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы. Работа иллюстрирована 26 рисунками, содержит 5 таблиц Библиография - 115 источников зарубежных и отечественных авторов. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Распространенность денсовируса BoDNV в популяциях рыжего

тавшна

Денсовирус SgONV впервые был обнаружен при исследовании тараканов линии Р6, полученной из популяции этих насекомых, обитающих в одном из свинарников коммерческой компании "Prestige" (США). Линия тараканов Р6 поддерживается в лабораторных условиях около 10 лет

При анализе тотальной ДНК тараканов линии Р6 посредством фракционирования в 1% агарозном геле было показано, что после окраски геля бромистым этидием у части препаратов выявляется дополнительная фракция, часто сопоставимая по количеству с геномной ДНК (рисунок 1, дорожка 2) Было показано, что выявленная фракция соответствует ДНК денсовируса рыжего таракана [Муха Д В Шал К., 2003]. Отметим, что все тараканы, содержащие большое количество вируса, проявляли яркие признаки заболевания: вялость и нескоординированность движения.

Рисунок 1. Результат гель-электрофореза нескольких образцов тотальной ДНК рыжего таракана, выделенной из индивидуальных особей линии Р6. Наклонной стрелочкой указана дополнительная фракция вирусной ДНК.

Горизонтальной стрелочкой указана фракция геномной ДНК.

Детальный анализ тараканов данной линии показал, что количество ДНК вируса относительно геномной ДНК значительно отличается у препаратов тотальной ДНК, экстрагированных из разных особей. У ряда особей вирусная ДНК

Т.п.о.

5.0

1 2

представлена слабой фракцией (рисунок 1, дорожка 3), а у большинства особей (-80%) данным методом не выявлялась вовсе (рисунок 1, дорожка 1)

Образцы ДНК, у которых методом окраски бромистым этидием дополнительная фракция выявлена не была, исследовали более чувствительным методом, а именно, блот-гибридизацией по Саузерну с зондом, комплементарным ДНК вируса. Данный подход позволил более четко дифференцировать тараканов данной линии по количеству вирусной ДНК Отметим, что у ряда образцов тотальной ДНК (-20%) даже при использовании столь чувствительного метода вирусная ДНК обнаружена не была.

В то же время, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, комплементарными ДНК денсовируса (№1 - caggattgccataatagaag, Vir2 - catcatcttggttagactgtc), во всех образцах ДНК тараканов данной линии был выявлен продукт амплификации (рисунок 2)

Таким образом показано, что вирус в инфицированных тараканах может находиться в двух формах - активной и неактивной

Можно предположить, что в неактивной форме ДНК вируса находится не в виде эписомной ДНК и/или в вирусных частицах, так как в этих случаях методом блот-гибридизации должна была бы выявляться фракция вирусной ДНК, а интегрирована в геном хозяина.

jj 0 Рисунок 2. Результат амплификации ДНК тараканов линии Р6 с праймерами, комплементарными ДНК денсовируса (Virl/Vir2). Во всех образцах (дорожки 1-6) присутствует продукт амплификации.

Показано, что ареал обитания исследуемого денсовируса не ограничен охарактеризованной выше популяцией тараканов. При исследовании выборок тараканов из популяций этих насекомых, обитающих в свинарниках двух других коммерческих компаний - "BritF и "Riverside*

'I »it is? \

500

(обе расположены на территории США) - было показано, что часть особей данных популяций инфицированы денсовирусом.

Методом ПЦР тотальной ДНК тараканов (по 30 особей из каждой популяции) с праймерами Vlr1/Vir2 ВдОШ был обнаружен у 50% особей популяции "Britt" и у 20% особей популяции "Riverside" (рисунок 3).

При исследовании методом ПЦР тотальной ДНК тараканов, отловленных в квартирах жилых домов из разных районов городов Москва (Россия) и Киев (Украина) - пять и две выборки по 30 особей, соответственно, - и ряда лабораторных линий ("Orange", "Black" и "Normal") SgDNV обнаружен не был.

А Б

123456789 10 123456789 10

Рисунок 3. Результат амплификации ДНК тараканов с праймерами, комплементарными ДНК денсовируса (Virl/Vir2). из популяций A- "Britt": 5 тараканов из 10 инфицированы (дорожки 2, 7, 8, 9, 10). Б- "Riverside": 2 таракана (дорожки 1 и 5) инфицированы из 10.

2. Пересеваемая культура клеток рыжего таракана как модель для изучения денсовируса

В работе использовали два типа пересеваемых культур клеток рыжего таракана: BGE-1 и BGE-2 [Kurtti T.J., Brooks М. А., 1976]. Клетки поддерживали на клеточной среде ранее описанного состава [Kurtti T.J., Brooks М. А., 1976] при температуре 25° С Культуру клеток пересевали каждые 10 дней путем разведения суспензии клеток 1:10. Заражение культуры клеток денсовирусом проводили следующим образом Несколько зараженных денсовирусом тараканов на стадии поздней инфекции гомогенизировали тефлоновым пестиком в культуральной клеточной среде. Полученный гомогенат пропускали через фильтр 0,22 мкм, и

очищенный раствор добавляли в хультуральную среду на стадии пересева клеток из расчета 1 часть гомогената на 50 частей культуральной клеточной среды

Для анализа инфекционности вируса после 3-4° пересева зараженных денсовирусом клеток из них выделяли тотальную ДНК, которую анализировали методом электрофореза в 1% агарозном геле Показано, что активная репликация вирусной ДНК происходит только в клетках ВСЕ-2 (см. рисунок 4). На рисунке 4 (дорожка 2) вирусная ДНК представлена в виде дополнительной фракции размером около 5 т.п.н. В пересеваемой культуре ВвЕ-1 репликация вирусной ДНК используемым методом не выявляется (см рисунок 4, дорожка 1).

В тоже время, при использовании более чувствительного метода, а именно, полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, комплементарными к ДНК денсовируса, было показано, что вирусная ДНК присутствует в образцах тотальной ДНК обеих инфицированных линий как на стадии 3-4® пересева после заражения (см. рисунок 5), так и при более долгом культивировании.

1 2

Рисунок 4. Результат электро-форетического разделения тотальной ДНК культивируемых клеток после заражения денсовирусом: 1 - линия ВОЕ-1; 2 -линия ВСЕ-2. Стрелочкой показана фракция вирусной ДНК.

1 2 М

Рисунок 5. Результат ПЦР с праймерами Virl и Vir 2 тотальной ДНК инфицированных клеток линий BGE-1 (дорожка 1) и BGE-2 (дорожка 2) М - маркерная ДНК.

Рисунок 6. Электронно-микроскопическая фотография инфицированных вирусом клеток линии 1ЮЕ-2. А - общий вид вирогенной стромы. Б - При большем увеличении видны вирусные частицы, окруженные электронно-плотной стенкой, часть из которых содержат электрон-прозрачный центр, (показаны тонкими стрелками), другие - электрон-плотный (показаны жирными стрелками).

Методами электронной микроскопии на стадии 3-4 пассажей после заражения клеток описаны цитолатологические эффекты, обусловленные вирусной инфекцией. Показано, что основные цитолатологические проявления в инфицированных клетках линии ЕКЗЕ-2 заключаются в необычной структуризации хроматина, при этом большая часть нуклеоплазмы занята вирусными частицами, формирующими вирогенную строму (на рисунке 6а обозначено стрелкой) Выявлены два типа ультраструктуры вирусных частиц: первый характеризуется электронно-прозрачным центром, окруженным электрон-плотной стенкой (вирусные частицы без ДНК); второй тип представлен электрон-плотными сферами (вирусные частицы с ДНК) (рис. 66). Кроме того, показано, что вирусные частицы могут находиться не только в ядре, но и в цитоплазме.

Показано, что репликация вируса в пересеваемой культуре клеток ВОЕ-2 не является стабильной. После 5-6° пассажа концентрация вирусной ДНК относительно клеточной ДНК уменьшается, и примерно к 20-25"* пассажу не выявляется методом окраски бромистым этидием (рисунок 11, сравните дорожки 3-7).

Динамика развития вируса бдОМ\/ в культуре клеток ВбЕ-2 представлена в Таблице 1.

Таблица 1. Сравнение количества вирусной ДНК относительно тотальной ДНК в пересеваемой культуре 1ЮЕ-2, инфицированной денсовирусом

Количество пассажей Количество вируса в пересчете на единицу тотальной ДНК

1 22,6

2 20,21

5 1,57

10 0«52

25 0,0

«цр»

1

6

Т.п.о.

Рисунок 7. Динамика развития вируса BgDtfV в культуре клеток ВОЕ-2 (сравнение количества вируса относительно тотальной ДНК). 1- культура клеток без вируса, 2-через 10 дней инкубации с денсовирусом, 3 - 1-й пассаж, 4- 2-й пассаж, 5 - 5-й пассаж, 6- 10-й пассаж, 7- 25-й пассаж. Двумя звездочками указана зона локализации геномной ДНК. Звездочкой указан участок локализации вирусной ДНК. Стрелочкой указана репликативная мультимерная форма вируса.

С нашей точки зрения, возможны два варианта интерпретации полученных результатов. Первое объяснение заключается в том, что культура клеток ВвЕ-2 неоднородна, то есть состоит из клеток двух типов - восприимчивых и не восприимчивых к вирусу. Вторые в ходе развития вирусной инфекции постепенно вытесняют первых Другое объяснение заключается в том, что при увеличении числа копий денсовируса в инфицированной клетке включается регуляторный механизм, ограничивающий репликацию вируса.

Для проверки данных гипотез был проведен следующий эксперимент. Пересеваемая культура клеток ВЭЕ-г на стадии 10°* пересева после инфицирования вирусом, то есть когда количество вирусной ДНК значительно снизилось по сравнению с таковым на первых стадиях инфекции, подвергалась облучению у-лучами в дозах (40 Гр и 80 Гр), блокирующих пролиферацию клеток, но не влияющих на репликацию относительно короткой вирусной ДНК Облучение проводили на установке ГУПОС-1 (4,5 Гр/мин, 1а7Сз), расположенной в ИОГен РАН.

Очевидно, что в случае, когда лишь часть клеточной культуры содержит ДНК вируса, а другая часть представляет собой клетки, устойчивые к вирусной инфекции, репликация вируса после облучения не сможет привести к резкой смене соотношения между вирусной и геномной ДНК даже при достаточно длительном культивировании облученных клеток. Напротив, в случае, когда все клетки (или подавляющая часть) содержит ДНК вируса, и ослабление вирусной инфекции произошло согласно второму из обсужденных выше сценариев, длительное культивирование облученных клеток может привести к резкой смене соотношения между вирусной и геномной ДНК.

лйь ¿¡Ь вР

цр щш **

тпо Рисунок 8. Электрофорез тотальной ДНК инфицированных клеток рыжего таракана 10й1 пассажа после облучения. 1, 2 - одна неделя инкубации после облучения (40 Гр и 80 Гр соответственно); 3, 4 -25 дней (40 Гр и 80 Гр „ соответственно); М - маркерная ДНК.

8 6 5 4

Соотношение между клеточной геномной и вирусной ДНК определяли после фракционирования тотальной ДНК клеток в 1% агарозном геле Для

1 2 3 4 М

анализа использовали инфицированные клетки 10"° пассажа, культивируемые в течение 7 и 25 дней после облучения

Результат электрофореза представлен на рисунке 8. Как видно на рисунке, через неделю после облучения вирусная ДНК представлена в тотальной ДНК слабой дополнительной фракцией (рис 8, дорожки 1 и 2); через 25 дней в обоих экспериментах (40 Гр и 80 Гр рад) наблюдалась сильная фракция вирусной ДНК, сопоставимая по яркости с геномной (рис. 8, дорожки 3 и 4).

Таким образом, можно заключить, что результаты эксперимента подтверждают гипотезу, согласно которой при увеличении числа копий денсовируса в инфицированной клетке включается регуляторный механизм, ограничивающий репликацию вируса. Возможно, это является следствием саморегуляции, обусловленной генами денсовируса

3. Анализ тканеспеиифичности развития вирусной инфекции

Эксперименты in vitro с пересеваемыми культурами клеток рыжего таракана убедительно продемонстрировали зависимость хода инфекционного процесса от типа клеточной культуры (смотрите главу 2) Самостоятельной задачей нашего исследования являлся анализ тканеспецифичности развития вирусной инфекции in vivo, то есть в организме инфицированного насекомого.

В экспериментах использовали насекомых линии Рб, проявляющих признаки заболевания. Продольным разрезом насекомых разделяли на две части, одну из которых использовали для выделения тотальной ДНК, которую анализировали методом гель-электрофореза В случае обнаружения фракции вирусной ДНК в количестве, сходном с геномной ДНК (то есть при подтверждении, что вирус активно реплицируется в клетках данной особи), вторую часть насекомого исследовали методом электронной микроскопии.

Этим методом было показано, что у инфицированных вирусом тараканов развитие вируса происходит не во всех тканях: активное формирование вирусных частиц происходит в клетках пищеварительного тракта и жировом теле, при этом вирусных частиц не было выявлено в мышечной ткани и в мозге (рисунок 9)

Известно, что о отека представляет собой специализированный орган самки таракана, в котором происходит эмбриональное развитие насекомых следующего поколения У самок рыжего таракана оотеки представляют собой в значительной степени обособленный орган (особенно на поздних стадиях развития эмбрионов),

Рисунок 9. Электронная микроскопия клеток А - жирового тела, Б - мышечной ткани таракана, инфицированного денсовирусом. Стрелочками указаны скопления вируса.

однако долгое время сохраняющий клеточные контакты с тканями материнского организма.

В ходе эксперимента оотеки на поздних стадиях развития механически отделяли от самок линии Р6, и тотальную ДНК, экстрагированную отдельно из тел самок и из принадлежащих им оотек анализировали методом гель-электрофореза Показано, что активная репликация вируса происходит только в теле насекомого - в препаратах тотальной ДНК, экстрагированных из оотек инфицированных насекомых, дополнительной фракции, соответствующей вирусной ДНК, обнаружено не было.

4. Заражение рыжего таракана денсовирусом ВоОМУ методом микром нъекиий. Поддержание вируса в лабораторных условиях

Несколько зараженных денсовирусом тараканов на стадии поздней инфекции гомогенизировали тефлоновым пестиком в культуральной клеточной

А

Б

среде. Полученный гомогенат пропускали через фильтр 0,22 мкм, и очищенный раствор (-5 мкл) инъецировали под кутикулу тараканам с помощью шприца для микроинъекций (Hamilton Company) Микроинъекции проводили в тараканов линии Normal, не содержащих, как было показано ранее, SgDNV.

Через несколько дней после микроинъекций начинается массовая гибель тараканов (смотрите Табл 2). Показано, что тотальная ДНК тараканов, умерших в результате вирусной инфекции, содержит дополнительную фракцию, соответствующую вирусной ДНК.

Вирус-содержащий раствор инъецировали в 40 нимф Одна особь погибла от механических повреждений в ходе микроинъекции После электрофореза тотальной ДНК, экстрагированной из тараканов, умерших через определенное время (см Табл 2), после инфицирования денсовирусом 36 особей содержали дополнительную фракцию вирусной ДНК, 3 особи - дополнительной фракции ДНК не содержали

Таблица 2. Эксперимент по заражению денсовирусом в лабораторных условиях.

Количество суток, Количество погибших Наличие

прошедших со дня тараканов дополнительной полосы

инъекции

3 1 1 +

7 2 2+

8 4 4+

14 10 10+

18 11 9+

2-

20 4 4+

21 2 2+

22 1 1-

23 3 3+

24 1 1+

На рисунке 17 показан результат электрофореза с ДНК особей, зараженных вирусом путем инъекции.

Т.П.О. Рисунок 17. Электрофорез

тотальной ДНК тараканов, зараженных путем микроинъекций денсовирусом. Стрелочкой показана фракция вирусной ДНК.

5-0 Как видно на рисунке 17, на

дорожках 1 и 3 вирусной ДНК значительно меньше, чем на дорожках 2 и 4, то есть гибель тараканов может наступать при различном количестве вируса.

Ранее (смотрите главу 2) нами было показано, что репликация вируса в пересеваемой культуре клеток не является стабильной после последовательных пассажей количество ДНК вируса относительно клеточной эдерной ДНК резко сокращается Очевидно, что пересеваемую культуру клеток рыжего таракана нельзя рассматривать в качестве инструмента для длительного поддержания денсовируса в лабораторных условиях Напротив, разработанный нами метод микроинъекций вирус-содержащего раствора под кутикулу тараканов представляется оптимальным для этой цели

5. Определение видоспеииФичнотти вируса.

Разработанный метод микроинъекций вирус-содержащего раствора под кутикулу тараканов (смотрите главу 4) нами был использован для анализа видоспецифичности исследуемого денсовируса. Вирус-содержащий раствор инъецировали в гемолимфу трем близкородственным В. germanica видам тараканов: Suppella longipalpa, Blattella vag а, Leocophaea maderae Показано, что после инфицирования тараканов этих видов SgONV гибели насекомых не наблюдается, электорофоретический анализ тотальной ДНК инфицированных тараканов не выявил дополнительной полосы, соответствующей репликативным формам вируса. В тоже время, в контрольной группе происходила массовая

гибель Blattella germanica и электорофоретическим анализом тотальной ДНК инфицированных тараканов были выявлены дополнительные полосы, соответствующее репликативным формам вируса.

Таким образом показано, что исследуемый денсовирус является строго видоспецифичным, однако природа выявленной видоспецифичности требует дополнительного анализа.

в. Обнаружение ротроэламвитов рыжего таракана и анализ их азаимопеметяня с дансоаирусом floDNV

Обнаружение ретроидных элементов рыжего таранена

В рамках исследования структурно-функциональной организации денсовируса нами были амплифицированы и клонированы фрагменты ДНК, соответствующие открытым рамкам считывания генома вируса Схема взаимного расположения ОРС вируса и локализация праймеров, использованных для амплификации заданных участков вирусного генома, представлена на рисунке 11. В качестве матрицы использовали тотальную ДНК, экстрагированную из тараканов, инфицированных вирусом.

Известно, что ПЦР является эффективным высокочувствительным методом, однако при работе данным методом необходимо использовать максимальное количество контролей, подтверждающих специфичность продукта реакции На стадии отработки оптимальных условий амплификации, особенно в случаях, когда матрицей является ДНК, содержащая субповторы и способная формировать сложные вторичные структуры (примером такой матрицы является ДНК исследованного денсовируса) большое значение приобретает использование «отрицательных» контролей, в частности, праймеров и их различных сочетаний, которые в случае специфичной ПЦР не должны амплифицировать матричную ДНК. Так, при амплификации ОРС 4, кроме пары праймеров За/4а (5'-ctttggactcactatgggagatg-3') - 4b (5'-ttattcctgtagctcctccg-3'), обуславливающих в оптимальных условиях ПЦР амплификацию заданного участка вирусного генома, мы использовали пару праймеров За/4а' (5'-gaaacctcagtgataccctctac-3') и 4Ь' (5'-aataaggacatcgaggaggc-З'), где праймеры За/4а' и 4Ь' представляют собой,

последовательности ДНК, комплементарные праймерам За/4а и 4Ь, соответственно

' оюа

4V ЗаМ»

Рисунок 11. Схема структурной организации денсовируса SgDNV. ORF1, ORF2, ORF3, ORF4 и ORF5 - соответствующие ОРС. la-lb, 2a-2b, 3a/4a-3b, 3a/4a-4b и Sa-5b - пары праймеров, фланкирующие соответствующие ОРС (направление стрелок указывают на ориентацию праймеров). За/4а' и 4Ь' - праймеры, комплементарные За/4а и 4Ь, соответственно.

Очевидно, что при проведении ПЦР с праймерами За/4а' и 4Ь', продукта

амплификации вирусного генома наблюдаться не должно.

Т.п.о.

К нашему удивлению, при использовании пары праймеров За/4а' - 4Ь' в широких диапазонах температуры отжига и концентрации ионов магния в результате ПЦР тотальной ДНК инфицированных вирусом тараканов наблюдалась стабильная амплификация трех фрагментов ДНК размером 2,1; 0,9 и 0,73 т.п.о, соответственно (рис.12).

Рисунок 12. Результат ПЦР тотальной ДНК инфицированных денсовирусом рыжих тараканов с «контрольными» праймерами За/4а' и 4Ь'. Дорожка 1: а и b мажорные амплифицированные фрагменты, звездочка - минорный фрагмент. Дорожка 2 -маркерная ДНК.

Используемые условия ПЦР не позволяют строго судить о количественных соотношениях между амплифицируемыми фрагментами, однако следует отметить, что фрагмент 0,9 т.п.о., в отличие от двух других, во всех проведенных экспериментах (более десяти) был представлен минорными количествами ДНК.

2,5

Ь - 2,0

tmm 1.0

,..„40 0,75 0,5

1 2

Фрагменты ДНК размером 0,73 и 2,1 т.п о. (на рисунке 12 обозначены как а и Ь, соответственно) были клонированы и секаенированы

Сравнение нуклеотидных последовательностей фрагментов а и Ь с последовательностями нукпеотидов, представленными в базе данных GenBank посредством программы BLAST (blastn), не выявило значимой степени сходства.

Во фрагменте а было обнаружена одна открытая рамка считывания, во фрагменте Ь - две. При сравнении аминокислотных последовательностей ОРС фрагмента а и одной из ОРС фрагмента b (ОРС1) с базой данных белков Swissprot посредством программы BLAST (blastx) были выявлены значимые сходства с последовательностями аминокислот, соответствующих высококонсервативному аминокислотному домену белка обратной транскриптазы, принадлежащей различным ретротранспозонам насекомых (рис 13).

Как видно на рисунке 13, транслированная in silico ДНК фрагмента а выявляет максимальную степень сходства с аминокислотной последовательностью обратной транскриптазы не содержащего длинные концевые повторы (non-LTR) ретротранспозона наездника Nasonia vitripennis -каталожный номер GenBank L00950, а ОРС1 фрагмента b - с высококонсервативным доменом обратной транскриптазы ретротранспозона Bombyx топ.

Сравнение последовательности нукпеотидов ОРС фрагмента а и ОРС1 фрагмента b между собой показало, что они имеют значительное сходство (более 80%), но не идентичны (рисунок 14).

Не менее неожиданный результат был получен при сравнении гипотетической последовательности нукпеотидов второй ОРС фрагмента b с электронной базой данных белковых последовательностей. Выявлено высокое сходство с доменом аминокислот белка капсиды денсовируса Bombyx morí (рис.15).

На данный момент не ясно, являются ли выявленные фрагменты ретроэлементов частями мобильных элементов или же ретровирусов. Очевидно, что описание полноразмерных копий данных элементов позволит лучше понять их природу и выявить филогенетическое родство. Нельзя исключить, что обнаруженные ретро элементы представляют собой некий связующий (промежуточный) класс вирусов, филогенетически родственный как ретро-, так и денсовирусам.

А

Аминокислот: идентичных - 31% (44/140), позитивных - 53% (75/140)

а R2- -Hv 375 511 KGGVAGSLLSPILFNIFIDSLPRTQRTKHSSFLLGSHRINSLLYADDIVLVSSTRSGI.QS +G G LSP+LFN +D++ R + +++ FL+G+ +1 +L++ADD+VL++ TR GLQ+ RGVRQGDPLSPLLFNCVMDAVLR-RLPENTGFLMGAEKXGALVFADDLVLLAETREGLQA 554 569

а R2- -Ят 555 570 MLDTCERHSISHGYVFAPSKCEVIA—PQGKKTPC-------VTMYGEKVRK---TPSFK LE G Р КС +А Р GK+ Т+ +++ + +Х SLSRXEAGLQEQGLEMMPRKCHTLALVPSGKEKKIKVETHKPFTVGNQEITQLGHAOQWK 698 629

• R2- ■Hv 699 630 YLGVPFNDKGVDMAELCVEG 758 YLGV +N G ++ + G YLGWYNSYGPIQVKINIAG 649

Б Аминокислот: идентичных - 46% (32/69), позитивных - 63% (44/69)

ь Rt- -Вв 224 512 VPSNV1HTAVLHMIWKGKGRRDEIDKYRPIALTSIFRKVLEKTMIAQLQEY-EDR—LDVA VPS+W TA +И I К KG R + YRFIA+TS+ KV+E+ + QL +Y EDR + VPSSWKTAHVHPIPK-KGDRSDPSSYRPIAITSLLSKVMERIINIQLLKYLEDRQLISDR 394 570

ь 395 QGGFIKGKA 421

Q GF G++ Rt-B» 571 QYGFRHGRS 579

Рисунок 13. Сравнение гипотетической последовательности нуклеотидов А - ОРС фрагмента а; Б - ОРС1 фрагмента Ь с базой данных Swissprot. Условные обозначения:

а и b - фрагменты соответствующих аминокислотных последовательностей ОРС амплифицированных фрагментов ДНК а и Ь.

h2-hv - высококонсервативный домен обратной транскриптазы ретротранспозона Nasonia vilrípennisi Rt-вш - высококонсервативный домен обратной транскриптазы ретротранспозона Bombyx morí.

Активизаций выявленных ретроалемвнтов под действием денсовируса BgONV

Для дальнейшего исследования выявленных ретроэлементов, на основе определенных последовательностей нуклеотидов фрагментов а и b нами были созданы пары праймеров, полностью комплементарных данным ретроэлементам (а1 - 5'-cagcacatacgacttgatac-37 а2 - 5'-gtacatcgtgacgcacggag-3' - для фрагмента а; M - 5'-gagggtccgatggtatcacg-37 Ь2 - 5'-ccttgcggaatatgctagtc-3" - для фрагмента Ь).

90 100 110 120 130 140 150 160

ь aatcccgttacgtccaccccctggtcgttgaatcggatccccaaatatwaaacgataacgtctgtcttgccatt :t i s i t ti il im tiiiintiit t tu ttttt niiiiii n i im ii ц m aactccgccatatcaactcccttatcgttgaatggcacccctaaatacttaaacgacggagtttttcttaccttt 10 20 30 40 50 60 70

1*70 iso 190 200 210 220 230

b tctccatatagcctggcatatggaggttctttaccttgggggcttattatttcacacttagatggcgaaaacacg mit ti i i u t i i : i : : : : 111111111 : : 11:11 i : : i ; : 1i11111i t 111111

• tctccgtacatcgtgacgcacggagtctttttaccttggggggctattacttcgcacttagatggtgcaaacaca 80 90 100 110 120 130 140 150

240 250 260 270 280 290 300 310

ь tacccatggctaatactatgctgttcgcaggtgactagcatactctgtagttgttcttgtgttctagccaccaac

iiiiiiiliil tiitiittt i lim ni iiiiiii ti util Ulli iiii in in

ii tacccatggctgatactatgccgctcgcacgtgtctagcatgctttgtagccccgxatg'rgtcctagacactaac

160 170 180 190 200 210 220

320 330 340 350 360 370 380

ь acagtgtcgtcgecgtacagcaaagagttgatcctgtggctacctagcaagaagcttgagtgcttcctgcggagg

ii : í1111111111111111111 i(iitiiiiiii:i i с 111111111111111 iittii iiii i > acgatatcgtcggcgtacagcaaagaattgatcctctggctgcctagcaagaagcttgaatgcttcgigcgctgt 230 240 250 260 270 280 290 300

390 400 410 420 430 440 450 460

ь gtcctcgggagagtatcgatgaatatgttgaagagcatcggtgataataacgagccc tg-caacaatcctcttcc

11 11 ihm i 11 11 i 1 i 1 i 1 1 i i t i 1 1 i ttlltlttll! iui! Hill 11111 11 Ulli

a gttctcgggagggagtctataaatatgttgaagagaatcggtgataacaacgacccctggcaacaccccccttcc

310 320 330 340 350 360 370

470 480 490 500 510 520 530

ь catagggactttcctagatgcttgccccccgatccttattgtagtttcggcataatcgaacaaacacttcaaaag

ii lit 11 I11I1II! ! Hill 1 I i I I 1 1 1 1 Ï 1 t I I I tut ii llltllllll 11 tili II

• caaaggtaccttcctagacccctgccctccgatcotattgtaatttctgcgcaatcgaacaagcatttcaggag 380 390 400 410 420 430 440 450

540 550 560 570 580 590 600 610

ь -gacaagaggccctcctttaatgcctatcccattgcact-cttccacaatatgtctcggttgactgtatcgtagg

• tgccaagaggccc-cctttaatgcccatcctactgcacttcttccacaatatgtctcgattgactgtgtcgtagg

460 470 480 490 500 510 520

620 630 640 650 660 670

ь ccccctttatgtccaggaaggcctgccaacagtccct-ttctttctccactcctctttgacaa

t iiiiiiititiii llitlt itiittt Ii Ii iii hihi i itii tili Ii « cgccctttatgtccaaaaaggccagccaacaatctctcttccttctgctccgctccttgataa

530 540 550 560 570 580 590

Рисунок 14. Сравнение последовательности нуклеотидов ОРС фрагмента а и ОРС1 фрагмента b между собой. Выявлено 80,1 %-ное сходство фрагментов а и b на протяжении 588 нуклеотидов.

Первая пара праймеров позволяет амплифицировать методом ПЦР внутренний фрагмент "ретроэлемента а" величиной 542 п о, вторая пара внутренний фрагмент "ретроэлемента Ь" величиной 212 п.о.

Аминокислот: идентичных - 30% (17/56), позитивных - 50% (28/56)

ь 167 slslfcsthcpcfhïngwlstassvfscavavpwvysssvdvilvhpitwslvant 334

s +гс cp i+gw s s+ + a++ + + s v +pi+ +kt bndhv 3137 salifcpatcpnslisgwfswfsriaalallillilaqsfsvdfllpipykglpnt 2970

Рисунок 15. Сравнение гипотетической аминокислотной последовательности ОРС2 фрагмента b с базой данных Swissprot. Условные обозначения: ь -соответствующая аминокислотная последовательность ОРС 2 фрагмента Ь. bbidnv - последовательность аминокислот белка капсиды денсовируса Bombyx mon (SmDNV), каталожный номер АВ042597.

Методом ПЦР с использованием вышеописанных праймеров было показано, что количество ретроэлементов а и Ь в тотальной ДНК тараканов разных линий может колебаться в определенных пределах - наиболее значительные различия были выявлены при сравнении тараканов инфицированных и неинфицированных денсовирусом BgDNV. На рисунке 16 представлен результат ПЦР с праймерами а1 - 5'-cagcacatacgacttgatac-37 а2 - 5-gtacatcgtgacgcacggag-3' тотальной ДНК, экстрагированной из тараканов линии Р6, - как было описано выше, все особи данной линии инфицированы денсовирусом ВдDNV - (дорожки 1 и 2) и линии Normal, не содержащей денсовируса (дорожка 6). Как видно на рисунке, количество продуктов амплификации в анализируемых линиях значительно различались: следовые количества в линии Normal и яркий фрагмент ДНК в линии Рб Однако отметим, что данный эффект мог быть обусловлен не влиянием денсовирусной инфекции, а некими межлинейными различиями

Для демонстрации того, что инфицирование рыжего таракана BgDNV приводит к увеличению числа копий ряда ретроэлементов (ретротранспозонов и/или ретровирусов) клеток хозяина была поставлена серия дополнительных опытов.

В нашей дальнейшей работе мы использовали три типа тотальной ДНК' тараканов линии Normal, не инфицированных денсовирусом, тараканов из линии Р6, инфицированной BgDNV, и тараканов линии Normal, которые были заражены вирусом путем микроинъекции Описание метода инфицирования тараканов BgDNV посредством микроинъекций смотрите в разделе 5. После амплификации тотальной ДНК тараканов линии Normal с праймерами, комплементарными фрагменту а, наблюдалась слабая полоса (рисунок 16, дорожка 6). В случаях амплификации тотальной ДНК тараканов линии Р6 и тараканов линии Normal,

которые были заражены вирусом путем инъекций, наблюдался продукт

амплификации в большем количестве (рис 16, дорожки 1,2 и 3,4,5 соответственно).

Рисунок 16. Результат ПЦР с праймерами, комплементарными фрагменту а. ДНК тараканов линий: 1, 2 - Р6, 3, 4, 5,-Normal, которые были заражены денсовирусом путем микроинъекций, 6 -Normal. М - маркерная ДНК.

Отметим, что используемый метод ПЦР не является количественным и не позволяет строго судить о количестве амплифицированного продукта. Кроме того, известно, что неспецифические примеси тотальной ДНК могут значительно снижать количество ПЦР-продукта. На рисунке 17 приведен результат гель-электрофореза продуктов ПЦР тотальной ДНК тараканов линии Normal, зараженных денсовирусом путем микроинъекций (дорожка 1), и свободных от вируса (дорожка 2) с двумя парами прймеров, первая из которых комплементарна ретроэлементу а, вторая - фрагменту рДНК рыжего таракана Как видно на рисунке, после окраски бромистым этидием продукты амплификации, соответствующие рДНК, имеют сходную интенсивность свечения, а продукты амплификации, соответствующие ретроэлементу, количественно различаются Данный эксперимент, с нашей точки зрения, убедительно демонстрирует, что выявленные различия в интенсивности свечения продуктов амплификации обусловлены различиями в количестве ДНК-матрицы, то есть различиями количества ретроэлементов в анализируемой тотальной ДНК, а не некими неспецифическими факторами, потенциально способными приводить к ослаблению ПЦР.

Методические подходы, используемые для демонстрации активизации ретроэлемента а под действием денсовирусной инфекции, были применены для анализа активизации ретроэлемента b Показано, что в результате ПЦР с праймерами, комплементарными фрагменту Ь, и тотальной ДНК тараканов из незараженной денсовирусом популяции продукт амплификации представлен в следовых количествах. В тоже время, когда использовали тотальную ДНК

П.о.

~W

750 500

250

1 2 3 4 5 М 6

1 2

И.о.

5000

Рисунок 17. Результат ПЦР с двумя парами праймеров: первая из которых комплементарна ретроэлементу, вторая - фрагменту рДНК рыжего таракана - тотальной ДНК тараканов. 1 -линии Normal, зараженных денсовирусом путем микроинъекции; 2 -линии Normal. Стрелочкой показаны продукты амплификации с праймерами, комплементарными рибосомальным генам; звездочкой показаны продукты амплификации с праймерами, комплементарными фрагменту а.

500 тараканов из линии Р6 или ДНК тараканов, зараженных ВдОШ посредством микроинъекций, - продукт амплификации представлял собой мажорную фракцию.

Таким образом, показано, что выявленные нами ретроалементы (а и Ь) присутствуют в различных линиях рыжего таракана и что заражение тараканов ВдОМУ индуцирует увеличение числа их копий.

Демонстрация индукции активизации ретроэлементов под действием вирусной инфекции представляет, с нашей точки зрения, общебиологический интерес. В частности, полученные результаты, с нашей точки зрения, предполагают разработку новых подходов для оценки последствий «безобидных» вирусных инфекций для генома клеток человека.

выводы

1) Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) исследована распространенность денсовируса BgDNV в природе Показано, что две из трех исследованных популяций тараканов на территории США инфицированы денсовирусом. При исследовании тараканов, отловленных в квартирах жилых домов из разных районов городов' Москва (Россия) и Киев (Украина) - пять и две выборки по 30 особей, соответственно; и ряда лабораторных линий SgDNV обнаружен не был.

2) Определена динамика развития денсовируса BgDNV в лабораторной линии Р6, хронически инфицированной изучаемым вирусом Показано, что вирус может находиться в двух формах: «активной» и «неактивной» В первом случае методом окраски бромистым этидием и/или блот-габридизацией выявляются мультимерные репликативные формы вируса и ДНК вирусных частиц; во втором -присутствие вируса можно выявить только методом ПЦР

3) Методами электронной микроскопии описаны цитопатологические эффекты, обусловленные вирусной инфекцией. Показано, что у инфицированных вирусом тараканов развитие вируса происходит не во всех тканях' активное формирование вирусных частиц происходит в клетках пищеварительного тракта и жировом теле, при этом вирусных частиц не было выявлено в мышечной ткани и в мозге

4) Исследована динамика роста денсовируса BgDNV в пересеваемой культуре клеток рыжего таракана Показано, что репликация вируса в пересеваемой культуре клеток не является стабильной' после последовательных пассажей количество ДНК вируса относительно клеточной ядерной ДНК резко сокращается

5) Разработан новый метод поддержания изучаемого денсовируса в лабораторных условиях Метод основан на микроинъекции раствора, содержащего вирусные частицы, под кутикулу рыжего таракана.

6) Исследована видоспецифичность денсовируса BgDNV Показано, что близкородственные В germanica виды тараканов- Suppella longipalpa, Blattella vaga, Leocophaea maderae невосприимчивы к исследованному вирусу

7) Показано, что инфицирование рыжего таракана BgDNV приводит к активизации (увеличению числа копий) ряда ретроэлементов (ретротранспозонов

и/или ретровирусов) клеток хозяина. Клонированы и ееквенированы протяженные фрагменты ДНК двух ретроэлементов, активизируемых инфекцией денсовируса SgrDNV Показано, что оба фрагмента имеют открытую рамку считывания (ОРС), гомологичную обратной транскриптазе ретротранспозонов насекомых; кроме того, один из клонированных фрагментов содержит дополнительную ОРС, гомологичную белку оболочки денсовируса насекомых, не идентичную BgONV.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Чумаченко А.Г., Шал К., Муха Д.В. В.Обнаружение ретротранспозонов рыжего таракана Blattella germanica. Доклады Академии Наук, 2005, т. 401, № 1, С.112-116.

2) Chumachenko А , Mukha D. New cockroach-specific densonudeosis virus: virus and host Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. Kyiv, Ukraine. September 25-27, 2003, p. 11.

3) Чумаченко А Г., Шал К, Муха Д.В. Денсовирус рыжего таракана Blattella germanica (SgONV)- характеристика структурно- функциональной организации и анализ взаимоотношений с организмом хозяина III съезд ВОГис, Москва, 2004, 6-12 июня, т1, с 29

4) Чумаченко А.Г., Шал К., Муха Д.В. Денсовирус рыжего таракана- генетический аспект взаимодействия вирус/ хозяин Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных Материалы международной научной конференции Сарансх, 2005, с. 261-262.

5) Чумаченко А Г Новый денсовирус рыжего таракана' вирус и хозяин 8-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2004,17-21 мая, с. 39.

6) Чумаченко А Г Мобильные элементы рыжего таракана 9-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых Пущино, 2005, 18-22 апреля, с. 61.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 06 02.2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ л. 1,5 Тираж 90 экз Заказ 064. Тел. 939-3890. Тел /Факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М В Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

- 5 4 92

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чумаченко, Анастасия Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Денсовирусы

Общая характеристика денсовирусов 8 Краткое описание структурно-функциональной организации денсовирусов, инфицирующих различные виды насекомых 13 Генетические элементы, содержащие домен обратной транскриптазы

Мобильные элементы

Типы мобильных элементов

Дупликация сайтов-мишений 58 Мобильные элементы как диспергированные повторяющиеся последовательности.

Индукция мобильных элементов под действием стресса

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Условия содержания В. germanica

Постановка скрещиваний

Линии В. germanica, использованные в работе

Выделение тотальной ДНК рыжего таракана

Электрофорез в агарозном геле

Полимеразная цепная реакция

Получение очищенных продуктов ПЦР

Лигирование фрагментов ДНК

Трансформация клеток Е. со// 69 Выделение и очистка плазмидной ДНК для идентификации рекомбинантных молекул 70 Рестрикция рекомбинантных плазмид для установления длины вставки

Секвенирование ДНК

Компьютерный анализ

Саузерн-блот гибридизация

Поддержание пересеваемой культуры клеток B.germanica

Облучение клеток у-лучами

Микроинъекции вирусных частиц под кутикулу тараканов

Электронная микроскопия срезов ткани тараканов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Распространенность денсовируса BgDNV в популяциях рыжего таракана

2. Пересеваемая культура клеток рыжего таракана как модель для изучения денсовируса

3. Анализ тканеспецифичности развития вирусной инфекции

4. Заражение рыжего таракана денсовирусом BgDNV методом микроинъекций. Поддержание вируса в лабораторных условиях

5. Определение видоспецифичности вируса

6. Обнаружение ретроэлементов рыжего таракана и анализ их взаимодействия с денсовирусом BgDNV

Обнаружение ретроидных элементов рыжего таракана 93 Активизация выявленных ретроэлемёнтов под действием денсовируса BgDNV

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Денсовирус рыжего таракана Blattella germanica"

Актуальность проблемы

К настоящему времени описано около 25 денсовирусов различных видов беспозвоночных. Денсовирусы содержат линейную однонитевую молекулу ДНК. Размер вирионов денсовирусов составляет 18-25 нм. Длины геномов варьируются от 4000 до 6100 п.о. На флангах геномов денсовирусов находятся концевые инвертированные повторы (КИПы), образующие вторичные структуры. КИПы играют важную роль в автономной репликации вирусной ДНК.

Денсовирусы входят в семейство Parvoviridae, которое состоит из двух подсемейств - Parvovirinae и Densovirinae. Парвовирусы инфицируют клетки млекопитающих животных, денсовирусы - клетки членистоногих, главным-образом насекомых. Свое название они получили из-за содержания в ядрах зараженных клеток плотных, темных масс вирионов. Большинство денсовирусов вызывают летальные заболевания организма-хозяина.

Известно, что денсовирусы - эффективные переносчики генетической информации и могут быть использованы в качестве вектора в генетической инженерии, в частности, для экспрессии чужеродного генетического материала в клетках насекомых. В настоящее время несколько видов денсовирусов были успешно использованы для этих целей [Afanasiev B.N., Ward T.W., Beaty В. J., Carlson J.O., 1999].

Кроме того, описанная «особенность» позволяет на стадии клонированного в плазмидном векторе вируса осуществлять с его ДНК любые генно-инженерные манипуляции, а затем изучать, как внесенные изменения скажутся на фенотипе (свойствах) вируса.

В 2000 году Д.В. Муха и К. Шал обнаружили новый денсовирус - денсовирус рыжего таракана (SgDNV) [Муха Д.В. Шал К., 2003] и приступили к его изучению.

Данный вирус на сегодняшний момент является единственным описанным денсовирусом рыжего таракана.

Можно надеяться, что создание векторных конструкций на основе BgDNV позволит на новом уровне изучать молекулярно-генетическую организацию данного вида насекомых и разработать новые экологически чистые методы регуляции численности этого синантропного паразита.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы было изучение взаимодействия между денсовирусом (BgDNV) и его хозяином (В. germanica).

Были поставлены следующие задачи:

1) Изучить распространенность денсовируса в популяциях рыжего таракана;

2) Исследовать динамику роста вируса BgDNV в культуре клеток;

3) Описать цитопатологические эффекты, вызываемые вирусной инфекцией;

4) Исследовать тканеспецифичность денсовирусной инфекции рыжего таракана;

5) Разработать метод поддержания вируса в лабораторных условиях;

6) Исследовать степень видоспецифичности BgDNV;

7) Исследовать геномные изменения в организме рыжего таракана, вызываемые вирусной инфекцией.

Список сокращений

DNV-денсовирусы,

NS - неструктурный белок,

VP -структурные белки,

КИП - концевые инвертированные повторы,

МЭ - мобильные элементы,

ОРС - открытая рамка считывания,

ПЦР - полимеразная цепная реакция, т п.о. - тысяч пар нуклеотидных остатков.

PEG - полиэтиленгликоль

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Денсовирусы

Общая характеристика денсовирусов

Денсовирусы (DNVs) являются членам семейства Parvoviridae, которое состоит из двух подсемейств: Parvovirinae и Densovirinae. Парвовирусы - вирусы позвоночных, тогда как денсовирусы - вирусы членистоногих животных, главным образом насекомых. В настоящее время известно пять различных отрядов насекомых (Lepidoptera, Orthoptera, Diptera и Odonate) у представителей которых обнаружены денсовирусы [Fediere, 2000]. К настоящему времени открыто около 25 денсовирусов [Tijssen P., Li Y., El-Far М., Szelei J., Letarte M., Zadori Z., 2003].

Около 25 денсовирусов были выделены из различных видов беспозвоночных: насекомых, креветок [Shike Н., Dhar А.К., Burns J.С., Shimizu С., Jousset F.-X., Klimpel K.R., Bergoin M., 2000]. Физико-химические свойства денсовирусов подобны свойствам парвовирусов позвоночных, хотя они имеют очень небольшое сходство нуклеотидных последовательностей [Chapman М. S., Rossmann М. G., 1993].

Подсемество денсовирусов делится на три рода: один род (Densovirus) содержит денсовирусы, цепи ДНК которых упаковываются примерно в одинаковом количестве, с геномом размером около 6 т.п.о, содержащем длинные инвертированные терминальные повторы, такие, как Junonia coenia DNV (JcDNV) и денсовирус Galleria mellonella, GmDNV; второй род (Brevidensovirus) состоит из денсовирусов, у которых упаковывается преимущественно одна цепь, с геномом размером около 4 т.п.о., неодинаковые терминальные «шпильки», например, денсовирус Aedes (AaeDNV); в третий род (Interavirus) входят вирусы, у которых упаковывается'преимущественно одна цепь, с геномом размером около 5 т.п.о., содержащим довольно короткие КИПы (Casphalia DNV, Bombix mori DNV). Некоторые денсовирусы, нуклеотидная последовательность которых определена к настоящему времени^не подходят под данное разделение на три рода. Многие другие денсовирусы остаются неклассифицированными из-за отсутствия их молекулярных характеристик.

Ядра зараженных денсовирусами клеток становятся темными, электронная микроскопия позволяет рассмотреть плотные массы вирионов. Из-за этого свойства денсовирусы получили свое название [Vago С., Duthoit J.L. Delahaye F., 1966].

Это предположительно обусловлено тем, что эти вирусы автономно реплицируются и собираются в ядре. Как правило, денсовирусы вызывают смертельные заболевания хозяев [TanadaY., Кауа Н. К., 1993]. Первые симптомы - потеря аппетита, вялость, подавление линьки и метаморфоза. Личинки насекомых становятся белесыми, у них наблюдаются признаки паралича конечностей. Такие симптомы у >4aeDNV и /W/DNV. Таракан P. fuliginosa, зараженный P/DNV, проявляет сходные симптомы: перед смертью задние ноги парализуются, и их движения становятся нескоординированными. Другие денсовирусы вызывают опухоли в кишках хозяев, эпителиальные клетки средней кишки зараженных личинок разрастаются, становятся тонкими и полупрозрачными.

Денсовирусы имеют гексагональную форму с диаметром 19-22 нм и содержат линейную однонитевую молекулу ДНК протяженностью примерно 5-6 т.п.о. В зависимости от типа вируса вирусные частицы могут содержать или преимущественно комплементарную мРНК нить ДНК (например, >4aeDNV), или обе нити примерно в равном отношении (например, JcDNV) [ Bergoin М., Tijssen P.,

2000]. В том случае, когда в различных вирусных частицах упакованы как «плюс», так и «минус» нити, при выделении тотальной ДНК в условиях высокой концентрации соли происходит формирование двухцепочечной ДНК.

Фланги ДНК денсовирусов содержат концевые инвертированные повторы (КИП), способные формировать вторичные структуры. У некоторых вирусов, например у JcDNV, КИП являются одинаковыми на обоих концах вирусной ДНК [Dumas В., Jourdan М., Pascaud А.-М., Bergoin М., 1992]; у других, например, у /\aeDNV, КИП представлены различающимися последовательностями [Afanasiev B.N., Galyov Е.Е., Buchatsky L.P., Kozlov Y.V., 1991]. Показано, что КИП играют важную роль в процессе автономной репликации вирусной молекулы [Astell C.R., 1990]. Все денсовирусы, нуклеотидная последовтельность которых определена к настоящему времени, имеют несколько открытых рамок считывания (ОРС). В зависимости от типа вируса ОРС могут быть локализованы в одной или обеих цепях вирусной ДНК. Часть из них кодирует последовательности, экспресирующие белки вирусной капсулы, другие ОРС экспрессируют неструктурные регуляторные белки [Bergoin Мм Tijssen Р., 2000].

Вирус - эффективный переносчик генетической информации и может быть использован как вектор в генетической инженерии. Денсовирусы, измененные методами генетической инженерии, могут быть использованы в качестве удобных векторных систем для генетических манипуляций с насекомыми; в настоящее время несколько денсовирусов были успешно использованы для этих целей. Другая интересная возможность заключается в использовании вирусов насекомых для контроля над численностью, используя вирус для доставки гена специфического для насекомых токсина.

Клонированная в плазмидном векторе ДНК денсовирусов после трансформации клеток соответствующего насекомого рекомбинантной ДНК способна «вырезаться» из плазмиды - при этом вирус начинает «самостоятельную» жизнь, то есть реплицируется, экспрессирует вирусные белки и формирует вирусные частицы [Afanasiev B.N., Ward T.W., Beaty В. J., Carlson J.O., 1999]. Это является одной из особенностей денсовирусов и позволяет рассматривать данный тип вирусов в качестве уникального инструмента для генетических манипуляций с насекомыми. Действительно, описанная «особенность» позволяет на стадии клонированного вируса осуществлять с его ДНК любые генно-инженерные манипуляции, а затем изучать, как внесенные изменения скажутся на фенотипе (свойствах) вируса. Кроме того, денсовирусы можно использовать как векторные системы для экспрессии чужеродного генетического материала в клетках насекомых.

Показано, что для репликации вирусной ДНК принципиальным является сохранение КИПов, а «тело» вирусной ДНК может быть заменено любыми последовательностями, в частности, генетическими конструкциями, содержащими репортерный ген под контролем исследуемого промотора. Очевидно, что для репликации и упаковки в вирусные частицы рекомбинантной ДНК, сохранившей от вируса только КИПы, необходима одновременная экспрессия как регуляторных вирусных белков, так и белков капсиды. В описанных экспериментах это достигается посредством одновременной трансформации клеток двумя типами рекомбинантной ДНК: 1) плазмидой, содержащей КИПы и репортерный ген, 2) плазмидой, содержащей нативную вирусную ДНК. Показано, что часть вирусных частиц после котрансформации клеток насекомого описанными плазмидами содержит нативную вирусную ДНК, то есть представляют собой «обычный» вирус, в то время как другая часть вирусных частиц содержит рекомбинантную ДНК с репортерным геном. Относительным ограничением данного подхода является размер рекомбинантной ДНК, так как в вирусные частицы не могут быть упакованы слишком протяженные молекулы ДНК. Показано, что максимальный размер ДНК, которая может быть упакована в капсиду денсовйруса комаров (yAaeDNV), составляет 8% от длины нативной вирусной ДНК, в то время как в капсиду денсовйруса бабочки может быть упакована ДНК на 50% большей длины, чем нативный вирус.

Описанный выше метод был реализован при анализе экспрессии чужеродного генетического материала в клетках различных насекомых.' В одном из таких исследований [Afanasiev B.N., Ward T.W., Beaty В. J., Carlson J.О., 1999] в качестве маркерного гена использовали GFP (зеленый флюоресцирующий белок), а в качестве промотора, обеспечивающего экспрессию этого гена, -промотор NS1 денсовйруса /AaeDNV. На первом этапе пересеваемую культуру клеток комара трансформировали смесью плазмид, содержащих клонированную последовательность нативного вируса и рекомбинантного вируса, то есть содержащего КИПы AaeDNV и маркерный ген. GFP эффективно экспрессируется под контролем промотора NS1, при этом происходит формирование вирусных частиц, часть из которых содержит чужеродный генетический материал. Очищенные вирусные частицы были использованы для трансдукции личинок комара. Показано, что маркерный ген эффективно переносится в составе вирусных частиц в клетки насекомого и экспрессируется в них.

Краткое описание структурно-функциональной организации денсовирусов, инфицирующих различные виды насекомых

Таблица 1. Биологические и структурные характеристики денсовирусов. название хозяин Размер вириона (нм) Длина генома (п.о.)

PstDNV - Infectious Penaeus aztecus, 22 4075

Hypodermal and P. californiensis,

Hematopoetic P. chinensis,

Necrosis Virus P. duorarum,

IHHNV) P. esculentus, P. japonicus, P. monodon, P. ocidentalis, P. schmitti, P. semisulcatus, P. setiferus, P. stylirostris, P. vannameii

AaeDNV {Aedes Aedes aegypti 18-26 4009 aegypti densovirus) ■

Ла/DNV (Aedes 1. Aedes aegypti 22 4176 albopictus 2. Aedes albopictus densovirus) (AaPV

Aedes albopictus

Parvovirus)

BmDNV (Bombix mori densovirus) Тутовый шелкопряд Bombix mori 22 5048

Ds DNV (Diatraea saccharalis densovirus) огневка сахарного тростника Diatraea saccharalis 5941

JcDNV (Junonia coenia densovirus) Бабочка Junonia coenia 5908

GmDNV (Galleria mellonella densovirus) большая вощинная моль Galleria mellonella 6039

PcDNV (iPlanococcus citri densovirus) мучнистый червец Planococcus citri 5500

P/DNV (Periplaneta fuliginosa densovirus) (CSSV- cockroach small spherical virus) Таракан Periplaneta fuliginosa 22 5454

CpDNV (Culex pipiens densovirus) Комар Culex pipiens 25 6000

M/DNV (Mythimna loreyi densovirus) Mythimna loreyi, Chilo agamemnon, Galleria mellonella, Ostrinia nubalis, Sesamia cretica, Pectiniphora gossypiela, Spodoptera littoralis - 6000

MpDNV (Myzus persicae densovirus) Myzus persicae -' . ■ 6000

CeDNV (Caspalia extanea densovirus) паразит масличной пальмы и кокоса Caspalia extanea 22 5000

P/DV (Pseudoplusia includens densovirus) пяденица Pseudoplusia includens 20

BgDNV (Blattella germanica densovirus) Рыжий таракан Blattella germanica 20 5335

Далее более подробно рассмотрим структурно функциональные особенности некоторых денсовирусов.

Денсовирус мучнистого червеца PcDNV.

Препараты тотальной геномной ДНК из цитрусового мучнистого червеца Planococcus citri содержали добавочную полосу ДНК около 5,5 т.п.о. Ват HI-Крп I фрагмент ДНК размером 700 нуклеотидов был клонирован в pBCKS и секвенирован. Сравнения полученных OPC с OPC, размещенными в базах данных, указали на родство с неструктурными белками денсовирусов. Репликативная форма, найденная в хозяине, состоит из двухцепочечной линейной ДНК.

Вирус был назван PcDNV (Planococcus citri densovirus).

Длина генома денсовйруса составляет около 5,5 т.п.о. В последовательности нуклеотидов вируса имеется инвертированный терминальный повтор из 122 п.о. на концах фрагмента. 4 больших ОРС были определены. Из сравнения с последовательностями в банках данных было выяснено, что ОРС1 и ОРС2 похожи на структурные гены денсовирусов, тогда как ОРСЗ, транскрибируемая с противоположной ориентацией, сходна с неструктурными генами. В организация рамок считывания и в их аминокислотных последовательностях денсовирус PcDNV больше всего похож на P/DNV из Periplaneta fulginosa [Thao М. L., Wineriter S., Buckingham G., Bauman P., 2001].

Денсовирусы комаров (MDVs)

Описано 3 денсовирусов комаров: CpDNV, и 2 вируса vAeDNV. (AaeDNV, Aa/DNV) [Bergoin M., Tijssen P., 1998].

AaeDNV был найден в лабораторной культуре A. Aegypty, Ла/DNV {Aedes albopictus densovirus) был выделен из С6/36 субклона клеточной линии А. Albopictus [Roekring S„ Nielsen L., Owens L., Pattanakitsakul S., Malasit P., Flegel T.W., 2002]. Оба вируса имеют небольшой (4 т.п.о.) геном, который упаковывается преимущественно как «-» цепь и обладает на каждом конце коротким терминальным палиндромом с уникальной последовательностью. Эти два вируса обладают 92% -ной гомологией.

CpDNV значительно отличается от этих вирусов наличием генома размером 6 т.п.о., который упаковывается в соотношении 1:1 для «+» и «-» цепей. CpDNV имеет гомологию по антигенной перекрестной реакции и нуклеотидной последовательности с JcDNV.

Денсовирус комара CpDNV.

В лабораторной линии комара Culex pipiens наблюдалась необычно высокая смертность личинок. Для того, чтобы определить причину этого, были изучены трупы. Видимые симптомы возникали на третьей возрастной стадии, личинки становились деформированными и кривыми. Обычно смерть имела место до образования куколки на четвертой возрастной стадии личинок. Изучение гомогената методом электронной микроскопии выявило многочисленные икосаедрические частицы размером около 25 нм.

На срезах зараженных личинок ядра были гипертрофированные, в пятнах после окрашивания по Фульгену. Такая картина наблюдалась почти во всех тканях личинок, включая гиподермис, жировое тело, клетки кишечного эпителия, имагинальный диск и нервную ткань. Ядра были настолько расширенные, что цитоплазму почти не было видно.

Срез тканей зараженных комаров продемонстрировал, что увеличенные ядра содержат вирогенную строму, заполненную небольшими парасферическими вирусными частицами, имеющими 20 нм в диаметре, иногда образующими паракристальные матрицы. Хроматин был уменьшен и сдвинут в сторону внутренней ядерной мембраны. Данные гистопатологические и цитопатологические наблюдения привели к выводу, что зараженные личинки демонстрировали яркие признаки болезни, вызванной денсовирусом. Вирус был назван CpDNV (Culex pipiens densonucleosis virus).

Полипептидный состав вирионов был изучен с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. 4 полипептида с молекулярными весами 90, 64, 57, и 12 кДа были обнаружены и обозначены VP1, VP2, VP3, VP4 соответственно; VP2 VP3 давали яркую полосу, VP1 более слабую, VP4 демонстрировал слабую полосу.

Очень маленький размер и малое количество VP4 приводит к мысли, что этот полипептид может быть внутренним и не участвовать напрямую в образовании капсида. Структура белков капсида CpDNV значительно отличается от структур Да/DNV и JcDNV [Jourdan М. et al., 1990].

Серологическое сходство между CpDNV и Да/DNV и JcDNV были исследованы посредством иммунного анализа точек-пятен. Антитела к очищенным частицам CpDNV были получены с помощью иньецирования кроликам подкожно вирусной суспензии. Антитела к вирусным капсидам Да/DNV и JcDNV были получены на мышах. Этот метод выявил четкое антигенное сходство между CpDNV и Да/DNV, но большое различие в антигенной перекрестной реакции между CpDNV и Да/DNV.

Чтобы охарактеризовать вирусный геном, из очищенного вируса были удалены белки. Вирусные нуклеиновые кислоты были чувствительны к ДНКазе, но не были чувствительны к РНКазе и двигались как одна полоса при 1%-ном гель-электрофорезе. Профиль миграции был почти идентичен профилю двухцепочечной ДНК JcDNV. Это позволило установить, что геном CpDNV имеет размер около 6 т.п.о.

При высокой концентрации соли вирусная ДНК становилась двухцепочечной. Это привело к выводу, что CpDNV - член рода денсовирусов, но в отличие отДа/DNV, имеет равное количество «+» и «-» цепей.

Наличие сайтов рестрикции, расположенных симметрично на обоих концах, с высокой вероятностью указывает на наличие инвертированных терминальных повторов, которые свойственны всем денсовирусам [Jousset F.-X., Baquerizo Е., Bergoin М., 2002].

Денсовирус комара iAaeDNV iAaeDNV вызывает денсонуклеозную болезнь у кровососущих насекомых. Он был обнаружен у личинок лабораторной культуры Aedes aegypty и отнесен к денсовирусам на основании цитопатологических, химических и физических характеристик. iAaeDNV заражает личинок, куколок и взрослых насекомых некоторых кровососущих видов, в насекомых он реплицируется почти во всех тканях и вызывает гипертрофию ядер.

Вирус упаковывается в соотношении примерно 85% «-» и 15% «+» цепи ДНК, которые легко отжигается при очистке вирусной ДНК. Вследствие этого образуется две части вирусной ДНК: двухцепочечная (30%) и «-» цепь (70%).

Компьютерная обработка выявила ряд повторов, разбросанных по геному iAaeDNV. Оба конца генома вируса содержат палиндромы, которые могут образовывать структуру шпильки.

Как и у большинства парвовирусов, З'-конец iAaeDNV может принимать Т-форму. Последовательность этой структуры состоит из 146 п.о. и GC-бедна. Количество GC-nap составляет 27%, это значительно ниже, чем у BmDNV (50%). Таким образом, несомненно, что З'-конец iAeDNV менее стабилен.

5'-конец iAaeDNV тоже может образовывать Т-форму. Шпилька на 5*-конце состоит из 164 п.о. Количество GC-nap на 5'-конце составляет 45%, таким образом, шпилька на 5ч-конце более стабильна, чем на 3'.

Имеется три больших ОРС на первой цепи и ОРС на другой. Две большие ОРС (левая ОРС и правая ОРС) простираются непрерывно друг за другом на одной цепи ДНК. Это общее свойство парвовирусов [Astell С. L., Mol С. D., Anderson W. F., 1987; Bloom М. Е. et al., 1988; Chen К. С. et al., 1986]. Меньшая ОРС на данной цепи используется после сплайсинга для того, чтобы кодировать добавочный белок. При сравнении /\aeDNV с другими парвовирусами выясняется, что их крупные структуры довольно похожи. Так же, как и у других парвовирусов, 2 большие последовательно расположенные ОРС простираются рядом друг с . другом по всей длине «+» цепи. 2 большие ОРС на «+» цепи были обозначены как левая и правая ОРС. Однако геном /AaeDNV имеет несколько значимых отличий от других денсовирусов, такие, как еще одна ОРС, расположенная внутри левой ОРС и ОРС на «-» цепи. Эти ОРС были обозначены как средняя ОРС и минус ОРС, соответственно. Длинная ОРС на «-» цепи также имеется у Bombix топ DNV.

На «+» цепи имеется более 15 предполагаемых 15 промоторов и 8 сигналов полиаденилирования.

Левая ОРС простирается от 54 нуклеотида до ТАА-терминирующего кодона на 2676 нуклеотиде. Первый в рамке ATG-кодон начинается на 129 нуклеотиде, если транляция начинается с него, образуется белок из 849 аминокислот с молекулярной массой 98 «Да. По аналогии с другими парвовирусами, можно предположить, что данный белок является большим неструктурным белком (NS-1). Был найден участок, имеющий значительную гомологию по аминокислотам с белком NS-1 других парвовирусов. Данный участок является высококонсервативным [Astell C.R., Thomson М., Merchlinsky М., Ward D.C., 1983]. NS-1 вовлекается в репликацию ДНК вируса [Cotmore S. F., Tattersal P., 1988; Hermonat P.L., Labow M. A. Wright R., Berns К. I., Muzyczka N., 1984] и играет большую роль в регуляции экспрессии генов капсида.

Небольшая последовательность на N-конце левой ОРС имеет гомологию с последовательностью белка NS-2 вируса норки ADV.

Правая ОРС начинается на 2477 нуклеотиде и заканчивается ТАА-кодоном на 3635 нуклеотиде. Первый метиониновый кодон начинается на 2561 нуклеотиде, и если трансляция начинается с него, синтезируется белок размером 358 аминокислот с молекулярной массой 41 кДа. Кодирующая способность правой ОРС достаточна для того, чтобы кодировать структурный белок VP1. На N-конце правой ОРС обнаружен участок, нужный для протеолитического расщепления, путем которого может образовываться второй белок [Cotmore S. F., Tattersal P., 1987]. После расщепления образуется белок массой 38 кДа, что соответствует VP2.

Внутренняя средняя ОРС расположена внутри левой ОРС. Она начинается на 304 нуклеотиде и простирается до ТАА-терминирующего кодона на 1462 нуклеотиде. Первый ATG-кодон в данной рамке начинается на 377 нуклеотиде, если трансляция инициируется с него, образуется белок длиной 362 аминокислоты с молекулярной массой 41 кДа. Возможно, данная ОРС производит еще один неструктурный белок.

Минус» ОРС располагается в середине «-» цепи, начинается на 2575 нуклеотиде и заканчивается ТАА-кодоном на 1732 нуклеотиде. Если трансляция идет с первого ATG-кодона (2443 н.), то образуется белок размером 237 аминокислот с молекулярной массой 26 кДа. Не было выявлено значимой гомологии при сравнении с белками других парвовирусов.

AaeDNV заключается в капсид только 15 % «+» цепи [Afanasiev B.N., Galyov Е.Е., Buchatsky L.P., Kozlov Y.V., 1991].

ЛаР\/ высокопатогенен для личинок Геном АаРУ имеет длину 4176 нуклеотида. На «+» цепи имеется три ОРС: левая ОРС (2415 п.о.), средняя ОРС (1116 п.о.) и правая ОРС (1089 п.о.). Вся средняя ОРС входит в левую ОРС. Внутренняя кодирующая последовательность окружена некодирующими последовательностями с 5'- и З'-концов размером 289 и 513 нуклеотидов, соответственно. Организация генома AaPV очень похожа на организацию генома Aedes DNV, за исключением той особенности, что на «-» цепи генома AaPV не было обнаружено ОРС.

Левая ОРС начинается на 290 нуклеотиде и заканчивается ТАА-кодоном на 2704. Первый в данной рамке ATG-кодон начинается на 335 нуклеотиде и является функциональным. Следовательно, левая ОРС кодирует белок размером 790 аминокислот, соответствующий молекулярной массе 91 кДа. Левая ОРС имеет 13 добавочных метиониновых кодонов.

Средняя ОРС начинается на 384 нуклеотиде, всего лишь на 50 нуклеотидов ниже первого ATG-кодона левой ОРС и заканчивается ТАА-кодоном на 1499 нуклеотиде. Таким, образом, средняя ОРС всецело включается в левую ОРС. Первый в средней ОРС ATG-кодон расположен в положении 411, если он инициирует трансляцию, то средняя ОРС кодирует белок, имеющий размер 363 аминокислоты с молекулярной массой 41 кДа.

Правая ОРС начинается на 2575 нуклеотиде, то есть на 129 нуклеотидов выше стоп-кодона левой ОРС, и заканчивается ТАА-кодоном на 3663 нуклеотиде. Таким образом, левая и правая ОРС перекрываются своими 3' и 5*-концами соответственно. Два ATG-кодона в положении 2599 и 3617 могут выступать в роли инициаторов трансляции. Следовательно, могут синтезироваться белок размером 355 или 349 аминокислот. (40,92 или 40,31 кДа.) Правая ОРС содержит 12 добавочных метиониновых кодонов.

Выше левой ОРС был найден промотор Р7.2, соответствующий критериям для эукариотических промоторов [Bensimhon M.J., Gabarro-Arpa J., Ehrlich R., Reiss C., 1983]. Следовательно, транскрипция левой и средней ОРС находится под контролем одного промотора. Еще одни возможный промотор Рбо.о найден выше правой ОРС. Вероятно, он контролирует транскрипцию правой ОРС.

Сайты полиаденилирования расположены на 1666 и 2758 нуклеотидах. Еще 2 ААТАА-элемента начинаются на 3651 и 3662 нуклеотидах. Данные сайты полиаденилирования, вероятно, регулируют терминацию мРНК, транскрибируемую с помощью промотора Р6о.о- Интересно, что ТАА- стоп кодон в правой ОРС является частью ААТАА последовательности в положении 3662. Такая же ситуация описана для первого сигнала полиаденилирования, расположенного ниже ОРС1 в положении 2998 у JcDNV.

Геном АаРУ имеет палиндромные последовательности на обоих концах, что свойственно парвовирусам [Bensimhon M.J., Gabarro-Arpa J., Ehrlich R., Reiss C., 1983]. Складывающийся З'-конец размером 134 нуклеотида может образовывать Т-форму со стержнем из 52 нуклеотидов и двумя ассиметричными плечами размером 6 и 5 нуклеотидов. Содержание G-C пар в 3' палиндроме низкое (31,1%). 5' палиндром немного длиннее (182 нуклеотида) и имеет другую последовательность с гораздо большим содержанием G-C-nap (44%). Его складывающийся участок образует Т-форму со стержнем размером 77 нуклеотидов. Так как в палиндроме на 5'-конце выше содержание G-C пар, данная структура является более устойчивой.

Палиндромы З'-конца большинства парвовирусов могут образовывать типичные Т-образные структуры («стержень плюс плечи»). AaPV, AaeDNV и JcDNV могут образовывать подобные структуры на 5'-конце. Геном JcDNV имеет инвертированные терминальные повторы [Lusby Е., Fife К. Н, Berns K.I., 1980], «+» и «-» цепи генома JcDNV упаковываются в равных пропорциях. В противоположность этому в . геномах АаРУ и AaeDNV упаковывается преимущественно «-» цепь. Многие данные указывают на то, что у автономнореплицирующихся парвовирусов сигнал упаковки локализован в 5'-конце на «-» цепи [Tatersall P., Cotmore S. F., 1990].

Длинные прямые повторы присутствуют на обоих концах генома АаРУ между концевыми палиндромами и внутренними кодирующими участками.

Сходство последовательностей AaPV и Aedes DNV составляет 77,3 %. Эта . гомология не равно распределена среди разных ОРС.

По-видимому, правая ОРС кодирует структурные белки (VP). Максимальная кодирующая возможность правой ОРС >AaPV совместима с размерами больших белков VP2 и VP3. VP2 и VP3 могут образовываться путем инициации трансляции на первом или втором ATG-кодоне (2599 и 2617 п.о., соответственно) данной ОРС. С другой стороны, VP3 может образовываться путем протеолитического расщепления VP2.

Расположение средней ОРС, локализованной в 5* концевой последовательности «+» цепи приводит к мысли, что данная ОРС может кодировать неструктурный белок NS-2Boublik Y., Jousset F.-X. Bergoin M., 1994

Денсовирус таракана P/DNV.

Лабораторная линия тараканов Periplaneta fuliginosa пострадала от инфекционной болезни. Электронная микроскопия продемонстрировала небольшие шарообразные частицы в кишечнике заболевших тараканов. Очищенные частицы имели диаметр около 22 нм и содержали 5 структурных белков (VP1 -52 кДа, VP2 - 56 кДа, VP3 - 79 кДа, VP4 - 82 кДа, VP5 - 105 кДа) и одноцепочечную вирусную ДНК. Однако выделенная из частиц ДНК была двухцепочечной и имела размер около 5500 п.о. Основываясь на этом, была установлено, что болезнь вызывал денсовирус [Ни Y., Zheng J., lizuka Т., Bando Н., 1994]. Он был назван CSSV (cockroaches small sherical virus).

Геном CSSV состоит из 5455 п.о. Последовательность имеет инвертированные терминальные повторы, состоящие из 202 п.о. на обоих концах. Повторы содержат палиндромы размером 120 п.о., которые могут образовывать шпильки. В отличие от AaeDNV и JcDNV инвертированные терминальные повторы CSSV не образуют Т-форму, а образуют простые шпильки, так же, как у BmDNV и GmDNV.

CSSV имеет три ОРС на одной цепи (а, р, у) и 3 на другой (1, 2, 3). ОРС а, (3, у, 1, 2 и 3 кодируют белки с молекулярными весами 62, 33, 30, 61, 26 и 20 кДа, соответственно.

Имеется несколько промоторов. Промоторы в положениях 168 п.о. (рЗ), 977 п.о (р18) и 5391 п.о. (р97, на комплементарной цепи) следуют за кодонами, инициирующими трансляцию; рЗ и р97, возможно, промоторы к ОРС р и ОРС 2, соответственно. Р18, вероятно, промотор к ОРС а и/или ОРС у.

На цепи, содержащей ОРС а, р, у, предположительно имеются сигналы полиаденилирования в положениях 2734, 3786 и 4954. Также сигналы полиаденилирования были обнаружены в положениях 1119, 2103, 2778, 3652, 4111 и 4686 на комплементарной цепи.

ОРСу кодирует белок размером 30 кДа. Последовательность, кодирующая этот белок, начинается на 1129 нуклеотиде и демонстрирует небольшое сходство с белком, который кодирует ОРСЗ у JcDNV и DsDNV. ОРС р кодирует белок размером ЗЗКда. Первый ATG кодон данной ОРС начинается в положении 326. Этот белок имеет также небольшое сходство с белками, которые кодирует ОРС4 у JcDNV, GmDNV и DsDNV.

Белок, размером 62 кДа кодируется ОРС а, первый ATG кодон этой ОРС располагается в положении 1122, всего лишь на 7 п.о. выше от первого стартового кодона ОРС у. Концевая часть этого белка имеет сходство с белком, кодируемым ОРС2 у JcDNV, GmDNV, DsDNV и BmDNV.

ОРСЗ кодирует белок размером 20 кДа. Первый стартовый кодон начинается на 4490 нуклеотиде. С данным белком не было обнаружено значительного сходства среди белков других парвовирусов.

ОРС1 и ОРС2 кодируют белок размером 86 «Да, объединяясь в большую ОРС. Этот белок демонстрирует значительное сходство с белками капсида JcDNV, GmDNV и DsDNV и BmDNV [Yamagishi J., Hu Y„ Zheng J., Bando H., 1999].

Денсовирус бабочки Junonia соenia (JcDNV)

Денсовирус бабочки Junonia coenia содержит двухцепочечную ДНК. Обе цепи имеют одинаковые кодирующие емкости в 5*-половинах их последовательностей. Одна цепь кодирует структурные белки, комплементарная, вероятно, кодирует неструктурные белки. Геном JcDNV составляет 5908 нуклеотидов.

Крайние 430 нуклеотидов правого конца (с 5479 по 5908) и нуклеотиды с 89 по 517 левого конца являются идентичными инвертированными повторами за исключением одного G в положении 5762. Левый конец содержит многочисленные прямые повторы от 6 до 12 нуклеотидов длиной. Среди них последовательность TGACCT самая распространенная.

Вторичная структура крайних 96 нуклеотидов левого конца образует типичную Y-образную шпильку «флип» или «флоп»-конфигурации.

Нуклеотиды с 1 по 33 и нуклеотиды 64-96 образуют стержень, а 22 нуклеотида формируют 2 ассиметричных плеча. Непарные С и А служат для образования двухцепочечной структуры. Оба плеча имеют одинаковые петли с последовательностями GAA. Структура плечей очень похожа на структуру плечей парвовирусов позвоночных [Astell С. R., Smith М., Chow М. В., Ward D. С., 1979].

Обе цепи генома JcDNV обладают почти одинаковой способностью кодировать полипептиды. Геном содержит 4 больших ОРС. Самая большая, ОРС1, располагается в 5' половине на одной цепи, тогда как ОРС2, ОРСЗ, ОРС4 занимают 5' половину комплементарной цепи.

ОРС1 начинается на 534 нуклеотиде и заканчивается ТАА-кодоном на 2985 нуклеотиде. Первый в рамке ATG-кодон, начинающийся на 555 нуклеотиде, вероятно, является функциональным [Kozak М., 1986]. Если данный кодон инициирует трансляцию, то ОРС1 кодирует полипептид длиной 810 аминокислот, что соответствует молекулярной массе 89 кДа. ОРС1 содержит 14 добавочных метиониновых кодона. В ОРС1 промотор (Р9) начинается на 520 нуклеотиде, таким образом, образуется транскрипт с очень короткой (3-9 нуклеотида) нетранслируемой 5* областью.

Ниже стоп-кодона ОРС 1 находятся 5 последовательностей ААТААА, которые являются потенциальными сайтами расщепления и полиаденилирования мРНК. Только вторая последовательность расположена между CATTG-последовательностью и GT-богатой областью, таким образом, вероятно, она является функциональной [Birnstiel М. L., Busslinger М., Strub К., 1985]. Интересно, что у первого сайта полиаденилирования в положении 2986 первое А является последним А в ТАА-кодоне. Подобная ситуация описана для небольшой ОРС генома вируса В19 [Shade R. О., Blundell М. С., Cotmore S. F., Tattersal P., Astell С. R., 1986].

3 ОРС локализованы на комлементарной цепи. ОРС2 и ОРС4 разделены одним терминирующим кодоном. Самая правая, ОРС4, начинается на 5367 нуклеотиде и заканчивается ТАА-стоп кодоном на 4665 нуклеотиде. ОРС2 начинается непосредственно ниже на 4662 нуклеотиде и продолжается до ТАА стоп-кодона на 3021 нуклеотиде.

ОРСЗ, которая включена в ОРС2, начинается на 11 нуклеотидов ниже начала ОРС2, на 4652 нуклеотиде и завершается ТАА-стоп-кодоном на 3824 нуклеотиде. Таким образом, ОРС1, ОРСЗ и ОРС 4 образуют группу длиной примерно 2,3 т.п.о. занимающую около половины цепи со стороны 5\

Первый ATG-кодон в ОРС4 обнаружен на 5223 нуклеотиде. В ОРС2 и ОРСЗ потенциальные ATG-кодоны инициации обнаружены на 4656 и 4649 нукпеотидах, то есть на 2 и 1 кодона ниже начала данных ОРС, соответственно. Если трансляция начинается на этих ATG-кодонах, то ОРС2, ОРСЗ и ОРС4 будут иметь способность кодирования 545, 275 и 186 аминокислот, что соответствует полипептидам с молекулярными массами 60, 30 и 20 кДа, соответственно. Таким образом, использование 2 ОРС обеспечивает способность кодирования, превышающую 1000 аминокислот для последовательности размером 2,3 т.п.о., соответствующей данным ОРС; тогда как такая же последовательность одной ОРС может кодировать только 766 аминокислот.

Выше ОРС4 находится элемент промотора TATAAATA (Рд3, 5476 нукпеотид). Он регулирует транскрипцию не только ОРС4, но также ОРС2 и ОРСЗ. Последовательность ААТААА, начинающаяся на 3321 нуклеотиде, может действовать как сигнал полиаденилирования для мРНК, транскрибируемой с ОРС4 и ОРСЗ.

Цепь генома JcDNV, несущая ОРС2 имеет гомологию 57% на протяжении 400 нуклеотидов с BmDNV. С геномом Aedes DNV не было выявлено значимой гомологии.

ОРС1 кодирует структурные белки, а ОРС2, ОРСЗ и ОРС4 - неструктурные. Последовательность длиной 107 нуклеотидов, находящаяся внутри ОРС2, демонстрирует гомологию с высококонсервативным GKRN-участком, кодирующим NS1 у парвовирусов позвоночных. Данный участок соответствует NTP-связывающему домену и домену хеликазной активности, общих для парвовирусов [lm D. S., Muzyczka N., 1990; Li X., Rhode S. L., 1990]. Вероятней всего OPC2 кодирует NS1.

Вероятно, что геном JcDNV может транскрибироваться как 2 ОРС, по одной на каждой цепи [Li Y., Bergoin М., 1991]. Р9 промотор является самым подходящим для того, чтобы производить мРНК, соответствующую размером самому большому полипептиду (VP1). Ниже первого метионинового кодона (555 п.о.) ОРС1 содержит три ATG-кодона, которые могут инициировать трансляцию VP2 (1486 п.о.), VP3 (1521 п.о.), VP4 (1674 п.о.) [Dumas В., Jourdan М., Pascaud А.-М, Bergoin М., 1992].

Денсовирус моли GmDNV

GmDNV (Galleria mellonella densovirus) поражает большую вощинную моль Galleria mellonella. Вощинная моль паразитирует на колониях пчел. Вирус обычно убивает личинок моли в течение нескольких дней после заражения [Simpson А., Chipman P. R., Baker Т. S., Tijssen P., Rossmann М. G., 1998].

GmDNV самый большой среди парвовирусов (6039 п.о.) с самыми большими инвертированными терминальными повторами (550 п.о.) Крайние 136 нуклеотидов могут складываться в шпильки в ориентации «флип-флоп». Гены, кодирующие неструктурные (NS) и структурные (VP) белки расположены в 5'-половинах цепей. ТАТА-боксы расположены в инвертированных терминальных повторах и одинаковы для неструктурных и структурных белков. Блок, кодирующий неструктурные белки, состоит из трех генов, которые содержат NS2 в себе полностью, в пределах NS1, но с разными ОРС. Рестрикционное картирование говорит о большом сходстве между GmDNV и JcDNV.

Обе цепи ДНК содержат большие ОРС в 5'-половинах. Одна цепь имеет 3 ОРС (1, 2, 3), две из которых перекрываются. На другой цепи располагается ОРС размером 2,5 т.п.о. Исключая сдвиг рамки считывания, только ОРС4 имеет достаточную протяженность, чтобы кодировать самый большой структурный белок VP1, имеющий размер 90 кДа. Предположительно, другие структурные белки VP2, VP3, и VP4 также кодируются ОРС4. ОРС1 , и ОРСЗ кодируют неструктурные белки [Tijssen P., Li Y., El-Far М., Szelei JM Letarte М., Zadori Z., 2003]. Эта мысль подкрепляется тем, что ОРС1 содержит NTP-азный домен, найденный в NS1 других парвовирусов, а ОРС4 содержит домен фосфолипазы А2, найденный в структурных белках многих парвовирусов [Li У., Zadori Z., Bando Н., Dubuc R., Fediere G., Szelei J., Tijssen P., 2001].

Геном денсовйруса Mythimna loreyi (M/DNV) имеет сходство 90% с геномом GmDNV [El-Far M., Li Y., Fediere G., Abol-Ela S., Tijssen P., 2004].

Денсовирус тли МрОШ

Длина генома денсовйруса Myzus persicae составляет 6 т. п. о.

В геноме /WpDNV присутствуют 5 ОРС. 3 ОРС (1-3) расположены в 5'-части одной цепи, и еще 2 ОРС (4-5) охватывают 5'-часть комплементарной цепи.

Промотор Р1 найден в положении 2-65 п.о. в инвертированном терминальном повторе в 5'-половине той цепи, на которой расположены ОРС1-3. Р1 содержит TATA- бокс и имеет GC-богатую область выше по цепи, которая может выступать как активатор. Тот факт, что других промоторов на этой цепи не обнаружено, приводит к мысли, что Р1 ответственен за транскрипцию ОРС1-3.

Небольшая ОРС1 начинается на 208 нуклеотиде и заканчивается на 238. Трансляция данной ОРС приводит к образованию пептида размером 97 аминокислот, что соответствует молекулярной массе 10,3 кДа. ОРС2 и ОРСЗ перекрываются с ОРС1. ОРС2 начинается на 395 нуклеотиде с ATG-кодона и заканчивается на ТАА кодоне на 1142 нуклеотиде. Два добавочных ATG кодона в положениях 443 и 467, возможно, могут выступать как стартовые кодоны. ОРСЗ перекрывается с ОРС2, начинается на 525-ом нуклеотиде и заканчивается на 2667-ом на ТАА-кодоне. Первый в рамке ATG кодон начинается на 573 нуклеотиде и является старт-кодоном данной ОРС. Трансляция ОРСЗ проводит к образованию белка размером 698 аминокислот, что соответствует молекулярной массе 81 кДа.

Несколько сайтов полиаденилирования было, выявлено на той цепи, где находятся ОРС 1-3. Но только один ААТААА-сайт в положении 2642 окружен CATTG-последовательностями и имеет расположенную ниже GT-богатую область, необходимую для терминации транскрипции. Следовательно, скорее всего этот участок является сайтом полиаденилирования для транскрипции РНК ОРС1-3.

ОРС4 и ОРС5 располагаются рядом на 5'-части комплементарной цепи. Было выявлено два потенциальных промотора Р2 и РЗ. Промотор Р2, расположенный в инвертированном терминальном повторе, содержит в себе ТАТА-бокс в положении 5360 и участок активации (5408 нуклеотид). Р2, вероятно, ответственен за транскрипцию ОРС4. Другой промотор, РЗ, имеющий ТАТА-бокс в положении 4887 и участок активации на 4881 нуклеотиде, расположенный выше ОРС5, может начинать транскрипцию этой ОРС.

ОРС4 начинается на 5352 нуклеотиде и заканчивается ТАА-стоп кодоном на 4758-ом. ATG-кодон, начинающийся на 5337-м нуклеотиде, вероятно, является точкой инициации трансляции и приводит к образованию белка размером 20,8

Да. 0РС5 перекрывается с 0РС4. ОРС5 начинается на 4883 нуклеотиде и простирается до TGA-стоп кодона на 2999 нуклеотиде. Если первый ATG-кодон является функциональным, то-данная ОРС кодирует белок размером 68,3 кДа. Сигнал полиаденилирования находится в положении 2694 на цепи, содержащей ОРС4-5.

Последовательность аминокислот, образуемых ОРС4-5, демонстрируют сходство с белком капсида денсовирусов VP4.

Сравнение неструктурных белков MpDNV с неструктурными белками различных денсовирусов показало, что MpDNV имеет наибольшее сходство с P/DNV. Однако сравнение структурных белков MpDNV выявило наибольшее сходство с PcDNV.

Два консервных участка были обнаружены в ОРС, кодирующих белки капсида. Два главных домена в ОРС, кодирующих неструктурные белки, демонстрируют сходство с белком парвовирусов NS-1 [Van Munster М. et al., 2003].

Денсовирус Caspalia extanea (CeDNV)

Денсовирус Caspalia extanea (CeDNV) является высокоспецифичным для паразита масличной пальмы и кокоса Caspalia extanea (Limacodidae) и был успешно использован для контроля над численностью его хозяина. Хотя большинство денсовирусов поражают почти все личиночные ткани, за исключением средней кишки, денсовирусы В. топ, C.extenea, Sibine fusca размножаются в основном в столбчатых клетках эпителия прямой кишки. Вирион CeDNV, который является изометрическим и имеет размер 22 нм, содержит четыре полипептида с молекулярными массами 82, 74, 54, и 49 кДа. Его геном состоит из одноцепочечной линейной ДНК размером около 5 кб, комплементарные цепи упаковываются в отдельные капсиды. Геном CeDNV имеет наибольшее сходство с BmDNV. Было обнаружено наличие домена фосфолипазы А2 в уникальной части VP1.

В геноме CeDNV обнаружены инвертированные повторы размером 230 нуклеотидов, концы которых, размером 159 нуклеотидов, могут образовывать «шпильки». Данные шпильки не имеют типичных для парвовируов Y- или Т-форм, а состоят из стержня и неполного J-образного палиндрома, существующего в двух различных ориентациях, которые друг другу обратно комплементарны («флип-флоп»). Интересно, что последовательность «флип-флопа» имеет большое сходство с последовательностью BmDNV, чем последовательность стержня. Это может указывать на то, что добавление данного палиндрома является важным для вирусного цикла.

Большая левая ОРС, кодирующая NS1, начинается на 306 нуклеотиде и заканчивается на 2612, вторая ОРС, кодирующая NS2, расположена между 361 и 1836 нуклеотидами. Вероятно, имеется единственный промотор для обоих ОРС. Несколько TATA и CATG-боксов были обнаружены. А в CATG-боксе обычно соответствует первому нуклеотиду транскрипта. Второй в большой ОРС ATG-кодон дает старт транскрипции. Первый ATG-кодон в ОРС может также функционировать как потенциальный стартовый кодон.

Старт второй ОРС, кодирующей NS2 , был найден на 55 нуклеотидов ниже от старт-кодона левой ОРС, и, таким образом, всецело включается в ОРС, кодирующую NS1. Первый в данной ОРС ATG-кодон начинается на 452 нуклеотиде и может допускать трансляцию белка размером 452 аминокислоты, что соответствует 52кДа. Значение NS2 неизвестно. Возможно, что NS2 у парвовирусов необходим при репликации и трансляции, также как при сборке капсида [Naeger L.K., Cather J., Pinthel D.J., 1990; Cotmore S. F., D'Abramo Jr., Carbonell A.M., Bretton L. F., Tattersal P., 1997].

Перекрывающиеся последовательности двух данных ОРС высококонсервативны. Самый консервативный район был найден в NS1.

Правая ОРС начинается на 2653 нуклеотиде и заканчивается на стоп-кодоне на 4708 нуклеотиде. Трансляция с первого в рамке ATG-кодона должна приводить к образованию белка размером 678 аминокислот с молекулярной массой 82 кДа. Fediere et al. обнаружили большой структурный белок данной молекулярной массы, которому соответствуют три структурных белка (VP2-VP4) с молекулярными массами 74, 54 и 49 кДа [Federiere G., Montsarrat P., Mariau D., Bergoin M., 1986]. VP2-VP4 могут синтезироваться с различных РНК, которые образуются за счет альтернативного сплайсинга РНК правой ОРС.

Как и у многих других парвовирусов, консервативный район, известный как PGY-район был обнаружен в белке VP1. Было замечено, что некоторые консервативные аминокислоты соответствуют консервативным аминокислотам в Са2+"связывающей петле и катализирующим сайт, выделяющий фосфолипазу А2 [Zadori Z., Szelei, J., Lacoste, M.-C., Li Y., Gariepy S., Raimond, P., Allaire M., Nabi I., Tijessen P., 2001]. Мутации данных аминокислот в парвовирусе свиньи приводит к потере инфекционности вируса [Fediere G., Zadori Z., Szelei J., Tijessen P., 2002].

Денсовирус тутового шелкопряда BmDNV

В 1968 году вирусное заболевание тутового шелкопряда Bombix топ было открыто на ферме по производству шелка в Японии.

Вирусные частицы BmDNV имеют диаметр около 22 нм. Его вирион имеет 4 структурных белка [Nakagaki М., Kawase S., 1980 (2)]. Вирусные частицы BmDNV имеют форму двадцатигранника, состоящего из 12 капсомеров, вирусный белок VP1 (молекулярная, масса - 50 кДа), по-видимому, является повторяющейся единицей в структуре капсида [Nakagaki М., Kawase S., 1982].

ДНК денсовируса состоит из линейной одноцепочечной молекулы, две комплементарные цепи ДНК содержатся в различных частицах вируса [Nakagaki М., Kawase S., 1980 (1)]. Обе цепи имеют инвертированные терминальные повторы на обоих концах. Синтез ДНК имеет место преимущественно в ядрах зараженных столбчатых клеток кишечника шелкопряда. Это указывает на то, что вирус размножается в ядрах [Watanable Н., Maeda S., 1979].

Геном BmDNV имеет 3 больших ОРС: ОРС1 и ОРС2 лежат на одной цепи, ОРСЗ - на комплементарной. ОРС1 состоит из 1290 нуклеотидов. Если ОРС1 транслируется без сплайсинга РНК, то должен образовываться белок размером 43 кДа. ОРС2 содержит 887 нуклеотидов и локализована между 1546 и 4207 нуклеотидами, она кодирует белок размером 89 кДа. ОРСЗ, находящаяся на комплементарной цепи, содержит 501 нукпеотид (167 кодонов).

Были найдены 4 возможных сигнала инициации в геноме Bombix mori DNV. Три возможных сигнала инициации были найдены для ОРС2. Если все три возможных сигнала инициации функционируют, ОРС2 производит белки с молекулярными массами 89, 67 и 55 кДа [Bando Н., Kusuda J., Gojoborl Т., Maruyama Т., Kawase S., 1987].

He были найдены сигналы инициации транскрипции для ОРС1. ОРСЗ имеет один сигнал инициации транскрипции.

Распространенность кодонов различается среди разных ОРС. Например, аспарагин встречается горздо чаще в ОРС2, чем в ОРСЗ. Набор аминокислот структурных белков похож на аминокислоты, которые может произвести ОРС2, но отличается, от аминокислот ОРС1 и ОРСЗ. Это позволяет сделать вывод, что все структурные белки кодируются одной ОРС, ОРС2.

Так как два неструктурных белка NS-1 и NS-2 у парвовирусов кодирует ОРС, расположенная в левой половине цепи, можно предположить, что ОРС1 кодирует неструктурные белки Bombix mori DNV [Cotmore S. F., Sturzenbecker L. J., Tattersall P., 1983].

Консервативный участок внутри OPC2 и внутри последовательностей, кодирующих неструктурные белки SmDNV, демонстрирует 35% гомологию с вирусом мыши MVM, человека AAV-2 и вирусом грызунов Н-1 [Bando Н., Kusuda J., Gojoborl Т., Maruyama Т., Kawase S., Feb. 1987].

Денсовирус личинки совки Mythimna loreyi (/W/DNV)

Денсовирус личинки совки Mythimna loreyi (M/DNV) был обнаружен в Египте [Fediere G., El-Sheikh M. A., Abol-Ela S., Salah M., Mastri M., Veyrunes J.-C., 1995]. Вирус поражает различных хозяев [Fedire G., 1996].

МЮШ имеет размер генома 6034 п.о. Геном Atf/DNV содержит инвертированные терминальные повторы размером 543 нуклеотида с одного конца и 439 нуклеотида с другого. Крайние 126 нуклеотидов инвертированных терминальных повторов могут складываться в Y-образные шпильки, типичные для многих парвовирусов. Первые 47 нуклеотидов в стержне совершенно комлементарны нуклеотидам 80-126, нуклеотиды 48-79 в двух ассиметричных плечах GC-богаты.

Одна («+») цепь содержат три ОРС в 5'-половине. Первая ОРС начинается на 112 нуклеотиде после КИП, непосредственно за ней следуют две перекрывающиеся ОРС, кодоны инициации которых отстоят друг от друга всего на 4 нуклеотида. Наибольшая (1635 нуклеотида) ОРС содержит типичный домен нуклеотид-3-фосфатазы.

Комплементарная («-») цепь также содержит большую (2463 п.о.) ОРС (ОРС4) в 5' части. ОРС 4 начинается только на 32 нуклеотида ниже КИП и содержит домен фосфолипазы А2, которая часто обнаруживается в структурных белках парвовирусов.

Вирион /W/DNV содержит четыре структурных белка с молекулярными массами, похожими на молекулярные массы структурных белков GmDNV. Только ОРС4 имеет достаточный размер для того, чтобы кодировать самый большой структурный белок, VP1, с молекулярной массой около 90 кДа. Молекулярные массы четырех структурных белков /W/DNV соответствуют предположенным молекулярным массам, если трансляция инициируется с четырех первых кодонов инициации ОРС4. (ОРС4а, Ь, с, d). OPC4d имеет два возможных кодона инициации, как и у таких представителя рода Densovirus, как JcDNV и GmDNV. OPC4d была разделена на OPC4d и OPC4d\

Нуклеотидная последовательность MIDW имеет высокую степень сходства (около 85%) с последовательностями JcDNV и GmDNV, также с данными вирусам MIDW имеет сходство в организации генома. В особенности последовательность шпилек /W/DNV имеет гомологию с последовательностью шпилек GmDNV более 96 %. Стратегия транскрипции МЮШ имеет сходство со стратегией транскрипции GmDNV. ТАТА-боксы частично локализованы в инвертированных терминальных повторах и, следовательно, почти все они находятся выше промоторов.

MID NV использует альтернативный спалайсинг для экспрессии неструктурных белков. Альтернативная экспрессия NS3 и NS1/NS2 достигается за счет того, что несплайсируемый транскрипт служит для получения NS3, а сплайсируемый транскрипт служит для синтеза NS1 и NS2. Донорский сайт сплайсинга находится непосредственно выше кодона инициации NS3, акцепторный сайт располагается непосредственно выше кодона инициации NS1, таким образом, оба транскрипта, подвергающийся сплайсингу и неподвергающийся, имеют одинаковые последовательности за исключением двух последних нуклеотидов (GT), предшествующих NS3. Ген, кодирующий NS2, перекрывается с геном, кодирующим NS1, и кодон инициации гена NS2 начинается через 4 нуклеотида после кодона инициации NS1. Подобным образом с РНК-6 вируса гриппа В синтезируются два белка с двух кодонов инициации, разделенных 4-мя нукпеотидами [Shaw М. W., Choppin P. W., Lamb R. А., 1983].

Четыре структурных белка кодируются несплайсируемым транскриптом с одной ОРС. Это наводит на мысль, что данные белки получаются путем «leaky scanning mechanizm» [Fediere G., El-Far M., Li Y., Bergoin M., Tijssen P., 2004].

Leaky scanning» представляет собой следующий процесс: 40S рибосомальная субъединица при сканировании мРНК «проскакивает» первый AUG и инициирует на втором или даже на третьем AUG. Описано более 20 мРНК, в которых 5'- проксимальный AUG находится в слабом или субоптимальном контексте, в этих случаях инициация происходит как на первом, так и на последующих AUG, в результате происходит синтез белков с разным началом. Если первый и второй AUG находятся в одной ОРС, то синтезируется длинная и короткая изоформы белка, отличающиеся на некоторое количество аминокислотных остатков. Если первый и второй AUG находятся в разных перекрывающихся ОРС, то . синтезируются два различных по составу полипептида.

Степень «leaky scanning» может варьироваться в зависимости от ряда факторов:

- наличие вторичной структуры между двумя AUG снижает вероятность «leaky scanning», способствуя инициации на первом AUG.

- второй возможный сайт инициации может быть блокирован элонгирующей 80S рибосомой, двигающейся от первого AUG.

- возможна инициация с не-AUG, если он является дополнительным к нижележащему AUG.

- независимо от контекста первого AUG инициация на нем малоэффективна, если от кэпа до него менее 12 нуклеотидов [Kozak М., 1995].

Фактор, который определяет количество хозяев вируса, неизвестен. Антигенная детерминанта некоторых парвовирусов позвоночных локализована в структурных белках [Gardiner Е. М., Tattersall Р., 1990; Bergeron J., Hebert В., Tijssen P., 1996] и присутствует на поверхности вириона.

Денсовирус пяденицы P/DV

Двадцатигранный ДНК-содержащий денсовирус был изолирован из пяденицы Pseudoplusia includens. Вирион обладает размером около 20 нм и имеет тенденцию образовывать трехмерные кристаллы. Содержание ДНК в вирусе составляет около 37,8 %, он является типичным нуклеопротеином. Вирусная ДНК одноцепочечная и имеет инвертированные терминальные повторы. Терминальные повторы составляют 6-7 % генома. Молекулярная масса одноцепочечной ДНК составляет 2-2,1 103 кДа. С помощью 9 % SDS-полиакриламидного гель-электрофореза были обнаружены 4 белка вириона с молекулярными массами: 46,5, 54, 64, 87 «Да. Ультратонкие срезы показали, что ядра хемоцитов, клеток мышц и клеток жирового тела содержат вирусные частицы. Хроматин в ядрах зараженных клеток всегда смещен к краям, и нуклеоплазма часто замещена на вирионы [Chao Y.-C., Young S.Y., Kim К. S., Scott H. A., 1985].

Денсовирус рыжего таракана BgDNV.

Для многих молекулярно-биологических целей необходимо экстрагировать тотальную ДНК из объекта исследований. В 2000 году Д.В.Муха и К. Шал анализировали тотальную ДНК, экстрагированную из тараканов Blattella germanica, выловленных из различных свинарников, локализованных на территории США. Было показано, что после электрофореза в 0,7% агарозном геле часть образцов тотальной ДНК, экстрагированной из тараканов, собранных в одном из свинарников (Р6) и поддерживаемых в лабораторных условиях в течение 5 лет, содержала дополнительную фракцию ДНК размером примерно 5 т.п.н. (Рис. 1а). Обнаруженная дополнительная фракция была экстрагирована из геля, очищена и использована для электронно-микроскопического анализа, который показал, что исследуемая ДНК представлена линейной формой длиной около 1,2 мкм (Рис. 16).

Т.п.о.

А Б

Рисунок 1. А.- Электрофорез в 0,7%-ном агарозном геле ДНК, выделенной из неинфицированного (дорожка 1) и инфицированного (дорожка 2) вирусом тараканов. Стрелкой указана фракция вирусной ДНК. Б. - Электронно-микроскопическая фотография вирусной ДНК. **- Линейная вирусная ДНК * - Маркерная кольцевая ДНК плазмиды.

Электронно-микроскопическое исследование ультратонких срезов тканей больных тараканов показало, что клетки пищеварительной системы, жирового тела и эпидермиса инфицированы вирусом, который вызывает значительные ультраструктурные изменения. Основные цитопатологические эффекты сходны в клетках различных тканей и заключаются в необычной структуризации хроматина, при этом большая часть нукпеоплазмы занята вирусными частицами. Показано, что вирусные частицы имеют диаметр примерно 20 нм и могут локализоваться как в ядре, так и в цитоплазме. Вирусные частицы внутри ядер инфицированных клеток плотно упакованы в электрон-плотную вирогенную строму. Все описанные свойства обнаруженных вирусных частиц являются характерными для денсовирусов

Затем дополнительная фракция ДНК была экстрагирована из геля, очищена, клонирована и секвенирована. После сравнения полученной последовательности с базой данных стало ясно, что обнаружен новый денсовирус. По аналогии с ранее открытыми вирусами он был назван BgDNV {Blattella germanica densovirus) [Муха Д.В., Шал К., 2003].

Последовательность нуклеотидов генома вируса и структура концевых инвертированных повторов. Полная последовательность генома BgDNV представлена 5335 нуклеотидами. В то же время, при сравнении последовательностей нуклеотидов денсовирусов, изолированных из насекомых, принадлежащих к эволюционно удаленным таксонам - бабочкам и тараканам -было выявлено несколько эволюционно консервативных мотивов, обладающих 100% сходством.

Последовательность нуклеотидов BgDNV содержит концевые инвертированные повторы протяженностью 216 и 217 нуклеотидов на правом и левом концах соответственно. Известно, что представители семейства Parvoviridae могут формировать три типа вторичных структур КИП: Т-, Y- или I- подобные шпильки, имеющие большое значение для репликации вируса. В отличие от вирусов AAV и JcDNV КИП BgDNV не формируют Т- или Y-подобные вторичные структуры, а складываются в l-подобные шпильки; аналогичная вторичная структура КИП характерна для вирусов BmDNV-1, GmDNV и P/DNV [Муха Д.В., Шал К., 2003].

Последовательность нуклеотидов КИП BgDNV обладает повышенным Г/Ц составом. Общее количество Г/Ц нуклеотидов в последовательности BgDNV составляет 39,6%, в то время как КИП содержат 59,0%, что может придавать повышенную устойчивость формируемым вторичным структурам. Повышенное содержание Г/Ц нуклеотидов является типичным для КИП парвовирусов. Например, содержание Г/Ц нуклеотидов в КИП P/DNV равно 60%, Bombyx DNV

50% , автономно реплицируемых парвовирусах - 46-60%. В то же время имеются исключения из этого правила: КИП Aedes DNV содержит 27% Г/Ц нуклеотидов.

В пределах генома BgDNV было обнаружено 5 ОРС. Две из них (1 и 2) локализуются на одной цепи, три другие (3, 4 и 5) - на комплементарной (Рис. 2). Описанный характер расположения ОРС является типичным для вирусов рода Densovirus.

ОРС1 локализуется между 922-2808 нуклеотидами и кодирует белок, состоящий из 628 аминокислот (69,7 кДа). ОРС2 локализуется между 243-932 нуклеотидами и кодирует белок, состоящий из 229 аминокислот (24.8 кДа). ОРСЗ локализуется между 4404-2811 нуклеотидами и кодирует белок, состоящий из 530 аминокислот (60.2 кДа). ОРС4 локализуется между 4397-3608 нуклеотидами и кодирует белок, состоящий из 262 аминокислот (30.3 кДа). ОРС5 локализуется между 5055-4404 нуклеотидами и кодирует белок, состоящий из 216 аминокислот (25.9 кДа) [Муха Д.В., Шал К., 2003].

ORF

CRT ORF

ORF ORF ORF }

Белки

Регуляторные

ORF

Рисунок 2. Организация ОРС генома денсовйруса.

Все описанные белки вируса BgDNV обладают очень низким сходством с соответствующими белками других денсовирусов. В то же время, выявлены относительно короткие аминокислотные мотивы, которые обладают высоким уровнем эволюционного консерватизма и проявляют значительную степень сходства в пределах денсовирусов, паразитирующих на насекомых различных таксонов: BgDNV, P/DNV, JcDNV, GmDNV, DsDNV.

В результате проведенного компьютерного анализа были выявлены два потенциальных промотора: Р1 (локализован между 200-250 нуклеотидами) и Р2 (локализован между 5136-5086 нуклеотидами). Р1 может быть ответственен за транскрипцию ОРС1 и ОРС2, Р2 - за транскрипцию ОРСЗ, ОРС4 и ОРС5. Были обнаружены сигналы полиаденилирования на цепи ДНК, содержащей ОРС1 и ОРС2 в позициях 937-942 и 2818-2823. Дополнительный сигнал полиаденилирования был обнаружен на комплементарной цепи, содержащей ОРСЗ.ОРС4 и ОРС5, в позиции 2810-2815 [Муха Д.В., Шал К., 2003].

Описанная структурная организация BgDNV имеет ряд уникальных черт, отличающих денсовирус рыжего таракана от других описанных денсовирусов насекомых. Главным образом это касается структурной организации ОРС, кодирующих белки вирусного капсида. BgDNV содержит две ОРС, кодирующие структурные белки вируса, при этом на концах каждой ОРС локализуются сайты полиаденилирования (нуклеотидные позиции 937-942 и 2818-2823). В тоже время, было показано, что трансляция белков оболочки у JcDNV и GmDNV происходит с нескольких стартовых кодонов, локализованных в пределах одной ОРС. Трансляция белков оболочки P/DNV также происходит с нескольких стартовых кодонов. Подобно JcDNV и GmDNV, денсовирус рыжего таракана содержит один промотор (Р1), ответственный за транскрипцию РНК структурных белков. Можно предположить, что с данного промотора происходит транскрипция двух типов иРНК; транскрипция одной из них, соответствующей ОРС2, начинается с сайта инициации транскрипции промотора Р1 и , терминируется после сайта полиаденилирования, локализованного в позиции 937-942 нуклеотид, транскрипция второй, большей по размеру иРНК, также начинается с сайта инициации транскрипции промотора Р1, а терминируется после сайта полиаденилирования, локализованного в позиции 2818-2823 нуклеотид. Трансляция белков оболочки BgDNV, по-видимому, происходит с нескольких стартовых кодонов, локализованных в пределах иРНК большего размера; дополнительная экспрессия одного из белков оболочки может осуществляться с иРНК, соответствующей ОРС2. Такая необычная структурная организация может быть объяснена, если предположить, что структурные белки BgDNV представлены в оболочке неравным количеством: один из них (соответствующий ОРС2) представлен большим числом копий.

Геномная организация ОРС денсовйруса рыжего таракана, соответствующих неструктурным белкам, сходна с планом строения генома JcDNV. Как и у JcDNV, экспрессия неструктурных белков BgDNV, организованных в виде трех ОРС, регулируется посредством одного промотора (Р2). Сайт полиаденилирования локализуется в позиции 2810-2815 нуклеотид, что строго соответствует концу ОРСЗ. По-видимому, единая иРНК транскрибируется под контролем Р2, и трансляция неструктурных белков происходит с различных сайтов инициации. Является неожиданным тот факт, что P/DNV, денсовирус, инфицирующий наиболее эволюционно близкого к Blattella germanica насекомого-таракана Periplaneta fuliginosa, имеет столь значительные различия в структурной организации генома, в то время как денсовирус бабочки JcDNV проявляет значительное структурно-функциональное сходство с BgDNV [Муха Д.В., Шал К., 2003].

На основании известных данных [Муха Д.В., Шал К., 2003; Afanasiev B.N. et al., 1991; Bando H. et al., 1987Boublik Y. et al., 19944; Dumas B. et al., 1992; El-Far

M. et al., 2004; Fediere G. et al., 2002; Fediere G. et al., 2004; Thao M. L. et al., 2001; Van Munster M. et al., 2003; Yamagishi J. et al., 1999;] мы составили таблицу 2.

Таблица 2. Молекулярные особенности некоторых денсовирусов. денсовирус Количество ОРС Расположение ОРС

PcDNV 4

AaeDNV 4 Три ОРС на одной цепи и одна - на комплементраной

ЛaPV 3 Три ОРС на одной цепи

P/DNV 6 Три ОРС на одной цепи и одна - на комплементарной

JcDNV 4 Три ОРС на одной цепи и одна ОРС - на комплементарной

GmDNV 4 Три ОРС на одной цепи и одна ОРС - на комплементарной

MpDW 5 Три ОРС на одной цепи и две ОРС - на комплементарной

CeDNV 2 Две ОРС на одной цепи

BmDNV 3 Две ОРС на одной цепи и две - на комлементарной.

MID NV 4 Три ОРС на одной цепи и одна ОРС - на комплементарной

SgDNV 5 Две ОРС (1 и 2) локализуются на одной цепи, три другие (3, 4 и 5) - на комплементарной

Все небольшие (20-257 нм) двадцатигранные вирусы, содержащие одноцепочечнуга ДНК, относятся к Парвовирусам. Парвовирусы членистоногих называют денсовирусами. Обычно денсовирусы, в отличие от парвовирусов летальны для своих хозяев.

Первичные транскрипты генов насекомых сплайсируются гораздо меньше, чем гены млекопитающих. Транскрипты денсовирусов также подвергаются сплайсингу в малой степени или совсем не подвергаются [Tijssen P., Bergoin М., 1995].

Размер вирионов денсовирусов составляет 18-25 нм. Длины геномов варьируются от 4000 до 6100 п.о. На флангах денсовирусов находятся КИПы, образующие вторичные структуры.

Генетические элементы, содержащие домен обратной транскриптазы

Около 30 лет назад при исследовании вирусов был обнаружен фермент -обратная транкриптаза - обладающий способностью синтезировать однонитевую ДНК, используя в качестве матрицы РНК. Вирусы, геном которых кодирует данный фермент, были названы ретровирусам. Ретровирусы составляют большое семейство вирусов животных. Их свойства - это одноцепочечный РНК-содержащий геном и репликация с помощью обратной транскриптазы, которую кодирует вирусный геном. Хотя ретровирусы различаются друг от друга в деталях, все они имеют три гена: gag, pol и env, и фланкируются двумя длинными концевыми повторами (ДКП) [Varmus Н. Е., 1983]. Ген pol кодирует несколько различных энзимов, среди которых есть обратная транскриптаза. Участок гена pol, который кодирует обратную транскриптазу, является наиболее консервативным участком ретровирусного генома и используется для определения филогенетического родства среди ретровирусов [Chui l.-M. et al., 1988]; а также для определения родства между ретровирусами и ретротранспозонами дрозофилы [Toh Н., et al., 1986]. Ген gag кодирует белок капсида, ген env- белок оболочки.

С того времени были найдены многие генетические элементы, содержащие ОРС, кодирующие белки со структурой, сходной с ретровирусной обратной транскриптазой [Weiner А. М., Deininger P. L.,, Efstratiadis А., 1986]. Последовательности, кодирующие обратную транскриптазу, были обнаружены во многих различных элементах, включая ДНК-содержащие вирусы растений и животных [Toh Н., Hayashida Н., Miyata Т., 1983]. Элемент млекопитающих L1 [Hattori М., Kuhara S., et al., 1986], мобильные элементы дрозофилы, дрожжей, трипаносомы [Saigo K.,et. al., 1984; Clare J., 1985; Kimmel В. E., Ole-Moiyou О. K;,

Young J. R., 1987] и митохондриальные плазмиды и интроны грибов [Michel F., Lang F., 1985; Matsuura E. Т. Domenico J. M., Cummings D. J., 1986].

В настоящее время генетические элементы, содержащие домен обратной транскрилтазы, делятся на несколько групп: гепаднавирусы - вирусы животных и каулимовирусы - вирусы растений, ДНК-содержащие вирусы; мобильные элементы дрожжей и дрозофилы, которые содержат гены gag и ро/ и длинные концевые повторы; интроны II группы дрожжей и митохондриальные плазмиды; и i группа мобильных элементов, обнаруженных у млекопитающих и дрозофилы, которые также содержат гены gag и ро/, но не содержат длинные концевые повторы (ДКП) [Fawcett D. Н., Lister С. К., Keller Е., Finnegan., 1986]. Сходство последовательностей аминокислот данных элементов приводит к выводу об общем их происхождении. Элементы, в отличие от вирусов не образуют вирусных частиц, так как не кодируют необходимые для этого белки, но так же, как и ретровирусы, имеет обратную транскриптазу, обладают способностью перемещаться по геному и интегрировать.

Хотя сходство нуклеотидных последовательностей может быть обнаружено и в других кодирующих участках данных групп генетических элементов, только участок, кодирующий обратную транскриптазу, является общим для всех данных элементов и может быть использован для филогенетического анализа ретроэлементов. Ретроэлементы могут быть разделены на две большие ветви. Первая ветвь содержит митохондриальные интроны II порядка и ретротранспозоны, не содержащие длинные концевые повторы (non-LTR). Вторая ветвь включает в себя ретровирусы и содержащие ДКП ретроэлементы. Гепаднавирусы, copia-элементы и Ту-элементы составляют наиболее отдаленную часть этой ветви, тогда как каулимовирусы близки к ретровирусам.

Дополнительные генетические элементы из всех данных категорий были обнаружены в различных таксонах, в том числе в растениях и простейших. Данные ретроэлементы нельзя отнести к какой-либо ветви. Интересная последовательность, кодирующая обратную транскриптазу, обнаружена в бактериях. Данная обратная транскриптаза производит многокопийную одиоцепочечиую ДНК, содержащую как ДНК, так и РНК, связанную ковалентно с ДНК (msDNA) [Lim D., Mass W., 1989; Lampson B.C., Sun J., et al., 1989]. г

РНИ-сщержщЬе трусь/

• « •»•«»<>" Ф пре^коЬая (ро/жа. ретровцрусы цитронЦ f Л \тт/ Мытахондрипльняя плазмидгх ( \ мумьтцкопцйная йдьюцегютнля ЪНК

Рисунок 3. Схема эволюции ретроэлементов.

Обозначения к рисунку 3: RTL - белок простейших, сходный с обратной транскриптазой, msDNAs - мультикопийная одноцепочечная ДНК, ретротранспозоны с ДКП (а) - группа copia-элемента и Ту 1-элемента, ретротранспозоны с ДКП (б) - группа gypsy-элемента. Черные участки соответствуют домену обратной транскриптазы, серые -участок гена gag, заштрихованные по диагонали - домену интегразы, участки, заштрихованные клеточкой, соответствуют гену env. Длинные концевые повторы обозначены стрелочками.

Рисунок 3 демонстрирует схематическое филогенетическое древо элементов, содержащих домен обратной транскриптазы. Так как ретротранспозоны являются единственными элементами, общими для ветвей с ДКП и без ДКП, их структура изображена в качестве наиболее вероятного предка всех элементов, содержащих домен обратной транскриптазы. Так как РНК-содержащие вирусы и гепаднавирусы не содержат ДКП, можно предположить, что предковый элемент не содержал ДКП. Многообразие ретротранспозонов без ДКП и их широкое распространение приводит к выводу, что ретротранспозоны без ДКП являются наиболее древней группой ретроэлементов. Основываясь на присутствии в составе как ретротранспозонов с ДКП, так и ретротраспозонов без ДКП, генов дад и pol, делается вывод о наличии у предкового ретротраспозона данных генов. Сходство в последовательностях гена дад у ретротранспозонов с ДКП и у ретротранспозонов без ДКП заключается в сериях Суэ-участка [Xiong Y., Eickbush Т. Н., 1988]. У элементов, которые потеряли данный участок (например, L1) остается небольшая ОРС на 5'- конце. У ретровирусов Суэ-участок остался в последовательности, соответствующей белку капсида, который необходим для эффективней обратной транскрипции. Тот факт, что не обнаружены ретроэлементы, способные интегрироваться в геном, но без гена дад, приводит к выводу, что ген дад необходим, чтобы изолировать РНК ретроэлементов.

Ген pol предковой формы изображен содержащим домены обратной транскриптазы и интегразы. Домен интегразы у элементов без ДКП локализован ниже домена обратной транскриптазы, у ретротранспозонов группы copia-элемента - выше домена обратной транскриптазы.

Ретровирусы обладают сходством с ретротранспозонами групп gypsy и могут быть представлены как ретротраспозоны, приобретшие ген env, позволяющий им покидать клетку [Temin Н. М., 1980]. Труднее объяснить происхождение гепаднавирусов и каулимовирусов, так как структуры их геномов сильно отличаются от геномных структур ретротранспозонов. Вероятно, участок гена pol был приобретен вирусами-предшественниками [Finnegan D. J., 1990].

Перенос домена обратной транскриптазы от ретротранспозонов имеет место у многих ретроэлементов органел и бактериального генома. Лучше всего изучены интроны II порядка митохондрий и пластид. Большинство интронов II порядка не содержат домена обратной транскриптазы. Не ясно, являются ли интроны II порядка, содержащие домен обратной транскриптазы, предками интронов, потерявших данный домен, или, наоборот некоторые интроны приобрели его. Также возможно, что соседние три элемента приобрели домен обратной транскриптазы из митохондриальных плазмид, митохондриального генома или бактериального генома.

Некоторые родственные ретротранспозоны встречаются в организмах из далеко отстоящих таксонов. С другой стороны, 3 типа вирусов обнаружены каждый для отдельного таксона: гепаднавирусы и ретровирусы позвоночных и каулимовирусы растений [Xiong Yue, Eickbush Т., 1990].

Вирусы и ретротранспозоны с ДКП

Эту ветвь филогенетического древа составляют ретровирусы, некоторые ДНК-содержащие вирусы и 7 мобильных элементов. Вирус гепатита В, copia-элемент, Ту-элемент образуют наиболее отдаленную часть ветви. Интересно, что ретротранспозоны дрозофилы (17.6, 297, Gupsy и 412) обладают большим сходством с CaMV (Cauliflower mosaic virus). Общее свойство данной группы -наличие длинных концевых повторов. Ретровирусы и 6 мобильных элементов D. melanogaster и Saccharomyces cerevisia содержат длинные концевые повторы со сходными структурами и функциями. ДНК-содержащие вирусы, вирус гепатита В, и CaMV (Cauliflower mosaic virus), хотя не имеют полных ДКП, но содержат те участки повторов, которые необходимы для их жизненного цикла [Summers J., Mason W. S., 1982; Pfeiffer P., Hohn Т., 1983; Miller R. H. Robinson W. S., 1986]. Мобильный элемент D. discoideum, DIRS I, также содержит длинные концевые повторы [Cappello J., Handelsman К., Lobish H., 1985].

Транспозоны без длинных концевых повторов и интроны II порядка

Вторая группа элементов, кодирующих обратную транскриптазу, состоит из митохондриальных интронов грибов, митохондриальных плазмид, и ряда мобильных элементов, обнаруженных в различных таксонах. Особенностью данной группы является высококонсервативный домен YXDD, фланкируемый несколькими гидрофобными остатками. Наиболее отдаленными элементами в данной группе являются R2 и L1. Наиболее нетипичным элементом является R2, так не содержит второй ОРС, подобной дад гену ретровирусов и не вызывает дупликации по сайту-мишени [Burke W. D., Calalang С. С., Eickbush Т. Н., 1987; Bingham P. М. ZacharZ., 1989].

В данную группу входят митохондриальные интроны дрожжей (II порядка). Плазмида Neurospora (Nc-pl) наиболее сходна с интронами II порядка [Nargang F. Е„ Bell J. В., Stohl L. L., Lambowitz A. M, 1984].

Одной из важных функций ДКП является участие в репликации [Temin Н. М., 1982]. Отсутствие ДКП у элементов данной группы подразумевает под собой то, что они используют альтернативный механизм увеличения числа копий. В случае с плазмидой Neurospora полный транскрипт получается просто, так как ее геном кольцевой. L1 увеличивает число копий за счет использования 5*-тандемных повторов. Другие члены группы могут использовать промоторы хозяев. Многие члены этой группы приобрели внешний промотор за счет способности встраиваться в специфический сайт в гене хозяина. Например, R1 и R2 - в рибосомальные гены. Интроны II порядка также встраиваются в определенные гены. В таком случае, использование данных генов хозяином приводит к сплайсированию данных интронов. Другие интроны II порядка могут использовать аутосплайсинг [Cech Т. R., 1986].

Интроны II порядка, интегрируясь в новый ген, сохраняют способность к аутосплайсингу, то есть практически никак не влияют на функцию этого гена. Механизм аутосплайсинга, реализованный в «обратном порядке», позволяет вырезанной РНК-копии интрона интегрировать в РНК нового гена, затем, посредством «собственной» обратной транскриптазы синтезируется копия кДНК, представляющая собой ДНК гена с интроном; на заключительном этапе происходит гомологичная рекомбинация между ДНК и хромосомной копией гена, и, как следствие, наследование нового структурного варианта с интроном.

Temin [Temin H. M., 1980] предположил, что ретровирусы произошли от клеточных мобильных элементов. Мобильные элементы могут быть предшественниками всех ретроэлементов [Xiong Y. Eickbush Т., 1988].

Мобильные элементы

В начале 40-х года американская исследовательница Б. МакКлинток открыла существование гена, который вызывал повышение частоты хромосомных перестроек у кукурузы. Среди потомков от скрещивания, в котором оба родителя несли такие перестройки, появлялись нестабильные мутации с неожиданно высокой частотой. В 1948 году МакКлинток опубликовала результаты исследования этого локуса, вызывающего разрывы хромосом, сделав вывод, что он является совершенно необычным, поскольку может перемещаться из одного участка в другой. МакКлинток назвала феномен перемещения транспозицией, а сами локусы - контролирующими элементами.

Эти элементы характеризуются следующими свойствами:

1) они могут перемещаться из одного сайта в другой;

2) их встраивание в данный район влияет на активность генов, расположенных рядом;

3) утрата мобильных элементов в данном локусе превращает прежде мутабельный локус в стабильный;

4) в тех сайтах, где присутствуют мобильные элементы, могут возникнуть делеции, транслокации, транспозиции, инверсии, а также разрывы хромосом. [Жимулев И.Ф., 2003]

Типы мобильных элементов

Транспозирующиеся элементы. Первые мобильные элементы, исследованные на молекулярном уровне, происходили из геномов прокариот, а также из фагов и плазмид. Сейчас известно несколько типов таких элементов, но все они обладают двумя общими свойствами: во-первых, несут ген, необходимый для транспозиции; во-вторых, на концах содержат специфические взаимно инвертированные повторяющиеся последовательности, также необходимые для транспозиции. Сами транспозирующиеся элементы не кодируют никаких существенных для организма функций, однако часто содержат специфические гены, например, ген устойчивости к антибиотикам. Транспозиция этих элементов, как правило, сопровождается сильными мутагенными эффектами.

Мобильные элементы многих эукариот сходны со своими прокариотическими «родственниками» в том отношении, что для их транспозиции необходимы гены, содержащиеся в самих элементах, и специфические концевые последовательности. Если транспозиция протекает без участия обратной транскриптазы, то они относятся к транспозирующимся элементам. К этому классу принадлежат контролирующие элементы кукурузы - первые из обнаруженных мобильных единиц, а также некоторые элементы Drosophila. Сходные элементы имеются у других беспозвоночных и у некоторых цветковых растений, где они отвечают за пеструю раскраску лепестков.

Ретротранспозоны. Эукариотические мобильные элементы, транспозиция . которых происходит при транскрипции или обратной транскрипции, называются ретротранспозонами. Они содержат центральный сегмент, кодирующий среди других белков обратную транскриптазу. У некоторых ретротранспозонов (класса I), этот центральный сегмент окружен длинными концевыми повторами (LTR, ДКП). У ретротранспозонов класса I на одном из концов имеются также короткие инвертированные повторы. По своей структуре, особенностям транскрипции и механизму транспозиции они напоминают ретровирусные провирусы. Отличие состоит в отсутствии жизнеспособных внеклеточных форм. Семейства ретротранспозонов обнаружены у разных беспозвоночных, в частности у дрожжей и Drosophila, а также у растений и некоторых млекопитающих.

Ретротранспозоны класса II не имеют концевых повторов, а один из концов часто бывает представлен АТ-богатой последовательностью. В этом отношении они не похожи на ретровирусные провирусы.

Ретроген». По геному перемещаются также разнообразные сегменты ДНК, не обладающие специфическими структурными и кодирующими свойствами транспозонов и ретротранспозонов. В отличие от мобильных элементов других классов, они весьма гетерогенны по размеру и структуре. У них нет концевых повторов, а на одном из концов часто присутствует АТ-богатая последовательностью. К элементам этого класса, называемым «ретрогенами», относятся процессированные псевдогены и SINE-последовательности; они обнаружены у различных эукариот, но особенно обильно представлены у млекопитающих. Транспозиция «ретрогенов», по-видимому, происходит через образование РНК с последующей обратной транскрипцией. Однако это процесс скорее всего пассивный в том смысле, что данные элементы не кодируют необходимых для транспозиции активностей (т.е. обратную транскриптазу).

Дупликация сайтов-мишений

Независимо от типа мобильного элемента его встраивание в новый генетический локус обычно сопровождается дупликацией короткого участка ДНК в месте встраивания (в сайте-мишени). Эти дуплицированные сегменты фланкируют встроившийся элемент. Почти обязательная дупликация сайтов-мишеней указывает на то, что при различиях в механизме, большинство вставок происходит с образованием в потенциальных сайтах-мишенях смещенных одноцепочечных разрывов. Сайт-мишень в геноме, содержащий мобильный элемент условно называется «заполненным», а не содержащий такового -«свободным».

Размер дуплицированных последовательностей для мобильных элементов различается. Для транспозонов и ретротранспозонов класса I, как правило, характерны дупликации сайтов-мишеней определенного размера. Например, встраивание транспозонов ТпЗ E.coli в новые локусы всегда сопровождается дупликацией участка размером 5 п.о.; встраивание так называемого Ас-элемента у кукурузы приводит к дупликации участка размером 8 п.о., а ретротранспозона Drosophila, называемого gypsy, - 4 п.о. В то же время при встраивании ретротранспозонов класса II и «ретрогенов» происходит дупликация участков разного размера. Например, встраивание F-элемента Drosophila -ретротранспозона класса II - приводит к дупликации участка длиной от 8 до 13 п.о. Такая вариабельность или, напротив, неизменность размеров, вероятно, обуславливается специфичностью ферментов, катализирующих образование смещенных одноцепочечных разрывов в сайтах-мишенях. Неизменность размеров дуплицирующихся участков, характерная для транспозонов и ретротранспозонов класса I, по-видимому, связана с тем, что ДНК разрезается специфическими эндонуклеазами, кодируемыми каждым из элементов.

Мобильные элементы как диспергированные повторяющиеся последовательности.

Как правило, каждый тип мобильных элементов встречается в геноме многократно, то есть элементы образуют семейства диспергированных повторяющихся последовательностей. Такие семейства благоприятствуют дальнейшим геномным перестройкам, создавая сайты для неаллельных гомологичных рекомбинаций, что приводит к делециям, дупликациям, инверсиям и транслокациям. Способность мобильных элементов облегчать перестройки подтверждается на примере ретротранспозона Ту класса I у дрожжей. Если такие перестройки происходят в единичных соматических клетках многоклеточного организма, то вероятность их влияния на функционирование соответствующего органа очень мала. Но в клетках зародышевой линии они могут вызывать серьезные мутационные изменения и хромосомные аберрации. Если такие перестройки фиксируются в популяции в результате естественного отбора или генетического дрейфа, то это имеет заметные эволюционные последствия.

Гомологичные рекомбинации между неаллельными диспергированными повторами в отдельных семействах часто привлекают для объяснения повторения сегментов ДНК. А некоторые различия между гомологичными локусами у разных млекопитающих можно связать с делециями в прямых повторах. К геномным перестройкам приводят также неравный гомологичный кроссинговер между диспергированными повторами в сестринских хроматидах или гомологичных хромосомах, внутрицепочечная рекомбинация и «проскальзывание с неправильным спариванием» («slipped misparing»). Молекулярно-генетический анализ, проведенный на Drosophila, показывает, что высокая частота неравного кроссинговера между определенными парами аллелей - это результат присутствия в каждом из членов пары мобильных элементов, находящихся в разных позициях. Реципрокная гомологичная рекомбинация между диспергированными повторяющимися последовательностями из разных хромосом может привести и к крупным хромосомным перестройкам [Сингер М., Берг П., 1998].

Индукция мобильных элементов под действием стресса

Индуцировать транспозиции мобильных элементов возможно стрессовыми факторами (вирусным заражением клеток, обработкой ядами, повышением температуры, детергентами, этанолом, ионами металлов, другими химическими веществами, гипоксией, УФ и уизлУчением) [Lindquist S., Graif Е.А., 1998.]. Активация системы генов, подчиненных регуляторным сайтам теплового шока (РСТШ), приводит к усилению транскрипции и синтеза ферментов транспозиции МЭ (ревертаз и др.) и к увеличению вероятности транспозиции. В свою очередь это вызовет вспышку инсерционного мутагенеза. Наличие энхансеров в структуре МЭ приводит к заметной активации олигогенов и полигенов, в окрестности которых совершаются транспозиции [Van Bogelen R. A., Neidhardt F. С., 1990].

Для температурной индукции нет необходимости в запредельных температурах. Для дрозофилы это интервал 33-37° С, что отвечает условиям теплого летнего дня; у термофильных бактерий, растущих при 50° С, это 60° С; у арктических рыб, живущих вблизи 0° С, это 8-19° С; у млекопитающих, имеющих постоянную температуру тела, это повышении температуры при заболеваниях, у сои - температура солнечного летнего дня. Поэтому температурная индукция -это вполне обычное явление в реальных условиях существования популяций. Температурное воздействие воспринимается чувствительным звеном регуляции ответа: у Е. Coli это б32 - фактор РНК-полимеразы, узнающий регуляторные сайты теплового шока, у эукариот - это фактор теплового шока (HSF), приобретающий активность после повышения температуры и активирующий транскрипцию генов hsp [Ратнер В А, Васильева Л.А., 1992].

Основная функция продуктов этих генов - повышение термотолерантности, защита клеток от летальных воздействий. Система ответа на тепловой шок индуцируется не только повышением температуры, но и воздействием других, весьма разнообразных внешних факторов, перечисленных выше. [McDonald J.F., 1989; Neidhart F.C., Van Bogellen R.A., Vaughn V., 1984; Nover L., Hellund D., Neumann D., 1984]. Все эти воздействия являются стрессовыми, неблагоприятными, а реакция системы теплового шока - генерализованной. Существует также система ответа на холодовой шок, которая действует альтернативно и антагонистично системе теплового шока [Anantham J., Goldberg A. L., VoelmyR., 1986].

Все это дает основание рассматривать совокупность паттернов различных МЭ как геномную систему, которая может быстро перестраиваться под влиянием стрессовых внешних, метаболических и геномных воздействий [Ratner V. А., Vasilyeva L. А., 1989; Ратнер В.А., Васильева Л.А.; 1992; Ratner V. A., Vasilyeva L. А., 1992]. В этом смысле систему паттернов МЭ можно рассматривать как своего рода геномную систему восприятия стрессовых сигналов из внешней и генетической среды, которые запускают системные вспышки наследственной изменчивости в критические, стрессовые периоды эволюции популяций. Существенно, что эта изменчивость имеет ярко выраженный регуляторный характер. Массовые перемещения МЭ после индукции могут переподчинять гены другим сигналам генетического управления, изменять тканевую специфичность, гормональную специфичность, усилить или ослабить экспрессию. Массовые индуцированные транспозиции и эксцизии МЭ могут повлечь за собой многочисленные генетические последствия: относительно мягкую перестройку генетического управления многих генов, быстрое изменение видовой нормы лимитирующих количественных признаков, возможно - эстафетное изменение самого лимитирования, изменение спектра дальнейших мутаций, рекомбинаций и перестроек, становление нового генетического гомеостаза.

Участие в этих событиях ретротранспозонов означает, что их собственный генетический материал при воспроизведении проходит РНК-стадию, которая имеет вероятность мутирования при прямой и обратной транскрипции ~ 10"3 - КГ4 [Reanney D.C., 1986], что на несколько порядков выше, чем в ДНК-копиях генов эукариот. Таким образом, гены и функциональные сайты самих ретротранспозонов подвержены особо сильному мутагенезу. Это касается также генов, захваченных ретротранспозонами из генома хозяина.

Критические, стрессовые условия существования часто сопряжены с прохождением популяций через стадию «бутылочного горлышка», которое может быть связано либо с массовым вымиранием, либо с заселением новых экологических ниш по «принципу основателя», а также может встретиться на границах занимаемых ареалов. В этих условиях новые формы, индуцированные через вспышки транспозиций, могут стать основателями новых популяций с резко измененным фенотипом по лимитирующим генам количественных и качественных признаков. Здесь возможны как адаптивные, так и случайные варианты быстрого преобразования популяций, нормы их признаков и паттернов МЭ. В результате эти события могут стать одной из главных компонент изменчивости и эволюции генома.

Нормальные скорости транспозиций Р-элемента - 2,5 -10 "3 и copia-подобных элементов дрозофилы - 5,7-10 ~5 на сайт, на геном, за поколение [Harada К., Yukushiro К., Mukai Т., 1990]. При пересчете на геном за поколение получаем соответственно ~ 0,1 и 0,01. То есть в каждом поколении лишь малая часть геномов претерпевает спонтанные транспозиции, что совместимо с устойчивостью популяционной нормы. Однако стрессовая ситуация разрушает это состояние: для Р-элемента и copia-подобных элементов дрозофилы имеем соответственно 7,8-13 и 18,6 транспозиций на геном, за поколение. Иначе говоря, в каждом поколении десятки олигогенов и полигенов в каждом геноме изменяют свою регуляторную подчиненность. Кроме того, поскольку кодирующая часть генома дрозофилы составляет 3-5%, то можно предположить, что такая же доля инсерций будет грубо дефектной. Тогда в случае индукции будем иметь ~ 0,5 - 1 дефектную транспозицию на геном. Вероятнее всего, что все это приводит к массовым потерям в популяции.

Вполне вероятно, что изменения паттерна МЭ является одним из механизмом видообразования. Так, в частности, гибридный дисгенезис, включающий в себя транспозиции Р-элемента, является изолирующим механизмом между скрещиваемыми линиями дрозофил. Поскольку система паттернов является общегеномной системой, то она может маркировать или модифицировать экспрессию любых лимитирующих признаков, в том числе и признаков, обеспечивающих изоляцию: морфологическую, генетическую или иную несовместимость, летальность гибридов и т.д. Различные варианты таких признаков, вызванных именно транспозициями МЭ, будут отвечать различным паттернам. Поэтому есть довольно заметные шансы, что в популяциях, проходящих через стрессовую стадию «бутылочного горлышка», индуцированные транспозиции, помимо прочих, будут затрагивать так же признаки изоляции [Ратнер В.А., Васильева Л.А.; 1992].

Материалы и методы

Условия содержания В. germanica Насекомых содержали в стеклянных банках, емкостью 1-1,5 л при температуре 25° С. На дно банок помещали плотную бумагу в форме круга. Из этой же бумаги изготавливали «гармошки», высотой 8-10 см. Их располагали по периметру банки. В центр помещали пластиковые поилки с небольшим тампоном ваты. Верхнюю внутреннюю часть банок смазывали вазелиновым маслом. В качестве корма использовали сухой корм для собак «Dog Chow». Особого внимания требовало постоянное наличие чистой воды в поилках. Банки закрывали хлопчатобумажной тканью, затем полиэтиленовыми крышками с отверстиями (не менее десяти, диаметром 0,5-0,7 см.)

Постановка скрещиваний

Сначала отбирали виргинных самок. Для этого нескольких нимф отсаживали по одной в небольшие банки, объемом около 200 мл. Через несколько линек, когда насекомые становились половозрелыми, тех из них, которые оказывались самками, использовали в скрещиваниях. Для скрещивания самца и самку помещали в банку объемом около 0,5 л, на дно которой клали корм, поилку и бумажную «гармошку». После того, как у самки рождалось потомство, самца и самку изымали из банки.

Линии В. germanica, использованные в работе

В данной работе были использованы несколько линии рыжего таракана. 1-я линия (Р6) была получена в 1995 году из тараканов, пойманных на американской свиноферме. Данная линия инфицирована денсовирусом BgDNV. 2-я линия (Normal) была получена в 1993 году из тараканов, пойманных в жилых помещениях США. Было показано, что линия Normal не содержит денсовируса. Также были использованы линии "Orange" и "Black".

Выделение тотальной ДНК рыжего таракана

Выделение тотальной ДНК из тараканов проводили согласно стандартной методике с обработкой лизата протеиназой К и последующей экстракцией ДНК смесью фенол-хлороформ [Маниатис, Фрич, Сэмбрук, 1984]. .Особь гомогенизировали в 800 мкл раствора, содержащего Трис HCI рН 8,0 0,2 М

ЭДТА рН 8,0 0,5 М

SDS 0,5%

Протеиназа К (10мг/мл) до конечной концентрации 1%

Лигировали в течение 4 часов при 55° С.

Затем добавляли 8 мкл РНКазы, до конечной концентрации 50 мкг/мл оставляли на 15 минут.

После этого добавляли 700 мкл фенола. Перемешивали, центрифугировали при 5000 об./мин. Верхнюю фазу переносили в стерильный эппендорф.

Добавляли 700 мкл фенол-хлорофома, перемешивали, центрифугировали, отбирали верхнюю фазу. Повторяли 2 раза.

Добавляли к верхней фазе 30 мкл 5 М NaCI. Перемешивали.

Добавляли 600 мкл хлороформа, перемешивали, центрифугировали, отбирали верхнюю фазу.

ДНК осаждали 96% этанолом (1000 мкл), промывали сначала 70% этанолом, затем 96% этанолом.

Спирт отбирали, высушивали при 55° С, растворяли в 100 мкл стерильной воды. Качество выделения ДНК проверяли в агарозном геле.

Электрофорез в агарозном геле

Разделение фрагментов ДНК осуществляли с помощью электрофореза в 0,8-1,2% горизонтальном агарозном геле с использованием трис-ацетатного буфера (0,04 М трис-ацетат, 0,002 М ЭДТА). В гель добавляли бромистый этидий (1 мкг/мкл). Форез вели при напряженности электрического поля от 2 до 15 В/см и комнатной температуре. После разделения окрашенную бромистым этидием ДНК наблюдали при освещении геля ультрафиолетовыми лучами.

Полимеразная цепная реакция

Реакцию проводили по следующей схеме: 5 минут при 95° С;

1 мин при 94° С (денатурация), 2 мин при 55° С (отжиг), 3 мин при 72°С (элонгация) - 30 циклов; 7 мин при 72° С.

Для амплификации использовали набор реактивов «GenePakCore» фирмы «Лаборатория Изоген», в состав которого, в частности входят такие усилители полимеразной цепной реакции, как betain Na и (NH4)2S04.

Результат реакции оценивали с помощью электрофоретического разделения фрагментов ДНК в агарозном геле.

Получение очищенных продуктов ПЦР Электрофорез ДНК проводился в 1% геле из легкоплавкой агарозы. Острым скальпелем вырезали из геля кусочки, содержащие нужные фрагменты ДНК, и помещали их в стерильные эппендорфы. Инкубировали при температуре 70° С до полного растворения агарозы. Последующую очистку проводили с использованием набора реактивов Wizard® PCR DNA Purification Systems (Promega). Чистка продуктов ПЦР проводилась в соответствии с протоколом этой фирмы. В эппендорфы с ДНК добавляли по 1 мл Resin и перемешивали 20 секунд. Раствор помещали в колонку, соединенную с вакуумным насосом. После удаления жидкости из колонки наливали по 2 мл 80%-ного изопропилового спирта. Далее переносили миниколонку с ДНК в стерильный эппендорф и центрифугировали при 10 тыс. об./мин в течение 2-х минут при комнатной температуре. Снова переносили миниколонку в чистый эппендорф и добавляли 50 мкл бидистиллированной воды, центрифугировали 20 секунд при 10 тыс. об./мин. Проверяли чистоту и концентрацию ДНК в 1%-ном агарозном геле электрофорезом.

Лигирование фрагментов ДНК Для лигирования использовали набор pGem® - Т Easy Vector system фирмы Promega. Смесь включала следующие компоненты: 2х Rapid Ligation Buffer (60 mM Tris-HCI, рН 7,8, 20 MgCI2l 20 mM MgCI2, 20 mM DTT, 2 mM ATP, 10%-ный PEG) - 5 мкл; плазмида pGEM® - Т Easy Vector (50 ng) - 1 мкл; ДНК в концентрации 0,3 мкг/мкл - 3 мкл; Т4 DNA Ligase (3 единицы/мкл) - 1 мкл. Лигирование происходило в течение часа при комнатной температуре

Трансформация клеток Е. coli Приготовление компетентных клеток Е. coli Для приготовления компетентных клеток был использован метод, описанный Маниатисом с соавторами [Маниатис, Фрич, Сэмбрук, 1984].

1) Штаммом E.coli XL 2 - Blue засевали 10 мл стерильной жидкой среды 2х УТ(на 1л Н 20: бакго-пептон -16 г, дрожжевой экстракт - 10 г, NaCI - 5г). Инкубировали на качалке при 37°С в течение ночи.

2) Из ночной культуры отбирали 100 мкл и переносили в 10 мл среды YT, продолжая инкубацию в течение часа.

3) Колбу с культурой Е. coli охлаждали десять минут во льду и центрифугировали в охлажденных центрифужных пробирках 5 минут при 4 тыс. об/мин при 0°С.

4) Супернатант сливали, к осадку добавляли 5 мл стерильного водного раствора MgCI2 (0.05М), встряхивали на роторе и оставляли во льду на 5 минут.

5) Центрифугировали пять минут при 0°С.

6) Удаляли надосадочную жидкость.

7) Осадок ресуспендировали в 1 мл раствора охлажденного до 0°С, содержащего 0.1 М CaCI2 и 0.05 MnCI2, и помещали в ледяную баню на 40 минут.

8) Готовые компетентные клетки разливали по 200 мкл в охлажденные пробирки.

Трансформация компетентных клеток

1) В 200 мкл клеточной суспензии добавляли 5 мкл лигированной смеси.

2) Инкубировали в течение 30 минут при 0°С.

3) Переносили в термостат на 42°С на 2 минуты, а затем охлаждали при комнатной температуре пять минут.

4) Клетки смешивали с 1 мл YT и инкубировали при 37°С в течение часа.

5) Высевали на чашки с питательной средой Agar triptose (Ferak) с селективным антибиотиком ампицилином (50 мкг/мл). Для анализа активности маркерного гена LacZ в среду добавляли IPTG (50 мг/мл) и X-Gal (50 мг/мл). Чашки помещали в термостат на 37" С на ночь.

Выделение и очистка плазмидной ДНК для идентификации рекомбинантных молекул

Растворы для выделения: Раствор БАК 1: 50 мМ трис- HCI, рН 8,0 50 мМ ЭДТА, рН 8,0 лизоцим 0,5 мг/мкл РНКаза 100 мкг/ мкл Раствор БАК 2: 50 мМ трис-HCI, рН 8,0 50 мМ ЭДТА, рН 8,0 1% тритон Х-100

1) Отбирали рекомбинантные белые колонии и пересевали штрихом на новые чашки (по 4 колонии на чашку). Оставляли на ночь в термостате.

2) С каждого сектора прокаленной петлей отбирали клеточную массу и суспендировали в 200 мкл раствора БАК 1.

3) В эппендорфы с клеточной суспензией струей вливали 400 мкл лизирующего раствора БАК 2, затем их кипятили 40 секунд и охлаждали.

4) Центрифугировали при 14 тыс. об/мин в течение 30 мин.

5) Стерильной деревянной палочкой удаляли осадок из раствора.

6) В супернатант добавляли 10% SDS (додецил-сульфат натрия) до 1% и инкубировали при 65° С 45 минут.

7) Добавляли 1/7 объема ЮМ ацетата калия, перемешивали и инкубировали в ледяной бане 30 минут.

8) Центрифугировали 10 минут при 10 тыс. об/мин. Супернатант переносили в чистый эппендорф, добавляли 1 объем хлороформа, перемешивали, центрифугировали 5 минут при 10 тыс. об/мин.

9) Супернатант переносили в чистый эппендорф. ДНК осаждали 96%-ным изопропиловым спиртом, промывали 70%-ным этанолом.

10) Отбирали спирт, ДНК высушивали при 37° С и растворяли в 50 мкл стерильной воды.

Рестрикция рекомбинантных плазмид для установления длины вставки

В работе были использованы рестрикционная эндонуклеаза (рестриктаза) и буфер фирмы «Fermentas». Рестрикцию проводили в объеме 20 мкл в течение часа при 37° С. Реакционная смесь включала: буфер (10х) - 2 мкл; плазмидная ДНК - 10 мкл; деионизированная вода - 6 мкл; фермент EcoR I (5 ед/мкл) - 2 мкл.

Секвенирование ДНК

Клонированные объекты ДНК секвенировали по методу Сэнгера [Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R., 1977] с использованием ДНК-секвенатора ABI PRISM™ 310 и набора реактивов dGTP Big Dye Termination Kit («РЕ Applied Biosystems», Foster City CA) согласно рекомендациям фирмы-производителя.

Компьютерный анализ

В работе использованы компьютерные базы данных и интернет-ресурсы, размещенные на серверах NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.Qov/BLAST/). ВСМ Search Launcher, (http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/) и GeneBee Servises (http://www.aenebee.msu.ru/aenebee.htmn.

Саузерн-блот гибридизация

ДНК-зонды метили (a-32P)dATP методом ник-трансляции [Sambrook J., Fritsch E.F., ManiatisT., 1989], используя наборы реактивов фирмы «Amersham».

Проводили электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле в ТАЕ-буфере с добавлением бромида этидия в течение 18-20 часов.

Денатурация ДНК в геле проводили в течение 1 часа при комнатной температуре в растворе следующего состава: 0,5 М NaOH 0,6М NaCI. Этот раствор использовали и для вакуумного переноса фрагментов ДНК на нейлоновые мембранные фильтры «Hybond» («Amersham», Англия). Перенос осуществляли в течение 4-6 часов.

Предгибридизацию проводили в течение 12-16 часов при 68° С в растворе, содержащем 0,5 М NaH2P04 рН 7,2, 7%SDS, 1 mM EDTA, 150 мкг/мкл тотальной РНК дрожжей. Гибридизация осуществлялась в течение 4-6 часов при тех же условиях, с добавлением меченого ДНК-зонда.

Фильтр отмывали в растворе 40 mM NaH2P04l 0,1% SDS, затем высушивали и экспонировали в кассете с рентгеновской пленкой РМ-В в течение 1 -7 суток.

Поддержание пересеваемой культуры клеток В. germanica Приготовление культуральной среды Раствор «А» (хЮ5) на 100 мл CoCI-6H20 20 мг

CuS04-5H20 20 мг

MnS04 H20 160 мг

ZnS04-7H20 200 мг

Раствор «В» (х105) NaMo404-2H20 на 100 мл 20 мг

Раствоп «С» (х105^ на 100 мл

Na2Se03 20 мг

РаствоЕлО» (хЮ3) на 100 мл

Глутатион 1000 мг

Аскорбиновая кислота 1000 мг

FeS04-7H20 50 мг

Раствор «А» 1 мл

Раствор «В» 1 мл

Раствор «С» 1 мл

Витаминный раствор (х103) на 100 мл р-аминобензойная кислота 100 мг цианокобаламин (витамин В12) 50 мг d-биотин 10 мг

Среда:

Растворяли в 2 л дистиллированной воды 2 упаковки L15 Powder (GibcoBRL, Catalog#41300-039). Затем добавляли: L-аспартамовой кислоты 0,598 г

L- глутамина 0,584 г

L-пролина 0,600 г

L-глутаминовой кислоты

1,000 г а-кетоглутаровой кислоты

0,598 г глюкозы

28,821 г раствора «D»

2 мл витаминного раствора

2 мл

Tryptose Phosphate Broth (Difco) 200 мл

С помощью 10 N NaOH доводили рН до 7,2. Раствор стерилизовали с помощью фильтрации через фильтр 0,22 мкм. Непосредственно перед пересевом клеток добавляли 1/20 объема Fetal Bovine Serum (Harlan) и 1/100 объема Cholesterol concentrate [Kurtti Т.J., Brooks M. A., 1976 (1)].

Культуру клеток пересевали каждые 7-14 дней путем разведения суспензии клеток 1:10. Инкубировали при 25 °С.

Облучение клеток у-лучами Клетки облучали на установке ГУПОС-1 (4,5 Гр/мин, 137Cs) на стадии 10-го пересева после заражения вирусом в пластиковых флаконах фирмы «Nunc» (Дания).

Брали замороженные половинки тараканов с большим количеством вируса, помещали в эппендорф и пластиковым пестиком растирали в среде, используемой для поддержания культуры клеток таракана. Полученный гомогенат

Поддержание культуральной среды

Микроинъекции вирусных частиц под кутикулу тараканов стерилизовали путем пропускания через фильтр 0,22 мкм. Затем инъецировали под кутикулу тараканам с помощью шприца для микроинъекций (Hamilton Company). В одного таракана инъецировали около 5 мкл гомогената.

Электронная микроскопия срезов ткани тараканов Для получения ультратонких срезов ткани тараканов фиксировали, заливали в смолу и окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца согласно [Radek and Fabel, 2000].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Чумаченко, Анастасия Геннадьевна

выводы

1) Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) исследована распространенность денсовйруса BgDNV в природе. Показано, что две из трех исследованных популяций тараканов на территории США инфицированы денсовирусом. При исследовании тараканов, отловленных в квартирах жилых домов из разных районов городов: Москва (Россия) и Киев (Украина) - пять и две выборки по 30 особей, соответственно; и ряда лабораторных линий BgDNV обнаружен не был.

2) Определена динамика развития денсовйруса BgDNV в лабораторной линии Р6, хронически инфицированной изучаемым вирусом. Показано, что вирус может находиться в двух формах: «активной» и «неактивной». В первом случае методом окраски бромистым этидием и/или блот-гибридизацией выявляются мультимерные репликативные формы вируса и ДНК вирусных частиц; во втором -присутствие вируса можно выявить только методом ПЦР.

3) Методами электронной микроскопии описаны цитопатологические эффекты, обусловленные вирусной инфекцией. Показано, что у инфицированных вирусом тараканов развитие вируса происходит не во всех тканях: активное формирование вирусных частиц происходит в клетках пищеварительного тракта и жировом теле, при этом вирусных частиц не было выявлено в мышечной ткани и в мозге.

4) Исследована динамика роста денсовйруса BgDNV в пересеваемой культуре клеток рыжего таракана. Показано, что репликация вируса в пересеваемой культуре клеток не является стабильной: после последовательных пассажей количество ДНК вируса относительно клеточной ядерной ДНК резко сокращается.

5) Разработан новый метод поддержания изучаемого денсовируса в лабораторных условиях. Метод основан на микроинъекции раствора, содержащего вирусные частицы, под кутикулу рыжего таракана.

6) Исследована видоспецифичность денсовируса BgDNV. Показано, что близкородственные В. germanica виды тараканов: Suppella longipalpa, Blattella vaga, Leocophaea maderae невосприимчивы к исследованному вирусу.

7) Показано, что инфицирование рыжего таракана BgDNV приводит к активизации (увеличению числа копий) ряда ретроэлементов (ретротранспозонов и/или ретровирусов) клеток хозяина. Клонированы и секвенированы протяженные фрагменты ДНК двух ретроэлементов, активизируемых инфекцией денсовируса BgDNV. Показано, что оба фрагмента имеют открытую рамку считывания, гомологичную обратной транскриптазе ретротранспозонов насекомых; кроме того, один из клонированных фрагментов содержит дополнительную ОРС, гомологичную белку оболочки денсовируса насекомых, не идентичную BgDNV.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чумаченко, Анастасия Геннадьевна, Москва

1. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика, Новосибирск, 2003. с.131-145.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Москва, Мир, 1984.

3. Муха Д.В., Шал К. Денсовирус рыжего таракана Blattella germanica: обнаружение, нуклеотидная последовательность и организация генома // Молекулярная биология, 2003, т. 37 № 4, с. 607-618.

4. Ратнер В.А., Васильева Л.А. Мобильные элементы и их количественные признаки у дрозофилы: факты и гипотезы // Генетика, 1992, т.28, № 11, с. 15-27.

5. Ратнер В.А., Васильева Л.А. Роль мобильных генетических элементов (МГЭ) в микроэволюции // Генетика, 1992, дек 28 (5), с. 5-17.

6. Резник Н.Л., Кидготко О.В., Золотова Л.И., Шуппе Н.Г. гетерологическая индукция ретротранспозиции Ту1: обратная транскриптаза играет ключевую роль в запуске цикла ретротранспозиции // Генетика, 1995, т.31, № 12, с. 1605-1613.

7. Сингер М., Берг П. Гены и геномы, Москва, Мир, 1998 с.227-262.

8. Afanasiev B.N., Galyov Е.Е., Buchatsky L.P., Kozlov Y.V. Nucleotide sequence and genome organizayion of Aedes densonuclear virus // Virology. 1991. V. 185. P.323-336.

9. Afanasiev B.N., Ward T.W., Beaty B. J., Carlson J.O. Transduction of Aedes aegypty mosquites with vector derived from Aedes densovirus // Virology. 1999. V. 257. P. 62-72.

10. Anantham J., Goldberg A. L., Voelmy R. Abnormal proteins serve as eukariotic stress signals and trigger the activation of heat shock genes // Science, 1986. V. 232, №2, p. 41-46.

11. Astell C. R., Mol C. D., Anderson W. F. Structural and functional homology of parvovirus and papovavirus polypeptides//J. Gen. Virol., 1987, 68, p.885-893.

12. AsteII C. R., Smith M., Chow M. В., Ward D. C. Structure of the 3* hairpin termini of four rodent parvovirus genomes: nucleotide sequence homology at the origins of DNA replication // Cell, 1979,179, p. 57-63.

13. Astell C.R. Terminal hairpins of parvovirus genomes and their role in DNA replication. In «Handbook of Parvoviruses», Vol. 1,1990, p. 59-79.

14. Astell C.R., Thomson M., Merchlinsky M., Ward D.C. The complete nucleotide sequence of minute virus of mice, an autonomous parvovirus // Nucleic Acid Res., 1983, 11, p. 999-1018.

15. Bando H., Kusuda J., Gojoborl Т., Maruyama Т., Kawase S. Organization and nucleotide sequence of a Densovirus genome imply a host-dependent evolution of the parvoviruses // Journal of Virology, Feb. 1987, Vol. 61, No 2, p. 553-560.

16. Bensimhon M.J., Gabarro-Arpa J., Ehrlich R., Reiss C. Physical characteristics in eukaryotic promoters // Nucleus Acid Res, 1983,11, p.4521-4540.

17. Bergeron J., Hebert В., Tijssen P. Genome organization of the Kresse strain of porcine parvovirus: identification of the allotropic determinant and comparison with those of NADL-2 and field isolates //J. Virol., 1996, 70, p.2508-2515.

18. Bergoin M., Tijssen P. Molecular biology of Densovirinae. In «Parvoviruses. From molecular biology to pathology and therapeuc uses» (Faisst S. Rommelaere J., Ed). 2000., V. 4. P. 12-32. Contrib Microbiol. Basel, Karger.

19. Bingham P. M. Zachar Z. Retrotransposons and the FB elements from Drosophila melanogaster // Amer. Soc. Microbiol., 1989, p. 458-502.

20. Birnstiel M. L., Busslinger M., Strub K. Transcription termination and 3% processing: the end is in site // Cell, 1985, 41, p. 349-359.

21. Boublik Y., Jousset F.-X. Bergoin M. Complete nucleotide Sequence and genomic organization of the Aedes albopictus parvovirus (>4aPV) Pathogenic for Aedes aegypti larvae // Virology, 200,1994, p.752-763.

22. Burke W. D., Calalang С. C., Eickbush Т. H. The site-specific ribosomal insertion element type II of Bombix mori (R2Bm) contains the coding sequence for a reverse transcriptase-like enzyme // Moll. Cell. Biol., 1987, 7, p. 2221 -2230.

23. Cappello J., Handelsman K., Lobish H. Sequence of Dictyostelium DIRS-1: an apparent retrotransposon with inverted terminal repeats and an internal circle junction sequence // Cell, 1985, 43, p. 105-115.

24. Cech T. R. The generality of self-splicing RNA: relationship to nuclear mRNA splicing // Cell, 1986, 44, p.207-210.

25. Chao Y.-C., Young S.Y., Kim K. S., Scott H. A. A newly isolated densonucleosis virus from Pseudoplusia includens (Lepidoptera: Noctuidae) I I Journal of invertebrate pathology, 1985, 46, p.70-82.

26. Chapman M. S., Rossmann M. G. Structure, sequence, and function correlation among parvoviruses //Virology, 1993,194, p. 491-508.

27. Chen К. C., Shull В. C., Moses E. A., Lederman M., Stout E. R., Bates R. C. Complete nucleotide sequence and genome organization of bovine parvovirus // J. Virol., 1986, 60, p.1085-1097.

28. Chui l.-M., Yaniv A., Dahlberg J. E., Gazit A., Skuntz S. F., Tronick S. R., Aaronson S. A. Nucleotide sequence evidence for relationship of AIDS retrovirus to lentiviruses // Nature, 1985, 317, p. 366-368.

29. Clare J., Farabaugh. Nucleotide sequence of a yeast Ту element: evidence for a novel mechanism of gene expression // Proc. Nathl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, p. 2829-2833.

30. Cotmore S. F., D'Abramo Jr., Carbonell A.M., Bretton L. F., Tattersall P. The NS2 polypeptide of parvo virus MVM is required for capsid assembly in murine cells // Virology, 1997, 231, p.267-280.

31. Cotmore S. F., Sturzenbecker L. J., P. The autonomous parvovirus MVM encodes two nonstructural proteins in addition to its capsid polypeptides // Virology, 1983,129, p. 333-343.

32. Cotmore S. F., Tattersall P. The autonomous replicating parvoviruses // Adv. Virus Res., 1987, 33, p.91 -174.

33. Cotmore S. F., Tattersall P. The NS-1 polypeptide of minute virus of mice is covalently attached to the 5' termini of duplex replicative-form DNA and progeny signal strands // J. Virol, 1988, 62, p.851 -860.

34. Dumas В., Jourdan M., Pascaud A.-M., Bergoin M. Complete nucleotide sequence of cloned infection genome of Junonia coenia densovirus reveals an organization unique among parvoviruses//Virology., 1992. V.191. P. 202-222.

35. El-Far M., Li Y., Fediere G., Abol-Ela S., Tijssen P. Lack of infection of vertebrate cells by the densovirus from tha maize worm Mythimna loreyi, (M/DNV) // Virus Research, 2004,99 p. 17-24.

36. Fawcett D. H., Lister С. K., Keller E., Finnegan. Transposable elements controlling l-R hybrid dysgenesis in D. melanogaster are similar to mammalian LINES//Cell, 1986, 47, p. 1007-1015.

37. Federiere G., Montsarrat P., Mariau D., Bergoin M. A densovirus of Caspalia extanea (Lepidoptera, Limacodidae): Characterization and use for biological control. «Fundamental and Applied Aspects of Invertebrate Pathology» 1986, p.705.

38. Fediere G., El-Far M., Li Y., Bergoin M., Tijssen P. Expression strategy of densonucleosis virus from Mythimna loreyi// Virology, 2004, 320, p. 181 -189.

39. Fediere G., El-Sheikh M. A., Abol-Ela S., Salah M., Mastri M., Veyrunes J.-C. Isolation of a new Densonucleosis Virus from Mythimna loreyi Dup. (Lepidoptera: Noctuidae) in Egypt. Bull. Fac. Agric., Univ. Cairo, 1995, 46, p. 693-702.

40. Fediere G., Zadori Z., Szelei J., Tijssen P. Genome organization of Caspalia extanea Densovirus, a new Iterovirus // Virology, 2002, 292, p.299-308.

41. Fediere, G. Epidemiology and pathology of Densovirinae. In «Parvoviruses. From molecular biology to pathology and therapeutic uses» (Faisst S.Rommelaere J., Ed). 2000. V.4.P.1-11. Contrib. Microbiol. Basel, Karger.

42. Fediere G. Recherches sur der viruses de Lepidopteeres ravageus de cultures perennes en Cote d'lvoire et de cultures annuelles en Egypte // Doctorat d'Etat. Univ. Montpellier, 1996, 2, p.141.

43. Finnegan D. J. Transposable elements and DNA transposition in eukaryotes // Curr. Opin. Cell Biol. 1990, V.2, p. 471-477.

44. Gardiner E. M., P., Evidence that developmental^ regulated control of gene expression by a parvoviral allotroplc determinant is particle mediated // J. Virol., 1990, 71, p. 2463-2466.

45. Harada K., Yukushiro K., Mukai T. Transposition rates of mobile genetic elements in Drosophila melanogaster // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1990, V. 87, № 8, p. 3248-3252.

46. Hattori M., Kuhara S., Takenaka O., Sakaki Y. L1 family of repetitive sequences in primates may be derived from a sequence encoding a reverse transcriptase-related protein // Nature, 1986, 326, p. 662-669.

47. Hermonat P.L., Labow M. A. Wright R., Berns К. I., Muzyczka N. Genetics of adeno-associated virus: isolation and preliminary characterization of adeno-associated virus type 2 mutants // J. Virol., 1984, 51, p.329-339.

48. Jourdan M., Jousset F.X., Gervais M., Skory S., Bergoin M., Dumas B. Clonning of the genome of a densovirus and rescue of infectious virions from recombinant plasmid in the insect host Spodoptera littoralis // Virology, 1990,179, p.403-409.

49. Jousset F.-X., Baquerizo E., Bergoin M. A new densovirus isolated from the mosquito Culex pipiens (Diptera: Culicidae) //.Virus Research, 2002, 67, p.11-16.

50. Jousset F.X., Barreau C., Boublik Y., Cornet M. A. Parvo-like persistently infecting a C6/36 clone of Aedes albopictus mosquito cell line and pathogenic for Aedes aegypti larvae // Virus Res., 29,1993, p.99-114.

51. Kozak M. Adherence to the first-AUG rule when a second AUG codon follows closely upon the first // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1995, 92, p.2662-2666.

52. Kozak M. Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes // Cell, 1986, 44, p. 283-292.

53. Kurtti T.J., Brooks M. A. Preparation of Mycetocytes for culter in Vitro // Journal of invertebrate pathology, 1976, 27, p.209-214 (1).

54. Kurtti T.J., Brooks M. A. The dissociation of insect embryous for cell culture // In Vitro, 1976, V. 12, №2 (2).

55. Lampson B.C., Sun J., Hsu M.Y., Vallejo-Ramirez J., Inouye S., Inouye M. Reverse transcriptase in a clinical strain of Escherichia coli: production of branched RNA-linked msDNA // Science, 1989, Feb 24; 243, p. 1033-1038.

56. Li X., Rhode S. L. Mutation of lysine 405 to serine in the Parvovirus H1 NS1 abolishes its functions for viral DNA replication. Late promotor trans activation and cytotoxicity // J. Virol., 1990, 64, p. 4654-4660.

57. Li Y., Bergoin M. In vivo and in vitro transcription and translation of structural and nonstructural genes of Junonia coenia densovirus. 4th Parvovirus Workshop, Lo-Skoden, Elsinore, 1991, August.

58. Li Y., Zadori Z., Bando H., Dubuc R., Fediere G., Szelei J., Tijssen P. Genome organization of densovirus from Bombix mori (BmDNV-1) and enzyme activity of its capsid // J. Gen. Virol., 2001, 82, p. 2821 -2825.

59. Lim D., Mass W. K. Reverse transcriptase-dependent synthesis of a covalently linked, branched DNA-RNA compound in E. colillCell. 1989 Mar 10; 56(5), p. 891-904.

60. Lindquist S., Graif E.A. The heat-shock protein // Ann. Rev. Genet. 1998. V. 22. p. 631-677.

61. Loeb D. D. Padgett R. W., Hardies S. C., Shehee W. R„ Comer M. В., Edgell M. H., Hutchison. The sequence of a large L1 Md element reveals tandemly repeated 54end and several features found in retrotransposons // Mol. Cell. Biol., 1986, 6, p. 168-182.

62. Lusby E., Fife К. H, Berns K.I. Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA // J. Virol., 34,1980, p.402-409.

63. Matsuura E. T. Domenico J. M., Cummings D. J. An additional class II intron with homology to reverse transcriptase in rapidly senescing Podospora anserine // Curr. Genet., 1986,10, p. 1129-1134.

64. McDonald J.F. The potentiona! evolutionary significance of retroviral-like transposable elements in peripheral population. Evolutionary Biology of Transient Unstable Population, 1989, p.190-205.

65. Michel F., Lang F. Mitochondrial class II introns encode proteins related to the reverse transcriptase of retroviruses // Nature, 1985, 316, p. 641-643.

66. Miller R. H. Robinson W. S. Common evolutionary origin of hepatitis В virus and retroviruses // Proc. Natl. Acad. Sci., 1986, 83, p. 2531 -2535.

67. Naeger L.K., Cather J., Pinthel D.J. The small nonstructal protein (NS2) of the parvo virus minute virus of mice is required for efficient replication and infectious virus production in a cell-type specific manner//J. Virol., 1990, 64, p. 6166-6175.

68. Nakagaki M., Kawase S. Capsid structure of the densonucleosis virus of the silkworm, Bombix mori// J. seric., Sci. Jpn., 1982, 51, p.420-424.

69. Nakagaki M., Kawase S. DNA of e new parvolike virus isolated from the silkworm, Bombix moriI/ J.Invertebr. Pathol., 1980, 35, p. 124-133 (1).

70. Nakagaki M., Kawase S. Structural proteins of densonucleosis virus isolated from the silkworm, Bombix mori, infected with the flacherie virus // J. Invertebr. Pathol., 1980,36, p. 166-171 (2).

71. Nargang F. E., Bell J. В., Stohl L. L., Lambowitz A. M. The DNA sequence and genetic organization of Neurospora mitochondrial plasmid suggest a relationship to introns and mobile elements // Cell, 1984, 38, p. 441 -453.

72. Neidhart F.C., Van Bogellen R.A., Vaughn V. The genetic and regulation of heat-shock protein //Ann. Rev. Genet. 1984, V.18 p. 295-329.

73. Nover L., Hellund D., Neumann D. The heat shock response of eukariotic cell // Biol. Zbl., 1984, B103, № 4, p.357-438.

74. Pfeiffer P., Hohn T. Involvement of reverse transcription in the replicatin of cauliflower mosaic virus: a detailed model and test of some aspects // Cell, 1983, 33, p. 781-789.

75. Radek, Fabel. A new entomopoxvirus from a cockroach: light and electron microscopy // J. Invertebrate Pathology. 2000, V. 75, p. 19-27.

76. Ratner V. A., Vasilyeva L. A. The role of mobile genetic elements (MGEs) for variability, selection and evolution. Transposable elements and evolution // Ed. J. McDonald. Genetica, Spesial Issue, 1992.

77. Reanney D.C. Genetic error and genome design // Trends in Genet., 1986, V. 2, №2, p. 41-46.

78. Saigo KM Kugimiya W., Matsuo Y., Inouye S., Yoshioka K., Yuki S. Identification of the coding sequence for reverse transcriptase-like enzyme in a transposable genetic elements in Drosophila melanogaster // Nature, 1984, 312, p.677-681.

79. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: Laboratory Manual. N. Y., 1989, V. 1-3, p. 1626.

80. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977, V.74, p. 5463-5467.

81. Shade R. O., Blundell M. C., Cotmore S. F., Tattersall P., Astell C. R. Nucleotide sequence and genome organization of human parvovirus B19 isolated from the serum of child during aplastic crisis // J. Virol., 1986, 58, p. 921-936.

82. Shaw M. W., Choppin P. W., Lamb R. A. A previously unrecognized influenza В virus glycoprotein from a bicistronic mRNA that also encodes the viral neuraminidase// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1983, 80, p. 4879-4883.

83. Shike H., Dhar A.K., Burns J.C., Shimizu C., Jousset F.-X., Klimpel K.R., Bergoin M. Infectious hypodermal and hematopoetic necrosis virus of shrimp is related to mosquito Brevidensoviruses//Virology, 2000, 277, p.167-177.

84. Simpson A., Chipman P. R., Baker T. S., Tijssen P., Rossmann M. G. The structure of an insect parvovirus (Galleria mellonella densovirus) at 3,7 A resolution I I Structure, 15, Nov. 1998, p.1355-1367.

85. Summers J., Mason W. S. Replication of the genome of a hepatitis B-like virus by reverse transcription of an RNA intermediate // Cell, 1982, 29, p.403-415.

86. TanadaY., Kaya H. K. Insect pathology. 1993. Academic Press, Inc.

87. P., Cotmore S. FM Reproduction of autonomous parvovirus DNA. In «Handbook of Parvovirus», 1990, Vol. 1, p. 123-140, CRC Press, Boca Raton, FL.

88. Temin H. M. Function of the retroviral long terminal repeat. Cell, 1982, 28, p.3-5.

89. Temin H. M. Origin of retroviruses from cellular moveable genetic elements // Cell, 1980, 21, p.599-600.

90. Temin H. M. Origin of retroviruses from cellular moveable genetic elements // Cell, 1980, 21, p. 599-600.

91. Thao M. L., Wineriter S., Buckingham G., Bauman P. Genetic Characterization of a Putative densovirus from the mealybug Planococcus citri // Current Microbiology, 2001, Vol. 43 p. 457-458

92. Tijssen P., Bergoin M. Densonucleosis viruses constitute an increasingly diversified subfamily among the parvoviruses//Virology, 1995, 6, p.347-355.

93. Tijssen P., Li Y., El-Far M., Szelei J., Letarte M., Zadori Z. Organization and expression strategy of the ambisense genome of densonucleosis virus of Galleria mellonella // J. Virol., 2003, October 77 (19).

94. Toh H., Hayashida H., Miyata T. Sequence homology between retroviral transcriptase and putative polymerases of hepatitis В virus and cauliflower mosaic virus // Nature, 1983, 305, p. 827-829.

95. Vago C., Duthoit J.L. Delahaye F. Les lessions nucleares de la «Virose a noyaaux denses» du Lepidoptere Galleria mellonella // Arch.Ges. Virusforsch. 1966. V. 18. P. 344-349.

96. Van Bogelen R. A;, Neidhardt F. C. Ribosomes as sensors of heat and cold shock in Escherichia col. I I Prog. Nat. Acad. Sci. USA, 1990, V.87, № 15, p.5589-5593.

97. Varmus H. E. Retroviruses. Mobile elements (ed. Shapiro), 1983, New York, p. 411-503.

98. Watanable H., Maeda S., Multiplication of densonucleosis virus in the silkworm Bombix mori L., reared high temperature // Jpn.J. Appl. Entomol. Zool., 1979, 23, p.151-155.

99. Weiner A. M., Deininger P. L, Efstratiadis A. Annu Rev. Biochem, 1986, 55, p.631-661.

100. Xiong Y., Eickbush T. Similarity of reverse transcriptase-like sequences of viruses, transposable elements, and mitochondrial introns // Mol. Biol. Evol., 1988, 5(6), p. 675-690.

101. Xiong Y., Eickbush Т. H. The site-specific ribosomal DNA insertion element R1 Bm belongs to a class of non-long-terminal repeat retrotransposons //Mol. Cell. Biol., 1988, 8, p. 114-123.

102. Xiong Yue, Eickbush T. Origin and evolution of retroeltments based upon their reverse transcriptase sequences // EMBO Journal, 1990, 9 (10), p. 33533362.

103. Yamagishi J., Hu Y., Zheng J., Bando H. Genomic organization and mRNA structure of Periplaneta fuliginosa densovirus imply alternative splicing involvement in viral gene expression // Arch. Virol., 1999,144: 2111-2124.

104. Yokoyama S., Chung L., Gojobori T. Molecular evolution of the human immunodeficiency and related viruses // Mol. Biol. Evol., 1988, 5, p.237-251.

105. Zadori Z., Szelei, J., Lacoste, M.-C., Li Y., Gariepy S., Raimond, P., Allaire M., Nabi I., Tijssen P. A viral fospolipase A2 is required for parvovirus infectivity // Dev. Cell, 2001,1, p. 291-302.