Изучение стратегии экспрессии денсовируса рыжего таракана Blattella germanica

Мартынова, Елена Уразовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение стратегии экспрессии денсовируса рыжего таракана Blattella germanica
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение стратегии экспрессии денсовируса рыжего таракана Blattella germanica"

eäa^-

На правах

Мартынова Елена Уразовна

ИЗУЧЕНИЕ СТРАТЕГИИ ЭКСПРЕССИИ ДЕНСОВИРУСА РЫЖЕГО ТАРАКАНА BLATTELLA GERMANICA

Специальность 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 6 ОКТ 2011

Москва 2011

4855549

Работа выполнена в лаборатории генетических основ биоразнообразия Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Муха Дмитрий Владимирович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Засухина Галина Дмитриевна, Учреждения Российской академии наук Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН

кандидат биологических наук Генинг Леонид Владимирович

Учреждения Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биологии гена РАН

Защита состоится 20 октября 2011 года в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 002.214.01 при Учреждении Российской академии наук

Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН по адресу: 119991, г. Москва,

ГСП-1, ул. Губкина, д. 3.

Тел.: (499) 135-62-13, Факс: (499) 132-89-62

E-mail: iogen(<7;vigg.ru, aspirantLirafffivigg.ru:

Адрес в Интернете: www.vigg.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан_сентября 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.А. Синелыцикова

Общая характеристика работы

Актуальность работы

Несмотря на то, что впервые симптомы заболевания, вызываемого денсовирусом, и сам патоген были описаны еще в 60-х гг. прошлого века (Meynadier et al., 1964; Amargier et al., 1965; Vago et al., 1966), эта группа вирусов до настоящего времени остается сравнительно малоизученной. К настоящему времени известно уже около 30 различных денсовирусов (Yang et al., 2008), однако их исследования носят в основном описательный (описание симптомов вызываемого заболевания, определение нуклеотидной последовательности и биоинформатический анализ генома) или узкоспециализированный характер. При этом практически не изученными до последнего времени оставались такие важные аспекты жизненного цикла вирусов как механизмы проникновения и выхода из клетки-хозяина, механизмы реализации генетической информации вируса (стратегии экспрессии генома) и ее регуляция, роль вирусных белков и систем клетки-хозяина в жизненном цикле вируса, в конечном итоге определяющие характер патогенеза. Необходимо отметить также, что отсутствие достаточного уровня знаний о биологии денсовирусов, а также значительное разнообразие и разнородность данной группы вирусов затрудняют создание системы классификации подсемейства Densovirinae и приводят к постоянному пересмотру уже существующих.

Aedes и Anopheles (Afanasiev et al., 1991; Boublik et al., 1994; Ren et al., 2008), имеющих важное медицинское значение как переносчики различных тяжелых заболеваний человека, таких как малярия, желтая лихорадка, лихорадка Деньге. В природных популяциях денсовирусы играют значительную роль в поддержании и регуляции численности этих насекомых. Это обстоятельство, а также ряд особенностей самих денсовирусов дает возможность широко использовать эту группу вирусов в качестве новаторских биопестицидов направленного действия (Carlson et al., 2006; Fediere, 2000).

Необходимо отметить и другие направления практического использования денсовирусов, а именно, создание на их основе векторов для эффективной трансформации и генетических манипуляций с насекомыми, а также экспрессионных систем, подобных бакуловирусным, для продукции чужеродных белков в клетках насекомых (Afanasiev & Carlson, 2000). Помимо этого простота и регулярность организации капсидов денсовирусов, их небольшие размеры и неспособность инфицировать клетки млекопитающих делает данную группу вирусов перспективной для разработки на их основе биологических носителей для направленной доставки лекарственных средств или генетического материала в целевые клетки.

Денсовирус рыжего таракана Blattella germanica (BgDNV) является одним из представителей подсемейства Densovirinae. BgDNV был впервые обнаружен в 2000 г. Д. В. Муха и К. Шалом. В ходе последующей работы была определена нуклеотидная последовательность его генома, проведен ее биоинформатический анализ и предсказаны предполагаемые открытые рамки считывания и регуляторные элементы. Кроме того, методом электронной микроскопии были описаны цитопатологические эффекты и тканеспецифичность вирусной инфекции (Муха, Шал, 2003; Mukha et al., 2006). Особенности же стратегии экспрессии генома денсовируса рыжего таракана, являющейся одним из ключевых этапов в жизненном цикле вируса, до настоящего исследования оставались неизвестными.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение стратегии экспрессии генома денсовируса рыжего таракана Blattella germanica (BgDNV).

В связи с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Изучение динамики развития вирусной инфекции BgDNV в культуре клеток рыжего таракана BGE-2.

2. Изучение характера экспрессии генома BgDNV на уровне транскрипции: определение количества транскриптов, характеристика альтернативных форм сплайсинга, определение сайтов начала и окончания транскрипции.

3. Изучение характера экспрессии генома BgDNV на уровне белковых продуктов.

4. Определение внутриклеточной локализации белковых продуктов денсовируса рыжего таракана Blattella germanica.

Научная новизна результатов исследования

В настоящей работе впервые для денсовирусов продемонстрирован характер временной динамики транскрипции и репликации вирусного генома и показано стабильное поддержание BgDNV в культуре клеток рыжего таракана BGE-2.

Впервые описана стратегия экспрессии генома BgDNV на уровне транскрипции. Получены данные о точках начала и окончания транскрипции, выявлены и охарактеризованы мРНК как для капсидных, так и для регуляторных белков и показано участие альтернативного сплайсинга в образовании транскриптов для обеих групп белков.

Впервые для денсовирусов охарактеризована дополнительная группа транскриптов для неструктурных белков, транскрибирующихся с того же промотора, что и основная группа, но заканчивающихся в области расположения открытых рамок считывания для капсидных белков. Описано несколько вариантов транскриптов, имеющих большую (около 1600 нт.) область перекрывания с транскриптами для капсидных белков. Обнаружение данной группы вирусных мРНК позволяет предполагать возможность участия механизмов РНК-интерференции в антивирусной защите клетки насекомого-хозяина.

Получен высокоочищенный препарат вирусных частиц BgDNV и определен белковый состав капсида данного вируса. Показано, что экспрессия белков капсида имеет ряд уникальных особенностей, не описанных до сих пор ни для одного из денсовирусов.

Впервые для денсовирусов показано наличие постгрансляционной модификации капсидных белков убиквитином.

Методом белкового иммуноблоттинга выявлены три неструктурных белка денсовируса рыжего таракана. Показано соответствие описанных белков открытым рамкам считывания, выявляемым методами in silico.

В данной работе была впервые определена внутриклеточная локализация как структурных, так и регуляторных белков денсовируса рыжего таракана в инфицированной пересеваемой культуре клеток.

Полученные в процессе работы результаты демонстрируют наличие уникальных особенностей, характеризующих денсовирус рыжего таракана, и позволяют предположить, что BgDNV может принадлежать к отдельному роду внутри своего подсемейства.

Научно-практическая значимость работы

Данные, полученные в рамках настоящей работы, расширяют представления о стратегиях реализации генетической информации вирусов подсемейства Densovirinae и о биологии денсовирусов в целом. Полученные результаты могут быть использованы при чтении

лекций по вирусологии и молекулярной биологии в высших учебных заведениях биологического, медицинского и сельскохозяйственного профиля. Кроме того, полученные результаты могут являться основой для последующей разработки биологических способов борьбы с рыжим тараканом на основе BgDNV, а также создания на его базе инструментов для изучения методами генетической инженерии молекулярно-генетических процессов в клетках рыжего таракана. Экспериментальные данные, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, о белковом составе капсида и природе структурных белков BgDNV являются важными для создания системы in vitro сборки вирусных частиц, что, в свою очередь, служит важным шагом для разработки на основе денсовируса рыжего таракана молекулярных носителей, пригодных для использования в биомедицинской практике.

Апробация работы

Основные положения и результаты работы были представлены на следующих российских и международных конференциях: на 4 съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008г); на XX Международном генетическом конгрессе (Берлин, 2008г); на I Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии» (Донецк, 2009 г); на I Всероссийской Научной Конференции, посвященной 125-летию биологических исследований в Томском Государственном Университете «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 20 Юг); на IV Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» (Москва-Звенигород, 20 Юг).

Декларация личного участия автора Суммарное личное участие автора составило 85%. Исследование стратегии экспрессии вирусного генома на уровне РНК было выполнено совместно с к.б.н. Т.В. Капелинской, изучение внутриклеточной локализации белков - совместно с д.б.н. Д.В. Муха. Определение нуклеотидных последовательностей плазмид осуществлялось A.JI. Королевым.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, включенных в перечень научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 189 страницах и состоит из следующих разделов: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы, содержащий 323 источника. Диссертация содержит 60 рисунков и включает 5 приложений.

Содержание работы Материалы и методы

Результаты, представленные в работе, получены с использованием линии эмбриональных клеток рыжего таракана BGE-2 (любезно предоставлена доктором Т. Курти, Университет штата Миннесота, США). Клетки заражали денсовирусом путем добавления суспензии, содержащей вирусные частицы, в культуральную среду. Пересевы клеток проводились с интервалами от 10 дней до двух недель в зависимости от времени достижения необходимой концентрации (сплошного газона).

Для получения препаратов вирусных частиц были использованы лабораторные линии тараканов, исходно не зараженные денсовирусом: Normal и White. Тараканов заражали либо перорально, добавлением вируссодержащей суспензии в воду для питья, либо инъецируя ее под кутикулу.

Тотальную ДНК из зараженных клеток и тараканов выделяли фенольным методом (Маниатис и др., 1984), наличие вирусной инфекции детектировали по присутствию в препарате дополнительной полосы вирусной геномной ДНК размером около 5 т.п.о., формирующейся в результате отжига инкапсидированных «+» и «-» цепей вирусного генома в условиях повышенной концентрации солей.

Выделение тотальной РНК, РНК-элекгрофорез, Northern-блоттинг, получение радиоактивно-меченных зондов, RT-PCR, RACE проводили по стандартным методикам или с использованием коммерческих наборов, согласно рекомендациям фирм-изготовителей. Для Northern-блоттинга было использовано 7 ДНК-зондов к различным участкам генома BgDNV, а также РНК-зонд, расположение которых относительно открытых рамок считывания BgDNV приведено на рис. 1. Использованные в работе праймеры для RT-PCR и RACE также представлены на рис. 1. После ПЦР-амплификаций необходимые полосы вырезали из геля, клонировали в вектор pGEM-T/T-Easy (Promega), вставки секвенировали и сравнивали полученные последовательности с базами данных с использованием программы BLAST.

Очистку вирусных частиц из зараженных тараканов проводили методом центрифугирования в градиенте плотности сахарозы или CsCl. Наличие вирусных частиц в отобранных фракциях проверяли путем выделения вирусной ДНК и SDS-ПААГ электрофореза. SDS-ПААГ электрофорез проводили согласно методу Лэммли (Laemmli, 1970), гели окрашивали Coomassie R250. Western-блоттинг для детекции капсидных и регуляторных белков и убиквитинирования белка VP2 проводили по стандартной методике, белки предварительно переносили на PVDF-мембраны методом полусухого электроблотгинга. В работе были использованы поликлональные кроличьи антитела (заказаны в фирме Genemed Synthesis, San Antonio, USA) к эпитопам, соответствующим ORF3 (0.22 мг/мл, 1:500), ORF4

(0.33 мг/мл, 1:1000) и ORF5 (0.5 мг/мл, 1:1500) (регуляторные белки), а также ORF2 (VP Kl, 0.34 мг/мл, 1:500) и С-концевому участку ORF1, являющемуся общим для всех капсидных белков (VP К2, 0.5 мг/мл, 1:10000) и мышиные антитела к убиквитину (P4G7, фирма Covance, New Jersey, USA, 1:850). Эпитопы были подобраны методом in silico с использованием программного обеспечения на сайте (http^/tools.imimweepitope.org/tools/bcell/iedb input).

Масс-спектрометрический анализ проводили в НИИФХМ РАМН (фирма «Пинни»), Идентификацию белков BgDNV проводили по методу пептидного фингерпринтинга при помощи программы Mascot Search (www.matrixscience.com') в белковых базах данных NCBI. Значимыми считали совпадения, со значением р<0,05 (score > 83).

Внутриклеточную локализацию белков VP1 и NS1 проводили методом иммуно-флуоресцентного анализа с использованием указанных выше антител (VP Kl, 1:1000 и к ORF3, 1:500) и вторичных антител, конъюгированных с FITC (1:200) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Baltimore, USA) по стандартной методике. Ядра окрашивали DAPI. Визуализацию проводили с использованием конфокального микроскопа LSM 510Meta (Carl Zeiss).

Номер последовательности нуклеотидов BgDNV в GenBank AY189948.

NS VP

ORF2

ЗОВД2

Зонд 1 ~Зонд 3 '

ЮШа

PTRACt RACE ORF J 5 RACE OV.il J splORF1_2 P1 RACE

IORF6 i\ew RACEl

P2st P3st OBFCDA1 ORFGeiKl 1US_3F St>lice2 P1st

*. • » 4- 4- + *

ORF4«iKl ORF3 end ORFIemt

Рисунок 1. Схема расположения зондов для Northern-блот гибридизации и праймеров для RT-PCR и RACE, использованных в работе. VP - капсидные белки, NS - регуляторные белки. ORF 15 — соответствующие открытые рамки считывания. ITR — концевые инвертированные повторы. Зонды для Northern-блот гибридизации обозначены пунктиром, одноцепочечный РНК-зонд обозначен пунктиром с точками. Праймеры, использовавшиеся только для RACE, обозначены длинными стрелками, праймеры для RT-PCR — короткими стрелками (праймеры splice2, ORF6 end, ORFöpAl также использовались для RACE).

Результаты и обсуждение

Динамика развития вирусной инфекции BgDNV в культуре клеток BGE-2

Для исследования динамики развития вирусной инфекции часть суспензии с растущими клетками BGE-2 отбирали через 3 ч, 1 сутки, 5 суток и 7 суток (нулевой пассаж, V0) после заражения и далее при каждом пересеве и из зараженных клеток выделяли тотальную ДНК.

Всего с момента заражения было осуществлено 25 пересевов (пассажи УО - У24). Данные для пассажей У1-У13, У16, У22 и У24 представлены на рис. 2.

I Зч 1сут5сут VI У2 УЗ У-4 У5 У6 V? У8 У10У11У13 У16 У22 У24 К

ItHHIOl

К1Ю01

мню!

ЯИЮ|

— *~> ti mg Ы ыЫЫЫмЫМУйЫи

t : fe*«

Рисунок 2. Электрофореграмма тотальной ДНК из культуры клеток BGE-2, инфицированной BgDNV. Дорожка 1 - молекулярный маркер, здесь и далее размеры даны в п.о. Над дорожками сверху указано время после заражения денсовирусом (V1-V24 - соответствующие пассажи). К - клетки BGE-2, не инфицированные денсовирусом. Звездочкой обозначена полоса размером около 5 т.п.н., соответствующая геномной ДНК BgDNV. Двумя звездочками - репликативная димерная форма вируса.

На рис. 2 можно видеть, что вирусная ДНК в виде дополнительной полосы размером приблизительно 5 т.п.н. четко выявляется на уровне первого пассажа (VI, 25 суток после заражения). В течение последующих 13 пассажей наблюдается стабильная репликация вирусного генома без значительного изменения количества вирусной ДНК относительно геномной. Вирусная ДНК в препаратах геномной ДНК клеток сохранялась вплоть до 24 пассажа после заражения (V24, 535 дней).

Полученные результаты говорят о том, что пересеваемая культура клеток BGE-2 может быть использована для подержания денсовируса BgDNV в лабораторных условиях.

Для изучения временного характера транскрипции генома BgDNV тотальную РНК выделяли из клеток BGE-2 отобранных на уровне 3 ч, 1 суток, 5 суток, 7 суток, 25 суток и далее до десятого пассажа (VIO) включительно после инфицирования. Для выявления транскриптов, относящихся к структурным белкам, использовали зонд ко всей правой части генома (зонд 2); для выявления транскриптов, относящихся к неструктурным белкам, использовали зонд ко всей левой части генома (зонд 7) (рис. 1).

На основе результатов Northern-блот гибридизации нами была определена временная динамика транскрипции вирусных мРНК. На рис. За можно видеть, что экспрессия генов неструктурных белков начинается уже через 3 часа после заражения с постепенным небольшим увеличением количества мРНК к 25 суткам и остается стабильной вплоть до конца наблюдений (VIO). Гены вирусных капсидных белков (рис. 36), начинают экспрессироваться с запозданием: соответствующая мРНК появляется, начиная с 5 суток после заражения. Их экспрессия заметно возрастает к 25 суткам и остается стабильной вплоть до 10 пассажа. Отметим, что экспрессия

генов белков капсида начинается несколько раньше, чем интенсивное образование и накопление ДНК вируса (рис. 2), и в дальнейшем образование транскриптов генов вирусных капсидных белков идет параллельно с накоплением вирусной ДНК до 10 пассажа.

Рисунок 3 Northern-блот гибридизация РНК, выделенной из клеток BGE-2 через 3 ч (дорожка 1), 1 сут (дорожка 2), 5 сут (дорожка 3), 7 сут (дорожка 4) и 25 сут, первый пассаж, (дорожка 5) после заражения, а) гибридизация с зондом к ORF неструктурных белков и б) гибридизация с зондом к ORF белков капсида. Для каждой дорожки на а) и б) внизу приведены сравнительные количества рРНК. Размеры детектированных фрагментов даны в нуклеотидах.

Полученные нами данные согласуются с теми функциями, которые предложены для белков, кодируемых соответствующими мРНК, в жизненном цикле парвовирусов (Berns, 1990; Bergoin & Tijssen, 2000). Неструктурные белки необходимы на самых ранних стадиях инфекции до начала репликации вирусного генома (Abd-Alla et all, 2004). В частности, белок NS1 является инициаторным белком репликации (Cotmore & Tattersall, 1996) и способен трансактивировать как свой собственный промотор, так и промотор для структурных белков (Afanasiev et al., 1994; Doerig et al., 1988, 1990; Giraud et al., 1992; Lorson et al., 1996; Rhode, 1985). Можно предположить, что синтез и накопление NS1 способствует репликации ДНК BgDNV, приводит к активизации транскрипции мРНК для белков капсида и синтезу соответствующих белковых продуктов и сборке капсидов, что в свою очередь ведет к формированию зрелых дочерних вирусных частиц и накоплению значительного количества вирусной ДНК (рис. 2).

Таким образом, как можно заключить из представленных выше данных, в случае BgDNV имеется разделение появления двух групп транскриптов во времени. Можно выделить ранние (неструктурные) и поздние (капсидные) мРНК, как и соответственно ранний и поздний промоторы, с которых они транскрибируются.

Определение профиля транскрипции генов капсидных и регуляторных белков BgDNV

Для детального изучения мРНК, образующихся в ходе инфекции BgDNV, были использованы пробы к участкам вирусного генома, кодирующим капсидные белки: зонд 1 (4244-4989 нт.), зонд к 5'-концевому участку ORF2, (зонд 3, 4642-5096 нт.) и зонд к 3'-концевому участку вирусного генома (зонд 4, 2564-3466 нт.). В случае регуляторных белков использовались зонд к ORF3 (зонд 5, 958-2505 нт.) и зонд к ORF5 (зонд 6, 346-901 нт.) (рис. 1).

а)

1 г з j s

12 1 2 3

Рисунок 4. NortUern-блот гибридизация тотальной РНК, выделенной из клеток BGE-2,

инфицированных BgDNV. Гибридизация проводилась с зондами а) к ORF, кодирующим неструктурные белки: дорожка 1 - зонд 5; дорожка 2 - зонд 6; б) к ORF, кодирующим белки капсида: дорожка 1 - зонд 1; дорожка 2 - зонд 3; дорожка 3 - зонд 4 Стрелками обозначены идентифицированные транскрипты с указанием их приблизительных размеров в нуклеотидах.

Как можно видеть на рис. 4а, дорожка 1, РНК, соответствующая неструктурным белкам, транскрибируется в виде двух основных мРНК, размером около 2300 нт. и 1800 нт. и дополнительных минорных мРНК размером около 5000 нт., 4000 нт. и 900 нт., причем количественно наиболее представлен транскрипт размером 1800 нт. Гибридизация с зондом к ORF5 (рис. 4а, дорожка 2) выявила присутствие дополнительного транскрипта размером 5000 нт. и основного транскрипта размером 2300 нт. В случае мРНК, соответствующей капсидным вирусным белкам (рис. 46, дорожка 1), гибридизуются два мажорных транскрипта размером приблизительно 2400 нт. и 2600 нт. Кроме того, дополнительно было выявлено семь минорных транскриптов размером около 5000 нт., 4000 нт. (аналогично ситуации в случае с NS транскриптами), 2000 нт., 1200 нт., 900 нт., 750 нт., 600 нт. и 300 нт., а также восьмой транскрипт размером около 1700 нт., выявляемый при более длительных сроках экспозиции. Гибридизация с зондом, соответствующим 5'-концевому участку ORF2 выявила присутствие всех описанных выше транскриптов, за исключением двух высокомолекулярных минорных транскриптов с размерами 5000 нт. и 4000 нт. (рис. 46, дорожка 2). В то же время гибридизация с зондом к З'-концевому участку вирусного генома (рис. 46, дорожка 3) кроме двух основных транскриптов (2400 нт и 2600 нт.) выявила только один дополнительный транскрипт размером 2000 нт. Необходимо отметить, что выявленный транскрипционный паттерн является уникальным для денсовирусов: наличие дополнительных высокомолекулярных минорных транскриптов было описано в литературе только для GmDNV и Ps/DNV, но их природа не была изучена (Dhar et al., 2010; Gross et al., 1990; Gross and Tal., 2000); низкомолекулярные

минорные транскрипты не были выявлены ни у одного из описанных к настоящему времени денсовирусов.

Построение трапскрипциониой карты BgDNV

Ранее методами биоинформатики для BgDNV было предсказано наличие одного промотора Р1 (транскрипция начинается с 5096 нт.) и двух сигналов полиаденилирования для вирусных капсидных белков, и двух промоторов Р2 (начало транскрипции — 240 нт.) и РЗ (начало транскрипции - 823 нт.) и одного сигнала полиаденилирования для неструктурных белков (Mukha et al., 2006, в настоящей работе номера нуклеотидов даны для последовательности обратно-комплементарной последовательности, представленной в указанной статье). Исходя из этих данных, можно было предполагать, что большое число транскриптов, выявляемых Northern-блот гибридизацией, связано с тем, что в экспрессии вирусного генома задействованы механизмы альтернативного сплайсинга. Для определения структуры транскриптов BgDNV был применен метод RT-PCR с использованием пар праймеров, соответствующих различным участкам вирусного генома (рис. 1).

При амплификации с парой праймеров P2st/ORF3 end (рис. 1), соответствующими началу и концу участка, кодирующего регуляторные белки, были получены три фрагмента, соответствующие кДНК BgDNV (обозначены стрелками на рис. 5, дорожки 1, 2), а также ряд неспецифических полос. Амплификация с парой праймеров P2st/ORF4 end (праймер ORF4end расположен в конце ORF4, рис. 1) привела к появлению двух специфических фрагментов (обозначены стрелками на рис. 5, дорожки 3, 4) и нескольких неспецифических полос. При этом согласно последовательности нуклеотидов генома BgDNV в каждом случае, в отсутствие сплайсинга, предполагалось образование только одного фрагмента размером 2259 п.о. и 1476 п о. соответственно.

Рисунок 5. RT-PCR тотальной РНК из клеток BGE-2, зараженных BgDNV. Первая дорожка для каждой пары праймеров — РНК, выделенная из клеток на стадии V4, вторая дорожка — на стадии VI2. Дорожки 1, 2 -амплификация с праймерами P2st /ORF3 end, дорожки 3, 4 - P2st /ORF4 end, дорожки 5, 6 - P2st /ORF6 end, дорожки 7, 8 - Plst/ORFl end, дорожки 9, 10-P3st/C)RF6 end. Дорожка 11-молекулярный маркер. Размеры кДНК-фрагментов даны в парах оснований.

Клонирование и секвенирование кДНК-фрагментов показало, что при образовании мРНК для регуляторных белков имеет место явление сплайсинга (рис. 9). В одном случае

(кДНК размером 1600/800 п.о., рис. 5, дорожки 1, 2/3,4) происходит вырезание 658 нт.: с 275 (за семь нуклеотидов перед AUG кодоном для ORF5) (D1_NS) по 932 (сразу после стоп-кодона для ORF5) (A1_NS) (рис. 6Б). При этом происходит полное удаление ORF5 с формированием мРНК, кодирующей практически полностью перекрывающиеся ORF3 и ORF4. Во втором случае (кДНК размером 800 п.о., рис. 5, дорожки 1, 2) происходит сплайсинг между 274 нт. (аналогично предыдущему) и 1705 нт. (Al '_NS), с вырезанием интрона размером 1430 нт. (рис. 6В). В результате сплайсинга образуется транскрипт, содержащий открытую рамку считывания размером 501 нт. (19,3 кДа), соответствующую З'-концевой части ORF3 (hpNStrunc) (первый AUG-кодон находится на 2025 нт.). Интересно отметить, что hpNStrunc содержит один из доменов белка NS1 - домен ЭРЗ-хеликазы (рис. 13). кДНК размером 2300/1500 п.о. (рис. 5, дорожки 1,2/3,4) соответствует несплайсированному транскрипту, содержащему все три (ORFs 3-5) открытые рамки считывания для регуляторных белков.

Помимо этого, нами был описан дополнительный сплайс-вариант мРНК для неструктурных белков. В этом случае происходило вырезание 1123 нт. с 1031 нт. (D2_NS) по 2153 нт. (A2_NS), также в данном транскрипте имел место сплайсинг, описанный ранее с 275 нт. по 932 нт. Этот транскрипт кодирует маленькую 345 нт. (13,4 кДа) рамку считывания, соответствующую концу ORF3 (первый AUG-кодон находится на 2181 нт.), но, остается не понятным, имеет ли данная мРНК функциональное значение в жизненном цикле денсовируса или является артефактной. Таким образом, для неструктурных белков было определено наличие трех транскриптов, экспрессирующихся с промотора Р2.

При амплификации с парой праймеров PI st/ORF 1 end, соответствующих началу и концу участка генома, кодирующего структурные белки (рис. 1), были получены два кДНК-фрагмента размером около 2600 п.о. и около 2400 п.о. (рис. 5, дорожки 7, 8). Анализ полученных фрагментов показал, что больший по размеру соответствует несплайсированной пре-мРНК, включающей в себя обе рамки считывания для структурных белков. Меньший фрагмент соответствует сплайсированному транскрипту, в котором происходит вырезание 229 нт., с 4420 нт. (D1_VP) по 4192 нт. (A_VP). Интрон включает в себя конец ORF1 и начало ORF2, таким образом, что при его вырезании образуется одна большая рамка считывания (ORFspl) размером 778 а.о. (83,5 кДа) (рис.бГ). Нами также были обнаружены кДНК, содержащие сплайсинг другого типа. В данном случае задействован альтернативный донорный сайт (D2_VP), расположенный на 10 нуклеотидов выше и описанный уже акцепторный сайт, и происходит вырезание 239 нт. между 4431 нт. и 4191 нт. Данный вариант сплайсинга не приводит к появлению новой рамки считывания, а лишь продлевает незначительно ORF2, увеличивая ее кодирующую емкость от 229 а.о. до 271 а.о. (размер белка около 30 кДа) (рис.

6Г). Таким образом, для структурных белков было продемонстрировано наличие трех транскриптов, экспрессирующихся с промотора Р1 (рис. 9).

Для определения точек начала и окончания транскрипции применяли метод 5' и 3'-ЯАСЕ соответственно с набором заглубленных относительно друг друга специфических праймеров (отмечены на рис. 1).

5'-конец мРНК для неструктурных белков был определен на 240 нт., как и было предсказано ранее (МикЬа е1 а1., 2006), на 24 нт. ниже конца 1ТЛ в пределах 1пг (ТТА+^ТТ) сайта (первый нуклеотид в транскрипте выделен жирным шрифтом) (рис. 6А). Последовательность сайта согласуется с консенсусной последовательностью А(А/С/Т)СА+1(ОЛГ)Т(С/Т), характерной для представителей типа Членистоногие (РигпеИ е1 а1., 1994; Туззеп&Вег§от, 1995). На расстоянии 28 нт. от него расположен консервативный ЭРЕ элемент (С+24АССАС+29АССТ), полностью согласующийся с соответствующей консенсусной последовательностью (С+24 ЫШ А/ОЛ-+28 СЛЗ А/Т С/Т А/СЛЗ С/Т) (КтаЬ, Кааопа§а, 2000; Kadonaga, 2000; Вийег, Кадопа§а, 2002). 5'-конец транскриптов для структурных вирусных белков был определен на 5096 нт., на 23 нт ниже конца 1ТЯ, согласно предсказанному ранее (МикЬа е! а1., 2006) в пределах менее консервативного 1пг-элемента (ТТА+^ТА) (рис. 6Д). Но при этом консервативного ЭРЕ элемента правильно расположенного относительно 1пг обнаружено не было (ОЛС^ТСАО^ТОССТТТ). Можно предположить, что, так как вышележащие регуляторные элементы (включая ТАТА-Ьох) для Р1 и Р2 являются одинаковыми, то именно нижележащие элементы (1пг, БРЕ и другие) могут оказывать влияние на силу и специфичность промотора. Большая консервативность соответствующих мотивов для промотора регуляторных белков может определять большую активность транскрипции, описанную для этого промотора денсовирусов (ЭЬаг е! а1., 2007, 2010). 5'-некодирующая область для ЫБ белков является достаточно протяженной и составляет 42 нт. для сплайсированных транскриптов и 35 нт. для несплайсированного транскрипта. В то же время 5'-нетранслируемая область для V? белков составляет всего 3 нт. Нами не было найдено ни одного транскрипта, начинающегося с 823 нт., предсказанного для промотора РЗ (МикЬа е1 а1., 2006).

З'-конец транскриптов для неструктурных белков был идентифицирован на 2541 нт., на расстоянии 14 нт. от предсказанного ранее (МикЬа е1 а1., 2006) сигнала полиаденилирования (АААСТТ, 2521-2526 нт.). Транскрипты для структурных белков заканчиваются на 2494 нт., на расстоянии 19 нт. от предсказанного сигнала полиаденилирования (ААТААА, 2513-2518). Транскрипты перекрываются своими 3'-концами на протяжении 48 нт (рис. 6Е).

Инчию транскрипции N3 мРПК ТАГА Во*

СтаргЛК мИ1К" -

г* ОШ 5 • ато •

1 -,лаа г А t 282

Нячало трякскршпиш \ Р мРПК «ЮЗ

С :. ::: т я К* Иача-ю\Т!

сил А*- Старт УРмРНК

- » а - ЭТА

5096

("хемя пшнсмш и меж.!}' 1)1 и Л1 гамгачп« п N8 м('11К Р2«. 240

Т АГ А Но* *

Старт м1'11К —*• Л..:;^..-^.».-^:

1>1 N4.

5 'г

__2Т?

♦ '

274

Л^Л.г-^ОШ-Зг* <>КК4 , д]лта АТО

1 дулиа лаа

+ 4

933 940 lU4a.-to.NSI* И К 1 а К П»ча.ю.\'Х2* М .-. V

Сяйш (жшсшшя 1|)м1ккрншхнм лы N8 иУР мГПК*

роЬ-л к'омеиОНРЗ*-«

Оконняннг траискрипиин N4 мР! 1К* 4 2541

2Ш 4 роКЛ

Окгмсинис транскрипции УР иП1К

Схема ги.ш[<снн1а »к-жп 1)1 н ЛГ гайшин в NN мРПК 240

1А ТА М»ж +

Стар! мРПк" А 1.1,.•

ЛГ NN .

1>1_.\Х

, « к < I ' лта

фз , АО®

------ 4 4

П05 2025 Начало гмкот*тнчг«.-о1о |"х-1кя |]р>|Мгипс—М <;

С'1 ра 1<-| ни 1|М№.М»1'НГ|С.1К(Н) кктаи

УР! н М'З

< Качало соя [1<1Н1мП А1 О и |>»

В>ирой А1 <•■ « рам**

4 4 + * Кмкц УПЛТЗ

Л:,1'Ата..... АТО

т'о А-%~.лиС асо ЛСС" ........"Л.4

яр Н •■■•■■> V -< 12 ••> г- ..... >• Л :> 7 И >'■■':■■ 1

ЛИ 1-........... 1 ----------------^

Схема с

»ьУР мРПК

\Т| [>1 \Т| П2_\Т|

<7]е е\е <г|

вТ9 ата вг

............/ 4

\TSpB

начало ■есол&Аофогмкнах'о V? траиескрипт* 1

Рисунок 6. Сайты начала и окончания транскрипции и основные сайты сплайсинга мРНК 1^01ЧУ. Схема стратегии трансляции белков капсида

Учитывая полученные нами данные о точках начала и окончания транскрипции, размеры охарактеризованных с помощью RT-PCR мРНК для регуляторных белков составляют 2302 п.о., 1644 п.о., 872 п.о. и согласуются с размерами трех полос 2300 нт., 1800 нт. и 900 нт., полученных при Northern-блот гибридизации с зондом к ORF3 (рис. 4а, дорожка 1). Полученные данные о наличие сплайсинга, приводящего к вырезанию ORF5, согласуются и с результатами Northern-блот гибридизации с зондом к ORF5 (рис. 4а, дорожка 2), который выявляет только полосу 2300 нт., соответствующую несплайсированной пре-мРНК. Размеры описанных мРНК для белков капсида составляют 2603 нт для несплайсированного и 2374 нт. и 2364 нт. для двух сплайсированных вариантов, что сопоставимо с размерами двух мажорных полос (2600 нт. и 2400 нт.), выявляемых при Northern-блот гибридизации (рис. 46). Так как мРНК, содержащие сплайсинг, практически не отличаются между собой по размеру, то на Northern-блоте и электрофореграммах они идут как одна полоса и идентифицировать их отдельно не возможно.

Установление природы группы дополнительных VP транскриптов.

Полученные данные о транскрипции генома BgDNV не давали нам возможность объяснить природу ряда дополнительных транскриптов (2000 нт. - 300 нт., рис. 46), выявленных для капсидных белков. Можно было предполагать, что их появление связано с наличием альтернативных сайтов полиаденилирования.

Для проверки данного предположения нами был поставлен З'-RACE с использованием праймера PI RACE (рис. 1), локализующегося в районе сайта начала транскрипции, и амплифцирующего полностью область генома BgDNV, кодирующую капсидные белки и позволяющего выявить все возможные мРНК.

Рисунок 7. З'-RACE для мРНК, соответствующей капсидным белкам. М -

молекулярный маркер. Тонкой стрелкой обозначен фрагмент, соответствующий несплайсированной кДНК (2600 нт.), толстой - фрагмент, соответствующий сплайсированный кДНК (2400 нт.). Скобкой обозначены дополнительные мРНК для каспидных белков.

Результат амплификации представлен на рис. 7, где можно видеть, что помимо кДНК-фрагментов, соответствующих основным продуктам, размером около 2400 и 2600 п.о. (обозначены стрелками), был получен ряд дополнительных полос размером приблизительно 1600 п.о., 1200 п.о., 1100 п.о., 900 п.о., 800 п.о, 600 п.о., 550 п.о., представлявших собой стабильный паттерн, воспроизводившийся в нескольких повторных амплификациях (обозначен фигурной скобкой). Клонирование и секвенирование данных кДНК показало, что они действительно соответствуют мРНК, образующимся в результате альтернативной терминации транскрипции на следующих

сайтах внутри области, кодирующей капсидные белки: 4641 нт, 4447 нт, 4031 нт, 3989 нт, 3824 нт, 3551 нт, 3387 нт. При этом среди данных транскриптов встречались как сплайсированные, так и несплайсированные варианты (сайты сплайсинга соответствуют описанным выше). Размеры образующихся мРНК соотносятся с размерами дополнительных транскриптов, обнаруживаемых МогШегп-блот гибридизацией с УР зондами (рис. 46, дорожка 1, 2) и согласуются с результатами гибридизации с пробой к З'-концевой области УР-кодирующей части (рис. 46, дорожка 3). Функциональная роль данных транскриптов остается не понятной, так как они не содержат никаких новых рамок считывания, а кодируют только различающиеся по длине участки ранее описанных (СЖР1 и СЖР2) рамок считывания для капсидных белков. Интересно отметить, что анализ нуклеотидных последовательностей, окружающих сайты окончания транскрипции выявил в каждом случае наличие консервативных элементов, определяющих терминацию транскрипции (А-богатые участки, ОТ-богатые последовательности, САУТС-последователыюсти, полиА-подобные Аи-последовательности) (Веаис1ой^ е1 а1., 2000).

Второй участок полиаденилирования (4394 - 4399 нт., МикЬа е1 а1., 2006) для неструктурных белков, скорее всего, не используется, т.к. нами не было обнаружено ни одного транскрипта, оканчивающегося в соответствующем месте.

Обнаружение и характеристика дополнительной группы транскриптов для неструктурных белков

Размеры дополнительных высокомолекулярных N8 транскриптов (4000 нт. и 5000 нт., рис. 4) позволяли предполагать, что их синтез может начинаться с промотора для регуляторных белков, но не заканчиваться на определенном ранее сайте терминации транскрипции, а продолжаться почти до конца генома BgDNV. Методом т ¡Шсо в геноме BgDNV была обнаружена шестая открытая рамка считывания размером 396 п.о. (ОИРб, рис. 9), расположенная в пределах 3684 - 4079 нт. в части генома, кодирующей белки капсида, но считывающаяся с комплементарной цепи и кодирующая белок размером 13.6 кДа. Сравнение предсказанной аминокислотной последовательности ОИРб с имеющимися в базах данных МСВ1, не выявило гомологии ни с белками эукариот, ни с известными белками денсовирусов.

Было выдвинуто предположение, что высокомолекулярные Ш-транскрипты могут кодировать СЖР6, хотя ее функциональная роль в жизненном цикле BgDNV оставалась не понятной. Для проверки данного предположения были поставлены ЯТ-РСЯ амплификации с праймером (ЖРбепё, расположенным в конце СЖР6, и рядом праймеров, расположенных в области, кодирующей неструктурные белки (рис.1). Амплификация с праймерами Р2з1/(ЖР6епс1 привела к появлению высокомолекулярного фрагмента с ожидаемым размером около 3800 п.о., а также дополнительного фрагмента с размером 3100 п.о. (рис. 5, дорожка 5).

При использовании праймеров P3st/ORF6 end был получен один фрагмент с ожидаемым размером около 3300 п.о. (рис. 5, дорожка 9, 10), при этом в обоих случаях присутствовал ряд дискретных низкомолекулярных фрагментов. Секвенирование полученных кДНК показало, что фрагмент размером 3100 нт. соответствует сплайсированной мРНК, содержащей описанный ранее сплайсинг, приводящий к вырезанию ORF5. Все остальные минорные низкомолекулярные фрагменты представляли собой продукты альтернативного сплайсинга транскрипта размером 3800 п.о. (6 различных сплайс-вариантов).

Для подтверждения наличия длинных NS-транскриптов были проведены RT-PCR с одноцепочечной кДНК, полученной с использованием ген-специфического праймера 1NS_3F, расположенного в области, кодирующей белки капсида (рис. 1). При последующей амплификации с праймерами P2st/ORF3 end, P2st/ORF4 end и P2st/1NS_3F (рис. 1) были получены ПЦР-продукты предсказанного размера, в том числе со сплайсингом (рис. 8). Northern-блот гибридизация с использованием одноцепочечного РНК-зонда (INS, рис. 1) также

подтвердила присутствие высокомолекулярных мРНК, считывающихся с промотора Р2 и продолжающихся в область, кодирующую белки капсида.

Рисунок 8. RT-PCR амплификации кДНК, полученной с использованием ген-специфического праймера 1NS_3F. а) Праймеры P2st/ORF3 end. б) Праймеры P2st/ORF4 end. в) Праймеры P2st/1NS_3F. Стрелкой в каждом случае обозначен кДНК-фрагмент, соответствующий

сплайсированной мРНК. Молекулярные веса в парах оснований, обозначены слева от каждого рисунка.

Для определения предполагаемого 3'-конца длинных NS транскриптов проводили З'-RACE картирование. При этом нам пришлось столкнуться с наличием большого количества постоянно присутствовавших неспецифических ПЦР-продуктов, что затрудняло отбор искомых фрагментов. З'-конец данных транскриптов был определен на 4139 нт. Принимая во внимание то, что данные мРНК имеют ту же точку начала транскрипции, что и основная группа NS мРНК, их размеры составляют 3900 нт. и 3240 нт., т.е. меньше, чем размеры соответствующих транскриптов, детектированных Northern-блоттингом. Основываясь на данном обстоятельстве, а также ряде других доводов, представленных в работе, можно предполагать, что большинство данных транскриптов может заканчиваться позднее определенной нами точки или иметь гетерогенный сайт окончания транскрипции. Кроме того, часть из них может не быть полиаденилирована.

Таким образом, в нашей работе было выявлено две группы транскриптов для неструктурных белков: первые транскрибируются с промотора Р2 и заканчиваются после

2500 — 2000 -1500 — НЕ

' и

500 —1| £

250—ЩВ

а) I

2000—{ 1500

о—тшт ЕШШн

ли

б)

СЖРЗ, вторые тоже транскрибируются с промотора Р2, но заканчиваются после ОИРб. При этом данные транскрипты имеют протяженную область перекрывания с транскриптами для белков капсида, составляющую не менее 1600 нт (рис. 9).

На рисунке 9 представлена схема, иллюстрирующая стратегию транскрипции денсовируса рыжего таракана. Для длинных N8 транскриптов на схеме представлены только две основные мРНК, детектируемые с помощью ЫоПЬегп-блот гибридизации.

УР транскрипты ч

1ц>\/Р

УР1.УРЗ

\/Р2

ИрИИмтс

N53

274 нт.

247 НТ.

Длинные N5 транскрипты

N5 транскришы

---"1"

2364 п.о. 2374П.О. 2603 п.о.

УчлЦ.

-АЛЛ

1644П.О. 2302 п.о.

перекрывание 48 нт.

274 нт. 93 Знт.

3900 п.о.

перекрывание >1600 нт.

ОИЧ

Р2

24« нт. Р?

Ро1уДИ5 2541 нт.

А_УР Ш\Ф Ш_\Ф

I " I I

5096 нт.

Р1

Рисунок 9. Общая схема экспрессии генома денсовируса рыжего таракана Р1 -

промотор Р1, Р2 - промотор Р2 (цифрами обозначены точки начала транскрипции). Пунктирными линиями обозначены сайты полиаденилирования, серыми треугольниками с цифрами - точки окончания транскрипции. Для мРНК капсидных и регуляторных белков обозначены основные донорные и акцепорные сайты сплайсинга. Сбоку от транскриптов отмечены их размеры с учетом определенных нами сайтов начала и окончания транскрипции. Для длинных ЫЭ транскриптов в качестве концевой точки при подсчете размеров использовался 4139 нт. Для каждого сплайсинга цифры обозначают первый нуклеотид до и после вырезанного участка. Каждый тип сплайсинга обозначен латинской буквой. Предсказанные промотор РЗ для неструктурных белков и дополнительный сайт полиаденидирования для белков капсида, оказавшиеся нефункциональными, перечеркнуты. Слева для каждого транскрипта указаны белки, предположительно кодируемые им.

Идентификация белков капсида

Для очистки вирусных частиц применяли два подхода: центрифугирование в градиенте плотности сахарозы и центрифугирование в градиенте плотности СэО. Как показало сравнение полученных препаратов, второй подход позволил получить более качественный высокоочищенный препарат частиц Е^ОТчР/. В обоих случаях присутствовала как фракция пустых частиц, так и фракция частиц, содержащих вирусную ДНК, причем центрифугирование

в градиенте плотности CsCl позволило получить две фракции ДНК-содержащих частиц, с различающейся плавучей плотностью.

Для определения белкового состава капсидов BgDNV препараты вирусных частиц разделяли в 7,9% SDS-ПААГ. Как можно видеть на электрофореграмме, приведенной на рис. 10а, нами было обнаружено присутствие 8 различных полос с ориентировочными размерами 97 кДа, 85 кДа, 80 кДа, 57 кДа, 56 кДа, 40 кДа, 35,8 кДа, 27 кДа. При этом белки р97, р85, р80, р57 представляли собой мажорные полосы, в то время как оставшиеся четыре белка присутствовали в минорных количествах.

а)

2» 150 ' 120

б)

В)

vp3 4

кДя

150 —

120 —

100 —

85 —

70 —

60 - ,

50 —

40 —

VP1 ¡} VI*2

1 зо f"

- рЗб

(Н

г)

Наложение иеитидов для VP1 на аминокислотную последовательность ORFspI

MsTSCIJtSVPI^PVMaATVIYGGIim^ir^YOAbRLPYKrr^A/r^rACYJÍiy

OVICAVC^-KC^KIICK^C^*!^

мзлеел i vxc^хягл-'г posasi p ixíona'si^ta^pctsarrccsmtbsrhtoldasstíinpzsr gi HVMr»fTrnaonarLS гсуаоухьгомсттелж^гг r- t.yn : fíeyafnwsfm: rew. rsiccyfat к с l kiííympitrturqtadthstwtuiaincrrri а kg lkmnpli l fcs20rrfsf.c£

PQYHKYC3IW3CbIGKQVl^AHflDriCTAÍLTTRARHYQDSI*L?GOIPBKMS<ÍPAIfWI PA35X IVDl^^VRHP3TGrSASTCiA.4SRXXDAKTl/;HLQVGGVDIJCr<3^I^)ISr^DrDTLYT^ PME3GG

VÍDZPJMQrrMTKTAIHLQTTVKPrrraXPQRV'-feiVSL

Паожсине пептидов для VP2 на ашшокнслогиую иослсцовятсльносгь ORFl

?D3A31PT£^PSIBSGSALPCTS<arn>GSl^STHLD^^

FLSPCTADVlLPieiWCTTAPAItXbAlIISLVKIl^CTAFXíynt'XK^llLKl^^/tAT^CDrKiy ОГЯ PRYATQTAUTttST'QArL.TOKX Г Г i IA XG1 ^.MMPHLJGSORD ГГГ S S D E FKÍ.PLGrETn/lOQYTG

r гхинг e i vfa:s rc^y^r-ryyrvyasqtidsotpqiinkcsetksítl:

osovlsahhdrmraplttraíhrqds :ylpgdipbo®SaPA«wi pagsk aolcsvríffsrgrsa VlGAaSRXXDAHTICHl^}!?rt)lJCTCZAIJ«STITDft>TLrrW

sbhvgyrav UfTjZT avm гi naso"« -эсох*» г veoriucvstipit* pffinys} ie lksqftaa7kt apmlqtfdríyrygkeqrv—

Наложение hciitiwob для VP3 на аминокислотную последовательность ORFl

9 У& ЛОТ l'l KKffiCPSeaS<WAlJ«OTSGI1TDGSílCSSTI<LDLOASI«r,; M P : 5RG : i г/Бкгаитггкзскк rLSrCVREVILroDIGlTTTA?A*K<AI.T?:'iLVKI PWEYAfMíNjr Abi"\RLPJD<TGVrATOCI)ISI Y Q»MPRVAlQ5!ADTiJST0ATIíK»IKt'?KI AKC LKNNPHLJCSOftEYTrSSDIPHKPLGFrrNAOQif«: QK fS ЖЫ KB&rfGTTTRTTHTPTVPA 3 STGRKMSüRÍ YTVYASQTIDSGFPQ YHKICSKFMSMDI, I

GKQVIJAHKDITCÍAPLTraAKHIQDSlYLPGOXPlKKCSQPAir/VIPiCSKIVDLÍISVBHPSTGrSA

YBGA»SRranAmTSÜtiCflG6VDLriG*»LSHSTrrD

SbHYGVRAV ИОСГАУУГ 1 N.VOSW ?rr*FSCKVSDI PLRSQrPAATKT

APKLQTrCRrfrí«KPOKVL«OVK

Рисунок 10. а) Электрофореграмма белков капсида BgDNV. Цифрами слева обозначены 8 полос, проанализированных методом масс-спектрометрии. VP1, VP2, VP3 обозначают идентифицированные нами белки денсовируса (нумерация согласно электрофоретической подвижности). Справа приведен маркер молекулярных весов. б) Western-блот с антителами к капсидным белкам. Дорожка 1 -антитела VP К2 к С-концу ORF1, общему для всех белков капсида. Стрелками и фигурной скобкой обозначены выявляемые данными антителами белки капсида. Дорожка 2 - антитела VP К1 к ORF2. Молекулярные веса обозначены слева от рисунка, в) Western-блот с антителами к убиквитину (Ub). Дорожка 1 - белки капсида BgDNV. Дорожка 2 - гибридизация белков капсида с МАЬ к убиквитину. Стрелками обозначены полосы, соответствующие VP2. г) Наложение пептидов белков VP1 - VP3, выявляемых методом масс-спектрометрии, на аминокислотные последовательности открытых рамок считывания BgDNV.

Для дальнейшей идентификации все 8 полос были вырезаны из геля и подвергнуты масс-спектрометрическому анализу, что дало возможность установить природу каждой из белковых полос и предсказать стартовый кодон РНК, с которого происходило считывание соответствующего белка. Результат наложения пептидов, полученных для белков VP 1-3 на ORFspl и ORF1, с использованием программы Mascot представлен на рис. Юг.

Анализ показал, что полосы 1 и 4 соответствуют двум белкам, считывающимся с первых двух последовательных AUG-кодонов ORFspl, кодируемой сплайсированным VP-транскриптом (см. схему трансляции белков капсида на рис. 6). Данные белки были обозначены VP1 и VP3, соответственно (рис. 10а). Полосы 2 и 3 оказались идентичными, причем соответствующий белок, обозначенный нами VP2, полностью кодируется ORF1 (объединены фигурной скобкой на рис.Юа). Увеличение размеров белков VP1 (97 кДа) и VP2 (85/80 кДа) относительно предсказанных (85,3 кДа и 69,7 кДа, соответственно) может объясняться наличием посттрансляционной модификации. Масс-спектрометрический анализ показал также, что оставшиеся полосы 5, 6, 7 и 8 (рис. 10а) представляют собой продукты протеолитического расщепления белка VP3.

Полученные нами данные о капсидных белках BgDNV были дополнительно подтверждены результатами Western-блот гибридизации с антителами, соответствующими открытым рамкам считывания, кодирующим белки капсида. Использование антител к концу ORF1 (VP К2) выявило все три белка, видимых на электрофореграмме (рис. 106, дорожка 1), что подтверждает наличие у всех этих белков общего С-конца, соответствующего концу ORF1. Антитела к ORF2 (VP Kl) гибридизуются только с одной полосой, которая соответствует белку VP1 (рис. 106, дорожка 2), что свидетельствует о том, что только данный белок содержит уникальный N-концевой участок, соответствующий ORF2. При этом ни окрашиванием Кумасси, ни гибридизацией с антителами не было выявлено белка, кодируемого только ORF2 (24,8 кДа), и белка hpVP (30 кДа), кодируемого сплайсированным VP-транскриптом размером 2364 нт. (см. схему 9).

Таким образом, денсовирус рыжего таракана BgDNV содержит в составе капсида три различных белка VP1, VP2 и VP3, обладающих одинаковой С-концевой, но уникальными N-концевыми участками, причем белок VP2 присутствует в двух формах. Отметим, что белок VP3 представлен в капсиде в наибольшем количестве и составляет, следовательно, его основную структурную единицу.

Анализ последовательности белка VP1 показал присутствие в его уникальном N-концевом участке высококонсервативного мотива фосфолипазы А2 (PLA2) (134-192 а.о.), необходимого для инфекционности парвовирусов, а в общем С-концевом участке - домена Denso_VP4 (300 - 760 а.о.). В уникальном N-концевом участке белка VP2 с использованием

программы NetNES 1.1 dittp:/Avvvw.cbs.dlu.dk/services/NetNESA был обнаружен сигнал ядерного экспорта (NES) ELDRLL (64-69 а.о.) (рис. 11).

Следует отметить, что белки VP1 и VP3 синтезируются, наиболее вероятно, с двух последовательных AUG-кодонов ORFspl, кодируемой сплайсированным VP-транскриптом, с использованием leaky scanning механизма. Третий белок VP2 транслируется с несплайсированного транскрипта, содержащего ORF1 и ORF2, расположенную перед ней (рис. 8). Первый AUG-кодон данного транскрипта (стартовый кодон ORF2), будучи расположенным очень близко к 5'-концу мРНК, может в данном случае быть «невидимым» для рибосомы, и, таким образом, ORF2 может не синтезироваться, в то время как рибосома будет перемещаться в область, близкую к AUG-кодону ORF1 и начинать трансляцию этого белка. Схема трансляции белков капсида BgDNV представлена на рис. 6Ж.

Обнаружение убиквитинирования белка VP2

Указанное выше существенное превышение молекулярного веса белков VP1 и VP2 относительно предсказанного теоретически позволило предположить, что в поспрансляционное модифицирование данных белков может быть вовлечен процесс убиквитинирования. Присоединение одной молекулы убиквитина (Ub) приводит к увеличению молекулярного веса модифицированного белка примерно на 8 кДа, что в целом согласовалось с наблюдаемым в нашем случае увеличением молекулярного веса белка VP2 (80 кДа) по сравнению с теоретически предсказанным для ORF1 (69,7 кДа). Для проверки этой гипотезы мы использовали метод Western-блот гибридизации белков капсида с моноклональными антителами к убиквитину. На рисунке 10в представлен результат этого анализа. Показано, что белок VP2 действительно конъюгирован с Ub, в то время как VP1 и VP3 не содержат данной модификации. В более ранних работах было показано моноубиквитинирование капсидных белков ряда вирусов растений, отдельных вирусов позвоночных, а также одного вируса беспозвоночных - бакуловируса Lymantria dispar MNPV (Dunigan et al., 1988; Hazelwood and Zaitlin, 1990; Hingamp et al., 1995). Тем не менее, функциональное значение таких модификаций не было выяснено ни в одном случае. Функциональное значение связывания Ub с белком VP2 BgDNV также остается непонятным. Наши данные свидетельствуют, что убиквитинирование происходит, скорее всего, после синтеза соответствующих белков в клетке или сразу после сборки вирусных капсидов, при этом из зараженной клетки частицы выходят уже модифицированными. Исходя из литературных данных, можно предположить, что убиквитинирование может выполнять положительную роль в инфекции, например, участвуя в траффике вирусных частиц в ядро и подготовке вирусной ДНК к последующей репликации и экспрессии. С другой стороны, убиквитинирование может быть частью системы антивирусной защиты клетки-хозяина.

>VP1 (ORF spl)

mstsglesvpllpvnsatveyggiepkvhsgygasrlpvkptsaaggagaqydkifqsqlgraassgnplnvfksrdeyynsvpwelrrlpfaerdrlikpy gvkwdkvskaqyaqhwklvhpragqkriqqgivlpfsnni^BntiqdaktgsdfiaqgBihyseaksdidiqra^ieaigqfiqeathshnpisqtqgvi gavglagkqlvekltgkvqygspqqsqggtsnsdqpvagp5srpdpvpaqlpvqpstiqepaqtMsapeaivtgkrgaeepdsast|tkknkps ".hsgsalp gtsgntdgsmgsstmldldasrgimpisrgihvekfewtftkkwkflsfgvadvilpddigtttapakrwalttslvnipweyafmymsfaefnrlremtgv fatdcdikiyqynprvafqtadthstqatlnqnkftriakglrnnphlfgsdrdytfssdepmkplgfetnadqytgqkfrdrlskemygtttrttntptvp aistgkemgllryytvyasqtidsgfpqynkycsefnsmdligkqvlsahhdfkyaplttrarhyqdsiylpgdipekkesqpanwipagskivdlqsvrm pstgfsavegawsrkedamtlghlqvggvdlktgealsnstftdfdtlytkfpmeqgglyheagyqgatcgdqeslhvgvravpklgtavntinasswldcq mywtvecrlrcvstepftyprgnvsdiplrsqftaatktapmlqtfdrpyfygkpqrvlnsvel

Рисунок 11. Анализ доменной организации белка VP1. Желтым цветом обозначен участок PLA2, синим на нем - наиболее консервативные аминокислотные остатки. Розовым цветом - сигналы ядерной локализации (NLS). Красным - домен Denso_VP4. Крупным жирным шрифтом показаны первые два метиониновых кодона, с которых происходит считывание белков VP1 и VP3 соответственно.

Детекция экспрессии неструктурных белков BgDNV

Western-блот гибридизация с антителами к ORF3 (NS1) и ORF4 (NS2) в каждом случае выявили одну четкую полосу, размером приблизительно 60 кДа и 29 кДа соответственно, которые практически точно совпадали с предсказанными (60,2 кДа и 30,3 кДа) (рис. 12,

кДя Рисунок 12. Western-блот с антителами к регуляторным белкам.

100 Дорожка 1 -антитела к ORF3. Дорожка 2 - антитела к ORF4. Дорожка 3, 4 - антитела к ORF5: дорожка 3 - тотальные экстракты из клеток BGE-2, 75 зараженных вирусом, дорожка 4 - контроль, тотальные экстракты из клеток BGE-2, не инфицированных вирусом. Стрелками обозначены выявляемые белки BgDNV NSI, NS2 и NS3 соответственно. Квадратной 50 скобкой обозначены неспецифические полосы. M - маркер молекулярных весов.

37 В случае ORF5 (NS3) при Western-блот гибридизации как в

контрольных, так и в экспериментальных препаратах антитела выявляли значительное количество неспецифических полос (рис. 12, дорожки 3, 4). При этом в препарате зараженных клеток дополнительно присутствовала полоса, соответствовавшая белку с молекулярным весом 31 кДа. Ее размер согласовался с предсказанным для ORF5 (25,9 кДа), хотя и несколько превышал его, что могло быть связано с наличием неких посттрансляционных модификаций (например, фосфорилирования).

Биоинформатический анализ последовательности наиболее консервативного белка NS1 показал, что данный белок состоит из двух доменов: эндонуклеазного Rep-домена и SF3-хеликазного домена (см. рис. 13). В белках NS2 и NS3 методами биоинформатики не было выявлено никаких консервативных доменов.

Таким образом, нами было показано, что все три регуляторных белка, кодируемых открытыми рамками считывания генома BgDNV, экспрессируются в ходе продуктивной инфекции вируса в культуре клеток рыжего таракана. При этом необходимо отметить, что белок NS1, наиболее вероятно, считывается с несплайсированного NS-транскрипта, в то время

дорожки 1 и 2). 1 2 3 4 M

как два остальных белка NS2 и NS3, транслируются с 1644 нт. сплайсированного транскрипта (см. схему 9), с использованием механизма leaky scanning.

Определение внутриклеточной локализации белков BgDNV

Анализ аминокислотной последовательности регуляторных белков BgDNV с использованием программы Wolf PSORT ("http://www.psort.org/) выявил присутствие в белке NS1 ряда мотивов, сходных с сигналами ядерной локализации (NLS) (рис. 13): KKPR (514 -516 а.о.), RRRKRR (243-248 а.о.) и PRANRRR (239 - 245 а.о.), а также подобных мотивов KRKK (142 - 145 а.о.) и PALKKKI (66 - 72 а.о.) в белке NS2. В то же время, в белке NS3 аналогичных мотивов выявлено не было. Кроме того, два возможных NLS мотива были обнаружены в N-концевой части белка VP3, общей для всех капсидных белков (PTKKNKP, 23 - 29 а.о., KKWK, 80 - 83 а.о.). Также в аминокислотной последовательности белка NS1 была обнаружена последовательность, сходная с сигналом ядерного экспорта - LPLEITAL (рис. 13).

>NS1

mnygrltdfwsrfgvtmgddagrdsvsssdmveavggepsggpvqgqaevtsssvdqklqelvdrfvsrleektwkdsgyyisdvyacesserahalarrle

qraesfgrgfigifihnn2^33Eacpytsrtcrcqf™fpeakedirrllrkppaietftrrdwenitk2fctsgrratffkifghlqrlp^|talsdst

TSnonGnnpnRnvF.NCMnpT.KFHRnpFVGDTPftRlJïMM:l:l:^4:ltlDQIVVGGDGGIGGATGIILDL/LSKCAVCPLTEIVFTKEYLQDPIVACKRLDSKSVKD

aidtrasvihtweredfvafynmpntiliwsarslnafdsyyfkyeesfnwtelltfqmgenlvqfcrhlvdtlecnipkrncfwcepps: -*"

Рисунок 13. Анализ доменной организации белка NS1. Желтым обозначен Rep-домен, консервативные аминокислотные остатки, общие у всех денсовирусов, указаны синим. Серым обозначен SF3 хеликазный домен, темно-серым в его пределах участок гомологии с ААА+АТФазами, фиолетовым указан Walker А-мотив, голубым - Walker В-мотив, желтым - Walker В'-мотив, коричневым - Walker С-мотив и зеленым — «аргининовый палец». Красным цветом обозначен сигнал ядерного экспорта, бирюзовым - сигналы ядерной локализации (NLS).

Рисунок 14. Внутриклеточная локализация белков BgDNV. а). Белок VP1. б). Белок NS1. В каждом случае: А - ядра клеток, окрашенные DAPI; В - гибридизация клеток BGE-2 с соответствующими антителами, конъюгированными с FITC; С - клетки культуры BGE-2, сфотографированные с применением метода фазового контраста; D - наложение флуоресцентных сигналов DAPI и FITC на клетки BGE-2. Внизу каждой фотографии приведен масштаб.

Иммуно-флуоресцентный анализ с антителами VP К1 к белку VP1 продемонстрировал ядерную локализацию соответствующего белка (рис. 14), причем белок VP1 характеризовался практически равномерным распределением по всему объему ядра. Гибридизация с антителами к белку NS1 также выявила четкую ядерную локализацию соответствующего белка, при этом белок NS1 характеризовался четко выраженной примембранной локализацией (рис. 14).

Выводы

1. Определена динамика транскрипции генов дексовируса рыжего таракана BgDNV. Показано наличие ранних, соответствующих неструктурным белкам, и поздних, соответствующих капсидным белкам, групп транскриптов. Выявлены ранние и поздние промоторы изучаемого вируса.

2. Определены сайты старта и терминации транскрипции генов капсидных и неструктурных белков BgDNV. Определена последовательность нуклеотидов сплайсированных вариантов РНК, соответствующих как генам капсидных белков (два варианта), так и неструктурных белков (два варианта). Впервые для денсовирусов описана дополнительная группа транскриптов для генов неструктурных белков, транскрипция которых начинается с основного промотора, но продолжается в область, кодирующую капсидные белки.

3. Исследован белковый состав капсида BgDNV. Показано, что капсиды денсовируса рыжего таракана состоят из трех белков (VP1 - 97 кДа, VP2 - 85/80 кДа, VP3 - 57 кДа). Для каждого капсидного белка определены сайты инициации трансляции. Показано моноубиквитинирование капсидного белка VP2.

4. Методом белкового иммуноблоттинга выявлено три неструктурных белка денсовируса рыжего таракана (NS1 - 60 кДа, NS2 - 29 кДа, NS3 - 31 кДа). Показано соответствие описанных белков открытым рамкам считывания, выявляемым методами in silico.

5. Определена внутриклеточная локализация неструктурного белка NS1 и капсидного белка VP1 в инфицированной денсовирусом пересеваемой культуре клеток BGE-2. Показано, что оба исследованных белка накапливаются в ядрах инфицированных клеток, причем белок NS1 локализуется, преимущественно, вблизи ядерной мембраны.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1. Мартынова Е.У.. Капелинская Т.В., Муха Д.В. Денсовирусы насекомых: структура генома, особенности жизненного цикла и возможности практического использования. Успехи современной биологии, 2008 г., т. 128, № 4, с. 329 - 341.

2. Капелинская Т.В., Мартынова Е.У.. Королев А.Л., Шал К., Муха Д.В. Транскрипция генома денсовируса рыжего таракана BgDNV: альтернативный процессинг вирусных РНК. Доклады Академии Наук, 2008 г., т. 421, № 2, с. 256 - 261.

3. Мартынова Е. У.. Капелинская Т. В., Муха Д. В. Характеристика капсидных белков денсовируса рыжего таракана Blattella germanica (BgDNV). Труды Томского Государственного Университета, Серия биологическая, 2010, т. 275, с. 374 - 377.

Материалы всероссийских и международных конференций:

1. Капелинская Т.В., Мартынова Е.У., Королев А.Л., Муха Д.В. «Изучение стратегии транскрипции генома денсовируса рыжего таракана Blattella germanica». 4 съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 11-15 мая 2008 г., с. 114.

2. Kapelinskaya Т., Martvnova Е„ Korolcv A., Mukha D. The transcription of the Red Cockroach Densovirus BgDNV genome: Alternative Processing of the Viral RNAs in the BGE-2 cells. XX Международный генетический конгресс, Берлин, 12 - 17 июня 2008 г., с. 169.

3. Мартынова Е. У.. Капелинская Т. В., Королев А. Л., Муха Д. В. «Изучение стратегии экспрессии генома денсовируса рыжего таракана Blattella germanica на уровне транскрипции». I Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии», Донецк. 23 - 26 февраля 2009 г., с. 144-145.

4. Мартынова Е.У.. Капелинская Т.В., Муха Д.В' «Характеристика капсидных белков денсовируса рыжего таракана Blattella germanica (BgDNV)». Первая всероссийская молодежная научная конференция, посвященная 125-летию биологических исследований в Томском Государственном Университете: «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии», Томск, 6 — 9 октября 2010, с. 131 - 132.

5. Мартынова Е.У.. Капелинская Т. В., Муха Д. В. Идентификация белков, кодируемых геномом денсовируса рыжего таракана BgDNV. IV Международная школа молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки», 29 ноября — 3 декабря 2010, Москва -Звенигород, 145 - 146.

Заказ № 54-Р/09/2011 Подписано в печать 14.09.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:т/о@с/г.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мартынова, Елена Уразовна

Список сокращений б

Общая характеристика работы

Актуальность работы

Цели и задачи исследования

Научная новизна и практическая значимость работы

Апробация работы

Обзор литературы

I. Классификация и общая характеристика семейства Parvoviridae

II. Характеристика подсемейства Densovirinae

1. Общая характеристика и биология денсовирусов а) Общие свойства денсовирусов б) Распространенность денсовирусов в) Патогенез денсовирусов

2. Классификация подсемейства Densovirinae

3. Генетически детерминируемая устойчивость к заражению у тутового ^ шелкопряда

4. Белки денсовирусов а) Белки капсида (структурные белки) б) Неструктурные белки

5. Практическое использование денсовирусов а) Использование в качестве векторов экспрессии б) Использование денсовирусов в бологическом контроле

III. Рецепторы и проникновение в клетку

1. Парвовирусы позвоночных

2. Денсовирусы

IV. Общая схема репликации парвовирусов и репликация денсовирусов

V. Стратегии экспрессии вирусов подсемейства Densovirinae а) Основненые особенности экспрессии генома денсовирусов б) Стратегии экспрессии геномов денсовирусов

VI. Денсовирус рыжего таракана Blattella germanica (.ögDNV) 69 Материалы и методы

Микробиологические среды

Пересеваемая культура клеток рыжего таракана Blattella germanica 72 Условия содержания тараканов Blattella germanica и заражение вирусом ^

BgDNV

Электрофорез

Экстракция нуклеиновых кислот фенол-хлороформом

Обработка ДНКрестрикционными эндонуклеазами 74 Очистка фрагментов ДНК ' 75 Оценка качества и количества нуклеиновых кислот

Выделение геномной ДНК фенольным методом

Выделение геномной ДНК с использованием набора Diatom Prep

Выделение плазмидной ДНК

Выделение плазмидной ДНК методом быстрого лизиса

ПЦР с колонии для определения размера вставки

Выделение плазмидной ДНК для секвенирования

Выделение тотальной РНК и РНК-электрофорез

Нозерн-блот

Авторадиография

Гибридизация с одночепочечными РНК-зондами

Радиоактивномеченые зонды для гибридизации а). Получение ДНК-зондов б). Мечение ДНК-зондов с). Получение радиоактвно-меченых РНК-зондов (рибопробы)

ПЦР с обратной транскрипцией 82 Long-PCR

Быстрая амплификация концов кДНК (RACE)

Праймеры для амплификации и секвенирования

Клонирование ПЦР-продуктов а). Вектор для клонирования б). Подготовка клонируемых фрагментов в). Лигирование 87 Приготовление химически компетентных клеток E.coli и трансформация 87 Трансформация клеток Е. coli и селекция колоний 87 Секвенирование 88 Очистка вирусных частиц 88 Выделение вирусной ДНК из вирусных частиц BgDNV

Электрофорез белков в полиакриламидном геле

Масс-спектрометрический анализ белков

Получение тотальных клеточных экстрактов

Получение ядерных и цитоплазматических экстрактов из клеток BGE

Вестерн-блоттинг

Dot-блоттинг

Иммунопреципитация

Иммунофлуоресдентный анализ локализации вирусных белков в ^ клетках культуры BGE

Биоинформатические ресурсы

Результаты и обсуждение

I. Стратегия экспрессии генома i?gDNV на уровне транскрипции

1. Динамика развития вирусной инфекции BgDNV в культуре клеток BGE-2 на уровне репликации

2. Определение профиля транскрипции и временной динамики синтеза вирусных мРНК

3. Построение транскрипционной карты денсовируса BgDNV а). Характеристика транскриптов для капсидных и неструктурных белков б). Обнаружение и характеристика дополнительной группы транскриптов для неструктурных белков

RT-PCR

Гибридизация

4. Определение точек начала и окончания транскрипции методом RACE

З'-RACE '

5'-RACE

5. Установление природы группы дополнительных VP транскриптов

II. Изучение белков BgDKV

1 .Очистка вирусных частиц ZigDNV

2.Изучение структурных белков денсовируса BgDNV а) Идентификация структурных белков 2?,gDNV б) Westem-блот анализ экспрессии белков капсида в) Обнаружение убиквитинирования белка VP г) Дополнительный 5'-RACE для изучения природы образования белка VP

3. Детекция экспрессии неструктурных белков jBgDNV

4. Стратегия синтеза капсидных и регуляторных белков iîgDNV

5. Биоинформатический анализ капсидных и регуляторных белков

BgUNV

1 ) Белки капсида

2) Белок NS

3) Белок NS

4) Белок NS

6. Изучение внутриклеточной локализации белков BgDNV 148 Заключение 152 Выводы 156 Список литературы 157 Приложение 1 184 Приложение 2 185 Приложение 3 186 Приложение 4 187 Приложение

Список сокращений а.о. - аминокислотные остатки;

БСА - бычий сывороточный альбумин; е.к. - единицы карты;

ИФА - иммуно-флуоресцентный анализ; нт. - нуклеотиды; п.и. - после инфицирования; п.о. - пары оснований; тнт - тысяч нуклеотидов;

ОТ-ПЦР — ПЦР с обратной транскрипцией;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

РФ - репликативная форма;

УП - универсальный праймер;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

AAV - адено-ассоциированный вирус;

AMDV - вирус болезни алеутских норок;

BPV - парвовирус быка (bovine parvovirus);

CPV- парвовирус собаки (canine parvovirus);

DEPC - диэтилпирокарбонат; dNTP - дезоксинуклеотидтрифосфат;

DNV - денсовирус, вирус денсонуклеоза;

DPE - downstream promoter element;

DTT - дитиотрейтол;

EtBr - бромистый этидий;

FITC - флуоресцеинизотиоцианат;

FPV - feline panleucopenia virus (парвовирус кошек);

HBS - HEPES buffered saline;

HIV - вирус иммунодефецита человека;

HPV - вирус папилломы человека;

HPV - hepatopancreatic virus;

IPTG - изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид;

ITR - концевой инвертированный повтор (inverted terminal repeat);

MCV - мелкий вирус собак (minute canine virus);

MNPV - mononuclear polyhedrosis virus;

Mo-MULV - Moloney Murine Leukemia Virus;

MVM - мелкий вирус мышей;

NES - сигнал ядерного экспорта;

NLS - сигнал ядерной локализации;

NTP - нуклеотидтрифосфат;

NS - неструктурные белки (nonstructural protein);

ORF - открытая рамка считывания (open reading frame);

PLA2 - фосфолипаза А2;

PMSF - фенилметилсульфонилфлуорид;

PPV - парвовирус свиней;

PVDF — поливинилдифлуорид;

RACE - быстрая амплификация концов кДНК (rapid amplification of cDNA ends);

SDS -додецилсульфат натрия;

SIV - вирус иммунодефицита обезьян;

SPV - парвовирус обезьян;

SSC - sodium, sodium citrate;

VD - вирусная ДНК (viral DNA);

VLP — вирусоподобные частицы;

VP - вирусные (структурные) белки (viral protein);

VSV - вирус везикулярного стоматита;

Ub - убиквитин;

X-gal - 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-р-В-галактопиранозид;

Общая характеристика работы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение стратегии экспрессии денсовируса рыжего таракана Blattella germanica"

Денсовирусы, или вирусы денсонуклеоза, относятся к подсемейству Densovirinae семейства Parvoviridae. Представители данного семейства характеризуются одноцепочечным линейным ДНК-геномом размером от 4 до 6 т.п.о., заключенным в икосаэдрический капсид размером 18f- 26 нм, не имеющий липопротеиновой оболочки и состоящий из 60 белковых субъединиц. Отличительной особенностью генома^ является наличие на его концах палиндромных последовательностей, способных образовывать стабильные вторичные структуры, служащие затравками для синтеза второй нити вирусного генома. Вирусы, относящиеся- к подсемейству Densovirinae, инфицируют клетки беспозвоночных, в основном насекомых и ракообразных, и в большинстве случаев вызывают летальные заболевания организма-хозяина. Представители второго подсемейства парвовирусов - Parvovirinae — поражают позвоночных, вызывая* некоторые заболевания птиц, животных и человека. » \

Несмотря на то, что впервые симптомы заболевания, вызываемого денсовирусом, и сам патоген (денсовирус бабочки Gallería mellonella) были описаны еще в 60-х гг. прошлого века (Meynadier et al., 1964; Amargier et al., 1965; Vago et al., 1966), эта группа вирусов до настоящего времени остается малоизученной по сравнению с остальными парвовирусами, интерес к которым вызван, в первую очередь, природой организма-хозяина и возможностью использования отдельных представителей (адено-ассоциированных вирусов) в качестве векторов для генной терапии (Flotte & Carter, 1995). К настоящему времени обнаружено около 30 различных денсовирусов (Yang et al., 2008) и это число постоянно увеличивается. Однако исследования данной группы вирусов носят в основном описательный (описание симптомов» вызываемого заболевания, определение нуклеотидной последовательности генома и его биоинформатический анализ) или узкоспециализированный характер. В то же время практически не изученными оставались такие важные аспекты жизненного цикла вирусов как механизмы проникновения и выхода из клетки-хозяина, трехмерная атомная структура капсидов, механизмы реализации генетической информации вируса (репликация, транскрипция, трансляция), ее регуляция, роль вирусных белков и систем клетки-хозяина в жизненном цикле вируса, в конечном итоге определяющие характер патогенеза. Кроме того, практически не было уделено внимания системам антивирусной защиты клетки.

Только в последнее десятилетие начинают накапливаться данные об этих аспектах биологии денсовирусов: описаны стратегии экспрессии геномов ряда денсовирусов, представляющих различные группы - G/wDNV, A//DNV, Q?DNV, P/DNV, PstDNV

Baquerizo-Audiot et al., 2009; Fediere et al., 2004; Dhar et al.,2010; Tijssen et al., 2003; Yang et al., 2008); получены с высоким разрешением трехмерные структуры капсидов денсовирусов GvraDNV, JcDNV, £wDNV-l и M3NV (Bruemmer et al., 2005; Kaufmann et al., 2010, 2011; Simpson et al., 1998); проведен ряд исследований, позволивших получить сведения о структуре промоторных областей генов.вирусных капсидных и неструктурных белков и факторах, регулирующих их экспрессию (Kimmick, et al., 1998; Shirk et al., 2007; Ward et al., 2001; Yang et al., 2008), а также о биологических активностях отдельных регуляторных белков, в частности белка NS-1 (Abd-Alla et al., 2004; Ding et al., 2002; Yang et al., 2006, 2009; Zhou et ahí, 2009). Полученные данные дают основание говорить о значительном« разнообразии и разнородности денсовирусов как'на уровне структурной организации их геномов, так и на уровне стратегий реализации его генетической информации. Это обстоятельство в свою очередь в определенной степени затрудняет создание системы классификации данной группы вирусов и приводит к постоянному пересмотру уже существующих.

Углубление знаний об особенностях жизненного цикла данной группы вирусов имеет не только чисто научное значение, но и высокую практическую значимость. С одной стороны денсовирусы являются природными патогенами таких хозяйственно ценных видов беспозвоночных как тутовый шелкопряд {Bombyx morí) и различные виды креветок рода Penaeiis. Периодически возникающие эпизоотии приносят значительный ущерб сельскому хозяйству Японии, Китая, Индии, Таиланда и других азиатских стран. С другой» стороны, значительное количество насекомых-хозяев денсовирусов являются вредителями сельского хозяйства (личинки S. fusca, G. mellonella, M. persicae, D. punctatus) либо синантропными паразитами (P. fuliguinosa, В. germánico). В природных популяциях денсовирусы играют значительную роль в поддержании и регуляции, численности этих насекомых. Это обстоятельство, а также особенности самих денсовирусов дает возможность широко использовать эту группу вирусов в „качестве новаторских биопестицидов направленного действия (Carlson et al., 2006; Fediere, 2000). Применение методов генной инженерии позволит создание на основе денсовирусов более высокоэффективных препаратов, в том числе и с увеличенной специфичностью к виду-хозяину путем внесения изменений в кодирующие или регуляторные участки генома, а также путем внедрения чужеродных генов, кодирующих, например, специфические токсины (Gu et al.,2010; Jiang et al., 2007; Ren et al., 2008).

Следует особо подчеркнуть, что денсовирусы поражают также различные виды комаров, и в том числе из родов Aedes и Anopheles (Afanasiev et al., 1991; Boublik et al., 1994; Baquerizo-Audiot et al., 2009; Ren et al., 2008). Данные насекомые имеют важное медицинское значение в связи с тем, что они являются переносчиками различных тяжелых заболеваний человека, таких как малярия, желтая лихорадка, лихорадка Деньге, и исследование денсовирусов комаров и их взаимоотношений с хозяином будет способствовать разработке средств для борьбы, как с переносчиками, так и г непосредственно с самими возбудителями заболеваний.

Необходимо отметить и другое направление практического использования денсовирусов, а именно, создание на их основе векторов для эффективной трансформации и генетических манипуляций, с насекомыми, а также экспрессионных систем, подобных бакуловирусным, для- продукции чужеродных белков в клетках насекомых (Afanasiev et al., 1999,1994; Bossin et al., 2007; Giraud et al., 1992; Gu et al.,2010). Уникальной особенностью денсовирусов является способность вирусного генома, клонированного в плазмидном векторе, после трансформации в пермессивные клетки, вырезаться из вектора и функционировать как полноценная двуцепочечная» вирусная» геномная ДНК (Dumas et al., 1992; Jourdan et al., 1990). Эта специфическая черта в совокупности с небольшим размером генома вирусов и возможностью интеграции в геном* клетки-хозяина (Bossin et al., 2003; Hu et al., 2007) способствует развитию данного-направления. Помимо этого простота и регулярность организации капсидов денсовирусов, их небольшие размеры и неспособность инфицировать клетки млекопитающих делает данную группу вирусов перспективной для разработки на их основе биологических носителей для направленной доставки лекарственных средств или генетического материала в целевые клетки.

Денсовирус рыжего таракана Blattella germanica (Z?gDNV) - один из представителей подсемейства Densovirinae был впервые обнаружен в 2000 г. Д. В. Муха и К. Шалом. Это второй денсовирус, обнаруженный у представителей отряда Таракановые (Yamagishi et al., 1999). В ходе дальнейшей работы была определена, нуклеотидная последовательность его генома, проведен ее биоинформатический анализ и предсказаны предполагаемые открытые рамки считывания и регуляторные элементы. Кроме того, методом электронной микроскопии были описаны цитопатологические эффекты и тканеспецифичность вирусной инфекции, а также показана возможность использования линии клеток рыжего таракана BGE2 для поддержания вируса (Муха, Шал, 2003; Mukha et al., 2006). Особенности стратегии экспрессии генома денсовируса рыжего таракана, являющейся одним из ключевых этапов в жизненном цикле вируса, до настоящего исследования оставались неизвестными.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение стратегии экспрессии генома денсовируса рыжего таракана Blattella germanica (ßgt>NV).

В связи;с поставленной целью нами были сформулированы следующие задачи:

1) Изучение динамики развития * вирусной: инфекции BgDNW в культуре клеток рыжего таракана BGE-2.

2) Изучение характера; экспрессии: генома^ ßgDNV на уровне транскрипции: опрсделение количества транскриптов, характеристика альтернативных форм; сплайсинга, определение сайтов началаи окончания транскрипции. ,

3) Изучение характера экспрессии генома ÄgDNV на уровне белковых продуктов.

4) Определениевнутриклеточной локализации белковыхпродуктовденсовируса рыжего таракана Blattellä germanica: ' '

Научная новизна и практическая значимость работы

В настоящей работе впервые для! денсовирусов продемонстрирован характер: временною динамики транскрипции и репликации; вирусного генома и показано стабильное под держание BgDNV в культуре клеток,рыжего таракана BGE-2.

Впервые описана стратегия экспрессии! генома денсовируса рыжего таракана Blattella germanica (ßgDNV) на уровне транскрипции. Получены данные о точках начала и окончания транскрипции^ выявлены, и охарактеризованы мЕНК как длякапсидиых, так; и для регуляторных белков и; показано участие: альтернативного сплайсинга в образовании транскриптов для обеих групп белков.

Впервые для денсовирусов охарактеризована дополнительная, группа транскриптов: для регуляторных белков, транскрибирующихся, с того же промотора; что и основная группа, но заканчивающихся;в области расположения-:открытых рамок.считывания для капсидных белков: Описано восемь различных-сплайс-вариантов^транскриптов, имеющих большую (около 1600 нт.) область перекрывания с транскриптами для капсидных белков.

Обнаружение, данной группы, вирусных мРНК позволяет; предполагать возможность • ' . ' ' ' - . • ' участия; механизмов РНК-интерференции в, антивирусной, защите: клетки насекомогохозяина. '

Получен высокоочищенный: препарат вирусных частиц BgüNV и определен белковый состав капсида данного вируса. Показано, что происхождение белков капсида имеет ряд уникальных особенностей, не описанных до сих- пор ни для одного из денсовирусов.

Впервые для денсовирусов, показано наличие посттрансляционной модификации капсидных белков убиквитином.

Методом белкового иммуноблоттинга выявлены три неструктурных белка денсовируса рыжего таракана. Показано соответствие описанных белков- открытым рамкам считывания, выявляемым методами in silico.

Полученные в процессе работы результаты демонстрируют наличие уникальных особенностей, характеризующих денсовирус рыжего таракана, и позволяют предположить, что 5gDNV может принадлежать к отдельному роду внутри своего подсемейства.

Данные, полученные в рамках настоящей работы, расширяют представления о стратегиях реализации генетической'информации вирусов подсемейства Densovirinae и о биологии денсовирусов в^ целом. Полученные результаты могут быть .использованы при чтении лекций по вирусологии и молекулярной биологии в высших учебных заведениях биологического, медицинского и сельскохозяйственного профиля. Эти результаты, могут являться основой для последующей разработки биологических способов борьбы с рыжим тараканом на основе SgDNV, а также создания!на его базе инструментов для изучения! методами генетической инженерии молекулярно-генетических процессов в клетках рыжего таракана, который в свою очередь может использоваться как модельный' объект для выявления различных общих аспектов биологии клеток насекомых. Экспериментальные данные, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, о белковом составе капсида и возможных путях синтеза белков представляют базу для разработки системы in vitro сборки вирусных частиц, что является важным шагом для разработки на основе денсовируса рыжего таракана носителей, пригодных для использования в биомедицинской практике.

Апробация работы

На данный момент по результатам диссертационной работы опубликовано три статьи. Основные положения, и результаты работы были представлены на 4 съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск 11 — 15 мая 2008г.,; на XX Международном генетическом конгрессе, Берлин, 12-17 июня 2008г.; на I Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии», Донецк, 23 — 26 февраля 2009г.; на I Всероссийской Научной Конференции, посвященной 125-летию биологических исследований в Томском Государственном Университете «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии», Томск, 6 — 9 октября 20 Юг; на IV Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки», Москва-Звенигород, 29 ноября — 3 декабря 2010г.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Мартынова, Елена Уразовна

Заключение

В результате наших исследований для денсовируса рыжего таракана 5gDNV была определена стратегия экспрессии вирусного генома на уровне транскрипции и охарактеризованы синтезируемые вирусом белки. Полученные нами данные показали, что хотя BgDNV обладает целым рядом характеристик, схожих с другими вирусами подсемейства1 Densovirinae, но обладает и рядом,-уникальных особенностей, отличающих его от других описанных до настоящего времени денсовирусов.

Для BgDNV нами было достоверно показано1участие альтернативного сплайсинга в образовании вирусных транскриптов как для неструктурных, так и для капсидных белков. При этом механизмы формирования мРНК для двух групп белков, объединяют в- себе черты, характерные для двух различных родов денсовирусов: Densovirus и Pefudensovirus. .BgDNV аналогично представителям рода Densovirus и Pefudensovirus, а также Лс/DNV (Bergoin & Tijssen, 2000; Fediere et al., 2004; Tijssen et al., 2003; Yang et al.,2008) содержит три ORF для регуляторных белков; один активный, промотор и использует такую же стратегию* для образования соответствующх мРНК. Все эти вирусы обнаруживают присутствие двух транскриптов для неструктурных белков, в меньшем из которых происходит полное вырезание первой справа ORF, кодирующей белок NS-3, приводящее к образованию мРНК, кодирующей только две последующих ORF (белки NS-1 и NS-2). Во всех случаях наиболее представленным является сплайсированный вариант. На основании данного сходства, предполагается, что аналогично представителям рода Densovirus (Tijssen et al., 2003) у .BgDNV считывание ORF5 (белок NS-3) происходит с несплайсированного транскрипта, а считывание ORF3 (белок NS-1) и ORF4 (белок NS-2) - со сплайсированного транскрипта с использованием механизма leaky-scanning.

В отличие от других денсовирусов для .BgDNV был описан дополнительный сплайсированный транскрипт для* неструктурных белков, который содержит ORF размером 166 а.о. (hpNS). Данная рамка кодирует С-концевой участок белка NS-1, содержащий в себе все три консервативных домена необходимых для NTP-связывающей и хеликазной активности. Последнее может говорить о наличие у BgDNV дополнительного четвертого неструктурного белка по сравнению с другими денсовирусами (Bergoin & Tissen, 2000).

BgDNV содержит две ORF для капсидных белков, что отличает его от других представителей рода Densovirus, имеющих в данном случае только одну рамку считывания, но делает схожим с PJDNV, /Ic/DNV, а также MpDNV и PcDNV — двумя денсовирусами, поражающими представителей отряда Полужесткокрылые, для которых было показано разделение кодирующей области для белков капсида на несколько ORF

Thao et al., 2001; van Munster et al., 2003; Yamagishi et al., 1999).- В случае транскриптов для структурных белков у iígDNV происходит вырезание участка, содержащего конец ORF2 и начало ORF1, с образованием одной большой рамки- считывания ORFspl, начинающейся на AUG-кодоне для ORF2 и заканчивающейся на стоп-кодоне для ORF1 и кодирующей белок размером 778 а.о. При сравнении аминокислотной последовательности данной рамки с аминокислотными последовательностями белков денсовирусов была выявлена протяженная область гомологии с капсидными белками представителей рода Densovirus. Это позволяет предположить, что ORFspl соответствует единственной ORF для капсидных белков у представителей данного рода. Объединение двух рамок для структурных белков в одну за счет сплайсинга, а также наличие ряда других сплайсированных транскриптов было продемонстрировано ранее и для P/DNV (Yamagishi et al., 1999). Уникальной особенностью Z?gDNV является присутствие группы дополнительных VP-транскриптов, образующихся посредством альтернативной терминации траскрипции.

Для денсовируса рыжего таракана было продемонстрировано наличие в составе капсидов трех белков VP1 (97 кДа), YP2 (85/80 кДа), YP3 (57 кДа). причем VP2 представлен в виде двух вариантов, различающихся, по-видимому, наличием посттрансляционной модификации. Это отличает Z?gDNV от представителей рода Densovirus, для которых было продемонстрировано наличие также четырех капсидных белков, но характеризующихся другими соотношениями молекулярных весов (например, 98 кДа, 69 кДа, 59 кДа, 49 кДа для GwzDNV) (Tijssen et al., 2003). Паттерн капсидпых белков jSgDNV отличается и от представителей рода Iteravirus, характеризующихся наличием двух «дуплетных» полос белков (82 кДа и 74 кДа, 54 кДа и 49 кДа) (Fediere et al., 2002; Nakagaki & Kawase, 1990), и, в,целом, от всех других денсовирусов, что делает его уникальным: Наиболее схож с j5gDNV паттерн капсидных белков i^DNV 105 кДа, 82 кДа, 79 кДа, 56 кДа и 52 кДа (Ни et al., 1994). В данном случае также имеются два белка, 82 и 79 кДа, характеризующиеся близкими молекулярными массами, но, к сожалению, природа капсидных белков .P/DN V не известна.

Уникальным представляется механизм синтеза белков капсида. В то время, как t представители родов Densovirus, Iteravirus, и, вероятно P/DNV используют механизм "leaky scanning" для считываются всех капсидных белков (Fediere et al., 2004; Tijssen et al., 2003; Yamagishi et al., 1999), Z?gDNV применяет две стратегии: leaky scanning для считывания белков VP1 и VP3 и неидентифицированный пока механизм альтернативной инициации трансляции для синтеза VP2.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мартынова, Елена Уразовна, Москва

1. Вирусология: в 3 т., Т.З. Пер. с англ./ Под ред. Б. Филдса, Д. Найпа при участии Р. Ченока, Б. Ройзмана, Дж. Мелника, Р. Шоупа. М.: Мир, 1989, стр. 67-102.

2. Гены и геномы: в 2т., Т.2: Пер. с англ./ М.Сингер, П.Берг. М.: Мир, 1998, стр. 104-108.

3. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ./ Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. М.: Мир, 1984 г.

4. Д.В.Муха, К.Шал. Денсовирус рыжего таракана Blattella germanicw. обнаружение, нуклеотидная последовательность и организация генома. Молекулярная биология 37, № 3,1-12,2003.

5. Скулачев М.В. Внутренняя инициация трансляции — разнообразие механизмов и возможная роль в жизнедеятельности клетки. Успехи биологической химии 45, 123 — 172, 2005.

6. Спирин А.С. Молекулярная биология: Структура» рибосомы и биосинтез белка. Учеб. для студентов биол. спец. вузов. — М.: Высшая школа, 1986.

7. Чумаченко А.Г. Денсовирус рыжего таракана Blattella germanica: генетический аспект взаимодействия вирус/хозяин: Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М., 2006.

8. Abe, H.; Harada, Т.; Kanehara, M.; Shimada, Т.; Ohbayashi, F.; Oshiki, T. Genetic mapping or RAPD< markers linked to the densonucleosis refractoriness gene, nsd-1, in the silkworm, Bombyx mori. Genes & genetic systems 73, 237-424, 1998.

9. Afanasiev, B.N.; Carlson, J.O. Densovirinae as gene transfer vehicles. In «Parvoviruses. Fiom Molecular Biology to Pathology and Therapeutic Uses» (Faisst S. Rommelaere J, Ed.). Contributions to microbiology. Basel, Karger, 4, 33-58, 2000.

10. Afanasiev, B.N.; Gaylov, E.E.; Buchatsky, L.P.; Kozlov, Y.V. Nucleotide sequence and genomic organization of Aedes Densonucleosis Virus. Virology 185, 323-336, 1991.

11. Afanasiev, B.N.; Kozlov, Y.V.; Carlson, J.O.; Beaty, B, J. Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells. Experimental Parasitology 79, № 3, 322-339, Nov. 1994.

12. Afanasiev B. N., Ward T. W., Beaty B. J., Carlson J. O. Transduction of Aecles aegypti mosquitoes with vectors derived from Aedes densovirus. Virology 257, № 1, 62 72, Apr. 1999.

13. Amargier A., Vago C., Meynadier G. Etude histopathologique d'un nouvcau type de virose mise en evidence chez le lepidoptere. Archiv fur die gesamte Virusforschung 15, 659, 1965.

14. Astell C. R. & Blundell M. C. Sequence of the right hand terminal palindrome of the human B19 parvovirus genome has the potential to form a «stem plus arm» structure. Nucleic Acids Research, 17, № 14, 5857, 1989.

15. Astell C. R., Smith M., Chow M. B., Ward D.C. Structure of the 3' hairpin termini of four rodent parvovirus genomes: nucleotide sequence homology at origins of DNA replication. Cell, 17, 691 703, 1979.

16. Astell C. R., Thompson M., Chow M. B., Ward D.C. Structure and replication of minute virus of mice. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 47, 751 — 762, 1983a.

17. Astell C.R., Thompson* M., Merchlinsky M., Ward D. C. The complete DNA sequence of minute viius of mice, an autonomous parvovirus. Nucleic Acids Research, 11, 999-1018, 1983b.

18. Attasart P., Kaewkhaw R., Chimwai C., Kongphom U., Namramoon O., Panyim S. Inhibition of Penaeus monodon densovirus replication-in shrimp by double-stranded RNA. Archives of Virology 155, 825 832, 2010.

19. Azarkh E., Robinson E., Hirunkanokpun S., Afanasiev B., Kittayapong P., Carlson J., Corsini J. Mosquito densonucleosis virus non-structural protein NS-2 is necessary forproductive infection. Virology 374, 128 147, 2008.

20. Bando, H.; Choi, H.; Ito, Y.; Kawase, S. Terminal structure or a Densovirus implies a hairpin transfer replication which is similar to the model for AAV. Virology 179, 57-63, 1990.

21. Berns, K.I. Parvovirus replication. Microbiological reviews 54, № 3, 316 329, Sept. 1990.

22. Blackburn C. D., Cline S.E., Hemming J. P., Johnson F. B. Attachment of Bovine parvovirus to 0-1 inked alpha 2, 3 neuraminic acid on glycophorin A. Archives of Virology 150, № 7, 1477-1484, Jul. 2005.

23. Boisvert M., Fernandes S., Tijssen P. Multiple pathways involved in Porcine parvovirus cellular entry and trafficking toward the nucleus. Journal of Virology 84, № 15, 7782 7792, Aug. 2010.

24. Bonami J.-R., Mari J., Poulos B. T., Lightner D. V. Characterization of hepatopancreatic parvo-like virus, a second unusual parvovirus pathogenic for penaeid shrimps. Journal of General Virology 76, 813 817, 1995.

25. Bonamu J.-R., Trumper B., Mari J., Brehelin M., Lightner D. V. Purification and characterization of the infectius hypodermal haematopoietic necrosis virus of penaeid shrimp. Journal of General Virology 71,2657 2664, 1990.

26. Bonsch C., Zuercher Ch., Lieby P., Kempf Ch., Ros C. The globoside receptor triggers structural changes in B19v capsid that facilitate virus internalization. Journal of Virology 2010 doi:10.1128/JVI.01143-10.

27. Bossin H., Furlong R. B., Gillett J. L., Bergoin M., Shirk P.D. Somatic transformation efficiencies and expression patterns using the JcDNV and piggyBac transposon gene vectors in insects. Insect Molecular Biology 16, № 1, 37 — 47, Febr. 2007.

28. Boublik, Y.; Jousset, F.-X.; Bergoin, M. Complete nucleotide sequence and genomic organization of the Aedes albopictus Parvovirus {AaW) pathogenic for Aedes aegypti larvae. Virology 200, 752-763, 1994.

29. Bourguignon G.J., Tattersall P. J.,Ward D.C. DNA of minute virus of mice: self-priming, nonpermuted, single-stranded'genome with 5'-terminal hairpin duplex. Journal of Virology, 20,290-306, 1976.

30. Brockhaus K., Plaza S., Pintel D. J., Rommelaere J., Salome N. Nonstructural Proteins NS2 of Minute Virus of Mice Associate In Vivo with 14-3-3 Protein Family Members. Journal of Virology 70, № 11, 7527 7534, Nov. 1996.

31. Broemer M., Meier P. Ubiquitin-mediated regulation of apoptosis. Trnds in Cell Biology 19, №3, 130-140,2009.

32. Brown K.E., Anderson-S.M., Young N.S. Erythrocyte P antigen: cellular receptor for B19 parvovirus. Science 262, № 5130, 114 117, Oct. 1993.

33. Bruemmer A., Scholari F., Lopez-Ferber M.', Conway J. F., Hewat E. A. Structure of an insect parvovirus (Junonia coenia densovirus) determined by cryo-electron microscopy. Journal of Molecular Biology 347, № 4, 791 801, Apr. 2005.

34. Brunstein, J.; Soderlund-Venermo, M.; Hedman, K. Identification of a novel RNA splicing pattern as a basis of restricted cell tropism of erythrovirus B19. Virology 274, № 2, 284-291, Sept. 2000.

35. Butler J. E.F., Kadonaga J. T. The RNA polymerase II core promoter: a key component in the regulation of gene expression. Genes & development 16, 2583 2592, 2002.

36. Burivong P., Pattanakitsakul S. N., Thongrungkiat S., Malasit P., Flegel T. W. Markedly reduced severity of Dengue virus infection in mosquito cell cultures peisistently infected with Aedes albopictus densovirus (¿a/DNV). Virology 329, 261 269, 2004.

37. Burnett E., Cotmore S. F., Tattersall P. Segregation of a single outboard left-end orogin is essential for the viability of parvovirus Minute Virus of Mice. Journal of Virology 80, № 21, 10879- 10883, Nov. 2006.

38. Carlson J., Suchman E., Buchatsky L. Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes. Review. Advances in Virus Research 68, 361 — 392, 2006.

39. Cavalier-Smith T. Palindromic base sequences and replication of eukaryotic chromosome ends. Nature (London) 250, 467 470, 1974.

40. Chao Yu-Chan; Young III, S.Y.; .Kim, K.S.; Scott, H.F. A newly isolated densonucleosis virus from Psendoplusia includens (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Invertebrate Pathology 46, 70-82, 1985.

41. Chellappan, P.; Vanitharani, R.; Fauquet, C.M. Short interfering RNA accumulation correlates with host recovery in DNA virus-infected host, and gene silencing targets specific viral sequences. Journal of Virology 78, № 14, 7465-7477, Jul. 2004.

42. Chen S., Cheng L., Zhang Q., Lin W., Lu X., Brannan J., Zhou Z. H., Zhang J. Genetic, biochemical, and structural characterization of a new densovirus isolated from a chronically infected Aedes albopictus C6/36 cell line. Virology 318, 123 133, 2004.

43. Chen K. C., Shull B.C., Moses E. A., Lederman M., Stout E. R., Bates R. C. Complete nucleotide sequence and genome organization of bovine parvovirus. Journal of Virology, 60, 1085- 1097, 1986r

44. Christensen J., Tattersall P. Parvovirus initiator protein NS1 and RPA coordinate replication fork progression in a reconstituted DNA replication system. Journal of Virology 76, №136 6518-6531, July 2002.

45. Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome pathway: on.protein death and cell life. The EMBO Journal 17, № 24, 7151 7160, 1998.

46. Clemens, K.E.; Pintel, D.J. The two transcription units of the autonomous parvovirus Minute Virus of Mice are transcribed in a temporal order. Journal of Virology 62, № 4, 1448 1451, Apr. 1988.

47. Clemens, K.E.; Pintel, D.J. Minute Virus of Mice mRNAs are predominately polyadenilate at a single site. Virology 160, № 2, 511 514, Oct. 1984.

48. Cohen S., Behzad A. R., Carroll J. B., Pante N. Parvovirus nuclear import: bypassing the host nuclear-transport machinery. Journal of General Virology 87, 3209 — 3213, 2006.

49. Cotmore S. F., Christensen J., Niiesch J. P. F., Tattersall P. The NS1 polypeptide of the murine parvovirus Minute Virus of Mice binds to DNA sequences containing the motif ACCA.2-3. Journal ofVirolgy 69, 1652 1660, 1995.

50. Cotmore S. F., D'Abramo Jr. A.M., Ticknor C. M., Tattersall P. Controlled confoimational transitions in the MVM virion exposes VP1 N-terminus and viral genome without particle disassembly. Virology 254, № 1, 169 181, Febr. 1999.

51. Cotmore S. F., Tattersall P. The NS-1 polypeptide of Minute Virus of Mice is covalently attached to the 5'-termini of duplex replicative form DNA and progeny single strands. Journal of Virology 62, № 3, 851 869, Mar. 1989.

52. Cotmore S. F., Tattersall P. A genome-linked copy of the NS-1 polypeptide is located on the outside of infectious parvovirus particles. Journal of Virology 63, № 9, 3902 — 391 1, Sept. 1989.

53. Cotmore S. F., Tattersall P. As ymmetric resolution of a parvovirus palindrome in vitro. Journal of virology 61, 1579- 1589, 1993.

54. Cotmore S. F., Tattersall P. An asymmetric nucleotide in the parvoviral 3' hairpin directs segregation of a single active origin of DNA replication. The EMBO Journal 13, № 17, 4145 — 4152, 1994.

55. Cotmore S.F., Tattersall P. Parvovirus DNA replication. In «DNA replication in eucariotic cells» (M. DePamphilis, ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1996.

56. Cotmore S. F., Tattersall P. Resolution of parvovirus dimmer junction proceeds through a novel heterocruciform intermediate. Journal of Virology 77, № 11, 6245 6254, June. 2003.

57. Croizier L., Jousset F.-X., Veyrunes J.-C., Lopez-Ferber M., Bergoin M., Croizier G. Protein requirements for assembly of virue-like particles of Junonia coenia densovirus in insect cells. Journal of General Virology 81, 1605 — 1613, 2000.

58. Curran J. and Kolahofsky D. Scanning independent ribosomal initiation of the Sendai virus Y proteins in vitro and in vivo. EMBO Journal 8, № 2, 521 526, 1989.

59. Danilevskaya O. N., Traverse K. N., Hogan N. C., DeBaryshe P.G., Pardue M. L. The two Drosophila telomeric transposable elements have very different patterns of transcription. Molecular and cellular Biology 19, № 1, 873 881, Jan. 1999.

60. Deiss V., Tratschin J. D., Weitz M., Siegl G. Cloning of the human parvovirus B19 genome and structural analysis of its palindromic termini. Virology, 175, 246 254, 1990.

61. Dhar A. K., Kaizer K. N., Lakshman D. K. Transcriptional analysis of Penaeus stylirostris densovirus genes. Virology 402, № 1, 112 — 120, June 2010.

62. Ding, C.; Urabe, M.; Bergoin, M.; Kotin, R.M. Biochemical Characterization of Junonia coenia Densovirus Nonstructural Protein NS-1. Journal of Virology 76, № 1, 338-345, Jan. 2002.

63. Doerig Ch., Hirt B., Antonietti J.-P., Beard P. Nonstructural protein of parvoviruses B19 and Minute Virus of Mice controls transcription. Journal of Virology 64, № 1, 387 396, 1990.

64. Doerig Ch., Hirt B., Beard P., Antonietti J.-P. Minute Virus of Mice non-structural protein NS-1 is necessary and sufficient for /nm^-activation of the viral p39-promoter. Journal of General Virology 69, 2463 2573, 1988.

65. Douar A.-M., Poulard K., Stockholm D., Danos O. Intracellular trafficking of Adeno-associated virus vectors: routing to yhe late endosomal compartment and proteasomc degradation. Journal of Virology 75, № 4, 1824 1833, Febr. 2001.

66. Duan D., Li Q., Kao A.W., Yue Y., Pessin J. E., Engelhardt J! F. Dinamin is required for recombinant Adeno-associated virus type 2 infection. Journal of Virology 73, № 12, 10371 -10376, Dec. 1999.

67. Duan D., Yue Y., Yan Z., Yang J., Engelhardt J. F. Endosomal processing limits gene transfer to polarized airway epithelia by adeno-associated virus. Journal of Clinical Investigation 105, № 11, 1573 1587, June 2000.

68. Dudleenamjil E., Lin C. Y., Dredge D., Murray B. K., Robinson R. A., Johnson F. B. Bovine parvovirus used clathrin-mediated endocytosis for cell entry. Journal of General virology Sept. 2010 doi: 10.1099/vir.0.024133-0.

69. Dumas, B.; Jourdan, M.; Pascaud, A.-M.; Bergoin, M. Complete nucleotide sequence of the cloned infectious genome of Junonia coenia densovirus reveals on organization unique among parvoviruses. Virology 191, № 1, 202-222, Nov. 1992.

70. Dunigan D. D., Dietzgen R. G., Schoelz J. E., Zaitlin M. Tobacco mozaic virus particles comtain uiquitinated coat protein subunits. Virology 165, 310 — 312, 1988.

71. Eichwald V., Daeffler L., Klein- M., Rommelaere J., Salome N. The NS2 proteins of parvovirus Minute virus of mice are required for efficient nuclear egress of progeny virions in mouse cells. Journal of Virology 16, № 20; 10307 10319, Oct. 2002.

72. El-Far M., Li Y., Fediere G., Aol-Ela S., Tijssen P.' Lack of infection of vertebrate cells by densovirus from maize worm Mythimna lorei (A//DNV). Virus Research 99,' 17 24, 2004.

73. Enemark E. J. and Joshua-Tor L. On helicases and other motor proteins. Current Opinions in Structural Biology 18, № 2, 243 257, Apr. 2008.

74. Farr G. A., Cotmore S. F., Tattersall P. VP2 cleavage and leucine ring at the base of the fivefold cylinder control pH-dependent externalization of both the VP1 N terminus and genome of Minute Virus of Mice. Journal of Virology 80, № 1, 161 171.

75. Farr G. A., Zhang Li-guo, Tattersall P. Paroviral virions deploy a capsid-tethered lipolitic enzyme to breach the endosomalmembrane during cell entry. PNAS 102, № 47, 17148 — 17153, Nov. 2005.

76. Farris K. D. and Pintel D. Adeno-associated virus type 5 utilizes alternative translation initiation,to encode a small Rep40-like protein. Journal of Virology 84, № 2, 1193 1197, Jan: 2010.

77. Fediere, G. Epidemiology and pathology of Densovirinae. In «Parvoviruses. From Molecular Biology to Pathology and Therapeutic Uses» (Faisst S. Rommelaere J, Ed.). Contributions to microbiology. Basel, Karger, 4, 1-11, 2000.

78. Fediere, G.; El-Far, M.; Li, Y.; Bergoin, M.; Tijssen, P. Expression strategy of densonucleosis virus from Mythimna loreyi. Virology 320, № 1, 181-189, Mar. 2004.

79. Fediere, G.; Li, Y.; Zadori, Z.; Szelei, J.; Tijssen, P. Genome Organization of Casphalia extranea Densovirus, a New Iteravirus. Virology 292, № 2, 299-308, Jan. 2002.

80. Feinberg, A.P.; Vogelstein, B. A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Analytical Biochemistry 132, №1, 6-13, Jul. 1983.

81. Feinberg, A.P.; Vogelstein, B. «A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity». Addendum. Analytical Biochemistry 137, №1, 266-267, Feb: 1984.

82. Finnegan, E.J.; Matzke, M.A. The small RNA world. Journal of Cell Science 116, 46894693,2003.

83. Flotte T. R*. and Carter B. J. Adeno-associated virus vectors for gene theropy. Gene Therapy 2,357-362,1995.

84. Fox J. M. and Bloom M. E. Identification of the cell surface protein from Crandell feline kidney cells that specifically binds Aleutian Mink Decease Parvovirus. Journal of Virology 73, № 5, 3835 3842, May 1999.

85. Futterer J., Kiss-Laszlo Z., Hohn J. Nonlinear ribosome migration on cauliflower mosaic virus 35S RNA. Cell 73, № 4, 789 802, May 1993.

86. Gai D., Xhao R., Li D., Finkielstein C. V., Chen X. S. Mechanisms of conformational change for a replicative hexameric helicase of SV40 Large Tumor Antigen. Cell 119, 47 60, Oct. 2004.

87. Giraud, C.; Devauchelle, G.; Bergoin, M. The densovirus of Junonia coenia (Jc DNV) as an insect cell expression vector. Virology 186, № 1, 207-218, 1992.

88. Gorziglia, M.; Botero, L.; Gil, F.; Esparza, J. Preliminary characterization of vhus-like particles in a mosquito (Aedes pseudoscutellaris) cell line (Mos. 61). Intervirology 13, № 4, 232-240, 1980.

89. Gottwein E., Jäger S., Habermann A., Kräusslich H.-G. Cumulative mutations of ubiquitin acceptor sites in Human Immunodeficiency Virus type 1 Gag cause a late budding defect. Journal of Virology 80, № 13, 6267 6275, July 2006.

90. Green, M.R.; Lebovitz, R.M.; Roeder, R.G. Expression of the autonomous parvovirus HI genome: evidence for a single transcriptional unit and multiple spliced polyadenilated transcripts. Cell 17, 967-977, Aug. 1979.

91. Green M. R., Roeder R. G. Transcripts of Adeno-associated virus genome: mapping of the major RNAs. Journal of Virology 36, № l, 79 92, Oct. 1980.

92. Grieger J. C., Snowdy S., Samulski R. J. Separate basic region motifs within the Adeno-associated virus capsid proteins are essential for infectivity and assembly. Journal of Virology 80, № 11,5199-5210, June 2006.

93. Gross, O.; Tal, J. Expression of the insect parvovirus GwDNV in vivo: the structural and nonstructural proteins are encoded by opposite DNA strands. Journal of Invertebrate Pathology 75, 126-132, 2000.

94. Gross O., Tijssen P., Weinberg D., Tal J. Expression of densonucleosis virus G/;/DNV in Galleria mellonella larvae: size analysis and in vitro translation of viral transcription products. Journal of Invertebrate Pathology 56, № 2, 175 180, 1990.

95. Guo H., Zhang J., Hu Y. Complete sequence and organization of Periplaneta fuliginosa densovirus genome. Acta Virologica 44, 315 322, 2000.

96. Hafenstein S., Palermo M. L., Kostyuchenko V., A., Xiao Ch., Morais M. C., Nelson C. D. S. et al. Asymmetric binding of transferrin receptor to parvovirus capsid. PNAS 104, № 16, 6585 6589, Apr. 2007.

97. Hamilton, A.J.; Baulcombe, D.C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science 286, 950-952, Oct. 1999.

98. Harbison C. E., Lyi S. M., Weichert W. S., Parrish C. R. Early Stepps in cell infection by parvoviruses: host-specific differences in cell receptor binding but similar endosomal trafficking. Journal of Virology 83, № 20, 10504 10514, Oct. 2009.

99. Hayakawa T., Asano S., Sahara K., Iizuka T., Bando H. Detection of leplicative intermediate with closed terminus of Bombyx densonucleosis virus. Archives of Virology 142, 393-399, 1997.

100. Hazelwood D., Zaitlin M. Ubiquitinated conjugates are found in preparations of several plant viruses. Virology 177, 352 356, 1990.

101. Hickman A.B., Ronning D. R., Kotin R. M., Dyda F. Structural unity among viral origin binding proteins: crystal structure of the nuclease domain of Adeno-Associated Virus Rep. Molecular cell 10, 327 337, Aug. 2002.

102. Hickman A.B., Ronning D. R., Perez Z.N., Kotin R. M., Dyda F. The Nuclease Domain of Adeno-Associated Virus Rep Coordinates Replication Initiation Using Two Distinct DNA Recognition Interfaces. Molecular cell 13, 403 414, Feb. 2004.

103. Hingamp P. M., Leyland M. L., Webb J., Twigger S., Mayer R. J., Dixon L. K. Characterization of a uiquitinated protein which is externally located in African Swine Fever Virions. Journal of Virology 69, № 3, 1785 1793, Mar. 1995.

104. Hu L., Zhang L., Shen C., Lu J., Zhang J., Hu Y. The densovirus of Periplaneta fuliginosa (P/DNV) as an insect vector for peisistent foreign gene expression in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communicaions 358, № 4, 976 982, July 2007.

105. Hu, Y.; Zheng, J.; Iizuka, T.; Bando, H. A densovirus newly isolated from the smoky-brown cockioach Periplaneta fuliginosa. Brief report. Archives of Virology 138, № 3-4, 365-372, 1994.

106. Isaacson M. K. , Ploegh H. L. Ubiquitination, ubiquitin-modifiers, and deubiquitination in viral infection .Cell Host & Microbe 5, 559 570, June 2009.

107. Jadwin J. A., Rudd V., Sette P., Challa S., Bouamr F. Late-domain independent rescue of a release-deficient Moloney Murine Leukemia Virus by the ubiquitin-ligase Itch. Joumaloj Virology 84, № 2, 704 715, Jan. 2010.

108. James J. A., Aggarwal A. K., Linden R. M., Escalante C. R. Structure of adeno-associated virus type 2 Rep40-ADP complex: Insight into nucleotide recognition and catalysis by superfamily 3 helicases. PNAS 101, № 34, 12455-12460, Aug. 2004.

109. James J. A., Escalante C. R., Yoon-Robarts M., Edwards T. A., Linden R. M., Aggarwal A. K. Crystal Structure of the SF3 Helicase from Adeno-Associated Virus Type 2. Structure 11, 1025- 1035, Aug. 2003.

110. Jiang, H.; Zhang, J.M.; Wang, J.P.; Yang, B.; Liu, C.F.; Lu, J.; Hu, Y.Y. Genetic engineering of Periplaneta fuliginosa densovirus as an improved biopesticide. Archives of Virology 152, № 2, 383-394, Feb. 2007.

111. Jiang J., Horowitz D. S., Xu R.-M. Crystal structure of the functional domain of the splicing factor Prpl8. PNAS 97, № 7, 3022 3027, Mar. 2000.

112. Johnson F. B., Fenn L. B., Owens T. J., Faucheux L. J., Blackburn S. D. Attachment of Bovine parvovirus to sialic acids on bovine cell membranes. Journal of General virology 85, 2199-2207,2004.

113. Jongeneel C.V.; Sahli R.; McMaster G.K., Hirt, B. A precise map of splice junctions in the mRNAs of Minute Virus of Mice, an Autonomous Parvovirus. Journal of Virology 59, №3, 564-573, Sept. 1986.

114. Joshi A., Munshi U., Ablat S. D., Nagashima K., Free E. O. Functional replacement of a retroviral late domain by ubiquitin fusion. Traffic 9, 1972 1983, 2008.

115. Jourdan M., Jousset F. X., Gervais M., Skory S., Bergoin M., Dumas B. Cloning of the genome of a densovirus and rescue of infectious virions from recombinant plasmid in the insect host Spodoptera littoralis. Virology 179, 403 409, 1990.

116. Jousset F.X., Baquerizo E., Bergoin M. A new densovirus isolated from the mosquito Culex pipiens (Diptera: Culicidae). Virus Research 67, № 1, 11-16, Mar. 2000.

117. Jousset F. X., Barreau C., Boublik Y., Cornet M. A parvo-like virus persistently infecting a C6/36 clone of Aedes albopictus mosquito cell line and pathogenic for Aedes aegypti larvae. Virus Research 29, № 2, 99 114, Aug. 1993.

118. Kadonaga J. T. The DPE, a core promotor element for transcription by RNA polymerase II. Experimental and Molecular medicine 34, № 4, 259 — 264, Sept. 2002.

119. Kawase S, Kurstak E. Parvoviridae of invertebrates: Densonucleosis viruses. In "Viruses of Invertebrates" (ed. Kurstak E.), 315 343, Dekker, New York, 1991.

120. Kanlaya R., Pattanakitsakul Sa-nga, Sinchaikul S, Chen S.-T., Thongboonkerd V. The Ubiquitin-Proteasome Pathway Is Important for Dengue Virus Infection in Primary Human Endothelial Cells. Journal ofProteome Research9, № 10, 4960 4871, 2010.

121. Kaspari M., Tavalai N., Stamminger T., Zimmermann A , Schilf R., Bogner E. Proteasome inhibitor MG132 blocks viral DNA replication and assembly of human cytomegalovirus. FEBS Letters, 582, № 5, 666-672, Mar. 2008.

122. Kaufmann B., Bowman V. D:, Li Y., Szelei J., Waddell P. J., Tijssen P., Rossmann M. G. The structure of Penaeas stylirostris Densovirus, a shrimp, pathogen. Journal of Virology 2010, doi:10.1128/JVI.01240-10.

123. Kaufmann B., El-Far M., Plevka P., Bowman V. D., Tissen P., Rossmann MJ." G. Structure of Bombyx mori densovirus 1, a silkworm pathogen. Journal of virology 85, № 10, 4691 — 4697, May 2011.

124. Kelly D.C., Elliott R.M. Notes: Polyamines contained by two densonucleosis viruses. Journal of Virology 21, № 1, 408-410, Jan. 1977.

125. Kersher O., Felberbaum R., Ilochstrasser M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Annual Review of Cell and Developmental Biology 22, 159 180, 2006.

126. Kidokoro K., Ito K., Ogoyi D. O., Abe H., Mite K., Kadono-Okuda K. Non-susceptibility genes to Bombyx densovirus type 1, Nid-1 and nsd-1, affect distinct steps of the viral infection pathway. Journal of Invertebrate Pathology 103, 79-81, 2010.

127. Kimmick, M.W.; Afanasiev, B.N.; Beaty, B.J.; Carlson, JiO. Gene expression and regulation from the p7 promoter of Aedes densonucleosis virus. Journal of Virology 72, №5, 4346-4370, May 1998.

128. Kittayapong, P.; Baisley, K.J; O'Neill, S.L. A mosquito densovirus infecting Aedes aegypti and Aedes albopictus from Thailand. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 61, №4, 612-617, 1999.

129. Koczot F.J., Carter B. J., Garon C. F., Rose J. A. Self-complementarity of terminal sequences within plus or minus strands of adeno-associated virus DNV. PNAS, 70, 215-219, 1973.

130. Kogan P. H., Chen X., Blissard G. V. Overlapping TATA-dependent and TATA-independent early promoter activities in the baculovirus gp64 envelope protein fusion gene. Journal of Virology 69, 1452 1461, 1995.

131. Kouassi N., Peng J.-x., Li Y., Cavallaro Ch., Veyrunes J.-C., Bergoin M. Pathogenicity of Diatrea saccharalis densovirus to host insects and characterization of its viral genome. Virologica Sinica 22, № 1, 53 60, Feb. 2007.

132. Kurtti, T. J.; Brooks, M.A. Isolation of cell lines from embryos of the cockroach, Blattella germanica. In Vitro 13, №1,11-17, Jan. 1977.

133. Kutach, A.K.; Kadonaga, J.T. The downstream promoter element DPE appears to be as widely used as the TATA-box in Drosophila core promoters. Molecular and Cellular Biology 20, № ¡3,4754-4764, 2000.

134. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, № 5259, 680-685, Aug. 1970.

135. La Fauce K. A., Elliman J., Owens L. Molecular characterization of hepatopancreatic parvovirus (PmergDNV) from Australian Penaeus merguiensis. Virology 362, 397 403, 2007.

136. Lebovitz R. M., Roeder R. G. Parvovirus H-l expression: mapping of the abundant cytoplasmic transcripts and identification of promoter sites and overlapping transcription units. Journalof Virology 58, № 2, 271 280, May 1986.

137. Li, H.-W.; Ding, S.-W. Antiviral silencing in animals. FEBS Letters 579, № 26, 5965-5973, Oct. 2005.

138. Li Z., He J., Huang X., Dai A., Cheng L., Shao D., Zhang J. The truncated virus-like particles of c6/36 cell densovirus: implications for the assembly mechanism of Brevidensovirus. Virus Research 132, 248 252, 2008.

139. Li, H.; Li, W. X.; Ding, S. W. Induction and suppression of RNA silencing by animal virus. Science 296, № 5571, 1319-1321, May. 2002.

140. Li M., Guo Q., Hou C., Miao X., Xu A., Guo X., Huang Y. Linkage and mapping analyses of the densonucleosis non-susceptible gene nsd-Z in the silkworm Bombyx mori using SSR markers. Genome, 49, 397 402, 2006.

141. Li G., Sun C., Zhang J., He Y., Chen C., Kong J., Huang G., Chen K., Yao Q. Characterization of Bombyx mori parvo-like virus non-structural protein NS-1. Virus Genes 39,396-402, 2009.

142. Li X., Rhode S. L. 3rd. Nonstructural protein NS2 of parvovirus H-l is required for efficient viral protein synthesis and virus production in rat cells in vivo and in vitro. Virology 184, № 1, 117-130, Sept. 1991.

143. Li, Y:; Zadori, Z.; Bando, H.; Dubuc, R.; Fediere, G.; Szelei, J.; Tijssen, P. Genome organization of the densovirus from Bombyx mori (BmDNV-1) and enzyme activity of its capsid. Journal of General Virology 82, № 11, 2821-2825, Nov. 2001.

144. Lingel A., Simon B., Izaurralde E., Sattler M. The structure of the flock house virus B2 protein, a viral suppressor of RNA interference, shows a novel mode of double-stranded RNA recognition. EMBO 6, № 12, 1149 1155, 2005.

145. Linser P., Bruning H., Armentrout A. V. Specific binding sites for a parvovirus, Minute Virus of Mice, on cultured mouse cells. Journal of Virology 24, № 1,211 221, Oct. 1977.

146. Linser P., Bruning H., Armentrout A. V. Uptake of Minute Virus of Mice into cultured rodent cells. Journal of Virology 31, № 2, 537 545, Aug. 1979.

147. Lorson C., Burger L. R., Mouw M., Pintel D. J. Efficient transactivation of the Minute Virus of Mice P38 promotor requires upstream binding of NS1. Journal of Virology 70, № 2, 834 — 842, Feb. 1996.

148. Lu, R.; Maduro, M.; Li. F.; Li, H.W.; Broitman-Maduro, G.; Li, W.X.; Ding, S.W. Animal virus replication'and RNAi-mediated antiviral silencing in C.elegans. Nature 436, № 7053, 1040-1043, Aug. 2005.

149. Luo W. and Astell C. R. A novel protein encoded by small RNAs of parvovirus B19. Virology 195, 448-455, 1993.

150. Lusby E., Fife K. H., Berns K. I. Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA. Journal of Virology, 34, 402 409, 1980.

151. Manteufel J. & Truyen U. Animal bocaviruses: a brief review. Intervirology, 51, 328 334, 2008.

152. Maroto B., Valle N., Saffrich R., Almendral J. M. Nuclear export of the nonenveloped parvovirus virion is directed by an unordered protein signal exposed on the capsid surface. Journal of Virology 78, № 19, 10685 10694, Oct. 2004.

153. Mayo, M.A. Changes to virus taxonomy 2004. Archives of Virology 150, 189 -198, 2005.

154. Meynadier, G.; Vago, C.; Plantevin, G.; Atger, P. Viiose d'un type inhabituel chez le lepidoptere Gallería mellonella L. Rev Zool Agrie Appl 63, 207-209, 1964.

155. Miller C. L. & Pintel D. J. Interaction between Parvovirus NS2 protein and nuclear export factor Crml is important for viral egress from the nucleus of murine cells. Journal of Virology 76, № 7, 3257 3266, Apr. 2002.

156. Molitor, T.W.; Joo, H.S.; Collett, M.S. Identification and characterization of a Porcine Parvovirus nonstructural polypeptide. Journal oj Virology 55, № 3, 554-559, Sept. 1985.

157. Mosesson Y., Yarden Y. Monoubiquitylation: a recurrent theme in membrane protein transport. IMAJ8,233 237, Apr. 2006.

158. Mukha, D.V.; Ghumachenko, A.G.; Dykstra, M.J.; Kurtti, T.J.; Schal, C. Characterization or a new densovirus infecting the German cockroach, Blattella germanica. Journal of General Virology SI, № (Pt6), 1567-1575, Jun 2006.

159. Munderloh, U.G.; Kurtti, T.J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & applied acarology 7, № 3,219-229, Aug 1989.

160. Naeger L. K., Salome N., Pintel D. J. NS2 Is Required for Efficient Translation of Viral mRNA in Minute Virus of Mice-Infected Murine Cells. Journal of Virology 67, № 2, 1034 -1043, Feb. 1993.

161. Nakagaki M., Kawase S. DNA of a New Parvo-like virus isolated from the silkwoim, Bombyx mori. Journal of Invertebrate Pathology 35, 124— 133, 1980.

162. Nakagaki, M. and S. Kawase. Structural proteins of densonucleosis virus isolated from the silkworm, Bombyx mori, infected with the flacherie virus. Journal of Invertebrate Pathology. 36, 166-171, 1980.

163. Nam H-J., Gurda-Whitaker B., Gan W. E., Ilaria S., McKenna R., Mehta P., Alvarez R. A., Agbandje-McKenna R. Identification of sialic acid structures recognized by Minute Virus of

164. Mice and the role of binding affinity in virulence adaptation. Journal of Biological Chemistry 281, № 35,25670 25677, Sept. 2006.

165. Nash K., Chen W., MuzyczkaN. Complete in vitro reconstitution of Adeno-associated virus DNA replication requires the Minichromosome maintaining complex proteins. Journal of Virology 82, № 3, 1458 1464, Feb. 2008.

166. Ogoyi D. O., Kadono-Okuda K., Eguchi R., Furuta Y., Hara W., Nguu E. K., Nagayasu K. Linkage-and mapping analysis of a non-susceptibility dene to densovirus (nsd-2) in the silkworm, Bambyx mori. Insect molecular biology, 12, № 2, 117 — 124, 2003.

167. O'Neill, S.L.; Kittayapong, P.; Braig, H.R.; Andreadis, T.G.; Gonzalez, J.P. Insect densoviruses may be widespread in mosquito cell lines. Journal of General Virology 76, 2067-2074,1995.

168. Ott D.E., Coren L. V., Chertova E. N., Gagliardi T., Schubert U. Ubiquitination of HIV 1 and Mu-LV gag. Virology 278, 111 -121, 2000.

169. Ott D. E., Coren L. V., Sowder R.S. 2nd, Adams J., Nagashima K., Shubert U. Equine infectious anemia virus and the ubiquitin-proteasome system. Journal of Virology 76, № 6, 3038-3044, Mar. 2002.

170. Ozawa, K.; Ayub, J.; Yu-Shu, H.; Kurtzman, G.; Shimada, T.; Young, N. Novel transcription map for the B19 (Human) pathogenic parvovirus. Journal of Virology 61, № 8, 2395-2406, Aug. 1987.

171. Parker J. S. L., Murphy W. J., Wang D., O'Brien S. J., Parrish C. R. Canine and Feline Parvoviruses can use human or feline transferrin receptors to bind, enter, and infect cells. Journal of Virology, 75, № 8, 3896 3902, Apr. 2001.

172. Parker J. S. L. and Parrish C. R. Cellular uptake and infection by Canine parvovirus involves rapid dynamin-regulated clathrin-mediated endocytosis followed by slower intracellular trafficking. Journalof Virology 74, № 4, 1919 1930, Feb. 2000.

173. Paterson A., Robinson E., Suchman E., Afanasiev B., Carlson J. Mosquito densonucleosis viruses cause dramatically different infection phenotypes in the C6/36 Aedes albopictus cell line. Virology 337, 253 261, 2005.

174. Patnaik A., Chau V., Wills J. W. Ubiquitin is part of the retrovirus budding machinery. PNAS 91, № 24, 13069-13074, Nov. 2000.

175. Pattanakitsakul S. N., Bonnak K., Auethavornanan K., Jairungsrl A., Duangjinda T.,

176. Puttatesk P., Thongrungkiat S., Malasit P. A new densovirus isolated from the mosquito Toxorhynchites splendens (Wiedemann) (Diptera: Cullicida). Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health 38, № 2, 283 293, Mar. 2007. . .

177. Pintel D., Dadachanji D., Astell G. R., Ward D. C. The genome of Minute Virus of Mice, an autonomous parvovirus, encodes two overlapping transcription units. Nucleic Acid Research 11, №4, 1019-1038, 1983.

178. Pooggin, M.M.; Hohn, T. Fighting geminiviruses by RNAi and vice versa. Plant Molecular biology 55, 149-150,2004.

179. Purnell B. A., Emanuel P. A., Gilmour P. S. TFIID sequence recognition of the initiator downstream in Drosophila class II genes. Genes & Development 8, № 7, 830 842, Apr. 1994.

180. Qing K., Mah C., Hansen J., Zhou S., Dwarki V., Srivastava A. Human fibroblast growth factor receptor 1 is a co-receptor for infection by adeno-associated virus 2. Nature medicine 5, № 1, 71-77, Jan. 1999.

181. Qiu, J., Cheng, F., Burger, L.R., Pintel, D. The transcription profile of Aleutian Mink Disease Virus in CRFK cells is generated by alternative processing or pre-mRNAs produced from a single promoter. Journal of Virology 80, № 2; 654-662, Jan. 2006.

182. Qiu J., Cheng F., Johnson F. B., Pintel D. The transcription profile of the Bocavirus Bovine parvovirus is unlike those previously characterized parvoviruses. Journal of Virology 81, № 21, 12080 12085, Nov. 2007.

183. Qiu J., Cheng F., Pintel D. Expression profiles of bovine adeno-associated virus and avian adeno-associated virus display significant similarity to that of adeno-associated virus type 5. Journal of Virology 80, № 11, 5482 5493, Jun. 2006.

184. Qiu J., Cheng F., Pintel D. The abundant R2 mRNA generated by Aleutian Mink Desease Parvovirus is tricistronic, encoding NS2, VP1, and VP2. Journal of Virology 81, № 13, 6993 -7000, July 2007.

185. Qu X. W., Liu W. P., Qi Z. Y., Duan Z. J., Zheng L. S., Kuang Z. Z., Zhang W. J., Hou Y. D. Phospholipase A2-like activity of human bocavirus VP1 unique region. Biochemical and biophysical research communications 365, № 1, 158 — 163, Jan. 2008.

186. Remm M., Remm A., Ustav M. Human Papillomavirus type 18 El protein is translated from polycistronic mRNA by a discontinuous scanning mechanism. Journal of Virology 73, № 4, 3062-3070, Apr. 1999.

187. Rhode S. L. III. 7><ms-activation of parvovirus p38 promoter by 76K nucleocapsid protein. Journal of Virology 55, 886 889, 1985.

188. Rhode S. L. Ill & Klaassen B: DNA sequence of the 5'-terminus containing the replication origin of parvovirus replicative form DNA. Journal of Virology, 41, № 36 990 999, Mar. 1982.

189. Ren X., Hoiczyk E., Rasgon J. L. Viral paratransgenesis in the malaria vector Anopheles gambia. PLOSpathogens, 4, № 8, 1 8, Aug. 2008.

190. Reverter D. and Lima C. D. A basis for SUMO protease specificity provided by analysis of human senp2 and senp2-SUMP complex. Structure 12, 1519- 1531, 2004.

191. Ros C., Burkhardt Ch. J., Kempf Ch. Cytoplasmic trafficking of Minute Virus of Mice: low-pH requirement, routing to late endosomes, and proteasome interaction. Journal of Virology 16, № 24, 12634 12645, Dec. 2002.

192. Ros C., Kempf C. The ubiquitin-protesome machinery is essential for nuclear transloction of incoming Minute Virus of Mice. Virology 324, 350 — 360, 2004.

193. Rose J. A., Berns K. I., Hoggan M. D., Koczot F. J. Evidence for a single-stranded adenovirus-associated virus genome: formation of a DNA density hybrid on release of viral DNA. PNAS, 64, 863 869, 1969.

194. Ruiz Z., Mihaylov I. S., Cotmore S. F., Tattersal P. Recruitment of DNA replication and damage response proteins to viral replication centers during infection with NS2 mutants of Minute Virus of Mice (MVM). Virology 410, № 2, 375 384, Febr. 2011.

195. Ryabov E. V., Keane G., Naish N., Evered C., Winstanley D. Densovirus induces winged morphs in asexual clones of the rosy apple aphid, Dysaphis plantaginea. PNAS, 106, № 21, 8465 8470, May 2009.

196. Safeena M. P., Tyagi A., Rai P., Karunasagar I., Karunasagar I. Complete nucleic acid sequence of Penaeus monodon densovirus (PmDNV) from India. Virus research 150, №1 2, 1 — 11, Jun. 2010.

197. Sanger, F.; Nicklen, S.; Coulson, A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74, № 12, 5463-5467, Dec. 1977.

198. Sambrook, J.; Fritsch, E.F.; Maniatis, T. Molecular cloning. A laboratory manual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

199. Sanders C. M., Kovalevskiy O. V., Sizov D., Lebedev A.A., Isupov M. N., Antson A. A. Papillomavirus El helicase assembly maintains an asymmetric state in the absence of DNA and nucleotide cofactors. Nucleic Acids Research 35, № 19, 6451 6457, 2007.

200. Schwarz O., Marechal V., Friguet B., Arenzana-Seisdedos F., Heard J.-M. Antiviral activity of the proteasome on incoming Human Immunodeficiency Virus type 1. Journal of Virology 75, № 5, 3845 3850, May 1998.

201. Seisenberger G., Ried M., Endress T., Buning H., Hallek M., Brauchle Ch. Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of a Adeno-associated virus. Science 294, № 5548, 1929-1932, Nov. 2001.

202. Sen N., Cao F., Tavis J. E. Translation of Duck Hepatitis B Virus reverse transcriptase by Ribosomal shunting. Journal of Virology 78, № 21, 11751 11757, 2004.

203. Shen L., Tatham M. H., Dong C., Zagorska A., Naismith J. H., Hay R. T. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond. Nature Structure&Molecular Biology 13, № 12, 1069 1077, Dec. 2006.

204. Shih S.C., Piag G., Francis S. A., Sutanto M. A., Hurley J. H., Hicke L. A ubiquitin-binding motif required for intramolecular monoubiquitylation, the CUE domain. The EMBO Journal 22, №6, 1273- 1281,2003.

205. Shike, H.; Dhar, A.K.; Burns, J.C.; Shimizu, C.; Jousset, F.X.; Klimpel, K.R.; Bergoin, M. Infectious Hypodermal and Hematopoetic Necrosis Virus of Shrimp is related to Mosquito Brevidensoviruses. Virology 277, № 1, 167-177, Nov. 2000.

206. Shirk P. D., Bossin H., Furlong R. B., Gillett J. L. Regulation of Junonia coinia densovirus P9 promoter expression. Insect Molecular Biology 16, № 5, 623 633, Oct. 2007.

207. Siegel G & Gautschi M. Multiplication of Parvovirus LuIII in a synchronized culture system. Journal of Virology, 17, № 3, 841 853, Mar. 1976.

208. Simpson A. A., Chipman P. R., Baker T. S., Tijssen P., Rossmann M. G. The structure of an insect parvovirus (Galleria mellonella densovirus) at 3.7°A resolution. Structure 6, № 11, 1355- 1367, Nov. 1998.

209. Singer I. I. & Rhode S. L. Replication process of the parvovirus H-l. VII. Electron microscopy of replicative form DNA synthesis. Journal of Virology, 21, 713 723, 1977a.

210. Sivaram A., Barde P. V., Kumar S. R. P., Yadav P., Gokhale M. D., Basu A., Mourya D. T. Isolation and characterization of Densonucleosis virus from Aedes aegypti mosquitocsand its distribution in India. Intervirology 52, 1 —7, 2009.

211. Smale S. T., Baltimore D. The initiator as transcription control element. Cell 57, 103 — 113, 1989.

212. Spear I. S., Fife K. I., Hauswirth W. W., Jones C. J., Berns K. I. Evidence for two nucleotide sequence orientations within the terminal repetition of Adeno-associated viius DNA. Journal of Virology, 24, № 2, 627 634, 1977.

213. Srivastava R. A. K. Analysis of RNA by Northern blotting using riboprobes. In "RNA isolation and characterization protocols", Rapley R. and Manning D. L. Methods in molecular biology, 86, 103-112, 1998.

214. St Amand J. and Astell C. R. Identification and characterization of a family of 11-kDa proteins encoded by the human parvovirus B19. Virology 192, 121-131, 1993.

215. Straus S. E., Sebxing E., Rose J. Concatemers of alternating plus and minus strands are intermediates in adenovirus-associated virus DNA synthesis. PNAS, 73, 742 746, 1976.

216. Suikkanen S , Aaltonen T., Nevalainen M., Valilento O., Lindholm L., Yuento M , Vihinen-Ranta M. Exploitation of microtubule cytoskeleton and dynein during pavoviral traffic towards the nucleus. Journal of virology 77, № 19, 10270 10279, Oct. 2003a.

217. Suikkanen S., Antila M., Jaatinen A., Vihinen-Ranta M., Vuento M. Release of canine parvovirus from endocytic vesicles. Virology 316, 267 280, 2003b.

218. Suikkanen S., Saajarvi K., Hirsimaki J., Valilehto O , Reunanen H., Vihinen-Ranta M., Vuento M. Role of the recycling endosomes and lysosomes in dynein-dependent entry of Canine parvovirus. Journal of Virology 16, № 9, 4401 4411, May 2002.

219. Sukhumsirichart W., Attasart P., Boonsaeng V., Panyim S. Complete nucleotide sequence and genomic organization of hepatopancreatic parvovirus (HPV) of Penaeus monodon. Virology 346, № 2,266 277, Mar. 2006.

220. Summerford C., Bartlett J. S., Samulski R. J. aVp5 integiin: a co -receptor for adeno-associated virus type 2 infection. Nature medicine 5, № 1, 78 — 82, Jan. 1999.

221. Summerford C. and Samulski R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated viius type 2 virions. Journal of Virology IT, № 2, 1438 1445, Feb. 1998.

222. Sun L., Chen Z. J. The novel functions of ubiquitination in signaling. Current Opinion in Cell Biology 16,119 126, 2004.

223. Sun Y., Chen A. Y., Cheng F., Guan W., Johnson F. B., Qiu J. Molecular characterization of infectious clones of the Minute Virus of Canines reveals unique features of Bocaviruses. Journal of Virology, 83, №> 8, 3956 3967, Apr. 2009.

224. Suto, C.; Kawamoto, F.; Kumada, N. A new virus isolated from the cockroach, Periplaneta fuliginosa (Serville). Microbiology and Immunology 23, №3, 207-211, 1979.

225. Tal, J; Attathom, T. Insecticidal potential of the insect parvovirus GmDNV. Archives of Insect Biochemistry and Physiology 22, 345-356, 1993.

226. Tañada, Y.; Kaya, H.K. Insect Pathology. 1993, Academic Press, Inc.

227. Tang K. F., Pantoja C. R., Lightner D. V. Nucleotide sequence of Madagaskar Hepatopancreatis Parvovirus (HPV) and comparison of genetic variation among geographic isolates. Deseases of Aquatic Animals 80,' № 2, 105 112, Jul. 2008.

228. Tattersall P., Cawte P. J., Shatkin A. J:, Ward D. C. Three structural polypeptides coded for by Minute Virus of Mice, a Parvovirus. Journal of Virology 20, № 1, 273 289, Oct. 1976.

229. Tattersall P., Ward D. C. Rolling hairpin model for replication of parvovirus and linear chromosomal DNA. Nature 263, 106 109, Sept-1976.

230. Thacker T. C. and Johnson F. B. Binding of bovine parvovirus to erythrocyte membrain cialylglycoproteins. Journal of General virology 79, 2163 2169, 1998.

231. Thao, M.L.; Wineriter, S.; Buckingham, G.; Baumann, P. Genetic characterization of a putative Densovirus from the Mealybug Planococcus citri. Current Microbiology 43, № 6, 457-458, Dec 2001.

232. Tijssen, P.; Bergoin, M. Densonucleosis viruses constitute an increasingly diversified subfamily among the parvoviruses. Seminars in Virology 6, № 5, 347-355, 1995.

233. Tijsen, P.; Kurstak, E. Biochemical; Biophysical, and Biological Properties of Densonucleosis Vims (Parvovirus). III. Common sequences of structural proteins. Journal of Virology 37, № 1, 17-23, Jan. 1981.

234. Tijssen, P.; Li, Y.; El-Far, M.; Szelei, J.; Letarte, M.; Zadori, Z. Organization and expression strategy of the ambisense genome of Densonucleosis Virus of Gallería mellonella. Journal of Virology 77, № 19, 10357-10365, Oct 2003.

235. Tijssen, P.; van den Hurk, J. and Kurstak, E. Biochemical, Biophysical, and Biological Properties of Densonucleosis Virus. I. Structural proteins. Journal of Virology 17, № 3, 686691, Mar. 1976.

236. Tijssen P., Tijssen-van der Slikke T., Kurstak E. Biochemical, biophysical, and biological properties of densonucleosis virus (paravovirus). II. Two types of infectious virions. Journalof Virology 21, № 1, 225 231, 1977.

237. Vanitharani, R.; Chellappan, P.; Fauguet, C.M. Geminiviruses and RNA silencing. Trends in Plant Science 10, № 3, 144-151, Mar. 2005.

238. Vance, V.; Vaucheret, H. RNA silencing in plants defense and counterdefense. Science 292, № 5525, 2277-2280, Jun. 2001.

239. Vashisht, K.; Faabeig, K.S.; Aber, A.L.; Brown, K.E.; O'Sullivan, M.G. Splice junction map of Simian Parvovirus transcripts. Journal of Virology 78, № 20, 10911-10919, Oct. 2004.

240. Vihinen-Ranta M., Kakkola L., Kalela A., Vilja P., Vuento M. Characterization of the nuclear localization signal of canine parvovirus capsid proteins. European Journal of Biochemistry 250, 389 394, 1997.

241. Vihinen-Ranta M., Kalela A., Makinen P., Kakkola L.,Marjomaki V., Vuento M. Intracellular route of Canine Parvovirus entry Journal oj virology 72, № 1, 802 806, Jan. 1998.

242. Vihinen-Ranta M., Suikkanen S., Parrish C. R. Pathways of cell infection by parvoviiuses and adeno-associated viruses. Minireview. Journal of Virology 78, № 13, 6709 6714, July 2004.

243. Vihinen-Ranta M., Wang D., Weichert W. C., Parrish C. R. The VP1 N-terminal sequence of Canine parvovirus affects nuclear transport of capsids and efficient cell infection. Journal of Virology 74, № 4, 1884 1891, Febr. 2002.

244. Vihinen-Ranta M., Yuan W., Parrish C. R. Cytoplasmic trafficking of the Canine parvovirus capsid and its role in infection and nuclear transport. Journal of Virology 74, № 10, 4853 — 4859, May 2000.

245. Vogt V. M. Ubiquitin in retrovhus assembly: Actor or Bystander. PNAS, 97, № 24, 12945 -12947, Nov. 2000.

246. Wang D., Yuan W., Davis I., Parrish C. R. Nonstructural Protein-2 and the Replication of Canine Parvovirus. Virology 240, № 2, 273 281, Jan. 1998.

247. Wang, X-H; Aliyari, R.; Li, W.-X.; Li, H.-W.; Kim, K.; Carthew, R.; Atkinson, P.; Ding, S.W. RNA interference directs innate immunity against viruses in adult Drosophila. Science 312, № 5772, 452-454, Apr. 2006.

248. Wang Y.-J., Chen K.-P., Yao Q., Han X. Transcriptional analysis of the DNA polymerase gene of Bombyx mori Parvo-like viius (China Isolate). The Journal of Microbiology 45, № 2, 139- 145, Apr. 2007.

249. Wang Y. J., Yao Q., Chen K. P, Wang Y., Lu J., Han X. Characterization of the genome structure of Bombyx mori densovirus (China isolate). Virus Genes 35, 103 — 108, 2007.

250. Wang, J.; Zhang, J.; Jiang, H.; Liu, C.; Yi, F.; Hu, Y. Nucleotide sequence and genomic organization of a newly isolated densovirus infecting Dendrolimus punctatus. Journal of General Virology 86, № 8, 2169-2173, Aug. 2005.

251. Ward, T.W.; Kimmick, M.W.; Afanasiev, B.N.; Carlson, J.O. Characterization of the structural gene promoter of Aedes aegypti densovirus. Journal of virology 75, №3, 1325-1331, Feb. 2001.

252. Wei B. L., Denton P. W., O'Neill E., Luo T., Foster J. L., Garcia J. V. Inhibition of Lysosome and Proteasome Function Enhances Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infection. Journal of Virology 79, № 9, 5705 5712, May 2005.

253. Weichert W.S., Parker J. S., Wahid A. T., Chang S. F., Meier E., Parrish C. R. Assaying for structural variation in the parvovirus capsid and its role in the infection. Virology 250, № 1, 106-117, Oct. 1998.

254. Welchman R. L., Gordon C., Mayer R. J. Ubiquitin and ubiquitin-like proteins as multifunctional signals. Nature Reviews Molecular Cell Biology 6, 599 — 609, Aug. 2005.

255. Widjaja I., de Vries E., Tschcrne T. M., García-Sastre A. Rottier P. J. M„ de Haan C.A.M. Inhibition of the Ubiquitin-Proteasome System Affects Influenza A Virus Infection at a Postfusion Step. Journal of virology 84, № 18, 9625 9631, Sept. 2010.

256. Wilkins, C.; Dishongh, R.; Moore, S.C.; Whitt, M.A.; Chow, M.; Machaca, K. RNA interference is an antiviral defense mechanism in Caenorhabditis elegans. Nature 436, № 18, 1044-1047, Aug. 2005.

257. Wise de Valdez M. R., Suehman E. L., Carlson J. O., Black W.C. A large scale laboratory cage trial of Aedes densonucleosis virus (/4eDNV). Journal of medical enthomology, 47, № 3, 392-399, May 2010.

258. Wodarz A. Extraction and immunoblotting of proteins from embryos. "Drosophila. Methods and protocols", Dahmann C. Methods in Molecular Biology 420, 335 345, 2008.

259. Yamagishi, J.; Hu, Y.; Zheng, J.; Bando, H. Genome organization and mRNA structure of Periplaneta fuliginosa densovirus imply alternative splicing involvement in viral gene expression. Archives of Virology! 144, № 11, 2111-2124, Sept. 1999.

260. Yang B., Cai D., Yu P., Dong X., Liu Z., Hu Z., Cao X., Zhang J., Hu Y. Non-structural proteins of Periplaneta fuliqinosa Densovirus inhibit cellular gene expression and induce necrosis in Sf9 cell cultures. Virus Genes 38, № 3, 478 486, June 2009.

261. Yang B., Zhang J., Cai D., Li D., Chen W., Jiang H., Hu Y. Biochemical characterization of Periplaneta fuliginosa densovirus non-structural protein NS1. Biochemical and Biophysical Research Communications 342, № 4, 1188 1196, Apr. 2006.

262. Yin H., Yao Q., Guo Z., Bao F., Yu W., Li J., Chen K. Expression of non-structural piotein NS-3 gene of Bombyx mori densovirus (China isolate). Journal of Genetics and Genomics, 35, 239-244, 2008.

263. Yoto Y., Qui J:, Pintel D. J. Identification and characterization of two internal cleavage and polyadenilation sites of parvovirus B 19 RNA. Journal of Virology 80, № 3, 1604 1609, Feb. 2006.

264. Zadori, Z.; Szelei, J.; Lacoste, M.-C.; Li, Y.; Gariepy, S.; Raymond, P.; Allaire, M.; Nabi, I.R.; Tijssen, P. A viral phospholipase A2 is required for parvoviral infectivity. Developmental Cell 1, № 2,291-302, Aug. 2001.

265. Zhang X. D., Zhang J. M., Guo H. T., Zhu L. H., Hu Y. Y. Rescue of infectious virions from recombinant plasmid with the genome of Periplaneta fuliginosa densovirus. Virologica Sinica 14, 152- 156.

266. Zhou, W., Zhang, J., Yang, B., Zhou, L., Hu, Y. The nuclear localization signal of the NS1 protein is essential for Periplaneta fuliginosa densovirus infection. Virus Research 145, 134 -140, 2009.

267. AAV Rep4О BgDNV NS-1 SV4 0 LTag MPOV LTag HPV60 El HPVla El BPV1 El PPV NS-1 HHV6

Информация о работе

Мартынова, Елена Уразовна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.07

Диссертация

Изучение стратегии экспрессии денсовируса рыжего таракана Blattella germanica - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Изучение стратегии экспрессии денсовируса рыжего таракана Blattella germanica ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение стратегии экспрессии денсовируса рыжего таракана Blattella germanica"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мартынова, Елена Уразовна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение стратегии экспрессии денсовируса рыжего таракана Blattella germanica"

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Мартынова, Елена Уразовна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мартынова, Елена Уразовна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение стратегии экспрессии денсовируса рыжего таракана Blattella germanica
ВАК РФ 03.02.07, Генетика