Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ структурно-функциональной организации и эволюционной изменчивости кластера рибосомных генов насекомых
ВАК РФ 03.00.15, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Анализ структурно-функциональной организации и эволюционной изменчивости кластера рибосомных генов насекомых"
На правах рукописи
МУХА
ДМИТРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ
АНАЛИЗ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ И эволюционной ИЗМЕНЧИВОСТИ КЛАСТЕРА РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ НАСЕКОМЫХ
03.00.15 • генетика
АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК
Москва -2004 год
Работа выполнена в Группе генетической инженерии животных Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН
Научный доктор биологических наук, профессор,
консультант академик РАН
Юрий Петрович Алтухов
Официальные доктор биологических наук, профессор
оппоненты: Николай Казимирович Янковский
доктор биологических наук Александр Иннокентьевич Ким
доктор биологических наук, профессор Вячеслав Залманович Тарантул
Ведущая организация: Институт биологии развития
им. Н. К. Кольцова РАН
Защита состоится_февраля 2004 года в_часов
на заседании Диссертационного совета Д002.214.01 при Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3. Факс: (095) 132-89-62
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН.
Автореферат разослан_января 2004 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук
Г. Н. Полухина
2004-4 26842
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Геном эукариот представляет собой сложноорганизованную систему генов, регуляторных и структурных элементов. Неотъемлемой частью генома любого (за исключением ряда простейших [Yao, 1982]) эукариотического организма является кластер рибосомной ДНК (рДНК), представляющий собой тандемно повторенные гены рибосомных РНК, разделенные рядом спейсерных последовательностей [Gerbi, 1985].
Молекулярно-генетическая организация рДНК различных эукариот во многом сходна, в то же время каждый вид обладает рядом структурных и функциональных особенностей, характерных для данного участка генома. С нашей точки зрения, для комплексного понимания всего разнообразия генетических процессов, лежащих в основе функциональной активности и эволюционной изменчивости живых организмов, принципиально важным является молекулярно-генетическое исследование новых, ранее не исследованных видов, то есть традиционно не являющихся "модельными".
Сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов рДНК эукариот
может рассматриваться как эффективный подход к изучению закономерностей
эволюционного процесса [Hillis & Dixon, 1991]. Характерной особенностью рДНК
является то, что различные структурные элементы данного участка генома
эволюционируют с разной скоростью. Наиболее эволюционно консервативны гены
рибосомных РНК (18S, 5.8S и 28S) - их сравнительный анализ эффективен при
исследовании генетических дистанций между эволюционно отдаленными таксонами.
Внешний и внутренние транскрибируемые спейсеры (ETS, ITS1 и ITS2)
эволюционируют более активно - их сравнительный анализ эффективен при
исследовании филогенетических взаимоотношений между близкородственными
видами. Нетранскрибируемый спейсер (NTS) является наиболее изменчивой частью
рДНК - в пределах одного генома может содержаться несколько типов NTS - анализ
изменчивости данного района рДНК, с нашей точки зрения, позволит проследить
первые этапы эволюционного процесса, то есть возникновение индивидуальных,
внутрипопуляционных и межпопуляционных генетических различий,
предшествующих возникновению нового вида. .... _ •
| РОС. НАЦИОНАЛ(ii(Ajj 1
Кроме того, кластер рДНК является классическим примером мультигенного семейства и, следовательно, представляет собой удобную модель для анализа механизмов изогенизации ("согласованной" эволюции) членов мультигенного семейства. Основные генетические процессы, лежащие в основе изогенизации, были описаны на примере рДНК различных эукариот [Dover, 1982].
Промотор, обусловливающий экспрессию генов рибосомных РНК (промотор РНК полимеразы I), в отличие от промоторов РНК полимеразы II, обусловливающих транскрипцию большинства генов, кодирующих информацию о белках, и РНК полимеразы III обладает рядом уникальных особенностей. Во-первых, данный промотор обусловливает гиперзкспрессию РНК. Клетки эукариотических организмов синтезируют около 10000 различных типов РНК, при этом около половины транскрипционной активности направлено на синтез только одного типа РНК, а именно рибосомной РНК [Paule & Lofquist, 1996]. Во-вторых, данный промотор не обладает тканеспецифичностью и активно работает во все типах клеток на всех стадиях развития организма. В-третьих, он является видоспецифичным [Sollner-Webb & Tower, 1986]. С нашей точки зрения, вышеперечисленные особенности позволяют предположить, что промотор, обусловливающий экспрессию генов рибосомных РНК, может быть использован как уникальный инструмент для решения многих экспериментальных задач методами генетической инженерии. В частности, для исследования функциональной значимости конкретных генов методом "нокаута", посредством экспрессии двунитивой РНК (то есть транскрипции соответствующей палиндромной последовательности ДНК), комплементарной изучаемому гену, под контролем промотора РНК полимеразы I.
Отметим, что методы генетической инженерии, получившие в последние десятилетия большое развитие, позволяют не только генетически модифицировать живые организмы, но и, что с нашей точки зрения особенно важно, изучать биологическую роль конкретных генов посредством специфического подавления функциональной активности соответствующих РНК. В этой связи особенно актуальными представляются исследования, направленные на разработку новых векторных систем, позволяющих переносить чужеродный генетический материал в геном исследуемого объекта. Для получения трансгенных насекомых одним из подходов является использование денсовирусов [Carlson et al., 2000].
Цели и задачи исследования
Сравнительный анализ молекулярно-генетической организации рДНК различных видов организмов необычайно важен для понимания - механизмов функционирования и эволюции живых организмов. В этой связи одной из целей данного исследования была разработка "универсальных" методических подходов, позволяющих исследовать структуру рДНК любых эукариотических организмов вне зависимости от видовой принадлежности.
Второй целью данного исследования являлось описание и выявление особенностей структурной организации и эволюционной изменчивости рДНК нескольких видов насекомых (на примере отряда Blattodea).
Третья цель - характеристика открытого нами нового вида денсовирусов -BgDNV - потенциальной векторной системы, позволяющей экспрессировать чужеродную генетическую информацию в клетках насекомых под контролем мощного промотора генов рибосомных РНК.
В соответствии со сказанным выше были сформулированы следующие основные задачи данного исследования.
1) Посредством анализа п эШоо рДНК эукариот выявить универсальные
праймеры и молекулярные зонды, позволяющие исследовать методами ПЦР и блот-гибридизации рДНК любых эукариотических организмов, привести экспериментальные доказательства "универсальности" предложенных методических подходов.
2)
Клонировать и секвенировать полноразмерный повтор рДНК рыжего таракана Blattella germanica, описать структурно-функциональные элементы данного участка генома.
3)
Описать внутривидовой полиморфизм различных структурных элементов рДНК рыжего таракана. На основе выявленного полиморфизма исследовать генетическую структуру природных популяций этого вида.
4)
На основе анализа изменчивости нуклеотидов 28S генов рРНК определить генетические дистанции между представителями различных родов отряда Blattodea. Провести анализ эволюционной
изменчивости внутренних и внешних транскрибируемых спейсеров у близкородственных видов родов Blattella и Periplaneta.
5) Клонировать, секвенировать и описать структуру ДНК обнаруженного
нами денсовируса рыжего таракана BgDNV.
Научная новизна и практическая ценность работы
В работе впервые разработан новый методический подход исследования структурно-функциональной организации кластера рибосомных генов эукариот, основанный на использовании универсальных праймеров и зондов. На примере нескольких таксономических групп эукариот (насекомых и растений) продемонстрирована эффективность данного подхода, позволяющего клонировать нативные повторы рДНК любых эукариотических организмов, первичная структура рДНК которых не определена, а также исследовать полиморфизм длин рестриктных фрагментов рДНК на популяционном и видовом уровнях. Впервые дано полное описание структурно-функциональной организации нативного повтора рДНК рыжего таракана.
Впервые проведен комплексный анализ различий структурных элементов рДНК (генов 28S- и 5.8S рРНК, внутренних и внешних транскрибируемых спейсеров) у различных видов отряда Тараканы, - как близкородственных,- так и эволюционно удаленных друг от друга. Показано, что степень эволюционной изменчивости описанных структурных элементов рДНК сильно различается, что отражает двойственную природу эукариотического генома [Алтухов, 2003]. Сравнительный анализ структуры двух внутренних транскрибируемых и внешнего транскрибируемого спейсеров рДНК у близкородственных видов тараканов двух родов - Blattella и Periplaneta - выявил внутривидовой генетический мономорфизм и сальтационный характер эволюции данных участков генома.
В связи с активным использованием антибиотиков на животноводческих фермах особую озабоченность вызывает способность тараканов переносить микроорганизмы, устойчивые к антибиотикам, которые используют как для ветеринарных целей, так и в медицинской практике [Schal & Hamilton, 1990]. Нами впервые разработаны молекулярно-генетические маркеры ДНК, позволяющие дифференцировать популяции тараканов и определять генетические дистанции и
уровень миграции между ними. Успешное развитие исследований в данном направлении позволит установить основные пути переноса тараканов из животноводческих ферм в населенные пункты и, соответственно, сфокусировать санэпидемиологический надзор в правильном направлении.
Открыт, клонирован и описан новый вирус рыжего таракана Blattella germanica (SgDNV). Показано, что исследованный вирус принадлежит семейству Parvoviridae, род Densovirus. Клонированный денсовирус представляет собой многообещающий инструмент для исследования рыжего таракана методами генетической инженерии и разработки новаторских экологически чистых способов регуляции численности данного вида насекомых.
Результаты, полученные в настоящем исследовании, были использованы для разработки методологии и оригинальных экспериментов при изучении различных видов насекомых на Кафедре энтомологии Государственного университета Северной Каролины (США). Полученные данные и обобщения следует учитывать при проведении работ в области популяционной генетики, молекулярной эволюции и структурно-функциональной организации генома, а также использовать при чтении соответствующих курсов лекций в ВУЗах.
Апробация работы
Результаты работы были представлены на съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова (Саратов, 1994); Евроазиатском симпозиуме "Текущие тенденции в биотехнологии" (Анкара, 1995); на международной конференции "Генетические манипуляции с насекомыми" (США, 1999); на международной конференции "Биология насекомых" (Москва, 2002); на второй конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова (Москва, 2003); на научных семинарах Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН; на научных семинарах кафедры генетики Государственного университета Миннесоты (США, 1999), кафедры генетики и кафедры энтомологии Государственного университета Северной Каролины (1997,1999,2000).
Объем и структура работы. Публикации
Диссертация, изложенная на 253 страницах, включает стандартные разделы и иллюстрирована 19 таблицами и 52 рисунками.
Ряд данных, представленных в диссертации, был получен в результате плодотворного сотрудничества с А. П. Сидоренко, А. Л. Королёвым, О. Е. Лазебным и Л. Е Андреевой, работавшими под руководством автора аспирантами - А. В. Ильичевым, И. В. Лазебной, А. Г. Чумаченко, М. В. Паленко, В. А. Мысиной, а также К. Шалом и Б. Вигманном (Университет Северной Каролины, США), которым автор приносит глубокую и искреннюю благодарность.
По теме диссертации опубликовано 19 работ в российских и международных рецензируемых журналах' и зарегистрирован патент на изобретение в Государственном реестре изобретений Российской Федерации.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. АНАЛИЗ IN SIUCO генов РИБОСОМНЫХ РНК ЭУКАРИОТ
С целью выявления высококонсервативных доменов в пределах генов рибосомных РНК эукариот ранее опубликованные последовательности 26S и 17S генов рибосомных РНК Tetrahymena pyriformis - представителя эукариот из типа простейших - условно наиболее примитивного живого существа, сравнивали с последовательностями рДНК других эукариотических организмов, представленными в EMBL базе данных, посредством компьютерной программы ImaGene (QueryLogic Inc.). Принцип действия программы заключается в следующем. Субпоследовательность, состоящая из N первых нуклеотидов изучаемой ДНК, сравнивается с базой данных, состоящей из нуклеотидных последовательностей определенного типа. Количество последовательностей, представленных в базе данных, обладающих заданной степенью сходства с анализируемой субпоследовательностью, отмечается по оси ординат в качестве определенной абсолютной величины. По оси абсцисс обозначается полное количество нуклеотидных пар изучаемой последовательности. В очередном цикле работы программы сравнению подвергается субпоследовательность, состоящая из следующих N нуклеотидов анализируемой ДНК. Длина субпоследовательности, тестируемая в единичном цикле работы программы, равнялась 40 нуклеотидам.
1.1 28S- подобные гены рибосомных РНК
Для анализа 283-подобных генов рРНК эукариот использовали базу данных, состоящую из всех последовательностей рДНК эукариот, содержавшихся в EMBL банке генов к моменту начала работы (1993 год). Общая длина 26S рДНК Т. pyriformis равняется 3341 п.н. [Engberg, 1984]. На рисунке 1 представлены результаты, полученные при использовании различных степеней сходства: 40/40 (100%) - рис. 1а; 40/38 (95%) - рис. 16; 40/35 (87,5%) - рис. 1в; 40/30 (75%) -рис. 1г; 40/28 (70%)-рис. 1 д.
Как видно на рисунках 1а, б, в, г, д общий характер изменений при увеличении значений задаваемых степеней сходства заключается в сужении областей последовательности 26S рДНК Т. pyriformis и уменьшении количества последовательностей, содержащихся в базе данных, удовлетворяющих данному критерию. Однако даже при столь высокой степени сходства как 87,5% (рис. 1 в), в анализируемой последовательности рДНК можно выявить до 7 доменов, протяженностью 200 - 400 нуклеотидов, степень эволюционной консервативности которых соответствует заданному параметру. Наиболее протяженные высококонсервативные домены 26S рДНК 7. pyriformis локализованы ближе к 3' концу изучаемой последовательности.
На рисунке 1а представлен результат сравнения субпоследовательностей 26S рДНК Т. pyriformis с банком генов рДНК посредством компьютерной программы ImaGene при заданной 100% степени сходства (40/40). Обнаружено три субпоследовательности 26S рДНК Т. pyriformis, которые проявляли 100% сходство с определенным числом (от 40 до 70) последовательностей рДНК, представленных в EMBL базе данных. Более тонкий анализ проводился посредством программы FASTA. Результаты проведенной работы представлены в таблице 1. Как видно на таблице, три субпоследовательности рДНК Т. pyriformis, протяженностью от 41 до 61 п.н., имеют 100% сходство с соответствующими последовательностями рДНК таких различных организмов, как Arabidopsis thaliana, Oryza sativa (растения), Saccharomyces cerevisiae (грибы), Caenorhabditis elegans (круглые черви), Xenopus leavis (земноводные), Homo sapiens (человек). Описанные субпоследовательности 26S рДНК Т. pyriformis могут быть рекомендованы для создания праймеров для
исследования методом ПЦР рДНК организмов различных таксонов, в том числе и тех организмов, первичная структура рДНК которых еще не определена.
1.2 18S- подобные гены рибосомных РНК
Аналогично анализу 288-подобных генов рРНК (описано выше) исследовали гены 18Э-подобных рРНК эукариот. Отличительной особенностью данных последовательностей является тот факт, что эволюционно консервативные домены со степенью сходства 80% и выше - 200-300 п. н. - равномерно распределены вдоль длины ^ генов рРНК.
Данные субпоследовательности имеют следующую примерную локализацию на последовательности 17S рДНК Г. pyriformis (указаны первый и последний нуклеотид): 310-410; 550-650; 900-1010; 1200-1320; 1550-1650. Внутри данных доменов были выявлены более короткие субпоследовательности, протяженностью в несколько десятков нуклеотидных пар, имеющие степень сходства около 100% с рДНК таких эволюционно удаленных от простейших таксонов, как растения, грибы, млекопитающие и человек. Описанные субпоследовательности 17S рДНК Т. pyriformis могут быть рекомендованы в качестве основы для исследования методом ПЦР рДНК организмов различных таксонов, в том числе и тех организмов, первичная структура рДНК которых еще не определена.
2. СОЗДАНИЕ УНИВЕРСАЛЬНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ЗОНДОВ, ПОЗВОЛЯЮЩИХ МЕТОДАМИ ПЦР и БЛОТ-ГИБРИДИЗАЦИИ АНАЛИЗИРОВАТЬ СТРУКТУРУ РИБОСОМНОЙ ДНК ЭУКАРИОТ
2.1 Создание универсальных праймеров, позволяющих методом ПЦР анализировать структуру рДНК эукариот
На основе проведенного сравнительного анализа степени эволюционного консерватизма различных субпоследовательностей генов рРНК и выявленных сверхконсервативных доменов были предложены две пары праймеров DAMSJI8 - 5' gtccctgccctttgtacaca 3'; DAMS_28 - 51 ctactagatggttcgattagtc 3' и NTS_18 - 5' tccaccaactaagaacggcc 3'; NTS_28 - 5' aactatgactctcttaaggt 3', обладающие 100%-ным сходством с соответствующими доменами генов рРНК почти всех эукариотических организмов, нуклеотидная последовательность рДНК которых описана к настоящему времени. Отметим, что данная работа была проведена в
начале 90-х годов прошлого века. На современном этапе развития биоинформатики
и компьютерной
Рисунок 1. Выявление в последовательности 26S рДНК Т. руп/ЬгтЪ доменов, обладающих различной степенью эволюционной консервативности (пояснения в тексте). Данные получены совместно с Сидоренко А. П.
Таблица 1
Характеристика субпоследовательностей гена 26S рРНК Т. руп/огтгх, которые имеют 100%-ное сходство с рДНК организмов - представителей различных таксонов.
Последовательность нуклеотидов Протяженность и локализация на последовательности гена 26S рРНК Т. pyriformls Названия организмов, рДНК которых имеет 100% сходство с указанными ¡ субпоследовательностями '
taggggcgaaagactaatcga accatctagtagctggttcc 41 нуклеотид, с 916 по 956 п.н. Растения: Arabidopsis th abana, Oryza sativa; Грибы: ! Saccharomyces cerevisiae\ ' Круглые черви: Caenortiabditis elegans: Земноводные: Xenopus feaws; Человек: Homo sapiens i ¡
aagcgcgggtaaacggcggga gtaactatgactctcttaagg tagccaaatgcctcgtcat 61 нуклеотид, с 2214 по 2274 п.н.
tgagctgggtttagaccgtcg tgagacaggttagttttaccct actg 47 нуклеотидов, с 2920 по 2966
Данные получены совместно с Сидоренко А. П.
техники стали общедоступными сверхмощные серверы, содержащие на порядок большее количество последовательностей рДНК, и разработаны соответствующие компьютерные программы, позволяющие проводить сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей. Сравнение последовательностей нуклеотидов предложенных праймеров (DAMS_18, DAMS_28, NTS_18 и NTS_28) с последовательностями нуклеотидов рДНК эукариот, представленными в EMBL и GenBank базах данных (февраль 2003 года - htto //www псы nim mh QOV ), посредством компьютерных программ BLAST и FASTA не выявило соответствующих субпоследовательностей, которые имели бы более одной нуклеотидной замены, причем вариабельные нуклеотиды не затрагивали 3' фланга праймера, важного для инициации полимеразной цепной реакции. Таким образом можно заключить, что данные праймеры являются универсальными для амплификации методом ПЦР соответствующих фрагментов рДНК эукариотических организмов.
На рисунке 2 приведена схема структурной организации кластера рибосомных генов эукариот и обозначены ориентация и примерная локализация универсальных праймеров. Суть предложенного нами подхода, позволяющего амплифицировать перекрывающиеся фрагменты полноразмерного, то есть содержащего все структурные элементы, повтора кластера рибосомных генов любого эукариотического организма, проста и заключается в следующем. С использованием
пар универсальных праймеров DAMS_18/DAMS_28 и NTS_18/NTS_28 амплифицируют, клонируют и определяют последовательность нуклеотидов соответствующих фрагментов рДНК (смотрите рисунок 2). На основе определенной нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов создаются дополнительные две пары видоспецифичных праймеров, обозначенные на рисунке 2 как а/b и c/d, которые позволяют амплифицировать дополнительные два фрагмента рДНК, необходимые для полного перекрывания нативного повтора кластера рибосомных генов.
В рамках данной диссертационной работы описанный подход был реализован при анализе структурно-функциональной организации кластера рибосомных генов рыжего таракана, Btattella germanica.
Рисунок 2. Схема строения кластера рибосомной ДНК эукариот. БАМ8_18, БАМ8_28, №Т8_18 и ОТ8_28 - универсальные праймеры; а, Ь, с и ё - видоспецифичные праймеры (пояснения в тексте). 188, 5.88, 288 - последовательности генов рибосомных РНК; ГТ81 и ГТ82 - внутренние транскрибируемые спейсеры; ОТ8 - нетранскрибируемый спейсер.
2.2 Клонирование высококонсервативных фрагментов рДНК Tetrahymena pyriformis
На рисунках 1 а, б видно, что наиболее протяженные высококонсервативные домены 26S рДНК Т. pyriformis локализованы ближе к 3' концу изучаемой последовательности в районе между 2000 и 3000 нуклеотидами. Эта область была выбрана для создания зонда, позволяющего выявлять последовательности рДНК различных таксономических групп методом блот-гибридизации. В пределах последовательности 17S рДНК Т. pyriformis характер распределения высококонсервативных последовательностей иной - относительно короткие домены равномерно распределены по всей длине гена. Поэтому, а также учитывая
относительно небольшой размер этого гена (1752 п.н.), для создания зонда, гомологичного 18S- подобным рДНК, клонировали фрагмент рДНК, содержащий полноразмерный ген 17S рРНК Т. pyriformis.
Как известно, в процессе созревания макронуклеуса инфузорий происходит амплификация локализованной в хромосоме копии рДНК, причем в макронуклеусе кластер рибосомальных генов представлен в виде палиндромной последовательности длинной около 20 т.п.н. (рисунок 3). В зрелом вегетативном ядре Tetrahymena содержится около 1 х 104 копий таких палиндромных последовательностей [Engberg, 1985].
Подход, используемый нами для выделения амплифицированных копий рДНК 7. pyriformis, был основан на методе пульс-электрофореза, при этом тотальную ДНК предварительно экстрагировали в особо мягких условиях для сохранения нативных размеров и лучшего фракционирования мультикопийных линейных молекул - рДНК и митохондриальной ДНК. Результат пульс-электрофореза тотальной ДНК Т. pyriformis представлен на рисунке 4.
Рибосомапьная ДНК Т. pyriformis являлась предметом изучения многих авторов, и к настоящему времени составлена подробная рестриктная карта этих молекул, определена полная последовательность нуклеотидов 17S, 5.8S и 26S рДНК [Engberg, 1985]. На рисунке 3 представлена схема, иллюстрирующая расположение сайтов узнавания рестриктаз H/ndlll и Вд1\\ на палиндромной молекуле рДНК Г. pyriformis. Отметим, что при обработке рДНК Т. pyriformis рестриктазой Hind III в числе прочих образуется фрагмент ДНК (1212 п.н.), соответствующий последовательность 26S рДНК с 1989 -го по 3201 -й нукпеотид, то есть фрагмент, содержащий высококонсервативную зону 26S рДНК Т. pyriformis (смотрите рисунки 1 и 3), а при последовательной обработке рестриктазами H/ndlll и BglH - фрагмент, содержащий полноразмерный ген 17S рРНК Г. pyriformis (смотрите рисунок 3).
Очищенную ДНК полноразмерных амплифицированных молекул рДНК Т. pyriformis обрабатывали рестриктазой Hind III или последовательно рестриктазами Hind III и Bgl II. Полученный препарат использовали для создания миниклонотек на основе вектора pUC19. Анализ полученных рекомбинантных молекул позволил отобрать искомые клоны, то есть плазмидные молекулы, содержащие последовательность 26S рДНК Т. pyriformis с 1989 -го по 3201 -й нукпеотид (плазмида названа pFF(H-H)1212) и полноразмерный ген 17S рРНК (плазмида
названа p17S(H-B)1752). Фланги клонированных фрагментов были частично секвенированы в составе описанных плазмид и показана полная идентичность ранее описанным последовательностям.
Центр симметрии
н н н 1 1 1
Т Г
в
ттг
в в в
173(Н-В)1752
. нн
11 т ц
нн
тгт
вв в
РР(Н-Н11212
н н
и
н
т г
в
Рисунок 3. Схема структурной организации автономно реплицируемых молекул рДНК Т. руп/отт1з. Стрелками указано расположение сайтов узнавания рестриктаз /й^Ш (H) и Б§Ш (В). Короткими продольными полосами обозначены соответствующие фрагменты рДНК, входящие в состав рекомбинантных плазмид pl7S(H-B)1752 и pFF(H-H)1212.
Рисунок 4. Пульс-электрофорез тотальной ДНК ТвШкутвпа руп/огт1$. Стрелкой указана фракция автономно реплицирующихся линейных молекул рибосомной ДНК; звездочкой обозначена фракция линейных молекул митохоцдриальнойДНК.
2.3 Демонстрация применимости полученных универсальных зондов для анализа структуры рДНК животных и растений.
К сожалению, нельзя теоретически однозначно определить степень сходства двух последовательностей ДНК, необходимую для того, чтобы одна из них могла бы быть использована в качестве зонда для выявления гомологичных
последовательностей в других видах организмов методом блот-гибридизации. "Адекватность" зонда всегда следует проверять экспериментально.
В рамках диссертационной работы было проведено несколько серий экспериментов, направленных на анализ структурной организации и эволюционной изменчивости рДНК представителей различных таксонов - главным образом, насекомых и растений, в ходе которых были использованы "универсальные" зонды sFF(H-H)1212 и p17S(H-B)1752. В автореферате диссертации я ограничусь описанием исследования внутривидового полиморфизма рДНК гороха посевного.
Анализ внутривидовой вариабельности кластера рибосомных генов гороха посевного (Pisum sativum,)
В работе использовали 21 сорт гороха P. sativum, полученный из коллекций Института земледелия УААН и Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.
Первой задачей данного исследования - было выявление ферментов рестрикции, позволяющих детектировать внутривидовой полиморфизм длин рестриктных фрагментов рДНК P. sativum, обусловленный ее гетерогенностью. На рисунке 5 показан результат блот-гибридизации p17S(H-B)1752 с тотальной ДНК двух произвольно взятых сортов гороха после рестрикции эндонуклеазами BamHI, EcoRI и Hind III. В результате гибридизации с тотальной ДНК, гидролизованной ферментами BamHI и Hind III, полиморфизм рДНК между двумя исследованными сортами не выявляется (рисунок 5, сравните дорожки 1, 2 и 5, 6). После рестрикции тотальной ДНК гороха ферментом EcoRI, зонд pl7S(H-B)1752 выявляет у каждого сорта по два варианта фрагментов размерами от 2 до 5 т.п.н. (рисунок 5, дорожки 3, 4). Один из них, имеющий размер около 3.7 т.п.н., обнаруживается у каждого из двух сортов, два других являются характерными для данного сорта.
На рисунке 6 представлены типичные для 21 исследованного сорта P. sativum варианты блот-гибридизационных характеристик рестрицированной EcoRI тотальной ДНК с клонированной последовательностью 17S рДНК Т. pyriformis. Гибридизационный зонд выявляет два типа полос. Одна из полос в положении, соответствующем фрагментам длиной около 3.7 т.п.н. (с-полоса), обнаруживается у всех тестированных сортов; остальные гибридизационные полосы (a, b, d) выявляются на электрофореграмме в различных положениях, соответствующих размерам от 2.0 до 5.0 т.п.н.
Рисунок 5. Результат блот-гибридизации pl7S(H-B)l752 с тотальной ДНК двух произвольно взятых сортов гороха (1-й сорт -1,3,5, 2-й сорт - 2, 4, б), рестрицированной В - ВатН IE- EcoR X Н- Hind Ш. Данные получены совместно с Сидоренко А П. и Королевым А. Л
Рисунок 6. Результат блот-гибридизации рестрицированной эндонуклеазой EcoR I тотальной ДНК гороха сорта. 1 - Неручь, 2 - Напарник, 3 -Арендатор. Зонд pl7S(H-B)1752.
a, Ь, с, d - условное обозначение выявленных фрагментов рДНК, имеющих различную электрофоретическую подвижность. Данные получены совместно с Сидоренко А. П и Королевым А. Л.
Рисунок 7. Результат блот-гибридизации тотальной ДНК, выделенной из индивидуальных проростков (1-8) гороха сорта Чешский богатырь и рестрицированной эндонуклеазой EcoRl Зонд р17(Н-В) 1752. Ь, с - фрагменты рДНК, соответственно обозначенные на рисунке б Данные получены совместно с Сидоренко А. П. и Королевым А. Л.
Специфические характеристики ПДРФ рДНК стабильно воспроизводятся у растений одного сорта, что показано на примере сорта Чешский богатырь (рисунок 7). Отсутствие индивидуальной вариабельности тестируемого признака внутри сорта и наличие сортоспецифических отличий позволяет использовать выявляемый описанным способом полиморфизм рДНК гороха посевного для анализа сортовой принадлежности.
3. КЛОНИРОВАНИЕ, СЕКВЕНИРОВАНИЕ И ОПИСАНИЕ СТРУКТУРЫ ПОЛНОРАЗМЕРНОГО ПОВТОРА РДНК РЫЖЕГО ТАРАКАНА BLATTELLA GERMANICA
Методические подходы, описанные в первых двух главах, позволяющие с использованием "универсальных" праймеров амплифицировать, клонировать и
15
определять последовательность нуклеотидов перекрывающихся фрагментов полноразмерного повтора рДНК эукариот, были применены для анализа структурной организации кластера рДНК рыжего таракана Blattella genmanica.
На рисунке 8а (дорожка 1) приведен результат амплификации фрагмента рДНК рыжего таракана с использованием "универсальных" праймеров DAMS_18/DAMS_28. Амплифицированный участок генома включает фрагменты генов 18S и 28S рРНК, ген 5.8S рРНК и внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2 (смотрите рисунок 2). Известно, что гены рибосомных РНК и транскрибируемые спейсеры являются наиболее эволюционно консервативными частями кластера рДНК эукариот. Нетранскрибируемый спейсер (NTS) является наиболее вариабельной частью рДНК эукариот, известно, что в пределах кластера генов рРНК может содержаться несколько вариантов NTS [Gerbi, 1985]. На рисунке 86 (дорожки 1, 2) представлен результат ПЦР ДНК различных особей рыжего таракана с использованием-"универсальных" праймеров NTS_18/NTS_28, то есть участков рДНК, содержащих фрагменты генов 18S и 28S рРНК и нетранскрибируемый спейсер (смотрите рисунок 2). Как видно на рисунке 86, электрофоретическая подвижность сравниваемых фрагментов резко различается.
Описанные выше амплифицированные фрагменты рДНК рыжего таракана были клонированы (результат клонирования двух вариантов фрагментов, содержащих NTS, представлен на рисунке 86, дорожки 3 и 4) и секвенированы (больший по размеру фрагмент, содержащий NTS, секвенирован частично). На основе определенной последовательности нуклеотидов описанных фрагментов рДНК рыжего таракана были созданы две дополнительные пары видоспецифичных праймеров а/Ь и c/d, позволяющие амплифицировать, клонировать и секвенировать фрагменты 28S и 18S генов рРНК соответственно, последовательность нуклеотидов которых оставалась неопределена (смотрите рисунок 2).
Полная последовательность нуклеотидов полноразмерного повтора рДНК рыжего таракана (9015 п.н.), содержащая один из вариантов нетранскрибируемого спейсера, зарегистрирована в GenBank # AF321244.
Определение границ генов рРНК (18S, 5.8S и 28S) и соответственно границ внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1 и ITS2) проводили посредством сравнения различных участков рДНК рыжего таракана с соответствующими
Рисунок 8. Результат ПЦР амплификации рДНК В. germanica с использованием праймеров А - DAMS_18 / DAMS_28 (дорожка 1); Б - NTS_18 / NTS_28 (дорожки 1 и 2); дорожки 3 и 4 -результат электрофореза рестрицированных ферментом Not I (уникальный сайт рестрикции) плазмид pGEM-T, содержащих клонированные фрагменты, представленные на дорожках 2 и 1 (соответственно). М - маркерыразмеров фрагментов ДНК.
последовательностями, представленными в EMBL и GenBank базах данных. За начало (конец) генов рРНК принимались наиболее протяженные области рДНК, дающие 100% сходство с соответствующими последовательностями других эукариот, представленных в настоящее время в базах данных.
Для определения старта транскрипции рДНК, т. е. области локализации промотора, был применен следующий стандартный подход. Радиоактивно меченный праймер, локализованный в непосредственной близости от начала 18S гена отжигали с тотальной РНК, изолированной из рыжего таракана и посредством обратной транскриптазы синтезировали комплементарную цепь ДНК (кДНК). Размер кДНК определяли методом фракционирования в 6%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (рисунок 9, дорожка 1), используя для определения размера синтезируемой кДНК фХ174 DNA/Hinf I маркеры фирмы "Promega". Отметим, что выбранный нами метод не позволяет с точностью до одного нуклеотида определить старт транскрипции, но выявляет область локализации промотора с точностью, зависящей от типа используемых маркеров. На рисунке 10 область старта транскрипции выделена курсивом и жирным шрифтом.
Как видно на рисунке 10, в пределах ETS В. germanica находятся три типа субповторов, каждый из которых представлен несколькими копиями. Сравнительный анализ с EMBL и GenBank базами данных не выявил значимого сходства описанных субповторов ни с одной из известных последовательностей ДНК. В то же время
сравнение субповторов с известными регуляторными элементами, основанное на алгоритме Вайбела (Waibel) и соавторов (http.//www. fruit-fly.org/seq_tOOls/promoter.htinl), выявило значительное сходство последовательности tctagcttgtctcggcatatctgtccgtataggattgtgtgtgtgtgaga (на рис. 10 выделено строчными буквами и жирным шрифтом) с промоторами генов прокариот.
Рисунок 9. Результат авторадиографии кДНК после электрофореза в 6% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Для синтеза кДНК использовали радиоактивно меченый праймер и тотальную РНК, экстрагированную из тараканов: / - В. germanica; 2-В. lituricolis; 3-5. asahinai.
Известно, что в отличие от эукариотических организмов, использующих для транскрипции различных генов три типа РНК полимераз, прокариоты используют только один фермент, в том числе и для транскрипции генов рибосомных РНК. Остается неясной эволюционная преемственность данных типов регуляторных элементов, однако, с нашей точки зрения, это является важным указанием на функциональную значимость описанных субповторов и их возможную роль в регуляции активности промотора РНК полимеразы I В. germanica. Отметим, что описанный факт не является первым случаем обнаружения прокариотических регуляторных элементов в геноме эукариот. Ранее в составе эукариотических геномов мной в соавторстве с Ильичевым А. В. и Андреевой Л. Е. был описан БАК-домен лактозного оперона Е. со// и методами генетической инженерии показана его роль в регуляции активности эукариотических промоторов (описано в Приложение к диссертации).
Известно, что NTS рибосомных генов эукариот содержат субповторы, играющие важную роль в регуляции транскрипционной активности данных генов. Причем различные типы NTS могут отличаться между собой как по типу субповторов, так и по их количеству. На рисунке 10 кластер, состоящий из четырех одинаковых субповторов, обозначен темным фоном и подчеркиванием. Анализ функциональной
Рисунок 10. Фрагмент последовательности нуклеотидов полноразмерного повтора рДНК В germanica, содержащего один из вариантов NTS. Праймер, использованный для определения старта транскрипции выделен жирным шрифтом и одиночным подчеркиванием. Фрагменты последовательностей генов 18S- и 28S рРНК выделены белым шрифтом на темном фоне. Область старта транскрипции выделена курсивом и жирным шрифтом. Субповторы NTS обозначены темным фоном и подчеркиванием. Последовательности, проявляющие значительное сходство с промоторами генов прокариот выделены строчными буквами и жирным шрифтом. Субповторы ETS выделены темным фоном.
значимости данных субповторов может быть проведен известными методами генетической инженерии, что будет являться предметом нашей дальнейшей работы.
4. ВНУТРИВИДОВОЙ ПОЛИМОРФИЗМ НЕТРАНСКРИБИРУЕМОГО СПЕЙСЕРА РДНК BLATTELLA
GERMANICA.
4.1 Выявление и описание ПДРФ рДНК
Нетранскрибируемый спейсер рДНК эукариот является важным структурно-функциональным элементом генома, ответственным за регуляцию активности промотора РНК-полимеразы I и, в конечном итоге, за количество синтезируемой рибосомной РНК, то есть за количество рибосом в клетках организма. Можно предположить, что различным экологическим условиям, в которых данный вид может находиться в силу особенностей своей биологии, соответствуют определенные наиболее адекватные уровни интенсивности обмена веществ, которые коррелируют с интенсивностью белкового синтеза и, следовательно, требуют оптимального количества рибосом, зависимого от транскрипционной активности рДНК. В силу этого обстоятельства наличие в геноме нескольких типов NTS, избирательная активность которых в соматических клетках может корректировать количество формируемых рибосом, и способность клеткок полового пути формировать новые типы NTS представляется крайне адаптивным эволюционным приобретением эукариот.
В рамках данной работы выявлен полиморфизм длин рестриктных фрагментов (ПДРФ) рДНК рыжего таракана, определен характер наследования различных структурных вариантов NTS, с помощью созданных ПДРФ рДНК маркеров проведен анализ генетической структуры лабораторных линий и природных популяций данного вида насекомых.
Рибосомная ДНК эукариот является уникальным структурно-функциональным образованием генома, в котором собраны воедино генетические элементы, обладающие резко различающейся степенью эволюционной консервативности. Наиболее консервативными являются гены рРНК - в пределах вида в этих последовательностях выявляют лишь единичные нуклеотидные замены либо полное отсутствие вариабельных сайтов. Наиболее вариабельной областью рДНК эукариот является нетранскрибируемый спейсер - несколько структурных вариантов которого может содержаться в составе одного генома. Исходя из описанных особенностей структуры рДНК эукариот, становится ясным, что после рестрикции тотальной ДНК
эукариотического организма эндонуклеазой, один сайт узнавания которой локализован в пределах 28S гена, а второй в пределах вариабельной области NTS, и блот-гибридизации с зондом, гомологичным 3' концу 28S гена, у разных представителей данного вида или даже в пределах одного генома, будет выявлено несколько фрагментов, имеющих различную длину (смотрите рисунок 11). ПДРФ рДНК, обусловленный вариабельностью структуры NTS, методом блот-гибридизации может быть выявлен у любого эукариотического организма. На практике задача сводится к поиску соответствующих рестриктаз, имеющих вышеописанные особенности локализации сайтов узнавания ДНК. Отметим, что для успешного проведения данного анализа необходимо иметь зонд, гомологичный 3' концу 28S гена. Если известна последовательность нуклеотидов рДНК исследуемого организма, можно амплифицировать методом ПЦР соответствующую область 28S гена и клонированный фрагмент использовать в качестве зонда. Альтернативным подходом является использование "универсального" зонда sFF(H-H)1212, описанного во второй главе данной работы, который, как было нами показано, содержит высококонсервативные домены, гомологичные 3' концу 28S генов всех эукариот.
Для анализа внутривидового ПДРФ рДНК рыжего таракана методом блот гибридизации по Саузерну в качестве зонда использовали клонированный фрагмент рДНК Blattella germanica, полученный в результате ПЦР с праймерами DAMS_18 / DAMS_28 (смотрите рисунок 11; зонд №1). Как видно на рисунке, этот зонд содержит большую часть 28S гена, имеющую главное значение для выявления данного типа полиморфизма.
Очевидно, что для выявления ПДРФ рДНК, обусловленного вариабельностью в пределах NTS, один сайт рестрикции должен находиться в 28S гене ближе к его 3' концу так, чтобы последовательность от сайта узнавания до конца 28S гена была достаточной для выявления методом блот гибридизации. Поскольку 3' конец 28S гена эволюционно консервативен, данный сайт рестрикции не будет полиморфным в пределах вида. Второй сайт рестрикции должен быть локализован в высоковариабельной области NTS. Поскольку последовательность
Зонд 2
Зонд 1
18S ITS1 5 8S ITS2
28S
NTS
18S
В
Рисунок 11. Схема строения рДНК рыжего таракана. А • 18S, S.8S, 28S - последовательности генов рибосомкых РНК; ITS1 и ITS2 -внутренние транскрибируемые спейсеры; NTS - нетрансгрибируемый спейсер. Тонкими стрелками указаны сайты узнавания рестрнктазы Hmdlll в эволюционно консервативной области рДНК, толстыми стрелками - вариабельный сайт(ы). Зонд 1 и Зонд 2 - обозначение областей гомологии фрагментов ДНК, использованных в качестве радиоактивно меченных проб для блот-гибрндизации. Б и В - два гипотетических варианта структуры рДНК.
тпо
Рисунок 12. Результат блот-гибридизации
65 рестрицированной Hindlll тотальной ДНК
61 индивидуальных тараканов из лабораторных 50
линий; в качестве зондов использовальсь клонированные фрагменты А - рДНК В. germanica, Б - 188-подобный фрагмент 3 0 рДНК Т. pyriformis. ДНК использованная на дорожках 1 - 5 (Б) соответствует дорожкам 20 1,2,3, 8 и 10 (А), соответственно.
.1 0
123456789 10 11 12 13 1 2 3 4 5
нуклеотидов 28S гена рДНК рыжего таракана была определена нами ранее, с помощью соответствующих компьютерных программ можно было определелить сайты локализации всех известных эндонуклеаз, из которых несколько (Bgltt, Dra\, Psfi, Pvu\, Hin6\\\) были выделены нами в качестве кандидатных. Понятно, что выполнение второго условия - локализация дополнительного сайта рестрикции (ближайшего к 3 концу 28S гена) в вариабельной области NTS - может быть определена только экспериментально. В результате проведенной работы из всех кандидатных рестриктаз была отобрана одна - HindIII, выявляющая ярковыраженный внутривидовой полиморфизм рДНК рыжего таракана.
На рисунке 12а представлен результат блот-гибридизации тотальной ДНК рыжего таракана, обработанной ферментом рестрикции Hindlll, с зондом №1 (смотрите рисунок 11). На каждой дорожке представлен результат блот-гибридизации с ДНК, выделенной из индивидуальной особи. В работе использовали только самцов - представителей различных лабораторных линий. В результате эксперимента были выявлены три зоны гибридизации: две из них ( в районе около 1 т.п.н. и 2 т.п.н ) являются мономорфными и одна зона (в районе 5.0 - 6.5 т.п.н.) содержит вариабельные фрагменты ДНК. Как видно на рисунке 12а (сравните
дорожки 1-13), в вариабельной зоне фрагменты ДНК, выявляемые используемым зондом, у исследованных особей имеют различную длину и представлены различным числом- вариантов. Кроме того, в ряде случаев интенсивность гибридизации различных Hindlll-фрагментов, принадлежащих ДНК одной особи, значительно различались. Данный результат показывает, что особи в пределах популяции не являются идентичными, а содержат различные типы повторов рДНК.
Для характеристики внутривидового полиморфизма рДНК В. germanica анализировали только самцов (XX - самки; ХО - самцы), следовательно, все описанные у одной особи варианты повторов рДНК локализованы в пределах одной Х-хромосомы. Исходя из вышеизложенных экспериментальных данных, можно предположить два варианта структурной организации рДНК В. germanica. Согласно первому варианту повторы определенного типа рибосомной ДНК локализуются в геноме кластерами - "островной" тип организации (рис. 116). Согласно второму варианту, различные типы повторов расположены случайным образом (рис. 11 в). Выбор между этими вариантами может быть сделан на основе анализа рекомбинации между гомологичными Х-хромосомами, несущими различные повторы рДНК.
4.2 Анализ наследования различных структурных вариантов рДНК
Для анализа наследования различных структурных вариантов рДНК было поставлено несколько индивидуальных скрещиваний. На рисунке 13 представлен результат блот-гибридизации тотальной ДНК индивидуальных особей рыжего таракана (родителей и потомков F1), обработанной ферментом рестрикции Hind III, с зондом №1 (смотрите рисунок 11). Известно, что кластер рибосомных генов у В. germanica локализован в Х-хромосоме; самки содержат в геноме две Х-хромосомы, самцы - одну [Ross, 1992]. Как видно на рисунке, обе хромосомы Рсамки содержат кластеры рДНК, у которых после рестрикции Hindlll и блот-гибридизации с соответствующим зондом выявляются фрагменты одинаковой длины. X хромосома самца (Рсамца) содержит кластер рДНК, отличный от такового самки; после рестрикции H/ndlll и блот-гибридизации выявляется один фрагмент большего размера, чем у Рсамки. Очевидно, что все самцы первого поколения должны
содержать одну из хромосом Рсвмки, а самки первого поколения одну из хромосом Рсэмкк и одну от самца Рсамц». , что и наблюдалось в эксперименте (рисунок 13).
тпо
12 34 5 6 5 6789 10
F1<j> ' ' F1</
Рисунок 13. Анализ наследования различных структурных вариантов рДНК В germamca у потомков Ft в индивидуальном скрещивании. Р - ДНК родителей (самки и самца, соответственно).
Анализ наследования описанных структурных вариантов в поколениях F2 показал, что самцы F2 содержат одну из родительских X хромосом, а самки F2 две хромосомы в разных сочетаниях. Отметим, что все исследованные самцы F2 не содержали рекомбинантных X хромосом, то есть X хромосом, образованных в результате рекомбинации между хромосомами Реши* и Римщ в районе кластера рибосомных генов. Аналогичный результат был получен при анализе 100 самцов F9 - рекомбинантов также не было выявлено. Таким образом, X хромосомы, содержащие различные типы NTS, стабильно поддерживаются в ряду поколений.
4.3 Анализ генетической структуры природных популяций рыжего таракана
Рыжий таракан В. germanica является синантропным видом. На протяжении долгой истории человечества это насекомое обитает в жилых помещениях, а с развитием сельскохозяйственной индустрии в качестве среды обитания использует и животноводческие фермы. К сожалению, совместная жизнь с этим видом насекомых далеко не безопасна. Недавние исследования показали, что тараканы являются этиологическими агентами многих аллергических заболеваний человека, в частности,
детской бронхиальной астмы и старческого ринита [Rosenstreich et al. 1997]. Известно также, что тараканы способны переносить многие микроорганизмы, потенциально патогенные для человека. Однако в последнее время, в связи с активным использованием антибиотиков на животноводческих фермах, особую озабоченность вызывает способность тараканов переносить микроорганизмы, устойчивые к антибиотикам, которые используют как для ветеринарных целей, так и в медицинской практике.
В этой связи, с нашей точки зрения, является актуальной разработка молекулярно-генетических маркеров, позволяющих дифференцировать популяции тараканов и определять пути их миграции. Успешное развитие исследований в данном направлении позволит установить основные пути переноса тараканов из животноводческих ферм в населенные пункты и, соответственно, сфокусировать санэпидемиологический надзор в правильном направлении.
Нами было предложено в качестве такого маркера использовать ПДРФ рДНК, основанный на вариабельности нуклеотидных последовательностей нетранскрибируемого спейсера.
В таблице 2 схематично представлены рестрикционные спектры, полученные в результате блот-гибридизации Hindlll-рестриктов тотальной ДНК самцов б. germanica из трех американских популяций (свиноферм). Длины выявленных фрагментов находятся в интервале 5.0-6.5 т.п.н. Суммарно в исследованных популяциях выявлено 8 типов фрагментов. В популяциях "Britt" и "Riverfront" выявлено 7 и 6 типов фрагментов, соответственно, в популяции "Hairr" - 3. Фрагменты 3, 4, 5 являются общими для всех популяций. Популяции "Riverfront" и "Britt" кроме названных выше типов фрагментов характеризуются еще двумя общими типами: 1 и 7. Достоверность различий по частотам типов фрагментов между парами популяций оценивали по G2-статистике. Достоверные (р<0,01) различия получены между парами популяций "Riverfront" и "Hairr" по двум локусам (1 и 7), "Hairr" и "Britt" - по трем локусам (1, 6 и 8), "Riverfront" и "Britt" - по четырем локусам (2, 3, 6, 8). Таким образом, анализ частот различных типов фрагментов может быть использован для дифференцировки отдельных пар популяций.
Нами были даны оценки генетического полиморфизма рДНК в исследованных американских популяциях, рассчитанные на основе анализа типов фрагментов: среднее число фрагментов на особь (N), доля полиморфных локусов (Р), среднее
внутригрупповое сходство (APS - Average Pairwise Similarity), а также степень генного разнообразия, или гетерозиготности (Н). Определены уровни достоверности различий перечисленных параметров. Так, по среднему числу фрагментов на особь все популяции достоверно отличаются друг от друга (р<0.01). При этом наиболее богатыми- рестрикционными спектрами характеризуется популяция "Britf (N=3.000±0.166), значительно беднее спектры в популяции "Hairr" (N=1.476±0.131), промежуточное положение занимает популяция "Riverfront" (N=2.150±0.209). Популяции "Riverfront" и "Britf характеризуются высоким уровнем полиморфизма выявленных локусов (Pr=0,875 и Рв=0,750), который как минимум в два раза выше, чем в популяции "Britf (Р=0,375). Значение индекса внутригруппового среднего сходства (APS) указывает на меньшую однородность популяций "Riverfront" по сравнению с двумя другими исследованными популяциями (APSH=0,645, APSB=0,534); отличие популяции "Riverfront" от популяций "Hairr" и 'Britf является достоверным. Сравнение индексов генетического разнообразия (Н) также указывает на высоко достоверные отличия (р«0.001) популяции "Riverfronf от двух других. Отметим, что во всех популяциях уровень гетерозиготности является высоким и уменьшается в ряду: "Riverfront", "Britf, "Hairr" (Hr=0,750, Hb=0,602, Hh=0.540).
Уровень межпопуляционной изменчивости по типам фрагментов оценивали с использованием коэффициента фиксации Показано, что межпопуляционная
изменчивость, рассчитанная по всем выборкам, составляет
Эта доля межпопуляционной изменчивости свидетельствует о дифференциации популяций. Наиболее четко дифференцированы популяции "Hairr" и-"Britt" (F«h. в=0,314), наименее -"Riverfronf и "Hairr" (F,tR^=0,172).
Генетические расстояния между популяциями оценивали с использованием алгоритма Cavalli-Sforza [Cavalli-Sforza et al., 1967] на основе различий частот встречаемости различных структурных вариантов рДНК. На рисунке 14 изображены исследованные популяции в пространстве первых двух главных компонент. Как видно на рисунке, наиболее близко друг к другу расположены популяции "Riverfronf и "Hairr". На значительном расстоянии от них находится популяция "Britf, причем вклад обеих двух главных компонент в дистанцирование данной популяции от двух других примерно одинаков.
Полученный результат многомерного анализа методом главных компонент, как и проведенный выше анализ изменчивости локусов, свидетельствует о существовании различий между исследованными популяциями.
Доминирование рестриктных фрагментов рДНК определенного типа в различных популяциях было также показано при анализе тотальной ДНК, выделенной из 50 оотек, взятых от самок, обитающих в каждом из свинарников. Поскольку каждая оотека содержит около 30 зародышей (то есть -45 X - хромосом), это соответствует тотальной ДНК из более 2000 самцов. На рисунке 156 представлен результат блот гибридизации с такой "суммарной" ДНК. Отчетливо видно доминирование определенных фрагментов в различных популяциях. Данный тип экспериментов может быть рекомендован в качестве "экспресс анализа" подразделенности популяций рыжего таракана.
Представленный выше полокусный анализ применительно к кластеру рибосомных генов рыжего таракана является формальным, поскольку различные по структуре повторы рРНК генов расположены в районе одного ядрышкового организатора Х-хромосомы и наследование этих фрагментов, как нами было показано выше, происходит сцеплено. Исходя из этого, нами был проведен также анализ изменчивости структуры рДНК отдельных Х-хромосом (гаплотипов). Была определена достоверность различий между популяциями по частотам хромосом каждого типа, оцененная с помощью в2-ТеСа. Достоверные различия между парами популяций "Р1уе|1гопГ-"На1|т" и "Рме|1гопГ-"ВгШ-" получены по двум типам хромосом (типы В, Е и типы А, Н, соответственно), а между популяциями "На1|т" и "ВпП" - по четырем типам (А, В, С, Н).
5. АНАЛИЗ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ РИБОСОМНОЙ ДНК ОТРЯДА В1_АТТООЕА
В рамках данной работы предметом анализа являлась эволюционная изменчивость различных структурно-функциональных элементов рДНК представителей отряда В!аПоСеа с целями 1) изучения филогенетических
Таблица 2
Схематическое изображение выявленных в результате блот-гибридизации структурных вариантов рДНК В. germanica.
взаимоотношений между представителями данного отряда (на примере генов 28в рРНК) и 2) анализа закономерностей эволюционной изменчивости рДНК данной фуппы организмов (на примере БТв, !ТБ1 и !ТБ2).
Мы амплифицировали, клонировали и секвенировали протяженные (более 2500 п.н.) фрагменты рДНК, локализованные между "универсальными" праймерами ЭАМв^ / 0АМв_28, то есть участки рДНК, содержащие 1ТБ1, !Тв2, 5.8Б и протяженный фрагмент (-1200 п.н.) гена 28в рРНК, у
Рисунок 14. Генетические расстояния межу выборками в пространстве первых двух главных компонент. Данные получены совместно с Лазебным О. Е. и Лазебной И В.
Рисунок 15. Результат блот-гибридизации рестрицированной НтбШ тотальной ДНК 50 оотек, изолированных от самок из различных популяций R - Riveiside, Н - Hair, В - Bntt. В качестве зонда использовали клонированный фрагмент DAMS_18/DAMS_28 рДНК В germanica
следующих представителей отряда Blattodea: Blattella germanica (GenBank # AF321244), Blattella asahmai (GenBank # AF321253), Blattella lituncollis (GenBank # AF321245), Blattella vaga (GenBank # AF321246), Penplaneta amencana (GenBank # AF321248), Penplaneta brunnea (GenBank # AF321249), Penplaneta fuliginosa (GenBank # AF321250), Parcoblatta lata (GenBank # AF321247), Blaberus atropos (GenBank # AF321252), Blaberus giganteus (GenBank # AF321254), Diploptera punctata (GenBank # AF321251) и фрагменты рДНК, содержащие ETS, трех близкородственных видов тараканов рода Blattella: В. gemanlca, В. asahinal, В. lituhcollis.
5.1 Построение филогенетического древа отряда Blattodea на основе нуклеотидных последовательностей генов 28S рРНК
Известно, что тараканы являются одним-из наиболее древних отрядов насекомых - различия во времени становления между различными родами могут составлять 75 - 100 миллионов лет. Филогенетические взаимоотношения между различными таксонами отряда Тараканы являются предметом интенсивных дебатов в мировой литературе, посвященной систематике несекомых. Несмотря на использование различных подходов, то есть попытки построить совершенное филогенетическое древо на основе сравнения морфологических, физиологических и молекулярных различий, в настоящее время нет полного согласия относительно филогении данной группы насекомых. Нами было сделано предположение, что для анализа филогении такой древней группы насекомых, как тараканы, наиболее адекватным будет использование медленно эволюционирующих районов ядерной рибосомной ДНК- генов 28S рРНК.
Для построения филогенетического древа отряда Blattodea были использованы фрагменты 28S рДНК, локализованные в пределах амплифицированных с использованием праймеров DAMS_18 / DAMS_28 участков рДНК 11 названных видов тараканов.
Попарное сравнение фрагментов 28S генов рРНК показало, что в пределах родов (например, рода Blattella) расхождение (дивергенция) варьирует от 0.1 до 8%; а между между родами и семействами достигает 11 - 19%. Максимальное расхождение наблюдалось между родами Diploptera и Blattella. Средние частоты оснований в анализируемом фрагменте рДНК у исследованных видов равны: А=16.10, С=34.07, G=29.29 и Т=20.06%. Достоверных различий по частотам встречаемости нуклеотидов между таксонами не наблюдалось р=0.93).
Для определения степени насыщенности исследованных фрагментов рДНК различных таксонов вариабельными нуклеотидами было проанализировано соотношение между числом транзиций и трансверсий, с одной стороны, и попарными различиями между таксонами, вычисленными на основе модели HKY [Hasegawa et al., 1985], с другой. Показано, что число обоих типов замен постепенно
аккумулировалось по мере роста дивергенции, (смотрите рисунок 16), что свидетельствует о том, что насыщение не было достигнуто.
Попарный анализ исследованных фрагментов рДНК методом "максимальной экономии", привел к построению наиболее вероятного филогенетического древа, изображенного на рисунке 17. Топология древа была подтверждена высокими бутстреп (bootstrap) значениями (около 89%), подтверждающими все внутренние узлы (структуру филогенетического древа). Дополнительный анализ методом "максимального сходства" привел к аналогичному филогенетическому древу, со сходными генетическими расстояниями между таксонами.
Рисунок 16. Общее количество транзиций и трансверсий в 883 пы 28S рДНК, использованных для построения филогенетического древа отряда Тараканы методом "максимальной экономии", как функция "HKY - коррелированной" дивергенции для каждой пары сравниваемых видов.
Тот факт, различными
что двумя методами
Попарная дивергенция (НКУ- корреляция)
("максимальной экономии" и "максимального сходства") были построены сходные филогенетические деревья с высокой достоверностью расхождений между ветвями деревьев, а также полученные оценки степени насыщенности вариабельными нуклеотидами убедительно демонстрируют высокую информативность исследованных фрагментов рДНК для филогенетических построений в пределах отряда Тараканы.
5.2 Анализ эволюционной изменчивости транскрибируемых спейсеров у близкородственных видов родов Blattella и Perlplaneta
Эволюционная изменчивость внутренних транскрибируемых
спейсеров
Нами был проведен сравнительный анализ последовательностей ДНК ITS1 и ITS2 трех близкородственных видов тараканов рода Blattella: В. germanica, В. lituricollis и В. vaga и трех близкородственных видов рода Periplaneta: P. americana, P. fuliginosa и P. brunea; а также сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента ITS1 11 особей из трех различных популяций В. germanica.
Рисунок. 17. Филогенетическое дерево отряда Тараканы, постросное на основе двух методов: "максимальной экономии" и "максимального сходства" (оба использованных алгоритма выявили идентичные генетические расстояния между видами). Цифрами обозначены достоверности (в процентах) расхождения ветвей, выявленные бутстреп (bootstrap) анализом - первая цифра соответствует методу "максимальной экономии", вторая - "максимального сходства".
Для выявления внутри- и межпопуляционных различий структуры ITS1 В. germanica сравнивали последовательности нуклеотидов амплифицированных
Ptgum
Юэамея
НОС. МЛЦИОНА. БИБЛНОТЕ
СПетербуТ-09 «3 акт
«
фрагментов рДНК протяженностью околр 630 п.н. В работе использовали тараканов, выловленных из трех различных популяций: Jacksonville (США) - 5 особей, Prestage (США) - 5 особей и Москва (Россия) - 1 особь. Сравнение последовательности нуклеотидов проводили посредством компьютерной программы ClustalW. Было показано, что в пределах анализируемых фрагментов рДНК наблюдаются лишь единичные замены нуклеотидов. Известно, что тараканы являются одним из наиболее древних таксонов насекомых. Согласно теории нейтральной эволюции в функционально инертных последовательностях ДНК должно происходить быстрое накопление нейтральных мутаций, которые, в свою очередь, в пределах мультигенного семейства рибосомных генов фиксируются согласно описанным механизмам молекулярного драйва [Dover, 1982]. Обнаружение высокой степени внутривидового консерватизма 1TS1 свидетельствует, с нашей точки зрения, о функциональной значимости этого района в регуляции активности кластера рибосомных генов тараканов.
Для попарных сравнений нуклеотидных последовательностей ITS1 и ITS2 трех видов тараканов каждого из выбранных для изучения родов (Blattella и Periplaneta) использовали компьютерную программу FASTA. На рисунке 18 приведен фрагмент нуклеотидных выравниваний ITS1 двух представителей рода Blattella (В. germanica и В. lituricollis). Видно, что сравниваемые последовательности нуклеотидов сильно различаются: выявлены инсерции / делеции, в том числе протяженные (выделено темным шрифтом) и большое количество точечных замен. Сходство между ITS1 В. germanica и В. lituricollis и В. germanica и В. vaga составляет 67,2% и 30,0%, соответственно, а между 1TS2 - 81,1% и 55,8%. Таким образом, показано, что эволюция исследованных видов тараканов сопровождалась сильными качественными изменениями структуры ITS1 и ITS2.
Общий характер эволюционной изменчивости ITS1 тараканов рода Periplaneta сходен с таковым, описанным выше для тараканов рода Blattella. Сходство между последовательностями ITS1 Р. атвriсаnа и P. fuliginosa и Р. втепсапа и Р. Ьгипеа составляет 59.5 и 55.4%, соответственно. Размер последовательности ITS1 исследованных видов также значительно различается и составляет 388, 343 и 354 п.н. для видов P. americana, P. fuliginosa и Р. Ьгипеа, соответственно. Множественное выравнивание ITS1 данных видов демонстрирует
300 310 320 330 340 350
ger CCTTGTGGCGCGGCGGTTGTCCTGCATGCTTCGCGTGCTGCGTCTGACCTAACTCGCCCT :::::::::::;::::::::: t::::::::::::::¡ ::::::¡: lit CCTTGTGGCGCGGCGGTTGTCATGCATGCTTCGCTTGCTGCGTCTGACCTACCTCGCCCT 280 290 300 310 320 330
360
ger TTTTTTT-----TAC---------------------------------------------
: i !: ¡ i::
lit TCTCTTTATGGGTACGGCGCTTCTTGCGACGTTGAAAGAAGACTTTCTCTCGTCTTCGCC
340 350 360 370 380 390
ger------------------------------------------------"--------
lit CAAAGGGTTTQCAGCASGAAGGGTCTGCATGCTTCACGTGCT6TGCGTCYGGC&CCGCCT
400 410 420 430 440 450
ger------------------------------------------------------------
lit TGTeeCGeGIGICCTSCAIblGCCTCGCGTGCTSCeTCTGkCnCATCTCGCCCTTCTCTC
460 470 480 490 500 510
370 380 390 400 410 420
ger --TGTCGAATGCTTTGGGCACTGCAAAATGCGCGGTTTAAAGGAGCCAGCTTTAGGCTTC
lit TATGTCGAAGGCTTTGGGCACTGCAAAATGCGCGGTTTAAAGGAGCCAGCTTTAGGTTTC 520 530 540 550 560 570
Рисунок 18. Фрагмент попарного сравнения нуклеотидных последовательностей ITS1 В. germanica (ger) и В. litericoHis (lit). Протяженная иысерция (делеция) выделена жирным шрифтом.
большое количество нуклеотидных замен и инсерций / делеций, возникших в процессе эволюции данных видов. Сранительный анализ ITS2 тараканов рода Periplaneta демонстрирует больший эволюционный- консерватизм данных последовательностей по сравнению с ITS1. Сходство между последовательностями ITS2 Р. атэпсапа и P. fuliginosa и P. americana и P. brunea составляет 71.1 и 64.0%, соответственно.
Таким образом, сравнение ITS1 и ITS2 трех близкородственных видов тараканов внутри каждого из исследованных родов выявляет сальтационный характер изменчивости анализируемых последовательностей ДНК в процессе эволюции описываемых видов. При сравнении ITS тараканов одного вида выявляется генетический мономорфизм данного признака.
Эволюционная изменчивость внешних транскрибируемых спейсеров
В рамках данной работы был проведен сравнительный анализ последовательностей ДНК ETS трех близкородственных видов тараканов рода
Blattella: В. germanica, В. asahinai (виды близнецы) и В. lituricollis, а также сравнительный анализ длины ETS 50 особей из 10 различных популяций В. germanica.
Структура ETS трех близкородственных видов - В. germanica, В. asahinai и В. lituricollis - представлена на рисунке 19. Для амплификации ETS использовали праймеры catcatcttggttagactgtc / gtgagactgaaccaagtgtg, один из которых локализован в пределах 5' области 18S гена, а второй за потенциальным промотором РНК полимеразы I.
Сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов ETS В. germanica и вида близнеца В. asahinai выявляет делецию двух субповторов (123 п.н.) у последнего (рисунок 19а, б, в). В пределах ETS В. lituricollis выявлен лишь один из субповторов, описанных у двух других эволюционно родственных видов (рисунок 19г).
В рамках данной работы мы не проводили секвенирования полноразмерных повторов рДНК В. asahinai и В. lituricollis, поэтому старт транскрипции рДНК у этих видов остается неопределенным. Однако сравнение величины фрагмента транскрипта пре-рРНК от начала до последовательности, обозначенной на рисунке 19 одиночным подчеркиванием (праймер, использованный для определения старта транскрипции) показывает, что изменение длины, первичного транскрипта пропорционально изменениям длины ETS этих видов (рисунок 9).
Таким образом, показано, что в процессе эволюции тараканов рода Blattella происходят сальтационные изменения в структуре функционально значимого района генома - внешнего транскрибируемого спейсера рДНК.
Для выявления внутри- и межпопуляционных различий структуры ETS В. germanica сравнивали размер соответствующих амплифицированных фрагментов рДНК протяженностью 787 п.н. В работе анализировали по 5 тараканов, выловленных из десяти различных популяций: США - 4 популяции, Франция - 2 популяции и Россия - 4 популяции. На рисунке 20 приведен результат электрофоретического разделения соответствующих фрагментов,
амплифицированных из ДНК тараканов 10 описанных популяций. Как видно на рисунке, вариации длины анализируемых фрагментов не наблюдается, другими словами, ETS В. germanica является видоспецифичным высококонсервативным участком генома.
*
С нашей точки зрения, характер изменчивости транскрибируемых спейсеров рибосомной ДНК исследованных видов тараканов не может быть объяснен с позиций теории нейтральной эволюции [Кимура, 1985]. Более адекватной представляется интерпретация полученных результатов с позиции теории генетического мономорфизма [Алтухов, 1969, 1989, 2003; Алтухов и Рысков, 1972], согласно которой, как известно, видообразование трактуется не как постепенный вероятностный процесс, протекающий на популяционном уровне, а как следствие качественных реорганизаций генома.
Как уже было отмечено, интенсивность синтеза рРНК коррелирует с общим уровнем метаболизма, который, в свою очередь, является важной адаптивной составляющей, определяющей приспособительные способности особи к данным условиям окружающей среды. Можно предположить, что эволюция тараканов сопровождалась освоением новых экологических ниш, для которых более адаптивными являлись разные уровни интенсивности метаболизма и, следовательно, различная интенсивность синтеза рРНК, которая, в свою очередь, определяется, в частности, структурой транскрибируемых спейсеров.
В настоящее время остается открытым вопрос о конкретных механизмах, лежащих в основе качественной смены структуры рибосомной ДНК в процессе эволюции видов. В тоже время показано, что меж- и / или внутрихромосомная генная конверсия лежат в основе изогенизации членов мультигенного семейства и их
А
> В. уппдп1са
САСеССАСТССТСАССАСДСАТСТОТААТСОАААТОТТСТСССССТТСОТССССТТССАТСССССАССТАТбТСТССТСС ТСТССССТСССТТСАТСТССАТТСАСТСССССАСТСАСЕСТАОаААТТТТгСТТТСССЗАССАСТТТСТСАТССССТССА САССАССТСССССбССАСТАСССССТССАТАСССТТТСТСТСТСТТАТССССАСАСССТТТТТАТСТССГАГСГААГСАГ ЛТАГАСТСГСГТСССТССеССССССДЗСТАТОТСТССАСТТТСТСАТСАСССТТСТССТТОССССТТТССССССТССОаО
АСАССССАТССА^СССССТАСАТССССАЛААСААТСССАСАССТАСбСТЬс^ад^^^Есдасай^сЕойссд^йа
ЭТаЪДОдЪдЪдЪдЪдадаССТССССТСТДОССДССССКШШСМТС^
СААААСААТСССАСАССТАСССТЕс1адс1Е<^сЕссгосайа1сйдйссд1а£адда£йд^д1^дЬдйстадаССТС<5СС
ТСТ6йСС1ИССССАСАААСМТСТАСТСТСТСС6ССАТСТА5ТСТСТССССААССАССТТТССССТСТССАеАТС1АТТ1
СТТСТСТССССОСТСТАТАаСТТТТСХТСТССССТСТСЕСАСТТТТТСТСТСССАСАСТАТТААТСАСТАОаТТСССАТЗ
СССОССТТТТОТАССССТССССССТСТТСССАССАССГСТААААСЛ^
САГАГОГГТгПСТСАЛАСАГТААСССЛГаЛТет^
Б
> В. aeablnal
ccgcttgaggccgcagagccgatggacgggggtagatcgggaaa'ygaa'^gcga^ACGTACGGTtetagettgtcteggtca tatctgtccjtataggattgtgtgtgtgtgagaCGTGGCCTSTÄCCMCCCCAaiAAGAGTGTACTCTGTGCGCCTTCü
ggcatgaatgagttggggcaatgcgtggaaggttcgtccgagatatggtcgatcccgcttgaggctgcagagccgätgga
CGGGGGTAGATCGGGAAAAGAATCCGÄCACCTACGGTtctaaettateteageatatetateeatataoa»ttatatatci tqtqaCfaCGTGGCCTGTGACCGACCCCACAAASAGYGTACTCTGTGCGCGATCTAGTCTCTCCGCAAGGACCTTTCCCGT CTCGAGATGTATTTCTTGTGTCCGGGGTCTATAGGTTTTCTTGTCGGCTGTCGGACTTTTTCTGTCGCAGAGTATTAATG
aotaggttgccatgcggggcttttgtacccgtggcgcctgttcggagcaC(?TCXAAAJICAACGCACCAAGTTCCCT^TT(; atcctgccagtagtcatatccttgtctcaaagattaagccatgcgtgtctcagtgcaagctatactaaagtgaaaccgcg
в
Делеция (В. germanica/ В. asahinai)-123 п.н.
TaTärsfc£iiCiÄ£!^Öi^t^S^39GGCGIACGGTtctagcttgtctcggcatatctgtccgtataggattgtgtgt gtgtgagaCGTGGCCTGTGACCGACCCCACAAAGAGTGTACTC
Г
> В. lltuxleollla
cccgcttgaggctgcagagccgctggacgggtcgat'cgggäatataatccgacacgcacggttctagcttgtcgcatatc
TGTCCGTCCCTGTCGGGAGGATTGTGTGTCTGACATGGCCTGTGACCGACCCCAGTGTACTCTTGTGCGTCTAGTCTCTC CGCAAGGACCTTCCCCGACCGGATGTATTTCTTGTTTGGGGTCTAGGTTTTCTTGTCGGCTGTCGGACTTGTACTCGCAG AGTATGAATGACTAGGTTGCCATGCGGGGCTTTGCACCCGTGGCGCCTGTTCGGAGCAGGTGIÄACACAAOGCÄCGAGrT CCCTGGTTGATCCTtXCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGAttAAGCCATGCATGrCTCAGTGCAAjGCTATACTAAAGT
Рисунок 19. Область ETS трех близкородственных видов тараканов А-В. germanica, Б - В. asahinai, Г - В. lituricollis. Жирным курсивом выделено начало 18S гена; курсивом и одиночным подчеркиванием - область локализации промотора; одиночным подчеркиванием -последовательность нукпеотидов, соответствующая праймеру, используемому для определения старта транскрипции; темным фоном, жирным шрифтом и двойным подчеркиванием выделено три типа субповторов; строчными буквами и жирным шрифтом выделена последовательность, имеющая высокую гомологию с промоторами генов прокариот. В - последовательность нуклеотидов, делегированная из генома В. asahinai (при сравнении с В. germanica).
Рисунок 20. Результат амплификации фрагмента
рибосомной ДНК В. germanica, содержащего внешний
транскрибируемый спейсер. В качестве матрицы использовали ДНК тараканов 10 различных популяций.
согласованной, концертной эволюции [Dover, 1982; Slatkin, 1986]. Можно предположить, что процесс изогенизации происходит неравномерно по всей длинне мультигенного семейства и фланги кластера вовлечены в этот процесс в меньшей степени. В этом случае именно фланкирующие члены кластера рибосомных генов представляют собой материал для дальнейшей эволюции. В этих районах без существенного влияния на фенотип особи может происходить формирование новых структурных вариантов, которые могут оказаться селективно выгодными в новых
условиях окружающей среды. Избирательная магнификация генов рРНК, описанная в экспериментах на D. melanogaster[Hawley et al., 1985], и направленная ("полярная") генная конверсия [Dover, 1982] - два механизма, благодаря которым новый структурный вариант может стать основным членом мультигенного семейства.
Подчеркнем, что в описанной гипотетической схеме эволюции тараканов рода Blattella, особое внимание уделяется генетическим событиям, происходящим на уровне особи. Именно определенный структурный вариант рибосомной ДНК, магнифицированный в клетках полового пути конкретной особи, является основой для формирования кластера рибосомных генов другого вида. Этот подход, с нашей точки зрения, хорошо согласуется с постулатами теории генетического мономорфизма, согласно которой, в частности, "любой вид по генетически мономорфной части генома предстает перед нами как отдельная особь" [Алтухов, 2003].
6. ДЕНСОВИРУС РЫЖЕГО ТАРАКАНА BLATTELLA CERMANICA: ОБНАРУЖЕНИЕ, ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ И ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА
Как уже было отмечено, промотор, обусловливающий гиперэкспрессию генов рибосомных РНК, может быть использован как уникальный инструмент для решения многих экспериментальных задач методами генетической инженерии. В частности, для исследования функциональной значимости конкретных генов методом "нокаута", посредством экспрессии двунитивой РНК (то есть транскрипции соответствующей палиндромной последовательности ДНК), комплементарной изучаемому гену, под контролем промотора РНК полимеразы I. Вторым направлением может являться разработка биологических методов борьбы с вредными для человека животными, посредством использования генетически модифицированных вирусов. В этом случае необычайно важно, чтобы не только вирус являлся видоспецифичным, но и экспрессия токсина, или двунитевой РНК, комплементарной функционально важному гену хозяина, контролировалась видоспецифичным промотором (каковым является промотор РНК полимеразы I).
В данной главе дается описание открытия и общая характеристика денсовируса рыжего таракана Blattella germanica (SgDNV). Денсовирусы были описаны у многих насекомых и было показано, что они являются эффективным инструментом для переноса генетической информации в клетки хозяина [Carlson et
al., 2000]. Можно надеяться, что конструирование векторных конструкций на основе SfitoNV с использованием промотора генов рибосомных РНК позволит на новом уровне изучать молекулярно-генетическую организацию данного вида насекомых и разработать новые экологически чистые методы регуляции численности этого синантропного паразита.
Обнаружение вируса, общая характеристика и клонирование вирусной ДНК
При исследовании живых объектов молекулярно-биологическими методами часто является необходимым экстрагировать тотальную ДНК из объекта исследований. Мы анализировали тотальную ДНК, экстрагированную из индивидуальных тараканов Blattella germanica, выловленных в различных свинарниках, расположенных на территории США. Было показано, что после электрофореза в 0,7% агарозном геле часть образцов тотальной ДНК, экстрагированной из тараканов, собранных в одном из свинарников (Р6) и поддерживаемых в лабораторных условиях в течение 5 лет, содержала дополнительную фракцию ДНК размером примерно 5 т.п.н. (Рис. 216). Обнаруженная дополнительная фракция была экстрагирована из геля, очищена (Рис. 21 в) и использована для электронно-микроскопического анализа, который показал, что исследуемая ДНК представлена линейной формой длиной около 1,2 мкм (Рис. 22).
Рисунок 2 1. Выделение ДНК вируса рыжего таракана.
Результат электрофореза в 0.7% агарозном геле тотальной ДНК, экстрагированной из А - неинфицированного, Б - инфицированного вирусом таракана В. germanica. В - очищенная ДНК вируса, вырезанная из геля. Стрелка указывает на фракцию вирусной ДНК.
Рисунок 22. Электронная микроскопия вирусной ДНК.
* линейная ДНК вируса
** маркерная кольцевая ДНК плазмидыр1!С19. f j^i-r
Посредством обработки рядом ферментов рестрикции (BglH, EcoRI и Pst\) было показано, что данная фракция является двуцепочечной ДНК, и была построена частичная рестриктная карта. В ходе дальнейшего исследования тараканов Р6 было показано, что все тараканы, тотальная ДНК которых содержала дополнительную фракцию, проявляли явные признаки болезни: вялость, нескоординированность движений, полный или частичный паралич задних конечностей. Сходные признаки заболевания были описаны для других насекомых, инфицированных денсовирусами, - тараканов Penplaneta fuliginosa и сверчков Acheta domestica [Meynadier et al., 1977; Hu, 1994].
Электронно-микроскопическое исследование ультратонких срезов тканей больных тараканов показало, что клетки пищеварительной системы, жирового тела и эпидермиса инфицированы вирусом, который вызывает зачительные ультраструктурные изменения. Основные цитопатологические эффекты сходны в клетках различных тканей и заключаются в необычной структуризации хроматина, при этом большая часть нуклеоплазмы занята вирусными частицами. Показано, что вирусные частицы имеют диаметр примерно 20 нм и могут локализоваться как в ядре, так и в цитоплазме.
Для клонирования вирусной ДНК в плазмидном векторе pl)C119 был использован метод, основанный на добавлении гомополимерных фрагментов ДНК (примерно по 20 нуклеотидов на каждый фланг) с последующим отжигом векторной и клонируемой ДНК. Было проанализировано несколько сотен рекомбинантных плазмид, и только одна из них (pVir-8) содержала инсерцию, соответствующую полноразмерной копии исследуемого вируса (SgDNV). Данная плазмида была использована для секвенирования вирусной ДНК.
Последовательность нуклеотидов и организация генома вируса
Полная последовательность генома BgDNV представлена 5335 нуклеотидами (фрагмент последовательности изображен на рисунке 23а). Последовательность нуклеотидов BgDNV содержит концевые инвертированные повторы (КИП) протяженностью 216 и 217 нуклеотидов на правом и левом концах, соответственно. Показано, что КИП BgDNV содержат несовершенные палиндромные последовательности длиной 192 нуклеотида, которые могут формировать вторичные структуры.
В пределах генома BgDNV было обнаружено 5 ОРС. Две из них (1 и 2) локализуются на одной цепи, три другие (3,4 и 5) - на комплементарной (Рис. 236).
Описанные ОРС потенциально могут кодировать следующие белки. ОРС1 локализуется между 922-2808 нуклеотидами и кодирует белок, состоящий из 628 аминокислот (69,7 кДа). ОРС2 локализуется между 243-932 нуклеотидами и кодирует белок, состоящий из 229 аминокислот (24.8 кДа). ОРСЗ локализуется между 44042811 нуклеотидами и кодирует белок, состоящий из 530 аминокислот (60.2 кДа). ОРС4 локализуется между 4397-3608 нуклеотидами и кодирует белок, состоящий из 262 аминокислот (30.3 кДа). ОРС5 локализуется между 5055-4404 нуклеотидами и кодирует белок, состоящий из 216 аминокислот (25.9 кДа).
Для сравнения белков BgDNV с белками других описанных денсовирусов использовали программу BLAST, специально адаптированную для сравнения аминокислотных последовательностей. Показано, что все описанные белки вируса BgDNV обладают очень низким сходством с соответствующими белками других денсовирусов. В то же время, мы выявили относительно короткие аминокислотные мотивы, которые обладают высоким уровнем эволюционного консерватизма и проявляют значительную степень сходства в пределах денсовирусов, паразитирующих на насекомых различных таксонов: BgDNV, P/DNV, JcDNV, GmDNV, DsDNV.
Предсказание промоторных последовательностей было основано на алгоритме П. Бушера (P. Bucher) [Bucher, 1989]. В результате проведенного компьютерного анализа были выявлены два потенциальных промотора: Р1 (локализован между 200250 нуклеотидами) и Р2 (локализован между 5136-5086 нуклеотидами). Р1 может быть ответствен за транскрипцию ОРС1 и ОРС2, Р2 - за транскрипцию ОРСЗ, ОРС4 и ОРС5.
Были обнаружены сигналы полиаденилирования на цепи ДНК, содержащей ОРС1 и ОРС2 в позициях 937-942 и 2818-2823. Дополнительный сигнал полиаденилирования был обнаружен на комплементарной цепи, содержащей ОРСЗ.ОРС4 и ОРС5, в позиции 2810-2815.
С нашей точки зрения, клонированный денсовирус представляет собой многообещающий инструмент для исследования рыжего таракана методами генетической инженерии (в частности, функциональной значимости регуляторных
элементов рДНК) и разработки новаторских экологически чистых способов регуляции численности данного вида насекомых.
Рисунок 23 Основные структурные элементы BgDNV. А - Фрагмент последовательности нуклеотидов вирусного генома. Комплементарные последовательности концевых инвертированных повторов (палиндромов) а (выделено двойным подчеркиванием) и Ь (выделено одиночным подчеркиванием) обозначены как а' и Ь' соответственно. Кодоны инициации трансляции открытых рамок считывания выделены жирным шрифтом и обозначены как Старт ОРвУ, где N - номер соответствующей открытой рамки считывания. Предполагаемые районы локализации промоторов (Р1 и Р2) обозначены темным фоном; нуклеотид, соответствующий началу транскрипции обозначен увеличенным размером. Б - Схема расположения открытых рамок считывания.
выводы
1) Выявлены in silico высококонсервативные домены рибосомной ДНК (рДНК) эукариот. Впервые подобраны универсальные праймеры, позволяющие методом ПЦР амплифицировать полноразмерные копии повторов рДНК различных эукариот. Клонированы высококонсервативные районы рДНК простейших и созданы универсальные зонды, позволяющие методом блот-гибридизации изучать ПДРФ рДНК различных эукариот. Применимость полученных универсальных праймеров и зондов показана на примере анализа структуры рДНК эволюционно отдаленных таксонов: простейших, животных и растений.
2) Клонирован и секвенирован полноразмерный повтор (9015 п.н.) рДНК рыжего таракана Blattella germanica. Впервые для этого вида насекомых описана структура изучаемого района генома (нетранскрибируемый спейсер, внешний и внутренние транскрибируемые спейсеры, гены 18S, 5.8S и 28S рибосомных РНК) и охарактеризованы функционально значимые регуляторные элементы.
3) Впервые обнаружен и охарактеризован внутривидовой полиморфизм нетранскрибируемого спейсера рДНК Blattella germanica. С помощью созданных ПДРФ маркеров проведен анализ генетической структуры лабораторных линий и природных популяций данного вида насекомых. Показано, что маркеры ПДРФ рДНК позволяют дифференцировать популяции тараканов и определять генетические дистанции между ними.
4) Проведен анализ эволюционной изменчивости 5.8S рДНК, двух транскрибируемых спейсеров и протяженного фрагмента 28S рДНК у 11 видов отряда Тараканы. Показано, что генетическая изменчивость фрагмента (-1200 п.н.) 28S рДНК, в отличие от других исследованных участков генома, отражает филогенетические дистанции между видами отряда Тараканы.
5) Проведен сравнительный анализ структуры двух внутренних транскрибируемых и внешнего транскрибируемого спейсеров рДНК у близкородственных видов на примере тараканов двух родов - Blattella и Periplaneta. Выявлен внутривидовой генетический мономорфизм и сальтационный характер эволюции данных участков генома.
6) Открыт, клонирован и описан новый вирус рыжего таракана Blattella germanica (BgDNV). Показано, что исследованный вирус принадлежит семейству Parvoviridae, род Densovirus. Проведен электронно-микроскопический анализ ДНК вируса и ультратонких срезов тканей рыжего таракана, инфицированных вирусом. Проведены определение полной последовательности нуклеотидов (5335 п.н.) и компьютерный анализ ДНК исследованного вируса. Выявлены и описаны структурно-функциональные элементы исследованного вируса: пять открытых рамок считывания, промоторы и концевые инвертированные повторы.
Клонированный денсовирус представляет собой многообещающий инструмент для исследования рыжего таракана методами генетической инженерии и разработки новаторских экологически чистых способов регуляции численности данного вида насекомых.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1) Муха Д. В. Исследование динамики роста массовой культуры Tetrahymena pyhfonmis на различных питательных средах// Цитология, 1991, Т. 33. С. 106-109.
2) Муха Д. В., Сидоренко А. П., Хомякова Е. Б., Петрова Н. В., Марченко Г. Н. Оптимизация методов выделения высокомолекулярной ДНК Tetrahymena pyrifonvis II Молекулярная биология. 1994. Т. 28. С. 172-174.
3) Муха Д. В., Сидоренко А. П. Выявление и анализ доменов последовательности 26S рибосомной ДНК Tetrahymena pyriformis, различающихся по степени эволюционного консерватизма // Молекулярная биология. 1995. Т. 29. С. 529-537.
4) Муха Д. В., Сидоренко А. П., Марченко Г. Н. Клонирование протяженной палиндромной последовательности рибосомной ДНК Tetrahymena pyriformis II Молекулярная биология. 1995. Т. 29. С. 824-829.
5) Муха Д. В., Сидоренко А. П., Лазебная И. В., Захаров И. А. Анализ вариабельности структуры кластера рибосомных генов в пределах класса Insecta // Генетика. 1995. Т. 31. С. 63-67.
6) Муха Д. В., Андреева Л. Е., Ильичев А. В. Анализ экспрессии чужеродного генетического материала под контролем гетерогенных промоторов в процессе раннего развития вьюна (Misqunus fassilis)ll Генетика. 1996. Т. 32. С. 1387-1391.
7) Муха Д. В., Сидоренко А. П. Выявление высококонсервативных доменов в последовательности 17S рибосомальной ДНК Tetrahymena pyrifonvis II Генетика. 1996. Т. 32. С. 1494-1497.
8) Сидоренко А. П., Муха Д. В., Королев А. Л., Созинов А. А. // Анализ внутривидовой вариабельности кластера рибосомных генов гороха посевного Pisum sativum) II Генетика. 1997. Т. 33. С. 676-680.
9) Mukha D. V., Sidorenko A. P., Sibiryak M. I. A simple method for isolation of amplified copies of ribosomal DNA of Tetrahymena pyriformis by pulse-field gel electrophoresis // Цитология и генетика. 1997. Т. 31. С. 46-48.
10) Муха Д. В., Лазебная И. В., Сидоренко А. П. Hind III полиморфизм рибосомальной ДНК рыжего таракана (Blattella germanica) II Цитология и генетика. 1997. Т. 31. С. 8890.
11) Муха Д. В., Вигманн Б. М., Шал К. Сальтационные изменения в структуре кластера рибосомных генов в процессе эволюции тараканов рода Blattella II Доклады Российской Академии наук. 1999. Т. 364. С. 134-139.
12) Муха Д. В., Лазебный О. Е., Лазебная И. В. Анализ различий структуры кластера рибосомных генов двух видов близнецов: : Drosophila melanogaster and Drosophila simulans// Генетика. 1999. Т. 35. С. 1394-1397.
13) Сидоренко А. П., Муха Д. В. Выявление внутривидового внутреннего полиморфизма внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомной ДНК кукурузы // Молекулярная биология. 2000. Т. 34. С. 308-310.
14) Муха Д. В., Лазебная И. В., Сидоренко А. П. Внутривидовая структурная вариабельность рибосомной ДНК рыжего таракана Blattella germanica II Генетика. 2000. Т. 36. С. 11-15.
15) Mukha D. V., Sidorenko A. P., Lazebnaya I. V., Wiegmann В. М., and Schal С. Analysis of intraspecies polymorphism in the ribosomal DNA duster of the cockroach Blattella germanica It Insect Molecular Biology. 2000, V. 9. P. 217-222.
16) Муха Д. В., Вигманн Б. и Шал К. Сальтационные изменения структуры внешнего транскрибируемого спейсера рибосомной ДНК в процессе эволюции тараканов рода Blattella II Доклады Российской Академии Наук. 2002. Т. 387. С. 1-5.
17) Mukha D. V., Wiegmann В. М., Schal С. Evolution and phylogenetic information content of the ribosomal DNA repeat unit in the Blattoidea (Insecta) // Insect Biochemistry and Molecular Biology. 2002. V. 32. P. 951-960.
18) Лазебная И. В., Муха Д. В. Генетическая изменчивость ядерной рибосомной ДНК насекомых отряда тараканы (Blattaria): филогенетический анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов // Генетика. 2003. Т. 39. С. 474-477.
19) Муха Д. В. и Шал К. Денсовирус рыжего таракана: обнаружение, последовательность нуклеотидов и организация генома // Молекулярная биология. 2003. Т. 37. С. 607-618.
20) Изобретение: "Способ исследования структурно-функциональной организации ДНК рибосомного кластера эукариот." Патент № 2113481 Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 20 июня 1998 года
Авторы: Захаров И. А., Муха Д. В., Сидоренко А. П., Созинов А. А.
Напечатано с готового оригинал-макета
Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 21.01.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 3,0. Тираж 120 экз. Заказ 033. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.
i.170 з
РЫБ Русский фонд
2004-4 26842
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Муха, Дмитрий Владимирович
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Структурно-функциональная организация кластора рибосомных генов эукариот
1.1 РНК-полимераза I
1.2 Организация рибосомных генов в геноме эукариот
1.3 Промотор Pol I и структура нетранскрибируемого спейсера
1.4 Регуляция количества копий рибосомной ДНК
1.5 Инсерции в генах рибосомных РНК
2. Эволюционная изменчивость кластера рибосомных генов эукариот
2.1 Согласованная (концертная) эволюция повторяющихся структурных единиц кластера рибосомных генов эукариот
2.2 Эволюционная изменчивость генов рибосомных РНК
2.3 Эволюционная изменчивость транскрибируемых внешних и внутренних спейсеров
2.4 Эволюционная изменчивость нетранскрибируемых спейсеров
3. Общая характеристика денсовирусов. Денсовирусы как векторы для генетической трансформации насекомых и анализа регуляторных элементов генома
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Условия содержания В. germanica в инсектарии 51 Поддержание культуры и наращивание биомассы
Tetrahymena pyriformis
Выделение и очистка тотальной ДНК
A) Инфузорий 52 Б) Тараканов
B) Растений 54 Г) Других эукариот, исследованных в данной работе 55 Гель-электрофорез и элюция фрагментов ДНК
Выделение нативных амплифицированных копий рДНК Tetrahymena pyriformis Получение и очистка FF-фрагмента Ферментативная обработка ДНК Трансформация Е. со// Выделение плазмидной ДНК из Е. со// Очистка плазмидной ДНК Введение метки в ДНК Саузерн-блот анализ Полимеразная цепная реакция Методы работы с РНК Методы работы с вирусом Электронная микроскопия
Клонирование вирусной ДНК
Секвенирование ДНК
Методы статистической обработки
Эксперименты на вьюнах (Misgurnus fossilis)
Стимуляция созревания ооцитов и получение оплодотворенной икры
Микроинъекции ДНК в зиготы вьюна
Определение активности р-галактозидазы
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Анализ insiuco генов рибосомных РНК эукариот
1.1 28S-подобные гены рибосомных РНК
1.2 18S-подобные гены рибосомных РНК
2. Создание универсальных праймеров и зондов, позволяющих методами ПЦР и блот гибридизации анализировать структуру рибосомной ДНК эукариот
2.1 Клонирование высококонсервативных фрагментов рДНК
Tetrahymena pyriformis.
2.2 Демонстрация применимости полученных универсальных праймеров и зондов для анализа структуры рДНК эволюционно отдаленных таксонов животных и растений.
- Анализ различий структуры кластера рибосомных генов двух видов близнецов: Drosophila melanogaster и Drosophila simulans
- Анализ внутривидовой вариабельности кластера рибосомных генов гороха посевного (Pisum sativum^
- ПДРФ рДНК насекомых отряда тараканы
3. Клонирование, секвенирование и описание структуры полноразмерного повтора РДНК рыжего таракана blattella germanic а
4. Внутривидовой полиморфизм нетранскрибируемого спейсера РДНК blattella germanica
4.1 Выявление и описание ПДРФ рДНК
4.2 Анализ наследования различных структурных вариантов рДНК
4.3 Анализ генетической структуры лабораторных линий рыжего таракана
4.4 Анализ генетической структуры природных популяций рыжего таракана
5. Анализ эволюционной изменчивости рибосомной ДНК отряда Blattodea
5.1 Построение филогенетического древа отряда Blattodea на основе нуклеотидных последовательностей генов 28S рРНК
5.2 Анализ эволюционной изменчивости внутренних и внешних транскрибируемых спейсеров у близкородственных видов родов Blattella и Periplaneta
- Эволюционная изменчивость внутренних транскрибируемых спейсеров
- Эволюционная изменчивость внешних транскрибируемых спейсеров
5.3 Анализ эволюционной изменчивости 5.8S генов у представителей отряда Тараканы
6. Денсовирус рыжего таракана Blattella germanica: обнаружение, последовательность нуклеотидов и организация генома
6.1 Обнаружение и электронно-микроскопическое исследование вируса
6.2 Клонирование вирусной ДНК
6.3 Последовательность нуклеотидов генома вируса и структура концевых инвертированных повторов
6.4 Структура генома
- Характеристика открытых рамок считывания и сравнительный анализ белковых последовательностей.
- Промоторы
- Сигналы полиаденилирования 205 ВЫВОДЫ 211 ПРИЛОЖЕНИЕ
Анализ экспрессии чужеродного генетического материала под контролем гетерогенных промоторов в процессе раннего развития вьюна (MlSGURNUS FOSSILIS L.)
Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ структурно-функциональной организации и эволюционной изменчивости кластера рибосомных генов насекомых"
Актуальность проблемы.
Геном эукариот представляет собой сложно организованную систему генов, регуляторных и структурных элементов. Неотъемлемой частью генома любого (за исключением ряда простейших) эукариотического организма является кластер рибосомной ДНК (рДНК), представляющий собой тандемно повторенные гены рибосомных РНК, разделенные рядом спейсерных последовательностей.
Кластер рДНК является классическим примером мультигенного семейства и, следовательно, представляет собой удобную модель для анализа механизмов изогенизации (концертной эволюции) членов мультигенного семейства. Основные генетические процессы, лежащие в основе изогенизации, были описаны на примере рДНК различных эукариот.
Сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов рДНК эукариот является эффективным подходом для исследования закономерностей эволюционного процесса. Характерной особенностью рДНК является то, что различные структурные элементы данного участка генома эволюционируют с разной скоростью. Наиболее эволюционно консервативными районами являются гены рибосомных РНК (18S, 5.8S и 28S) - их сравнительный анализ эффективен при исследовании генетических дистанций между эволюционно отдаленными таксонами. Внешний и внутренние транскрибируемые спейсеры (ETS, ITS1 и ITS2) эволюционируют более активно - их сравнительный анализ эффективен при исследовании филогенетических взаимоотношений между близкородственными видами. Внешний транскрибируемый спейсер (NTS) является наиболее изменчивой
частью рДНК - в пределах одного генома может содержаться несколько типов NTS -анализ изменчивости данного района рДНК, с нашей точки зрения, позволит проследить первые этапы эволюционного процесса, то есть возникновение индивидуальных, внутрипопуляционных и межпопуляционных генетических различий, предшествующих возникновению нового вида.
Молекулярно-генетическая организация рДНК различных эукариот во многом сходна, в то же время, каждый вид обладает рядом структурных и функциональных особенностей, характерных для данного участка генома. С нашей точки зрения, для комплексного понимания всего разнообразия генетических процессов, лежащих в основе функциональной активности и эволюционной изменчивости живых организмов, необычайно важным является молекулярно-генетические исследования новых, ранее не исследованных видов, то есть традиционно не являющихся "модельными".
Отметим, что методы генетической инженерии, получившие в последние десятилетия большое развитие, позволяют не только генетически модифицировать живые организмы, но и, что, с нашей точки зрения, особенно важно, изучать биологическую роль конкретных генов посредством специфического подавления функциональной активности соответствующих РНК. В этой связи особенно актуальными представляются работы, направленные на разработку новых векторных систем, позволяющих переносить чужеродный генетический материал в геном исследуемого объекта. Для получения трансгенных насекомых одним из подходов является использование денсовирусов.
Промотор, обуславливающий экспрессию генов рибосомных РНК (промотор
РНК полимеразы I), в отличие от промоторов РНК полимеразы II, обуславливающих транскрипцию большинства генов, кодирующих информацию о белках, обладает 8 рядом уникальных особенностей. Во-первых, данный промотор обуславливает гиперэкспрессию РНК. Клетки эукариотических организмов синтезируют около 10000 различных типов РНК, при этом около половины транскрипционной активности направлено на синтез только одного типа РНК, а именно рибосомных РНК. Во-вторых, данный промотор не обладает тканеспецифичностью и не подвержен эпигенетической регуляции, то есть активно работает во все типах клеток на всех стадиях развития организма. В-третьих, является видоспецифичным. Так, например, показано, что промотор РНК полимеразы I D. melanogaster не активен в клетках D. virilis. С нашей точки зрения, вышеперечисленные особенности позволяют предположить, что промотор, обуславливающий экспрессию генов рибосомных РНК, может быть использован как уникальный инструмент для решения многих экспериментальных задач методами генетической инженерии. В частности, для исследования функциональной значимости конкретных генов методом "нокаута", посредством экспрессии двунитивой РНК (то есть транскрипции соответствующей ' палиндромной последовательности ДНК), комплементарной изучаемому гену, под контролем промотора РНК полимеразы I.
Цели и задачи исследования.
Сравнительный анализ молекулярно-генетической организации рДНК различных видов организмов, как было показано выше, необычайно важен для понимания механизмов функционирования и эволюции живых организмов. В этой связи одной из целей данного исследования являлось разработка "универсальных" методических подходов, позволяющих исследовать структуру рДНК любых эукариотических организмов вне зависимости от видовой принадлежности.
Второй целью данного исследования являлось описание и выявление особенностей структурной организации и эволюционной изменчивости рДНК нескольких видов насекомых (на примере отряда Blattodea).
Третьей целью являлось характеристика открытого нами нового вида денсовирусов - BgDNV - потенциальной векторной системы, позволяющей экспрессировать чужеродную генетическую информацию в клетках насекомых под контролем мощного промотора генов рибосомных РНК.
В соответствии со сказанным выше были сформулированы следующие основные задачи данного исследования.
1) Посредством анализа in silico рДНК эукариот выявить универсальные праймеры и молекулярные зонды, позволяющие исследовать методами ПЦР и блот гибридизации рДНК любых эукариотических организмов. Привести экспериментальные доказательства "универсальности" предложенных методических подходов.
2) Клонировать и секвенировать полноразмерный повтор рДНК рыжего таракана Blattella germanica. Описать структурно-функциональные элементы данного участка генома.
3) Описать внутривидовой полиморфизм различных структурных элементов рДНК рыжего таракана. На основе выявленного полиморфизма исследовать генетическую структуру природных популяций данного вида.
4) На основе анализа изменчивости нуклеотидов 28S генов рРНК определить генетические дистанции между представителями различных родов отряда Blattodea. Провести анализ эволюционной изменчивости внутренних и внешних транскрибируемых спейсеров у близкородственных видов родов Blattella и Periplaneta. Клонировать, секвенировать и описать структуру ДНК обнаруженного нами денсовируса рыжего таракана SgDNV.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Генетика", Муха, Дмитрий Владимирович
выводы
1) Выявлены in silico высококонсервативные домены рибосомной ДНК (рДНК) эукариот. Впервые подобраны универсальные праймеры, позволяющие методом ПЦР амплифицировать полноразмерные копии повторов рДНК различных эукариот. Клонированы высококонсервативные районы рДНК простейших и созданы универсальные зонды, позволяющие методом блот гибридизации изучать ПДРФ рДНК различных эукариот. Применимость полученных универсальных праймеров и зондов показана на примере анализа структуры рДНК эволюционно отдаленных таксонов: простейших, животных и растений.
2) Клонирован и секвенирован полноразмерный повтор (9015 п. н.) рДНК рыжего таракана Blattella germanica. Впервые для этого вида насекомых описана структура изучаемого района генома (нетранскрибируемый спейсер, внешний и внутренние транскрибируемые спейсеры, гены 18S, 5.8S и 28S рибосомных РНК) и охарактеризованы функционально значимые регуляторные элементы.
3) Впервые обнаружен и охарактеризован внутривидовой полиморфизм нетранскрибируемого спейсера рДНК Blattella germanica. С помощью созданных ПДРФ маркеров проведен анализ генетической структуры лабораторных линий и природных популяций данного вида насекомых. Показано, что маркеры ПДРФ рДНК позволяют дифференцировать популяции тараканов и определять генетические дистанции между ними.
4) Проведен анализ эволюционной изменчивости 5.8S рДНК, двух транскрибируемых спейсеров и протяженного фрагмента 28S рДНК у 11 видов отряда Тараканы. Показано, что генетическая изменчивость фрагмента (-1200 п н) 28S рДНК, в отличии от других исследованных участков генома, отражает филогенетические дистанции между видами отряда Тараканы.
5) Проведен сравнительный анализ структуры двух внутренних транскрибируемых и внешнего транскрибируемого спейсеров рДНК у близкородственных видов на примере тараканов двух родов - Blattella и Periplaneta. Выявлен внутривидовой генетический мономорфизм и сальтационный характер эволюции данных участков генома.
6) Открыт, клонирован и описан новый вирус рыжего таракана Blattella germanica (SgDNV). Показано, что исследованный вирус принадлежит семейству Parvoviridae, род Densovirus. Проведен электронно-микроскопический анализ ДНК вируса и ультратонких срезов тканей рыжего таракана, инфицированных вирусом. Проведены определение полной последовательности нуклеотидов (5335 п н) и компьютерный анализ ДНК исследованного вируса. Выявлены и описаны структурно-функциональные элементы исследованного вируса: пять открытых рамок считывания, промоторы и концевые инвертированные повторы.
Клонированный денсовирус представляет собой многообещающий инструмент для исследования рыжего таракана методами генетической инженерии и разработки новаторских экологически чистых способов регуляции численности данного вида насекомых
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Муха, Дмитрий Владимирович, Москва
1. Алешин В. В., Владыческая Н. С., Кедрова О. С., Милютина И. А., Петров Н. Б. Сравнение генов 18S рРНК в филогении бесповоночных // Молекуляр. Биология. 1995. Т. 29. С. 1408-1426.
2. Алтухов Ю. П. Генетические процессы в популяциях // Москва. "Академкнига". 2003. 431 с.
3. Антонов А. С. Основы геносистематики растений. М.: МАИК "Наука/Интерпериодика", 2000.134 с.
4. Башкиров В. Н. Регуляция числа генов рибосомных РНК у дрозофила // Генетика. 1980. Т. 16. С. 7-29.
5. Бей-Биенко Г. Г. Низшие, древнекрылые, с неполным превращением . Определитель насекомых европейской части СССР. 1964. Т. 1. Наука. Москва.
6. Глотов Н. В, Животовский Л. А., Хованов Н. В., Хромов-Борисов Н. Н. Биометрия. (Ред. Тихомирова М. М.) Изд. Ленинградского Университета. 1982. 264 с.
7. Кафиани К. А. и Костомарова А. А. Информационные макромолекулы в раннем развитии животных. 1978. М., "Наука". С. 44.
8. Нейфах А. А. и Тимофеева М. Я. Молекулярная биология процессов развития. 1977. М., "Наука". С. 47.
9. Нейфах А. А. и Тимофеева М. Я. Проблемы регуляции в молекулярной биологии развития. 1978. М., "Наука". С. 19.
10. Спирин А. С. "Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка" Высшая школа, Москва,1986.
11. Adoutte A., Balavoine G., Lartillot N., deRosa R. The end of intermedia taxa? // Animal Evol. 1999. V. 15. P. 104-108.
12. Afanasiev, В. N. Galyov, E. E., Buchatsky L. P., Kozlov Y. V. Nucleotide sequence and genome organization of Aedes densonucleosis virus. Virology. 1991. V. 185. P. 323336.
13. Afanasiev, B. N., Ward T. W., Beaty B. J., Carlson J. O. Transduction of Aedes aegypti mosquitoes with vectors derived from Aedes densovirus // Virology. 1999. V. 257. P. 62-72.
14. Allmang C. and Tollervey D. The role of the 3' external transcribed spacer in yeast pre-rRNA processing // J. Mol. Biol. 1998. V. 278. P. 67-78.
15. Alvares L. E., Brison O., Ruiz I. R. Identification of enhancer-like elements in the ribosomal intergenic spacer of Odontophrynus americanus 2n and 4n (Amphibia, Anura) // Genetica. 1998. V. 104. P. 41-44.
16. Appels R., Gerlach W. I., Dennis E. S., Swift H., Peacock W. J. Molecular and chromosomal organization of DNA sequences coding for the ribosomal RNAs in cereals // Chromosoma. 1980. V. 78. P. 293-311.
17. Arnheim N. Concerted evolution of multigene families. In: Evolution of Genes and Proteins (Eds. Nei M. and Koehn R. K.) 1983. P. 38-61. Sinauer, Sunderland.
18. Arnheim N. M., Krystal M., Schmickel R., Wilson G., Ryder O., Zimmer E. Molecular evidence for genetic exchanges among ribosomal genes on nonhomologous chromosomes in man and ape // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77. P. 7323-7327.
19. Arnheim N. Treco D., Taylor В., Eicher E. Distribution of ribosomal gene length variants among mouse chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. P. 46774680.
20. Atwood К. C. Some aspects of the bobbed problem in Drosophila II Genetics. 1969. V. 61. P. 319-324.
21. Bakken A., Morgan G., Sollner-Webb B.( Roan J., Busby S.( Reeder R. H. Mapping of the transcription initiation and termination signals on Xenopus laevis ribosomal DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. P. 56-60.
22. Baldridge G. D. and Fallon A. M. Primery structure of the ribosomal DNA intergenic spacer from the Mosquito, Aedes albopictusll DNA Cell Biol. 1992. V. 11. P. 51-59.
23. Baldwin B. G. and Markos S. Phylogenetic utility of the external transcribed spacer (ETS) os 18S-26S rDNA: Congruence of ETS and ITS trees of Calycadenia (Compositae) // Mol. Phyl. Evol. 1998. V. 10. P. 449-463.
24. Baldwin B. G., Sanderson M. J., Porter J. M., Wojciechowski M. F., Campbell C. S.p Donoghue M. J. The ITS region of nuclear ribosomal DNA: a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny//Ann. Mol. Bot. Gard. 1995. V. 82. P. 247-277.
25. Bartsch I., Schoneberg C., Grummt I. Evolutionary changes of sequences and factors that direct transcription termination of human and mouse ribosomal genes // Mol. Cell. Biol. 1987. V. 7. P. 2521-2529.
26. Barker R. F., Harberd N. P., Jarvis M. G., Flavell R. B. Structure and evolution of the intergenic region in a ribosomal DNA repeat unit of wheat//J. Mol. Biol. 1988. V. 201. P. 117.
27. Bartnik E., Bartoszewski S., Borsuk P., Empel J. Aspergillis niduians 5SrRNA genes and pseudogenes // Curr. Genet. 1986. V. 10. P. 453-457.
28. Bateman E., lida С. Т., Kownin P., Paule M. R. Footprinting of ribosomal RNA genes by transcription initiation factor and RNA polymerase I // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 8004-8008.
29. Benson R. H., Spindler S. R., Hodo H. G., Blatti S. P. DNA-dependent RNA polymerase II stimulatory factors from calf thymus: Purification and structural studies. // Biochemistry. 1978. V17. P. 1387.
30. Bergoin, M., Tijssen P. Molecular biology of densovirinae. In "Parvoviruses. From molecular biology to pathology and therapeutic uses" (Faisst S. Rommelaere J., Ed). 2000. V. 4. P. 12-32. Contrib Microbiol. Basel, Karger.
31. Boyd D. C., Greger I. H, and Murphy S. In vivo footprinting studies suggest a role for chromatin in transcription of the human 7SK gene // Gene. 2000. V. 247. P. 33-44.
32. Brown D. D. and Dawid I. B. Specific gene amplification in oocytes II Science. 1968. V. 160. P. 272-280.
33. Boncinelli E., Graziani F., Polito L., Malva C., Ritossa F. rDna magnification at the bobbed locus of the Y chromosome in D. melanogaster// Cell Diff. 1972. V. 1. P. 133-139.
34. Brown D. D. and Blackler A. W. Gene amplification proceeds by a chromosomal copy mechanism //J. Mol. Biol. 1972. V. 63. P. 75-83.
35. Bruno W. J., Socci N. D., Halpern A. L. Weighted neighbor joining: a likelihood-based approach to distance-based phylogeny reconstraction // Mol. Biol. Evol. 2000. V. 17. P. 189-197.
36. Bucher P. Weight matrix description of four eukaryotic RNA polymerase II promotor elements derived from 502 unrelated promotor sequences // 1989. J. Mol. Biol. V. 212. P. 563-578.
37. Burke W. D., Eickbush Т. H., Xiong Y., Jakubczak J., Eickbush Т. H. Sequence relationship of retrotransposable elements R1 and R2 within and between divergent insect species II Mol. Biol. Evol. 1993. V. 10. P. 163-185.
38. Burke W. D., Malik H. S., Lathe W. C., , Eickbush Т. H. Are retrotransposons long-term hitchhikers? // Nature. 1998. V. 392. P. 141-142.
39. Burke J. M. Sequences and classification of group I and group II introns // Methods Enzymol. 1989. V. 180. P. 533-545.
40. Busby S. J. and Reeder R. H. Spacer sequences regulate transcription of ribosomal gene plasmids injected into Xenopus embryos // Cell. 1983. V. 34. P. 989-996.
41. Campbell В. C„ Steffen-Campbell J. D., Werren J. H. Phylogeny of the Nasonia species complex (Hymenoptera: Pteromalidae) inferred from an internal transcribed spacer (ITS2) and 28S rDNA sequences // Insect Mol. Biol. 1993. V. 2. P. 225-237.
42. Carranza S., Baguna J., Riutort M. Origin and evolution of paralogous rRNA gene cluster within the flatworm family Dugesiidae (Platyhelminthes, Tricldida) II J. Mol. Evol. 1999. V. 49. P. 250-259.
43. Cassidy B. G., Yang-Yen H.-F., Rothblum L. I. Additional RNA polymerase I initiation site within the nontranscribed spacer of the rat rRNA gene II Mol. Cell. Biol. 1987. V. 7. P. 2388-2396.
44. Cavalli-Sforza L. L. and Edwards A. W. F. Phylogenetic analysis: models and estimation procedures II Evolution. 1967. V. 22. P. 550-570.
45. Cech T. R. Self splicing of group I introns II Annu. Rev. Biochem. 1990. V. 59. P. 543-568.
46. Cech T. R. Self-splicing RNA: implication for evolution II International Review of Cytology. 1985. V. 93. P. 3-22.
47. Chomczynsky P. and Sacchi N. Single-srep method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Anal. Biochem. 1987. V. 2. P. 156-159.
48. Cluster P. D., Marinkovlc D.( Allard R. W., Ayala F. J. Correlations between development rates, enzyme activities, ribosomal DNA spacer-length phenotypes, and adaptation in Drosophila melanogaster // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 610614.
49. Clos J., Buttgereit D., Grummt I. A purified transcription factor (TIF-IB) binds to essential sequences of the mouse rDNA promoter // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 604-608.
50. Coen E. S. and Dover G. A. Unequal exchanges and the coevolution of X and Y rDNA arrays in Drosophila melanogasterII Cell. 1983. V. 33. P. 849-855.
51. Coen E. S., Strachan Т., Dover G. A. Dynamics of concerted evolution of ribosomal DNA and histone gene families in the melanogaster species subgroup of Drosophila II J. Mol. Biol. 1982a. V. 158. P. 17-35.
52. Coen E. S., Thoday J. M., Dover G. A. The rate of turnover of structural variants in the ribosomal gene family of Drosophila melanogaster И Nature. 1982b. V. 295. P. 564568.
53. Coggins L. W. Preparation of nucleic acid for electron microscopy. In: Electron microscopy in molecular biology: a practical approach. (Eds. Sommerville J. and Scheer U.). 1987. Oxford. IRL Press Limited. P. 1 -29.
54. Cooper D. N. and Schmidtke J. DNA restriction fragment length polymorphisms and heterozygosity in the human genome // Hum. Genet. 1984. V. 66. P. 1-16.
55. Crease T. J. Ribosomal DNA evolution at the population level: nucleotide variation in intergenic spacer arrays of Daphnia pulex II Genetics. 1995. V. 141. P. 1327-1337.
56. Cullis C. A. and Charlton L. The induction of ribosomal DNA changes in flax II Plant Sci. Lett. 1981. V. 20. P. 213-217.
57. Cumming M. P., Otto S. P., Wakeley J. Sampling properties of DNA sequence data in phylogenetic studies // Mol. Biol. Evol. 1995. V. 12. P. 814-822.
58. D'Allesio J. M., Perna P. J., Paule M. R. DNA-dependent RNA polymerases from Acantahamoeba castellanii: Comparative subunit structure of the homogeneous enzymes // J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 11282-11287.
59. Degroote I., Pont G., Micard D., Picard G. Extrachromosomal circular DNAs in D. melanogaster. comparison between embryos and Kc cells // Cromosoma. 1989. V. 98. P. 201-206.
60. Delany M. E. and Krupkin A. B. Molecular characterization of ribosomal gene variatin within and among NORs segregating in specialized populations of chicken // Genome. 1999. V. 42. P. 60-71.
61. Delcasso-Tremousaygue D., Grellet F., Panabieres F., Ananiev E. D., Delseny M. Structural and transcriptional characterization of the external spacer of a ribosomal RNA nuclear gene from a higher plant // Eur. J. Biochem. 1988. V. 172. P. 767-776.
62. De Winter R. F. and Moss T. Spacer promoters are essential for efficient enhancement of X. laevis ribosomal transcription // Cell. 1986. V. 44. P. 313-318.
63. Dover G. A molecular drive through evolution // Bioscience. 1982a. V. 32. P. 526533.
64. Dover G. Molecular drive: a cohesive mode of species evolution // Nature. 1982b. V. 299. P. 111-117.
65. Dover G. and Coen E. Springcleaning ribosomal DNA: a model for multigene evolution? // Nature. 1981. V. 290. P. 731-732.
66. Dumas, В., Jourdan, M., Pascaud, A.-M., Bergoin, M. Complete nucleotide sequence of the cloned infectious genome of Junonia coenia densovirus reveals an organization unique among parvoviruses. Virology. 1992. V. 191. P. 202-222.
67. Edwards A. M., Kane С. M., Young R. A., Kornberg R. D. Two dissociable subunits of yeast RNA polymerase II stimulate the initiation of transcription at a promoter in vitro // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 71-75.
68. Eickbush Т. H. R2 and related site-specific non-LTR retrotransposons. In: Mobile DNA (Eds. Craig N. Craigie R., Gellert M. and Lambowitz A.). 2002. P. 813-835. American Society of Microbiology Press, Washington, DC.
69. Elion E. A. and Warner J. R. An RNA polymerase I enhancer in Saccharomyces cerevisiae// Mol. Cell. Biol. 1986. V. 6. P. 2089-2097.
70. Enea V. and Corredor V. The evolution of plasmodial stage specific rRNA genes is dominated by gene conversion //J. Mol. Evol. 1991. V. 32. P. 183-186.
71. Engberg J. The ribosomal RNA genes of Tetrahymena: structure and function // European Journal of Cell Biology. 1985. V. 36. P. 133-151.
72. Fediere, G. Epidemiology and pathology of densovirinae. In "Parvoviruses. From molecular biology to pathology and therapeutic uses"(Faisst S. Rommelaere J., Ed). 2000. V. 4. P. 1-11. Contrib Microbiol. Basel, Karger.
73. Fenton В., Malloch G., Germa F. A study of variation in rDNA ITS regions show that two haplotypes coexist within a single aphid genome// Genome. 1998. V. 41. P. 337-345.
74. Ferat J. L. and Michel F. Group II self-splicing introns in bacteria // Nature. 1993. V. 364. P. 358-361.
75. Financsek I., Mizomoto K., Mishima Y., Muramatsu M. Human ribosomal RNA gene: Nucleotide sequence of the transcription initiation region and comparison of three mammalian genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. P. 3092-3096.
76. Firek S., Read C., Smith D. R., Moss T. Point mutation analysis of the Xenopus laevis RNA polymerase I core promoter// Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 105-109.
77. Flavell R. В. Variation in structure and expression of ribosomal DNA loci in wheat // Genome. 1993. V. 31. P. 963-968.
78. Forterre P. and Phillipe H. Where is the root for the universal tree of life // BioEssay. 1999. V. 21. P. 871-879.
79. Franz G. and Kunz W. Intervening sequences in ribosomal RNA genes and bobbed phenotype in Drosophila hydeill Nature. 1981. V. 292. P. 638-640.
80. Fritz G. N., Conn J., Cockburn A., Seawright J. Sequence analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacer 2 from populations of Anopheles nuneztovari (Diptera: Culicidae) // Mol. Biol. Evol. 1994. V. 11. P. 406-416.
81. Gabrielsen O. S. and Sentenac A. RNA polymerase С (III) and its transcription factors//Trends Biochem. Sci. 1991. V. 16. P. 412-416.
82. Gall J. G. Differential synthesis of genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1968. V. 60. P. 553-559
83. Gall J. G. The genes for ribosomal RNA during oogenesis // Genetics. 1969. V. 61. P. 121-131.
84. Gantley A. R. and Scott B. Extraordinary ribosomal spacer length heterogeneity in a neotyphodium endophyte hybrid: implications for concerted evolution // Genetics. 1998. V. 150. P. 1625-1637.
85. Gentile K., Burke W. D., Eickbush Т. H. Multiple lineages of R1 retrotransposable elements can coexist in the rDNA loci of Drosophila И Mol. Biol. Evol. 2001. V. 18. P. 235245.
86. Geiduschek E. P. and Tocchini-Valentini G. P. Transcription by RNA polymerase III //Annu. Rev. Biochem. 1988. V. 57. P. 873-914.
87. Gerbi S. A. Evolution of ribosomal DNA // In: Molecular Evolutionary Genetics. N. V.: Plenum, 1985. P. 419-517.
88. Gomez-Zurita J., Juan C., Petitpierre E. The evolutionary history of the genus Timarcha (Coleoptera, Chrysometidae) inferred from mitochondrial COII gene and partial 16S rDNA sequences // Mol. Phylogenet. Evol. 2000. V. 14. P. 304-317.
89. Grandcolas P. The phylogeny of cockroach families: a cladistic appraisal of morpho-anatomical data // Can. J. Zool. 1996. V. 74. P. 508-527.
90. Gray W. Origin and evolution of mitochondrial DNA // Annu. Rev. Cell Biol. 1989. V. 5. P. 25-50. Good P. Permutation test. 1993. Springer Verlag, New York.
91. Graziani F., Boncinelli E., Malva C., Gargano S. Mutual regulation of magnified bobbed loci in D. me/anogaster// Mol. Gen. Genet. 1974. V. 134. P. 307 312.
92. Gray M. W. and Schnare M. N. Evolution of rRNA gene organization. In: Ribosomal RNA structure, evolution, processing, and function in protein biosynthesis ( Eds. Zimmerman & Dahlberg A. E.). 1996. P. 49-70. New York. CRC Press.
93. Grimaldi G., Fiorentini P., Di Nocera P. P. Spacer promoters are orientation-dependent activators of pre-rRNA transcription in Drosophila melanogaster // Mol. Cell. Biol. 1990. V. 10. P. 4667-4677.
94. Grimaldi G. and Di Nocera P. P. Multiple repeated units in Drosophila melanogaster ribosomal DNA spacer stimulate rRNA precursor transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 5502-5506.
95. Grondal E. J. M.( EversR., Cornelissen A. W. C. A. Identification and sequence analysis of the ribosomal DNA promoter region of Crithidia fasciculata // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 1333-1338.
96. Grummt I. Mapping of a mouse ribosomal DNA promoter by in vitro transcription // Nucleic Acids Res. 1982. V. 9. P. 6093-6102.
97. Grummt I., Kuhn A., Bartsch I., Rosenbauer H. A transcription terminator located upstream of the mouse rDNA initiation site affects rRNA synthesis // Cell. 1986. V. 47. P. 901-911.
98. Grummt I., Maier U., Ohrlein A., Hassouna N. Bachellerie J. P. Transcription of mouse rDNA terminates downstream of the 3' end of 28S RNA and involves interaction of factors with repeated sequences in the 3' spacer// Cell. 1985. V. 43. P. 801-810.
99. Grummt I., Roth E., Paule M. R. Ribosomal RNA transcription in vitro is species specific // Nature. 1982. V. 296. P. 173-174.
100. Haltiner M. M., Smale S. Т., Tjian R. Two distinct promoter elements in the human rRNA gene identified by linker scanning mutagenesis // Mol. Cell. Biol. 1986. V. 6. P. 227235.
101. Hancock J. M., Tautz D., Dover G. A. Evolution of the secondary structures andcompensatory mutations of the ribosomal RNAs of Drosophila melanogaster II Mol. Biol.
102. Evol. 1988. V. 5. P. 393-414.
103. Harlew R. S. and Tartof K. D A two-stage model for the control of rDNAmagnification // Genetics. 1985. V. 109. P. 691-700.
104. Harley R. S. and Marcus С. H. Recombination controls of rDNA redundancy in
105. Drosophila //Ann. Rev. Genet. 1989. V. 23. P. 87-120.
106. Harrington C. A. and Chikaraishi D. M. Identification and sequence of the initiationsite for rat 45S ribosomal RNA synthesis // Nucleic Acids Res. 1983. V. 11. P. 3317-3347.233
107. Hasegawa M., Kishino H., Yano Т. Dating of the human-ape splitting by a molecular clock of mitochondrial DNA//J. Mol. Evol. 1985. V. 21. P. 160-174.
108. Hawley R. S. and Marcus С. H. Recombination controls of rDNA redundancy in Drosophila II Ann. Rev. Genet. 1989. V. 23. P. 87-120.
109. Henderson A. S., Eicher E. M., Yu M. Т., Atwood К. C. Variations in RNA gene number in mouse chromosomes // Cytogenet. Cell Genet. 1976. V. 17. P. 307-316.
110. Henderson A. and Ritossa F. M. On the inheritance of rDNA of magnified bobbed loci in D. melanogaster II Genetics. 1970. V. 66. P. 463- 468.
111. Henderson S. L., Ryan K., Sollner-Webb B. The promoter-proximal rDNA terminator augments initiation by preventing disruption of the stable transcription complex caused by polymerase read-in // Genes. Dev. 1989. V. 3. P. 212-223.
112. Henderson S. L. and Sollner-Webb B. A transcriptional terminator is a novel element of the promoter of themouse ribosomal RNA gene // Cell. 1986. V. 47. P. 891-900.
113. Hershkovitz M. A. and Lewis L. A. Deep-level diagnostic value of the rDNA-ITS region // Mol. Biol. Evol. 1996. V. 13. P. 1276-1295.
114. Hillis, D. M. and Davis S. K. Evolution of ribosomal DNA: fifty million years of recorded history in the frog genus Rana // Evolution. 1986. V. 40. P. 1275-1288.
115. Hillis D. M.f Moritz C., Mable В. K. (Eds) Molecular Systematics. 1996. 655p. SinauerAss. Sunderland, Massachusetts, USA.
116. Hillis D. M., Moritz C., Porter C. A., Baker R. J. Evidence for biased gene conversion in concerted evolution of ribosomal DNA//Science. 1991. V. 251. P. 308-310.
117. Hillis, D. M. and Dixon M. T. Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic inference//Q. Rev. Biol. 1991. V. 66. P. 411-453.
118. Hoshikawa Y., lida Y., Iwabuchi M. Nucleotide sequence of the transcriptional initiation region of Dictyostelium discoidium rRNA gene and comparison of the inition regions of three lower eukaryotic genes//Nucleic Acids Res. 1983. V. 11. P. 1725-1734.
119. Hottinger-Werlen A., Schaack J., Lapointe J., Mao J. I., Nichols M., Soli D. Dimeric tRNA gene arrangement in Schizosaccharomyces pombe allows increased expression of the downstream gene // Nucleic Acids Res. 1985. V. 13. P. 8739-8747.
120. Huet J., Buhler J. M., Sentenac A., Fromageot P. Dissociation of two polypeptide chains from yeast RNA polymerase A // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. P. 30343038.
121. Jackson J. A. and Fink G. R. Gene conversion between duplicated genetic elements in yeast// Nature. 1981. V. 292. P. 306-311.
122. Jakubczak J., Burke W. D., Eickbush Т. H. retrotransposable elements R1 and R2 interrupt the rDNA genes of most insect // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 3295-3299.
123. Jakubczak J., Xiong Y., Eickbush Т. H. Type I (R1) and type II (R2) ribosomal DNA insertions of Drosophila melanogaster are retrotransposable elements closely related to those of Bombyx moriII J. Mol. Biol. 1990. V. 212. P. 37-52.
124. Jakubczak J„ Zenni M. K., Woodruff R. C., Eickbush Т. H. Turnover of R1 (type I) and R2 (type II) retrotransposable elements in the ribosomal DNA of Drosophila melanogasterII Genetics. 1992. V. 131. P. 129-142.
125. Jamrich M. and Miller O. L. The rare transcripts of interrupted rRNA genes in Drosophila melanogaster are processed or degraded during synthesis // EMBO J. 1984. V. 3. P. 1541-1545.
126. Jones M. H., Learned R. M., Tjian R. Analysis of clustered point mutations in the human ribosomal RNA gene promoter by transient expression in vivo II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 669-673.
127. Kambhampati S. A phylogeny of cockroaches and related insects based on DNA sequence of mitochondrial ribosomal DNA genes // Proc. Nat. Acad. Sci. 1995. V. 92. P. 2017-2020.
128. Kambhampati S. Phylogenetic relationship among cockroach families inferred from 12S rRNA gene sequence // Sys. Entomol. 1996. V. 21. P. 81-98.
129. Kidd S. J. and Glover D. M. Drosophila melanogaster ribosomal DNA containing type II insertions is variably trancribed in different strains and tissues // J. Mol. Biol. 1981. V. 151. P. 645-662.
130. Kishimoto Т., Nagamine M., Sasaki Т., Tarakusa N. Miwa Т., Kominami R., Muramatsu M. Presence of a limited number of essential nucleotides in the promoter region of mouse ribosomal RNA gene // Nucleic Acids Res. 1985. V. 13. P. 3515-3532.
131. Kiss Т., Marshallsay C., Filipowicz W. Alteration of the RNA polymerase specifity of U3snRNA genes during evolution and in vitro II Cell. 1991. V. 65. P. 517-526.
132. Klass K. D. The external male genitalia and the phylogeny of Blattaria and Mantodea// Bonner Zoologische Beitrage. 1997. V. 42. P. 1-341.
133. Klein H. L. and Peters T. D. Intrachromosomal gene conversion in yeast // Nature. 1981. V. 289. P. 144-148.
134. Klemenz R. and Gelduschek E. P. The 5' terminus of the precursor ribosomal RNA of Saccharomyces cerevisiae II Nucleic Acids Res. 1980. V. 8. P. 2679-2689.
135. Kownin P., Bateman E., Paule M. R. Effect of single-base substitution within the Acantahamoeba castellani rRNA promoter on transcription and on binding of transcription initiation factor and RNA polymerase 11 Mol. Cell. Biol. 1988. V. 8. P. 747-753.
136. Kownin P., lida С. Т., Brown-Shimer S., Paule M. R. The ribosomal RNA promoter of Acantahamoeba castellani determined by transcription in a cell-free system // Nucleic Acids Res. 1985. V. 13. P. 6237-6247.
137. Krieder H. M. and Plaut W. Studies on nuclealar RNA synthesis in D. melanogaster. I. The relationship between number of nucleolar organizers and rate of synthesis // J. Cell Sci. 1972. V. 11. P. 675-681.
138. Krystal M., D'Eustachio P., Ruddle F. H., Arnheim N. Human nucleolus organizer on nonhomologous chromosomes can share the same ribosomal gene variants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P. 5744-5748.
139. Kuhn A., Deppert U., Grummt I. A 140-base-pair repetitive sequence element in the mouse rRNA gene spacer enhances transcription by RNA polymerase I in a cell-free system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 7527-7531.
140. Mackay Т., Lyman R. F., Jackson M. S., Terzian C., Hill W. G. Polygenic mutation in Drosophila melanogaster. estimates from divergence among inbred strains // Evolution. 1992. V. 46. P. 300-316.
141. Maekawa K. and Matsumoto T. Molecular phylogeny of cockroaches (Blattaria) based on mitochondrial COII sequences// Sys. Entomol. 2000. V. 25. P. 511-519.
142. Malik H. S., Burke W. D., Eickbush Т. H. The age and evolution of non-LTR retrotransposable elements// Mol. Biol. Evol. 1999. V. 16. P. 793-805.
143. Malik H. S.and Eickbush Т. H. Retrotransposable elements R1 and R2 in the rDNA units of Drosophila mercatorum: abnormal abdomen revisited // Genetics. 1999. V. 151. P. 653-665.
144. Malva G., Graziani F., Boncinelli E., Polito L., Ritossa F. Check of gene number during the process of rDNA magnification // Nature New Biology. 1972. V. 239. P. 135-139.
145. Mann C., Buhler J. M., Treich I., Sentenac A. RPC40, a unique gene for a subunit shared between yeast RNA polymerases A and С // Cell. 1987. V. 48. P. 627-637.
146. Margottin F., Dujardin G., Gerard M., Egly J. M., Huet J., Sentenac A. Participation of the TATA factor in transcription of the yeast U6 gene by RNA polymerase С // Science. 1991. V. 251. P. 424-426.
147. McMullen M. D., Hunter В., Phillips R. LM Rubenstein I. The structure of the maize ribosomal DNA spacer region // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P. 4953-4968.
148. McStay B. and Reeder R. H. A termination site for Xenopus RNA polymerase I also acts as an element of an adjacent promoter// Cell. 1986. V. 47. P. 913-920.
149. Melen G. J., Pesce C. G., Rossi M. S., Kornblihtt A. R. Novel processing in a mammalian nuclear 28S pre-rRNA: tissue-specific elimination of an "intron" bearing a hidden break site// EMBO J., 1999. V. 18. P. 3107-3118.
150. Memet S., Saurin W., Sentenac A. RNA polymerase В and С are more closely related to each other than to RNA polymerase AII J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 1004810051.
151. Metzenberg R. L., Stevens J. N., Selker E. U., Morzycka-Wroblewska E. Identification and chromosomal distribution of 5S rRNA genes in N. crassa II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 2067-2071.
152. Miller B. R., Crabtree M. В., Savage H. M. Phylogeny of fourteen Culex mosquito species, including the Culex pipiens complex, inferred from the internal transcribed spacers of ribosomal DNA II Insect Mol. Biol. 1996. V. 5. P. 93-107.
153. Miller J., McLachlan A. D., Klug A. Repetitive zinc-binding domains in the protein transcription factor IIIA from Xenopus laevis oocytes // EMBO J. 1985. V. 4. P. 1609-1614.
154. Mindell, D. P. and Honeycutt R. L. Ribosomal RNA in vertebrates: evolution and phylogenetic applications//Annu. Rev. Ecol. Syst. 1990. V. 21. P. 541-566.
155. Mohan J. and Ritossa F. M. Regulation of ribosomal RNA synthesis and its bearing on the bobbed phenotype in D. melanogaster И Develop. Biol. 1970. V. 22. P. 495-501.
156. Moran J. V. and Gilbert N. Mamalian LINE-1 retrotransposons and related elements. In: Mobile DNA (Eds. Craig N. Craigie R., Gellert M. and Lambowitz A.). 2002. P. 836-869. American Society of Microbiology Press, Washington, DC.
157. Morgan G. Т., Roan J. G., Bakken A. H., Reeder R. H. Variations in transcriptional activity of rDNA spacer promoters // Nucleic Acids Res. 1984. V. 12. P. 6043-6052.
158. Moss T. and Bimstiel M. L. The putative promoter of a Xenopus laevis ribosomal gene is reduplicated II Nucleic Acids Res. 1979. V. 6. P. 3733-3743.
159. Moss T. and Stefanovsky V. Y. Promotion and regulation of ribosomal transcription in eukaryotes by RNA polymerase I // Progress in Nuclear Acid Research and Molecular Biology. 1995. V. 50. P. 25-66.
160. Mukabayire O., Boccolini D., Lochouarn L., Fontenille D., Besansky N. J. Mitochondrial and ribosomal internal transcribed spacer (ITS2) diversity of the African malaria vector Anopheles funestusll Mol. Ecol. 1999. V. 8. P. 289-297.
161. Murtif V. L. and Rae P. M. In vivo transcription of rDNA spacers in Drosophila II Nucleic Acids Res. 1985. V. 13. P. 3221-3239.
162. Musters W., Knol J., Maas P., Dekker A. F., van Heerikhuizen H„ Planta R. J. Linker scanning of the yeast RNA polymerase I promoter // Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. P. 9661-9678.
163. Nagylaki T. Evolution of multigene families under interchromosomal gene conversion // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 3796-3800.
164. Nagylaki T. and Petes T. D. Intrachromosomal gene conversion and the maintenance of sequence homogeneity among repeated genes // Genetics. 1982. V. 100. P. 315-337.
165. Navajas M., Lagnel J., Gutierrez J., Boursot P. Species-wide homogeneity of nuclear ribosomal ITS2 sequences in the spider mite Tetranychus urticae contrasts with extensive mitochondrial COI polymorphism // Heredity. 1998. V. 80. P. 742-752.
166. Nei M. Genetic distance between population // Am. Nat. 1972. V. 106. P. 283-292.
167. Nei M. and Li V. Mathematical model for studing genetic variation in terms of restriction endonucleases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. P. 5269-5273.
168. Niles E. G., Sutiphong J., Haque S. Structure of Tetrahymena pyriformis rRNA gene // J. Biol. Chem. 1981. V. 256. P. 12849-12856.
169. Nogi Y., Yano R., Nomura M. Synthesis of large rRNAs by RNA polymerase II in mutants of Saccharomyces cerevisiae defective in RNA polymerase I // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 3962-3966.
170. Paskewitz S. M., Wesson D. M., Collins F. H. The internal transcribed spacers of ribosomal DNA in five members of the Anopheles gambiae species complex // Insect Mol. Biol. 1993. V. 2. P. 247-257.
171. Pasyukova E. G. and Nuzhdin S. V. Doc and copia instability in an isogenic Drosophila melanogaster stock II Mol. Gen. Genet. 1993. V. 240. P. 302-306.
172. Paule M. R. Comparative subunit composition of eukaryotic nuclear RNA polymerases//Trends Biochem. Sci. 1981. V. 6. P. 128-131.
173. Pawlowski J., Bolinar I., Fahrini J. F. Extreme differences in rates of molecular evolution of Foraminifera revealed by comparison of ribosomal DNA sequences and the fossil record // Mol. Biol. Evol. 1997. V. 14. P. 498-505.
174. Pennisi E. Genome data shake tree of life // Science. 1998. V. 280. P. 672-674.
175. Perelson A. S. and Bell G. I. Mathematical models for the evolution of multigene families by unequal crossing over// Nature. 1977. V. 265. P. 304-310.
176. Perez-Gonzalez С. E., Burke W. D., Eickbush Т. E. R1 and R2 retrotransposition and deletion in the rDNA loci on the X and Y chromosomes of Drosophila melanogaster // Genetics. 2003. V. 165. P. 675-685.
177. Perez-Gonzalez С. E. and Eickbush Т. E. Dynamic of R1 and R2 elements in the rDNA locus of Drosophila simulans// Genetics. 2001. V. 158. P. 1557-1567.
178. Perez-Gonzalez С. E. and Eickbush Т. E. Rates of R1 and R2 retrotransposition and elimination from the rDNA locus of Drosophila melanogaster I I Genetics. 2002. V. 162. P. 799-811.
179. Perna P. J., Harris G. H., lida С. Т., Kownin P., Bugren S., Paule M. R. The start site of the Acantahamoeba castellani ribosomal RNA transcription unit // Gene Exp. 1992. V. 2. P. 71-78.
180. Petes T. D. Unequal meiotic recombination within tandem arrays of yeast ribosomal DNA genes // Cell. 1980. V. 19. P. 765-774.
181. Pfleiderer C., Smid A., Bartsch I., Grummt I. An undecamer DNA sequence directs termination of human ribosomal gene transcription // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 4727-4736.
182. Pikaard C. S., Pape L. K.f Henderson S. L., Ryan K., Paalman M. H., Lopata M. A., Reeder R. H., Sollner-Webb B. Enhancers for RNA polymerase I in mouse ribosomal DNA // Mol. Cell. Biol. 1990. V. 10. P. 4816-4825.
183. Filler K. J., Baerson S. R., Polans N. O., Kaufman L. S. Structural analysis of the short length ribosomal DNA variant from Pisum sativum L. cv. Alaska // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 3135-3145.
184. Poland D. Recursion relation generation of probability profiles for specific-sequence macromolecules with long-range correlations//Biopolymers. 1974. V. 13. P. 1859-1871.
185. Pruitt S. C. and Reeder R. H. Effect of topological constraint on transcription of ribosomal DNA in Xenopus oocytes // J. Mol. Biol. 1984. V. 174. P. 121-139.
186. Radek R. and Fabel P. A new entomopoxvirus from a cockroach: light and electron microscopy//J. Invertebrate Pathology. 2000. V. 75. P. 19-27.
187. Reeder R. H. Enhancers and ribosomal gene spacers // Cell. 1984. V. 38. P. 349351.
188. Reeder R. H. Regulatory elements of the generic ribosomal gene // Curr. Opin. Cell. Biol. 1989. V. 1. P. 466-474.
189. Reeder R. H. rRNA synthesis in the nucleolus // Trends Genet. 1990. V. 6. P. 390394.
190. Rich S. M., Rosenthal В. M., Telford S. R., Spielman A., Hartl D. L., Ayala F. J. Heterogenety of the internal transcribed spacer (ITS-2) region within individual deer ticks // Insect Mol. Biol. 1997. V. 6. P. 123-129.
191. Ritossa F. M. Unstable redundancy of genes for ribosomal RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1968. V. 60. P. 509-519.
192. Ritossa F. M. Procedure for magnification of lethal deletions of genes for ribosomal RNA // Nature New Biology. 1972. V. 240. P. 109 -111.
193. Ritossa F. Crossing-over between X and Y chromosomes during ribosomal DNA magnification in D. melanogaster// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. V. 70. P. 1950-1955.
194. Ritossa F. The bobbed locus. In: The genetics and biology of Drosophila. V. 1b (Eds. Aschburner M. and E. Novitski). London New York - San Francisco. 1976. P. 801812.
195. Ritossa F. M. and Scala G. Equilibrium variations in the redundancy in D. melanogaster // Genetics. 1969. V. 61. P. 305-314.
196. Robbins L. G. Genetically induced mitotic recombination in the heterochromatin of Drosophila melanogaster II Genetics. 1981. V. 99. P. 443-459.
197. Rocheford T. R., Osterman J. C., Gardner С. O. Variation in the ribosomal DNA intergenic spacer of a maize population mass-selected for high grain yield // Theor. Appl. Genet. 1990. V. 79. P. 793-800.
198. Rosenstreich D. L, Eggleston P., Kattan M., Baker D„ Slavin R. G.f Gergen P.(1997) The role of cockroach allergy and exposure to cockroach allergen in causing morbidity among inner-city children with asthma. N. Engl. J. Med. 1997. V. 336. P. 1356-1363.
199. Ross M. H. Cytological studies of Blattella germanica and Blattella asahinai. I. A possible genetic basis of interspecific divergence II Genome. 1988. V. 30. P. 812-819.
200. Ross M. H. and Cochran D. G. The German cockroach, Blattella germanica. In: Handbook of genetics (Ed. King R. C.) 1975. V. 3. P. 35-62. Plenum Press. NY.
201. Rothblum L. I., Reddy R., Cassidy B. Transcription initiation site of rat ribosomal DNA II Nucleic Acids Res. 1982. V. 10. P. 7345-7362.
202. Saiga H., Mizumoto K., Matsui Т., Higashinakagawa T. Determination of the transcription initiation site of Tetrahymena pyriformis rDNA using in vitro capping of 35S pre-RNA// Nucleic Acids Res. 1982. V. 10. P. 4223-4236.
203. Saldanha R., Mohr G., Belfort M., Lambowitz A. M. Group I and group II introns // FASEB J. 1993. V. 7. P. 15-24.
204. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
205. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 5463-5467.
206. Sawadogo M. and Sentenac A. RNA polymerase В (II) and general transcription factors//Annu. Rev. Biochem. 1990. V. 59. P. 711-754.
207. Schlotterer C., Hauser M., Haeseler A., Tautz D. Comparative evolutionary analysis of rDNA ITS regions in Drosophila// Mol. Biol. Evol. 1994. V. 11. P. 513-522.
208. Selker E. U., Yanofsky C., Driftmier K., Metzenberg R. L., Alzner-DeWeerd В., Raj'Bhandary . L. Dispersed 5S RNA genes in N. crassa: Structure, expression and evolution. II Cell. 1981. V. 24. P. 819-828.
209. Sellem С. H., Lecellier G., Belcour L. Transposition of a group II intron // Nature. 1993. V. 366. P. 176-178.
210. Sentenac A. Eukaryotic RNA polymerases // CRC Crit. Rev. Biochem. 1985. V. 18. P. 31-90.
211. Severini C„ Silvestrini F., Mancini P., La Rosa G., Marinucci M. Sequence and secondary structure of the rDNA second internal transcribed spacer in the sibling species Culex pipiens & Cx. quinquefasciatus II Insect Mol. Biol. 1996. V. 5. P. 181-186.
212. Shalet A. Exchanges at the bobbed locus of D. melanogaster 11 Genetics. 1969. V. 63. P. 133-142.
213. Simmen K. A., Bernues J., Parry H. D., Stunnenberg H. G., Berkenstam A., Cavallini В., Egly J. M., Mattaj I. W. TFIID is required for in vitro transcription of human U6 gene by RNA polymerase III II EMBO J. 1991. V. 10. P. 1853-1862.
214. Skinner J. A., Ohrlein A., Grummt I. In vitro mutagenesis and transcriptional analysis of a mouse ribosomal promoter elements // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 2137-2141.
215. Smith G. P. Unequal crossover and the evolution of multigene families II Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1973. V. 38. P. 507-513.
216. Smith G. P. Evolution of repeated DNA sequences by unequal cross over // Science. 1976. V. 191. P. 528-534.
217. Smith S. D., Oriahi E., Yang-Yen H.-F., Xie W., Chen C., Rothblum L. I. // Interaction of RNA polymerase I transcription factors with a promoter in the nontranscribed spacer of rat ribosomal DNA//Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 1677-1685.
218. Sollner-Webb B. and Reeder R. H. The nucleotide sequence of the initiation and termination sites for ribosomal RNA transcription in X. laevis II Cell. 1979. V. 18. P. 485499.
219. Sollner-Webb В. and Tower J. Transcription of cloned eukaryotic ribosomal RNA genes//Ann. Rev. Biochem. 1986. V. 55. P. 801-830.
220. Spencer D. F., Collings J. C., Schnare M. N. Gray M. W. Multiple spacer sequences in the nuclear large subunit ribosomal RNA gene of Crithidia fasciculata И EMBO J. 1987. V. 6. P. 1063-1071.
221. Spindler S. R. Deoxyribonucleic acid dependent ribonucleic acid polymerase II specific initiation and elongation factors from calf thymus // Biochemistry. 1979. V 18. P. 4042.
222. Stambrook P. J. Heterogeneity in Chinese hamster ribosomal DNA // Chromosoma. 1978. V. 65. P. 153-159.
223. Stephens J. C., Gilbert D. A., Yuhki N. O'Brien S. J. Estimation of heterozygosity for single-probe multilocus DNA fingerprints // Mol. Biol. Evol. 1992. V. 9. P. 729-743.
224. Stuart G. W., McMurray J. V. Westerfield M. Replication, integration and stable germaline transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryous // Development. 1988. V. 103. P. 403-412.
225. Suzuki H., Tsuchiya K., Sakaizumi M., Wakana S., Sakurai S. Evolution of sites of ribosomal DNA in natural populations of field mouse, Apodemus speciosus II J. Mol. Evol. 1994. V. 38. P. 107-112.
226. Szostak J. W. and Wu R. Unequal crossing over in the ribosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae II Nature. 1980. V. 284. P. 426-430.
227. Tanaka N. Kato H., Ishikawa Y., Hisatake K., Tashiro K., Kominami R., Muramatsu M. Sequence-specific binding of a transcription factor TFID to the promoter region of mouse ribosomal RNA gene // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 13836-13842.
228. Tanada Y., Kaya H. K. Insect pathology. 1993. Academic Press, Inc.
229. Tang J., Toe L., Back C., Unnasch T. R. Intra-specific heterogeneity of the rDNA internal transcribed spacer in the Simulium damnosum (Diptera: Simuliidae) complex // Mol. Biol. Evol. 1996. V. 13. P. 244-252.
230. Tartof K. D. Increasing the multiplicity of rRNA genes in D. melanogaster // Science. 1971. V. 171. P. 294-301.
231. Tartof K. D. Regulation of ribosomal RNA gene multiplicity in D. melanogaster // Genetics. 1973. V. 73. P. 57-63.
232. Tartof K. D. Unequal mitotic sister chromatid exchange and disproportionate replication as mechanism regulation ribosomal RNA gene redundancy // Cold Spring Harbor Sympos. Quant. Biol. 1973. V. 38. P. 491-492.
233. Tartof K. D. Unequal mitotic sister chromatid exchange as the mechanism of ribosomal RNA gene magnification // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. V. 71. P. 19721976.
234. Templeton A. R., Hollocher H., Lawler S., Johnston J. S. Natural selection and ribosomal DNA in Drosophila И Genome. 1989. V. 31. P. 296-303.
235. Tower J., Culotta V. C., Sollner-Webb B. Factors and nucleotide sequences that direct ribosomal DNA transcription and their relationship to the stable transcription complex // Mol. Cell. Biol. 1986. V. 6. P. 3451-3462.
236. Townes Т. M., Lingrel J. В., Chen H. Y. Erythroid-specific expression of human }-globin genes in transgenic mice II EMBO J. 1986. V.4. P. 1715-1723.
237. Tranel P. J., Froehlich J., Goyal A., Keegstra K. A component of the chloroplastic protein import apparatus in targeted to the enter envelope membrane via a novel pathway // EMBO J. 1995. V. 14. P. 2436-2446.
238. Tyler В. M. Two complex regions, including a TATA sequence, are required for transcription by RNA polymerase I in Neurospora crassa II Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 1805-1811.
239. Vago, C., Duthoit, J. L., Delahaye, F. (1966). Les lesions nucleates de la "Virose a noyaaux denses" du Lepidoptere Galleria mellonella. Arch. Ges. Virusforsch. 1966. V. 18. P. 344-349.
240. Van der Sande C. A. F. M., Kwa M., Van Nues R.W., Van Heerikhuizen H., Raue H. A., Planta R. J. Functional analysis of internal transcribed spacer-2 of Saccharomyces cerevisiae ribosomal DNA // J. Mol. Biol. 1992. V. 223. P. 899-910.
241. Vogler A. P. and DeSalle R. Evolution and phylogenetic information content of the ITS-1 region in the tiger beetle Cicindela dorsalis II Mol. Biol. Evol. 1994. V. 11. P. 393405.
242. Volkov R. A., Komarova N. Y„ Panchuk I. I., Hemleben V. // Molecular evolution of rDNA external trinscribed spacer and phylogeny of sect. Petota (genus Solanum) // Mol. Phyl. Evol. 2003. V. 29. P. 187-202.
243. Waibel F. and Filipowicz W. RNA-polymerase specifity of transcription of Arabidopsis U snRNA genes determined by promoter element spacing // Nature. 1990. V. 346. P. 199-202.
244. Warner J. R. Synthesis of ribosomes in Saccharomyces cerevisiae И Microbiol. Rev. 1989. V. 53. P. 256-271.
245. Wellauer P. К., Dawid I. В., Brown D. D. Reeder R. The molecular basis for length heterogeneity in ribosomal DNA from Xenopus laevis II J. Mol. Biol. 1976a. V. 105. P. 461486.
246. Wellauer P. K., Reeder R. H., Dawid I. В., Brown D. D. The arrangement of length heterogeneity in repeating units of amplified and chromosomal ribosomal DNA from Xenopus laevis II J. Mol. Biol. 1976b. V. 105. P. 487-505.
247. Wiegmann В. M., Mitter C., Regier J. C., Friedlander T. P., Wagner D. M.f Nielsen . S. Nuclear genes resolve Mesozoic-aged divergences in the insect order Lepidoptera // Mol. Phylogenet. Evol. 2000. V. 15. P. 242-259.
248. Williams S. M., DeSalle R., Strobeck C. Homogenization of geographical variants at the nontranscribed spacer of rDNA in Drosophila mercatorum II Mol. Biol. Evol. 1985. V. 2. P. 338-346.
249. Williams S. M. and Strobeck C. Sister chromatid exchange and the evolution of rDNA spacer length //J. Theor. Biol. 1985. V. 116. P. 625-636.
250. Windle J. J. and Sollner-Webb B. Upstream domains of the Xenopus laevis rDNA promoter are revealed in microinjected oocytes // Mol. Cell. Biol. 1986a. V. 6. P. 12281234.
251. Windle J. J. and Sollner-Webb B. Two distant and precisely positioned domains promote transcription of Xenopus laevis rRNA genes: Analysis with linker-scanning mutants II Mol. Cell. Biol. 1986b. V. 6. P. 4585-4593.
252. Yakura K., Kato A., Tanifuji S. Length heterogeneity of the large spacer of Vicia faba rDNA is due to the differing number of a 325 bp repetitive sequence elements // Mol. Gen. Genet. 1984. V. 193. P. 400-405.
253. Yamagishi, J., Ни, Y., Zheng, J., Bando, H. Genome organozation and mRNA strucrure of Periplaneta fuliginoza densovirus imply alternative splicing involvement in viral gene expression //Arch. Virol. 1999. V. 144. P. 2111-2124.
254. Yang Z. How often do wrong models produce better phylogenies? // Mol. Biol. Evol. 1997. V. 14. P. 105-108.
255. Yang Q., Zwick M. G., Paule M. R.Sequence organization of the Acanthamoeba rRNA intergenic spacer: Identification of transcriptional enhancers // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 4798-4805.
256. Yao M. C. Amplification of ribosomal RNA gene in Tetrahymena // In: The Cell Nucleus: rDNA. 1982. V. 12, Part С (eds. H. Busch and L. Rothblum). Academic Press. N. Y. P. 127-153.
257. Young R. A. RNA polymerase ll//Annu. Rev. Biochem. 1991. V. 60. P. 689-715.
258. Zaug A. J. and Cech T. R. Self-splicing RNA and an RNA enzyme in Tetrahymena // J. Protozool. 1987. V. 34. P. 416-417.
259. Zuker M., Stiegler P. Optimal computer folding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliary information II Nucleic Acids Res. 1981. V. 9. P. 133-148.
260. Zwick M. G., Wiggs M. Y., Paule M. R. Sequence and organization of 5S RNA genes from the eukaryotic protist Acantahamoeba castellaniill Gene. 1991. V. 101. P. 153157.
-
Муха, Дмитрий Владимирович
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2004
-
ВАК 03.00.15
- АНАЛИЗ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ И ЭВОЛЮЦИОННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КЛАСТЕРА РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ НАСЕКОМЫХ
- Анализ вариабельности структуры кластера рибосомных генов рыжего таракана
- Моделирование организации активных рибосомных генов в геноме человека и фенотипических проявлений их копийности
- Оценка изменчивости функциональной активности рибосомных генов в условиях воздействия экзогенных факторов
- Сравнительный анализ структурной организации кластера рибосомных генов ракообразных
