Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Частота клеток с мутациями в локусе Т-клеточного рецептора и радиационно-индуцированный апоптоз лимфоцитов как возможные показатели повышенного канцерогенного риска

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Орлова, Нина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I 1.1.

1.2. 1.3.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Ключевая роль мутаций при возникновении злокачественных опухолей.

Высокая частота мутантных клеток в организме как показатель повышенного канцерогенного риска.

Апоптотическая гибель клеток с поврежденной ДНК - один из механизмов поддержания генетической стабильности соматических клеток на уровне многоклеточного организма.

Методы определения индивидуального уровня апоптоза клеток человека в ответ на повреждение ДНК.

ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Метод определения клеток, несущих мутации по локусу-Т-клеточного рецептора (ТСИ-метод).

2.2. Подготовка проточного цитометра к анализу и сортировка образцов.

2.3. Методы оценки апоптотической гибели лимфоцитов.

2.3.1.

2.3.2.

2.3.3.

2.3.4. 2.4.

ГЛАВА III

3.2.1.

3.2.2.

3.2.3.

3.2.4.

Определение доли клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК.

Определение доли клеток, связывающих аннексии V, в разных субпопуляциях лимфоцитов.

Определение субпопуляционного состава лимфоцитов.

Морфологический анализ апоптоза.

Статистический анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Частота TCR-мутантных клеток у здоровых доноров и онкологических больных.

Исследования гибели лимфоцитов путем апоптоза после гамма-облучения in vitro.

Определение оптимальных условий удаления из клеток фрагментированной ДНК в процессе апоптоза.

Сопоставление результатов морфологического и проточноцитометрического анализа гибели клеток.

Зависимость доли клеток с признаками апоптоза и некроза от времени после облучения.

Уровень апоптотической гибели лимфоцитов при разной концентрации клеток во время культивирования.

3.2.5. Зависимость апоптотической гибели лимфоцитов здоровых доноров от дозы облучения.

3.2.6. Анализ возможного влияния субпопуляционного состава лимфоцитов на их радиочувствительность в отношении апоптоза.

3.2.7. Зависимость апоптотической гибели лимфоцитов онкологических больных от дозы облучения.

3.3. Сопоставление частоты ТСЯ-мутантных клеток с радиочувствительностью лимфоцитов в отношении апоптоза.

3.4. Сравнение уровня апоптотической гибели лимфоцитов и непосредственной реакции опухоли на лучевое воздействие.

ГЛАВА IV ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Высокая частота ТСЛ-мутантных клеток как показатель повышенного канцерогенного риска онкологических заболеваний.

4.2. Характеристика метода определения индивидуального уровня апоптоза лимфоцитов после гамма-облучения.

4.3. Вариабельность радиационно-индуцированного апоптоза лимфоцитов в группе здоровых доноров и онкологических больных.

4.4. Определение индивидуального уровня апоптоза для прогнозирования адекватности лучевого лечения опухолей.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Частота клеток с мутациями в локусе Т-клеточного рецептора и радиационно-индуцированный апоптоз лимфоцитов как возможные показатели повышенного канцерогенного риска"

Актуальность проблемы

Оценка риска возникновения злокачественных опухолей при действии ионизирующих излучений является актуальной проблемой радиобиологии. Среди специалистов нет единого мнения по многим вопросам, связанным с канцерогенным действием радиации на организм человека. Особенно много неопределенностей существует при оценке и прогнозировании канцерогенных эффектов облучения в малых дозах -воздействия, которому подвергаются большие группы населения, в связи с радиоактивным загрязнением окружающей среды или условиями работы (UNSCEAR, 2000). Недостаточность информации по этому вопросу обусловлена, наряду с другими причинами, отсутствием точных представлений о механизмах канцерогенного действия ионизирующих излучений. В то же время существенный прогресс в понимании общих механизмов злокачественного перерождения клеток, достигнутый в последнее время, указывает на ряд возможностей для выработки биологических критериев повышенного канцерогенного риска (UNSCEAR, 2000).

Молекулярно-биологические исследования показали, что определяющими событиями в злокачественной трансформации являются мутации в соматических клетках (Bishop L.M., 1991). В частности, установлена важная роль мутаций в протоонкогенах, генах-онкосупрессорах, а также ряде генов, контролирующих пролиферациию клеток и репарацию ДНК. Имеющиеся в настоящее время данные свидетельствуют, что высокий уровень мутагенеза (обусловленный как наследственными особенностями, так и действием генотоксических факторов) сопровождается повышенной вероятностью злокачественных новообразований. Так, например, анализ генетического материала в соматических клетках лиц, страдающих наследственными заболеваниями с высоким канцерогенным риском, свидетельствует о присутствии в организме клеток с большим количеством мутаций во всех исследованных локусах. Хорошо известно, что частота мутантных клеток (по любому локусу) увеличивается при действии генотоксических факторов, в том числе ионизирующих излучений. Причем, как показано при обследовании переживших атомную бомбардировку Хиросимы и Нагасаки, выход частоты мутантных по локусу гликофорина А клеток на единицу дозы выше примерно в 2 раза у лиц с онкологическими заболеваниями, чем без них (Kyoizumi S. et al., 1996). Поэтому есть основания предполагать, что повышенная частота клеток с мутациями в локусах, не связанных непосредственно с канцерогенезом, отражая общий уровень мутагенеза в соматических клетках, может являться показателем повышенного канцерогенного риска. Очевидно, что методы оценки частоты мутантных клеток должны быть пригодны для обследования больших контингентов в относительно короткие сроки. В настоящее время известно несколько методов, удовлетворяющих этому условию, и среди них - метод определения частоты клеток, несущих мутации по локусу Т-клеточного рецептора (Т-cell receptor - TCR), который был использован в данной работе.

Важным барьером на пути к злокачественной трансформации является элиминация клеток с поврежденной ДНК путем апоптоза (Blank K.R. et al., 1997; Crompton N., 1998, а). Это представление опирается в значительной мере на результаты исследования роли и механизмов действия продуктов генов р53 и семейства bel, которые позволяют полагать, что нарушение процесса апоптотической гибели клеток в ответ на повреждение ДНК является одним из факторов, обусловливающих возникновение и/или развитие злокачественной опухоли. В связи с этим можно предполагать, что отклонение индивидуального уровня апоптотической гибели от нормы (сформировавшейся в ходе эволюции) является показателем повышенного канцерогенного риска. Причем отклонения как в сторону снижения, так и в сторону повышения уровня апоптотической гибели клеток должны оба способствовать развитию канцерогенного процесса: первое за счет низкой эффективности элиминации мутантных клеток, а второе - за счет повышенной пролиферации для восполнения больших потерь клеток тканями макроорганизма. Следует отметить, что несмотря на интенсивные исследования апоптоза, известны лишь единичные данные об индивидуальной вариабельности апоптотической гибели нормальных клеток человека (Crompton N., 1998, b). Также пока неясно, существует ли корреляция между индивидуальным уровнем апоптоза в ответ на повреждение ДНК и частотой мутантных клеток у человека in vivo. Хотя отдельные данные (в частности, о высокой частоте клеток с генными и/или структурными мутациями у людей с низким уровнем радиационного апоптоза клеток при синдроме Ли-Фраумени) позволяют предполагать наличие такой корреляции. Исследование этого вопроса имеет важное значение для понимания механизмов мутагенеза и канцерогенеза. Можно было также ожидать, что у онкологических больных с высоким уровнем радиационно-индуцированного апоптоза нормальных клеток непосредственная реакция опухоли на облучение будет также значительной.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы явилось сравнительное исследование частоты мутантных клеток по локусу Т-клеточного рецептора и выраженности радиационно-индуцированного апоптоза лимфоцитов у больных раком гортани, гортаноглотки до лечения и у здоровых лиц для выяснения возможности использования данных параметров как показателей повышенного канцерогенного риска. При этом были поставлены следующие задачи исследования:

1. Провести сравнительное исследование частоты TCR-мутантных лимфоцитов в указанных выше группах лиц.

2. Разработать пригодный для массового обследования метод оценки индивидуального уровня апоптотической гибели лимфоцитов в ответ на ДНК- повреждающее воздействие.

3. Исследовать вариабельность индивидуального уровня апоптоза лимфоцитов после облучения in vitro в группе здоровых лиц и онкологических больных.

4. Провести сопоставление индивидуального уровня радиационного апоптоза и частоты TCR - мутантных лимфоцитов у обследованных лиц.

5. Оценить возможную корреляцию индивидуальной радиочувствительности лимфоцитов онкологических больных в отношении апоптоза с радиочувствительностью опухолевых клеток (гортани и гортаноглотки).

Научная новизна

• В результате исследования получены новые данные о частоте мутантных клеток по локусу Т-клеточного рецептора в большой однородной группе больных раком гортани и гортаноглотки до начала специфического лечения.

• Данные литературы об индивидуальной вариабельности апоптотической гибели нормальных клеток человека единичны. Исключение составляют редкие случаи наследственных заболеваний, обусловленных дефектами генов, контролирующих апоптоз. В данной работе оценивали апоптоз лимфоцитов, индуцированый разными дозами гамма-излучения, и вычисляли параметры линейной зависимости доза-эффект. Аналогичных данных в литературе нет. Встречаются работы, в которых апоптоз лимфоцитов оценивается при одной дозе облучения, но не по дозовой зависимости. Данный подход был впервые использован для обследования онкологических больных и здоровых лиц. Установлена более значительная вариабельность лимфоцитов по тесту апоптотической радиочувствительности у онкологических больных в сравнении со здоровыми лицами.

• Впервые проведено сопоставление индивидуального уровня апоптоза лимфоцитов периферической крови после облучения in vitro с частотой мутантных лимфоцитов по локусу Т-клеточного рецептора. При низком уровне апоптоза статистически значимо чаще наблюдается высокая частота мутантных клеток. Этот факт подтверждает существующие представления о биологической роли апоптоза как механизма поддержания генетической стабильности клеточных популяций.

• В последнее время предпринимаются попытки разработать методы определения индивидуальной радиочувствительности нормальных клеток in vitro (лимфоцитов или фибробластов), пригодные для прогнозирования реакции нормальной или опухолевой ткани на лучевое лечение. Чаще всего при этом используют методы определения выживаемости клеток (главным образом после облучения в дозе 2 Гр), частоты образования хромосомных аберраций или микроядер, т.е. определяют показатели репродуктивной гибели клеток. Апоптотическая гибель практически не изучена в этом отношении, несмотря на то, что, как известно, гибель опухолевых клеток под действием облучения и химиопрепаратов может происходить путем апоптоза. В данной работе впервые проведено сопоставление уровня радиационно-индуцированного апоптоза нормальных клеток с показателями радиочувствительности опухолевых клеток. Установлена положительная корреляция между уровнем радиационно-индуцируемого апоптоза лимфоцитов периферической крови у онкологических больных (определяемого in vitro до начала лучевого лечения) и степенью регрессии опухоли после первого этапа лучевой терапии.

Практическая и теоретическая значимость работы

Данные, полученные в диссертационной работе, свидетельствуют, что методы определения частоты мутантных клеток по локусу Т-клеточного рецептора и радиочувствительности лимфоцитов в отношении апоптоза могут использоваться для формирования группы повышенного канцерогенного риска. Учет биологических критериев при формировании группы риска в отношении онкологических заболеваний имеет практическое значение для целенаправленной профилактики и ранней диагностики злокачественных новообразований и является особенно актуальным для лиц, контактирующих с ионизирующим излучением, вследствие, например, профессиональных обязанностей или условий проживания. В практическом отношении также важно, что количественная оценка радиационного апоптоза лимфоцитов периферической крови до начала лечения позволяет прогнозировать непосредственные результаты лучевой терапии рака гортани и гортаноглотки.

Теоретическая значимость работы обусловлена тем, что изученные показатели повышенного канцерогенного риска представляют несомненнный интерес в качестве методического подхода при исследовании закономерностей и механизмов канцерогенного действия ионизирующих излучений на организм человека.

Данные об измененном уровне апоптоза (после облучения in vitro) нормальных клеток у онкологических больных также имеют теоретическое значение для понимания механизмов канцерогенеза человека.

Установленная в работе корреляция между уровнем радиационно-индуцированного апоптоза лимфоцитов и степенью регрессии опухоли после лучевой терапии имеет важное значение для понимания механизмов гибели опухолевых клеток после облучения.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на:

1. Объединенной конференции с международным участием «Медицинская физика 97. Новые технологии в радиационной онкологии» (Обнинск, 1997 г.).

2. Международном конгрессе «Энергетика 3000» (Обнинск, 1998г.).

3. Международном научном форуме «Онкология на рубеже 21 века. Возможности и перспективы» (Москва, 1999г.).

4. V онкологическом съезде (Казань, 2000г.).

5. IV съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2001г.).

Основные положения, выносимые на защиту

1. У больных раком гортани и гортаноглотки до лечения повышена частота мутантных клеток по локусу Т-клеточного рецептора по сравнению со здоровыми лицами, что свидетельствует о возможности

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Орлова, Нина Владимировна

ВЫВОДЫ:

1. У больных раком гортани и гортаноглотки до лечения установлена повышенная частота мутантных клеток по локусу Т-клеточного рецептора по сравнению со здоровыми лицами, что свидетельствует о возможности использования данного метода для формирования группы риска в отношении онкологических заболеваний.

2. Разработан модифицированный метод оценки индивидуального уровня апоптоза лимфоцитов в ответ на ДНК-повреждающее воздействие, пригодный для массового обследования.

3. Индивидуальная радиочувствительность лимфоцитов, погибающих путем апоптоза, у здоровых лиц значительно варьирует. Различия не зависят от субпопуляционного состава лимфоцитов.

4. В группе онкологических больных статистически значимо чаще встречаются лица с низкими и высокими показателями апоптотической гибели лимфоцитов, облученных гамма-лучами in vitro. Поэтому отклонения данного параметра от нормального уровня у здоровых лиц можно рассматривать в качестве показателя повышенного канцерогенного риска.

5. При сопоставлении индивидуального уровня радиационного апоптоза и частоты TCR- мутантных лимфоцитов выявлено, что при низком уровне апоптоза статистически значимо чаще наблюдается высокая частота мутантных клеток. Этот факт подтверждает существующие представления о биологической роли апоптоза как

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа предпринята с целью поиска биологических критериев повышенного канцерогенного риска - важной проблемы современной радиобиологии. Учитывая современные представления о канцерогенезе, можно было предполагать, что оценка состояния генетического аппарата соматических клеток и эффективности механизмов поддержания генетической стабильности может предоставить полезную в этом отношении информацию. Важно, чтобы методы такой оценки обеспечивали возможность обследования больших контингентов. Этому требованию в достаточной степени удовлетворяет метод определения частоты клеток, несущих мутации по локусу Т-клеточного рецептора, и разработанный нами вариант проточноцитометрического анализа апоптоза лимфоцитов после гамма-облучения in vitro. Для выяснения возможности использования этих параметров как критериев повышенного канцерогенного риска мы провели их сравнительное исследование в группе онкологических больных (рак гортани, гортаноглотки) до лечения и здоровых лиц.

По нашим данным частота TCR-мутантных клеток у онкологических больных статистически значимо выше, чем у здоровых лиц. При этом данный параметр у 33% больных превышает 95% доверительный интервал, установленный для контрольной группы. Полученные нами данные свидетельствуют о повышенном уровне мутагенеза по TCR-локусу у онкологических больных и о возможности использования данного показателя для формирования группы повышенного канцерогенного риска.

Учитывая биологическую роль апоптоза как механизма элиминации клеток с поврежденной ДНК и барьера для злокачественной трансформации, можно было предполагать, что уровень апоптотической гибели нормальных клеток в ответ на повреждение ДНК у онкологических больных отличается от такового у контрольных здоровых лиц. В этом случае выявление измененного уровня апоптоза клеток (после генотоксического воздействия) может быть использовано в качестве показателя повышенного канцерогенного риска.

Для оценки радиочувствительности лимфоцитов в отношении апоптоза вычисляли коэффициент Ь линейной зависимости У=а+ЬХ, где Х-доза облучение (Гр), У- доли клеток, выживших без признаков апоптоза в течение 24 инкубации в питательной среде после облучения. Среднее значение коэффициента Ь в группе онкологических больных и контрольных лиц не отличалось. Однако у больных отмечалась более широкая вариабельность этого параметра, чем у здоровых лиц, т.е. среди первых статистически значимо чаще встречались лица с высокой и низкой апоптотической гибелью лимфоцитов после облучения, которая существенно не зависит от субпопуляционного состава лимфоцитов.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о наличии статистически значимых различий по исследованным параметрам в группе здоровых лиц и онкологических больных. Отклонение индивидульного уровня радиационно-индуцированного апоптоза лимфоцитов (от нормального уровня у здоровых лиц), как и высокая частота мутантных клеток, является показателем повышенного риска возникновения онкологических заболеваний. В целом 49% онкологических больных имели указанные изменения того и/или другого параметра, что свидетельствует о необходимости одновременного определения других возможных биологических показателей канцерогенного риска для повышения эффективности обследования.

Сопоставление исследованных параметров друг с другом позволило установить, что у лиц с низким уровнем апоптоза

88 лимфоцитов после генотоксического воздействия статистически значимо чаще наблюдается высокая частота мутантных клеток, что подтверждает важную роль апоптоза как механизма элиминации генетически дефектных клеток.

Поскольку в работе показана широкая вариабельность радиационно-индуцированого апоптоза лимфоцитов у пациентов со злокачественными новообразованиями, представляло интерес сравнить этот параметр с радиочувствительностью опухоли в процессе лучевой терапии. По нашим данным у больных с очень высокой радиочувствительностью лимфоцитов статистически значимо чаще наблюдалась выраженная регрессия опухоли (более 50%), чем в группе больных с очень низкой радиочувствительностью клеток в отношении апоптоза. Эти данные указывают на то, что количественная оценка радиационного апоптоза лимфоцитов периферической крови является полезной для прогнозирования радиочувствительности опухолевых клеток гортани и гортаноглотки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Орлова, Нина Владимировна, Обнинск

1. Ауербах Ш. Проблемы мутагенеза / издательство «МИР»,- М1978.-463 с.

2. Белоусова Ф.К Загадки гена опухолевого супрессора //

3. Экспериментальная онкология.-1996,- Т. 18,- С. 197-207.

4. Бурлакова Е.Б., Михайлов В.Ф., Мазурик В. К. Системаокислительно-восстановительного гомеостаза при радиационно-индуцированной нестабильности генома // Радиационная биология. Радиоэкология,- 2001.-Т.41.-№5.-С.489-499.

5. Иванов И.Ю., Погорелюк О.Н. Обработка результатов медикобиологических исследований на микрокалькуляторах / М.: Медицина,- 1990. -С.53-70.

6. Имянитов E.H., Калиновский В.П., Князев П.Г. и соавт.

7. Молекулярная генетика опухолей человека // Вопросы онкологии,-1997.-Т.43 .-№ 1.-С.95-101.

8. Имянитов E.H., Князев П.Г. Роль антионкогенов в опухолевомпроцессе // Экспериментальная онкология,- 1992.- Т. 14,- №5.-С.З-18.

9. Имянитов E.H., Комочков И.В., Лыщев A.A., Того A.B.

10. Молекулярная и клиническая онкология: точки соприкосновения // Экспериментальная онкология.-1993.-Т. 15.- №5.- С.3-8.

11. Камплджон Ричард С. Применение проточной цитометрии вмолекулярной клинической диагностике / Молекулярная клиническая диагностика. Методы (под ред. Херрингтона С. и МакгиДж.). М.:Мир. -1999. -С. 281-301.

12. Киселев Ф.Л., Павлиш O.A., Татосян А.Г. / Молекулярные основыканцерогенеза у человека / М.: Медицина.-1990.-317 с.

13. Ю.Комарова Е.А., Гудков A.B. Супрессия р53:Новый подход к преодолению побочных эффектов противоопухолевой терапии // Биохимия,- 2000.- Т.65.-№1.-С.48-56.

14. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевыхсупрессоров: ключ к пониманию механизмов канцерогенеза // Биохимия.-2000.-Т.65." №1- С.5-33.

15. Лихтенштейн A.B., Шапот B.C. Опухолевый рост: ткани, клетки,молекулы // Патол. физиология и эксперим. терапия,- 1998.-№3.-С.25-44.

16. Лукьянова Н.Ю., Кулик Г.И.,Чехун В.Х. Роль генов р53 и bcl-2 вапоптозе и лекарственной резистентности опухолей // Вопросы онкологии. -2000. -Т.46. -№2. -С.121-128.

17. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз) / М.:1. Медицина.-2001.- 192 с.

18. Мазурик В.К., Михайлов В.Ф. О некоторых молекулярныхмеханизмах основных радиобиологических последствий действия ионизирующих излучений на организм млекопитающих // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999.- Т.39.-№1.- С.89-96.

19. Мазурик В.К, Морз Б.Б. Проблемы радиобиологии и белок р53 //

20. Радиационная биология. Радиоэкология. 2001.- Т.41.- №5.-С.548 -572.

21. Маянский А.Н., МаянскийН.А.,Заславская М.И. и др. Апоптознейтрофилов // Иммунология,-1999.- №6.- С.11-18.

22. Напалков Н.П. Общая онкология / Москва. "Медицина",- 1989.648 с.

23. Пожарисский K.M., Е.Е. Лееншман. Значениеиммуногистохимических методик для определения лечения и прогноза опухолевых заболеваний // Архив патологии. 2000. -№5.-Т.62. -С. 3-11.

24. Програмированная клеточная гибель / под ред. B.C. Новикова.1. СПб.: Наука. -1996. 276с.

25. Севанъкаев A.B., Саенко A.C. Соматический мутагенез какбиологический дозиметр радиационного воздействия // Радиационная биология. Радиоэкология,- 1997. Т.37,- № 4,- С,-560-564.

26. Уманский С.П. Апоптоз: молекулярные и клеточные механизмы //

27. Молекулярная биология,- 1996,- Т.30. №3. - С.487-498.

28. Урбах В.Ю. Биометрические методы / "Наука". Москва.- 1964.1. С.247-250.

29. Фильченков A.A., Стойка P.C. Апоптоз: краткая история,молекулярные механизмы, методы выявления и возможное значение в онкологии // Экспериментальная онкология,- 1996.Т. 18. С.435-448.

30. Фогель Ф., Мотулъски А. Генетика человека // Проблемы иподходы / Под ред. Алтухова Ю.П., Гиндилиса В.М.- М.: Мир,-1990. Т 2. - С.142-277.

31. Черезов А.Е. Общая теория рака: тканевый подход / М.: Изд-во1. МГУ. 1997. - 252 с.

32. Чыссов В.И., Даръялова С.Л. Избранные лекции по клиническойонкологии / Москва.-2000. -736 е.: ил.

33. Чумаков П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью

34. Биохимия.-2000.- Т.65. -№1. -С.34-47.

35. Эйду с Л.Х. Является ли апоптоз "програмируемой гибельюклеток"? // Радиационная биология. Радиоэкология. 1997.- Т.37.-С.526-531.

36. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах //

37. Иммунология,- 1996,-№6. -С.10-23.

38. Ярилин А.А. Апоптоз: природа феномена и его роль в целостноморганизме // Патол. физиология и эксперим. терапия,- 1998. -№2.- С.26-42.

39. Akiyama M., Umeki S., Kusunoki Y. et al. Somatic cell mutations as apossible predictor of cancer risk // Health Physics Society. 1995. -P.643-649.

40. Albertini R.J., Nicklas J.A., O.Neill J.F. Somatic cell gene mutations inhumans: biomarkers for genotoxicity // Environ Health Perspect. -1993. -V.101. suppl 3. -P.193-201.

41. Albertini R.J., Nicklas J.A., O.Neill J.P., Robison S.J. In vivo somaticmutations in humans: measurement and analisis // Ann. Rev. Genet. -1990. V.24. -P.305-326.

42. Ames B.N., Shigenagan M.K., GoldL.S. DNA lessions, inducible DNArepair, and cell division: Three key factors in mutagenesis and carcinogenesis // Environ Health Perspect Suppl.- 1993. V.101. -P.35-44.

43. Anisimov V.N. Age as a factor of risk in multistage carcinogenesis //

44. Geriatric Oncology / Eds. L. Balducci et al. Philadelphia: Lippincott. -1992. -P.53-59.

45. Arlett C.F., Lehman A.R. Human disorders showing increasedsensitivity to the induction of genetic damage // Annu. Rev. Genet. -1978. №12. - P.95-115.

46. Baker S.J., Fearon E.R., Nigro J.M. et al. Cromosome 17 deletions andp53 mutations in colorectal carcinoma // Science. 1989. - V.299. -P. 217-21.

47. Bentzen S.M. Potential clinical impact of normal- tissue intrinsicradiosensitivity testing // Radiother. Oncol. 1997. - V.43. -№2. -P. 121-131.

48. Berchuk A. Biomarkers in the ovary // J.Cell. Bio-chem. -1995. V.23.-P.223-226.

49. Bergh J. Impotance of p53 in the diagnosis and treatment of cancer //

50. ESMO congress. 1998. - P. 179-186.

51. Bigbee W.L., Langlois R.G., Swift M, Jensen R.H. Evidence for anelevated frequency of in vivo somatic cell mutations in ataxia teleangiectasia // Am J Hum Genet. 1989. - V.44. - №3. - P.402-408.

52. Bishop J.M. Molecular themes in oncogenesis // Cell. 1991. - V.641. P.235-248.

53. Blank K.R., Rudoltz M.S., Kao G.D. et al. The molecular regulation ofapoptosis and implications for radiation oncology // Int. J. Radiat. Biol. 1997. -V.71. - №5. - P.455-466.

54. Bonassi S., Abbondandolo A., Camurri L. et al. Are cromosomeabbertions in circulating lymphocytes predictive of future cancer onset in humans? Preliminary results of an Italian cohort study // Cancer Genetics and Cytogenetics. -V.79. №2. -P.133-135.

55. Boreham D.R., Gale K.L., Mavca S.R. et al Radiation-induced apoptosis lymphocytes: potential as a biological dosimeter // Heals Physics. 1996. - V.71. - №5. - P.685-691.

56. Bowersox J. Research gain insight into cellular delay // J. Nat. Canctr1.st.- 1992. -V.84. -P.1859-1860.

57. Callahan R. p53 mutations, another breast cancer prognostic factor // J.

58. Nat. Cancer Inst. 1992. -V.84. -P.826-827.

59. Camplejohn R.S., Perry P., Hodgson S.V. et al A possible test forinherited p53-related defects based on the apoptotic response of peripheral blood lymphocytes to DNA gamage // British J. of Cancer. -1995. -V.72. -P.654-662.

60. Cleary M.L., Sklar J. Nucleotide sequence of t (14; 18) chromosomalbreakpoint cluster region near a transcriotionally active locus on chromosome 18 // Proc. Nat. Acad. Sei USA 1985. V.82. -P.7439-7443.

61. Colle J. and Scopek T.R. Somatic mutant frequency, mutation rates and mutational spectra in the human population in vivo // Mutat. Res.-1994. V.304. -P.33-105.

62. Compton P.J., Hooper K., Smith M.T. Human somatic mutation assaysas biomarkers of carcinogenesis // Enviromental Health Perspectives. -1991. -V.94. -№1. -C.35-41.

63. Cooper J.A. Oncogenes and anti- oncogenes // Current Opinion in Cell

64. Biology. -1990. -№2. -P.285-295.

65. Crawford L.V., Pim D.E., Gurney E.D. et al Detection of commonfeature in several human tumor cell lines 53000 dalton protein // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. -1981. -V.78. -P.41-45.

66. Crompton N.E.A., Ozasahin M. A versatile and rapid radiosensitivitiassay of peripheral blood leukocytes based on DNA and surface marker assessment of cytotoxity // Radiat R. -1997. -V.147. -P.55-60.

67. Crompton N.E.A Programmed Cellular Response in Radiation

68. Oncology // Acta Oncologica Suppl. 1998 a. - Y. 11. - P. 1-49.

69. Crompton N.E.A. Programmed cellular response to ionizing radiationdamage // Acta Oncologica. 1998 b. - V.37. -№2. - P.129-142.

70. D'Amico D., Carbone D., Mitsudomi T. et al. Hight frequency ofsomatically acquired p53 mutations in smal-cell lung cancer cell lines and tumors // Oncogene. 1992. - V.7. -P. 339-346.

71. Darzynkiewicz Z., Bruno S., Del Bino G. et al. Features of apoptoticcells measured by flow cytometry // Cytometry. -1992. -V.13. -P.795-808.

72. Darzynkiewicz Z., Traganos F., Kapuscinski J., Melamed R.

73. Denaturation and condensation of DNA in situ induced by acridine orange in relation to chromatin changes during growth and differentiation of friend erythroleukemia cells // Cytometry. -1985. -V.6. -P.195-207.

74. Darzynkiewicz Z., Traganos F., Kapuscinski J., Melamed R.

75. Denaturation and condensation of DNA in situ induced by acridine orange in relation to chromatin changes during growth and differentiation of friend erythroleukemia cells // Cytometry. -1985. -V.6. -P.195-207.

76. Deiry V.S., Tokino T., Wilson S.J. et al. WAF-1, a potent mediator ofp53 tumor suppression // Cell. -1993. -V.75. -P.817-825.

77. Erlich H.A., Gelfand D., Sninsky J.J. Recent advances in thepolymerase chain reaction // Science. -1991. V.252. - P. 1643-1651.

78. Freiberg T., Friend S.H. The importance of p53 alterations in humancancer, is there more than circumstantial evidence // J. Nat. Cancer Inst.-1993. -V.85. -P.1554-1557.

79. Fukuchi K., Tanaka K., Kumahara Y. et al. Increased frequency of 6thioguanine-resistant peripheral blood lymphocytes in Werner syndrome patients // Hum. Genet. 1990. -V.84. -P.249-252.

80. Gottesman MM Molecular basis of cancer therapy // J. Nat. Cancer1.st. 1994. - V.86. - P.1277-1286.

81. Green D.R., McGahon A. Martin F.M. Regulation apoptosis byoncogenes //J. Cell Biochem. -1996. -V.60. -P.33-38.

82. Hagmar L., Brogger A., Hansteenl.L. et al. II Cancer risk in humanspredicted by increased levels of chromosomal aberrations in lymphocytes: Nordic study group on the health risk of cromosome damage // Cancer Research.- 1994,- V.54.- P.2919-2922.

83. Hall A.G. et al. The relationship between bcl-2 expression and responseto chemotherapy in acute leukemia 11 Leukemia. -1995. V.9. -P.530, abstract 010.

84. Harris C. Structure and functions of the p53 tumor supressor gene: Clues for rational cancer therapeutic strategies 11 J. Nat. Cancer Inst.-1996. -V.88. -P.1442-1455.

85. Hodge G., Hodge S., Han /^.Increased levels of apoptosis of leukocyte subsets in cultured PBMCs compared to whole blood as shown by annexin Y binding: relevance to cytokine production // Cytokine. -2000. -V.12. -№12. -P.1763-1768.

86. Hollstein M, Sidransky D., Vogelstein B. et al P53 mutations in human cancers // Science. -1991. -V. 253. -P.49- 53.

87. Isaacs W. B., Carter B.S., Ewing C.M. Wild-type p53 suppresses growth of human prostate cancer cells containing mutant p53 alleles // Ibid. -1991. V. 51. -P.4716-4720.

88. Jensen R.N., Bigbee W.L., Langlois R.G. Multiple endpoints forsomatic mutations in humans provide complementary views for biodosimetry, genotoxicity and health risks // Prog. Clin. Biol. Res.-1990. -V.340. P.81-92.

89. Kastan M.B. andKuerbitz S.J. Control of Gi arrest after DNA damage

90. Environ Health Perspect Suppl.- 1993. -V. 101. -P.55-58.

91. Kastan M.B., Oniekwere O., Sitransky D. et al. Participation of p53protein in the cellular response to DNA damage // Cancer Res.- 1991. -V.51. -P.6304-6311.

92. Kern P., Keilholz L., Forster C. et al. In vivo apoptosis in peripheral blood mononuclear cells induced by low-dose radiotherapy displays a discontinuous dose-dependense // Int. J. Radiat. Biol.- 1999. -V.75. -№8. -P.995-1003.

93. Kerr F.R., Winterford C.M., Harmon B.V. Apoptpsis. Its significance in cancer and cancer therapy // Cancer. -1994. -V.73. P.2013-2026.

94. Kerr J.F.R. et al. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide- ranging imlications in tissue kinetics //Br.J. Cancer. -1972. -V.26. -P.239-257.

95. Kondrashova T.V., Ivanova T.I., Katsalap S.N. Chromosomeaberrations in cultured peripheral lymphocytes from persons with elevated skin radiosensitivity // Environmental Health Perspectives. -1997. -V.105. -№6. -P.1437-1439.

96. Kroemer G. The proto-oncogene Bcl-2 and its role in regulatingapoptosis // Nature Medicine. 1997. - V.3. - №6. - P. 614-620.

97. Kurbits S.J., Plunkett B.S., Wash W. V. et al. Wild type p53 is a cellularcheckpoint determinant following irradiation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1992. V.89. - P.7491-7495.

98. Kyoizumi S., Akiyama M., Hirai Y. et al. Spontaneous loss andalteration of antigen receptor expression in mature CD4+ T cells // J. Exp. Med. -1990. -V.171. -P. 1981 -1999.

99. Kyoizumi S., Akiyama M., Umeki S., Hirai Y. et al. Frequency of mutant

100. T lymphocytes defective in the expression of the T-cell antigen receptor gene among radiation-exposed people // Mutat. Res. -1992. -V.265. -P.173-180.

101. Kyoizumi S., Kusunoki Y., Seyma T. et al. In vivo somatic mutations in

102. Werners syndrome // Hum Genet.- 1998.- V.103.- №4,- P.-405-410.

103. Kyoizumi S., Nakamura N., Takebe H. et al. Frequency of varianterythrocytes at the glycophorin-A locus in two Bloom's syndrome patiens // Mutat.Res.-1989.-№214.-P.215-222.

104. Kyoizymi S., Akiyama M, Colone J.B. et al. Somatic cell mutations atthe glycophorin A locus in erythrocytes of atomic bomb survivors: implications for radiations carcinogenesis // Radiat. Res.- 1996. -V.146. P.43-52.

105. Lane D.P. Cancer. P53, guardian of the genome // Nature. -1991.1. V.358. -P.15-16.

106. Lane D.P., CrawfordLV. T-antigen is bound to a host protein in SV40transformed cells//Nature. 1979. -V. 278. -P.261-263.

107. Lanza A., Robustelli F.S., Zibera C. et al. Somatic mutations at the Tcell antigen receptor in antineoplastic drug-exposed populations: comparison with sister cromatid exchange freguency // Int. Arch.Occup. Envirron. Health 1999. - V.ll. -P. 315-322.

108. Lee J.M., Abrahamson J.L., Kandel R. et al. Susceptibility to radiationcarcinogenesis and accumulation of chromosomal breakge in p53 deficient mice//Oncogene. 1994. -V.9. -P.3731-3736.

109. Levin A. J., Momand Y., Finlay C.A. The p53 tumor suppressor gene //

110. Nature. -1991. V.351. -P.453-456.

111. Li F., Fraumeni J.Jr. Soft-tissue sarcomas, breast cancer and otherneoplasms: a fammilian syndrome // Ann. Int. Med.- 1969. -V.71. -P.747-53.

112. Little J.B. Radiation-induced genomic instability // Int. J. Radiat. Biol.- 1998. V.74. - №6. - P.663-671.

113. Lothe R.O., Fossel T., Danielson E. et al. Molecular genetic studies of tumor suppressor gene regions on chromosomes 13 and 17 in colorectal tumor//J. Nat.Cancer Inst.- 1992. V84. -P. 1100-1108.

114. Marshall C.J. Tumor suppressor genes // Cell -1991. -V.64. -P.313-326.

115. Martin M., Ogburn C.E., Colgin L.M. et al. Somatic mutations are frequent and increase with age in human kidney epithelial cells // Human Molecular Genetics. -1996. V.5. - №2. - P.215-221.

116. Moretti M., Villarini M., Scassellati -Sforzolini G. et al. Extent of DNA damage in density separated trout erythrocytes assessed by the "comet" assay // Mutation Research. - 1998. -V.397. - P. 353-360.

117. Mothersill C., Seymour C. Radiation-induced bystender effects: past history and future directions // Radiation Research. 2001. - V.155. -P.759-767.

118. Murnane J.P., Kapp L.N. A critical look at the association of human genetic syndromes with sensitivity to ionizing radiation // Sem. Cancer Biol.- 1993. -V.4. -P.93-104.

119. Napalkov N.P., Anisimov V.N., Likhachev A.J., Tomatis L. 5-bromo-deoxyuridine-induced carcinogenesis and its modification by persistent estrus syndrome, unilateral nephrectomy, and X-irradiation in rats // Cancer Res. -1989. -V.49. -P.318-323.

120. Ochi-Lohmann T.H., Okazaki K., Madruga M.R. et al. Radiosensitivity of blood lymphocytes from basocellular carcinoma patients, as detected by the micronucleus assay // Mutation Reserch. -1996. V.357. - P.97-106.

121. Ojeda F., Guar da M.I., Maldonado C., Folch H. A flow-cytometric to study DNA fragmentation in lymphocytes // J. Of Immunological Methods. -1992.- V.152.- P.171-176.

122. Ozsahin M, Ozsahin H., Shi Y. et al. Rapid assay of intrisic radiosensitivity based on apoptosis in human CD4 and CD8 T-lymphocytes // Int. J. Radiat. Oncol. Phys.- 1997. V.38. - №2. -P.429-440.

123. Philippe J., Louagie H., Thierens H. et al. Quantification of apoptosis in lymphocyte subsets and effect of apoptosis on apparent expression of membrane antigens // Cytometry. -1997. -V.3 -P.241-249.1.l .Phmkett W. Apoptosis. -Oxford: CBC. 1995. 35 p.

124. Rached E., Schindler R., Beer K.T. No predictive value of the micronucleus assay for patients with severe acute reaction of normal tissue after radioterapy // European J. of Cancer. 1998. -V.34. -№3. -P.378 -383.

125. Reed J.C. Double 1 identity for proteins of the Bcl-2 family // Nature. -1997. -V387. -№19. -P.773-776.

126. Re nan M.J. How many mutations are required for tumorigenesis? Implications from human cancer data // Mol Carcinogenesis. -1993. -V.7. -P.139-146.

127. Rowan S., Fisher D.E. Mechanisms of apoptotic cell death // Leukemia. 1997. - V.l 1. - P. 457-465.

128. Samali A., Gorman A.M., Cotter N. G. Apoptosis the Story so far.// Experientia. -1996. -V.52. -№10-11. -P.933-941.

129. Scott D. Chromosomal radiosensivity, cancer predisponsition and response to radiotherapy // Strahlenther Oncol. 2000. - V.176. -№5. -P.229-234.

130. Simpson J.G. The natural somatic mutation frequency and human carcinogenesis // Cancer Research. -1997. P.209-240.

131. Slonina D., Gas ins ka A. Intrinsic radiosensitivity of healthy donors and cancer patients as determined by the lymphocyte micronucleus assay // Int. J.Radiat. Biol.- 1997. V.72. -№6. - P.693-70.

132. Srivastava S., Zou Z., Pirello K. et al. Germ-line transmission of mutanted p53 gene in a cancer prone family with Li-Fraumeni syndrome //Nature. -1990. -V.243. -P.747-749.

133. Stanbridge E.J., Nowell P.C. Origins of human cancer revisiteed // Cell-, V.63. -P.867-74.

134. Strom S.S., Gu Y., Sigurdson A.J. et al. Cromosome breaks and sister cromatid exchange as predictors of second cancers in Hodgkins diseans // Leykemia and Lymphoma. 1998. - V.28. - P.561-566.

135. Taga M., Shiraishi K., Shimura T. et al. Increased frequencies of gene and chromosome mutations after X-irradiation in mouse embryonal carcinoma cells transfected with the bcl-2 gene // Japanese Journal of Cancer Reserch. -2000. -V.10. -P.994-1000.

136. Thor A., Moore D.H.I., Adgerstan S.M. et al. Accumulation of p53 tumor suppressor gene protein an independent marker of prognosis in breast cancer // J. Nat. Cancer Inst. -1992. -V.84. -P.845-855.

137. Tuker M.S. Estimation of mutation frequencies in normal mammalian cells and the development of cancer // seminars in Cancer Biology. -1998. -V.8. -P.407-419.

138. Umeki S., Kusunoki Y., Endo K. et al. Somatic mutation at the TCR loci as a biological dosimetr of radiation-exposed people // Proc. Int. Conf. Rad. Effects and Protection, Mito, Japan.-l992.-P. 1 51-154.

139. UNSCEAR 2000 Repot to the General Assembly, with Scientific Annexes // Volume: Effects. New Yore, 2000. - Annex F: DNA repair and mutagenesis. -P. 1-72.104

140. UNSCEAR 2001 Repot to the General Assembly with Scientific Annexes // V. R.613: Hereditary effects of radiation. Vena, 2001. -P.57-69.

141. Vermes I., Haanen C. Apoptosis and programed cell death in health and disease//Adv. Clin. Chem. -1994. -V.31. -P. 177-246.

142. Wang Xin Wei Role p53 and Apoptosis in Cancerogenesis // Anticancer Research. -1999. -V.19. P.4759-4771.

143. Weinberg R.A. Tumor supressor genes // Scitnse. -1991. -V. 254,-P.l 138-1145.

144. West C.M.L., Davidson S.E., Elyan S.A.G. et al. The intrinsic radiosensitivity of normal and tumour cells // Int. J. Radiat. Biol.-1998. V.73. -№4. -P.409-413.

145. Yonish-Rouach E. The p53 tumour supressor gene: a mediator of a Gj growth arrest of apoptosis // Experientia. 1996. -V.52. -№10-11. -P.1001-1007.