Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интенсивность апоптоза лимфоцитов периферической крови у жителей прибрежных сел реки Теча, подвергшихся хроническому радиационному воздействию

ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Интенсивность апоптоза лимфоцитов периферической крови у жителей прибрежных сел реки Теча, подвергшихся хроническому радиационному воздействию"

На правах рукописи

Блинова Евгения Андреевна

ИНТЕНСИВНОСТЬ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ЖИТЕЛЕЙ ПРИБРЕЖНЫХ СЕЛ РЕКИ ТЕЧА, ПОДВЕРГШИХСЯ ХРОНИЧЕСКОМУ РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ

03.01.01 - «радиобиология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 ЯНВ 2012

ООЬОиоо^'

Москва-2011

005006837

Работа выполнена на базе Федерального государственного учреждения науки «Уральского научно-практического центра радиационной медицины» Федерального медико-биологического агентства, г. Челябинск

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, Аклеев Александр Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наука, профессор Пелевина Ирина Ивановна

доктор химических наук, профессор Серебряный Александр Маркович

Ведущая организация: Институт общей генетики им. И.Н.

Вавилова, г. Москва

Защита диссертации состоится « 16 » февраля 2012 г. в «_» часов на

заседании диссертационного совета Д.501.001.65. при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ауд. 557

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «i_>_^£i_2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук,

Т.В. Веселова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современном мире человек неизбежно подвергается воздействию ионизирующего излучения вследствие контакта с разнообразными источниками излучения. Облучению подвергается не только узкая ipynna специалистов, работа которых непосредственно сопряжена с источниками излучения, например врачи рентгенологи, сотрудники атомных станций, космонавты, ликвидаторы последствий аварий, но и широкая группа населения, которая подвергается ионизирующему облучению в процессе диагностики и лечения ряда заболеваний. Кроме того, опыт прошлых десятилетий в области использования атомной промышленности, как в военных, так и в мирных целях, свидетельствует о высокой вероятности возникновения ситуаций, при которых облучаются многочисленных групп населения в широком диапазоне доз. Как правило, в такой ситуации, люди подвергаются в начальный период острому облучению, с последующим равномерным снижением мощности дозы облучения в течение длительного периода времени, что в итоге способствует развитию отдаленных последствий ионизирующего излучения.

Для реализации отдаленных последствий воздействия ионизирующего излучения на клетку, наряду с повреждением ДНК, важным является активация защитных механизмов клетки: репарации повреждений, регуляции клеточного цикла и апоптоза (Пелевина И.И. и др., 2000; Бондарчук И. А., 2003; Серебряный Л.М. и др., 2004).

Согласно современным знаниям о реакции молекулярных структур клеток на повреждающие воздействие ионизирующего излучения, программируемая клеточная смерть является одним из главных механизмов поддержания постоянства генома (Мазурик В.К., 2005, Edinger А.Е., 2004, Huang L„ 2003, Jeggo P.A., 2009).

В случае возникновения генетических нарушений процесса апоптоза, развиваются патологические состояния, сопровождающиеся с одной стороны сохранением в организме клеток с неограниченным пролиферативным потенциалом, тем самым увеличивая вероятность развития онкопаталогии (Барышников A.IO. и др. 2002, Яршшн А.А., 2006, Huang L. et al, 2003), а с другой стороны развитием дистрофических процессов, связанных с усиленной гибелью клеток (Квачева А.Ю., 2002, Afford S. et al, 2000).

У лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию на реке Теча, одним из ранних эффектов облучения являлось развитие хронической

лучевой болезни. У таких пациентов наблюдалось угнетение процессов гемопоэза, выражающееся в развитии лейкопений, нейтропений и тромбцитопений. В более поздние периоды, от начала радиационного воздействия, гематологические показатели улучшались, однако, после прекращения внешнего 7-облучения, в течение длительного времени сохранялась лейкопения и нейтропения, за счет поступления радионуклидов в организм (Аклеев А.В., 2000).

Кроме того, в отдаленные периоды наблюдается повышение уровня соматических мутаций в гене Т-клеточного рецептора, увеличение частоты хромосомных аберраций, увеличение числа клеток с блоком клеточного цикла (Veremyeva G.A et al, 2010), а также отмечается повышенный риск развития таких соматических эффектов как рак и лейкоз (Косенко М.М. и др., 1999, Kristinina L. Yu. et al., 2005).

На данный момент остается открытым вопрос изменения интенсивности апоптоза у хронически облученных лиц пожилого и старческого возраста. Проведенное нами исследование дасг возможность оценить интенсивность апоптоза у обследованных лиц, подвергшихся длительному радиационному воздействию, усугубляющемуся инволюционными процессами, в силу которых происходит увеличение частоты возникновения целого ряда заболеваний связанных с апоптозом, таких как злокачественные опухоли, лейкозы, а так же различных дегенеративных процессов. В связи с этим исследование апоптоза как одного из основных барьерных механизмов, защищающих организм от генотоксического действия радиации, является актуальным.

Цель работы: исследовать шшяние хронического радиационного воздействия на апоптоз лимфоцитов периферической крови (ЛПК) в отдаленные сроки у лиц, проживающих' в прибрежных селах реки Теча.

Задачи исследовании:

1. Сравнить интенсивность исходного уровня апоптоза ЛПК, а также после стандартных нагрузочных тестов ex vivo (облучение лимфоцитов в дозе 1 Гр, инкубации 5 и 24 часа), у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, в том числе перенесших хроническую лучевую болезнь (ХЛБ), и у необлученных лиц.

2. Оценить зависимость частоты апоптоза лимфоцитов от дозы и мощности дозы облучения красного костного мозга (ККМ), дозы и мощности дозы облучения всего тела, а также пола, национальности и возраста на время обследования.

3. Исследовать взаимосвязь интенсивности апоптоза лимфоцитов с частотой соматических мутаций, блоком клеточного цикла, а также биохимическими и иммунологическими показателями, у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию.

Научная ковшна исследования. Впервые у жителей прибрежных сел реки Теча, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, была исследована интенсивность аноптотической гибели ЛПК на ее ранней стадии и стадии фрагментации ДНК с использованием метода проточной цитометрии. Было выявлено повышение количества клеток с ранней стадией апоптоза у облученных лиц, как на исходном уровне, так и после дополнительных нагрузок ex vivo. Проведен анализ влияния факторов радиационной и нерадиационной природы на интенсивность апоптоза ЛПК у облученных лиц. Показано сочетанное влияние дозы облучения и возраста на частоту апоптотической гибели ЛПК. Впервые у хронически облученных лиц изучена взаимосвязь апоптотической гибели ЛПК с иммунологическими и биохимическими параметрами, а также частотой клеток с мутациями Т-клеточного рецептора и блоком клеточного цикла.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования дополняют имеющиеся данные о состоянии защитных механизмов клеток и вносят вклад в понимание механизма развитая отдаленных эффектов облучения у людей, подвергшихся хроническому неравномерному радиационному воздействию в диапазоне доз на ККМ от 0,09 до 4,23 Гр на реке Теча. Полученные данные можно учитывать при оценке индивидуальной радиочуствительности людей к хроническому радиационному воздействию. Разработанный комплекс методик определения апоптоза ЛПК с использованием. проточной цитометрии может быть использован в курсе практических занятий на кафедре радиационной биологии биологического факультета Челябинского государственного университета.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия (дозы облучения ККМ от 0,09 до 4,23 Гр, среднее значение 1,05=Ш,0б Гр) у лиц преимущественно пожилого и старческого возраста отмечено увеличение интенсивности исходного уровня апоптотической гибели ЛПК на ранней стадии, а также повышение частоты апоптотической гибели клеток на ранней стадии, после дополнительных нагрузочных тестов ex vivo.

2. У лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, в отдаленные сроки, выявлена зависимость изменения количества CD95+ клеток от дозы и мощности дозы облучения ККМ и всего тела. Активация апоптотической гибели ЛПК обусловлена комплексом факторов радиационной и нерадиационной (возраст) природы.

Апробация работы: Материалы диссертационной работы были доложены на 12th International Congress of the International Radiation Protection Association (Buenos Aires, Argentina, 2008), 10th International Conferences on Health Effects of Incorporated Radionuclides (Santa Fe, NM., 2009), на 54th Annual Meeting of the Health Physics Society (Minneapolis, USA, 2009), на 5 международной научно-практической конференции, посвященной 10-летшо создания Северского биофизического центра ФМБА России (Томск, 2010), на 1 международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 2010), на IV международной конференции «Хроническое радиационное воздействие: эффекты малых доз» (Челябинск, 2010), на 56th Annual Meeting of the Health Physics Society (West Palm Beach, USA, 2011).

Публикации: по материалам работы опубликовано 17 печатных работ, из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав посвященных результатам собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы включающего 40 отечественных и 115 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Характеристика обследованных лиц. Исследование интенсивности апоптоза проводилось у лиц, проживающих в прибрежных селах реки Теча, подвергшихся хроническому радиационному воздействию в результате сбросов радиоактивных отходов производственным объединением «Маяк» в речную систему Теча-Исеть-Тобол-Иртыш-Обь с 1949 по 1956 гг. Население прибрежных сел подверглось комбинированному внешнему у- и внутреннему у-и ß-излучению. Основным дозообразующим радионуклидом являлся остеотропный ^Sr, тканями-мишенями которого был слой остеошшых клеток,

выстилающих поверхности скелета, и клетки красного костного мозга. Длительный период полураспада ^Sr привел к облучению тканей в течение длительного нериода времени с постепенно снижающейся мощностью дозы (Аклеев А.В. и др., 2000, Tolstykh E.I. et al., 2011).

Кроме того значимый вклад в формирование дозы внес 137Cs и 89Sr, но благодаря короткому периоду полураспада 89Sr и быстрому выведению из организма 137Cs, облучение за счет этих радионуклидов реализовывалось в первые 5 лет после их поступления (Аклеев А.В., 2000). В настоящее время радиационное воздействие на организм человека обусловлено, прежде всего,

90

инкорпорацией остеотропного Sr (Degteva МО. et al, 2000, Tolstykh E.I. et all, 2011).

Исследования апоптотической табели клеток проводились с 2008 по 2011 it. на базе Уральского научно-практического центра радиационной медицины. Была обследована группа облученных лиц, состоявшая из 144 человек проживающих на прибрежных территориях реки Теча. Среди облученных была выделена подгруппа облученных лиц перенесших ХЛБ (35 человек). Контрольную группу составили 78 необлученных лиц проживающих в сходных социально-экономических условиях на незагрязненной территории.

Средний возраст облученных людей составил 70 лет (58-83 года), в группе облученных с ХЛБ средний возраст составил 71 год (68-83 года), в группе необлученных лиц средний возраст составил 68 лет (56-81 год).

Информация об индивидуальных накопленных дозах была получена из базы данных УНПЦРМ TRDS-2009. Средняя доза облучения ККМ для всех облученных лиц составила 1,05±0,0б Гр (0,094,23 Гр), средняя мощность дозы ККМ составила 0,26±0,02 Гр/год (0,03-1,20 Гр/год), средняя доза облучения на все тело составила 0,06±0,007 Гр (0,0001-0,46 Гр), средняя мощность дозы на все тело составила 26,0±4,0 мГр/год (0,1-241,5 мГр/год). Средняя доза облучения ККМ для группы облученных лиц перенесших ХЛБ составила 1,06±0Д Гр(0,09-2,87 Гр), средняя мощность дозы ККМ составила 0,22±0,03 Гр/год (0,04-0,88 Гр/год), средняя доза на все тело - 0,05±0,02 Гр (0,004-0,46 Гр), средняя мощность дозы облучения на все тело - 23±9 мГр/год (2-241,5 мГр/год).

Методы исследовании. В работе использовались методы определения апоптоза ЛПК, позволяющие оценить раннюю стадию апоптоза по содержанию белка фосфатидилсерина (ФС) на внешней поверхности мембраны; позднюю стадию апоптоза, определенную по показателю фрагментации ДНК, а также количество клеток несущих на своей поверхности активанионный рецептор

смерти CD95 (Vermes I. et al. 2000, Lamm G.M. et al, 1997, Wilkins R.C. et al., 1999). Кроме того, нами было определено количество клеток погибших путем некроза, а также количество CD3-CD4+ клеток.

Схема эксперимента. В качестве объекта исследования был выбран лимфоцит периферической крови, выделенный в стерильных условиях, на градиенте плотности фиколл-урографин (Хейфец Л.Б. и др., 1973).

Была проведена оценка исходного уровня апоптоза ЛПК и после дополнительных нагрузок ex vivo. В качестве дополнительных нагрузок применялась инкубация 5 и 24 часа, а также облучение in vitro в дозе 1Гр на исследовательской гамма-установке ИГУР-1, мощность экспозиционной дозы

0.75 Гр/мин, источник - ®Со, с последующей инкубацией 5 и 24 часа. Клетки инкубировались при 37 С0 в среде RPMI-1640 (4мл) в присутствии сыворотки крупного рогатого скота (1 мл) с добавлением глютамииа и смеси антибиотиков (Lopez et. al. 1991).

Анализ частоты апоптотических клеток после дополнительных нагрузок позволит судить об адаптационных возможностях облученных клеток.

Суспензию клеток для определения фосфатидюхсерина и некротических клеток окрашивали по стандартной методике (Wilkins et al. 2002) с использованием набора Armexin V-FITC Kit (Becton Dickinson, США). Суспензию клеток для определения фрагментации ДНК пермобилизировали 4% парофармольдегадом, фиксировали 70% этиловым спиртом и окрашивали по стандартной методике TUNEL Apo-Direct Kit (Becton Dickinson, США) (Vermes

1. et at. 20.00).

Частоту клеток с рецептором CD95 определяли с помощью моноклональных антител IgGl-FE изотопический контроль, CD95-PE (Becton Dickenson, США),

Частоту мутаций в генах TCR оценивали по количеству лимфоцитов с генотипом CD3-CD4+. Для этого лимфоциты периферической крови окрашивали с применением моноклональных антител CD3-FITC, CD4-PE, Ig 1-FUCUg 1-РЕ (Becton Dickenson, США),

Анализ апоптотических клеток с белком фосфатидилсерин, фрагментацией ДНК, рецептором CD95, а также CD3-CD4+ лимфоцитов проводили на проточном цитофлуориметре серии EPICS XL-MCL (аргоновый лазер 488 им мощностью 15 мВт).

Статистический метод. Закон распределения полученных данных определялся тестом Колмогорова-Смиронова. По результатам теста, для

сравнения полученных выборок, использовался непараметрический U-тест Манна-Уигни. Для описания выборок использовались медианы и 25-75 проценгаль. Связь между дозовыми показателями и частотой апоптоза, а также связь между нерадиационными показателями и частотой апоптоза определяли с помощью ранговой корреляции по Спирману. Определение вида зависимости показателей апоптотической гибели от дозы и мощности дозы проводилось с использованием регрессионного анализа. Для аппроксимации зависимости применялись линейная, кубическая и экспоненциальная регрессионные модели. Влияние факторов радиационной и нерадиационной природы оценивали с помощью факторного анализа (анализ главных компонент с использованием вращения по методу Варимахса). Во всех случаях нулевую гипотезу отклоняли при р<0,05. Для оценки влияния пола, возраста и национальности на показатели апоптотической гибели клеток использовался многомерный дисперсионный анализ. На основании критерия «След Пиллая» нулевая гипотеза отклонялась в том случае, если между всеми возрастными группами не наблюдалось различий ни для одной из зависимых переменных (р=0,002) (Реброва О.Ю., 2002, Таганов Д.Н., 2005, Sokal R.R. et al., 1995). Статистический анализа проводили в программных пакетах Statistica 7.0, SPSS Statistic 17.0, KyPlot Portable 2.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка исходного уровня апоптоза ЛПК у лиц подвергшихся хроническому радиационному воздействию

В таблице 1 представлены данные исходного уровня апоптотической и некротической гибели лимфоцитов, а также количество клеток с рецептором CD95. Количество клеток на ранней стадии апоптоза, определенных но содержанию белка ФС на поверхности мембраны, у всех облученных лиц и лиц без ХПБ статистически значимо выше, по сравнению с группой не облученных лиц, что составляет 3,11% (р=0,01) против 0,52%. Напротив, в группе облученных лиц с ХЛБ не наблюдается статистически значимого увеличения исходного уровня апоптоза, по сравнению с группой облученных без ХЛБ и ipyniioii лиц, не подвергшихся облучению.

Увеличение количества клеток на стадии фрагментации ДНК, во всех обследованных группах облученных людей, было приблизительно равным и статистически незначимым, относительно группы необлученных лиц.

Содержание клеток, с активационным рецептором CD95 на поверхности лимфоцитов периферической крови, статистически значимо не различается в

группах «облученные с ХЛБ» и «облученные без ХЛБ» как между собой, так и с группой необлучешшх лиц.

Таблица 1 - Частота (%) апоптотических и некротических клеток в группе облученных лиц _

Группы Ранний алоптоз Медиана (25%-75%) Фрагментация ДНК Медиана (25%-75%) С095+клетки Медиана (25%-75%) Некроз Медиана (25%-75%)

Все облученные 3,11 (1.24-5,36) р=0,01 0,15 (0,06-0,47) 4,1 (0,10-24,2) 0,01 (0-0,01)

Облученные без ХЛБ 3,11 (1,32-5,17) р=0,007 0,15 (0,06-0,39) 2,05 (1,05-4,51) 0,01 (0-0,01)

Облученные с ХЛБ 2 37 (0,10-5,54) 0,16 (0,06-0,79) 1,96 (1,13-6,48) 0,01 (0-0,05)

Необлученные 0,52 (0,04-2,34) 0,11 (0,04-0,36) 3,77 (0,05-13,8) 0,01 (0-0,02)

Примечание: р - статистически значимые различия с группой «Необлученные»

Количество клеток погибших путем некроза, во всех обследованных группах, составило минимальный процент - 0,01.

Увеличение апоптотической гибели ЛПК на ранней стадии может бьггь объяснено реакцией наиболее чувствительной ■ фракции лимфоцитов на выделение из периферической крови. Отсутствие значимого увеличения апоптотической гибели на поздней стадии апоптоза может быть связано с тем, что апоптотическая гибель регистрировалась сразу после выделения, тем самым стадия фрагментации ДНК еще не реализовалась. Кроме того, известно, что начавшийся процесс апоптоза не всегда завершается фрагментацией ДНК с последующим образованием апоптотических телец. На ранних стадиях апоптотической гибели, в результате ряда причин, возможно переключение, посредством биохимических процессов, с апоптотической гибели клеток на некротическую или гибель путем аутофагии (Edinger А.Е. et al., 2004 Scott R.C. et al., 2007).

Оценка апоптоза ЛПК при дополнительных нагрузках у лиц, перенесших хроническому радиационному воздействию.

В таблице 2 представлено количество апоптотических клеток, определенных по наличию белка фосфатидилсерина на мембране ЛПК При сравнении лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, с необлученными лицами было выявлено статистически значимое повышение

и

частоты гибели клеток на ранней стадии апоптоза после 5 ч (р=0,001) и 24 ч (р=0,005) инкубации, а также, после дополнительного облучения культуры лимфоцитов в дозе 1 Гр, с последующей инкубацией 5 ч (р=0,001).

В группе облученных лиц без ХЛБ также наблюдалось статистически значимое повышение апоптотических клеток, при всех видах стрессовых воздействий, по сравнению с группой необлученных лиц (р<0,05).

В группе облученных лиц с ХЛБ, несмотря на увеличение апоптотической гибели клеток относительно контрольной группы, отсутствовала статистическая значимость.

Таблица 2 - Частота апоптоза (%) при дополнительных нагрузках (ранняя стадия апоптоза)

Группы Исходный уровень Медиана (25%-75%) 5ч инкубации Медиана (25%-75%) Облучение 1 Гр + 5 ч инкубации Медиана (25%-75%) 24 ч инкубации Медиана (25%-75%) Облучение 1 Гр + 24 ч инкубации Медиана (25%-75%)

Все облученные з,и (1,24-5,36) р=0,01 6,11 (3,87-10,42) р=0,001 5,21 (3,63-10,5) р=0,001 27,69 (16,52-35,0) р=0,005 р*=0,001 р**=0,002 26,16 (17,7-36,95) р*=0,001 р**=0,002

Облученные без ХЛБ 3,11 (1,32-5,17) р=0,007 6,21 (4,13-11,69) р=0,001 6,39 (4,58-14,27) р=0,001 р*=0,01 27,69 (16,52-32,9) р=0,004 р*=0,005 р**=0,005 23,67 (18,04-36,3) р=0,005 р*=0,006 р'^0,006

Облученные с ХЛБ 2,73 (0,10-5,54) 3,79 (2,3-6,9) 2,94 (1,17-4,46) 36,85 (9,64-56,35) р*=0,001 р"=0,002 29,2 (0,43^0,6) р*=0,001 р**=0,002

Необлученные 0,52 (0,04-2,34) 0,68 (0,36-0,86) 0,61 (0,38-1,30) 14,25 (4,62-18,2) р*=0,001 р**=0,001 18,35 (10,4-25,9) р*=0,001 р**=0,001

Примечание: р - статистически значимые различия с 1руппой «Необлученные» р - статистически значимые внутригрупповые отличия от исходного уровня апоптоза р" - статистически значимые внутригрупповые отличия от 5 часов инкубации / 5 часов инкубации с предварительным облучением.

При анализе изменения количества апоптотических клеток после нагрузок с исходным уровнем и сравнение между собой количества апоптотических клеток после инкубации 5 и 24 часа, а также сравнение между собой после

облучения в 1 Гр и инкубации 5 и 24 часа внутри выделенных групп, был выявлен ряд особенностей.

У облученных людей как с ХЛБ, так и без ХЛБ частота апопготической гибели клеток, после 24 часов инкубации, статистически значимо выше в сравнении с 5 часами инкубации и исходным уровнем. Кроме того в этих же группах частота апоптоза после 24 ч инкубации с предварительным облучением, по сравнению с 5 ч инкубации с предварительным облучением и исходным уровнем, также статистически значимо выше.

В таблице 3 представлена частота апоптотических клеток, на стадии фрашентации ДНК.

Таблица 3 - Частота (%) апоптоза при дополнительных нагрузках (фрагментация

ДНК) _____

Группы Исходный уровень Медиана (25%-75%) 5ч инкубации Медиана (25%-75%) Облучение 1 Гр + 5 ч инкубации Медиана (25%-75%) 24 ч инкубации Медиана (25%-75%) Облучение 1 Гр + 24 ч инкубации Медиана (25%-75%)

Все облученные 0,15 (0,06-0,47) 0,43 (0,12-0,86) р*=0,01 0,53 (0,15-1,15) р*=0,01 0,56 (0,24-1,73) р*=0,01 р**=0,04 0,69 (0,24-1,98) р*=0,01 р"=0,04

Облученные без ХЛБ 0,15 (0,06-0,39) 0,36 (0,13-0,79) р*=0,01 0,46 (0,12-1,12) р*=0,01 0,56 (0,26-1,50) р*=0,01 р"=0,04 0,69 (0,29-2,13) р*=0,01 р""=0,04

Облученные с ХЛБ . 0,16 (0,06-0,79) 0,50 (0,10-1,09) 0,72 (0,22-1,85) р=0,01 0,49 (0,14-2,30) 0,70 (0,18-1,45) р*=0,01

Необлученные 0,11 (0,04-0,36) 0,58 (0,19-1,24) р*=0,01 0,54 (0,23-1,49) р*=0,01 0,32 (0,08-1,72) р*=0,01 0,76 (0,19-3,02) р*=0,01

Примечание: р* - статистически значимые внутригрупповые отличия от исходного уровня апоптоза р * - статистически значимые внучригрупповые отличия от 5 часов инкубации / 5 часов инкубации с предварительным облучением.

Во всех исследованных группах облученных лиц, при различных дополнительных нагрузках, отсутствуют статистически значимые различия, по сравнению с контрольной группой по критерию фрагментации ДНК.

Важно отметить, что при проведении внутригрупповых сравнений изменения интенсивности апопготической гибели на стадии фрагментации ДНК, выявлено некоторое отличие от изменения ранней апопготической гибели.

У всех облученных, облученных без ХЛБ и необлученных лиц наблюдается статистически значимое повышение апонготической гибели клеток после всех видов нагрузок, по сравнению с исходным уровнем. При этом, в этих группах максимальное количество клеток погибших путем апоптоза регистрируется спустя 24 часа инкубации с предварительным облучением лимфоцитов в дозе 1 Гр. Кроме того, у облученных людей без ХЛБ частота апонготической гибели клеток после 24 часов инкубации в сравнении с 5 часами инкубации, а также после 24 ч инкубации с предварительным облучением по сравнению с 5 ч инкубации с предварительным облучением, статистически значимо выше. В группе облученных лиц перенесших ХЛБ, несмотря на повышение клеток гибнущих апоптозом после дополнительных нагрузок, статистически значимые изменения, относительно исходного уровня, наблюдаются только после предварительного облучения и последующей инкубацией 5 и 24 часа. В том случае, если применялась только инкубация, доля ЛПК погибших апоптозом после 5 ч и 24 ч была одинаковой.

Таким образом, у облученных лиц как с ХЛБ, так и без ХЛБ наблюдается увеличение апоптотической гибели клеток по показателю белка фосфатидилсерина на поверхности мембраны относительно необлученных лиц после дополнительных нагрузок. Это может свидетельствовать о некотором истощении репарационного потенциала и более высокой вероятности возникновения de novo повреждений генома у облученных лиц. В данном случае не стоит также исключать влияние факторов нерадиационной природы, в частности возраста, на вероятность возникновения повреждений в геноме.

При сравнении ранней и поздней стадий апоптоза, обращает на себя внимание ускоренное завершение апоптотической гибели клеток у необлученных лиц. При этом у облученных без ХЛБ нарастание клеток на ранней стадии и стадии фрагментации ДНК происходит постепенно, достигая максимума к 24 часам инкубации. В тоже время, после предварительного облучения in vitro у необлученных лиц максимум апоптотических клеток по показателю фрагментации ДНК приходиться на 24 часа, как и у облученных.

По-видимому, изменения в скорости гибели клеток у обследованных лиц могу быть связаны с тем, что часть клеток гибнет сразу после действия стрессовых факторов, а часть уходит в задержку клеточного цикла (Endlich В. et al., 2000) и гибнет путем апоптоза в более поздние сроки, о чем свидетельствуют предварительные результаты проведенного нами исследования

по увеличению белка СЫ(2, после дополнительных нагрузок, в два и более раз, по сравнению с исходным уровнем.

Влияние факторов радиационной и нерадиациоипой природы на апонтоз лимфоцитов периферической крови в группе облученных лиц.

При исследовании зависимости апоптотической гибели ЛПК от дозы и мощности дозы облучения ККМ и всего тела, регрессионным анализом с использованием линейной, квадратичной и кубической моделей были выявлены: слабая зависимость количества клеток с рецептором СШ5 от мощности дозы облучения ККМ (у=3,36+2,1415+5,(Ш2; И2=0;068; р=0,01), а также слабая зависимость от дозы на все тело (у=3,194+40,991 354,541*В2+753,061*Е>3; 1^=0,185; р=0,001) и мощности дозы на все тело (у=0,054*ЕН-2,969; ^=0,164; р=0,001).

При исследовании регрессионным анализом зависимости апоиготической гибели ЛПК на ранней стадии и стадии фрагментации ДНК от дозы и мощности дозы не было выявлено статистически значимых зависимостей.

Затем в группе облученных лиц нами были сформированы дозовые подгруппы для проведения анализ зависимости апоптотической гибели клеток на стадии фрагментации ДНК от дозы и мощности дозы на ККМ и все тело.

В

£ 0.8Г

I 0.6 |

1 g

8 0.2 о

р=0.04

¡>=0.0-1

0.S

5 0,6 ь

и §

I 0.4

¡5 0.2

0.5 1 1.5 Дота, Гр

р=0.05

р=0.0б

f ' 1 1 ' 1...... ' ....... I . . Ч I I . . .'

Л 1.1 I

0.1 0,2 0.3 0,4 0,5 0.6 0.7 Мощность дозы. Гр/год

Рис. 1 - Зависимость изменения апоптотической гибели клеток с фрагментацией ДНК от дозы облучения ККМ (А), и мощности дозы облучения ККМ (В).

Примечание: Здесь и далее указана медиана и интервал в 25-75 процегггалей

Изменение частоты апоптоза, от дозы облучения ККМ (рис. 1А), характеризуется повышением уровня апоптотической гибели клеток в диапазоне доз от 0 до 0,7 Гр, с последующим спадом в дозе 1 Гр. В диапазоне

доз от 0,5 до 0,8 Гр количество апоптотических клеток статистически значимо выше, по сравнению с группой необлученных (р=0,04) и группой с диапазоном доз от 2 до 2,5 Гр (р=0,04).

Зависимость изменения частоты апоптотических клеток от мощности дозы облучения на ККМ представлена на рисунке 1В. Количество апоптотических клеток постепенно возрастает, при мощности дозы менее 0,2 Гр/год, относительно контрольной группы и достигает максимальных значений в дозовой подгруппе с интервалом мощности дозы от 0,1 до ОД Гр/год (р=0,05), а затем наблюдается снижение частоты апоптотической гибели до уровней в контрольной группе.

А

р=0.03

0.1 0,2 Доза, Гр

20 40 . 60 80 . Мощность дочы.мГр'год

100

Рис. 2 - Зависимость изменения апоптотической гибели клеток с фрагментацией ДНК от дозы на все тело (А), и мощности дозы на все тело (В)

Интересным представляется изменение частоты апоптоза, на стадии фрагментации ДНК, в зависимости от дозы и мощности дозы облучения всего тела, представленных на рисункс 2. При малых дозах облучения всего тела наблюдается статистически значимое повышение частоты апоптотических клеток в дозе 0,01 Гр (р=0,03), относительно группы необлученных лиц. После чего, повышение сменяется спадом в диапазоне доз до 0,1 Гр, в дальнейшем наблюдается некоторое увеличение количества апоптотических клеток, за которым следует статистически значимый спад интенсивности апоптотической гибели клеток в диапазоне доз от 0,2 Гр до 0,4 Гр, по сравнению с количеством апоптотических клеток в диапазоне доз от 0,01 до 0,05 Гр (р=0,03).

При изучении динамики изменения апоптотической гибели клеток, в зависимости от мощности дозы облучения всего тела, в выделенных дозовых подгруппах не наблюдается статистически значимых различий.

Отсутствие четких зависимостей «доза-эффект» в отдаленные сроки, по-видимому, является следствием многолетнего воздействия различных факторов нерадиационной природы на организм обследованных людей. В пожилом возрасте усугубляющимися инволюционными процессами, проявляющимися в накоплении стареющих клеток с неэффективно работающими механизмами контроля генетической полноценности клетки. В связи с этим было предпринято исследование влияния комплекса радиационных и нерадиационных факторов на апоотоз ЛПК.

Таблица 4 - Зависимость частоты апоптотической гибели клеток (фрагментация ДНК) от факторов радиационной и нерадиационной природы

Факторы Исходный .уровень 24 ч инкубации Облучения 1 Гр + 24 ч инкубации

Национальность p=0,4;F=0,47 р=0,7; F=0,1 р=0,9; F=0,02

Пол. р=0,5; F=0,46 р=0,3; F=0,16 р=0,2; F=l,7

Возраст р=0,05; F=2,76 р=0,001; Р=8,83 р=0,02; F=3,45

Доза на ККМ р=0Д; F=2,02 р=0,001; F=6,41 р=0,05; F=2,53

Доза на все тело р=0,005; F=3,55 р=0,4 F=l,7 р=0,2; F=l,52

Мощность дозы на ККМ р=0,3; F=l,25 р=0,9 F=0,2 р=0,7; F=0,55

Мощность дозы на все тело р=0,002; F=5,37 р=0,9 F=0,15 p=0,9;F=0,16

Доза на ККМ+Возраст p=0,4;F=l,l р=0,001; F=7,39 р=0,004; F=4,02

Доза на все тело+Возраст р=0,001; F=3,17 р=0,6; F=0,79 р=0,3; F=U2

Примечание: F - коэффициент дисперсии;

По результатам дисперсионного анализа (таб. 4) было выявлено влияние фактора возраста (р=0,05; F=2,76), дозы на все тело (р=0,005; F=3,55), мощности дозы на все тело (р=0,002; F=5,37), а также сочетанное влияние дозы на все тело и возраста (р=0,001; F=3,17) на исходный уровень апоптоза. На уровень апоптотической гибели клеток после дополнительных нагрузок (инкубация 24 часа с облучением и без облучения) влияют такие факторы как возраст, доза на ККМ, а также сочетанное влияние возраста и дозы на ККМ.

Полученные результаты могут быть объяснены тем, что интенсивность апоптоза, с одной стороны, определяется возрастными изменениями, проявляющимися в накоплении генетических повреждений и как следствие увеличением частоты апоптотической гибели (Schmitz А, et al., 2003), а с другой стороны, повреждениями в генетической структуре зрелых лимфоцитов,

вызванными дозовой нагрузкой в течение всего периода циркуляции клеток в кровотоке. Повреждения ДНК, которые возникли в стволовых клетках, о чем свидетельствует влияние дозы облучения ККМ на апоптотиечскую гибель, могут приводить к срыву адаптационных механизмов после стрессовых воздействий.

Кроме того, нами была проанализирована взаимосвязь показателей оксидативного стресса и ряда цитокинов с частотой апоптотических клеток, представленная в таблице 5.

Таблица 5 -Коэффициенты корреляции Спирмана для изучаемых параметров

Некоторые параметры Исходный уровень алоптоза (фрагментация ДНК) CD95+клетки

Нитрит-ион (N02") -0,38 -

Нитрат-ион (N03") 0,362 -

Оксид азота (NO) -0,263 -

ФНОа 0,25 0,427

ИЛ1 - 0,260

ИЛ2 - -0,287

ИЛ4 - -0,384

Примечание: для всех параметров рассчитаны коэффициенты корреляции по Спирману, р<0,05 (2-х сторонняя).

Исходный уровень аноптоза умеренно положительно коррелирует с нитрат-ионом, фактором некроза опухоли и отрицательно умеренно коррелирует с нитрит-ионом и оксидом азота.

Клетки, несущие на своей поверхности рецептор CD95, положительно и умеренно коррелируют с содержанием в сыворотке фактора некроза опухоли и ИЛ1. С ЙЛ2 и Ш14 данные клетки имеют отрицательную умеренную корреляционную связь.

Известно, что оксид азот может выступать как в качестве проапопготического фактора, так и антиапоптотического фактора (Chen Y. Et al., 2001). ИЛ-2 является ингибитором апоптотической гибели клеток, а фактор некроза опухоли, напротив, способствует Fas-опосредованному пути апоптотической гибели, что подтверждается полученными результатами корреляционного анализа (Барышников А.Ю. и др., 2002, Kuida К. et al., 2000, Rabinowichli. etal., 1998).

При воздействии длительное время малыми мощностями дозы облучения в клетках возникают повреждения, которые репарируются, при этом у части клеток повреждения ДНК настолько велики, что клетки гибнут, а у части клеток поражения, вероятно, репарируются достаточно быстро, благодаря чему такие клетки способны дать клоногенное потомство. В-том случае, когда репарация прошла неэффективно, возпикают совместимые с жизнью структурные и функциональные дефекты в геноме стволовых кроветворных клеток, передающиеся их дифференцированным потомкам и реализующиеся в отдаленные эффекты облучения (Ярмоненко С.П., 2004, Little J.B. et al., 2003, NagarS.Etal.,2005).

В связи с этим, нами было проанализировано изменение количества клеток с мутациями в гене Т-клегочного рецептора, а также изменение количества клеток с задержкой клеточного цикла и апоптотической гибелью клеток у облученных лиц в одинаковых дозовых подгруппах (рис. 3).

А В

о 2 1

ъ &

а 2 0-8 0.6

S g

g 5 0,4

° ч

Л И, F 5 1

I I

0,5

1 1,5 Доза, Гр

2.5

;0,5

е

К 0,4 2

$ 0.3 р

с 0.1

В

£ о

о и

I?

р=0,02

0.5

1 1,5 Доча, Гр

2,5

$ 0-8 к

8 о.б

1 S

2 0-2

5

te

* о

р=0,04

о

р=0.04

0.5

1 1.5 2 2.5 Доза, Гр

Рис. 3 - Зависимость показателей частоты клеток с блоком клеточного цикла (А), доли СОЗ-СБ4+ клеток (В), доли исходного уровня алоптотических клеток (С) от дозы облучения ККМ

Согласно графику распределения частоты апоптотической гибели клеток, в зависимости от значения дозы облучения ККМ, наблюдается активация апоптоза в диапазопе доз от 0 до 0,8 Гр. Вместе с тем, мутации в гене Т-клеточного рецептора так же нарастают, но достигают максимального значения в диапазоне доз от 0 до 0,5 Гр (р=0,02), с последующим спадом. Спад апоптотической гибели клеток в диапазоне доз от 1 Гр до 2 Гр сопровождается ростом CD3-CD4+ клеток. При этом количество клеток с блоком клеточного цикла значимо не изменяется в зависимости от дозы. Однако наблюдается тенденция к увеличению и последующему спаду количества клеток с блоком клеточного цикла в тех же дозовых диапазонах, что и изменения апоптотической гибели.

ВЫВОДЫ

1. У лиц, проживающих в прибрежных селах реки Теча, в отдаленный период после начала хронического радиационного воздействия, средняя доза облучения красного костного мозга i,05±0,06 Гр, диапазон индивидуальных значений от 0,09 до 4,23 Гр, выявлено статистически значимое повышение исходного уровня апоптоза на ранней стадии, по сравнению с необлученными лицами. Частота исходною уровня апоптоза по критерию фрагментации ДНК, клеток с рецептором CD95+ и некротических клеток статистически значимо не отличаются от группы необлученных лиц.

2. У лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, апопгоз лимфоцитов периферической крови, после дополнительных стандартных нагрузок irt vitro (острое облучение в дозе 1 Гр и инкубация), по критерию ранней аноототической гибели достоверно выше, по сравнению с необлученными лицами. По критерию фрагментации ДНК облученные лица статистически значимо не отличаются от группы необлученных лиц.

3. У жителей прибрежных сел реки Теча установлена зависимость увеличения количества клеток с рецептором CD95+ от увеличения дозы и мощности дозы облучения всего тела и мощности дозы облучения красного костного мозга. Полученная зависимость описывается линейной, квадратичной и кубической моделями.

4. У лиц, подвергшихся хроническому радиационному облучению, в отдаленные сроки после начала воздействия, отмечено сочетанное влияние факторов радиационной природы (доза облучения красного

костного мозга и всего тела) и нерадиационной природы (возраст) на интенсивность апоптоза лимфоцитов периферической крови.

5. У облученных лиц, проживающих в прибрежных селах реки Теча, выявлена разнонаправленная корреляционная связь интенсивности апояготической гибели клеток на стадии фрагментации ДНК с показателями оксидативного стресса (положительная с уровнем нитрат-иона, отрицательная с уровнем нитрит-иона и оксидом азота в сыворотке крови), а также положительная корреляционная связь количества CD95+ клеток с TNFa и ИЛ1 и отрицательная корреляционная связь с уровнем сывороточных ИЛ2 и ИЛ4.

СЛИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Veremeyeva G., Akushevich I., Blinova E., Varfolomeyeva T., Ploshchanskaya O., Khudyakova O., Vozilova A, Kozionova O., Akleyev A.. Long -term cellular effects in humans chronically exposed to ioniziag radiation // Health Physics. - 2010. - Vol. 97.-No. 3,-P. 337-346.

2. Маркина Т.Н., Веремеева ГА, Блинова Е.А., Аклсев А.В. Блок клеточного цикла и активность апоптоза лимфоцитов периферической крови (ЛПК), частота мутаций в генах TCR в отдаленные сроки у людей, подвергшихся хроническому радиационному воздействию // Вопросы радиационной безопасности. - 2011. -№ 1.-С. 4149

3. Блинова А.В., Веремеева ПА, Аклеев АВ. Апоптоз лимфоцитов периферической крови и мутации в гене Т-клеточного рецептора у лиц перенесших хронической радиационное воздействие // Вопросы радиационной безопасности. - 2011. - № 4. - С. 38-44

Друг ие публикации

4. Блинова Е.А., Веремеева ГА Апоптоз лимфоцитов периферической крови человека при хроническом радиационном воздействии // Вестник Челябинского государственного университета: Серия Биология. - 2008. - № 4. - С. 99-102.

5. Аклеева АВ., Почухайлова Т.Н., Блинова Е.А. Пролиферация, клеточный цикл и апоптоз лимфоцитов крови человека в отдаленные сроки после хронического

радиационного воздействии // Медицинская наука и образование Урала. - 2009. -Т. 10.-№3.-С. 52-54.

6. Veremeyeva G.A, Akushevich I.V., Ukraintseva S.V., Yashin AI., Epifanova S.B., Blinova E.A., Akleyev A.V. A new approach to individual prognostication of cancer development under conditions of chronic radiation exposure // Int. Journal of Low Radiation. -2010.-Vol.7.-No. 1.-P. 53-80.

7. Веремеева Г.А., Блинова E.A., Почухайлова Т.Н., Аклеев А.В. Влияние хронического облучения на апоптоз лимфоцитов периферической крови человека // Материалы международной научно-практической конференции Чернобыльские чтения. - 2008. - С. 52-57.

8. Veremeyeva G., Varfolomeyeva Т., Vozilova A, Blinova Е., Pochukhailova Т., Pushkaryov S., Akleyev A. Genomic instability at late time after chronic radiation exposure // Poster presentation at the 12lh International Congress of the International Radiation Protection Association. -19-24 October 2008. - Buenos Aires, Argentina, 2008.-P. 92-93.

9. Veremeyeva G., Akushevich I., Blinova E., Pochukhailova T. and A. Akleyev. The Role of Apoptosis in the Development of Radiation-Induced Genome Instability under Chronic Radiation Exposure // Radioprotection. - 2008. - Vol. 43. - No.5., - P. 117

10. Veremeyeva G., Akushevich I., Pochukhailova Т., Blinova E., Varfolomeyeva Т., Ploshchanskaya O., Khudyakova O., Vozilova A, Kozionova O, Akleyev A Frequency of genomic abnormalities and peculiarities of physiological processes in blood cells under chronic radiation exposure in man: Bridging the Experimental and Epidemiologic Divide // Georgetown University Hotel & Conference Center. - 4-6 May 2009. - Washington, USA, 2009. - P. 37.

11. Veremeyeva G., Akushevich I., Pochukhailova Т., Blinova E., Varfolomeyeva Т., Ploshchanskaya O., Khudyakova O., Vozilova A, Kozionova O, Akleyev A. Long-term Cellular Effects in Humans Chronically Exposed to Ionizing Radiation // Presentation at 10th International Conferences on Health Effects of Incorporated Radionuclides. - 10-14 May 2009. - Santa Fe, USA, 2009. -P.101.

12. Akleyev AV., Pochukhailova Т., Blinova E. Proliferation. Cell cycle and Apoptosis in Blood Lymphocytes at Late Time after Chronic Radiation Exposure in Man // 54th Annual Meeting of the Health Physics Society. - 12-16 July 2009. - Minneapolis, USA, 2009. - P. 93

?.Веремеева Г.А., Акушевич И.В., Маркина Т.Н., Блинова Е.А., Площанская О.Г., Варфоломеева Т.А, Худякова О.И., Аклеев А.В. Особенности

внутриклеточных процессов при хроническом облучении человека // Тезисы докладов IV международной конференции «Хроническое радиационное воздействие: эффекты малых доз». 9-11 ноября 2010г. - Челябинск, 2010. - С.27

14. Б лилова Е.А., Веремеева Г. А., Аклеев A.B. Особенности апоптоза лимфоцитов у хронически облученных лиц, в том числе лиц, перенесших хроническую лучевую болезнь // Тезисы докладов IV международной конференции «Хроническое радиационное воздействие: эффекты малых доз». 9-11 ноября 2010г. - Челябинск, 2010. - С.26

15.Блинова Е.А., Аклеева A.B., Веремеева Г.А. Апоптоз лимфоцитов крови человека в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия // Материалы 5 международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию создания Северского биофизического центра ФМБА России. - 13-14 апреля 2010. - Томск, 2010. - С. 75-77

16. Димов Г.П., Маркина Т.Н., Блинова Е.А., Веремеева ГА, Аклеев AB. Оценка показателей клеточного цикла лимфоцитов периферической крови как метод прогнозирования ответа системы гемопоэза на регенеративную терапию Н Материалы 1 международной научно-практической конференции постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине. - 17-19 ноября 2010. - Москва, 2010. - С. 127

17.Площапская О.Г., Веремеева Г.А., Блинова Е.А. Частота мутаций в гене Тр53 и интенсивность апоптоза лимфоцитов периферической крови у людей, подвергшихся хроническому радиационному воздействию // Материалы 1 международной научно-практической конференции постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине. - 17-19 ноября 2010.-Москва, 2010.-С.196

Подписано кпечати 23.12.2011г. Формат 60x84 1/16 Объем 1,0 уч.-издл. Заказ № 488. Тираж 100 экз. Отпечатано на ризографе в типографии ФГБОУ ВПО ЧГПУ 454080, г. Челябинск, пр. Легши, 69

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Блинова, Евгения Андреевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Виды радиационно-индуцированной клеточной гибели.

1.1.1 Радиационно-индуцированный апоптоз.

1.1.2. Радиочувствитепьность и апоптоз.

1.1.3. Дозовые зависимости реализации апоптоза.

1.2. Молекулярные механизмы радиационно-индуцированного апоптоза.

1.2.1.Рецептор-опосредованный путь радиационно-индуцированного апоптоза.

1.2.2. Роль белка р53 в реализации радиационно-индуцированного апоптоза.

1.2.3. Оксидативный стресс и радиационно-индуцированный апоптоз.

1.3. Роль апоптоза в развитии радиационно-индуцированных эффектов.

1.3.1. Роль апоптоза в реализации ранних эффектов ионизирующего излучения.

1.3.2.Роль апоптоза в развитии отдаленных эффектов ионизирующего излучения.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Характеристика радиационной ситуации на р. Теча.

2.1.1. Характеристика обследованных групп населения.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Схема исследования.

2.2.2. Выделение лимфоцитов.

2.2.3. Анализ апоптоза лимфоцитов методом TUNEL.

2.2.4. Анализ апоптоза лимфоцитов методом Annexin V-FITC.

2.2.4. Анализ лимфоцитов экспрессирующих активационный рецептор СЭ95.

2.2.5. Анализ мутантных СБЗТЮ4+ клеток.

2.2.7. Статистические методы исследования.

ГЛАВА III. ВЛИЯНИЕ ХРОНИЧЕСКОГО РАДИАЦИОННОГО

ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ЧАСТОТУ АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА.

3.1. Оценка исходного уровня апопоза ЛПК у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию.

3.2. Оценка апоптоза ЛПК при дополнительных нагрузках у лиц, перенесших хроническое радиационное воздействие.

3.3. Влияние факторов радиационной и нерадиационной природы на апоптоз ЛПК в группе облученных лиц.

3.3.1. Зависимость апоптотической гибели ЛПК от дозы и мощности дозы облучения на ККМ и все тело.

3.3.2. Влияние комплекса факторов радиационной и нерадиационной природы на апоптоз ЛПК в отдаленный период после хронического радиационного воздействия.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Интенсивность апоптоза лимфоцитов периферической крови у жителей прибрежных сел реки Теча, подвергшихся хроническому радиационному воздействию"

Актуальность исследования

В современном мире человек неизбежно подвергается воздействию ионизирующего излучения вследствие контакта с разнообразными источниками облучения. Облучению подвергается не только узкая группа специалистов, работа которых непосредственно связана с использованием источников излучения, например врачи рентгенологи и сотрудники атомных станций. Работа космонавтов, ликвидаторов последствий аварий, военных, также может быть сопряжена с пребыванием в условиях повышенного радиационного фона, кроме того население в целом подвергается радиационному воздействию вследствие диагностики и лечения.

Опыт прошлых десятилетий в области использования атомной промышленности, как в военных, так и в мирных целях, свидетельствует о возможности возникновения ситуаций, при которых облучению подвергаются многочисленные группы населения. Примерами таких событий являются испытания ядерного оружия, проводившиеся в 1950-60 годы на Маршалловых островах, в Австралии, в Алжире, на Семипалатинском полигоне, а также бомбардировка японских городов Хиросимы и Нагасаки, вследствие чего пострадали тысячи мирных жителей. Кроме того аварии на ядерных реакторах в Англии в 1957 г., в США в 1979 г., на Чернобыльской атомной станции в 1986г. и в Японии на Факусиме-1 в 2011 г., а так же сбросы радиоактивных отходов в реку Теча. Все это приводит к ситуациям, при которых люди подвергаются острому облучению в начальный период, с последующим равномерным снижением мощности дозы облучения в течение длительного периода времени, что в итоге способствует развитию отдаленных последствий ионизирующего излучения.

Для реализации отдаленных последствий воздействия ионизирующего излучения на клетку, наряду с повреждением ДНК, важным является активация защитных механизмов клетки: репарации повреждений, регуляции клеточного цикла и апоптоза [3, 17, 25, 40].

Согласно современным знаниям о реакции молекулярных структур клеток на повреждающие воздействие ионизирующего излучения, программируемая клеточная смерть является одним из главных механизмов поддержания постоянства генома [16, 63, 75, 79].

В случае возникновения генетических и метаболических нарушений процессов инициации и реализации апоптоза, развиваются патологические состояния, сопровождающиеся с одной стороны сохранением в организме клеток с неограниченным пролиферативным потенциалом, тем самым увеличивая вероятности развития онкопаталогии [2, 39, 75], а с другой стороны развитием дистрофических процессов, связанных с усиленной гибелью клеток [9,41].

У лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию на реке Теча, одним из ранних эффектов облучения было развитие хронической лучевой болезни. У таких пациентов наблюдалось угнетение процессов гемопоэза, выражающееся в развитии лейкопений, нейтропений и тромбцитопений. В более поздние периоды, от начала радиационного воздействия, гематологические показатели улучшались, однако, после прекращения внешнего у-облучения, в течение длительного времени сохранялась лейкопения и нейтропения, за счет поступления радионуклидов в организм [22]. Кроме того в отдаленные периоды наблюдается повышение уровня соматических мутаций в гене Т-клеточного рецептора, увеличение частоты хромосомных аберраций, увеличение числа клеток с блоком клеточного цикла [20, 147], а также отмечается повышенный риск развития соматических эффектов стохастической природы (рак, лейкоз) [93].

На данный момент, остается открытым вопрос изменения интенсивности апоптоза у хронически облученных лиц пожилого и старческого возраста.

Проведенное нами исследование даст возможность оценить интенсивность б апоптоза у обследованных лиц при длительном радиационном воздействии, усугубляющимся инволюционными процессами, в силу которых происходит увеличение частоты возникновения целого ряда заболеваний, связанных с апоптозом, таких как злокачественные опухоли, лейкозы и дегенеративные процессы. В связи с этим исследование апоптоза, как одного из основных барьерных механизмов, защищающих организм от генотоксического действия радиации, является актуальным.

Цель исследования: исследовать влияние хронического радиационного воздействия на апоптоз лимфоцитов периферической крови (ЛПК) в отдаленные сроки у лиц, проживающих в прибрежных селах реки Теча.

Задачи исследования:

1. Сравнить интенсивность исходного уровня апоптоза лимфоцитов периферической крови, а также после стандартных нагрузочных тестов ех vivo (облучение лимфоцитов в дозе 1 Гр, инкубации 5 и 24 часа), у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, в том числе перенесших хроническую лучевую болезнь (ХЛБ), и у необлученных лиц.

2. Оценить зависимость частоты апоптоза лимфоцитов от дозы и мощности дозы облучения красного костного мозга (ККМ), дозы и мощности дозы облучения всего тела, а также пола, национальности и возраста на время обследования.

3. Исследовать взаимосвязь интенсивности апоптоза лимфоцитов с частотой соматических мутаций, блоком клеточного цикла, а также биохимическими и иммунологическими показателями у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию.

Научная новизна исследования.

Впервые у жителей прибрежных сел реки Теча, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, была исследована интенсивность апоптотической гибели лимфоцитов периферической крови на ее ранней стадии и стадии фрагментации ДНК с использованием метода проточной цитометрии. Было 7 выявлено повышение количества клеток с ранней стадией апоптоза у облученных лиц, как на исходном уровне, так и после дополнительных нагрузок ex vivo.

Проведен анализ влияния факторов радиационной и нерадиационной природы на интенсивность апоптоза ЛПК у облученных лиц. Показано сочетанное влияние дозы облучения и возраста на частоту апоптотической гибели ЛПК.

Впервые у хронически облученных лиц изучена взаимосвязь апоптотической гибели клеток с иммунологическими и биохимическими параметрами, а также частотой клеток с мутациями Т-клеточного рецептора и блоком клеточного цикла.

Положения, выносимые на защиту:

1. В отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия (дозы облучения ККМ от 0,09 до 4,23 Гр, среднее значение 1,05±0,06 Гр) у лиц, преимущественно пожилого и старческого возраста, отмечено увеличение интенсивности исходного уровня апоптотической гибели ЛПК на ранней стадии, а также повышение частоты апоптотической гибели клеток на ранней стадии, после дополнительных нагрузочных тестов ex vivo.

2. У лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, в отдаленные сроки, выявлена зависимость изменения количества CD95+ клеток от дозы и мощности дозы облучения ККМ и всего тела. Активация апоптотической гибели ЛПК обусловлена комплексом факторов радиационной и нерадиационной (возраст) природы.

Теоретическая и практическая значимость.

Результаты исследования дополняют имеющиеся данные о состоянии защитных механизмов клеток и вносят вклад в понимание механизма развития отдаленных эффектов облучения у людей, подвергшихся хроническому неравномерному радиационному воздействию на реке Теча в диапазоне доз на ККМ от 0,09 до 4,23 Гр.

Полученные данные можно учитывать при оценке индивидуальной радиочуствительности людей к хроническому радиационному воздействию.

Разработанный комплекс методик определения апоптоза ЛПК на основе использования проточной цитометрии может быть использован в курсе практических занятий на кафедре радиационной биологии биологического факультета Челябинского государственного университета.

Апробация работы: Материалы диссертационной работы были доложены на 12th International Congress of the International Radiation Protection Association (Buenos Aires, Argentina. 2008), 10th International Conferences on Health Effects of Incorporated Radionuclides (Santa Fe, NM., 2009), на 54th Annual Meeting of the Health Physics Society (Minneapolis, USA, 2009), на 5 международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию создания Северского биофизического центра ФМБА России (Томск, 2010), на 1 международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 2010), на IV международной конференции «Хроническое радиационное воздействие: эффекты малых доз» (г. Челябинск, 2010), на 56th Annual Meeting of the Health Physics Society (West Palm Beach, USA, 2011).

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Блинова, Евгения Андреевна

ВЫВОДЫ:

1. У лиц, проживающих в прибрежных селах реки Теча, в отдаленный период после начала хронического радиационного воздействия, средняя доза облучения красного костного мозга 1,05±0,06 Гр, диапазон индивидуальных значений от 0,09 до 4,23 Гр, выявлено статистически значимое повышение исходного уровня апоптоза на ранней стадии, по сравнению с необлученными лицами. Частота исходного уровня апоптоза по критерию фрагментации ДНК, клеток с рецептором CD95+ и некротических клеток статистически значимо не отличаются от группы необлученных лиц.

2. У лиц, подвергшихся хроническому радиационному вздействию, апоптоз лимфоцитов периферической крови, после дополнительных стандартных нагрузок in vitro (острое облучение в дозе 1 Гр и инкубация) по критерию ранней апоптотической гибели, достоверно выше, по сравнению с необлученными лицами. По критерию фрагментации ДНК облученные лица статистически значимо не отличаются от группы необлученных лиц.

3. У жителей прибрежных сел реки Теча установлена зависимость увеличения количества клеток с рецептором CD95+ от увеличения дозы и мощности дозы облучения всего тела и мощности дозы облучения красного костного мозга. Полученная зависимость описывается линейной, квадратичной и кубической моделями.

4. У лиц, подвергшихся хроническому радиационному облучению, в отдаленные сроки после начала воздействия отмечено сочетанное влияние факторов радиационной природы (доза облучения красного костного мозга и всего тела) и нерадиационной природы (возраст) на интенсивность апоптоза лимфоцитов периферической крови.

5. У облученных лиц, проживающих в прибрежных селах реки Теча, выявлена разнонаправленная корреляционная связь интенсивности апоптотической гибели клеток на стадии фрагментации ДНК с показателями оксидативного стресса (положительная с уровнем нитрат-иона, отрицательная с уровнем нитрит-иона и оксидом азота в сыворотке крови), а также положительная корреляционная связь количества CD95+ клеток с TNFa и ИЛ1 и отрицательная корреляционная связь с уровнем сывороточных ИЛ2 и ИЛ4.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Блинова, Евгения Андреевна, Москва

1. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза. М.: Эдиториал УРСС. - 2002. - 320 с.

2. Бондарчук И.А. Анализ роли репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптоза в радиационно-индуцированном адаптивном ответе клеток млекопитающих // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. - Т. 43. -№1. - С. 19-28.

3. Варга О.Ю., Рябков В.А. Апоптоз: понятие, механизмы, регуляция, значение // Экология человека. 2006. - №7. - С. 28-32.

4. Воробцова И.Е. Трансгенерационная передача радиационно-индуцированной нестабильности генома // Радиационная биология. Радиоэкология. 2006. -Т. 46,-№4.-С. 441-446.

5. Дегтева М.О., Воробьева М.И., Толстых Е.И., Шагина Н.Б., Кожеуров В.П. Дозиметрическая система реки Теча: реконструкция доз для оценки риска радиационных последствий // Вопросы радиационной безопасности. -2000. -№4. С.36-46.

6. Другова Е.Д. Содержание TNFa и его рецепторов в сыворотки рови профессионалов в отдаленном периоде после пролангированного облучения // Радиационная биология. Радиоэкология. 2007. -Том 47. - №6. -С. 696-700.

7. Егорова И.Ф. Апоптоз и некроз взаимоотношения явлений // Морфология. -2004. Т. 126. - №6. - С. 71-75.

8. Комарова Ф.И. Молекулярные механизмы апоптоза // Клиническая медицина. 2003. - №1. - 1 С. 78.

9. Косенко М.М., Аклеев A.B., Старцев Н.В. и др. Эпидемиологический анализ отдаленных канцерогенных последствии хронического облучения населения Урала // Международный журнал радиационной медицины. 1999. - Т.2. - №2. - С.34-41.

10. Костюченко В.А Эволюция санитарной зоны: «Маяк» вчера и сегодня // ИНФОР. 2000. - №3. - С. 5-57.

11. Кудряшов Ю.Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения). М.: ФИЗМАТЛИТ. - 2004. - 448 с.

12. Куцин И.А. Влияние гамма-радиции и апоптогенных факторов на активность ядерных протеаз // Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. -Т. 42.-№4.-С. 357-363.

13. Левикцая А.Б., Никитюк Д.Б. Современные методы определения апоптоза // Вестник новых медицинских технологий. 2005. - Т. XII. - №3-4. - С. 33.

14. Мазурик В.К. Роль регуляторных сетей ответа клеток на повреждения в формировании радиационных эффектов // Радиационная биология. Радиобиология. -2005. -Т. 45. -№1. С. 26-45.

15. Мазурик В.К. Проблема радиационной биологии и белка р53 // Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. - Т. 41. - №5. - С. 548-572.

16. Манских В.Н. Морфологические методы верификации и количественной оценки апоптоза // Бюллетень сибирской медицины. 2004. - №1. - С. 63-69.

17. Манских В.Н. Пути гибели клетки и их биологическое значение // Цитология. 2007. -Т. 49. - №11. - С. 909-915.

18. Маянский H.A. Митохондрии нейтрофилов: особенности физиологии и значение в апоптозе // Иммунология. 2004. - № 6. - С. 307-335.

19. Медико-биологические и экологические последствия радиоактивного загрязнения реки Теча // Под ред. A.B. Аклеева, М.Ф. Киселева. М. - 2000. -531 с.

20. Мушкамбаров H.H., Кузнецов C.JI. Молекулярная биология. М.: МИА -2003.-478 с.

21. Овчарова Е.А. Влияние низкоинтенсивного хронического радиационного воздействия на показатели иммунитета жителей прибрежных сел реки Теча в отдаленные сроки: Дисс. .канд. биол. наук. Челябинск. -2006. 164 с.

22. Пелевина И.И., Алещенко A.B., Антощина М.М., Готлиб В .Я, Кудряшова О.В., Семенова Л.П., Серебряный A.M. Реакция популяции клеток на облучение в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. -Том 43,-№2.-С. 161-166.

23. Разин C.B., Юдинкова Е.Ю. Крупномасштабная фрагментация ДНК при апоптозе: разрезается ли геном по границам топологических доменов? // Известия Ан: Серия биологическая. 1998. - №2. - С. 167-171.

24. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. -М.:МедиаСфера. 2002,- 312с.

25. Рождественский JI.M. Концепция биологического действия ионизирующей радиации низкого уровня // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. - Т. 39. -№1. - С. 127-144.

26. Самуилов В.Д. Биохимия программируемой клеточной смерти (апоптоза) у животных // Соровский образовательный журнал. 2001. - Т 7. - №10. - С. 1825.

27. Спитковский Д.М. О некоторых новых биофизических и биологических аспектах механизмов при воздействии малых и близких к ним доз ионизирующих излучений на клетки эукариот // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999.-Т. 39.-№1.-С. 145-155.

28. Таганов Д.Н. SPSS: Статистический анализ. -Спб.: -2005. 192 с.

29. Тяжелова В.Г. TRAIL и WNT сигнальные пути в апоптозе // Иммунология.2005,- №6. С. 377-384.

30. Тяжелова В.Г. Противо- и проапоптозные факторы при активации периферических лимфоцитов//Иммунология. 2005.- №6.- С. 377-384.

31. Устинова A.A., Рябинин В.Е., Влияние хронического воздействия у-излучения на перекисное окисление липидов в сыворотке крови мышей СВА // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003 -Т. 43. - №4. - С. 459-463.

32. Хейфец Л.Б., Абалакин В.А. Разделение форменных элементов крови человека в градиенте плотности верографин-фиколл // Лабораторное дело. -1973.- № 10.-С. 579-581.

33. Хансон К.П. Апоптоз: современное состояние проблемы // Известия АН: серия биологическая. 1998. -№2. - С. 134-141.

34. Ярилин A.A. Апоптоз и его место в иммунных процессах. Иммунология.2006. №6. - С. 10-20.

35. Ярмоненко С.П., Вайнсон A.A. Радиобиология человека и животных. М.: Высшая школа. - 2004. - 549 с.

36. Afford S., Randhawa S. Apoptosis // J. Clin. Pathol: Mol Pathol. 2000. - No. 53. - P.55-63.

37. Akagi Y., Sawada I., Sawada S. Radiation-induced apoptosis and necrosis in Molt-4 cells: A stady of dose-effect relationships and their modification // Int. J. Radiat. Biol. 1993. -No 64. -P.47-56.

38. Akleyev A.V., Aleschenko A.V., Gotlib V.J., Kudriashova O.V., Semenova L.P. et al. Adaptive capacities of lymphocytes in Techa riverside residents chronically exposed to radiation // Jpn. J. Health Phys. 2004. - No. 39. (4) - P. 375-381.

39. Anderson R.E. and Warner N.L. Ionising radiation and the immune response // Adv. Immunol. 1976. - No. 24. - P.215-335.

40. Anzar M. Sperm apoptosis in fresh and cryopreserved bull semen detected by flow cytometry // Biological of reproduction. 2002. - No. 66. - P. 354-360.

41. Ashush H., Rozenszajn L.A., Blass M., Barda-Saad M. et al. Apoptosis induction of human myeloid leukemic cells by ultrasound exposure // Cancer research. 2000 . -No. 15.-P. 1014-1020.

42. Belyakov O.V., Mitchell S.A., Parikh D., et al. Biological effects in unirradiated human tissue induced by radiation damage up to 1 mm away // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2005.-No. 102. -P. 14203-14208.

43. Belka C. Marini P., Budach W. et al. Radiation-induced apoptosis in human lymphocytes and lymphoma cells critically relies on the up-regulation of CD95/Fas/APO-1 ligand // Radiat. Res. 1998 . - No. 149 (6). - P. 588-595.

44. Brenner B., Ferlinz K., Grassme H. et al. Fas/CD95/Apo-I activates the acidic sphingomyelinase via caspases // Cell Death Differ. 1998. -No. 5(1). - P. 29-37.

45. Brown J.M., Wouters B.G. Apoptosis, p53, and tumor cell sensitivity to anticancer agents //Cancer research. 1999. - No. 59. - P. 1391-1399.

46. Brown S.B., Savill J. Phagocytosis triggers macrophage release of Fas ligand and induces apoptosis of bystander leukocytes // J. Immunol. 1999. - No. 162(1). - P. 480-485.

47. Chen Y., Stanford A., Simmones R.L. et al. Nitric oxide protects thymocytes from gamma-irradiation-induced apoptosis in correlation with inhibition of p53upregulation and mitochondrial damage // Cell. Immunol. 2001. - No. 214 (1). - P. 72-80.

48. Committee on the Biological Effects of Ionizing Radiation. Health Risks from Exposure to Low Levels of Ionizing Radiation: BEIR VII Phase 2. National Academy of Sciences, National Research Council. National Academy Press. Washington. -2006.

49. Crompton N.E., Ozsahin M. A versatile and repid assay of radiosensitivity of peripheral blood leukocytes based on DNA and surface-marker assessment of cytotoxicity // Radiat. Res. 1997. - No. 147(1). -P. 55-60.

50. Cui Y.F., Ding Y.Q., Xu H. et al. Relationship between apoptosis of mouse thymic lymphocytes and expressions of bax, protein and the Mrel 1 complex via Nbsl // J. Biol. Chem. 2004. -No. 279(20). -P. 21169-21176.

51. Cui Y.B., Gao Y.B., Yang H. et al. Apoptosis of circulating limphocytes induced by whole body gamma-irradiation and its mechanism // J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 1999. -No. 18(3). -P. 185-189.

52. Degteva M.O., Vorobiova M.I., Kozheurov V.P. et al. Dose reconstruction system for the exposed population living along the Techa River // Health Phis. 2000. - Vol. 78. -P. 542-554

53. Delic J., Morange M., Magdelenat H. Ubiquitin pathway involvement in human lymphocyte y-irradiation-induced apoptosis // Molecular and cellular biology. 1993. -Vol. 13. -No. 8. -P. 4875-4883.

54. Detre C., Kiss E., Varga Z. et al. Death or survival: Membrane ceramide controls the fate and activation of antigen-specific Y-cells depending on signal strength and duration // Cell Signal. 2006. -No. 18 (3). -P. 294-306.

55. Duffield J.S., Erwig L.P., Wei X. et al. Activated macrophages direct apoptosis and suppress mitosis of mesangial cells // J. Immunol. 2000. -No. 164(4) -P. 21102119.

56. Duhrsen U., Metcalf D. Effects of irradiation of recipient mice on the behavior and leukemogenic potential of factor-dependent hematopoietic cell lines // Blood. -1990. -No. 75(1). -P. 190-197.

57. Duport P. A database of cancer induction by low-dose radiation in mammals: overview and initial observations // Int. J. Low Radiat. 2003. -No. 1(1). -P. 120131.

58. Edinger A.E., Thompson C.B. Death by design: apoptosis, necrosis find autophagy // Current Opinion in cell biology. 2004. -No. 16. -P. 663-669.

59. Eisenberg-Lerner A., Kimchi A. The paradox of autophagy and its implication in cancer etiology and therapy // Apoptosis. 2009. -No. 14. -P. 376-391.

60. Firestein F., Rozenszajn L.A., Shemesh-Darvish L. et al. Role of mitochondria-caspase pathway activation // Ann New Yark academy of sciences. 2003. -No. 1010.-P. 163-166.

61. Globerson A., Effros R.B. Ageing of limphocytes in the aged // Immunol. Today. -2000.-No. 21(10).-P. 515-521.

62. Goans R.E., Holloway E.C., Berger M.E. et al. Early dose assessment in criticality accidents // Health Phys. 2001. -No. 81(4). -P. 446-449.

63. Goodhead D.T. Fifth Warren K. Sinclair keynote address: issues in quantifying the effects of low-level radiation. Health Physics. -2009. Vol. 97 No.5. - P. 394406.

64. Greenberger J.S., Epperly M.W., Zeevi A. et al. Stromal cell involvement in leukemogenesis and carcinogenesis // In Vivo. 1996. -No. 10(1). -P. 1-17.

65. Gross A., McDonnel J.M., Korsmeyer S.J. BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 1999. -No. 13. -P. 1899-1911.

66. Haimovitz-Friedman A., Kolesnick R.N., Fuks K. Differential inhibition of radiation-induced apoptosis // Stem cell. 1997. -No. 15. -P. 43-47.

67. Hayashi R., Ito Y., Matsumoto K., Fujino Y., Otsuki Y. Quantitative differentiation of both free 3'-OH and 5'-OH DNA end a between heat-induced apoptosis and necrosis // The Journal of histochemistry and cytochemistry. 1998. -Vol. 46 (9).-P. 1051-1059.

68. Holl V., Coelho D., Weltin D. et al. Ex vivo determination of the effect of whole-body exposure to fast neutrons on murine spleen cell viability and apoptosis // Radiat. Res. 2000. -No. 154(3). -P. 301-306.

69. Huang L., Snyder A.R., Morgan W.F. Radiation-induced genomic instability and its implications for radiation carcinogenesis // Oncogene. 2003. -No. 22. -P. 58485854.

70. Ishii K., Hosoi Y., Yamada S. et al. Decreased incidence of thymic lymphoma in AKR mice as a result of chronic, fractionated low-dose total-body X irradiation // Radiat. Res. 1996. -No. 146(5). -P. 582-585.

71. Iwai K., Miyawaki T., Takizawa T. et al. Differential expression of bcl-2 and susceptibility to anti-Fas-mediated cell death in peripheral blood limphocytes, monocytes, and neutrophils // Blood. 1994. -No. 84(4). -P. 1201-1208.

72. Jaffrezou J.P., Bruno A.P., Moisand A., Levade T., Laurent G. Activation of a nuclear sphingomyelinase in radiation-induced apoptosis // The FASEB Journal. -2001. -Vol. 15.-P. 1-11.

73. Jeggo P.A. Risks from low dose/dose rate radiation: what an understanding of DNA damage response mechanisms can tell us // Health physics. 2009. -V. 97. -№5.-P. 416-425.

74. Jonathan E.C., Bernhard E.J., McKenna W.G. How does radiation kill cells? // Curr. Opin. Chem. Biol. 1999. -No. 3. -P. 77-83.

75. Karawajew L., Rhein P., Czerwony G.et al. Stress-induced activation of the p53 tumor suppressor in leukemia cells and normal lymphocytes requires mitochondrial activity and reactive oxygen species // Blood. 2005. -No. 105(12). -P. 4767-4775.

76. Kolesnick R., Fuks Z. Radiation and ceramide-induced apoptosis // Oncogene. -2003. -No. 22(37). -P. 5897-5906.

77. Krestinina L., Yu D.L., Preston E.V., Ostroumova et al. Protracted radiation exposure and cancer mortality in the Techa River Cohort // Radiat.Res. 2005. - No. 164(5).-P. 602-611.

78. Kuida K., Lippke J.A., Ku G. et al. Altered cytokine export and apoptosis in mice deficient in interleukin-1 beta converting enzyme // Science. 2000. -No. 267(5206). -P. 2000-2003.

79. Kuwabara M., Takahashi K., Inanami O. Induction of apoptosis through the activation of SAPK/JNK followed by the expression of death receptor Fas in X-irradiated cells // J. Radiat. Res. 2003. -No. 44. -P. 203-209.

80. Lamm G.M., Steinlein P., Cotton M., Christofori G. A rapid, quantitative and inexpensine method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells // Nucleic acids research. 1997. -Vol 25. -No. 23. -P. 4855-4857.

81. Lee Y.J., Amoscato A.A. TRAIL and ceramide // Vitam. Horm. 2004 -No. 67. -P. 229-255.

82. Lemon J.A., Rollo C.D., McFarlane N.M., Boreham D.R. Radiation-induced apoptosis in mouse limphocytes is modified by a complex dietary supplement: the effect of genotype and gender // Mutagenesis. 2008. -Vol. 23. - No. 6. -P. 465472.

83. Limoli C.L., Giedzinski E., Morgan W.F., Swarts S.G., Jones G.D., Hyun W. Persistent oxidative stress in chromosomally unstable cells // Caner Res. 2003. -No. 63.-P. 3107-3111.

84. Limoli C.L., Ponnaiya B., Corcoran J.J., Giedzinski E., Kaplan M.I. et al. Genomic instability induced by high and low LET ionizing radiation // Adv Space Res. -2000. -No. 25. -P. 2107-2117.

85. Little J.B. Genomic instability and radiation // J. Radiation Prot. 2003. -No. 23.-P. 173-181.

86. Marekova M., Vavrova J., Vokurkova D. Dose dependent biological effects of idarubicin in HL-60 cells: alterations of the cell-cycle and apoptosis // ACTA Medica. 2000. -No. 43(2). -P. 69-73.

87. Mayer B., Oberbauer R. Mitochondrial regulation of apoptosis // News in physiological sciences. 2003. -No. 18. -P. 89-94.

88. Mizushima N. Autophagy: process and function // Genes Dev. 2007. -No 21. -P. 2861-2873.

89. Mitra B.G. Detection of apoptotic cells using the apoptosis detection system, fluorescein // Promega notes magazine. 1996. -No 57. -P. 10.

90. Moretti L., Cha Y.I., Niermann K.J., Lu B. Perspective: switch between apoptosis and autophagy radiation-induced endoplasmic reticulum stress? // Cell Cycle. 2007. -No 6-7. -P. 793-798.

91. Morgan W.F., Sowa M.B. Non-targeted effects of ionizing radiation: implications for risk assessment and the radiation dose response profile // Health physics. 2009. -V. 97. -No. 5. -P. 426-432.

92. Mori M., Desaintes C. Gene expression in response to molecular geatures in hematopoietic cells // J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 2004. -No. 18(3-4) -P. 363371.

93. Mori M., Benotmane M.A., Tiron I. et al. Transcriptional response to ionizing radiation in lymphocyte subsets // Cell Mol. Life Sci. 2005. -No. 62(13). -P. 14891501.

94. Nagar S., Smith L.E., Morgan W.F. Variation in apoptosis profiles in radiation-induced genomically unstable cell lines // Radiation research. 2005. -No. 163. -P. 324-331.

95. Nakamura N., Kusunoki Y., Akiyama M. Radiosensitivity of CD4 or CD8 positive human T-limphocytes by an in vitro colony formation assay // Radiat. Res. -1990. -No. 123(2). -P. 224-227.

96. Negoescu A., Lorimier P., Labat-Moleur F., et al. In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on preparations // The journal of histochemistry and cytochemistry. 1996. -Vol. 44. -No. 9. -P. 959-968.

97. Nias A.H.W. An Introduction to Radiobiologe. // Chichester.: John Wiley and Sons. 1998.-384 p.

98. Ogawa Y., Nishioka A., Inomata T. et al. Radiation kills human peripheral T cells by a Fas-independent mechanism // Int. J. Mol. Med. 1998. -No. 2(4). -P. 403-408.

99. Ogawa Y., Kobayashi T., Nishioka A. et al. Radiation-induced reactive oxygen species formation prior to oxidative DNA damage in human peripheral T cells // Int. J. Mol. Med. 2003. -No. 11(2) -P. 149-152.

100. Ohba K., Omagari K., Nakamura T. et al. Abscopal regression of hepatocellular carcinoma after radiotherapy for bone metastasis // Gut. 1998. -No. 43. - P. 575577.

101. Pawlwski J., Kraft A.S. Bax-induced apoptotic cell death // PNAS. 2000. -Vol. 97.-No. 2.-P. 529-531.

102. Pecaut M.J., Nelson G.A., Gridley D.S. Dose and dose rate effects of whole-body gamma-irradiation in lymphocytes and lymphoid organs // In Vivo. 2001. -No. 15(3).-P. 195-208.

103. Peters M.J., Heyderman R.S., Hatch D.J., Klein N.J. Investigation of platelet -neutrophil interactions in whole blood by flow cytometry // Journal of immunological methods. 1997. -No. 209. -P. 125-135.

104. Rabinowich H., Reichert T.E., Kashii Y., Gastman B.R., Bell M.C., Whiteside L. Lympocyte apoptosis induced by Fas ligand-expressing ovarian carcinoma cells // J. Clin. Invest. 1998. -Vol. 101. -No. 11. -P. 2579-2588.

105. Radford I.R., Murphy T.K., Radley J.M., Ellis S.L. Radiation response of mouse lymphoid and myeloid cell lines. Part II. Apoptotic death is shown by all lines examined // Int. J. Radiat. Biol. 1994. -No. 65. -P. 217-227.

106. Rotolo J.A., Zhang J., Donepudi M. et al. Caspase-dependent and -independent activation of acid sphingomyelinase signaling // J. Biol. Chem. 2005. -No. 280(28). -P. 26425-26434.

107. Rubinsztein D.C. Autophagy: where next? // EMBO repors. 2010. -Vol 11. — No. l.-P. 3.

108. Ryan L.A., Wilkins R.C., McFarlane N.M. et al. Relative biological effectiveness of 280 keV neutrons for apoptosis in human limphocytes // Helth Phys. 2006. -No. 91(1). -P. 68-75.

109. Schimmer A.D., Hedley D.W., Minden M.D. Receptor- and mitochondrial-mediated apoptosis in acute leukemia: a translational view // Blood. 2001. -Vol. 98.-No. 13.-P. 3541-3553.

110. Schmitz A., Bayer J., Dechamps N. et al. Intrinsic susceptibility to radiation-induced apoptosis of human lymphocyte subpopulations // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2003. -No. 57(3). -P. 769-778.

111. Scott R.C., Juhasz G., Neufeld T.P. Direct induction of autophagy by Atgl inhibits cell growth and ibduces apoptotic cell death // Current Biology. 2007. -No. 17.-P. 1-11.

112. Seed T.M., Fritz T.E., Tolle D.V. et al. Hematopoietic responses under protracted exposures to low daily dose gamma irradiation // Adv. Space Res. -2002. -No. 30(4). -P. 945-955.

113. Seed T.M., Fritz T.E., Tolle D.V. et al. Hematopoietic responses under protracted exposures to low daily dose gamma irradiation // Adv. Space Res. 2002. -No. 30(4). -P. 945-955.

114. Seed T.M., Kaspar L.V. Acquired radioresistance of hematopoietic progenitors (granulocyte/monocyte colony-forming units) during chronic radiation leukemogenesis // Cancer Res. 1992. -No. 52(6). -P. 1469-1476.

115. Seki H., Kanegane H., Iwai K. et al. Ionizing radiation induces apoptotic cell death in human TcR-gamma/delta+ T and natural killer cells without detectable p53 protein // Eur. J. Immunol. 1994. -No. 24(11). -P. 2914-2917.

116. Shankar B., Premachandran S., Bharambe S.D., Sundaresan P., Sainis K.B. Modification of immune redponse by low dose ionizing radiation: role of apoptosis // Immunology letters. 1999. -No. 68. -P. 237-245.

117. Shankar B., Sainis K.B. Cell cycle regulators modulating con A mitogenesis and apoptosis in low-dose radiation-exposed mice // J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. -2005.-No. 24(1).-P. 33-43.

118. Sharma D., Kumar S.S., Sainis K.B. Antiapoptotic and immunomodulatory effects of chlorophylin // Mol. Immunol. 2007. -No. 44(4). -P. 347-359.

119. Silvestroni D.L., Martino M.G., Gagliardi T.E. et al. Evalution of peripheral blood neutrohpileucytes in lead-exposed worker // Int. Arch. Occup. Environ. Health. 2006. - V. 17.-P. 1-8.

120. Smirnov D.A., Morley M., Shin E., Spielman S., Cheung V.G. Genetic analysis of radiation-induced changes in human gene expression // Nature. -2009. -Vol 459. -No 28.-P. 587-591

121. Sokal R.R., Rohlf F.J. Bioetry: the principles and practice of statistic in biological research. New York: Freeman and Co. 1995. - 850 p.

122. Spowart J., Luw J.J. Opening a new DOR to autophagy // EMBO repors. 2010. -Vol 11.-No. l.-P. 4-5

123. Strasser A., Harris A.W., Huang D.C. et al. Bcl-2 and Fas/APO-1 regulate distinct pathways to lymphocyte apoptosis // EMBO J. 1995. -No. 14(24). -P 6136-6147.

124. Susskind B.M., Faanes R.B. Effects of gamma-irradiation on lymphocyte subpopulations in the development of the cytotoxic T lymphocyte response // J. Immunol. 1981.-No. 127(4).-P. 1485-1489.

125. Tauchi H., Sawada S. Analysis of mitotic cell death caused by radiation in mouse leukaemia L5178Y cells: Apoptosis is the ultimate from of cell death following mitotic failure // Int. J. Radiat. 1994. -No. 65. -P. 449-455.

126. Torudd J., Protopopova M., Sarimov R., Nygren J. et al. Dose-response for radiation-induced apoptosis, residual 53BP1 foci and DNA-loop relaxation in human lynphocytes // Int. J. Radiat. Biol. 2005. -Vol 81. -No. 2. -P. 125-138.

127. Vavrova J., Rezacova M., Vokurkova D., Psutka J. Cell cycle alreration, apoptosis and response of leukemic cell lines to gamma radiation with high- and low-dose rate // Phyiol. Res. 2004. -No. 53. -P. 335-342.

128. Vermes I., Haanen C., Reutelingsperger C. Flow cytometry of apoptotic cell death // Journal of immunological Methods. 2000. -No. 243. -P. 167-190.

129. Vral A., Comelissen M., Thierens H. et al. Apoptosis induced by fast neutrons versus 60 Co gamma-rays in human peripheral blood ribozyme-based genomics approach // J. Virol. 2004. -No. 78(23). -P. 12829-12837.

130. Wang X., Zalcenstein A., Oren N. Nitric oxide promotes p53 nuclear retention and sensitizes neuroblastoma cells to apoptosis by ionizing radiation // Cell death and differentiayion. 2003. -No. 10. -P. 468-476.

131. Warenius H.M., Down J.D. RBE of fast neutrons for apoptosis in mouse thymocytes // Int. J. Radiat. Biol. 1995. -No. 68(6). -P. 625-629.

132. Willingham M.C. Cytochemical methods for the detection of apoptosis // The journal of histochemistry and cytochemistry. 1999. -Vol. 47(9). -P. 1101-1109.

133. Wilkins R.C., Wilkinson D., Maharaj H.P. et al. Differential apoptotic response to ionizing radiation in subpopulations of human white blood cells // Mutat. Res. -2002. -No. 513(1-2). -P. 27-36.

134. Umansky V., Schirrnacher V. Nitric oxide-induced apoptosis in tumor cells // Adv. Cancer Res. -2001. -No. 82. -P. 107-131.

135. Yasuhara S., Zhu Y., Matsui T., Tipirneni N. et al. Comparison of comet assey, electron microscopy, and flow cytometry for detection of apoptosis // The journal of histochemistry and cytochemistry. 2003. -Vol. 51 (7). -P. 873-885.