Пролиферативная активность и задержка клеточного цикла лимфоцитов крови человека в отдаленные сроки хронического облучения

Маркина, Татьяна Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Пролиферативная активность и задержка клеточного цикла лимфоцитов крови человека в отдаленные сроки хронического облучения
ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Пролиферативная активность и задержка клеточного цикла лимфоцитов крови человека в отдаленные сроки хронического облучения"

На правах рукописи

Маркина Татьяна Николаевна

ПРОЛИФЕРАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ И ЗАДЕРЖКА КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В ОТДАЛЕННЫЕ СРОКИ ХРОНИЧЕСКОГО ОБЛУЧЕНИЯ

03.01.01 -радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 МАЙ 2011

Москва, 2011

4847155

Работа выполнена на базе ФГУН — Уральского научно-практического центра радиационной медицины, г. Челябинск

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

заслуженный деятель науки РФ, Аклеев Александр Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Пелевина Ирина Ивановна

доктор химических наук, профессор Серебряный Александр Маркович

Ведущая организация: Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова, г. Москва

Защита диссертации состоится » июня 2011 г. в « на заседании диссертационного совета Д.501.001.65. в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, ауд. 557

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан «^¿Г» ¿2-гНЛ2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук,

Т.В. Веселова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Возрастающий риск облучения человека, связанный с бурно развивающейся атомной энергетикой и широким применением в медицине радиоизотопных методов диагностики и лечения приводит к необходимости исследования эффектов радиационного воздействия. После крупных радиационных инцидентов прошлых лет: атомной бомбардировки городов Хиросимы и Нагасаки, аварии на ЧАЭС, радиоактивного загрязнения вод р. Теча, ставшего результатом деятельности ПО «МАЯК», а также в связи с произошедшей в 2011 году радиационной аварией на Фукусиме-1, - особое место занимает проблема отдаленных эффектов радиационного воздействия на человека.

Известно, что ионизирующие излучение индуцируют комплекс цнтогене-тических, биохимических и биофизических изменений в клетках организма животных и человека (Пелевина И.И. и др., 2003, Бурлакова Е.Б. и др., 1996), в том числе изменяет состояние клеточных защитных механизмов: систем антпокси-датной защиты, систем репарации, клеточного цикла (Пелевина И.И. и др., 2000, Серебряный A.M. и др., 2004). Один из основных механизмов «радиационной защиты» клетки направленных на предотвращение деления клеток с повреждениями ДНК - блок клеточного цикла (Кудряшов Ю.Б., 2004). В случае нарушения этого защитного механизма, повреждения ДНК, возникающие при длительном облучении, могут быть реализованы в виде соматических мутаций, что, в конечном счете, может привести к продукции пула дефектных, структурно и функционально неполноценных клеток (Veremeyeva G.A. et. al., 2010). Особенно актуально это в отношении радиочувствительных гемопозтических клеток красного костного мозга (ККМ).

В ряде экспериментальных работ показано, что у хронически облученных животных выявлено изменение митотического цикла клеток ККМ (красного костного мозга) и их пролиферативной активности. Однако вопрос об экспрессии белка Chk2 (как маркера блока клеточного цикла) у хронически облученных людей ранее не рассматривался.

У пострадавших при атомных бомбардировках в Японии (Kyoizumi S. et. al., 1990), ликвидаторов ЧАЭС (Замулаева И.А. и др., 2006), у работников атомной промышленности (Смирнова С.Г и др. 2005; Костюк C.B. и др. 2008) выявлено увеличение частоты мутаций в генах Т-клеточного рецептора (TCR). Но пока остаётся неясным какова частота мутаций в генах TCR у хронически облученных людей в отдаленные сроки от начала радиационного воздействия (более 60 лет). В связи с этим особый интерес может представлять изучение частоты лимфоцитов с блоком клеточного цикла (БКЦ), пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови (ПК) и частоты CD3-CD4+ лим-

фоцитов у облученных жителей прибрежных сел р. Теча, в отдаленные сроки. Район реки Теча является единственным регионом в мире, где, начиная с 1949 г., в результате производственной деятельности комбината "Маяк" сложились аварийные условия многолетнего облучения значительного по численности контингента населения в широком диапазоне доз (Аклеев A.B., 2005). Особенно актуально, оценить данные параметры в период, когда большая часть облученных людей достигла пожилого возраста, характеризующегося снижением адаптационных резервов, ослаблением систем контроля клеточного цикла, репарации, спонтанным увеличением частоты соматических мутаций.

Цель исследования — оценить пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови (ЛПК), частоту лимфоцитов с блоком клеточного цикла (БКЦ) и частоту CD3-CD4+ лимфоцитов у людей, проживавших в прибрежных селах р. Теча и подвергшихся хроническому радиационному воздействию

В задачи работы входило:

1. Исследовать пролиферативную активность и частоту лимфоцитов с БКЦ методом проточной цитометрии (по экспрессии белков Chk2 и Ki-67), а также частоту CD3-CD4+ лимфоцитов у хронически облученных людей в отдаленные сроки после начала радиационного воздействия.

2. Оценить пролиферативную активность, долю лимфоцитов с БКЦ, и частоту CD3-CD4+ лимфоцитов у лиц, перенесших хроническую лучевую болезнь (ХЛБ).

3. Проанализировать пролиферативную активность и долю лимфоцитов с БКЦ, частоту CD3-CD4+ лимфоцитов у облученных людей, имеющих лейкопению в отдаленные сроки радиационного воздействия.

4. Оценить зависимость пролиферативной активности и доли лимфоцитов с БКЦ, частоты CD3-CD4+ лимфоцитов от дозы облучения ККМ и мощности дозы в период максимального радиационного воздействия.

Научная новизна исследования. Впервые у жителей прибрежных сел р. Теча, подвергшихся хроническому комбинированному облучению, в том числе у лиц, перенесших ХЛБ и имеющих лейкопению в отдаленный период радиационного воздействия, исследована пролиферативная активность ЛПК и частота клеток с блоком клеточного цикла, методом проточной цитометрии на основе анализа экспрессии белков ki-67 и Chk2.

Проведен анализ влияния дозы и мощности дозы облучения ККМ на пролиферативную активность и частоту лимфоцитов с БКЦ, а также частоту CD3-CD4+ лимфоцитов у хронически облученных людей в отдаленный период после начала радиационного воздействия.

Впервые изучена зависимость между содержанием лейкоцитов, лимфоцитов в периферической крови и пролифсративной активностью, а также блоком клеточного цикла ЛГ1К у облученных людей в отдаленные сроки после радиационного воздействия.

Практическая значимость работы. Оценка пролифсративной активности и частоты клеток с БКЦ, позволит обосновать и разработать критерии формирования групп риска в отношении отдаленных гемопоэтических эффектов.

Разработанная методика оценки доли (%) ЛПК с блоком клеточного цикла, методом проточной цитометрии на основе анализа экспрессии белка Chk2, совместно с исследованием пролиферативной активности ЛПК (белок Ki-67) рекомендуется для прогнозирования ответа системы гемопоэза на стимулирующее воздействие при лечении цитоненического синдрома, с применением регенеративной терапии.

Положения, выносимые на защиту

/ 1. В отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия (дозы облучения ККМ составили 0,06-4,46 Гр; среднее значение - 1,11±0,06 Гр) у лиц пожилого и старческого возраста в периферической крови отмечено увеличение уровня CD3-CD4+ лимфоцитов на фоне повышения пролиферативной активности лимфоцитов и клеток с блоком клеточного цикла. Частота лимфоцитов с блоком клеточного цикла в периферической крови и пролиферативная активность лимфоцитов зависят от мощности дозы облучения ККМ в период максимального облучения. Частота клеток с блоком клеточного цикла после инкубации и у-облучения зависит от дозы облучения ККМ.

2. У лиц, перенесших хроническую лучевую болезнь, не выявлено изменений пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови, уровня клеток с блоком клеточного цикла, а также изменения частоты CD3-CD4+ лимфоцитов.

3. Наибольшее увеличение пролиферативной активности лимфоцитов и частоты лимфоцитов с блоком клеточного цикла выявлено у людей имеющих признаки лейкопении в отдаленные сроки хронического радиационного воздействия.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на 12th International Congress of the International Radiation Protection Association (Buenos Aires, Argentina. 2008), 10tb International Conférences on Health Effects of Incorporated Radionuclides. (Santa Fe, NM., 2009), на 54 th Annual Meeting of the Health Physics Society (Minneapolis, USA, 2009), на 5 международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию создания Северского биофизического центра ФМБА России (Томск, 2010), на 1 международной на-

учио-практической конференции «Постгеноные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 2010), на IV международной конференции «Хроническое радиационное воздействие: эффекты малых доз» (г. Челябинск, 2010).

Публикации. По материалам работы опубликовано 14 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, приложения. Работа изложена на 154 станицах, иллюстрирована 10 рисунками, и 32 таблицами. Библиографический указатель содержит 210 источников литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы работы

Характеристика обследованного контингента. В результате сброса радиоактивных отходов ПО «Маяк» в речную систему Теча - Исеть - Тобол с 1949 по 1956 гг. население прибрежных сел р. Теча подвергалось хроническому низкоинтенсивному комбинированному облучению (внешнему и внутреннему). Наибольшая мощность дозы наблюдалась в первые 6 лет. Основной вклад в формирование внутренней дозы облучения приходился на ^Бг, поэтому ККМ стал критическим органом радиационного воздействия (Аклеев А. В. и др., 2001).

Исследование частоты клеток с БКЦ, пролиферативной активности лимфоцитов и частоты С03-С04+ лимфоцитов проводилось с 2007 по 2010 г.г. на базе Уральского научно-практического центра радиационной медицины. Было обследовано 140 облученных жителей прибрежных сел р. Теча. Контрольную группу составили 61 человек с нормальным клеточным составом крови, проживающие на незагрязненных радионуклидами территориях. Среди обследованных облученных лиц были выделены 2 подгруппы - люди, имеющие изменения гемопоэза в ранний период — лица, перенесшие ХЛБ (25 человек), и в отдаленный период от начала облучения - лица, имеющие лейкопению (30 человек).

Возраст обследованных облученных людей в среднем составил 70 лет (58-84 года), в группе сравнения 67,1 лет (59-80 лет), в группе людей перенесших ХЛБ - 73,64 лет (58-83 года), и в группе облученных с лейкопений - 68,89 лет (59-81 год). Во всех обследованных группах преобладали женщины.

Информацию об индивидуальных накопленных дозах была получена из базы данных УНПЦРМ Т1Ф8-2009. Средняя доза облучения ККМ для группы всех облученных людей составила 1,11±0,06 Гр (0,06-4,46 Гр), средняя мощ-

ность дозы 0.23А0,02 Гр\год (0,03-1,25 Гр\год), у облученных лиц с лейкопенией 1,07±0,19 Гр (0,06^,46 Гр), средняя мощность дозы 0.27-0,06 Гр\год (0,04-1,25 Г'р\год). В группе лиц. перенесших ХЛБ, средняя доза и мощность дозы облучения ККМ была меньше и составила 0,87±0,10 Гр (0,23-2,70 Гр) и 0,24±0,04 Гр\год (0,04-0,88Гр\год) соответственно.

Методы исследования. На первом этапе работы мы оценили уровень лейкоцитов периферической крови (ПК). Подсчет общего количества лейкоцитов ПК проводили на гематологическом анализаторе Abacus Junior В (Австрия). Подсчет лейкоцитарной формулы проводился - в мазках, окрашенных по методу Романовского-Гимза (Меньшиков В. В, 1987).

Объект исследования - лимфоциты периферической крови (ЛПК) человека, выделяли на градиенте плотности в стерильных условиях по стандартной методике (Хейфец Л. Б.и др., 1973). Для оценки частоты лимфоцитов с БКЦ в периферической крови - оценивали исходный уровень клеток, экспрессирую-щих белок сверочных точек - Chk2 (Nyberg К. A. et. al., 2002). Оценивали частоту лимфоцитов с БКЦ после инкубации с митогеном (ФГА), что позволяет судить о доле клеток, несущих скрытые повреждения ДНК, которые регистрируются белками сверочных точек только при прохождении клеток через точку рестрикции. Анализ частоты данного показателя после нагрузочного теста в виде острого у-облучения в дозе 1 Гр, позволил судить об эффективности работы системы сверочных точек. Облучение культуры ЛПК проводили в дозе 1 Гр на установке Hiyp-l ('''Со), (мощность дозы 0,75 Гр/мин.) через 22 ч. инкубации, затем культуру ЛПК снова инкубировали на протяжении 2 ч. для накопления клеток с задержкой клеточного цикла.

При исследовании пролиферативной активности мы оценивали долю лимфоцитов в ПК, экспрессирующих белок Ki-67 (спонтанно пролиферирующие лимфоциты), что позволило выявить процессы нарушения пролиферации (Lopez F. et. al. 1991) и пролиферативный потенциал, оцененный по частоте лимфоцитов (экспрессирующих ki-67), ответивших на митогенной стимул.

Инкубацию клеток проводили по стандартной методике в культуральмой среде с митогеном при 37С°, 24 ч. (для оценки клеток с БКЦ) и 42 ч. (для оценки пролиферативной активности) (Lopez F. et. al. 1991). Суспензию клеток фиксировали с применением набора Cyto\Fix (Beckton Dickenson, США), и окрашивали по стандартной методике (Prussin С. et.al., 1995). Для выявления клеток с БКЦ применяли первичные антитела anti-Chk2 (Beckton Dickenson, США) и вторичные FlTC-меченные антитела (Beckton Dickenson, США), а также PI/RNAsa (Beckton Dickenson, США). Для оценки пролиферативной активности набор anti-ki (Beckton Dickenson, США) и PI/RNAsa (Beckton Dickenson, США).

Частоту мутаций в генах TCR оценивали по количеству лимфоцитов с генотипом CD3-CD4+. Для этого лимфоциты периферической крови окрашивали с

применением моноклональных антител CD3-F1TC, CD4-PE, Ig l-FITC\Ig 1-РЕ (Beckton Dickenson. США).

Анализ клеток экспрессирующих белки Chk2 и ki-67, а также CD3-CD4+ лимфоцитов проводили на проточном цитофлуориметре серии EPICS XL-MCL (аргоновый лазер 488 нм мощностью 15 мВт).

Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи пакетов прикладных программ Microsoft Excel, STATISTICA 6.0. Использовались общепринятые методы вариационной статистики с вычислением средней арифметической величины, ее стандартной ошибки (М±т), характер распределения величин (тест Колмогорова-Смирнова), степень достоверности различий (U-теста Манна и Уитни). Зависимость от дозы и мощности дозы, а также зависимость между показателями оценивали с помощью методов регрессионного анализа для линейной модели (Y=a+bx) и многофакторного дисперсионного анализа (Гланц С., 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Блок клеточного цикла и пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови, частота СОЗ-СЭ4+лимфоцитов у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию

У облученных людей в отдаленный период (через 59-61 год) после начала радиационного воздействия исходная доля лимфоцитов с БКЦ достоверно увеличена 0,60% (р=0,008), по сравнению с контролем - 0,39% (рис.1.).

3,5 3

2,5 2

1,5 1

0,5 0

исходный уровень

и'ъ

¿V,

инкубация 24ч.

инкубация+Y-облучение

и облученные □ необлученные

Рис. 1. Доля лимфоцитов с блоком клеточного цикла в группе облученных людей (%), *р - достоверные различия с контролем (р=0,008)

Частота клеток с БКЦ после инкубации с ФГА увеличилась в обеих группах. Несмотря на более высокие значения в группе облученных лиц (3,08%) по ' сравнению с группой контроля (2,93%) достоверных различий между ними не выявлено. После инкубации и дополнительного облучения культуры лимфоцитов мы также не отметили различий между группами облученных и необлученных людей по частоте клеток с БКЦ.

Увеличение частоты лимфоцитов с БКЦ в периферической крови у облученных лиц по сравнению с необлученными, вероятно, обусловлено повышением частоты клеток с дефектами ДНК (Nyberg K.A.et. al. 2002), о чем свидетельствует выявленное ранее увеличение частоты лимфоцитов с хромосомными аберрациями и клеток с микроядрами (Аклеев А.В., 2005). Увеличение доли лимфоцитов в ПК с дефектами ДНК в отдаленный период после начала радиационного воздействия может быть обусловлено нестабильностью генома гемо-поэтических клеток ККМ (Пелевина И.И.и др., 1996; Little J.В. et. al., 1998), а также, возможно, результатом дефектов ДНК долгоживущих лимфоцитов (Галактионов В.Г., 1998).

У жителей прибрежных сел р. Теча, подвергшихся хроническому низкоинтенсивному облучению, частота лимфоцитов пролиферирующих в ПК достоверно выше (2,15%, р=0,02) значений у необлученных лиц (1,26%) (рис. 2).

16 14

12 10

8 б 4 2 О

Sj.fl. и -

В облученные Онеоблученные

исходный ур овень инкубация 42ч Рис. 2. Доля пролиферирующих лимфоцитов в группе облученных людей (%), * р - достоверные различия с контролем (р=0,02)

После митогенной стимуляции и инкубации культуры лимфоцитов доля пролиферирующих ЛПК увеличилась в обеих группах. У облученных людей частота пролиферирующих ЛПК была ровна 13,49%, тогда как в группе контроля- 10,32%. Значимых различий между группами облученных и необлученных людей не отмечено.

Анализ пролиферативной активности у облученных лиц выявил увеличение доли (%) пролиферирующих лимфоцитов в ПК на фоне нормального про-лиферативного ответа на митогенную стимуляцию (значения сопоставимы с контрольными). Эти данные могут указывать на повышение концентрации факторов способных стимулировать ЛПК к делению в периферической крови облученных людей. Такими факторами могут быть ИЛ-2 и ИЛ-6, концентрация которых в сыворотке облученных жителей прибрежных сел р. Теча повышена (Аклеев А. В., и др., 2009)

В группе облученных людей мы также выявили достоверное увеличение частоты СОЗ-СЭ4+ лимфоцитов (0,19%, р=0,01), по сравнению со значениями у необлученных людей (0,10%). Увеличение частоты лимфоцитов мутантных по генам ТСЯ, может быть обусловлено нестабильностью генома гемопоэтических клеток ККМ (Бычковская И.Б. и др., 2005; Цыб А.Ф.и др., 2005).

Таблица 1.

Зависимость пролиферативной активности и частоты лимфоцитов с БКЦ, частоты СОЗ-СЭ4+ лимфоцитов от дозы и мощности дозы облучения ККМ

(в 1951 г)

Показатель Доза облучения ККМ Мощность дозы облучения ККМ в 1951 г.

Доля лимфоцитов с БКЦ исходный уровень Р=1,14; р=0,3 Р=2,91; р=0,03

инкубация 24 ч. Р=1,15;р=0,2 Р=1,24; р=0,3

инкубация + у-облучение Р=2,90; р=0,03 Р=2,11;р=0,1

Доля пролиферирующих ЛПК исходный уровень Р=2,12; р=0,14 Р=3,28; р=0,002

инкубация 24 ч. Р=1,2; р=0,31 Р=1,02; р=0,4

Частота С03-С04+ лимфоцитов Р=2,42; р=0,7 Р=3,8; р=0,2

Примечание: И- коэффициент дисперсии

Мощность дозы облучения ККМ в период максимального радиационного воздействия может повлиять на изменение пролиферативной активности ЛПК, частоты лимфоцитов с БКЦ, а также на частоту СЭЗ-С04+ лимфоцитов в отдаленный период после радиационного воздействия. Однако методом регресси-

онного анализа не выявлено линейной зависимости частоты лимфоцитов с БКЦ (г=-0,12; р=0,12 - для исходного уровня, г=-0,11; р=0,23 - после инкубация с ФГА, и г=-0,1б; р^0,07 - после инкубации и у-облучения) от дозы (0,06-4,46 Гр) и мощности дозы облучения ККМ (0,03-1,25 Гр\год) (г=-0,16; р=0,16; г=-0,14; р=0,12 и г=-0,13; р=0,14, соответственно). Также спонтанная пролиферативная активность ЛПК (г=-0,08; р=0,45) и индуцированная (г=-0,05, р=0,62) не зависит от дозы, и мощности дозы облучения ККМ (г=0,009; р=0,93; г=0,06; р= 0,58, соответственно). Частота CD3-CD4+ лимфоцитов, также не зависит (линейная модель) от дозы (г=0,34; р=0,09) и мощности дозы облучения ККМ (г=-0,25; р=0,08).

На основании результатов дисперсионного анализа установлено, что слабо коррелирует с дозой облучения только доля лимфоцитов с БКЦ после инкубации и дополнительного у-облучения (F=2,90; р=0,03) (таблица 1).

От мощности дозы облучения ККМ зависит исходная частота лимфоцитов с БКЦ (F=2,91; р=0,03) и частота лимфоцитов пролиферирующих в ПК (F=3,28; р=0,002).

Таким образом, в отдаленные сроки (более 60 лет) от начала радиационного воздействия у хронически облученных жителей прибрежных селах р. Теча (дозы облучения ККМ составили 0,06-4,46 Гр), пролиферативная активность ЛПК и частота CD3-CD4+ лимфоцитов не имеет линейной зависимости от дозы облучения ККМ. Но доза облучения ККМ влияет на частоту лимфоцитов с БКЦ после инкубации и дополнительного у-облучения культуры ЛПК. Вероятно, облучение в период максимального радиационного воздействия (индивидуальная мощность дозы облучения ККМ в исследуемой выборке достигала 0,6 Гр\год) привело к накоплению клеток с дефектами в ДНК. Последнее могло способствовать развитию нестабильности генома клеток ККМ в отдаленный период после радиационного воздействия, о чем свидетельствует в частности увеличение частоты мутаций в гене Тр53 ( Veremeyeva G. A. et. al., 2009), лимфоцитов с хромосомными аберрациями (Аклеев А. В., 2005).

Повреждение ДНК, как правило, ингибирует пролиферативную активность клеток, вызывая блок клеточного цикла (Kara К. A. et. al. 2002). Поэтому увеличение доли лимфоцитов с БКЦ может оказать влияние на количество пролиферирующих лимфоцитов. Однако статистический анализ не выявил зависимости между долей лимфоцитов пролиферирующих в ПК и долей лимфоцитов с БКЦ (г=0,04, при.р=0,7).

Увеличение частоты TCR-мутантных лимфоцитов и доли лимфоцитов с БКЦ может быть следствием, в том числе и нестабильности генома гемопоэти-ческих клеток ККМ (Little J. В. et. al., 1998), поэтому между этими параметрами возможна корреляционная зависимость. Однако проведенный статистический анализ не выявил зависимости между этими параметрами (г=0,14; р=0,6).

2. Блок клеточного цикла н пролифератнвная активность лимфоцитов периферической крови, частота СПЗ-С04+лимфоинтов у лиц, перенесших ХЛБ

Группу людей, перенесших ХЛБ, принято считать группой развития риска отдаленных последствий облучения, что обусловлено, в том числе наличием цитопений в ранний период облучения (максимального радиационного воздействия) (Акпеев А. В. и др., 2001). Из группы облученных людей без ХЛБ и группы лиц, перенесших ХЛБ, были исключены лица, имеющие лейкопению в отдаленный период.

Для людей, перенесших ХЛБ, мы не отметили значимых изменений абсолютного количества клеток периферической крови по сравнению с контролем (таблица. 2.)

Таблица 2.

Количественный состав лейкоцитов периферической крови в группе облученных лиц, перенесших ХЛБ, (М± БЕ (тш-тах), хЮ\л}

Показатель

Группы лейко- лимфо- нейтро- моно- базо- эозино-

циты циты филы циты филы филы

Люди, пе- 6,15±0,35 2,10*0,17 3,35±0,36 0,45±0,05 0,03*0,01 0,22*0,05

ренесшие ХЛБ, п=25 (4,73-9,90) (0,87-3,12) (0,24-430) (0,11-0,99) (0-0,13) (0-0,84)

Облучен- 6,14±0,19 2,07±0,08 3,37±0,12 0,37*0,02 0,08±0,008 0,19*0,01

ные без (3,05-11,3) (0,75-4,09) (1,26-3,13) (0,06-131) (0,03-0,26) (0-1,19)

ХЛБ, п=85

Необлучен б,82±0,23 2Д5±0,11 3,94*0,17 0,39±0,07 0,03±0,005 0,21 ¿0,02

ные люди, п=61 (4,38-11,6) (0,82416) (2,1-7,19) (0,05-0,98) (0-0,16) (0-0,77)

Одной из причин угнетения гемопоэза в ранний период радиационного воздействия, которое отмечалось у лиц, перенесших ХЛБ, было нарушение процессов пролиферации, клеточного цикла гемопоэтических клеток ККМ, увеличение доли мутантных клеток ККМ (Аклеев А. В. и др., 2007). Поэтому, актуальным было оценить данные показатели в отдаленный период у лиц, перенесших ХЛБ.

Исходная доля лимфоцитов с БКЦ в группе людей, перенесших ХЛБ, статистически не отличается от таковой в группе контроля. Тогда как у облученных людей без ХЛБ мы отметили статистически достоверное увеличение ис-

ходной доли лимфоцитов с БКЦ (0,62%, р=0,005) по сравнению с контролем (0,39%) (рис. 3.).

3,5 3

2,5 2 1,5 1

0,5 0

-1- ■

'■V

□ обл-есХБ

□ необлученные

исходный инкубация 24ч инкубация+У-уровень облучение

Рис. 3. Доля лимфоцитов с блоком клеточного цикла в группе облученных людей, перенесших ХЛБ (%), *р - достоверные различия с контролем (р=0,005)

16 14 12 10 8 б 4 2 0

—г—

зт

И обл-е с ХЛБ Ообл-е без ХЛБ □ необлученные

и сходный уровень инкубация 42ч.

Рис. 4. Доля пролиферирующих лимфоцитов в группе людей, перенесших ХЛБ (%), *р - достоверные различия с контролем (р=0,04).

Инкубация культуры лимфоцитов с ФГА способствовала увеличению доли клеток с БКЦ в изучаемых группах. Достоверных различий между показателями лиц, перенесших ХЛБ, и облученных людей без ХЛБ не выявлено. Также не отмечено статистически значимых различий между показателями у облучен-

ных людей и у необлученных людей. Не выявлено статистически значимых различий по доле лимфоцитов с БКЦ между людьми, перенесших ХЛБ, облученными без ХЛБ и необлученными после инкубации и дополнительного у-облучения (1Гр) культуры лимфоцитов.

Анализ пролиферативной активности ЛПК показал, что в отдаленные сроки от начала радиационного воздействия у лиц, перенесших ХЛБ, доля пролиферирующих лимфоцитов в ПК не отличается от значений контроля. Однако у облученных людей без ХЛБ мы отметили значимое увеличение пролифери-рующих клеток (2,05%, р=0,04) по сравнению с контролем (1,08%) (рис. 4).

Пролиферативный потенциал, оцененный по доле пролиферирующих ЛПК после их инкубации в культуре с митогеном, в группе людей, перенесших ХЛБ, также статистически не отличался от значений контроля. Сравнение групп облученных людей с ХЛБ и без ХЛБ не выявило различий между ними как по доле спонтанно пролиферирующих ЛПК, так и по доле митогенстимули-рованных ЛПК.

Статистический анализ частоты СВЗ-СЭ4+ лимфоцитов не выявил изменения частоты мутаций в генах ТСЛ как в группе людей, перенесших ХЛБ (0,24±0,09%), так и у облученных лиц без ХЛБ (0,16±0,03%) по сравнению с показателями необлученных людей (0,10±0,01%). Также не отмечено различий по данному показателю между группами облученных людей.

Таким образом, у людей перенесших ХЛБ в ранний период радиационного воздействия не выявлено изменений показателей клеточного цикла и частоты СЭЗ-С04+ лимфоцитов по сравнению со значениями у необлученных людей и у облученных лиц без ХЛБ.

3. Блок клеточного цикла и пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови, частота СВЗ-С04+лимфоцитов у облученных лиц, имеющих лейкопению.

Облученные люди с лейкопенией претерпели наибольшие изменения со стороны гемопоэза. Дефицит зрелых клеток ПК у этих людей может быть результатом блока и \или нарушения клеточного цикла гемопоэтических клеток ККМ, и как следствие их пролиферации, поэтому анализ показателей клеточного цикла и частоты С03-С04+ лимфоцитов в данной группе представляет особый интерес.

У облученных людей в отдаленный период от начала радиационного воздействия (59-61 год) снижение уровня лейкоцитов (3,81x10%!, р=0,0001), обусловлено снижением количества как лимфоцитов (1,50х10\п, р=0,0001), так и нейтрофилов периферической крови (1,93x10®\л, р=0,0001) (таблица 3).

Таблица 3.

Количественный состав лейкоцитов периферической крови в группах облученных лиц и необлученных лиц

ГруппьЛ М± БЕ

параметр (тш-тах), ><10%

лейко- лимфо- нейтро- моно- базофи эозино-

циты циты филы циты лы филы

Облучен- 3,81 ±0,04 1ДШ),07 1,93±0,06 027+0,02 0,02±0,06 0,08±0,01

ные люди с (3,17-4,01) (0,75-23) (1,26-2,45) (0,07-0,58) (0-0,15) (0-032)

лейкопени- р=0,0001 р=0,0001 р=0,ШЮ1 р=0,002 р=0,0007

ей, п=30 р,=0,0001 Р!=0,0001 р,=0,0001 Р1=0,001 р,=0,0001

Облучен- 6,62±0,17 2,12±0,08 3,50±0,13 0,41 ±0,02 0,04±0,005 0,21 ±0,02

ные люди (4,43-11,3) (0,85-4,09) (1,26-8,13) (0,07-1,19) (0-0,23) (0-1,19)

без лейко- р=0,02

пении,

п=42

Необлучен- 6,82±0,23 2,25±0,11 3,94±0,17 0,39±0,07 0,03±0,005 0,21±0,02

ные люди, (4,38-11,6) (0,82-4,16) (2,1-7,19) (0,05-0,98) (0-0,16) (0-0,77)

п=61

Примечание: р- достоверные различия с необлученными людьми;

ргдостоверные различия с группой «облученные без лейкопении»

■ исходный инкубация 24ч. инкубация уровень +облучэние

Рис. 5. Доля лимфоцитов с БКЦ в группе облученных людей с лейкопенией (%), *р - достоверные различия с контролем (р=0,05), **р - достоверные различия с контролем (р=0,02) и достоверные различия с группой облученных лиц без лейкопении (р! =0,003).

Также выявлено снижение абсолютного количества моноцитов 0,27* 10\л, (р=0,002), и эозинофилов 0,08* !0'\п (р-0,0007).

Проведенный анализ доли лимфоцитов с БКЦ выявил ряд особенностей в группе облученных людей с лейкопенией (рис.5.). У облученных людей с лейкопенией отмечено статистически значимое увеличение исходной доли лимфоцитов с БКЦ по сравнению с группой контроля (1,30%, р=0,05). В группе облученных людей без лейкопении данный показатель также увеличен по сравнению с контрольными значениями (0,39%), и составил 0,52% (р=0,02).

Причем, у облученных людей, имеющих лейкопению, частота клеток с БКЦ достоверно выше, чем у облученных лиц без лейкопении (1,30%, р1=0,003, и 0,52%, соответственно). Также у людей с лейкопенией частота лимфоцитов с БКЦ в исходном уровне достоверно превышает (1,30%, р=0,02) значения людей, перенесших ХЛБ (0,46%).

Не выявлено статистически значимых различий по доле лимфоцитов с БКЦ после инкубации с митогеном при сравнении групп облученных людей (с лейкопенией и без) с группой контроля, а также при сравнении значений групп облученных людей между собой. Также не отмечено статистически значимых различий по данному показателю между исследуемыми группами после инкубации и дополнительного у-облучения культуры лимфоцитов.

Таким образом, для облученных лиц, имеющих наиболее выраженные изменения со стороны гемопоэза (снижение абсолютного количества нескольких типов лейкоцитов) отмечена наибольшая частота лимфоцитов с БКЦ. Данный факт может указывать на то, что БКЦ, возникающий в ответ на повреждение ДНК (в том числе следствие нестабильности генома), может быть одной из причин дефицита клеток в периферической крови.

У облученных людей, имеющих лейкопению в отдаленный период после радиационного воздействия, уровень спонтанно пролиферирующих лимфоцитов (3,72% р=0,009) был достоверно выше значений контроля (1,26%) (рис.6.). Значимое увеличение данного показателя отмечено и для группы облученных лиц без лейкопении (2,03%, р-0,04). Однако не выявлено различий между группами облученных людей между собой по частоте пролиферирующих лимфоцитов.

Не выявлено достоверных различий между спонтанной пролиферативной активностью ЛПК у облученных лиц с лейкопенией (3,72%) и у лиц, перенесших ХЛБ (1,60%). Частота пролиферирующих ЛПК после митогенной стимуляции в группе облученных лиц с лейкопенией статистически не отличается от значений облученных лиц без лейкопении, облученных, перенесших ХЛБ и необлученных людей (рис. 6).

18 16 И 12 10

8 *

2 0

-ъ

□ обл-е безлеикопении

СЗобл-с с лейкопений

негодный ур об«нь инку бацнл -12ч.

Рис. 6. Доля пролиферирующих лимфоцитов в группе облученных людей с лейкопенией (%), *р- достоверные различия с контролем (р=0,009), **р - достоверные различия с контролем (р=0,04)

Таким образом, у облученных лиц на фоне снижения абсолютного количества лейкоцитов ПК выявлено увеличение частоты лимфоцитов, пролиферирующих в ПК. Полученные результаты подтверждают выдвинутое предположение о компенсаторном увеличении пролиферативной активности ЛПК в ответ на снижение абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови. В пользу данного предположения свидетельствует тот факт, что в группе людей, перенесших ХЛБ, в которую были включены люди без признаков угнетений гемопоэза (лейкопении и лимфопении) в отдаленный период, не выявлено увеличение доли спонтанно пролиферирующих ЛПК.

У облученных людей, имеющих в отдаленный период лейкопению, не выявлено изменения частоты СОЗ-СВ4+ лимфоцитов (0Д4±0,02%) но сравнению со значениями у облученных лиц без лейкопении (0,18±0,03%) и у необлу-ченных лиц (0,10±0,0!%). Сравнительный анализ полученных данных по частоте С03-С04+ лимфоцитов для разных групп облученных людей также не выявил статистически значимых различий между ними.

У лиц, имеющих лейкопению в отдаленный период, не выявлено зависимости пролиферативной активности лимфоцитов от дозы (г=0,19, р=0,3) и мощности дозы облучения ККМ (г=0,21, р=0,4), а также частоты лимфоцитов с БКЦ от дозы (г=0,25, р=0,4) и мощности дозы (г=0,28, р=0,4). Не установлена линейная зависимость от дозы (г=-0,23, р=0,7) и мощности дозы облучения ККМ для лимфоцитов (г=-0,25, р=0,9), мутантных по генам ТСИ..

4. Зависимость абсолютного количества лимфоцитов и лейкоцитов от абсолютного количества клеток с БКЦ и абсолютного количества пролиферирующих лимфоцитов у облученных и необлученных людей.

У облученных людей на фоне снижения абсолютного количества лейкоцитов и лимфоцитов ПК отмечается увеличение доли лимфоцитов с БКЦ и

спонтанно пролиферирующих ЛПК. Для лиц с еще более глубоким угнетением гемопоэза (снижено несколько типов лейкоцитов), исследуемые показатели имели максимальные значения. Полученные эффекты могут указывать на взаимосвязь между абсолютным количеством лейкоцитов, лимфоцитов ПК и показателями клеточного цикла. Мы отметили слабую линейную положительную зависимость только между абсолютным количеством лимфоцитов ПК у облученных людей и абсолютным количеством лимфоцитов с БКЦ в исходном уровне (г=0,21; р—0,02). Не отмечено таковой зависимости для группы необлу-ченных людей (г=0,30; р=0,14). Не выявлено зависимости между количеством лейкоцитов ПК и лимфоцитов с блоком клеточного цикла у облученных (г=-0,01; р=0,90) и необлучениых людей (г=0,17; р=0,40).

Абсолютное количество ЛПК у облученных и у необлучениых людей, также не зависит от количества лимфоцитов с БКЦ после инкубации (г=0,15; р—0,1 и г=0,27; р=0,17, соответственно) и инкубации с облучением (г=0,08; р=0,4 и г=0,30; р=0,13 соответственно). Аналогичные результаты получены и при анализе зависимости между частотой лимфоцитов с БКЦ после инкубации с дополнительным у-облучением и абсолютным количеством лейкоцитов ПК.

I-

г=0,35, р=0,0008: у=1,67+1,23*х

< с

Абсолютное количество митогенстимулированных лимфоцитов. 10 л

Рис .7. Корреляция между абсолютным количеством ПК у облученных людей и абсолютным количеством пролиферирующих лимфоцитов после митогенной

стимуляции.

Абсолютное количество ЛПК не имеет линейной зависимости от количества лимфоцитов, пролиферирующих в ПК у облученных (г=0,02, р--0,85) и необлучениых людей (г=0,33; р=0,16). Также не отмечено зависимости между

спонтанной пролиферацией лимфоцитов и уровнем лейкоцитов в ПК у облученных (г=0,02; р=0,85) и необлученных людей (г=0,35; р=0,12). Напротив, выявлена слабая линейная зависимость между содержанием лимфоцитов (рис.7.) и лейкоцитов (г=0,24; р=0,02) в ПК и количеством пролиферирующих лимфоцитов после инкубации с ФГА в группе облученных лиц.

Аналогично отмечена слабая линейная корреляция между абсолютным количеством лейкоцитов(г=0,25, р=0,02), лимфоцитов (г=0,51, р=0,05) и количеством пролиферирующих лимфоцитов после инкубации с ФГА у необлученных людей.

Таким образом, у облученных лиц и необлученных лиц отмечается слабая корреляция между абсолютным количеством лимфоцитов\лейкоцитов ПК и их пролиферативной активностью.

ВЫВОДЫ

1. У жителей прибрежных сел р. Теча, в отдаленный период (59-61 год), после начала хронического радиационного воздействия (дозы облучения красного костного мозга составили 0,06-4,46 Гр; среднее значение 1,11±0,06 Гр) выявлено статистически значимое увеличение в периферической крови числа пролиферирующих лимфоцитов, лимфоцитов с блоком клеточного цикла и СБЗ-СП4+ лимфоцитов по сравнению с показателями у необлученных людей.

2. Не установлено зависимости пролиферативной активности лимфоцитов, доли лимфоцитов с блоком клеточного цикла и количества С03-С04+ лимфоцитов от дозы облучения красного костного мозга у людей в отдаленный период после начала хронического радиационного воздействия. Выявлена слабая положительная зависимость частоты лимфоцитов периферической крови с блоком клеточного цикла после дополнительного острого у-облучения в дозе 1 Гр от дозы облучения ККМ, а также исходной частоты лимфоцитов с блоком клеточного цикла и спонтанной пролиферативной активности лимфоцитов от мощности дозы облучения ККМ в период максимального радиационного воздействия (0,03-1,25 Гр; среднее значение 0,28±0,02Гр).

3. У людей, проживающих в прибрежных селах р. Теча и перенесших хроническую лучевую болезнь (дозы облучения красного костного мозга 0,232,70 Гр; среднее значение 0,87±0,10Гр), в отдаленные сроки от начала облучения не отмечено изменений пролиферативной активности и числа лимфоцитов с блоком клеточного цикла, а также количества С03-С04+ лимфоцитов по сравнению с показателями необлученных людей.

4. У облученных людей, имеющих в отдаленные сроки лейкопению (дозы облучения красного костного мозга 0,06-4,46 Гр; среднее значение 1,07±0,19

Гр), наблюдается увеличение пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови и доли лимфоцитов с блоком клеточного цикла по сравнению с контролем и с группой облученных людей, не имеющих лейкопению.

5. Пролиферативная активность и доля лимфоцитов с блоком клеточного цикла, а также частота СЭЗ-С04+ лимфоцитов не имеют зависимости от накопленной дозы и мощности дозы облучения ККМ в период максимального радиационного воздействия (0,04—1,25 Гр\год; 0,27±0,06 Гр\год) у облученных людей, имеющих в отдаленный период лейкопению.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Почухайлова Т.Н., Веремева Г.А, Аклеев А.В. Пролиферация и состояние клеточного цикла лимфоцитов периферической крови человека в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия // Медицинская наука и образование Урала. - 2009. - Т. 10. - № 3. - С. 52-54.

2. Veremeyeva G., Akushevich L, Pochukhailova T., Blinova E., Var-folomeyeva T., Ploshchanskaya O., Khudyakova O., Vozilova A., Kozionova O., Ak-leyev A. Long-term cellular effects in humans chronically exposed to ionizing radiation // Health Physics. - 2010. - Vol. 97. - P. 204-206.

3. Маркина Т.Н., Веремеева Г.A., Блинова E.A., Аклеев А.В. Блок клеточного цикла и активность апоптоза лимфоцитов периферической крови (ЛПК), частота мутаций в генах TCR в отдаленные сроки у людей, подвергшихся хроническому радиационному воздействию // Вопросы радиационной безопасности.-2011,-№1.-С. 41-49.

4. Маркина Т.Н., Аклеев А.В., Веремеева Г.А. Пролиферативная активность и клеточный цикл лимфоцитов периферической крови (ЛПК) человека в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия \\ Радиация и риск. - 2011. - Т. 20. - Вып. 1. - С. 50-58.

Тезисы

1. Веремеева Г.А., Акушевич И.В., Маркина Т.Н., Блинова Е.А., Пло-щанская О.Г., Варфоломеева Т.А., Худякова О.И., Аклеев А.В. Особености внутриклеточных процессов при хроническом облучении человека // Тезисы докладов IV международной конференции «Хроническое радиационное воздействие: эффекты малых доз». 9-11 ноября 2010г. - Челябинск, 2010. - С.27.

2. Веремеева Г.А., Е.А. Блинова, Т.Н. Почухайлова, А.В. Аклеев. Влияние хронического облучения на апоптоз лимфоцитов периферической крови

человека/ Чернобыльские чтения - 2008 // Материалы международной научно-практической конференции. - 24 - 25 апреля 2008 г. - Гомель, 2008. - С. 52-57.

3. G. Veremeyeva, I. Akushevich, Е. Blinova, Т. Pochukhailova and A. Akleyev. The Role of Apoptosis in the Development of Radiation-Induced Genome Instability under Chronic Radiation Exposure // Radioprotection. - 2008. - Vol. 43. — No.5.,-P. 117

4. G. Veremeyeva, T. Varfolomeyeva, A. Vozilova, E. Blinova, T. Pochukhailova, S. Pushkaryov, A. Akleyev. Genomic instability at late time after chronic radiation exposure // Poster presentation at the 12th International Congress of the International Radiation Protection Association. - 19-24 October 2008. - Buenos Aires, Argentina, 2008. - P. 92-93.

5. Veremeyeva G., Akushevich I., Pochukhailova T., Blinova E., Varfolomeyeva T., Ploshchanskaya O., Khudyakova O., Vozilova A., Kozionova O, Akleyev A. Frequency of genomic abnormalities and peculiarities of physiological processes in blood cells under chronic radiation exposure in man: Bridging the Experimental and Epidemiologic Divide // Georgetown University Hotel & Conference Center. - 4-6 May 2009. - Washington, USA, 2009. - P. 37.

6. Veremeyeva G., Akushevich I., Pochukhailova T., Blinova E., Varfolomeyeva T., Ploshchanskaya O., Khudyakova O., Vozilova A., Kozionova O, Akleyev A. Long-term Cellular Effects in Humans Chronically Exposed to Ionizing Radiation // Presentation at 10th International Conferences on Health Effects of Incorporated Radionuclides.- 10-14 May 2009.- Santa Fe, USA, 2009. -P.101.

7. Akleyev A.V., Pochukhailova T., Blinova E. Proliferation. Cell cycle and Apoptosis in Blood Lymphocytes at Late Time after Chronic Radiation Exposure in Man // 54th Annual Meeting of the Health Physics Society. - 12-16 July 2009. -Minneapolis, USA, 2009. - P. 93.

8. Почухайлова Т.Н., Веремеева Г.А., Аклеев A.B. Пролиферация и состояние клеточного цикла лимфоцитов периферической крови человека в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия // Материалы 5 международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию создания Северского биофизического центра ФМБА России. - 13-14 апреля 2010.-Томск, 2010.-С. 105-108.

9. Димов Г.П., Маркина Т.Н., Блинова Е.А., Веремеева Г.А., Аклеев А.В. Оценка показателей клеточного цикла лимфоцитов периферической крови как метод прогнозирования ответа системы гемопоэза на регенеративную терапию // Материалы 1 международной научно-практической конференции постгено-ные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине. - 1719 ноября 2010. - Москва, 2010. - С.127.

10. Маркина Т.Н., Веремеева Г.А., Аклеев А.В. Пролиферация и задержка клеточного цикла лимфоцитов периферической крови человека в отдаленные

сроки после хронического радиационного воздействия // Тезисы докладов IV международной конференции «Хроническое радиационное воздействие: эффекты малых доз». - 9-11 ноября 2010г. - Челябинск, 2010. - С.37.

На правах рукописи

Маркина Татьяна Николаевна

03.01.01 —радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2011

Отпечатано в типографии BNL. Подписано в печать 22.04 .11 г. Формат 60x84 l/iß. Гарнитура Arial Суг. Бумага офсетная. Печать на ризографе. Объем 1 усл. п.л. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Маркина, Татьяна Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Регуляция клеточного цикла.

1.2. Влияние возраста и пола клеточный цикл и частоту мутаций в генах Т-клеточного рецептора (ТСЯ).

1.3. Влияние ионизирующего излучения на клеточный цикл.

1.3.1. Радиочувствительность клеток системы кроветворения.

1.3.2. Радиационно-индуцированная остановка клеточного цикла.

1.3.3. Влияние острого облучения на клеточный цикл.

1.3.3.1 Влияние низких доз ионизирующего излучения на клеточный цикл.

1.3.3.2 Влияние высоких доз ионизирующего излучения на клеточный цикл.

1.3.4. Клеточный цикл и пролиферация клеток системы кроветворения при хроническом радиационном воздействии.

1.3.4.1 Влияние хронического радиационного воздействия на пролиферативную активность и количественный состав лейкоцитов периферической крови у людей в отдаленные сроки.

1.4. Частота мутаций в генах Т-клеточного рецептора.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Условия облучения лиц, проживающих в прибрежных селах р. Теча.

2.2. Характеристика обследованного контингента.

2.3. Методы исследования.

2.3.1. Определение общего количества лейкоцитов периферической крови.

2.4. Молекулярно-биологические методы исследования.

2.4.1. Оценка доли (%) лимфоцитов периферической крови с блоком клеточного цикла.

2.4.2. Оценка доли (%) пролиферирующих лимфоцитов периферической 61 крови человека.

2.4.3. Оценка частоты мутаций в гене СЬк2 методом ГЩР.

2.4.4. Оценка уровня СБЗ-СБ4+ лимфоцитов (ТСИ-мутаитных) периферической крови человека.

2.5. Методы статистической обработки.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Анализ влияния факторов нерадиационной природы на блок клеточного цикла, пролиферативную активность лимфоцитов и частоту СБЗ-С04+ лимфоцитов периферической крови у лиц, не подвергшихся хроническому радиационному воздействию.

3.2. Блок клеточного цикла и пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови, частота СБЗ-СБ4+ лимфоцитов у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию.

3.3 Зависимость пролиферативной активности лимфоцитов, частоты лимфоцитов с блоком клеточного цикла, и частоты СОЗ-СБ4+ лимфоцитов у облученных лиц от накопленной дозы облучения ККМ.

3.3.1. Зависимость доли (%) лимфоцитов с блоком клеточного цикла от дозы облучения ККМ.

3.3.2. Зависимость пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови (ЛПК) от дозы облучения ККМ.

3.3.3. Зависимость частоты СВЗ-СБ4+ лимфоцитов от дозы облучения

3.4. Зависимость пролиферативной активности, частоты лимфоцитов с блоком клеточного цикла, и частоты СБЗ-СБ4+ лимфоцитов от мощности дозы облучения ККМ.

3.4.1. Зависимость доли лимфоцитов с блоком клеточного цикла от мощности дозы облучения ККМ.

3.4.2 Зависимость пролиферативной активности лимфоцитов от мощности дозы облучения ККМ.

3.4.3. Зависимость частоты мутаций СБЗ-СБ4+ лимфоцитов от мощности дозы облучения ККМ.

3.5. Анализ зависимости частоты СБЗ-СВ4+ лимфоцитов от доли лимфоцитов с блоком клеточного цикла и от пролиферативной активности лимфоцитов. 3.6. Блок клеточного цикла и пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови, частота СБЗ-СВ4+ лимфоцитов у облученных лиц, имеющих лейкопению.

3.7. Блок клеточного цикла и пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови, частота СБЗ-СВ4+ лимфоцитов у облученных лиц, перенесших ХЛБ.

3.8. Сравнительный анализ частоты лимфоцитов с блоком клеточного цикла пролиферативной активности лимфоцитов и частоты СБЗ-СБ4+ лимфоцитов у лиц, имеющих лейкопению в ранний и отдаленный периоды 104 облучения.

3.9. Анализ зависимости абсолютного количества лимфоцитов и лейкоцитов от абсолютного количества клеток с блоком клеточного цикла и абсолютного количества пролиферирующих лимфоцитов периферической крови.

3.9.1 Анализ зависимости абсолютного количества лимфоцитов и лейкоцитов от абсолютного количества лимфоцитов с блоком клеточного цикла у облученных и необлученных людей.

Анализ зависимости абсолютного количества лимфоцитов и лейкоцитов от абсолютного количества пролиферирующих ЛПК у облученных людей и людей, не подвергшихся радиационному 111 воздействию.

3.9.3 Анализ зависимости абсолютного количества лимфоцитов и лейкоцитов периферической крови людей, перенесших ХЛБ, и облученных людей, имеющих лейкопению, от абсолютного 114 количества лимфоцитов с блоком клеточного цикла.

3.9.4 Анализ зависимости абсолютного количества лейкоцитов и лимфоцитов от пролиферативной активности лимфоцитов у людей, перенесших ХЛБ, и облученных лиц с лейкопенией.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пролиферативная активность и задержка клеточного цикла лимфоцитов крови человека в отдаленные сроки хронического облучения"

Актуальность проблемы Возрастающий риск облучения человека, связанный с бурно развивающейся атомной энергетикой и широким применением в медицине радиоизотопных методов диагностики и лечения приводит к необходимости исследования эффектов радиационного воздействия. После крупных радиационных инцидентов прошлых лет: атомной бомбардировки городов Хиросимы и Нагасаки, аварии на ЧАЭС, радиоактивного загрязнения вод р. Теча, ставшего результатом деятельности ПО «МАЯК», а также в связи с произошедшей в 2011 году радиационной аварией на Фукусиме-1, - особое место занимает проблема отдаленных эффектов радиационного воздействия на человека.

Известно, что ионизирующие излучение индуцируют комплекс цитогенетических, биохимических и биофизических изменений в клетках организма животных и человека [9, 48] в том числе изменяет состояние клеточных защитных механизмов: систем антиоксидатной защиты, систем репарации, клеточного цикла [48, 58]. Один из основных механизмов «радиационной защиты» клетки направленных на предотвращение деления клеток с повреждениями ДНК - блок клеточного цикла [38]. В случае нарушения этого защитного механизма, повреждения ДНК, возникающие при длительном облучении, могут быть реализованы в виде соматических мутаций, что, в конечном счете, может привести к продукции пула дефектных, структурно и функционально неполноценных клеток [11]. Особенно актуально это в отношении радиочувствительных гемопоэтических клеток красного костного мозга (ККМ).

В ряде экспериментальных работ показано, что у хронически облученных животных выявлено изменение митотического цикла клеток ККМ (красного костного мозга) и их пролиферативной активности. Однако вопрос об экспрессии белка СЬк2 (как маркера блока клеточного цикла) у хронически облученных людей ранее не рассматривался.

У пострадавших при атомных бомбардировках в Японии [147], ликвидаторов ЧАЭС [30], у работников атомной промышленности [37, 59] выявлено увеличение частоты мутаций в генах Т-клеточного рецептора (ТСЯ). Но пока остаётся неясным какова частота мутаций в генах ТСII у хронически облученных людей в отдаленные сроки от начала радиационного воздействия (более 60 лет). В связи с этим особый интерес может представлять изучение частоты лимфоцитов с блоком клеточного цикла (БКЦ), пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови (ПК) и частоты СВЗ-СБ4+ лимфоцитов у облученных жителей прибрежных сел р. Теча, в отдаленные сроки. Район реки Теча является единственным регионом в мире, где, начиная с 1949 г., в результате производственной деятельности комбината "Маяк" сложились аварийные условия многолетнего облучения значительного по численности контингента населения в широком диапазоне доз [43].

Исследование позволило оценить пролиферативную активность, клеточный цикл лимфоцитов периферической крови как модели ГСКМ (гемопоэтическая клетка красного костного мозга), а также частоту СБЗ-СБ4+ лимфоцитов в отдаленный период после начала радиационного воздействия. Особенно актуально, было оценить данные параметры в период, когда большая часть облученных людей достигла пожилого возраста, характеризующегося снижением адаптационных резервов, ослаблением систем контроля клеточного цикла и репарации, спонтанным увеличением частоты соматических мутаций.

Цель исследования: оценить пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови (ЛПК), частоту лимфоцитов с блоком клеточного цикла (БКЦ) и частоту СВЗ-С04+ лимфоцитов у людей, проживавших в прибрежных селах р. Теча и подвергшихся хроническому радиационному воздействию

Задачи исследования:

1) Исследовать пролиферативную активность и частоту лимфоцитов с БКЦ методом проточной цитометрии (по экспрессии белков СЪк2 и Кь67), а также частоту СГ)3-СБ4+ лимфоцитов у хронически облученных людей в отдаленные сроки после начала радиационного воздействия.

2) Оценить пролиферативную активность, долю лимфоцитов с БКЦ, и частоту СОЗ-СБ4+ лимфоцитов у лиц, перенесших хроническую лучевую болезнь (ХЛБ).

3) Проанализировать пролиферативную активность и долю лимфоцитов с БКЦ, частоту СОЗ-СБ4+ лимфоцитов у облученных людей, имеющих лейкопению в отдаленные сроки радиационного воздействия.

4) Оценить зависимость пролиферативной активности и доли лимфоцитов с БКЦ, частоты СБЗ-СБ4+ лимфоцитов от дозы облучения ККМ и мощности дозы в период максимального радиационного воздействия.

Научная новизна исследования Впервые у жителей прибрежных сел р.Теча, подвергшихся хроническому комбинированному облучению, в том числе у лиц, перенесших ХЛБ и имеющих лейкопению в отдаленный период радиационного воздействия, исследована пролиферативная активность ЛПК и частота клеток с блоком клеточного цикла, методом проточной цитометрии на основе анализа экспрессии белков кь67 и СЫс2.

Проведен анализ влияния дозы и мощности дозы облучения ККМ на пролиферативную активность и частоту лимфоцитов с БКЦ, а также частоту СБЗ-CD4+ лимфоцитов у хронически облученных людей в отдаленный период после начала радиационного воздействия.

Впервые изучена зависимость между содержанием лейкоцитов, лимфоцитов в периферической крови и пролиферативной активностью, а также блоком клеточного цикла ЛПК у облученных людей в отдаленные сроки после радиационного воздействия.

Практическая значимость работы Оценка пролиферативной активности и частоты клеток с блоком клеточного цикла позволит обосновать и разработать критерии формирования групп риска в отношении отдаленных гемопоэтических эффектов.

Разработанная методика оценки доли (%) ЛПК с блоком клеточного цикла, методом проточной цитометрии на основе анализа экспрессии белка СЫс2, совместно с исследованием пролиферативной активности ЛПК (белок Ю-67) рекомендуется для прогнозирования ответа системы гемопоэза на стимулирующее воздействие при лечении цитопенического синдрома, с применением регенеративной терапии.

Положения, выносимые на защиту

1. В отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия (дозы облучения ККМ составили 0,06-4,46 Гр; среднее значение - 1,11±0,06 Гр) у лиц пожилого и старческого возраста в периферической крови отмечено увеличение уровня СОЗ-СБ4+ лимфоцитов на фоне повышения пролиферативной активности лимфоцитов и клеток с блоком клеточного цикла. Частота лимфоцитов с блоком клеточного цикла в периферической крови и пролиферативная активность лимфоцитов зависят от мощности дозы облучения ККМ в период максимального облучения. Частота клеток с блоком клеточного цикла после инкубации и у-облучения зависит от дозы облучения ККМ.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Маркина, Татьяна Николаевна

выводы

1. У жителей прибрежных сел р. Теча, в отдаленный период.(59-61 год), после начала хронического радиационного воздействия (дозы облучения красного костного мозга составили 0,06-4,46 Гр; среднее значение 1,11±0,06 Гр) выявлено статистически значимое увеличение в периферической крови числа пролиферирующих лимфоцитов, лимфоцитов с блоком клеточного цикла и СБЗ-СВ4+ лимфоцитов по сравнению с показателями у необлученных людей.

2. Не установлено зависимости пролиферативной активности лимфоцитов, доли лимфоцитов с блоком клеточного цикла и количества СБЗ-СВ4+ лимфоцитов от дозы облучения красного костного мозга у людей в отдаленный период после начала хронического радиационного воздействия. Выявлена слабая положительная зависимость частоты лимфоцитов периферической крови с блоком клеточного цикла после дополнительного острого у-облучения в дозе 1 Гр от дозы облучения ККМ, а также исходной частоты лимфоцитов с блоком клеточного цикла и спонтанной пролиферативной активности лимфоцитов от мощности дозы облучения ККМ в период максимального радиационного воздействия (0,03-1,25

Гр; среднее значение 0,28±0,02Гр).

3. У людей, проживающих в прибрежных селах р. Теча и перенесших хроническую лучевую болезнь (дозы облучения красного костного мозга 0,23-2,70 Гр; среднее значение 0,87±0,10Гр), в отдаленные сроки от начала облучения не отмечено изменений пролиферативной активности и числа лимфоцитов с блоком клеточного цикла, а также количества СОЗ-СВ4+ лимфоцитов по сравнению с показателями необлученных людей.

4. У облученных людей, имеющих в отдаленные сроки лейкопению (дозы облучения красного костного мозга 0,06-4,46 Гр; среднее значение 1,07±0,19 Гр), наблюдается увеличение пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови и доли лимфоцитов с блоком клеточного цикла по сравнению с контролем и с группой облученных людей, не имеющих лейкопению.

5. Пролиферативная активность и доля лимфоцитов с блоком клеточного цикла, а также частота СОЗ-СБ4+ лимфоцитов не имеют зависимости от накопленной дозы и мощности дозы облучения ККМ в период максимального радиационного воздействия (0,04-1,25 Гр\год; 0,27±0,06 Гр\год) у облученных людей, имеющих в отдаленный период лейкопению.

Автор искренне благодарит своего научного руководителя Александра Васильевича Аклеева за руководство этой диссертационной работой.

Автор искренне благодарит к.б.н., заведующую клинико-физиологической лаборатории ФГУН УНПЦРМ Галину Анатольевну Веремееву за огромную помощь и консультации.

Автор искренне благодарит к.б.н., доцента кафедры радиационной биологии ЧелГУ Ольгу Глебовну Площанскую за проведение исследования частоты мутаций в гене СЬк2.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маркина, Татьяна Николаевна, Москва

1. Х.Аклеев A.B., Варфоломеева Т.А. Состояние гемопоэза в условиях многолетнего облучения костного мозга у жителей прибрежных сел р. Теча // Радиационная биология. Радиоэкология. 2007. - Т. 47. - № 3. - С. 307-321

2. Аклеев A.B., Голощапов П.В., Дегтева М.О., Косенко М.М, Костюченко, В.А. и др. Радиактивное загрязнение окружающей среды в регионе Южного Урала и его влияние на здоровье населения / Под ред. Л.А. Булдакова. Челябинск, -1991.- 64 с.

3. Анисимов В. Молекулярные и физиологические механизмы старения. СПб.: Наука. - 2003. - 468 с.

4. Антощина М.М., Рябченко Н.И., Насонова В.А. Нестабильность генома в потомках клеток китайского хомячка, облученных в низкой дозе при разных интенсивностях у-излучения // Радиационная биология. Радиоэкология экология. 2005. - Т. 45. - № 3. - С. 291-293

5. Баева Е.В., Соколенко В.Л. Экспрессия Т-клеточных поверхностных маркеров лимфоцитами лиц, подвергшихся воздействию малых доз радиации // Иммунология. 1998. - №3. - С. 56-59

6. Баранов А.Е., Петросян Л.Н., Пяткин Е.К. Случай острой лучевой болезни,развившейся после общего равномерного у-облучения (бОСо) // Медицинская радиология. 1977. - Т. 22. - № 8. - С. 48-55.

7. Бойчук Н.В., Исламов P.P., Кузнецов С.Л., Улумбеков Э.Г., Челышев Ю. Гистология. Изд-во: ГЭОТАР-МЕД.- 2001.- 672 с.

8. Радиационная биология. Радиоэкология. 2005. - Т. 45. - №5. - С. 581-586

9. Воробцова И.Е. Цитологические и цитогенетические основы лучевого старения // Проблемы радиационной геронтологии. Современные проблемы радиационной биологии.- М.: Атомиздат.-1978.-Т.УП-С.98-112.

10. Галактионов В.Г. Иммунология. М., Изд-во МГУ. -1998. - 480 с.

11. Гильманов И.Р., Котов Н.В. Исследование механизмов управление фазой Gl и прохождение точки рестрикции // Структура и динамика молекулярных систем. 2003. - вып. 10. - Часть 2. - С. 250-253

12. Готлиб В.Я., Пелевина И.И., Конопля Е.Ф. и др. Биологическое действие малых доз ионизирующей радиации // Радиобиология. 1991. - Т. 31. - № 3.1. С.318-325

13. Готлиб В.Я., Тапонайнен Н.Я., Пелевина И.И. Длительно существующие повреждения ДНК и выживаемость клеток млекопитающих // Радиобиология. 1985. Т. 25. - № 4. - С. 435^43

14. Григорян, A.C. Кругляков П.В., Таминкина Ю.А. Зависимость пролиферации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток от характеристик доноров // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. 2009. Том 4. -№2. - С. 70-75

15. Гришина JI.B. Распространенность иммунопатологических синдромов и характеристика иммунной системы у лиц, подвергшихся влиянию малых доз радиации: Дисс. канд. биол. наук. М:, 2004. 112 с.

16. Груздев Г.П. Острый радиационный костномозговой синдром / Г.П. Груздев. М.: Медицина, 1988. 144 с.

17. Ефимова Н.В. Закономерности компенсаторно-приспособительных реакций, реализуемых в популяции стволовых кроветворных клеток при хроническом радиационном воздействии. Автореферат дисс. док. биол. наук. Челябинск, 2007.- 52 с.

18. Ефимова Н.В., Шибкова Д.З.,. Толстых Е.И, Андреева О.Г. Состояние стволового пула кроветворных клеток (КОЕс) мышей линии СВА при однократном введении 90Sr // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2004. - Т. 90. - № 8. - С. 192

19. Календо Г.С., Различные уровни радиозащиты в популяции опухолевых клеток. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. - Том.41. - №5. - С. 519-527

20. Клаус Д. Лимфоциты. Методы. М.: Мир, - 1990. - 377 с.

21. Клеточный цикл. Проблемы регуляции / Под. ред. О.И. Епифановой. Изд-во «Наука». М., - 1973. - 104с.

22. Кончаловский М.В., Баранов А.Е., Соловьев В.Ю. Дозовые кривые нейтрофилов и лимфоцитов при общем относительно равномерном у-облучении человека (по материалам аварии на Чернобыльской АЭС) // Медицинская радиология. 1991. - №1. - С. 29-33

23. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия. 2000. - № 65.1. С.5-33

24. Кудряшов Ю. Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения) / Под ред. В.К. Мазурика, М.Ф. Ломанова. М.: ФИЗМАТЛИТ, - 2004. - 448 с.

25. Лабораторные методы исследования в клинике // Под ред. проф. В.В. Меньшикова. Медицина. - 1987. - 368 с.

26. Лыков А.П., Сахно Л.В., Козлов В.А. Продукция цитокинов (интерлейкинов 1 и 2, фактора некроза опухоли) мононуклеарами крови у ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС // Экологическая иммунология. 1998. - №4. - С.56-57

27. Мазурик В.К., Михайлов В.Ф. Радиационно-индуцируемая нестабильность генома: феномен, молекулярные механизмы, патогенетическое значение // Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. - Т. 41. - № 3. - С. 272-289

28. Медико-биологические и экологические последствия радиоактивного загрязнения реки Теча. / Под ред. д.м.н. A.B. Аклеева и к.х.н. М.Ф. Киселева. Москва. -2001.-530 с.

29. Медико-биологические эффекты хронического радиационного воздействия / Под ред. A.B. Аклеева. Том 2. Челябинск. Изд-во «Фрегат»., 2005. - 380с.

30. Молекулярно-клеточные механизмы реализации отдалённых эффектов хронического облучения человека. Отчет НИР /УНПЦРМ; Инв. № 153. Челябинск 2008. - 113 с.

31. Муксинова К.Н., Мушкачева Г.С. Клеточные и молекулярные основы перестройки кроветворения при длительном радиационном воздействии / Под ред. А. К. Гуськовой. М.: Энергоатомиздат. - 1990. - 160 с.

32. Мушкамбаров H.H., Кузнецов С.Л. Молекулярная биология. М.: Изд-во: ООО "Медицинское информационное агентство". 2003. - 544с.

33. Окада Ш. Радиационная биохимия клетки. М.:, - 1974- 408с.

34. Пелевина И.И., Готлиб В.Я., Кудряшова О.В. Нестабильность генома после воздействия радиации в малых дозах (в 10-километровой зоне аварии на ЧАЭС и в лабораторных условиях) // Радиационная биология. Радиоэкология. 1996. -Т. 36. - № 4. - С. 546-560

35. Окладникова Н.Д., Пестерникова B.C., Сумина М.В. и др. Хроническая лучевая болезнь человека, вызванная внешним гамма-облучением: отдаленный период наблюдения // Вестник академии медицинских наук. 1991. - № 2. - С. 22-26.

36. Полякова В.О, Кветной И.М., Хавинсон В.Х., Марьянович А.Т., Коновалов С.С. Тимус и старение // Успехи геронтологии. 2001. - Т.8. - С. 50-57

37. Радиация и патология. Учеб пособие / А.Ф. Цыб, P.C. Будагов, И.А. Замулаева и др. / Под ред. А.Ф. Цыба-М.: Высш. Шк., 2005. 341с.

38. Ретроспективная оценка и мониторинг индивидуальных доз внутреннего облучения от долгоживущих радионуклидов у населения Уральского региона.1. ОП I

39. Ретроспективная оценка поступления Sr и Cs в организм жителей прибрежных сел реки Теча. Отчет НИР /УНПЦРМ; Инв. № 293. Челябинск, -2009. 70 с.

40. Романова А.Ф., Третьяк H.H. Клименко В.И. Особенности гемопоэза у больных острой лучевой болезнью, возникшей у лиц, подвергшися воздействию ионизирующей радиации в результате аварии на ЧАЭС // Тез. Док. респ. науч,-прак. конф. Киев, 1991. - С. 193-195

41. Руководство по применению «SNP-экспресс». М.- 2009. 35с.

42. Саенко А. С.,. Замулаева И. А Изучение влияния малых доз радиации на устойчивость биологических систем // Медицинский радиологический научный центр РАМН. 2006. www.Sciencerf.ru

43. Серебряный A.M., Алещенко A.B., Готлиб В.Я., Кудряшова О.В., Семенова Л.П., Пелевина И.И. О новом механизме формирования адаптивного ответа // Радиационная биология. Радиоэкология. 2004. - Т. 44. - №6. - С.653-656

44. Талаев В.Ю., Романова Т.Е., Рубцова И.Е. Функциональное состояние Т-лимфоцитов периферической крови у больных хроническим бронхитом ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС // Иммунология. 1999. - №2. С. 39-40

45. Тетенев Ф.Ф., Поровский Я.В., Бодрова Т.Н., Рыжов А.И., Ветлугина Т.П. Изменение гемомикроциркуляции и структурных компонентов иммунитета у ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС // Бюллетень сибирской медицины. -2007. № 2. - С. 53-59

46. Туков А. Р., Шафранский И. Л., Клеева Н. А. Сопоставление показателей периферической крови и дозы внешнего облучения у мужчин-ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС // Медицинская радиология и радиационная безопасность.- 2002. Т. 4. № 6.- С. 27-32

47. Урбах В.Ю. Математическая статистика для биологов и медиков. М., - 1963. -323с

48. Фаворова О.О. Сохранение ДНК в ряду поколений: репликация ДНК. Соровский образовательный журнал // Биология. 1996. - №4. - С. 11-17

49. Фогель Ф. Мотульски А. Генетика человека // Проблемы и походы / Под. ред. Алтухова Ю.П. Гиндилиса В.М. М.: Мир, - 1990. - Том 2. - С. 142-277

50. Хейфец Л.Б., Абалакин В.А. Разделение форменных элементов крови человека в градиенте плотности верографин-фиколл // Лабораторное дело. 1973. - № 10. - С. 579-581

51. Шибкова Д.З., Ефимова Н.В., Толстых Е.И., Андреева О.Г. Компенсаторно-приспособительные реакции стволового кроветворного пула мышей линии СВАпри однократном введении 90Sr // Радиационная биология. Радиоэкология. -2005. Т. 45. - № 2. - С. 180-190

52. Шибкова Д.З., Н.В. Ефимова, А.В. Аклеев. Механизмы компенсации в стволовом кроветворном пуле (КОЕс) в условиях экспериментального хронического у-облучения // Радиационная биология. Радиоэкология. 2006. -Т. 46.-№5.-С. 596-604

53. Ярмоненко С.П. Радиобиология человека и животных. М., «Высш.школа».-1977.- 368с

54. Akiyama М., Kusunoki Y., Umeki S., Nakamura N., Kyoizumi S. Evaluayion of four somatic mutation assays as biological dosimeter in humans // Radiation Research. -1992. V. 11.- P.177-182

55. Aktas H., Cai H., Cooper G.M. Ras Links Growth Factor Signaling to the Cell Cycle Machinery via Regulation of Cyclin D1 and the Cdk Inhibitor p27KIPl // Molecular and Cellular Biology. 1997. - V. 17. - P. 3850-3857

56. Anisimov Y. N. Carcinogenesis and Aging. V. 1, 2. Boca RaVoru CRC Press, 1987. - 148 p.

57. Bartek J., Lukas J. Chkl and Chk2 kinases in checkpoint control and cancer // Cancer cell. 2003. - №. 3. - P. 421-429

58. Baserga R. L. Cell division and the cell cycle // Handbook of the Biology of Aging/ Eds. C.E. Finch, L. Hayflick, N. Y.: VanNostrand Reinholdd 1977. - P. 101-121.

59. Bertoni F., Codegoni A.M., Furlan D., Tibiletti M.G., Capella C., Broggini, M. CHK1 frameshift mutations in genetically unstable colorectal and endometrial cancers // Genes Chromosomes Cancer. 1999. - V. 26. - P. 176-180

60. Blagosklonny M.V., Pardee A.B. The Restriction Point of the Cell Cycle // Cell Cycle.-2002.-V. 1.-P. 103-110

61. Bogdan I., Gerashchenko B.I, Howell R.W. Bystander Cell Proliferation Is Modulated by the Number of Adjacent Cells That Were Exposed to Ionizing Radiation. // Cytometry. Part A. 2005. - № 66. - P. 62-70

62. Born T. L., Frost J. A., Schonthal A., Prendergast G. C., Feramisco J. R. c-Myc cooperates with activated Ras to induce the cdc2 promoter // Molecular and Cellular Biology. 1994. - V. 14. - P. 5710-5718

63. Broil R. The proliferation marker pKi-67 becomes masked to MIB-1 staining expression of its tandem repeats // Histochem Cell Biology. 2002. - V. 118. - №5. -P. 415-422.

64. Burdon R.H. Superoxide and hydrogen peroxide in relation to mammalian cell proliferation // Free Radical Biology and Medicine. 1995. - Vol. 18. - P. 775-794

65. Burke D.J. Complexity of the spindle checkpoint // Current Opinion in Genetics and Development. 2000. - V. 10. - P. 26-31

66. Campana D., Coustant-Smith E., Janossy G. Double and triple staining methods for studying the proliferation activity of human B and T lymphoid cells // Immunology Methods. 1988. - №107. - P. 79-88

67. Campana D., Janossy G. Proliferation of normal and malignant human immature lymphoid cells//Blood. 1988.-V. 71.-P. 1201-1210

68. Cha Soon K., Kim J.K., Nam S. Y., Yang K. H., Jeong M., Ki H. S. Low-dose radiation stimulates the proliferation of normal human lung fibroblasts via a transient activation of Raf and Akt // Cells. 2007. - Vol. 24. - №3. - P. 424-430

69. Chiang C.S., McBride W.H. Radiation enhanced TNF-a production by murine brain cells // Brain Research. 1991. - V. 566 - P. 265-269

70. Chu-Xia D. Survey and summary BRCA1: cell cycle checkpoint, genetic instability, DNA damage response and cancer evolution // Nucleic Acids Research. 2006. - Vol. 34.-N5.- P. 51416-1426

71. Clevers H., Alarcon B., Wileman T., Terhost C. The T cell receptor/CD3 complex: A dynamic protein ensemble // Annual Review of Immunology. 1988. - V. 6.1. P. 629-662

72. Constable P., Crowston J.G., Occleston N.L., Cordeiro M.F., Khaw P. T. Long term growth arrest of human Tenon's fibroblasts following single applications of |3-radiation // British Journal of Ophthalmology. 1998. - №82. - P. 448^52

73. Cordone I., Matutes E., Catovsky D. Characterization of normal peripheral blood cells in cycle identified by monoclonal antibody Ki-67 // Clinical Pathology. 1992. -№45.-P. 201-205.

74. Cox L.S., Lane D.P. Tumour suppressors, kinases and clamps: How p53 regulates the cell cycle in response to DNA damage // BioEssays. 1995. - V. 17. - P. 501-508

75. Crompton NEA. Programmed cellular response to ionizing radiation damage // Acta Oncology. 1998. - V. 37. - P. 129 -142

76. David O Morgan. Cell cycle / Princile of control. New science press.- Ltd.- 2007. 172p.

77. Di Leonardo A, Linke S.P., Clarkin K. DNA damage triggers a prolonged p53-dependent G1 arrest and long-term induction of Cipl in normal human fibroblasts // Genes and Development. 1994. - V. 8. - P. 2540-2551

78. Edwards, E., Geng, L., Tan, J., Onishko, H., Donnelly, E. Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling in the response of vascular endothelium to ionizing radiation // Cancer Research. 2002. - №62. - P. 4671-4677

79. Elledge S. J. The DNA damage response: putting checkpoints in perspective // Genes and Development. 1996. - V. 408(6811). - P. 433-9

80. Elledge S.J. Cell cycle checkpoints: preventing an identity crisis // Science. -1996.-V. 274.-P. 1664-1672

81. Enoch T., Norbury C. Cellular responses to DNA damage: Cell-cycle checkpoints, apoptosis and the roles of p53 and ATM // Trends in Biochemical Sciences. 1995. -V.20.-P. 426-430

82. Fabris N., Mocchegiani E., Muzzio U. M., Provincialli M. Zinc, Immunity and aging. // Goldstein A.L., ed. Biomedical Advances in Aging. N. Y.; London: Plenum Press, 1990.-P. 271-281

83. Falck J., Lukas C., Protopopova M., Lukas J., Selivanova G., Bartek, J. Functional impact of concomitant versus alternative defects in the Chk2-p53 tumour suppressor pathway // Oncogene. 2001. - №20. - P. 5503-5510

84. Feinendegen L. E. Evidence for beneficial low level radiation effects and radiation hormesis // British Journal of Radiology.- 2005. V. 78,- P. 3-7

85. Feng~X 7-H.7Liarig Y~ Y., Liang" Mr, Zhai W.,"Lin 'Xia (Jan.)."Direct interaction of c-Myc with Smad2 and Smad3 to inhibit TGF-beta-mediated induction of the CDK inhibitor pl5 (Ink4B) // Molecular Cell. 2002. - V. 9 (1).- P. 133-143

86. Furnari B., Blasina A., Boddy M.N., McGowan C.H., and Russell P. Cdc25 inhibited in vivo and in vitro by checkpoint kinases Cdsl and Chkl // Molecular Biology Cell. 1999. - V. 10. P. 833-845

87. Furuno N, den Elzen N, Pines J Human cyclin A is required for mitosis until mid prophase // Ceil Biolology. 1999. - V. 147(2). - P. 295-306

88. Galdiero M., Cipollaro G.D., Folgore A., Cappello M., Gibbe A., Sasso F.S. Effects of irradiation doses on alteration in cytokine release by monocytes and lymphocytes //Medicinal Chemistry. 1994. - V. 25. - P. 23-40

89. Gangulu B. B. Cell division, chromosomal damage and micronucleus formation in peripheral lymphocytes of healthy donors: related to donor's age // Mutation Research. 1993. - Vol. 295. - P. 135-148

90. Gatei M., Sloper K., Sorensen C.S., Syljuasen R., Falck J., Hobson J., Zhou B.B., Bartek, J., Khanna, K.K. ATM and DBS1 dependent phosphorylation of CHK1 on S317 in response to IR // Biological Chemistry. 2003. - V. 278. - P. 14806-14811

91. Gerashchenko B.I., Howell R.W. Cell proximity is a prerequisite for the proliferative response of bystander cells co-cultured with cells irradiated with gamma-rays // Cytometry. 2003. - V. 56A. P. 71-80

92. Gerashchenko B.I, Howell R.W. Flow cytometry as a strategy to study radiation-induced bystander effects in co-culture systems // Cytometry. 2003., - V. 54A. P. 1-7

93. Gerashchenko B.I, Howell R.W. Proliferative response of bystander cells adjacent to cells with incorporated radioactivity // Cytometry. 2005. V.63(2).- P. 118 -124

94. Guan-Jun W., Lu C. Induction of cell-proliferation hormesis and cell-survival adaptive response in mouse hematopoietic cells by whole-body low-dose radiation // Toxicological sciences. 2000. - V. 53. - P. 369-376

95. Gudkov A.V., Komarova A. Prospective therapeutic applications of p53 inhibitors //Nature. 2005. - V. 447. - P. 1130-1134

96. Guo Y., Sklar G.N., Borkowski A., Kyprianou N. Loss of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27(Kipl) protein in human prostate cancer correlates with tumor grade //Clinical Cancer Research. 1997. - V. 3. - P. 2269-2274

97. Harms-Ringdahl M. Some aspects on radiation induced transmissible genomic instability // Mutation Research. 1998. - V. 404. - P. 27- 33

98. Harrison D.E., Astle C.M., Delaittre J.A, Lost of proliferative capacity in immunohemopoietic stem cells caused by serial transplantation rather than ageing // Experimental Medicine. 1978. -V. 147. - P. 1526-1531

99. Hartwell L. Introduction to cell cycle controls / In: Cell Cycle Control. Ed. by Hutchison C., Glover D.M., Oxford University Press, 1995. - P. 1-15

100. Hartwell L., Weinert T. Checkpoints: Controls that ensure the order of cell cycle events // Science. -1989. V. 246. - P. 629-634

101. Hendrikse A.S., Hunter A.J., Keraan M. Effects of low dose irradiation on TK6 and U937 cells: Induction of p53 and its role in cell-cycle delay and the adaptive response//Radiation Biology. 2000. - V.76. - P. 167-178

102. Hyun S.J., Yoon M.Y., Kim T. H., Kim J. H. Enhancement of mitogen-stimulated proliferation of low dose radiation-adapted mouse splenocytes // Anticancer Research. 1997.-V. 171.-P. 225-229

103. IAEA. International Atomic Energy Agency Technical Reports Series No. 405.Cytogenetic Analysis for Radiation Dose Assessment: A Manual. 2001. - P. 3045

104. Igietseme J.U., Smith K., Simmon A., Rayford P.L. Effect of y-irradiation on the effectors function of T-lymphocytes in microbial control // International Journal of Biology. 1995. - V. 67 (5). - P. 557-564

105. Iliakis G., Wang Y., Guan J., Wang H. DNA damage checkpoint control in cells exposed to ionizing radiation // Oncogene. 2003. - V. 22. - P. 5834-5847

106. Iyer R., Lehnert B.E. Factors underlying the cell growth-related bystander responses to alpha particles // Cancer Research. 2000. - V. 60. - P. 1290-1298.

107. Jaffe D., Bowden T. G. Ionizing radiation as an initiator: effects of proliferation and promotion time on tumor incidence in micel // Cancer Research. 1987. - V. 47. - P. 6692-6696

108. John R., Jackson S. P. Interfaces between the detection, signaling and repair of DNA damage // Science. 2002. - Vol. 297 -. №. 5581 - P. 547-551

109. Jones S.M., Kazlauskas A. Growth-factor-dependent mitogenesis requires two distinct phases of signaling //National Cell Biology. 2001. - V. 3. - P. 165-172

110. Jong-Sung P., Liang Q., Zao-Zong S. Ionizing radiation modulates vascular endothelial growth factor (VEGF) expression through multiple mitogen activated protein kinase dependent pathways // Oncogene. 2001. - №20. - P. 3266 - 3280

111. Kara A. Nyberg, Michelson R.J., Putnam Ch.W., Weinert T.A. Toward maintaining the genome: DNA damage and replication checkpoints // Annual Review of Genetics Annual Review of Genetics. 2002. - Vol. 36. - P. 617-656

112. Kara Zeng Y., Forbes K.C., Wu Z., Moreno S., Piwnica-Worms H., Enoch T. Replication checkpoint requires phosphorylation of the phosphatase Cdc25 by Cdsl or Chkl //Nature. 1998. -V. 395. P. 507-510

113. Kastan M.B. Lim D.S. The many substrates and functions of ATM // Molecular Cell Biology.-2001.- №1.-P. 179-186

114. Kastan M.B., Bartek J. Cell-cycle checkpoints and cancer // Nature. 2004. - V. 432.-P. 316-323

115. Khaw P.T, Ward S., Porter A. The long-term effects of -fluorouracil and sodium butyrate on human Tenon's fibroblasts // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 1992. - V. 33. - P. 2043-2052

116. Kops G.J., Weaver B.A., Cleveland D.W. On the road to cancer: aneuploidy and the mitotic checkpoint //Nature Reviews Cancer. 2005. - V. 5. - P. 773-785

117. Kyoizumi S., Akiyama M., Hirai Y. Spontaneous loss and alteration of antigen receptor expression in mature CD4+ T cells // Experimental Medicine. 1990. - V. 171.-P. 1981-1999

118. Lee S. W., Fang L., Igarashi M., Ouchi, T., Lu, K. P. Sustained. activation of Ras/Raf/mitogen-activated protein kinase cascade by the tumor suppressor p53 // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2000. - V. 97. - P. 8302-8305

119. Little J.B. Radiation-induced genomic instability // Radiation Biology. 1998. - V. 74.-№6.-P. 663-671

120. Liu Q., Guntuku S., Cui X.S. Chkl is an essential kinase that is regulated by Atr and required for the G(2)/M DNA damage checkpoint // Genes and Development.2000.-V. 14.-P. 1448-1459

121. Lodish. H., Baltimore D., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Darnell Z. Molecular cell biology // Scientific American Books Ink. New York. - Fifth Edition. - 1995. - 973p.

122. Lopez F., Belloc F., Lacombe F., Dumain P., Reiffers J., Bernard P. and Boisseau M.R. Modalities of synthesis of Ki67 antigen during the stimulation of lymphocytes // Cytometry. -1991. V. 12. - P. 42-49

123. Maryam N., Hadjati J., Khabiri A, Vodjgani M., Khadem-Shariat H. Effects of Gamma Irradiation on Proliferation and IL-5 Production of Peripheral Blood Lymphocytes // Iranian Biomedical Journal. 2004. - V. 8 (4). - P. 211-214

124. Meyn M.S., Strasfeld L., Allen C. 1994. Testing the role of p53 in the expression of genetic instability and apoptosis in ataxia telangiectasia // Radiation Biology. -1994.-V. 44.-P. 141-149

125. Michael W. M., Newport J. Coupling of mitosis to the completion of S phase through Cdc34-mediated degradation of Weel // Science. 1998. -V. 282. - P. 18861889

126. Moberg K. M., Starz A., Lees J. A. E2F-4 switches from pl30 to pl07 and pRB in response to cell cycle reentry // Molecular Cell Biology. 1996. - V. 16(4). P. 14361449

127. Mochida S., Yanagida M. Distinct modes of DNA damage response in S. pombe GO and vegetative cells // Genes to Cells. 2006. - №11. - P. 13-27

128. Muller W-U., Streffer C. Biological indicators for radiation damage // Radiation Biology. 1991. - V. 59. - P. 863-873

129. Nabil H. Ch., Malikzay A., Appel M., Halazonetis Th.D. Chk2/hCdsl functions as a DNA damage checkpoint in G¡ by stabilizing p53 // Genes and Development. -2000. V. 14(3). - P. 278-288

130. Nalapareddy K., Choudhury A.R., Gompf A., Zhenyu J. CHK2-independent induction of telomere dysfunction checkpoints in stem and progenitor cells // EMBO. -2010.-Vol. 12.-P. 897-935

131. Nevarez J.A, Parrish R.K, Heuer D. K. The effect of beta irradiation on monkey Tenon's capsule fibroblasts in tissue culture // Current Eye Research. 1987. -V.6. -P. 719-23

132. Nold J.D., Miller G.K., Benjamin S.A. Prenatal and neonatal irradiation in dogs: hematologic and hematopoietic responses // Radiation research. 1987. - №112. - P. 490-499.

133. Nyberg K.A., Michelson Rh. J., Putnam C.W., and Weinert T.A. Toward maintaining the genome: DNA Damage and Replication Checkpoints // Annual Review of Genetics. 2002. - V. 36. - P. 617-656

134. O'Connor P.M., Jackman J., Jondle D., Bhatia K., Magrath I., Kohn K.W. Role of the p53 tumor suppressor gene in cell cycle arrest and radiosensitivity of Burkitt's lymphoma cell lines // Cancer Research. 1993. - V. 53. - P. 4776^1780

135. O'Connell M.J., Walworth N.C., Carr A.M. The G2-phase DNA-damage checkpoint // Trends Cell Biology. 2000. - V. 10(7). - P. 296-303

136. Ohshima T., Suzuki H., Morimura T., Ogawa M., Mikoshiba K. Modulation of Reelin signaling by Cyclin-dependent kinase 5 //Brain Research. 2007. - V. 1140.-P. 84-95

137. Okada S., Ouchi T. Cell cycle differences in DNA damageinduced BRCA1 phosphorylation affect its subcellular localization // Biology Chemically. 2003. - V. 278.-P. 2015-2020

138. Pines J., Hunter T. Cyclin-dependent kinesis: an embarrassment of riches? / Cell Cycle Control/ ed. Hutchison C, Glover D. -New York; Oxford Univ. Press, 1995. -P. 144-176

139. Pompei F., Poikanov M., Wilson R. Age distribution of cancer in mice: the incidence turnover at old age // Toxicology and Industrial Health. 2001. - Vol. 17. -P. 7-16

140. Prussin C., D. Metcalfe. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directry conjugated anti-cytokine antibodies // Immunology Methods. 1995.- Vr3"- №188: -"P. 117-128

141. Raaphorst, G. P., Boyden, S. Adaptive response and its variation in human normal and tumour cells // Radiation Biology. 1999. - V. 75. - P. 865-873

142. Rozgaj R., KaSuba V., Sentija K. Prlid Radiation-induced chromosomal aberrations and haematological alterations in hospital workers // Occupational Medicine and Toxicology. -1999. V. 49. - N. 6. - P. 353-360

143. Rubin I. The disparity between human cell senescence in vitro and lifelong replication in vivo // Nature Biotechnology. 2002. V. - 20. - P. 675-678

144. Sachsenberg N., Perelson S., Yerly G.A., Schockmel D., Leduc B., Hirschel L. Turnover of CD4+ and CD8+ T lymphocytes in HIV-1 infection as measured by Ki-67 antigen //Experimental Medicine. 1998. - V. 187. - P. 1295-1303

145. Satyanarayana A.,Hilton M.B., Kaldis Ph. p21 Inhibits Cdkl in the Absence of Cdk2 to Maintain the Gl/S Phase DNA Damage Checkpoint // Molecular Biology Cell.- 2008. V. 19(1). - P.65- 67 —

146. Schwarting R, Stein H. High proliferative activity of Reed Sternberg associated antigen Ki-1 positive cells in normal lymphoid tissue // Clinical Pathology. 1986. -V. 39.-P. 993-997

147. Schwarzl J. K., Lovlyl C.M, Piwnica-Worms H. Regulation of the Chk2 Protein Kinase by Oligomerization-Mediated cis- and trans-Phosphorylation' // Nature. -2003.-Vol. l.-P. 598-609

148. Serrano M., Hannon G. J., Beach D. A. New regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4 //Nature. 1993. - V. 366. - P. 704-707

149. Shao C, Furusawa Y, Aoki M, Matsumoto H, Ando K. Nitric oxide mediated bystander effect induced by heavy-ions in human salivary gland tumor cells // Radiation Biology. 2002. - V. 78. - P. 837-844

150. Sherr C.J. D-type cyclins. // Trends in Biochemical Sciences. 1995. - V. 2. - P. 187-190

151. Sullivan A., Yuille M., Repellin C., Reddy A., Reelfs O., Bell A., Dunne B., Gusterson B.A., Osin P., Farrell P.J Concomitant inactivation of p53 and Chk2 in breast cancer // Oncogene. 2002. - № 21.- P. 1316-1324

152. Suzuki K., Ojima M., Kodama S., Watanabe M. Delayed activation of DNA damage checkpoint and radiation-induced genomic instability // Mutation Research. -2006. V. 597. - № 1-2. - P. 73-77

153. Suzuki K., Kodama S., and Watanabe M. Extremely low-dose ionizing radiation causes activation of mitogenactivated protein kinase pathway and enhances proliferation of normal human diploid cells // Cancer Research. 2001 - V. 61. - P. 5396-5401

154. Takai H., Naka K., Okada Y., Watanabe M., Harada N., Saito S., Anderson C.W., Appella, E., Nakanishi M., Suzuki H. Chk2- deficient mice exhibit radioresistance and defective p53-mediated transcription // EMBO. 2002. - V.21. - P. 5195-5205

155. Thotnpson J. S., Robbins J., Cooper J. K. Nutrition and immune function in the geriatric population // Clinics in Geriatric Medicine. 1987. - Vol. 3. - P. 309-317

156. Umeki S., Kyoizumi S., Kusunoki Y., Nakamura N., Sasaki M., Mori., Ishikawa Y., Akiyama M. Flow cytometric measurements of somatic cell mutation in thorotrast patients // Cancer Research. 1991,- V. 82. - P. 1349-1353

157. Véronique G., Roux P., Wynford-Thomas D., Brondello J.M., Dulic V. DNA damage checkpoint kinase Chk2 triggers replicative senescence // EMBO. 2004. -V. 23.-P. 2554-256

158. Wang Q., Zhang H., Fishel R., Greene M.I. BRCA1 and cell signaling // Oncogene. 2000. - V. 19. - P. 6152-6158

159. Wang Y., Jacobs C., Hook K.E , Duan H., Booher R.N., Sun Y. Binding of 14-3-3beta to the carboxyl terminus of Wee 1 increases Weel stability, kinase activity, and G2-M cell population // Cell Growth Differen. 2000. - V. 11(4). - P. 211-219

160. Weinert T., Hartwell L. The RAD9 gene controls the cell cycle response to DNA damage in Saccharomyces cerevisiae // Science. 1988. - V. 241. - P. 317-322

161. Weinert T. DNA damage and checkpoint pathways: Molecular anatomy and interactions with repair // Cell. 1998. - № 94. - P. 555-558

162. Wu X., Webster S.R., Chen J. Characterization of tumor-associated Chk2 mutations // Biology Chemistry. 2001. - V. 274. - P. 2971-2974

163. Xu B., Kim S., Lim D., Kastan M.G. Two Molecularly Distinct G2/M Checkpoints Are Induced by Ionizing Irradiation // Molecular and cellular biology. -2002.-V. 22.-P. 1049-1059

164. Xu Y., Baltimore D. Dual roles of ATM in the cellular response to radiation and in cell growth control // Genes Development. 1996. - V. 10(19). - P. 2401-2410

165. Xu B., Kim S., Kastan M.B. Involvement of Brcal in S-phase and G2-phase checkpoints after ionizing irradiation // Molecular Cell Biology. 2001. - V.21. - P. 3445-3450

166. Xuang L. Radiation-induced genomic instability and its implications for radiation carcinogenesis // Oncogene. 2003. - V. 22. - № 37. - P. 5848-5854

167. Yang Guang, Liu Chang, Jia Ting-zhen. Effect of gamma-ray irradiation on cord blood lymphocyte proliferation and NK cell activity // Chinese Journal of Radiological medicine and Protection. 2006. - Vol. 26. - Is. 01. - P. 60-69

168. Yoshida, N., Imada, H., Kunugita, N., Norimura, T. Low doseradiation-induced adaptive survival response in mouse spleen T-lymphocytesin vivo // Radiation Research. 1993. - V.34. - P. 269-276

169. Zhao H., Watkins J.L., Piwnica-Worms H. Disruption of the checkpoint kinase 1/cell division cycle 25A pathway abrogates ionizing radiation- induced S and G2 checkpoints // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2002. - P. 14795— 14800

170. Zhiyun C., Kazuo S. Enhancement of radiation-induced apoptosis by preirradiation with low-dose X-rays in human leukemia MOLT-4 cells // Radiation Research. 2005. - V. 45. - P. 239-243

171. Zhou X.Y., Wang X., Hu B., Guan J., Iliakis G., Wang, Y. An ATM-independent S-phase checkpoint response involves CHK1 pathway // Cancer Research. -2002. -V. 62. -P. 1598-1603

172. Zhou B.B., Elledge S.J. The DNA damage response: putting checkpoints in perspective //Nature. 2000 - №408,- P. 433^39

Информация о работе

Маркина, Татьяна Николаевна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.01

Диссертация

Пролиферативная активность и задержка клеточного цикла лимфоцитов крови человека в отдаленные сроки хронического облучения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Пролиферативная активность и задержка клеточного цикла лимфоцитов крови человека в отдаленные сроки хронического облучения - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы